特許 7126623 ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の測定方法およびそのための装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-18

(45)【発行日】2022-08-26

(54)【発明の名称】ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の測定方法およびそのための装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20220819BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 F

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2021543450

(86)(22)【出願日】2019-12-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-15

(86)【国際出願番号】 KR2019018683

(87)【国際公開番号】W WO2020159088

(87)【国際公開日】2020-08-06

【審査請求日】2021-07-27

(31)【優先権主張番号】10-2019-0011493

(32)【優先日】2019-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0098646

(32)【優先日】2019-08-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】512328201

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティチュート オブ スタンダーズ アンド サイエンス

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】イ テ ゴル

(72)【発明者】

【氏名】ナ ヒ－キュン

(72)【発明者】

【氏名】ジョー スンホ

【審査官】吉田 将志

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０３５９２３６１（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１３７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１８５５９９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｈ０１Ｊ ４９／００ － Ｈ０１Ｊ ４９／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

基板層と、前記基板層上に積層される二硫化タングステン層と、を含むＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイの二硫化タングステン層上に、血液を含む試料をロードする試料ロードステップ、および
前記ＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ上にロードされた試料をＬＤＩ－ＭＳで分析し、試料中のターゲット物質を検出する分析ステップを含む、ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項2】

前記二硫化タングステン層は、前記基板層に接する複数の二硫化タングステンナノフレーク粒子を含む、請求項１に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項3】

前記分析ステップは、ターゲット物質の含量を計算する定量化ステップを含む、請求項１に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項4】

前記定量化ステップは、二硫化タングステン層に存在する二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度を得る第１定量化ステップを含み、
前記第１定量化ステップで得た二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度からターゲット物質の含量を決定する、請求項３に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項5】

前記試料ロードステップの前に、液状試料に内部標準物質を添加するステップを含み、
前記定量化ステップは、ＬＤＩ－ＭＳスペクトルにおいて、ターゲット物質に該当するピーク強度および内部標準物質に該当するピーク強度からターゲット物質の含量を決定する第２定量化ステップを含む、請求項３に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項6】

前記定量化ステップは、補正スペクトルを得るステップを含み、前記補正スペクトルにおいて決定係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が０．９以上である、請求項５に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項7】

検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬｏＤ）が０．０１ｐｍｏｌ／μｌ（ターゲット物質／血液）以下である、請求項１に記載のＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の試料分析方法。

【請求項8】

基板層と、前記基板層上に積層され、血液を含む試料がロードされるようにする二硫化タングステン層と、を含む、血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項9】

前記二硫化タングステン層は、前記基板層に接する複数の二硫化タングステンナノフレーク粒子を含む、請求項８に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項10】

前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、平均厚さが２～１５ｎｍである、請求項９に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項11】

前記二硫化タングステン層は、二硫化タングステンナノフレーク粒子が、単位面積当たり０．０００１～１００ｍｇ／ｃｍ^２で存在する、請求項９に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項12】

前記二硫化タングステン層は、二硫化タングステンナノフレーク粒子が分散された水分散溶液から前記基板層上にスポッティング（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）された後、水が蒸発して製造されたものである、請求項９に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項13】

前記水分散溶液は、二硫化タングステンナノフレーク粒子を０．００１～１０重量％で含む、請求項１２に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項14】

前記水分散溶液は、０．００１～１００μｌの含量（２５℃、１ａｔｍ）で同一領域に２回以上スポッティングされる、請求項１３に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項15】

前記二硫化タングステン層の平均厚さは０．００１～５００μｍである、請求項８に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項16】

前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は下記式１を満たす、請求項９に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。
式１：Ｒ_１／Ｒ_２≧１．３
（前記式１中、Ｒ_１は、二硫化タングステン層の任意選択された２×２μｍの領域で測定されたラマンスペクトルにおいて３４０～３８０ｃｍ^－１範囲のピーク面積であり、Ｒ_２は、前記ラマンスペクトルにおいて４００～４４０ｃｍ^－１範囲のピーク面積である。）

【請求項17】

前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、二硫化タングステンバルク粉末から、リチウムをインターカレートした化学的剥離方法により製造される、請求項９に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項18】

前記基板層は、アルミニウム、銅、鉄、ニッケル、亜鉛、クロム、銀、およびシリコンの中から選択される何れか１つまたは２つ以上を含む、請求項８に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項19】

血液中に注入されるターゲット物質の定性または定量分析のための用途として用いられる、請求項８に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ。

【請求項20】

請求項８から１９の何れか一項に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むＬＤＩ－ＭＳ用の試料ロードキット。

【請求項21】

請求項８から１９の何れか一項に記載の血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むレーザ脱着イオン化質量分析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血液中の有機物の検出方法および血液中の有機物を検出するための装置に関する。

【背景技術】

【0002】

治療薬物モニタリング（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、ＴＤＭ）は、指定された時間間隔で、患者の血液中の薬物およびこれらの代謝物質の濃度を測定するものである。治療薬物モニタリングを通じて個人別に薬物の投与量が調節可能であり、よって、個人別に薬物を通じた治療効果を極大化させることができる。血液濃度と治療効果との間の関係を含む特徴を有する治療薬物モニタリングは非常に重要である。

【0003】

免疫抑制薬物などのような種々の薬物があり、一例として、心臓活性薬に関するものがある。治療薬物モニタリングを通じて、薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）、狭い治療窓（ｎａｒｒｏｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）における個人間変動（Ｉｎｔｅｒ－ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）をモニタリングすることができる。

【0004】

免疫抑制薬物は、臓器移植後の患者に対する臓器拒否を予防するための免疫システムの抑制を誘導するために医師により処方可能である。薬物の効果を誘発しつつ副作用を防止するために、治療窓に適切な濃度で薬物を投与することが重要である。これらの狭い治療窓により、免疫抑制薬物が正確な濃度で注入される必要があり、具体的に、注入前１回または２回時に患者の血液において薬物を測定する必要がある。また、免疫抑制薬物は、薬物代謝（Ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）および薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の個人間の差により、治療薬物モニタリングを必要とする。患者の血液から薬物を検出するための最も一般的に用いられる従来の方法は、液体クロマトグラフィ－質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＣ－ＭＳ）である。しかし、ＬＣ－ＭＳは、複数の実験段階を必要とするため複雑であり、時間が多くかかるためリアルタイムで測定し難く、即時に測定データを収集することが容易ではない。よって、臨床サンプルから免疫抑制薬物の迅速な結果収集が求められており、正確性、センシティビティの向上はいうまでもなく、直接的且つ高い処理量の検出が可能な治療薬物モニタリングに対する研究が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】ＫＲ１０－２０１８－００６８２８０Ａ（２０１８．０６．２１）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、測定時に複雑ではなく、多くの測定段階を経る必要がなく、迅速な分析によりリアルタイムで測定および結果収集が容易な、ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法およびそのための装置を提供することにある。

【0007】

本発明の他の目的は、さらに低いサンプル濃度においても精密な分析が可能であるためセンシティビティおよび精密性に優れるとともに、種々の有機物を精密に検知可能であることはいうまでもなく、高い処理量を有し、マトリックスによる干渉なしに血液における代謝過程を経た有機物の構造分析およびその定量的分析が正確に行われる、ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法およびそのための装置を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた有機物の検出方法は、基板層と、前記基板層上に積層される二硫化タングステン層と、を含むＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイの二硫化タングステン層上に、血液を含む試料をロードする試料ロードステップ、および前記ＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ上にロードされた試料をＬＤＩ－ＭＳで分析し、試料中のターゲット物質を検出する分析ステップを含む。

【0009】

本発明の一実施形態において、前記分析ステップは、ターゲット物質の含量を計算する定量化ステップを含んでもよい。
本発明の一実施形態において、前記定量化ステップは、二硫化タングステン層に存在する二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度を得る第１定量化ステップを含んでもよく、前記第１定量化ステップで得た二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度からターゲット物質の含量を決定してもよい。

【0010】

本発明の一実施形態に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた試料分析方法は、前記試料ロードステップの前に、液状試料に内部標準物質を添加するステップを含んでもよく、前記定量化ステップは、ＬＤＩ－ＭＳスペクトルにおいて、ターゲット物質に該当するピーク強度および内部標準物質に該当するピーク強度からターゲット物質の含量を決定する第２定量化ステップを含んでもよい。

【0011】

本発明の一実施形態において、前記定量化ステップは、補正スペクトルを得るステップを含み、前記補正スペクトルにおいて決定係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が０．９以上であってもよい。

【0012】

本発明の一実施形態に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた試料分析方法は、検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬｏＤ）が０．０１ｐｍｏｌ／μｌ（ターゲット物質／血液）以下であってもよい。

【0013】

本発明に係る血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイは、基板層と、前記基板層上に積層され、血液を含む試料がロードされるようにする二硫化タングステン層と、を含む。

【0014】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステン層は、前記基板層に接する複数の二硫化タングステンナノフレーク粒子を含んでもよい。
本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、平均厚さが２～１５ｎｍであってもよい。

【0015】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステン層は、二硫化タングステンナノフレーク粒子が、単位面積当たり０．０００１～１００ｍｇ／ｃｍ^２で存在してもよい。

【0016】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステン層は、二硫化タングステンナノフレーク粒子が分散された水分散溶液から前記基板層上にスポッティング（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）された後、水が蒸発して製造されたものであってもよい。

【0017】

本発明の一実施形態において、前記水分散溶液は、二硫化タングステンナノフレーク粒子を０．００１～１０重量％で含んでもよい。
本発明の一実施形態において、前記水分散溶液は、０．００１～１００μｌの含量（２５℃、１ａｔｍ）で、同一領域に２回以上スポッティングされてもよい。
本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステン層の平均厚さは０．００１～５００μｍであってもよい。

【0018】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、下記式１を満たしてもよい。下記式１中、Ｒ_１は、二硫化タングステン層の任意選択された２×２μｍの領域で測定されたラマンスペクトルにおいて３４０～３８０ｃｍ^－１範囲のピーク面積であり、Ｒ_２は、前記ラマンスペクトルにおいて４００～４４０ｃｍ^－１範囲のピーク面積である。
式１：Ｒ_１／Ｒ_２≧１．３

【0019】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、二硫化タングステン（Ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＷＳ_２）バルク粉末から、リチウムをインターカレートした（Ｌｉｔｈｉｕｍ－ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）化学的剥離方法により製造されてもよい。

【0020】

本発明の一実施形態において、前記基板層は、アルミニウム、銅、鉄、ニッケル、亜鉛、クロム、銀、およびシリコン（ＳｉＯ_２）などから選択される何れか１つまたは２つ以上を含んでもよい。

【0021】

本発明の一実施形態において、前記試料ロードアレイは、血液中に注入されるターゲット物質の定性または定量分析のための用途として用いられてもよい。
本発明は、前記血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むＬＤＩ－ＭＳ用の試料ロードキットを提供してもよい。
本発明は、前記血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むレーザ脱着イオン化質量分析装置を提供してもよい。

【発明の効果】

【0022】

本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法およびそのための装置は、測定時に複雑ではなく、多くの測定段階を経る必要がなく、迅速な分析によりリアルタイムで測定および結果収集が容易であるという効果がある。

【0023】

本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法およびそのための装置は、さらに低いサンプル濃度においても精密な分析が可能であるためセンシティビティおよび精密性に優れるとともに、種々の有機物の検知が可能であることはいうまでもなく、高い処理量を有し、マトリックスによる干渉なしに血液における有機物の構造分析およびその定量的分析が正確に行われるという効果がある。

【0024】

本発明で明らかに言及していない効果であるとしても、本発明の技術的特徴により期待される明細書に記載された効果およびその内在的な効果は、本発明の明細書に記載されたものと同様に取り扱われる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ａ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子の透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＴＥＭ）イメージであり、ｂ）およびｃ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子の原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）イメージであり、ｄ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。

【図2】ａ）は、ウェハ上の二硫化タングステン層に対するラマンマッピング（Ｒａｍａｎ ｍａｐｐｉｎｇ）結果を示したものであり、ｂ）は、ａ）のラマンマッピングから選択された領域（２×２μｍ）から抽出されたラマンスペクトルであり、ｃ）は、３５０ｃｍ^－１（ｒｅｄ）および４２０ｃｍ^－１（ｇｒｅｅｎ）の波長でのピークを有するラマンマッピング結果を示したものであり、ｄ）は、ラマンマッピングからｒｅｄ領域（左側スペクトル）、ｇｒｅｅｎ領域（中央スペクトル）、およびｙｅｌｌｏｗ領域（右側スペクトル）から抽出されたラマンスペクトルである。

【図3】ａ）は、二硫化タングステン分散液のスポッティング数に応じたＬＤＩ－ＭＳ分析を用いたＣｓＡの強度を示したものであり、ｂ）は、ＬＤＩ－ＭＳ分析を用いたＣｓＡの強度とスポッティング数との間の関係を示したグラフである。

【図4】ａ）は、ＣｓＡおよびその内部標準物質であるＣｓＤの構造を示したものであり、ｂ）は、ＣｓＡ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）およびＣｓＤ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＣｓＡの多様な濃度に応じた全血抽出物からＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。

【図5】ａ）は、ＴＡＣおよびその内部標準物質であるＡＳＣの構造を示したものであり、ｂ）は、ＴＡＣ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）およびＡＳＣ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＴＡＣの多様な濃度に応じた全血抽出物からＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。

【図6】ａ）は、ＳＩＲおよびＥＶＲの構造を示したものであり、ｂ）は、ＳＩＲ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）および内部標準物質（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＥＶＲ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）および内部標準物質（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｄ）は、ＥＶＲの多様な濃度に応じた全血抽出物からＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。

【図7】ａ）は、イオン化のためにα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ；ＣＨＣＡ）マトリックスを用いて、ＣｓＡの定量範囲（０．００７５－３０ｐｍｏｌ／μｌ）に対する測定結果であり、ｂ）は、前記マトリックスを用いて、ＴＡＣに対する線形定量の範囲（０．００１５－３０ｐｍｏｌ／μｌ）に対する測定結果であり、ｃ）は、ＣＨＣＡ処理されたサンプルの低分子量領域ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルであり、ｄ）は、本発明に係る低質量領域ＬＤＩ－ＭＳスペクトルである。

【図8】実験例３のＬＤＩ－ＭＳの場合と従来のＬＣ－ＭＳとの相関関係を示したものであり、ＷＳ_２基盤ＬＤＩ－ＭＳ分析（ｙ－軸）およびＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ｘ－軸）による３種類の免疫抑制剤、ＣｓＡ（ａ）、ＴＡＣ（ｂ）、およびＥＶＲ（ｃ）の定量結果を比較分析したデータである。

【図9】ＣｓＡおよびＴＡＣが注入された血液患者サンプル総８０個をＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳで分析した測定値とＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓデータを示したものである。具体的に、ａ）は、ＣｓＡが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ（ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）データであり、ｂ）は、ＴＡＣが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ（ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）データである。また、ｃ）は、ＣｓＡが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔｓデータであり、ｄ）は、ＴＡＣが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔｓデータである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、添付図面を参照し、本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法およびそのための装置について詳しく説明する。
本発明に記載されている図面は、当業者に本発明の思想が十分に伝達されるように例として提供されるものである。よって、本発明は、提示される図面に限定されず、他の形態に具体化されてもよく、前記図面は、本発明の思想を明確にするために誇張して図示されてもよい。

【0027】

本発明で用いられる技術用語および科学用語において他の定義がなければ、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が通常理解している意味を有し、下記の説明および添付図面において、本発明の要旨を不要に濁す恐れがある公知の機能および構成に関する説明は省略する。
本発明で用いられる用語の単数の形態は、特に指示しない限り、複数の形態も含むものと解釈されてもよい。

【0028】

本明細書で言及されるｓ１、ｓ２、ｓ３、…；ａ１、ａ２、ａ３、…；ｂ１、ｂ２、ｂ３、…；ａ、ｂ、ｃ、…；などの各ステップを指す用語自体は、あるステップ、手段などを指すために用いられるものにすぎず、その用語が指す各対象の順序関係を意味するものと解釈されてはならない。
本明細書において、特に言及なしに用いられた％の単位は、他の定義がない限り、重量％を意味する。

【0029】

本明細書で言及される「層」または「膜」の用語は、各材料が連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）をなし、幅と長さに比べて厚さが相対的に小さい寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を有することを意味する。このため、本明細書において、「層」または「膜」の用語により、２次元の扁平な平面に解釈されてはならない。

【0030】

本発明は、ＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法、血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ、前記アレイを含むＬＤＩ－ＭＳ用の試料ロードキット、および前記アレイを含むレーザ脱着イオン化質量分析装置を提供する。本明細書において、ＬＤＩ－ＭＳは、レーザ脱着／イオン化質量分析法（Ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＬＤＩ－ＭＳ）を意味する。

【0031】

本発明においては、均一に蒸着された二硫化タングステン（Ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ、ＷＳ_２）ナノフレーク（Ｎａｎｏｆｌａｋｅ）粒子を用いて、チップ－基盤のＬＤＩ－ＭＳアレイが製造可能となることにより、高い処理量分析のための簡単なプラットフォームを提供することができ、試料準備において部分的または完全な自動化が可能であるため分析時間を画期的に減らすことができる。また、質量分析法での正確度および精度を顕著に向上させることができる。よって、ステップが複雑でリアルタイム検出が実質的に難しいＬＣ－ＭＳ／ＭＳの場合とは異なり、本発明は、有機物のリアルタイム検出および分析が可能でありながらも、定性分析および定量分析の精密性にさらに優れるという効果がある。

【0032】

本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の検出方法は、基板層と、前記基板層上に積層される二硫化タングステン層と、を含むＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイの二硫化タングステン層上に、血液を含む試料をロードする試料ロードステップ、および前記ＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイ上にロードされた試料をＬＤＩ－ＭＳで分析し、試料中のターゲット物質を検出する分析ステップを含む。

【0033】

本発明においては、二硫化タングステンがナノ粒子形態としてＬＤＩ－ＭＳ試料プレートの表面層に適用されることで、血液中の有機物の定性分析および定量分析に高い精度を有し、特に定量分析に高い正確度を有するため、分析しようとする有機物、すなわち、ターゲット分子の含量を正確に測定できるという効果がある。よって、高い精度および正確度の定性分析および定量分析が可能でありながらも、分析方法が簡単で、且つ、所要時間が非常に短いため、リアルタイムで血液中の有機物を定性および定量分析できるという効果がある。このような効果は、ＬＤＩ－ＭＳ試料プレートの表面層にナノ粒子形態として二硫化タングステンが用いられることによるものであり、二硫化タングステン以外の金属化合物が用いられる場合、例えば、二硫化モリブデン（Ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ、ＭｏＳ_２）、二酸化タングステン（Ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｄｉｏｘｉｄｅ、ＷＯ_２）などの他の金属化合物が用いられる場合には実現し難い。

【0034】

本発明の一実施形態において、前記分析ステップは、ターゲット物質の含量を計算する定量化ステップを含んでもよい。具体的に、二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度からターゲット物質の含量を分析する第１定量化ステップ、または内部標準物質による第２定量化ステップを例に挙げることができる。

【0035】

具体的な一例として、第１定量化ステップを説明すると、前記定量化ステップは、二硫化タングステン層に存在する二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度を得る第１定量化ステップを含んでもよく、前記第１定量化ステップで得た二硫化タングステンナノフレーク粒子の濃度からターゲット物質の含量を決定してもよい。

【0036】

具体的な一例として、第２定量化ステップを説明すると、本発明の一実施形態に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた試料分析方法は、前記試料ロードステップの前に、液状試料に内部標準物質を添加するステップを含んでもよく、前記定量化ステップは、ＬＤＩ－ＭＳスペクトルにおいて、ターゲット物質に該当するピーク強度および内部標準物質に該当するピーク強度からターゲット物質の含量を決定する第２定量化ステップを含んでもよい。前記内部標準物質は、分析ステップにおいてターゲット物質とは区別可能であるとともに、物理化学的特性（イオン化特性および溶解度）がターゲット物質と類似したものであればよい。かかる内部標準物質を用いて、分子量差によりターゲット物質の精密な定量分析が可能である。

【0037】

本発明の一実施形態において、前記定量化ステップは、補正スペクトルを得るステップを含み、前記補正スペクトルにおいて決定係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）が０．９以上、具体的には０．９３以上、より具体的には０．９５以上であってもよい。すなわち、本発明は、定量分析の精度に顕著に優れるという効果がある。この際、上限値は１以下であればよい。

【0038】

本発明の一実施形態に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた試料分析方法は、検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬｏＤ）が０．０１ｐｍｏｌ／μｌ（ターゲット物質／血液）以下であってもよい。すなわち、本発明は、極少量の血液を用いても精密な定量分析が可能であるという効果がある。

【0039】

本発明に係る血液中の有機物検出用のＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイは、基板層と、前記基板層上に積層され、血液を含む試料がロードされるようにする二硫化タングステン層と、を含む。
本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステン層は、前記基板層に接する複数の二硫化タングステンナノフレーク粒子を含んでもよい。

【0040】

前記二硫化タングステンナノフレークは、二硫化タングステンが、短幅、長幅、および厚さのうち少なくとも１つ以上がナノサイズであって、板状を有する。二硫化タングステンナノフレークは、多様な方法により製造されてもよく、一例として、化学的剥離方法、具体的には、二硫化タングステン（Ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＷＳ_２）バルク粉末から、リチウムをインターカレートした（Ｌｉｔｈｉｕｍ－ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）化学的剥離方法を製造する手段であってもよいが、この他にもナノサイズの板状二硫化タングステンが製造可能な手段であればよい。

【0041】

前記二硫化タングステンナノフレーク粒子を具体的にその規格について説明すると、次の例が挙げられるが、これは好ましい一例として説明されたものにすぎず、これに本発明が必ずしも制限されて解釈されるものではないことはいうまでもない。好ましい一例として、前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、平均厚さが１～５０ｎｍ、具体的には２～１５ｎｍであってもよく、その平均長幅が１～５，０００ｎｍであってもよく、単位面積当たり０．０００１～１００ｍｇ／ｃｍ^２で基板層上に存在してもよい。また、前記二硫化タングステン層は、その表面粗さ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）が１～５００ｎｍであってもよい。

【0042】

前記二硫化タングステン層は、二硫化タングステンナノフレーク粒子が分散された分散溶液から前記基板層上にスポッティング（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）された後、分散溶液が蒸発して製造されたものであってもよい。この際、分散溶液は、水および通常の周知の有機溶媒などから選択される何れか１つ以上の分散媒を含んでもよく、好ましくは、分散媒が水として水分散溶液が好ましい。分散溶液を介して、スポッティングおよび乾燥により、基板層上に二硫化タングステンとしてナノフレーク粒子を含む二硫化タングステンの層を形成する場合、さらに安定した構造で規則的なパターンの分散ロードされた状態を維持することができ、さらに精密な定性分析および定量分析が可能であるという効果がある。

【0043】

前記分散溶液の組成比は、最終的に基板層上に二硫化タングステンナノフレーク粒子が分散され、適正量がロードされた状態で存在できるように調節可能であるため、大きく制限されるものではないが、例えば、前記分散溶液は、二硫化タングステンナノフレーク粒子を０．００１～１０重量％、および残量の分散媒を含んでもよい。

【0044】

本発明の一実施形態において、前記分散溶液は、０．００１～１００μｌの含量（２５℃、１ａｔｍ）で、同一領域に２回以上、具体的には２～１０回スポッティングされることが、さらに安定した構造で規則的なパターンの分散ロードされた状態を維持することができ、さらに精密な定性分析および定量分析が可能であるという効果がある。

【0045】

前記二硫化タングステン層の平均厚さは、二硫化タングステンナノフレーク粒子のロード量およびロード状態に応じて適宜制御されてもよく、例えば、０．００１～５００μｍであってもよい。これを満たす場合、さらに安定的にロードされた状態を維持することができ、さらに精密な定性分析および定量分析が可能であるという効果がある。また、二硫化タングステン層の幅（横または縦）は、分析／測定規模に応じて適宜調節可能であるため、大きく制限されず、一例として、０．００１～１０ｍｍであってもよい。

【0046】

本発明の一実施形態において、前記二硫化タングステンナノフレーク粒子は、下記式１を満たすことができる。下記式１中、Ｒ_１は、二硫化タングステン層の任意選択された２×２μｍの領域で測定されたラマンスペクトルにおいて３４０～３８０ｃｍ^－１範囲のピーク面積であり、Ｒ_２は、前記ラマンスペクトルにおいて４００～４４０ｃｍ^－１範囲のピーク面積である。
式１：Ｒ_１／Ｒ_２≧１．３

【0047】

前記基板層としては多様なものが用いられてもよく、一例として、アルミニウム、銅、鉄、ニッケル、亜鉛、クロム、銀などの導電性金属、およびシリコン（ＳｉＯ_２）などから選択される何れか１つまたは２つ以上を含んでもよい。しかし、これは具体的な一例として説明されたものにすぎず、本発明がこれに必ずしも制限されて解釈されるものではない。

【0048】

前述したように、本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた有機物の検出方法およびそのための装置は、血液中のターゲット物質または血液中に注入されるターゲット物質の定性または定量分析のための用途として用いられてもよい。

【0049】

本明細書で言及される「試料」は血液または血液を含むものを意味し、血液としては、血液自体が用いられてもよく、血液から分離した血漿が用いられてもよく、血液にいかなる処理をしたものが用いられてもよい。

【0050】

本明細書において、検出のための「有機物」は「ターゲット物質」を意味し得るし、ターゲット物質は、好ましくは、ターゲット分子であってもよい。前記ターゲット物質としては、血液中の検出しようとする有機物質であれば制限されず、一例として、免疫抑制剤、抗遊走剤、消炎剤、血管新生抑制剤、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤、抗再狭窄剤、抗悪性腫瘍剤、抗菌剤、および抗真菌剤などの多様なものが用いられてもよい。また、前記ターゲット物質は、モニタリングが必要な血液中に注入用途として用いられてもよい。

【0051】

非制限的な具体的な一例として、前記ターゲット物質は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、エベロリムス、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アセメタシン、アセチルビスミオンＢ、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、アデメチオニン、アドリアマイシン、アエシン（ａｅｓｃｉｎ）、アフロモソン、アカゲリン、アルデスロイキン、アミドロン、アミノグルテセミド、アムサクリン、アナキンラ、アナストロゾール、アネモニン、アミノプテリン、抗真菌剤、抗血栓剤、アポシマリン、アルガトロバン、アリストラクタム－ＡＩＩ、アリストロキア酸（ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉｃ ａｃｉｄ）、アスコマイシン、アスパラギナーゼ、アスピリン、アトルバスタチン、オーラノフィン、アザチオプリン、アジスロマイシン、バッカチン、バフィロマイシン、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベンダムスチン、ベンゾカイン、ベルベリン、ベツリン、ベツリン酸、ビロボール、ビスパルセノリジン、ブレオマイシン、ボムブレスタチン、ボスウェル酸およびその誘導体、ブルセアノレスＡ、ＢおよびＣ、ブリオフィリンＡ、ブスルファン、抗トロンビン、ビバリルジン、カドヘリン、カンプトテシン、カペシタビン、ｏ－カルバモイル－フェノキシ－酢酸、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セファランチン、セリバスタチン、ＣＥＴＰ阻害剤、クロラムブシル、リン酸クロロキン、シクトキシン（ｃｉｃｕｔｏｘｉｎ）、シプロフロキサシン、シスプラチン、クラドリビン、クラリスロマイシン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、コンカナマイシン、クマジン、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、クドライソフラボンＡ、クルクミン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、シタラビン、ダカルバジン、ダクリズマブ、ダクチノマイシン、ダプソン、ダウノルビシン、ジクロフェナク、１，１１－ジメトキシカンチン－６－オン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、エポチロンＡおよびＢ、エリスロマイシン、エストラムスチン、エトポシド、フィルグラスチム、フルロブラスチン、フルバスタチン、フルダラビン、フルダラビン－５’－リン酸二水素、フルオロウラシル、ホリマイシン、ホスフェストロール、ゲムシタビン、ガラキノシド（ｇｈａｌａｋｉｎｏｓｉｄｅ）、ギンコール（ｇｉｎｋｇｏｌ）、ギンコール酸、グリコシド１ａ、４－ヒドロキシオキシシクロホスファミド、イダルビシン、イホスファミド、ジョサマイシン、ラパコール、ロムスチン、ロバスタチン、メルファラン、ミデカマイシン、ミトキサントロン、ニムスチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、プロカルバジン、マイトマイシン、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ヒドロキシカルバミド、ミルテホシン、ペントスタチン、ペグアスパラガーゼ、エキセメスタン、レトロゾール、フォルメスタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸モフェチル、β－ラパコン、ポドフィロトキシン、ポドフィリン酸２－エチルヒドラジド、モルグラモスチム（ｒｈｕＧＭ－ＣＳＦ）、ペグインターフェロンα－２ｂ、レノグラスチム（ｒ－ＨｕＧ－ＣＳＦ）、マクロゴール、セレクチン（サイトカイン拮抗剤）、サイトカイニン阻害剤、ＣＯＸ－２阻害剤、アンジオペプチン、筋細胞増殖を抑制するモノクローナル抗体、ｂＦＧＦ拮抗剤、プロブコール、プロスタグランジン、１－ヒドロキシ－１１－メトキシカンチン－６－オン、スコポレチン、ＮＯドナー、四硝酸ペンタエリスリトールおよびシドノンイミン、Ｓ－ニトロソ誘導体、タモキシフェン、スタウロスポリン、β－エストラジオール、α－エストラジオール、エストリオール、エストロン、エチニルエストラジオール、メドロキシプロゲステロン、シピオン酸エストラジオール、安息香酸エストラジオール、トラニラスト、カメバコーリン（ｋａｍｅｂａｋａｕｒｉｎ）および癌の治療療法に用いられるその他のテルペノイド、ベラパミル、チロシンキナーゼ阻害剤（チロホスチン）、パクリタキセルおよびその誘導体、６－α－ヒドロキシ－パクリタキセル、タキソテール、モフェブタゾン、ロナゾラク、リドカイン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ピロキシカム、メロキシカム、ペニシラミン、水酸化クロロキン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オキサセプロール、β－シトステリン、ミルテカイン、ポリドカノール、ノニバミド、レボメントール、エリプチシン、Ｄ－２４８５１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、コルセミド、サイトカラシンＡ－Ｅ、インダノシン、ノカダゾール、バシトラシン、ビトロネクチン受容体アンタゴニスト、アゼラスチン、金属プロテイナーゼ－１および－２のグアニジルシクラーゼ刺激因子組織阻害剤、遊離核酸、ウィルス伝達物質に組み込まれた核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ分節、プラスミノゲン・アクチベータ・インヒビター－１、プラスミノゲン・アクチベータ・インヒビター－２、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ阻害剤、ＩＧＦ－１、抗生物質のグループからアクチベータ、セファドロキシル、セファゾリン、セファクロル、セフォキシチン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ペニシリン、ジクロキサシリン、オキサシリン、スルホンアミド、メトロニダゾール、エノキサパリン、ヘパリン、ヒルジン、ＰＰＡＣＫ、プロタミン、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ワルファリン、ウロキナーゼ、血管拡張剤、ジピリダモール、トラピジル、ニトロプルシド、ＰＤＧＦ拮抗剤、トリアゾロピリミジン、セラミン、ＡＣＥ阻害剤、カプトプリル、シラザプリル、リシノプリル、エナラプリル、ロサルタン、チオプロテアーゼ・インヒビター、プロスタシクリン、バピプロスト、インターフェロンα、βおよびγ、ヒスタミン拮抗剤、セロトニン遮断剤、アポトーシス阻害剤、アポトーシス調節剤、ハロフジノン、ニフェジピン、パラセタモール、デクスパンテノール、クロピドグレル、アセチルサルチル酸誘導体、ストレプトマイシン、ネオマイシン、フラマイセチン、パロモマイシン、リボスタマイシン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ベカナマイシン、ジベカシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシンｂ、パロモマイシンスルフェート、ネチルマイシン、シソマイシン、イセパマイシン、ベルダマイシン、アストロマイシン、アプラマイシン、ジェネティシン、アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、ピブメシリナム、フルクロキサシリン、メズロシリン、ピペラシリン、アズロシリン、テモシリン、チカルシリン、アモキシシリン、クラブラン酸、アンピシリン、スルバクタム、ピペラシリン、タゾバクタム、スルバクタム、セファマンドール、セフォチアム、セフロキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフタジジム、セフスロジン、セフトリアキソン、セフェピム、セフピロム、セフォキシチン、セフォテタン、セファレキシン、セフロキシムアキセチル、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテン、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、アズトレオナム、スピラマイシン、アジスロマイシン、テリスロマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、スルファメトロール、ニトロフラントイン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、フレロキサシン、レボフロキサシン、スパルフロキサシン、モキシフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、リネゾリド、ダプトマイシン、リファンピシン、フシジン酸、ホスホマイシン、トロメタモール、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、コリスチン、ムピロシン、バシトラシン、ネオマイシン、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンｂ、５－フルシトシン、カスポファンギン、アニデュラファンギン、トコフェロール、トラニラスト、モルシドミン、お茶ポリフェノール（ｔｅａ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、レフルノミド、エタネルセプト、スルファサラジン、エトポシド、ジクロキサシリン、テトラサイクリン、トリアムシノロン、ムタマイシン、プロカインイミド、レチノイン酸、キニジン、ジソピラミド、フレカイニド、プロパフェノン、ソトロール（ｓｏｔｏｌｏｌ）、天然および合成的に得られたステロイド、イノトジオール（ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、マキロサイドＡ、ガラキノサイド、マンソニン、ストレブロシド、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、非－ステロイド性物質（ＮＳＡＩＤＳ）、フェノプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロキセン、フェニルブタゾン、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、クロトリマゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ケトコナゾール、ミコナゾール、ナイスタチン、テルビナフィン、アンチプロゾール剤、クロロキン、メフロキン、キニン、天然テルペノイド、ヒポカエスクリン、バーリントゲノール－Ｃ２１－ａｎｇｅｌａｔ、１４－デヒドロアグロスチスタチン、アグロスケリン、アグロスチスタチン、１７－ヒドロキシアグロスチスタチン、オバトジオリド、４，７－オキシシクロアニソメル酸、バッカリノイドＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ７、ツベイモシド、ブルセアンチノシドＣ、ヤダンジオシドＮおよびＰ、イソデオキシエレファントピン、トメンファントピンＡおよびＢ、コロナリンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、ウルソール酸、ヒプタチン酸（ｈｙｐｔａｔｉｃ ａｃｉｄ）Ａ、イソ－イリドジャーマナル、メイテンフォリオール、エフサンチンＡ、エクスシサニンＡおよびＢ、ロンギカウリンＢ、スクルポネアチンＣ、カメバウニン、ロイカメニンＡおよびＢ、１３，１８－デヒドロ－６－アルファ－セネシオイルオキシチャパリン、タキサマイリンＡおよびＢ、レジェニロール、トリプトリド、シマリン、ヒドロキシアノプテリン、プロトアネモニン、塩化ケリブリン、シノコクリンＡおよびＢ、ジヒドロニチジン、塩化ニチジン、１２－ベータ－ヒドロキシプレグナジエン－３，２０－ジオン、ヘレナリン、インジシン、インジシン－Ｎ－オキシド、ラシオカルピン、イノトジオール、ポドフィロトキシン、ジャスティシジンＡおよびＢ、ラレアチン、マロテリン、マロトクロマノール、イソブチリルマロトクロマノール、マキロシドＡ、マルカンチンＡ、メイタンシン、リコリジシン、マルゲチン、パンクラチスタチン、リリオデニン（ｌｉｒｉｏｄｅｎｉｎｅ）、ビスパルテノリジン、オキソウシンスニン（ｏｘｏｕｓｈｉｎｓｕｎｉｎｅ）、ペリプロコシドＡ、ウルソール酸、デオキシプソロスペルミン、サイコルビン（ｐｓｙｃｏｒｕｂｉｎ）、リシンＡ、サンギナリン、マヌー小麦酸（ｍａｎｗｕｗｈｅａｔ ａｃｉｄ）、メチルソルビホリン、スパテリアクロメン（ｓｐｈａｔｈｅｌｉａｃｈｒｏｍｅｎ）、スチゾフィリン（ｓｔｉｚｏｐｈｙｌｌｉｎ）、マンソニン、ストレブロシド（ｓｔｒｅｂｌｏｓｉｄｅ）、ジヒドロウサンバラエンシン（ｄｉｈｙｄｒｏｕｓａｍｂａｒａｅｎｓｉｎｅ）、ヒドロキシウサンバリン、ストリキノペンタミン、ストリキノフィリン（ｓｔｒｙｃｈｎｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）、ウサンバリン、ウサンバレンシン、リリオデニン（ｌｉｒｉｏｄｅｎｉｎｅ）、オキソウシンスニン（ｏｘｏｕｓｈｉｎｓｕｎｉｎｅ）、ダフノレチン、ラリシレシノール（ｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）、メトキシラリシレシノール、シリンガレシノール、ビオリムスＡ９、ミオリムス、ノボリムス（ｎｏｖｏｌｉｍｕｓ）、ピメクロリムス、リダホロリムス、デオキソラパマイシン、テムシロリムスおよびゾタロリムス、ソマトスタチン、タクロリムス、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン（ｔｒｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、シンバスタチン、ロスバスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、テニポシド、ビノレルビン、トロホスファミド、トレオスルファン、テモゾロミド、チオテパ、トレチノイン、スピラマイシン、ウンベリフェロン、デスアセチルビスミオンＡ、ビスミオンＡおよびＢ、ゼ
オリン、および硫黄含有アミノ酸、例えば、シスチンはいうまでもなく、塩、水和物、溶媒和物、エナンチオマー、ラセミ体、エナンチオマー混合物、ジアステレオマー混合物などの多様な成分が挙げられる。しかし、これは具体的な一例として説明されたものにすぎず、本発明が必ずしもこれに制限されて解釈されるものではない。

【0052】

前記免疫抑制剤は、生体の免疫体系の活性を防止または抑制する薬剤として免疫抑制治療に用いられる物質であって、本発明に係る検出方法または測定装置により検出可能な分子であってもよい。前記免疫抑制剤は、その種類が制限されるものではなく、理解を助けるために一例を挙げると、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、アザチオプリン（Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、ミコフェノール酸（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ；Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、エベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、テムシロリムス、デフォロリムス、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ステロイド（Ｓｔｅｒｏｉｄ）、ミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ３抗体、シクロホスファミド、イホスファミド、およびこれらの誘導体などから選択される何れか１つまたは２つ以上を含んでもよい。しかし、これは具体的な一例として説明されたものにすぎず、本発明がこれに制限されて解釈されないことはいうまでもない。

【0053】

本発明に係る分析／測定方法および装置は、多様な分野に多様な形態で適用または応用されてもよい。一例として、本発明は、ＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むＬＤＩ－ＭＳ用の試料ロードキットとして提供されてもよく、ＬＤＩ－ＭＳ試料ロードアレイを含むレーザ脱着イオン化質量分析装置として提供されてもよい。

【0054】

以下、本発明を製造例および実施例により詳細に説明するが、これらは本発明をより詳細に説明するためのものであって、本発明の権利範囲が下記の実施例によって限定されるものではない。

【0055】

［製造例１］
＜二硫化タングステンナノフレーク粒子の製造＞
平均粒径が９０ｎｍの二硫化タングステン（Ｔｕｎｇｓｔｅｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ；ＷＳ_２）粉末から、リチウムをインターカレートした（Ｌｉｔｈｉｕｍ－ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）化学的剥離方法により、二硫化タングステンナノフレーク（Ｎａｎｏｆｌａｋｅ）粒子を次のように合成した。

【0056】

塩化リチウムを含むヘキサン（１：１モル比）２０ｍｌに二硫化タングステンバルク粉末２．５ｇを分散し、１２０分間超音波処理し、リチウム－二硫化タングステン化合物（Ｌｉ_ｘＷＳ_２）を含む分散液を製造した。前記分散液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ヘキサンおよび未反応物を除去した。リチウム－二硫化タングステン化合物をジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ＤＭＦ）に分散した後に遠心分離して洗浄し、溶媒和されたリチウム－二硫化タングステン化合物（（Ｌｉ－ｓｏｌｖｅｎｔ）_ｘＷＳ_２）を得た。前記溶媒和されたリチウム－二硫化タングステン化合物を、室温で、軽い超音波処理により、ジメチルホルムアミド５００ｍｌにおいて二硫化タングステンを剥離した。このように、分散溶媒の存在下で、インターカレートされたリチウムが溶媒和（ｓｏｌｖａｔｅｄ）され、物理的衝撃により剥離されることで、二硫化タングステンナノフレーク粒子が製造される。

【0057】

［実施例１］
＜ＬＤＩ－ＭＳアレイの製造＞
再現性および均一な分析プラットフォームのために、微液滴分配器を用いて、二硫化タングステンナノフレーク粒子を含む粉末５ｇが水５０ｇに分散された二硫化タングステン分散液を製造した。次いで、前記二硫化タングステン分散液を用いて、チップ－基盤のＬＤＩ－ＭＳアレイを準備した。具体的に、微液滴分配器を用いて、二硫化タングステン分散液を１ｍｍ厚さのステンレススチールウェハにスポッティング（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）して十分に乾燥し、二硫化タングステンナノフレーク粒子がウェハに均一に蒸着されて形成された二硫化タングステン層を含むＬＤＩ－ＭＳアレイを製造した。この際、各スポッティング当たりの二硫化タングステン分散液の体積は０．１μｌに調節された。

【0058】

［実験例１］二硫化タングステンナノフレーク粒子の特性評価
図１において、ａ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子の透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＴＥＭ）イメージであり、ｂ）およびｃ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子の原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）イメージであり、ｄ）は、二硫化タングステンナノフレーク粒子のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルである。

【0059】

図１に示されたように、約２～１４ｎｍ範囲の薄片厚さを有する二硫化タングステンナノフレーク粒子を大きいスケールで水に分散させ、二硫化タングステン分散液を製造した。剥離された二硫化タングステンナノフレーク粒子のゼータ電位値は１８．３（±０．５）ｅＶであった。二硫化タングステン分散液のＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（Ｎｄ：ＹＡＧ ｌａｓｅｒ）は、３５０～４５０ｎｍの波長において強い吸収を示した。

【0060】

図２において、ａ）は、ウェハ上の二硫化タングステン層に対するラマンマッピング（Ｒａｍａｎ ｍａｐｐｉｎｇ）結果を示したものであり、ｂ）は、ａ）のラマンマッピングから選択された領域（２×２μｍ）から抽出されたラマンスペクトルであり、ｃ）は、３５０ｃｍ^－１（ｒｅｄ）および４２０ｃｍ^－１（ｇｒｅｅｎ）の波長でのピークを有するラマンマッピング結果を示したものであり、ｄ）は、ラマンマッピングからｒｅｄ領域（左側スペクトル）、ｇｒｅｅｎ領域（中央スペクトル）、およびｙｅｌｌｏｗ領域（右側スペクトル）から抽出されたラマンスペクトルである。

【0061】

図２に示されたように、Ｅ^１ _２ｇモードおよびＡ_１ｇモードに対応する３５０および４２０ｃｍ^－１波長でのピークとのマッピングから強さを比較することで、幾つかの階層化された二硫化タングステンナノフレーク粒子の存在を確認することができる。

【0062】

このように、図１～図３から、スポッティング後、基板上の二硫化タングステンナノフレーク粒子が規則的なパターンでアレイを形成することを確認することができる。

【0063】

［実験例２］二硫化タングステン層の厚さ分析
図３に示されたように、スポッティング回数を調節して二硫化タングステン層の最適厚さを確認した。この際、各スポッティング当たりの二硫化タングステン分散液の体積は０．１μｌに調節し、層の個数と質量信号強度との関係は図３に示された。図３に示されたように、スポッティングが３回行われた場合のピーク強度が最も強いため、この条件を用いて、血液中の４個の免疫抑制剤の定量的分析を行った。

【0064】

［実験例３］ＬＤＩ－ＭＳアレイを用いたターゲット物質の定量分析の評価
分子の予測不可能なイオン化挙動により、薬物の濃度を直接決定することは難しいため、類似した脱着／イオン化特性を有する内部標準物質の追加が求められる。すなわち、臨床サンプルにおいてターゲット物質の含量を定量化するために、ターゲット分子と類似した物理化学的特性（イオン化特性および溶解度など）を有する内部標準物質を用いた。内部標準物質を用いて、分子量差によりターゲット物質の質量分析が可能である。

【0065】

臓器移植後の治療中の患者の血液中のターゲット物質濃度をモニタリングするために、二硫化タングステンナノフレーク粒子に対するセンシティビティ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）をＬＤＩ－ＭＳ用物質をもって確認した。前記ターゲット物質として一般的に用いられる免疫抑制剤である、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ；ＣｓＡ）、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ；ＴＡＣ）、シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ；ＳＩＲ）、およびエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ；ＥＶＲ）が用いられた。

【0066】

＜ＣｓＡの定量分析＞
シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ；ＣｓＡ）を免疫抑制剤にして血液中ＣｓＡの定量化のために、図４に示されたように、ＣｓＡと類似した内部標準物質としてシクロスポリンＤ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ｄ；ＣｓＤ）が用いられた。詳細には、３０ｐｍｏｌ／μｌ濃度のＣｓＡが添加された全血抽出物０．５μｌを、実施例１のＬＤＩ－ＭＳアレイの二硫化タングステン層上にスポッティングした。そして、それをＬＤＩ－ＭＳで測定し、その結果を図４に示した。

【0067】

図４において、ａ）は、ＣｓＡおよびその内部標準物質であるＣｓＤの構造を示したものであり、ｂ）は、ＣｓＡ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）およびＣｓＤ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＣｓＡの多様な濃度に応じた全血抽出物においてＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。

【0068】

図４のｂ）から、１２４０．８１および１２５４．８２ｍ／ｚにおいて、ターゲット物質であるＣｓＡおよび内部標準物質であるＣｓＤに該当するピークが明確に区別可能であることを確認することができる。また、図４のｃ）から、ＣｓＡに該当するピークとＣｓＤに該当するピークに対する強度の相関関係として、０．９８３の決定係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；Ｒ^２）を有する一定した較正曲線を示した。検出限界（Ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬｏＤ）は、ＣｓＡを用いて免疫抑制治療を受ける患者の全血での治療濃度範囲（０．１～０．３ｐｍｏｌ／μｌ）よりも遥かに低い０．００７５ｐｍｏｌ／μｌに測定された。

【0069】

さらに、この結果から、免疫抑制剤の［Ｍ＋Ｋ］^＋に対応する１２４０．８０５ｍ／ｚでのピークの強さが、スポッティングされた層の個数によって影響を受けたことが分かる。

【0070】

＜ＴＡＣの定量分析＞
タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ；ＴＡＣ）を免疫抑制剤にして血液中ＴＡＣの定量化のために、図５に示されたように、ＴＡＣと類似した内部標準物質としてアスコマイシン（Ａｓｃｏｍｙｃｉｎ；ＡＳＣ）が用いられており、定量分析方法は、前記ＣｓＡの定量分析と同様である。

【0071】

図５において、ａ）は、ＴＡＣおよびその内部標準物質であるＡＳＣの構造を示したものであり、ｂ）は、ＴＡＣ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）およびＡＳＣ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＴＡＣの多様な濃度に応じた全血抽出物においてＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。ＴＡＣおよびＡＳＣは、それぞれ８４２．４５および８３０．４５ｍ／ｚにおいて検出され、２分子に対する［Ｍ＋Ｋ］^＋に相応する。標準化されたピーク強度とスパイク（Ｓｐｉｋｅ）されたＴＡＣ濃度との間の関係は、決定係数との線形相関（Ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）が０．９７であった。検出限界は０．００１５ｐｍｏｌ／μｌに測定され、ＴＡＣ治療患者の血液での治療範囲である０．００６－０．０２５ｐｍｏｌ／μｌに比べて非常にセンシティブであることが分かる。特に、この結果は、低いイオン化特性だけでなく、難しい検出限界に対する問題を顕著に緩和可能であることが分かる。

【0072】

＜ＳＩＲおよびＥＶＲの定量分析＞
図６ａ）に示されたシロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ；ＳＩＲ）およびエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ；ＥＶＲ）をそれぞれ免疫抑制剤にして血液中ＳＩＲの定量化のために、同位元素で標識されたＳＩＲおよびＥＶＲがそれぞれ内部標準物質として用いられており、定量分析方法は、前記ＣｓＡの定量分析と同様である。

【0073】

図６において、ａ）は、ＳＩＲおよびＥＶＲの構造を示したものであり、ｂ）は、ＳＩＲ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）および内部標準物質（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｃ）は、ＥＶＲ（３０ｐｍｏｌ／μｌ）および内部標準物質（３０ｐｍｏｌ／μｌ）のＬＤＩ－ＭＳ分析結果を示したものであり、ｄ）は、ＥＶＲの多様な濃度に応じた全血抽出物においてＬＤＩ－ＭＳ分析により得た補正曲線結果を示したものである。

【0074】

図６に示されたように、ＳＩＲおよび同位元素で標識されたＳＩＲ－ｄ_３は、それぞれ［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対応する９３６．５６および９３９．５７ｍ／ｚにおいて検出され、補正曲線は、００１５～３０ｐｍｏｌ／μｌの濃度範囲で、内部標準物質とともにＳＩＲの分析により得られた。検出限界は、全血での治療範囲である０．００５－０．０１１ｐｍｏｌ／μｌよりも遥かに低い０．００１５ｐｍｏｌ／μｌに決定された。

【0075】

ＥＶＲの場合、その内部標準物質は、［Ｍ＋Ｎａ］^＋に該当する９８０．５７および９８４．５９ｍ／ｚにおいて検出された。検出限界は、患者の全血においてＥＶＲを定量する程度センシティブな０．００１５ｐｍｏｌ／μｌに測定された。

【0076】

ＭＡＤＬＩ－ＭＳは、生物学的試料から薬物および代謝産物を検出するのに普遍的な方法であって、迅速な分析には有利であるが、マトリックスによる干渉の問題が存在する。図７に示されたように、血液サンプルからＣｓＡを検出するためのマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ；ＣＨＣＡ）を用いて分析した結果、ＣＨＣＡ自体およびその断片に相応する１９０．０９、１７２．０７、および２１２．０６ｍ／ｚ周辺の多重ピークが発見された（［Ｍ］^＋、［Ｍ^－ＯＨ］^＋、および［Ｍ＋Ｎａ］^＋）。

【0077】

すなわち、ＭＡＤＬＩ－ＭＳの場合、分析によって分子の断片化パターン程度は確認することができるが、マトリックスによる多様なピークの存在により精密な分析が難しい。また、マトリックスを用いて分析物とともに結晶化を必要とする従来のＭＡＤＬＩ－ＭＳでは、Ｓｗｅｅｔ ＳｐｏｔおよびＳｉｌｅｎｔ Ｓｐｏｔを形成して再現性および定量化が特に難しい。

【0078】

図７において、ａ）は、イオン化のためにα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（α－ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ；ＣＨＣＡ）マトリックスを用いて、ＣｓＡの定量範囲（０．００７５－３０ｐｍｏｌ／μｌ）に対する測定結果であり、ｂ）は、前記マトリックスを用いて、ＴＡＣに対する線形定量の範囲（０．００１５－３０ｐｍｏｌ／μｌ）に対する測定結果であり、ｃ）は、ＣＨＣＡ処理されたサンプルの低分子量領域ＭＡＬＤＩ－ＭＳスペクトルであり、ｄ）は、本発明に係る低質量領域ＬＤＩ－ＭＳスペクトルである。

【0079】

図７のａ）およびｂ）において、ＣＨＣＡを用いたＣｓＡおよびＴＡＣのＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析結果は、低いＲ^２値（それぞれ０．８８および０．８４）として不良な補正曲線を示した。また、ＴＡＣ分析結果によると、試料中の変動により変動係数の６０％に示された。この結果から、本発明に係るＬＤＩ－ＭＳプラットフォームは、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ技術に比べて、高い感度を可能にする、向上した性能を示すことを確認することができる。また、ＣＨＣＡマトリックスを用いたＣｓＡおよびＴＡＣの分析において、検出限界は、それぞれ０．０１５および０．０３ｐｍｏｌ／μｌに決定された。よって、本発明に係るＬＤＩ－ＭＳを用いた血液中の有機物の測定は、容易な実験および分析を含み、マトリックスを用いる分析法に比べてセンシティブで且つ再現性に優れることが分かる。

【0080】

［実験例４］免疫抑制剤の定量分析に対する従来のＬＣ－ＭＳとの比較評価
図８は、実験例３のＬＤＩ－ＭＳの場合と従来のＬＣ－ＭＳとの相関関係を示したものであり、ＷＳ_２基盤ＬＤＩ－ＭＳ分析（ｙ－軸）およびＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ（ｘ－軸）による３種類の免疫抑制剤、ＣｓＡ（ａ）、ＴＡＣ（ｂ）、およびＥＶＲ（ｃ）の定量結果を比較分析したデータである。具体的に、内部標準物質を用いた治療薬物の絶対定量化を基盤に、ＬＤＩ－ＭＳ分析により血液中の有機物を定量化することができた。ＣｓＡが注入された血液においてＣｓＡを定量化したＬＤＩ－ＭＳ結果（ａ）は、ＬＣ－ＭＳ結果と優れた相関関係を示し、ＴＡＣの場合（ｂ）およびＥＶＲの場合（ｃ）も、必要なＬｏＤおよび治療濃度にもかかわらず、許容可能な相関関係を有する治療薬物の定量化を可能にした。

【0081】

また、シクロスポリンＡ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ；ＣｓＡ）が注入された血液患者サンプル４０個、およびタクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ；ＴＡＣ）が注入された血液患者サンプル４０個を含む総８０個の血液患者サンプルを、実験例３の方法のＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳで分析した測定値とＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した測定値とを比較した後、Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎおよびＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔにより２つの測定値間の一致度を評価し、それに対する結果を図９に示した。

【0082】

Ｐａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎは、２つのデータセットのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｐｌｏｔから９５％信頼区間（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）に該当する直線の傾きと切片値を計算する線形回帰分析法である。Ｌｏｗｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線とｕｐｐｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線の傾きおよび切片値の間にそれぞれ１と０が含まれると、２つのデータセットの測定値は一致すると判断することができる。

【0083】

図９は、ＣｓＡおよびＴＡＣが注入された血液患者サンプル総８０個を、ＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳで分析した測定値とＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓデータを示したものである。具体的に、図９において、ａ）は、ＣｓＡが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ（ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）データであり、ｂ）は、ＴＡＣが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＰａｓｓｉｎｇ－Ｂａｂｌｏｋ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ（ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ）データである。また、ｃ）は、ＣｓＡが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔｓデータであり、ｄ）は、ＴＡＣが注入された血液患者サンプルのＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの比較測定値に対するＢｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔｓデータである。

【0084】

図９において、ＣｓＡ分析結果の場合（ａ）、ｌｏｗｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線とｕｐｐｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線の傾きは、それぞれ０．９６６６と１．０３１７であるため、１がこの範囲内に含まれる。また、ｌｏｗｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線とｕｐｐｅｒ ９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ直線の切片値は、それぞれ－１．１６７６と２．９９６８であるため、０がこの範囲内に含まれる。さらに、ＴＡＣ分析結果の場合（ｂ）も同様の結果を示した。Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔも２つの測定値間の一致度を評価する技法であって、９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｂｉａｓ値に０が含まれる際、２つの測定値が一致すると見ることができる。ＣｓＡデータ分析結果の場合（ｃ）、９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｂｉａｓ値は－２．３５６と２．６２８（青色点線）であり、この値の間に０が含まれるため、ＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳとＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定結果が互いに一致することが分かる。さらに、ＴＡＣ分析結果の場合（ｄ）も同様の結果を示した。よって、ＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳにより得た測定値がＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定値と統計的に一致することが分かる。

【0085】

この結果から、本発明に係るＷＳ_２ ＬＤＩ－ＭＳ測定方法は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに比べて、分析が簡単で且つ製造工程が簡単なプラットフォームであって、費用および時間に非常に効率的であり、即時にリアルタイムで定量分析が可能な利点があることはいうまでもなく、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳと同様の精度またはそれを超過する精度で定性および定量分析が可能であるという効果があり、高効率および経済性の利点により、複雑で且つ効率が落ちるＬＣ－ＭＳ／ＭＳを代替可能であることが分かる。

【図1a)】

【図1b)】

【図1c)】

【図1d)】

【図2】

【図3a)】

【図3b)】

【図4a)】

【図4b)】

【図4c)】

【図5a)】

【図5b)】

【図5c)】

【図6a)】

【図6b)】

【図6c)】

【図6d)】

【図7a)】

【図7b)】

【図7c)】

【図7d)】

【図8a)】

【図8b)】

【図8c)】

【図9】