(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-19
(45)【発行日】2022-08-29
(54)【発明の名称】微小管含有集合体形成方法および微小管含有集合体形成キット
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20220822BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20220822BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12Q1/68
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2018107494
(22)【出願日】2018-06-05
(65)【公開番号】P2019208432
(43)【公開日】2019-12-12
【審査請求日】2021-04-07
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構／次世代人工知能・ロボット中核技術開発／（革新的ロボット要素技術分野）生体分子ロボット／分子人工筋肉の研究開発」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】399030060
【氏名又は名称】学校法人 関西大学
(74)【代理人】
【識別番号】100136319
【弁理士】
【氏名又は名称】北原 宏修
(74)【代理人】
【識別番号】100148275
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100142745
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 世子
(74)【代理人】
【識別番号】100143498
【弁理士】
【氏名又は名称】中西 健
(72)【発明者】
【氏名】▲葛▼谷 明紀
【審査官】井関 めぐみ
(56)【参考文献】
【文献】特開２００６－２０４２４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１１１００４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）前記第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させて、前記微小管を含む第１集合体を形成する、微小管含有集合体形成方法。
【請求項2】
前記微小管を含む第１集合体に（ｃ）モータータンパク質を接触させて、前記微小管を含む第２集合体を形成し、前記第２集合体は、第１集合体の集合形態とは異なる集合形態を有する
請求項１に記載の微小管含有集合体形成方法。
【請求項3】
（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）前記第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と、（ｃ）モータータンパク質とを液体中で接触させて、前記微小管を含む集合体を形成する、微小管含有集合体形成方法。
【請求項4】
（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）前記第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と
を備える、微小管含有集合体形成キット。
【請求項5】
（ｃ）モータータンパク質をさらに備える請求項４に記載の微小管含有集合体形成キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微小管を含有する集合体を形成する方法に関する。また、本発明は、そのような集合体を形成するためのキットにも関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ＤＮＡの一本鎖を結合した微小管を、キネシンが塗布された基板上で移動させる分子モータシステムが種々提案されている（例えば、特開２００６－２０４２４１号公報、特開２００６－２７１３２３号公報、特開２００６－２８８３３６号公報、特開２００８－２０６４８０号公報等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００６－２０４２４１号公報
【文献】特開２００６－２７１３２３号公報
【文献】特開２００６－２８８３３６号公報
【文献】特開２００８－２０６４８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
ところで、最近、上述のような分子モータシステムを人工筋肉等に応用することが試みられている。そして、この試みを具現化させるためには、多数の微小管を固定する技術が必要となる。
【0005】
本発明の課題は、多数の微小管を固定する方法を提供することにある。また、本発明は、そのような方法を実現するためのキットを提案することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の第１局面に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とが液中で接触させられて、微小管を含む第１集合体が形成される。なお、ここで、デオキシリボ核酸集合体は例えばＤＮＡオリガミ等であって、二次元的な構造を有していてもよいし、三次元的な構造を有していてもよい。
【0007】
本願発明者らの鋭意検討の結果、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させると、微小管を含む第１集合体が形成されることが明らかとなった。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成方法は、本発明の課題を解決することができる。
【0008】
本発明の第２局面に係る微小管含有集合体形成方法は第１局面に係る微小管含有集合体形成方法であって、この微小管含有集合体形成方法では、微小管を含む第１集合体に（ｃ）モータータンパク質が接触させられて、微小管を含む第２集合体が形成される。なお、ここで、第２集合体は、第１集合体の集合形態とは異なる集合形態を有する。また、ここで、「モータータンパク質」とは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって生じる化学エネルギーを運動に変換するタンパク質のことであって、例えば、アクチン上を動くミオシンや、微小管上を動くキネシンやダイニンが挙げられる。
【0009】
本願発明者らの鋭意検討の結果、上述の「微小管を含む第１集合体」に（ｃ）モータータンパク質を接触させると、微小管を含む第２集合体が形成されることが明らかとなった。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成方法は、本発明の課題を解決することができる。なお、第２集合体は、上述の第１集合体の集合体であって、第１集合体よりも大きなものとなることも明らかとなっている。
【0010】
本発明の第３局面に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と、（ｃ）モータータンパク質とが液体中で接触させられて、微小管を含む集合体が形成される。
【0011】
本願発明者らの鋭意検討の結果、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と、（ｃ）モータータンパク質とを液中で接触させると、微小管を含む集合体（上述の第２集合体に相当するもの）が形成されることが明らかとなった。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成方法は、本発明の課題を解決することができる。
【0012】
本発明の第４局面に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）微小管と、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に（ｃ）モータータンパク質が添加されて、微小管を含む集合体が形成される。
【0013】
本願発明者らの鋭意検討の結果、（ａ）未修飾の微小管と、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に（ｃ）モータータンパク質を添加すると、微小管を含む集合体が形成されることが明らかとなった。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成方法は、本発明の課題を解決することができる。
【0014】
本発明の第５局面に係る微小管含有集合体形成キットは、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを備える。なお、ここで、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管および（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体は、それぞれ容器詰めされてもよい。
【0015】
上述の通り、本発明に係る微小管含有集合体形成キットの構成要素であるａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させると、微小管を含む第１集合体が形成される。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成キットは、本発明の課題を解決することができる。
【0016】
本発明の第６局面に係る微小管含有集合体形成キットは、第５局面に係る微小管含有集合体形成キットであって、（ｃ）モータータンパク質をさらに備える。なお、ここで、（ｃ）モータータンパク質も単独で容器詰めされていてもよい。
【0017】
上述の通り、「微小管を含む第１集合体」に（ｃ）モータータンパク質を接触させると、微小管を含む第２集合体が形成される。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成キットは、本発明の課題を解決することができる。
【0018】
本発明の第７局面に係る微小管含有集合体形成キットは、（ａ）微小管、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体および（ｃ）モータータンパク質を備える。
【0019】
上述の通り、本発明に係る微小管含有集合体形成キットの構成要素である（ａ）未修飾の微小管と、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に（ｃ）モータータンパク質を添加すると、微小管を含む集合体が形成される。このため、本発明に係る微小管含有集合体形成キットは、本発明の課題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】実施例１に係るＤＮＡ修飾微小管の吸光度チャートである。なお、サンプルの解重合後のＤＮＡの最大吸収波長は２６０．０ｎｍであり、微小管の最大吸収波長は２８０ｎｍである。
【図2】実施例１に係るＤＮＡオリガミチューブの模式図である。
【図3】実施例１に係るＤＮＡオリガミチューブの原子間力顕微鏡写真である。
【図4】実施例１に係るＤＮＡオリガミチューブの高さ測定結果を示すチャート図である。
【図5】実施例１に係るＤＮＡオリガミチューブの長さ測定結果を示すチャート図である。
【図6】実施例１においてＤＮＡ修飾微小管にＤＮＡオリガミチューブを添加した際の様子を観察した写真図である。
【図7】実施例１において異なる長さを有するＤＮＡ修飾微小管を用いた際の集合体の様子を示す写真図である。
【図8】実施例１においてＤＮＡ修飾微小管とＤＮＡオリガミチューブとで構成される集合体に、キネシンを添加した際の様子を示す写真図である。
【図9】実施例２においてＤＮＡ未修飾の微小管およびＤＮＡオリガミチューブに、キネシンを添加した際の様子を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
－第１実施形態－
本発明の第１実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させて、微小管を含む第１集合体を形成させる。
本発明の第１実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体とを液中で接触させて、微小管を含む第１集合体を形成させる。
【0022】
また、上述の「微小管を含む第１集合体」に（ｃ）モータータンパク質を接触させると、微小管を含む第２集合体が形成される。
【0023】
さらに、ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管と、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体と、（ｃ）モータータンパク質とを液中で接触させて、微小管を含む第２集合体を形成させることもできるものと思われる。
【0024】
以下、上述の方法に供される（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管、（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体、（ｃ）モータータンパク質について詳述する。なお、これらの構成成分は、それぞれ容器詰めされて微小管含有集合体形成キットとされてもよい。
【0025】
（ａ）表面に第１デオキシリボ核酸を修飾した微小管
微小管は、直径２４ｎｍ程度の細胞骨格線維であって、ＧＴＰ結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。微小管の各サブユニットは、α－チューブリンおよびβ－チューブリンのヘテロ二量体である。α,βチューブリンからなるヘテロ二量体が繊維状につながったものをプロトフィラメントと呼び、これが螺旋の形で１１－１６本程度集まって管状の構造を取ったものが微小管となる。なお、チューブリンは２つのＧＴＰ分子に２つの異なる部位で結合する。３つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の１つへのアクセスの制御に関与していると考えられている。
微小管は、直径２４ｎｍ程度の細胞骨格線維であって、ＧＴＰ結合チューブリンタンパク質サブユニットからなる会合体である。微小管の各サブユニットは、α－チューブリンおよびβ－チューブリンのヘテロ二量体である。α,βチューブリンからなるヘテロ二量体が繊維状につながったものをプロトフィラメントと呼び、これが螺旋の形で１１－１６本程度集まって管状の構造を取ったものが微小管となる。なお、チューブリンは２つのＧＴＰ分子に２つの異なる部位で結合する。３つのチューブリンは、不変のグリシンリッチ領域を共有し、その領域はヌクレオチド結合部位の１つへのアクセスの制御に関与していると考えられている。
【0026】
なお、微小管の表面に第１デオキシリボ核酸の一本鎖を修飾する手法については後ほど、実施例を示しながら詳述する。
【0027】
（ｂ）第１デオキシリボ核酸と相補的関係を有する第２デオキシリボ核酸を表面上に有するデオキシリボ核酸集合体
デオキシリボ核酸集合体は、例えば、ＤＮＡオリガミ等であって、二次元的な形状（例えば、円形、正方形、長方形、星形、三角形等の形状）を有していてもよいし、三次元的な形状（例えば、立方体等の形状）を有していてもよい。なお、このＤＮＡオリガミは、非常に長い一本鎖ＤＮＡ（足場鎖と呼ばれる）を織物の横糸のように使い、二重らせん形成の相手となる２００本以上の多数の短いＤＮＡ（ステープル鎖と呼ばれる）を縦糸として横糸を橋掛けしながら織り込んでいくことで形成することができ、その形状はＤＮＡの塩基配列を変化させることより自在に変化させることができる。なお、このＤＮＡオリガミについては、Paul W.K., Rothemund. Nature 2006, 440, 297や日本ロボット学会誌Vol.28,No. 10, pp.1155～1157, 2010等に詳しい。
デオキシリボ核酸集合体は、例えば、ＤＮＡオリガミ等であって、二次元的な形状（例えば、円形、正方形、長方形、星形、三角形等の形状）を有していてもよいし、三次元的な形状（例えば、立方体等の形状）を有していてもよい。なお、このＤＮＡオリガミは、非常に長い一本鎖ＤＮＡ（足場鎖と呼ばれる）を織物の横糸のように使い、二重らせん形成の相手となる２００本以上の多数の短いＤＮＡ（ステープル鎖と呼ばれる）を縦糸として横糸を橋掛けしながら織り込んでいくことで形成することができ、その形状はＤＮＡの塩基配列を変化させることより自在に変化させることができる。なお、このＤＮＡオリガミについては、Paul W.K., Rothemund. Nature 2006, 440, 297や日本ロボット学会誌Vol.28,No. 10, pp.1155～1157, 2010等に詳しい。
【0028】
デオキシリボ核酸集合体の表面に第２デオキシリボ核酸の一本鎖を修飾する手法については後ほど、実施例を示しながら詳述する。
【0029】
（ｃ）モータータンパク質
モータータンパク質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって生じる化学エネルギーを運動に変換するタンパク質のことであって、例えば、アクチン上を動くミオシンや、微小管上を動くキネシンやダイニンが挙げられる。
モータータンパク質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって生じる化学エネルギーを運動に変換するタンパク質のことであって、例えば、アクチン上を動くミオシンや、微小管上を動くキネシンやダイニンが挙げられる。
【0030】
－第２実施形態－
本発明の第２実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）微小管と、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に（ｃ）モータータンパク質を添加して、微小管を含む集合体を形成させる。
本発明の第２実施形態に係る微小管含有集合体形成方法では、（ａ）微小管と、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体とを含む液中に（ｃ）モータータンパク質を添加して、微小管を含む集合体を形成させる。
【0031】
以下、上述の方法に供される（ａ）微小管、（ｂ）デオキシリボ核酸集合体、（ｃ）モータータンパク質について詳述する。なお、これらの構成成分は、それぞれ容器詰めされて微小管含有集合体形成キットとされてもよい。
【0032】
（ａ）微小管
第２実施形態に係る微小管は、未修飾の微小管であって、第１デオキシリボ核酸の一本鎖が表面に修飾されていることはない。微小管については、第１実施形態で説明した通りであるため、ここでは省略する。
第２実施形態に係る微小管は、未修飾の微小管であって、第１デオキシリボ核酸の一本鎖が表面に修飾されていることはない。微小管については、第１実施形態で説明した通りであるため、ここでは省略する。
【0033】
（ｂ）デオキシリボ核酸集合体
第２実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体は、第１実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体と同様のものである。デオキシリボ核酸集合体の表面にデオキシリボ核酸の一本鎖を修飾する手法については後ほど、実施例を示しながら詳述する。
第２実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体は、第１実施形態に係るデオキシリボ核酸集合体と同様のものである。デオキシリボ核酸集合体の表面にデオキシリボ核酸の一本鎖を修飾する手法については後ほど、実施例を示しながら詳述する。
【0034】
（ｃ）モータータンパク質
第２実施形態に係るモータータンパク質は、第１実施形態に係るモータータンパク質と同様であるため、以下説明を省略する。
第２実施形態に係るモータータンパク質は、第１実施形態に係るモータータンパク質と同様であるため、以下説明を省略する。
【0035】
＜実施例＞
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に限定されることはない。
【実施例1】
【0036】
１．要素成分の調製
（１）ＤＮＡ修飾微小管の調製
銅フリークリック反応により、微小管にＤＮＡ一本鎖を修飾した。その後、ＤＮＡ修飾微小管を観察する目的でＤＮＡを蛍光染料で標識処理した。具体的には、以下の通りである。
（１）ＤＮＡ修飾微小管の調製
銅フリークリック反応により、微小管にＤＮＡ一本鎖を修飾した。その後、ＤＮＡ修飾微小管を観察する目的でＤＮＡを蛍光染料で標識処理した。具体的には、以下の通りである。
【0037】
（１－１）チューブリンの精製
高濃度のＰＩＰＥＳ緩衝液（１Ｍ ＰＩＰＥＳ，２０ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。）を用いてブタ脳からチューブリンを精製した。
高濃度のＰＩＰＥＳ緩衝液（１Ｍ ＰＩＰＥＳ，２０ｍＭ ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。）を用いてブタ脳からチューブリンを精製した。
【0038】
（１－２）アジド基修飾チューブリンの調製
Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステルを用いてアジド基標識チューブリンを調製した。このように、Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステルがチューブリンのアミノ基（－ＮＨ２）と反応すると、安定なアミド結合が形成され、Ｎ３－チューブリンが調製される。なお、このとき、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）が遊離する。
Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステルを用いてアジド基標識チューブリンを調製した。このように、Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステルがチューブリンのアミノ基（－ＮＨ２）と反応すると、安定なアミド結合が形成され、Ｎ３－チューブリンが調製される。なお、このとき、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）が遊離する。
【0039】
（１－３）標識方法
２００μＬのチューブリン、３８．８μＬの２倍脳再結合緩衝液（ＢＲＢ８０）、５．６μＬの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５．６ｍＬの１００ｍＭ ＧＴＰを小型の遠沈管に投入して溶液を調製した（なお、ここでは、標識処理および測定は、２００μＬのチューブリンを用いて行われた。）。なお、２倍ＢＲＢ８０は、１６０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２．０ｍＭ ＥＧＴＡの混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。そして、その溶液は、氷上で５分間インキュベートされた。その後、その溶液は、２℃の温度下、３５，０００ｒｐｍの速度で遠心分離処理された。なお、遠心分離処理開始前に、ローターおよび遠心分離機の内部の温度を２℃に保った。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて、液部分を採取した。そして、その液部分に２７．６μＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１００％ＤＭＳＯ）を加え、次いで、それらを３７℃の温度の水槽中で混ぜてから１５分間インキュベートした。さらに、３２０μＬの２０．０ｍＭ Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステル溶液（乾燥ＤＭＳＯ中）をチューブリンに添加し、３７℃の温度の水槽中で混ぜてから４０分間インキュベートした。なお、このインキュベーション中、１０分おきに（すなわち３回）撹拌を行った。そして、その溶液を３７℃の温度下、５４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。上澄み（液部分）を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。溶液（上澄みとペレット）の総体積は３０９．６μＬ（２５０．０μＬ＋２７．６μＬ＋３２．０μＬ）であった。すなわち、ペレットの体積＝総体積－上澄みの体積であった。その体積のペレットに１倍のＢＲＢ８０（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１．０ｍＭ ＥＧＴＡの混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。）を加えて２倍にし、マイクロピペットで溶液を調製した。なお、ペレットを溶解させる際、泡が立たないように注意した。そして、氷上で１時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を４℃の温度下、３５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この段階で、チューブリン溶液（チューブリン）の体積は、３６．０μＬであった。その後、そのチューブリン溶液に、３６．０μＬのチューブリン、７．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、１．０μＬの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０μＬの１００ｍＭ ＧＴＰおよび５．０μＬの乾燥ＤＭＳＯを加えた。次いで、それらを３７℃の温度の水槽中で１５分間インキュベートした。そして、その溶液を３７℃の温度下、５４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。上澄み（液部分）を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。上澄みを捨てる前に、上澄みの体積を測定した。そして、その溶液（上澄みとペレット）の総体積は１３９．１μＬであった。すなわち、ペレットの体積＝総体積－上澄みの体積であった。その体積のペレットに同体積の１倍ＢＲＢ８０を加えて、マイクロピペットでペレットを溶解させた。そして、氷上で１時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を４℃の温度下、３５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この液部分が、目的のアジド基標識チューブリンである。
２００μＬのチューブリン、３８．８μＬの２倍脳再結合緩衝液（ＢＲＢ８０）、５．６μＬの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２および５．６ｍＬの１００ｍＭ ＧＴＰを小型の遠沈管に投入して溶液を調製した（なお、ここでは、標識処理および測定は、２００μＬのチューブリンを用いて行われた。）。なお、２倍ＢＲＢ８０は、１６０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２．０ｍＭ ＥＧＴＡの混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。そして、その溶液は、氷上で５分間インキュベートされた。その後、その溶液は、２℃の温度下、３５，０００ｒｐｍの速度で遠心分離処理された。なお、遠心分離処理開始前に、ローターおよび遠心分離機の内部の温度を２℃に保った。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて、液部分を採取した。そして、その液部分に２７．６μＬの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１００％ＤＭＳＯ）を加え、次いで、それらを３７℃の温度の水槽中で混ぜてから１５分間インキュベートした。さらに、３２０μＬの２０．０ｍＭ Ｎ３－ＮＨＳ－ＰＥＧエステル溶液（乾燥ＤＭＳＯ中）をチューブリンに添加し、３７℃の温度の水槽中で混ぜてから４０分間インキュベートした。なお、このインキュベーション中、１０分おきに（すなわち３回）撹拌を行った。そして、その溶液を３７℃の温度下、５４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。上澄み（液部分）を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。溶液（上澄みとペレット）の総体積は３０９．６μＬ（２５０．０μＬ＋２７．６μＬ＋３２．０μＬ）であった。すなわち、ペレットの体積＝総体積－上澄みの体積であった。その体積のペレットに１倍のＢＲＢ８０（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ，１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１．０ｍＭ ＥＧＴＡの混合液であって、ＫＯＨでｐＨが６．８に調整されている。）を加えて２倍にし、マイクロピペットで溶液を調製した。なお、ペレットを溶解させる際、泡が立たないように注意した。そして、氷上で１時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を４℃の温度下、３５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この段階で、チューブリン溶液（チューブリン）の体積は、３６．０μＬであった。その後、そのチューブリン溶液に、３６．０μＬのチューブリン、７．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、１．０μＬの２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０μＬの１００ｍＭ ＧＴＰおよび５．０μＬの乾燥ＤＭＳＯを加えた。次いで、それらを３７℃の温度の水槽中で１５分間インキュベートした。そして、その溶液を３７℃の温度下、５４，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。上澄み（液部分）を捨てて、ペレットの体積を以下の通りに測定した。上澄みを捨てる前に、上澄みの体積を測定した。そして、その溶液（上澄みとペレット）の総体積は１３９．１μＬであった。すなわち、ペレットの体積＝総体積－上澄みの体積であった。その体積のペレットに同体積の１倍ＢＲＢ８０を加えて、マイクロピペットでペレットを溶解させた。そして、氷上で１時間、その溶液をインキュベートした。その後、その溶液を４℃の温度下、３５，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離処理した。遠心分離処理完了後、固形のペレットを捨てて液部分を採取した。この液部分が、目的のアジド基標識チューブリンである。
【0040】
（１－４）アジド基標識チューブリンの確認
紫外線分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００ｃ）を用いてアジド基標識チューブリンの濃度を測定した。アジド基標識チューブリンが吸光を示す２８０．０ｎｍ波長で吸光度を測定した。その結果、アジド基標識チューブリンの濃度の濃度は５０６．７３μＭであった。
紫外線分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００ｃ）を用いてアジド基標識チューブリンの濃度を測定した。アジド基標識チューブリンが吸光を示す２８０．０ｎｍ波長で吸光度を測定した。その結果、アジド基標識チューブリンの濃度の濃度は５０６．７３μＭであった。
【0041】
（１－５）クリック反応によるＤＮＡ修飾微小管の調製
ＤＮＡ修飾微小管を調製する目的で、先ず、重合試薬ＧＴＰ（グアノシン－５'－三リン酸）またはＧＭＰＣＰＰ（グアノシン－５’［（ａ，ｂ）－メチレノ］三リン酸）のプレミックスを用いてチューブリンを重合し、アジド基標識微小管を調製した。なお、ＧＴＰのプレミックスは１０．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、２．０μＬの純水、１．０μＬの１００．０ｍＭ ＧＴＰ、２．０μＬの２００．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５．０μＬのＤＭＳＯを混ぜ合わせて調製し、ＧＭＰＣＰＰのプレミックスは５．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、３．０μＬの純水、１．０μＬの１００．０ｍＭ ＧＭＰＣＰＰおよび１．０μＬの２００．０ｍＭ ＭｇＣｌ２を混ぜ合わせて調製した。具体的には、４．０μＬのアジド基標識チューブリンに１．０μＬのプレミックスを添加して３７℃の温度下、３０分間インキュベートしてアジド基標識微小管を調製した。
ＤＮＡ修飾微小管を調製する目的で、先ず、重合試薬ＧＴＰ（グアノシン－５'－三リン酸）またはＧＭＰＣＰＰ（グアノシン－５’［（ａ，ｂ）－メチレノ］三リン酸）のプレミックスを用いてチューブリンを重合し、アジド基標識微小管を調製した。なお、ＧＴＰのプレミックスは１０．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、２．０μＬの純水、１．０μＬの１００．０ｍＭ ＧＴＰ、２．０μＬの２００．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５．０μＬのＤＭＳＯを混ぜ合わせて調製し、ＧＭＰＣＰＰのプレミックスは５．０μＬの２倍ＢＲＢ８０、３．０μＬの純水、１．０μＬの１００．０ｍＭ ＧＭＰＣＰＰおよび１．０μＬの２００．０ｍＭ ＭｇＣｌ２を混ぜ合わせて調製した。具体的には、４．０μＬのアジド基標識チューブリンに１．０μＬのプレミックスを添加して３７℃の温度下、３０分間インキュベートしてアジド基標識微小管を調製した。
【0042】
重合完了後、０．５μＬの１．０ｍＭ ｔａｘｏｌおよび１．０μＬの４倍ＢＲＢ８０をその溶液に加え、微小管の安定性を向上させた。クリック反応を開始させるために、染料ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）共役ＤＮＡ（ＤＮＡ塩基配列：ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧ（ＴＴＧ単位の５回繰り返し））をその溶液に添加して、アジド－アルキン環化反応を行った。ＤＮＡ修飾微小管５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）または５’，６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）標識ＤＮＡが微小管の修飾に用いられた。なお、クリック反応は、３７℃の温度下で６時間インキュベートすることにより行われた（以下の化学反応式参照）。
【0043】
【化1】
【0044】
１００．０μＬのクッション緩衝液（８０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ ＥＧＴＡおよび０．５ｍｇ／ｍＬのカゼインの混合液である。）を用いて、３７℃の温度下、５４，０００ｒｐｍで１時間、遠心分離処理することにより、残存する一本鎖ＤＢＣＯ－ＤＮＡの相とＤＮＡ修飾微小管とを分離した。遠心分離処理完了後、直ぐに上澄みを取り除き、ＤＮＡ修飾微小管のペレットを洗浄して、１５．０μＬのＢＲＢ８０Ｐ（５００．０μＬの２倍ＢＲＢ８０，４９０．０μＬの純水および１０．０μＬの１．０ｍＭ Ｔａｘｏｌの混合液である。）で静かに懸濁させた。
【0045】
（１－６）ＤＮＡ修飾微小管の確認
ＤＮＡ修飾微小管の存在を確認する目的で、ＤＮＡ修飾微小管の吸光度を測定した。その措定結果を図１に示す。なお、サンプルの解重合後のＤＮＡの最大吸収波長は２６０．０ｎｍであり、微小管の最大吸収波長は２８０ｎｍであった。微小管に対するＤＮＡの濃度および標識比は、ピークの逆重畳処理およびガウス分布関数を用いることによって見積もられた。なお、標識比は、～９０％－１００％のＢｅｅｒ－ｌａｍｂｅｒｔ法から決定されたＤＮＡおよび微小管の濃度から計算された。そして、調製されたＤＮＡ修飾微小管は、暗所に保管された。このＤＮＡ修飾微小管は、１週間の間使用することができる。
ＤＮＡ修飾微小管の存在を確認する目的で、ＤＮＡ修飾微小管の吸光度を測定した。その措定結果を図１に示す。なお、サンプルの解重合後のＤＮＡの最大吸収波長は２６０．０ｎｍであり、微小管の最大吸収波長は２８０ｎｍであった。微小管に対するＤＮＡの濃度および標識比は、ピークの逆重畳処理およびガウス分布関数を用いることによって見積もられた。なお、標識比は、～９０％－１００％のＢｅｅｒ－ｌａｍｂｅｒｔ法から決定されたＤＮＡおよび微小管の濃度から計算された。そして、調製されたＤＮＡ修飾微小管は、暗所に保管された。このＤＮＡ修飾微小管は、１週間の間使用することができる。
【0046】
（２）ＤＮＡ修飾ＤＮＡオリガミチューブの調製
足場鎖としてのＭ１３ ｍｐ１８ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社製，製品コード３５１８，鎖長７，２４９，参考文献：Yanish-Perron, C.,Vieira,J., and Messing, J.Gene. (1985) 33: 103-119），５ｎＭ～１０ｎＭ、ステープル鎖としての各１本鎖ＤＮＡ（１６～６７塩基長の化学合成１本鎖ＤＮＡ（塩基配列：［配列表］の記載参照。表面に露出させるＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（ＣＡＡ単位の５回繰り返し）ユニットを含む）、計１７７本） ５等量～１００等量、液量 ５０μＬ～１００μＬを濃度条件内に収まるよう全て混合した。
足場鎖としてのＭ１３ ｍｐ１８ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（タカラバイオ株式会社製，製品コード３５１８，鎖長７，２４９，参考文献：Yanish-Perron, C.,Vieira,J., and Messing, J.Gene. (1985) 33: 103-119），５ｎＭ～１０ｎＭ、ステープル鎖としての各１本鎖ＤＮＡ（１６～６７塩基長の化学合成１本鎖ＤＮＡ（塩基配列：［配列表］の記載参照。表面に露出させるＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（ＣＡＡ単位の５回繰り返し）ユニットを含む）、計１７７本） ５等量～１００等量、液量 ５０μＬ～１００μＬを濃度条件内に収まるよう全て混合した。
【0047】
また、その混合ＤＮＡに１０倍のＴＡＥ／Ｍｇ２＋緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ 酢酸、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１２５ｍＭ 酢酸マグネシウムの混合液である。）を加えて、ＤＮＡの１倍ＴＡＥ／Ｍｇ２＋緩衝溶液を調製した。これをＰＣＲ用のサーマルサイクラーを用いて－１℃／分で９０℃から２５℃まで徐冷することによって、アニーリングを行った。なお、例えば、Ｍ１３ ｍｐ１８ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡに対して各１本鎖ＤＮＡを１０等量用いて、濃度５ｎＭ、形成量５０μＬのＤＮＡオリガミチューブ（６ＨＢ）を形成する場合、５ｎＭ Ｍ１３ｍｐ１８ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ、５０ｎＭの各１本鎖ＤＮＡ（２６７本）、５μＬの１０倍ＴＡＥ／Ｍｇ２＋緩衝液および減菌水（５０μＬ以下）を混ぜ合わせる。
【0048】
そして、最終濃度が上述の数値になるよう、各構成要素のストック溶液を所定量ＰＣＲチューブの中で混合し、それを、ＰＣＲサーマルサイクラーを用いて９０℃から２５℃まで－１℃／分の速度で徐冷する。最後に、ｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－４００ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケア）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、過剰の１本鎖ＤＮＡを除去した。構造の形成は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて、マイカ基板上、１倍のＴＡＥ／Ｍｇ２＋緩衝液による液中観察で確認した。なお、本実施例に係るＤＮＡオリガミチューブでは、図２に示されるように、二重螺旋体が６本集まって管状体を形成している。そして、図２に示されるように、理論的にはその高さは６ｎｍであって、長さは３９１ｎｍである。図３には、本実施例に係るＤＮＡオリガミチューブの原子間力顕微鏡写真を示した。この写真から、長さの異なる細長い構造体が多数形成されていることが明らかとなった。なお、長い構造体は塩基同士がスタッキングにより二量化したものであると思われる。図４には、ＤＮＡオリガミチューブの高さ測定時のチャート図が示されている。このチャート図から本実施例に係るＤＮＡオリガミチューブの高さは３～４ｎｍであることが明らかとなった。理論値よりは僅かに低い値であるが、測定時に圧縮されたことが原因であると考えられる。また、図５には、ＤＮＡオリガミチューブの長さ測定時のチャート図が示されている。このチャート図から本実施例に係るＤＮＡオリガミチューブの長さは３５０ｎｍ程度であり、理論値に近い値が示されていることが明らかとなった。以上より、目的のＤＮＡオリガミチューブが形成されているものと思われた。
【0049】
２．微小管を含む集合体の形成
２０ｎＭ、２００ｎＭおよび２，０００ｎＭの各ＤＮＡ修飾微小管に４ｎＭのＤＮＡ修飾ＤＮＡオリガミチューブを添加したところ、２４時間後に十数μｍサイズの放射状の集合体が形成された（図６および図７参照。）。また、この集合体中にキネシンを添加したところ、更に大きなサイズの集合体が形成された（図８参照）。このため、本実施例において、ＤＮＡオリガミチューブに対して多数の微小管を固定することが明らかとなった。
２０ｎＭ、２００ｎＭおよび２，０００ｎＭの各ＤＮＡ修飾微小管に４ｎＭのＤＮＡ修飾ＤＮＡオリガミチューブを添加したところ、２４時間後に十数μｍサイズの放射状の集合体が形成された（図６および図７参照。）。また、この集合体中にキネシンを添加したところ、更に大きなサイズの集合体が形成された（図８参照）。このため、本実施例において、ＤＮＡオリガミチューブに対して多数の微小管を固定することが明らかとなった。
【実施例2】
【0050】
ＤＮＡ未修飾の微小管に、実施例１で調整したＤＮＡ修飾ＤＮＡオリガミチューブを添加したところ、２４時間後でも変化は見られなかったが（図９の上段の二図を参照。）、そこにキネシンを添加すると、数十μｍの線状の集合体が形成された（図９の下段の二図を参照。）。このため、本実施例において、ＤＮＡオリガミチューブに対して多数の微小管を固定することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明に係る微小管含有集合体形成方法は、多数の微小管を固定することができるという特徴を有し、人工筋肉や表示素子等への応用が期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】