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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-22
(45)【発行日】2022-08-30
(54)【発明の名称】ガス発酵生成物のための方法およびバイオリアクター
(51)【国際特許分類】
C12P 7/62 20220101AFI20220823BHJP
C12M 1/113 20060101ALI20220823BHJP
【ＦＩ】
C12P7/62
C12M1/113
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2019551766
(86)(22)【出願日】2017-12-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-23
(86)【国際出願番号】 IB2017057696
(87)【国際公開番号】W WO2018109620
(87)【国際公開日】2018-06-21
【審査請求日】2020-12-07
(31)【優先権主張番号】62/433,748
(32)【優先日】2016-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】501052498
【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ハワイ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(72)【発明者】
【氏名】ユ ジャン
(72)【発明者】
【氏名】ムナシンゲ プラディープ
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２４９２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／０４３８２９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開昭６１－１７３７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５３８６８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０００－２６２８４６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ７／００
Ｃ１２Ｍ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出し、これを、少なくとも１個のスタティックミキサー（７）を備える循環ライン（６）を通して前記容器（２）の外部で循環させ、かつ、気相（１５）中に再び導入するステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を、前記循環ライン（６）に循環される前記液体発酵ブロス（１１）に供給し、前記ガス状基質（１４）を、前記少なくとも１個のスタティックミキサー（７）において前記液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｄ）こうして得られた気液混合物を前記ガス発酵容器（２）中に噴霧し、前記ガス発酵微生物を培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器（２）から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出し、これを、循環ライン（６）を通して前記容器（２）の外部で循環させ、かつ、気相（１５）中に再び導入するステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を、前記ガス発酵容器（２）の前記気相（１５）に導入することによって前記気相（１５）へ供給するステップと、
ｄ）前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）を、前記気相（１５）中へ噴霧して、噴霧された液滴形態の前記液体発酵ブロス（１１）と前記気相（１５）中に供給された前記ガス状基質（１４）とを接触させ、前記ガス発酵微生物を、気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
【請求項3】
前記液体発酵ブロス（１１）が、２Ｌ／分以上、好ましくは３Ｌ／分以上の循環速度で、抜き出され、前記ガス発酵容器（２）に再び導入される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記循環ライン（６）に循環される前記液体発酵ブロス（１１）に供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記ガス状基質（１４）と混合してもよい、前記液体発酵ブロス（１１）の噴霧が、それぞれ、圧力降下が１．０・１０5Ｐａ以下の、１個または複数のノズル（１２）を通じて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ガス状基質（１４）が煙道ガスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項9】
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記気相（１５）中に１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記容器（２）の内部と連通した注入導管（２５）を通じて、前記気相（１５）へ接続されている、供給システム（３０）
を備え、前記少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）及び供給システム（３０）が、噴霧された液滴形態の前記液体発酵ブロス（１１）と前記気相（１５）中の前記ガス状基質（１４）とが接触するように構成される、ガス発酵バイオリアクター（１）。
【請求項10】
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）中に、１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記循環ライン（６）に接続されることにより、こうして得られた気液混合物が、前記噴霧ノズル（１２）によって、前記容器（２）に存在する前記気相（１５）中に噴霧される、供給システム（３０）
を備え、前記循環ライン（６）が、前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と前記ガス状基質（１４）を混合して、前記気液混合物を生成するための、少なくとも１個のスタティックミキサー（７）を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦支援のＲ＆Ｄに関する声明
本発明は、米国海軍研究事務所から与えられた、政府支援Ｎ０００１４－１０－１－０３１０、Ｎ０００１４－１１－１－０３９１、Ｎ０００１４－１２－１－０４９６、Ｎ０００１４－１３－１－０４６３、Ｎ０００１４－１４－１－００５４、Ｎ０００１４－１５－１－００２８、およびＮ０００１４－１６－１－２１１６で行われた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本発明は、ガス発酵生成物を製造する方法、およびその方法を実施するのに用いることができるバイオリアクターに関する。本発明の方法およびバイオリアクターは、ＣＯ2を含むガス状原料を用いて、微生物ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を製造するのに特に好適である。
本発明は、米国海軍研究事務所から与えられた、政府支援Ｎ０００１４－１０－１－０３１０、Ｎ０００１４－１１－１－０３９１、Ｎ０００１４－１２－１－０４９６、Ｎ０００１４－１３－１－０４６３、Ｎ０００１４－１４－１－００５４、Ｎ０００１４－１５－１－００２８、およびＮ０００１４－１６－１－２１１６で行われた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本発明は、ガス発酵生成物を製造する方法、およびその方法を実施するのに用いることができるバイオリアクターに関する。本発明の方法およびバイオリアクターは、ＣＯ2を含むガス状原料を用いて、微生物ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を製造するのに特に好適である。
【背景技術】
【0002】
化石燃料の燃焼から放出されるＣＯ2は、主要な温室効果ガスである。典型的な煙道ガスは、（容積％）：ＣＯ2（６～１２）、Ｏ2（６～１４）、Ｎ2（６６～７６）、Ｈ2Ｏ（６～１８）、および他の副次的な汚染物質を含む。気候変動についての関心が高まると共に、炭素捕捉および炭素隔離によるＣＯ2排出の低減は、発電所、セメント工場、および一般廃棄物焼却炉などの大型の点煙源にとって重大な難題となる。ＣＯ2を価値ある生成物へ変換することは、貯蔵に対して、魅力ある代替案である。カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）などの水素酸化細菌は、無機独立栄養状態でＨ2およびＯ2を用いることによって、ＣＯ2を固定することができる。Ｈ2およびＯ2は、好都合なことに、太陽エネルギーおよび風力などの再生可能エネルギーを用いた水電解から得ることができるので、それは、ガス発酵を介してＣＯ2からバイオマスを製造する、持続可能な方法である。重要なことには、制御された条件の下、カプリアビダス・ネカトール細胞塊の相当な量（４０～８０質量％）が、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、具体的にはポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）である。微生物細胞中で、エネルギーおよび炭素貯蔵材料として蓄積される、このバイオポリエステルを処理して、熱可塑性樹脂、高品質燃料、アルケン、および芳香族などの、様々な価値ある生成物を得ることができる。水素酸化細菌のガス発酵は、ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2の混合物を用いて、ほぼ独占的に研究されてきた。出願人の知る限りでは、大量のＮ2が、ガス基質濃度を希釈し、バイオリアクターの作動を難しくするために、研究に煙道ガスは用いられなかった。
【0003】
微生物のＣＯ2固定は、ガス状基質の、無機水溶液に懸濁させた微生物細胞（すなわち、発酵ブロス）への物質移動によって制限される。発酵ブロス中の、ガス、特にＨ2およびＯ2の低い溶解度は、高いＣＯ2固定化速度、高い細胞密度、および高いＰＨＢ生産性のためのガス発酵に、大きな技術的難題を課す。従来の通気バイオリアクターにおいて、ガスが下部に導入され、気泡が水溶液中に急速に生じる。気泡周辺の物質移動は、機械的撹拌によって増大させ得るが、高いガス供給速度が、液相における、高いガスホールドアップまたは界面面積を生じるのに必要である。したがって、ガスのほとんどは、排出され、廃棄される。この問題は、密閉式バイオリアクターシステムでガスを再循環させることによって解決することができる。しかし、こうした解決法は、煙道ガスには適用不可能である。
ガス発酵用の、理想のバイオリアクターは、極めて低いガス供給速度であっても、高いガス物質移動係数（ｋLａ）を有するべきである。しかし、従来の撹拌式バイオリアクターにおいて、ｋLａ値は、ガス供給速度の低下と共に減少し、液相における高いエネルギー散逸によって、低いガス供給速度での高いｋLａを保証できないことを意味する。
産業界で、スプレーカラムは、ガス吸収用に用いられてきたが、主に液体溶液中の速い反応、例えば、ＮａＯＨ溶液中のＳＯ2吸収、およびアミン溶液中のＣＯ2吸収のために用いられてきた。そこでは、物質移動抵抗は、主にガス側にある。対照的に、微生物発酵の、ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2の物質移動抵抗は、主に液体側にあり、ガス側の物質移動抵抗よりもさらにより高い。
しかし、出願人の知る限りでは、ノズル噴霧は、微生物発酵で用いられていなかった。
ガス発酵用の、理想のバイオリアクターは、極めて低いガス供給速度であっても、高いガス物質移動係数（ｋLａ）を有するべきである。しかし、従来の撹拌式バイオリアクターにおいて、ｋLａ値は、ガス供給速度の低下と共に減少し、液相における高いエネルギー散逸によって、低いガス供給速度での高いｋLａを保証できないことを意味する。
産業界で、スプレーカラムは、ガス吸収用に用いられてきたが、主に液体溶液中の速い反応、例えば、ＮａＯＨ溶液中のＳＯ2吸収、およびアミン溶液中のＣＯ2吸収のために用いられてきた。そこでは、物質移動抵抗は、主にガス側にある。対照的に、微生物発酵の、ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2の物質移動抵抗は、主に液体側にあり、ガス側の物質移動抵抗よりもさらにより高い。
しかし、出願人の知る限りでは、ノズル噴霧は、微生物発酵で用いられていなかった。
【発明の概要】
【0004】
先行技術の欠点に鑑みて、出願人らは、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などのガス発酵生成物を製造する方法、および極めて少ないガス流量（Ｕs）、すなわちガス供給速度であっても、高いガス物質移動速度を維持しながら作動させることができる、ガス発酵バイオリアクターを提供する問題に向き合った。したがって、バイオリアクター中のガス分子の保持時間を制御して、高い効率の利用をもたらすことができる。
出願人らは、上記の利点、および以下の説明から明らかになる他の利点を、バイオリアクターのガス発酵容器に含まれるオーバーヘッド気相中で、噴霧された液滴形態の発酵ブロス（媒地溶液）を、ガス状基質と接触させることによって成し遂げ得ることを見出した。
接触は、いくつかの方法によって成し遂げることができる。第１の好ましい実施形態において、発酵ブロスを、容器から抜き出し、外部ループを通じて循環させ、その後バイオリアクターに含まれるオーバーヘッド気相中に噴霧することによって、バイオリアクター中に再び導入され、そこで、バイオリアクターの気相に個別に供給されるガス状基質と接触させることになる。発酵ブロスは、例えば正置換ポンプによって、外部ループに運ぶことができる。
出願人らは、上記の利点、および以下の説明から明らかになる他の利点を、バイオリアクターのガス発酵容器に含まれるオーバーヘッド気相中で、噴霧された液滴形態の発酵ブロス（媒地溶液）を、ガス状基質と接触させることによって成し遂げ得ることを見出した。
接触は、いくつかの方法によって成し遂げることができる。第１の好ましい実施形態において、発酵ブロスを、容器から抜き出し、外部ループを通じて循環させ、その後バイオリアクターに含まれるオーバーヘッド気相中に噴霧することによって、バイオリアクター中に再び導入され、そこで、バイオリアクターの気相に個別に供給されるガス状基質と接触させることになる。発酵ブロスは、例えば正置換ポンプによって、外部ループに運ぶことができる。
【0005】
第２の好ましい実施形態において、ガス状基質が外部ループに供給され、したがって気液混合物が得られ、その後気液混合物は、バイオリアクターの気相中に噴霧される。好都合なことに、この第２の実施形態において、外部ループは、高圧下で気液の混合および接触を増進するための、１個または複数のスタティックミキサーを備えることもできる。
本発明のバイオリアクターで達成可能なガス物質移動係数（ｋLａ）を、物理吸収および微生物発酵の条件下で測定して、増大させたガス物質移動速度が示された。物質移動速度は、生物的強化のために、８９％増加した。従来の撹拌式バイオリアクターとは対照的に、本発明のバイオリアクターは、低いエネルギー消費で高いｋLａを示す。ガス物質移動はまた、バイオリアクターの、液体－ガス接触の高い頻度数および小さい噴霧プルーム（ｓｐｒａｙ ｐｌｕｍｅ）によっても増進される。極めて低いガス供給速度でのエネルギー消費は、従来の撹拌式バイオリアクターのものよりもより低い。
好都合なことに、高い液体循環速度を、ノズル前後の小さい圧力降下で作動させて、気相への液体暴露の高い頻度数の維持が可能であることを観測した。ノズル前後の小さい圧力降下は、劇的にエネルギー散逸率を減らすので、これによりエネルギーも節約される。好都合なことに、高いエネルギー散逸率は、高い物質移動速度を確保することはできないが、エネルギーを浪費するので、本発明の噴霧式バイオリアクターでは避けるのが好ましい。
本発明のバイオリアクターで達成可能なガス物質移動係数（ｋLａ）を、物理吸収および微生物発酵の条件下で測定して、増大させたガス物質移動速度が示された。物質移動速度は、生物的強化のために、８９％増加した。従来の撹拌式バイオリアクターとは対照的に、本発明のバイオリアクターは、低いエネルギー消費で高いｋLａを示す。ガス物質移動はまた、バイオリアクターの、液体－ガス接触の高い頻度数および小さい噴霧プルーム（ｓｐｒａｙ ｐｌｕｍｅ）によっても増進される。極めて低いガス供給速度でのエネルギー消費は、従来の撹拌式バイオリアクターのものよりもより低い。
好都合なことに、高い液体循環速度を、ノズル前後の小さい圧力降下で作動させて、気相への液体暴露の高い頻度数の維持が可能であることを観測した。ノズル前後の小さい圧力降下は、劇的にエネルギー散逸率を減らすので、これによりエネルギーも節約される。好都合なことに、高いエネルギー散逸率は、高い物質移動速度を確保することはできないが、エネルギーを浪費するので、本発明の噴霧式バイオリアクターでは避けるのが好ましい。
【0006】
さらに、ガス物質移動が、ノズルチップの下で、主に短距離で生じるために、大きい噴霧プルームを避けることができる。小さい噴霧プルームにより、大きい噴霧オーバーヘッドの費用を節約することになる。
さらに、発酵ブロス中に懸濁させた微生物細胞によるバイオガス消費によって、ガス物質移動を大幅に増大させることができる。
最後に、本発明の噴霧式バイオリアクターを、極めて低いガス供給速度で作動させて、希釈する窒素の存在下でさえも、ガス循環なしでも、ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2からＰＨＡを製造することができる。
以下に、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを製造するための、Ｈ2およびＯ2の存在下での微生物ＣＯ2固定の方法に関して説明される。具体的には、大量の窒素の存在下、または非存在下で、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を、水素、二酸化炭素、および酸素のガス混合物から製造可能であることが観測された。
さらに、発酵ブロス中に懸濁させた微生物細胞によるバイオガス消費によって、ガス物質移動を大幅に増大させることができる。
最後に、本発明の噴霧式バイオリアクターを、極めて低いガス供給速度で作動させて、希釈する窒素の存在下でさえも、ガス循環なしでも、ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2からＰＨＡを製造することができる。
以下に、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを製造するための、Ｈ2およびＯ2の存在下での微生物ＣＯ2固定の方法に関して説明される。具体的には、大量の窒素の存在下、または非存在下で、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）を、水素、二酸化炭素、および酸素のガス混合物から製造可能であることが観測された。
【0007】
しかし、好都合なことに、本発明の方法および上記方法を実施するための関連装置は、やや難溶なガス状基質が用いられる、他の種類の微生物ガス発酵に用いることもできる。
第１の態様によれば、本発明は、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を供給するステップと、
ｄ）気相（１５）中で、噴霧された液滴形態の液体発酵ブロス（１１）をガス状基質（１４）と接触させることによって、ガス状基質（１４）を、ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｅ）ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法に関する。
第１の態様によれば、本発明は、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を供給するステップと、
ｄ）気相（１５）中で、噴霧された液滴形態の液体発酵ブロス（１１）をガス状基質（１４）と接触させることによって、ガス状基質（１４）を、ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｅ）ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法に関する。
【0008】
好ましい一実施形態において、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法は、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を供給し、ガス状基質（１４）を、ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｄ）こうして得られた気液混合物をガス発酵容器（２）中に噴霧し、ガス発酵微生物を培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む。
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を供給し、ガス状基質（１４）を、ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｄ）こうして得られた気液混合物をガス発酵容器（２）中に噴霧し、ガス発酵微生物を培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む。
【0009】
さらに好ましい一実施形態において、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法は、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を、気相（１５）へ供給するステップと、
ｄ）ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）を、気相（１５）中へ噴霧するステップと、
ｅ）ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む。
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）ガス発酵容器（２）から液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2を含むガス状基質（１４）を、気相（１５）へ供給するステップと、
ｄ）ガス発酵容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）を、気相（１５）中へ噴霧するステップと、
ｅ）ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）細胞塊から少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む。
【0010】
好ましくは、液体発酵ブロスは、０．５分以内の、好ましくは０．３分以内の液体保持時間をもたらす循環速度で、抜き出され、ガス発酵容器に再び導入される。液体保持時間は、バイオリアクターの液体容積を液体循環速度で割ることによって決定される。
好ましくは、上記ガス状基質は、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、ガス発酵容器に供給される。
好ましくは、液体発酵ブロス、またはガス状基質によって生成された気液混合物、および発酵ブロスを気相中に噴霧するステップは、それぞれ、圧力降下１．０・１０5Ｐａ以下の、１個または複数のノズルを通じて実施される。
好ましくは、上記ガス状基質は、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、ガス発酵容器に供給される。
好ましくは、液体発酵ブロス、またはガス状基質によって生成された気液混合物、および発酵ブロスを気相中に噴霧するステップは、それぞれ、圧力降下１．０・１０5Ｐａ以下の、１個または複数のノズルを通じて実施される。
【0011】
好ましくは、ガス状基質が、少なくとも１個のスタティックミキサーにおいて、ガス発酵容器から抜き出された液体発酵ブロスと混合されて、ガス発酵容器中に噴霧される気液混合物を生成する。
好ましくは、ガス状基質は、煙道ガス、すなわち、燃焼過程によって生じるガス流である。
好ましくは、ガス状基質は、煙道ガス、すなわち、燃焼過程によって生じるガス流である。
【0012】
さらなる一態様によれば、本発明は、
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 容器（２）の内部と連通し、それによって液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、導管（１９）が、液体発酵ブロス（１１）の上記一定分量を、容器（２）の外部で循環させ、次いで、容器（２）に含まれる気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続された、導管（１９）
－ 液体発酵ブロス（２）を気相（１５）中に噴霧するための、排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 気相（１５）中に１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、容器（２）の内部と連通した注入導管（２５）を通じて、気相（１５）へ接続された、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）に関する。
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 容器（２）の内部と連通し、それによって液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、導管（１９）が、液体発酵ブロス（１１）の上記一定分量を、容器（２）の外部で循環させ、次いで、容器（２）に含まれる気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続された、導管（１９）
－ 液体発酵ブロス（２）を気相（１５）中に噴霧するための、排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 気相（１５）中に１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、容器（２）の内部と連通した注入導管（２５）を通じて、気相（１５）へ接続された、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）に関する。
【0013】
さらなる一態様によれば、本発明は、
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 容器（２）の内部と連通し、それによって液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、導管（１９）が、液体発酵ブロス（１１）の上記一定分量を、容器（２）の外部で循環させ、次いで、容器（２）に含まれる気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続された、導管（１９）
－ 液体発酵ブロス（１１）を気相（１５）中に噴霧するための、排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）中に、１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、こうして得られた気液混合物を、上記噴霧ノズル（１２）によって、容器（２）に含まれる気相（１５）中に噴霧するように、循環ライン（６）に接続された、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）に関する。
－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 容器（２）の内部と連通し、それによって液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、導管（１９）が、液体発酵ブロス（１１）の上記一定分量を、容器（２）の外部で循環させ、次いで、容器（２）に含まれる気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続された、導管（１９）
－ 液体発酵ブロス（１１）を気相（１５）中に噴霧するための、排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）中に、１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、こうして得られた気液混合物を、上記噴霧ノズル（１２）によって、容器（２）に含まれる気相（１５）中に噴霧するように、循環ライン（６）に接続された、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）に関する。
【0014】
好ましくは、循環ライン（６）は、容器（２）から抜き出された液体発酵ブロス（１１）とガス状基質（１４）を混合して、気相（１５）中に噴霧される気液混合物を生成するための、１個または複数のスタティックミキサー（７）を備える。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一実施形態の、噴霧式バイオリアクター（ＳＮＢＲ）の概略構造を示す図である。
【図2】２個のスタティックミキサーおよびサイドラインガス導入を備えた噴霧ノズルバイオリアクター（ＳＮＳＭＢＲ）の模式図である。
【図3】溶存酸素濃度の段階的変化における、光学ＤＯ（溶存酸素）プローブの応答時間経過を示す図である。
【図4】M. Nocentini, D. Fajner, G. Pasquali, F. Magelli, Ind. Eng. Chem. Res. 32 (1993) 19-26（α＝０．００８３、β＝０．６２、およびγ＝０．４９）ならびにY. Kawse, M. Moo-Yong, Chem. Eng. Res. Des. 66 (1988) 284-288（α＝０．０１２６、β＝０．６５、およびγ＝０．５）に記載の、噴霧式バイオリアクターおよび従来の撹拌式バイオリアクターにおける、表面ガス速度０．０００２８ｍ／秒での容積物質移動係数および電力損を示す図である。
【図5】窒素の非存在下での、注入ガスＩ（表１）に伴う発酵時間経過：（Ａ）バイオマス濃度、残留バイオマス濃度、およびＰＨＢ含量、（Ｂ）瞬間細胞収量および累積細胞収量および溶存酸素濃度、ならびに（Ｃ）比増殖速度を示す図である。
【図6】窒素の存在下での、注入ガスＩＩＩ（表１）に伴う発酵時間経過：（Ａ）バイオマス濃度、残留バイオマス、およびＰＨＢ含量、（Ｂ）瞬間細胞収量および累積細胞収量および溶存酸素濃度（ＤＯ）、ならびに（Ｃ）比増殖速度を示す図である。
【図7】微生物発酵用の従来の撹拌式バイオリアクター（ＣＳＢＲ）の概略構造を示す図である。
【図9】従来の充填層吸収カラムバイオリアクター（従来のガス吸収装置－ＣＧＡ）の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
ガス－液相間にわたって、濃度駆動力の下、物質移動が生じる。抵抗二重境膜説（ｔｗｏ ｆｉｌｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｈｅｏｒｙ）によれば、やや難溶なガス、例えばＯ2、Ｈ2、およびＣＯ2の物質移動抵抗は、主に液体膜にあり、物質流束（Ｎi）は式１によって決まる
（式中、ｋi,Lは、ガス「ｉ」の液相物質移動係数であり、Ｐiは気相の分圧であり、Ｈiはヘンリー定数であり、Ｃi,L
*は平衡濃度（ｋｍｏｌ ｍ-3）であり、Ｃi,Lは液相の濃度である）。Ｗｈｉｔｍａｎの境膜モデルによれば、やはり式２に示すように、物質移動係数（ｋi,L）は、水中のガス「ｉ」の分子拡散率（Ｄi,L）および液体側物質移動抵抗（ＲL）によって決定されることが示される。
【数1】
【数2】
【0017】
本研究において、Ｏ2の容積物質移動係数（ｋLａ）のみが、信頼できるプローブを用いて測定されたが、酸素のｋLａを用いて、水中の、その分子拡散率から、Ｈ2およびＣＯ2のｋLａを見出すことができる（式３）。
噴霧式バイオリアクターの容積酸素利用速度（ＯＵＲ）は、式１によって表される酸素流束（Ｎ）、全有効界面面積（Ａe）、および液体容積（ＶL）によって決定されることが示される（式４）
（式中、「ａ」は、液体容積（Ａe／ＶL）あたりの有効界面面積であり、ＰoおよびＨoは、酸素の分圧およびヘンリー定数であり、Ｃ*
Lは、Ｐoでの酸素の平衡濃度であり、ＣLは、液相の溶存酸素濃度である）。
【数3】
【数4】
【0018】
化学反応と同様に、液体溶液中の微生物細胞によるバイオガス消費もまた、物質移動抵抗（ＲL）を減らし、ゆえに物質移動係数（ｋLａ）を増大させることがある。増大因子（Ｅ）は、以下に定められる（式５）
（式中、添字ＢｉｏおよびＰｈｙは、それぞれ、水中のバイオガス利用および物理吸収の条件下でのｋLａ値を示す）。
図１および図２は、本発明の２つの実施形態の、ノズル噴霧式バイオリアクター１を概略的に表したものである。下部の丸型ガラス容器２（φ１５ｃｍ、３Ｌ）に水溶液（発酵ブロス）１１（０．５～１．５Ｌ）を入れ、磁器撹拌器および加熱器３で撹拌し、加熱した。ガス状基質１４を２つの方法でバイオリアクターに導入することができる。図１のＳＮＢＲ構成であれば、ガス状基質１４は導管２５を通じて容器２へ供給される。図２のＳＮＳＭＢＲ構成では、ガス状基質１４は外部ループ６中に導入される。
【数5】
（式中、添字ＢｉｏおよびＰｈｙは、それぞれ、水中のバイオガス利用および物理吸収の条件下でのｋLａ値を示す）。
図１および図２は、本発明の２つの実施形態の、ノズル噴霧式バイオリアクター１を概略的に表したものである。下部の丸型ガラス容器２（φ１５ｃｍ、３Ｌ）に水溶液（発酵ブロス）１１（０．５～１．５Ｌ）を入れ、磁器撹拌器および加熱器３で撹拌し、加熱した。ガス状基質１４を２つの方法でバイオリアクターに導入することができる。図１のＳＮＢＲ構成であれば、ガス状基質１４は導管２５を通じて容器２へ供給される。図２のＳＮＳＭＢＲ構成では、ガス状基質１４は外部ループ６中に導入される。
【0019】
ガス発酵実証において、溶液のｐＨを、塩基溶液（２Ｍアンモニアまたは２ＭＮａＯＨ）で調節した。排出液排出導管１９に接続された隔膜ポンプ４（最大流量４．９Ｌ／分）により、液体発酵ブロスがプレキシガラスシリンダー５（φ２０ｃｍ×２３ｃｍ、６Ｌ）の頂上に設置されたノズル１２へ運ばれた。液体は、容器２に含まれる気相１５中で、フルコーンプルーム（９０°）に噴霧され、液体プール１１に戻された。ガス流１４は、供給システム３０によって液体循環ライン６に導入され、ノズル１２を通じて気相１５中に噴霧された。図２の実施形態において、ガス流１４は、２個のスタティックミキサー７の前に、供給システム３０によって液体循環ライン６に導入され、ノズル１２を通じて、容器２に含まれる気相１５中に、液体と共に噴霧された。この両方の実施形態において、ガス流量および組成は、それぞれのガスの流量によって制御された。空気およびＮ2は、ニードル弁および流量計（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）で調節された。ＣＯ2、Ｈ2、およびＯ2は、３個の質量流量計（Ａｌｉｃａｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）で制御された。バイオリアクターを１種の雰囲気下で作動させ、放出ガス２０の流量を石鹸膜計で測定し、排気管を通してドラフトに放出した。微生物ガス消費のない空白対照において、注入ガスおよび放出ガスは、等しいモル流量（＜±５％）を有した。
【0020】
噴霧プルームの物質移動に対する影響は、ノズルがガラス容器の頂上に直接設置された場合にも調べられた。ノズルチップから液面までの距離「Ｘ」は、約１０ｃｍ短くなり、噴霧プルームの容積は、８０％減少した。
水中の酸素の物理吸収
水または無機溶液（すなわち、水および微生物を培養する栄養分を含む発酵性媒地）中の酸素の物理吸収のｋLａは、動的方法で測定された。液体溶液（１．５Ｌ）は、溶存酸素濃度が０に低下するまでＮ2でストリップされた。その後、空気が０．３Ｌ／分（２５℃、１ａｔｍ）で導入された。溶存酸素濃度は光学ＤＯプローブ（ＰｒｏＯＤＯ、ＹＳＩ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ）を用いて追跡された。ｋLａは、式６で計算された
（式中、ＣL
*は、空気下での飽和酸素濃度であり、ＣLは、時間ｔでの溶存酸素濃度であり、ＣL,0は、測定が記録されたときの初期酸素濃度である）。プローブの応答時間は、濃度の段階的変化にさらすとき、プローブが、最終値である６３．２％に到達するのにかかる時間として定められる。応答時間が（ｋLａ）-1以下であるとき、測定を信頼することができる。図３は、溶存酸素濃度の段階的変化にさらしたときの、ＤＯプローブの応答時間曲線である。実験条件でのプローブの応答時間は、約６秒であり、したがって動的方法で測定可能な、最大のｋLａは、０．１７／秒または６００／時間であった。
水中の酸素の物理吸収
水または無機溶液（すなわち、水および微生物を培養する栄養分を含む発酵性媒地）中の酸素の物理吸収のｋLａは、動的方法で測定された。液体溶液（１．５Ｌ）は、溶存酸素濃度が０に低下するまでＮ2でストリップされた。その後、空気が０．３Ｌ／分（２５℃、１ａｔｍ）で導入された。溶存酸素濃度は光学ＤＯプローブ（ＰｒｏＯＤＯ、ＹＳＩ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ）を用いて追跡された。ｋLａは、式６で計算された
【数6】
【0021】
酸素物質移動の微生物による増強
微生物ガス発酵の酸素物質移動速度は、定常（または準定常）作動条件の下、酸素利用速度（ＯＵＲ）を測定することによって決定された。発酵ブロスとして、ＫＨ2ＰＯ4２．４ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4２．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５ｇ、ＮａＣｌ１．０ｇ、ＮａＨＣＯ3０．５ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．１ｇ、および微量元素溶液１ｍＬを含む（毎リットル）無機溶液中に増殖したカプリアビダス・ネカトールの実験室用株を用いた。媒地溶液は、同じ媒地溶液で調製された１００ｍＬ瓶培養で、初期光学密度（ＯＤ）０．９１まで植菌された。瓶（１Ｌ）を、Ｈ2（７０％）、Ｏ2（２０％）、およびＣＯ2（１０％）のガス混合物で２４時間毎にフラッシュし、回転培養器で、３０℃、２００ｒｐｍで振盪した。
微生物ガス発酵の酸素物質移動速度は、定常（または準定常）作動条件の下、酸素利用速度（ＯＵＲ）を測定することによって決定された。発酵ブロスとして、ＫＨ2ＰＯ4２．４ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4２．５ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4１．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．５ｇ、ＮａＣｌ１．０ｇ、ＮａＨＣＯ3０．５ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．１ｇ、および微量元素溶液１ｍＬを含む（毎リットル）無機溶液中に増殖したカプリアビダス・ネカトールの実験室用株を用いた。媒地溶液は、同じ媒地溶液で調製された１００ｍＬ瓶培養で、初期光学密度（ＯＤ）０．９１まで植菌された。瓶（１Ｌ）を、Ｈ2（７０％）、Ｏ2（２０％）、およびＣＯ2（１０％）のガス混合物で２４時間毎にフラッシュし、回転培養器で、３０℃、２００ｒｐｍで振盪した。
【0022】
噴霧式バイオリアクターの媒地溶液（０．５Ｌ）を、１５０ｒｐｍで撹拌し、その温度およびｐＨを、それぞれ３５℃および６．８で維持した。液体は、隔膜ポンプ（ＮＦ３００、ＫＮＦ Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を用いて１．２Ｌ／分で循環させ、ノズル（オリフィス直径１．６５ｍｍ、９０°フルコーン）を通じて噴霧した。液体プールの保持時間は、０．４分で制御された。注入ガスは、Ｈ2（７０ｓｃｃｍ）、Ｏ2（２０ｓｃｃｍ）、およびＣＯ2（１０ｓｃｃｍ）を含む、１００ｓｃｃｍ（０℃および１ａｔｍでの標準立方センチメートル毎分）で設定された。ガスモル流量（Ｆ）および酸素モル分率（ｙ）を測定して容積酸素利用速度（ＯＵＲ）を見出した（式７ａ）。
【数7】
【0023】
バイオリアクターで、液体とガスとの両方が良好に混合されるために、液体溶液は均一であり、気相の酸素の分圧（ＰO）は、放出ガス流の分圧と等しい。式４の溶存酸素濃度（ＣL）が０に低下したとき、酸素物質移動は、酸素利用の律速段階になった。したがって、最大のＯＵＲは、噴霧式バイオリアクターのｋLａを表す（式７ｂ）。
微生物のＣＯ2固定およびＰＨＢ生合成
ＣＯ2からのＰＨＢ生合成は、噴霧式バイオリアクターにおいて、下部のガラス容器にノズル（開口面積１０ｍｍ2）を設置することによって、減少した噴霧プルームで実施された。液体媒地（１．５Ｌ）を３５℃で維持し、ノズル前後の圧力降下４８ｋＰａで、４．７Ｌ／分で循環させた。媒地のｐＨは、初めに、窒素栄養分をもたらすためのアンモニア溶液（２Ｍ）を、次いでＰＨＢ生成を促進するためのＮａＯＨ溶液（２Ｍ）を用いることによって、６．８で維持された。それぞれの発酵の、注入ガスの組成および流量は、表１に示すように一定のレベルで維持された。Ｎ2ガス（４０～６０容積／容積％）をバイオリアクターに導入して、その希釈の、ガス発酵に及ぼす影響を調べた。
【数8】
ＣＯ2からのＰＨＢ生合成は、噴霧式バイオリアクターにおいて、下部のガラス容器にノズル（開口面積１０ｍｍ2）を設置することによって、減少した噴霧プルームで実施された。液体媒地（１．５Ｌ）を３５℃で維持し、ノズル前後の圧力降下４８ｋＰａで、４．７Ｌ／分で循環させた。媒地のｐＨは、初めに、窒素栄養分をもたらすためのアンモニア溶液（２Ｍ）を、次いでＰＨＢ生成を促進するためのＮａＯＨ溶液（２Ｍ）を用いることによって、６．８で維持された。それぞれの発酵の、注入ガスの組成および流量は、表１に示すように一定のレベルで維持された。Ｎ2ガス（４０～６０容積／容積％）をバイオリアクターに導入して、その希釈の、ガス発酵に及ぼす影響を調べた。
【0024】
【表1】
化学分析
ガス組成は、ガスクロマトグラフ（モデル４５０、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用いて測定された。ＧＣは、熱伝導度検出器（ＴＣＤ）およびＣａｒｂｏｘｅｎ ＰＬＯＴ１００６カラム（０．１５ｍｍ×３０ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を備えた。温度サイクルは、２分間、３５℃で開始し、その後１００℃まで３分以内で昇温させた。ピークは、ソフトウェアＧａｌａｘｉｅを用いて積分され、ガス標準物質で較正された。様々なモル組成の標準ガス試料は、気密注射器を用いて、バックグラウンドガスである、純粋ガスおよび窒素から調製された。
【0025】
微生物増殖は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＤＵ５３０、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて、６２０ｎｍで、媒地溶液の光学密度（ＯＤ）を測定することによって追跡された。媒地溶液を、５０００ｇで５分間遠心分離機にかけ、その湿潤ペレットを凍結乾燥して、乾燥細胞塊濃度を測定した。細胞塊のＰＨＢ含量は、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＧＣを用いることによって、以下のように調製された試料で決定された：ＰＨＢ含有乾燥細胞塊約５０ｍｇを、メタノール溶液２ｍＬ（内部標準としてＨ2ＳＯ4３容積％、安息香酸１０ｇＬ-1）およびクロロホルム２ｍＬに添加し、１００℃で４時間維持した。細胞内ポリエステルは、３－ヒドロキシブチレートメチルエステルに変換され、反応溶液中に放出された。混合物を室温まで冷却した後、蒸留水１ｍＬを添加し、溶液を１分間ボルテックスした。混合物を水性相および有機相に分離させた。有機溶液を、ＰＴＦＥ膜（０．４５μｍ）を通して濾過し、ＧＣで分析した。純粋ＰＨＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を較正について同じ手順で処理した。
【0026】
水中の酸素の物理吸収
表２は、様々な作動条件下で観測された、水中の酸素の物理吸収のｋLａを示す。
液体ガス供給速度に関して、表面ガス速度は、０．０００２８ｍ／秒、または０．２ｖｖｍ（液体容積あたりのガス容積毎分）であった。１個のノズルを用いた場合、ｋLａ値（０．０３～０．０４／秒）は、従来の通気バイオリアクターの範囲であった。
表２は、様々な作動条件下で観測された、水中の酸素の物理吸収のｋLａを示す。
【表2】
液体ガス供給速度に関して、表面ガス速度は、０．０００２８ｍ／秒、または０．２ｖｖｍ（液体容積あたりのガス容積毎分）であった。１個のノズルを用いた場合、ｋLａ値（０．０３～０．０４／秒）は、従来の通気バイオリアクターの範囲であった。
【0027】
複数のノズルを用いてより大きい開口面積をもたらした場合、ｋLａは、ほぼ２倍（０．０６４／秒）であった。興味深いことに、このｋLａの増加は、ノズル前後の圧力降下および液滴の速度の減少に伴って観測された。従来の知見とは対照的な現象である。ノズル周辺の力学的エネルギーバランスによれば、大きい圧力降下により、気相の液滴の高い速度および乱流が生じるであろう。また、大きい乱流により、より小さい液滴が生じて、大きい気液界面面積も得られるであろう。全てのこれらの因子は、ガス物質移動速度を増強させるはずであるが、代わりにｋLａの低い値が観測された。いかなる理論にも全く拘らないが、この従来の分析は、個々の液滴について当てはまり得るが、液体プールまたはバイオリアクター全体に適用することはできないと考えられる。ポンプの液体循環速度は、ノズル開口面積がより小さくなるにつれて低下し、気相への液体暴露の頻度数が減ったことが観測された。高い循環速度（４．７Ｌ／分）で、圧力降下が最も小さく、かつ液体速度が最も低かったが、液体プール（１．５Ｌ）の保持時間は最も短く（０．３２分）、すなわち、液体－ガス接触の頻度が最も高かった。したがって、噴霧式バイオリアクターのガス物質移動を増強させるために、小さい圧力降下に伴う高い液体循環速度が、大きい圧力降下に伴う低い循環速度よりも好ましい。このことは、以下に示すエネルギー節約の場合にも該当する。
【0028】
噴霧するのに、複数のノズルが用いられた場合、プルームは、１個のノズルを用いた場合よりも、より大きく、より多くの液滴を含んだ。これにより、ガス物質移動を増強させるために、大きい噴霧プルームが用意されるべきかどうかという疑問が生じた。これについて、頂上シリンダーを取り除き、ノズルを、ガラス容器の頂上に直接設置した場合に試みた。噴霧プルームが、７．５Ｌから１．５Ｌに劇的に減少した。しかし、表２に示すように、同じ作動条件の下、ｋLａは、０．０７５／秒に達し、１７％増加した。言い換えれば、小さいプルームは減らなかったが、ガス物質移動を増強させた。これは、気液物質移動が、主にノズルのチップの下で生じることに起因するとも思われる。気相の小さい液滴の長い保持時間は、物質移動に実質的に寄与することはなかった。代わりに、自由液面での液滴の衝撃が、ガス物質移動をある程度増強させることがある。
【0029】
酸素物質移動の微生物による増強
表３は、ガス発酵の様々な時点での、酸素利用速度（ＯＵＲ）およびｋLａの測定を示す。
表３は、ガス発酵の様々な時点での、酸素利用速度（ＯＵＲ）およびｋLａの測定を示す。
【表3】
【0030】
良好な混合および液体の気相への頻繁な暴露を維持するために、媒地溶液（０．５Ｌ）を１００ｒｐｍで撹拌し、１．２Ｌ／分で循環させて、プールの液体保持時間０．４分をもたらした。ノズル（φ１．６５ｍｍ）間の圧力降下は９０ｋＰａであり、細胞密度の増加で変化しなかった。作動条件の下、液体溶液中の、ポンプからのエネルギー散逸は、３．６ｋｗ・ｍ-3であった。光学密度（ＯＤ）は、１から２５まで増加し、バイオマス濃度は、０．４ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌまで増加した。十分な窒素栄養分があれば、微生物細胞は、少量のＰＨＡ（＜２％）を生成し、減少したＣＯ2は、主に細胞増殖に利用された。S. Kang and J. Yu, Biomass Bioenergy, 74 (2015) 92-95に記載されたように測定された、細胞塊の元素組成は、Ｃ４５．１％、Ｈ６．３％、Ｎ１２．８％、Ｏ２７．８％、および灰分８．０％であり、それにより有機式は、ＣＨ1.69Ｏ0.46Ｎ0.25である。微生物ガス消費のために、放出ガス流量は、初めの１０４ｍＬ／分から５０～６０ｍＬ／分まで低下した。次の測定の前に、バイオリアクターオーバーヘッド（約９Ｌ）を既存のガスで８時間フラッシュした。それぞれのガス流量および組成は、３０分以内に行われた３回の測定の平均であった。相対的に遅い生物活性のために、ガス組成の準定常状態が推測された。
【0031】
酸素利用速度より、ｋLａは、式７を用いて計算された。ｋLａの値は、低い酸素利用速度のために、低いＯＤで低く、次いで、溶存Ｏ2濃度が０に低下するとき、最も高いレベルに達し、酸素物質移動限界の明確な指標であった。言い換えれば、最も高いｋLａ（０．０８３／秒）は、作動条件下での、噴霧式バイオリアクターの最大酸素物質移動係数を表した。ｋLａは、細胞密度のさらなる増加に伴って減少した。これは、偏性好気性菌株を、酸素枯渇に長時間さらした後、低減された微生物活性ゆえの、低いＯＵＲに起因する。同じ液体保持時間（０．４分）での水中の物理吸収のｋLａ（０．０４４／秒）（表２）と比較して、微生物活性による酸素物質移動の増大因子が計算され、表３に列挙された。微生物細胞による酸素（および他の２種のガスも）の生物学的消費によって、ガス物質移動を大いに増強させた。
【0032】
エネルギー消費および比較
噴霧式バイオリアクターは、単純な構造を有する。液体循環ラインのポンプは、液体噴霧と混合との両方に力学的エネルギーをもたらす。図１の２点間（１－１’および２－２’）の力学的エネルギーバランスによれば、ポンプからのエネルギー入力（Ｗs）から摩擦損失を差し引いたものが、流体の、運動エネルギー、位置エネルギー、および圧力エネルギーの増加に等しい（式８ａ）。
わずかな摩擦損失、Ｕ1、および２点間の高さの差があれば、式８ａは式８ｂで単純化される
（式中、Ｕ2は、管（内径６ｍｍ）内の液体速度であり、ΔＰは、ノズル前後の圧力降下である）。実験条件（表２）の下、動的エネルギーは、ポンプ入力の小さい部分（＜８％）についてのみ考慮された。エネルギーは、主に、噴霧用の、液体の圧力を上げるために用いられた。液体容積あたりの電力消費は、式８ｂを用いて、液体循環速度および圧力降下から計算された。表２に示すように、小さい圧力降下での高い液体循環速度は、大きい圧力降下での低い循環速度よりも（７．３ｋｗ・ｍ-3）、さらにより低いエネルギー散逸（２．７ｋｗ・ｍ-3）を有する。後者の場合、前述したように、高い界面面積がガス物質移動速度に対してあまり寄与しないものの、エネルギーは、ごく小さい液滴（＜５０μｍ（ｕｍ））形成の、表面エネルギーおよび熱として消散した。
噴霧式バイオリアクターは、単純な構造を有する。液体循環ラインのポンプは、液体噴霧と混合との両方に力学的エネルギーをもたらす。図１の２点間（１－１’および２－２’）の力学的エネルギーバランスによれば、ポンプからのエネルギー入力（Ｗs）から摩擦損失を差し引いたものが、流体の、運動エネルギー、位置エネルギー、および圧力エネルギーの増加に等しい（式８ａ）。
【数9】
わずかな摩擦損失、Ｕ1、および２点間の高さの差があれば、式８ａは式８ｂで単純化される
【数10】
（式中、Ｕ2は、管（内径６ｍｍ）内の液体速度であり、ΔＰは、ノズル前後の圧力降下である）。実験条件（表２）の下、動的エネルギーは、ポンプ入力の小さい部分（＜８％）についてのみ考慮された。エネルギーは、主に、噴霧用の、液体の圧力を上げるために用いられた。液体容積あたりの電力消費は、式８ｂを用いて、液体循環速度および圧力降下から計算された。表２に示すように、小さい圧力降下での高い液体循環速度は、大きい圧力降下での低い循環速度よりも（７．３ｋｗ・ｍ-3）、さらにより低いエネルギー散逸（２．７ｋｗ・ｍ-3）を有する。後者の場合、前述したように、高い界面面積がガス物質移動速度に対してあまり寄与しないものの、エネルギーは、ごく小さい液滴（＜５０μｍ（ｕｍ））形成の、表面エネルギーおよび熱として消散した。
【0033】
従来の撹拌式バイオリアクターにおいて、酸素物質移動係数は、液体溶液の表面ガス速度および電力損に左右される。撹拌容器の、広く用いられる相関は、一般的な形式を有する（式９）
（式中、ｋLａは、単位／秒の酸素物質移動係数である）。Ｐは、Ｗの撹拌器によって消散する電力であり、ＶLは、単位ｍ3の液体容積である。Ｕsは、単位ｍ／秒の表面ガス速度であり、容積ガス流量を、バイオリアクターの断面積で割ったものとして定義される。多くの相関が、実験データから得られ、および／または理論から導かれてきた。その２つを、比較のために図４にプロットする：実験的相関から１つ（M. Nocentini et al., Ind. Eng. Chem. Res. 32 (1993) 19-26）、および特殊な構成および実験条件に制限されない、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ理論からもう１つ（Y. Kawse, M. Moo-Yong, Chem. Eng. Res. Des. 66 (1988) 284-288）。実験的相関のほとんどは、ｋLａについて、完全に整合性のある予測をもたらすが、理論に基づいた相関は、より高い予測をもたらす（M. Xie, J. Xia, Z. Zhou, J. Chu, Y. Zhuang, S. Zhang, Ind. Eng. Chem. Res. 53 (2014) 5941-5953）。それらを、図４において、同じエネルギー散逸率で、噴霧式バイオリアクターのｋLａと比較する。実証的相関が、最小表面ガス速度が０．００１ｍ／秒以上である、特殊な実験から得られることに注意されたい。相関が、本発明の記述における極めて低いガス速度（表２および表３の０．０００２８ｍ／秒）で用いられる場合、それらは参照目的のためだけにある。
【数11】
（式中、ｋLａは、単位／秒の酸素物質移動係数である）。Ｐは、Ｗの撹拌器によって消散する電力であり、ＶLは、単位ｍ3の液体容積である。Ｕsは、単位ｍ／秒の表面ガス速度であり、容積ガス流量を、バイオリアクターの断面積で割ったものとして定義される。多くの相関が、実験データから得られ、および／または理論から導かれてきた。その２つを、比較のために図４にプロットする：実験的相関から１つ（M. Nocentini et al., Ind. Eng. Chem. Res. 32 (1993) 19-26）、および特殊な構成および実験条件に制限されない、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ理論からもう１つ（Y. Kawse, M. Moo-Yong, Chem. Eng. Res. Des. 66 (1988) 284-288）。実験的相関のほとんどは、ｋLａについて、完全に整合性のある予測をもたらすが、理論に基づいた相関は、より高い予測をもたらす（M. Xie, J. Xia, Z. Zhou, J. Chu, Y. Zhuang, S. Zhang, Ind. Eng. Chem. Res. 53 (2014) 5941-5953）。それらを、図４において、同じエネルギー散逸率で、噴霧式バイオリアクターのｋLａと比較する。実証的相関が、最小表面ガス速度が０．００１ｍ／秒以上である、特殊な実験から得られることに注意されたい。相関が、本発明の記述における極めて低いガス速度（表２および表３の０．０００２８ｍ／秒）で用いられる場合、それらは参照目的のためだけにある。
【0034】
図４により、いくつかの興味深い情報が明らかにされた。第１に、噴霧式バイオリアクターをノズル前後の大きい圧力降下で作動させるとき、高いエネルギー散逸により、高い物質移動係数を確保することができない。高いエネルギー散逸であれば、噴霧式バイオリアクターは、極めて低いガス供給速度で、従来のバイオリアクターと同様のｋLａを示す。第２に、低いエネルギー散逸であれば、噴霧式バイオリアクターは、従来のバイオリアクターよりもより高い物質移動速度をもたらすことができる。極めて低いガス供給速度では、力学的エネルギーをより効率的に用いて、気泡をつぶすよりも、液体を液滴に分ける。したがって、噴霧式バイオリアクターは、同量のエネルギーを用いて、より高いｋLａをもたらすことができる。第３に、減少した噴霧プルームにより、噴霧式バイオリアクターの物質移動が促進される。最後に、バイオガス消費は、媒地溶液のガス物質移動を増大させることがある。
【0035】
窒素の非存在下でのＣＯ2からのＰＨＢ生成
図５は、注入ガスＩ（表１）の発酵時間経過である。Ｈ2（６０％）、Ｏ2（２０％）、およびＣＯ2（２０％）の一定の流量（１４０ｓｃｃｍ）で、微生物細胞密度は、時間と共に連続的に増加し、最大レベル２１．５ｇ／Ｌに達した。減少した炭素の大部分は、ＰＨＢに貯蔵され、最終ＰＨＢ含量は５０質量％に達した。興味深いことに、残留バイオマス、細胞塊とＰＨＢとの質量差は、十分な窒素栄養分と共に、初めに増加し、窒素制限が適用されたとき、プラトーに近づいた。このパターンは、例えば、N. Tanadchangsaeng, J. Yu, Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 2808-2818に記載されたように、有機炭素源の従属栄養培養のものに類似していた。液体溶液の溶存酸素（ＤＯ）濃度は、空気飽和のパーセントとして追跡され、細胞密度が５ｇ／Ｌに達するまで、相当に高いレベル（＞７０％）で維持された。その期間中に、酸素物質移動速度は、高い微生物活性を支持するのに十分に高かった。バイオマス濃度が９ｇ／Ｌ以上に増加したとき、ＤＯは０に急速に低下し、その後、偏性好気性菌株を酸素枯渇状態にさらした。ガス基質の利用可能性は、微生物増殖および生理機能に影響を及ぼした。微生物増殖は、比増殖速度（μ）に応じて、概ね３つの段階に分けることができた。図５に、比増殖速度は、光学密度対時間の、自然対数の曲線勾配で表される。初期誘導期の後、比増殖速度は、０．１／時間（μ1）であり、その後、高い細胞密度での酸素制限ゆえに低下した。比増殖速度は、０．０６／時間（μ2）まで低下し、その後さらに、発酵が１１５時間継続されると、０．０１／時間（μ3）まで低下した。
図５は、注入ガスＩ（表１）の発酵時間経過である。Ｈ2（６０％）、Ｏ2（２０％）、およびＣＯ2（２０％）の一定の流量（１４０ｓｃｃｍ）で、微生物細胞密度は、時間と共に連続的に増加し、最大レベル２１．５ｇ／Ｌに達した。減少した炭素の大部分は、ＰＨＢに貯蔵され、最終ＰＨＢ含量は５０質量％に達した。興味深いことに、残留バイオマス、細胞塊とＰＨＢとの質量差は、十分な窒素栄養分と共に、初めに増加し、窒素制限が適用されたとき、プラトーに近づいた。このパターンは、例えば、N. Tanadchangsaeng, J. Yu, Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 2808-2818に記載されたように、有機炭素源の従属栄養培養のものに類似していた。液体溶液の溶存酸素（ＤＯ）濃度は、空気飽和のパーセントとして追跡され、細胞密度が５ｇ／Ｌに達するまで、相当に高いレベル（＞７０％）で維持された。その期間中に、酸素物質移動速度は、高い微生物活性を支持するのに十分に高かった。バイオマス濃度が９ｇ／Ｌ以上に増加したとき、ＤＯは０に急速に低下し、その後、偏性好気性菌株を酸素枯渇状態にさらした。ガス基質の利用可能性は、微生物増殖および生理機能に影響を及ぼした。微生物増殖は、比増殖速度（μ）に応じて、概ね３つの段階に分けることができた。図５に、比増殖速度は、光学密度対時間の、自然対数の曲線勾配で表される。初期誘導期の後、比増殖速度は、０．１／時間（μ1）であり、その後、高い細胞密度での酸素制限ゆえに低下した。比増殖速度は、０．０６／時間（μ2）まで低下し、その後さらに、発酵が１１５時間継続されると、０．０１／時間（μ3）まで低下した。
【0036】
図５はまた、時間に伴う、瞬間水素収量および累積水素収量の変化をもたらす。水素は、微生物ＣＯ2固定のための、唯一のエネルギー源および還元剤であった。水素収量は、供給される水素あたりの、生成されるバイオマス量（ｇ・ｇ-1）で定義される。２つの時点の差から測定される「準」瞬間収量は、この短い期間の、ＣＯ2固定の平均生物学的効率を示す。累積水素収量は、発酵の始点からある時点までの全体の効率を表す。瞬間水素収量は、最大比増殖速度（０．１／秒）に対応して最も高く（約２ｇ・ｇ-1）、その後細胞塊のほとんどが形成された、相当に長い期間中、適度なレベル（１．２ｇ・ｇ-1）で維持された。小さい細胞塊が形成されたので、瞬間水素収量は０に低下した。方法経済性の重要な基準として、全体のバッチ発酵の累積水素収量は０．６ｇ・ｇ-1であった。
【0037】
同じガス組成の注入ガスＩＩであれば、ガス流量は７０ｓｃｃｍまで減少し、同じ時間経過が観測された。しかし、最大バイオマス濃度は、１２．４ｇ／Ｌまで減少し、ＰＨＢ含量は１７．５質量％まで減少した。最大瞬間水素収量は１．８ｇ・ｇ-1であり、同じ物質移動速度およびＣＯ2固定効率を示した。累積水素収量は、極めて低いガス供給速度（０．０５ｖｖｍ）で、より少ない水素廃棄ゆえに、さらにより高かった（０．９５ｇ・ｇ-1）。注入ガスＢであれば、微生物細胞は、増殖のための、十分な炭素およびエネルギー源を含まないこともある。
【0038】
ＣＯ2からのＰＨＢ生成への窒素の影響
図６は、大量のＮ2ガス（４０ｍｏｌ％）の存在下での、注入ガスＩＩＩ（表１）の発酵時間経過である。高いバイオマス密度２１．９ｇ／Ｌも得られ、ＰＨＢ含量は、６１質量％にも達した。高いＰＨＢ含量は、長期のプラトー後の残留バイオマスの減少に起因すると思われる。興味深いことに、溶存酸素は、大量の細胞塊（１６ｇ／Ｌ）が形成される間の、７５時間まで高いレベル（１５～３０％）で維持された。溶存酸素は、細胞密度が１７ｇ／Ｌに達するとき、０に低下した。明らかに、偏性好気性菌株は、相当に長い期間中、良好な代謝活性を維持するのに十分な酸素を含んだ。最大比増殖速度（μmax）は、初期誘導期８時間後の２０時間の期間中、０．１２／時間（μ1）であった。発酵が、さらに２０時間ほど進行したとき、増殖速度は、０．０４／時間（μ2）まで低下した。最後に、発酵が終わるまで、比増殖速度は、０．０１／時間（μ3）で保たれた。しかし、水素収量は、ガス組成を希釈したＮ2の存在下で、より低くかった。最も高い瞬間水素収量は、０．７ｇ・ｇ-1であり、累積収量は０．３ｇ・ｇ-1であった。この実験によれば、煙道ガスをＣＯ2源として直接用いることができ、それによってＣＯ2捕捉の費用が節約されることが示される。
極めて少量の水素（１０ｍｏｌ％）を注入ガスＩＶに与えたとき、細胞増殖はほとんど観測されなかった。３２時間後の最大光学密度（ＯＤ）は、わずか１．６８（細胞密度≒０．８１ｇ／Ｌ）であった。細胞密度は、作動中、同じガス供給速度で、このレベルで維持された。ＣＯ2固定および細胞増殖に利用可能な、十分なＨ2がない状態では、低いＨ2組成は、細胞を維持する程度であったと考えられる。表４に、様々な注入ガスのガス発酵を比較する。注入ガスＣおよび注入ガスＤの結果は、Ｎ2の希釈の影響（４０～６０ｍｏｌ％）を明らかに示す。
図６は、大量のＮ2ガス（４０ｍｏｌ％）の存在下での、注入ガスＩＩＩ（表１）の発酵時間経過である。高いバイオマス密度２１．９ｇ／Ｌも得られ、ＰＨＢ含量は、６１質量％にも達した。高いＰＨＢ含量は、長期のプラトー後の残留バイオマスの減少に起因すると思われる。興味深いことに、溶存酸素は、大量の細胞塊（１６ｇ／Ｌ）が形成される間の、７５時間まで高いレベル（１５～３０％）で維持された。溶存酸素は、細胞密度が１７ｇ／Ｌに達するとき、０に低下した。明らかに、偏性好気性菌株は、相当に長い期間中、良好な代謝活性を維持するのに十分な酸素を含んだ。最大比増殖速度（μmax）は、初期誘導期８時間後の２０時間の期間中、０．１２／時間（μ1）であった。発酵が、さらに２０時間ほど進行したとき、増殖速度は、０．０４／時間（μ2）まで低下した。最後に、発酵が終わるまで、比増殖速度は、０．０１／時間（μ3）で保たれた。しかし、水素収量は、ガス組成を希釈したＮ2の存在下で、より低くかった。最も高い瞬間水素収量は、０．７ｇ・ｇ-1であり、累積収量は０．３ｇ・ｇ-1であった。この実験によれば、煙道ガスをＣＯ2源として直接用いることができ、それによってＣＯ2捕捉の費用が節約されることが示される。
極めて少量の水素（１０ｍｏｌ％）を注入ガスＩＶに与えたとき、細胞増殖はほとんど観測されなかった。３２時間後の最大光学密度（ＯＤ）は、わずか１．６８（細胞密度≒０．８１ｇ／Ｌ）であった。細胞密度は、作動中、同じガス供給速度で、このレベルで維持された。ＣＯ2固定および細胞増殖に利用可能な、十分なＨ2がない状態では、低いＨ2組成は、細胞を維持する程度であったと考えられる。表４に、様々な注入ガスのガス発酵を比較する。注入ガスＣおよび注入ガスＤの結果は、Ｎ2の希釈の影響（４０～６０ｍｏｌ％）を明らかに示す。
【0039】
【表4】
以下に、ガス基質からの細胞増殖およびＰＨＢ生成のための、本発明のバイオリアクターの性能を、２種の従来のバイオリアクターおよびガス吸収装置の性能と比較する。
【0040】
微生物ガス培養のための従来のバイオリアクターの性能
従来の卓上バイオリアクター（全容積３リットル、ＢｉｏＦｌｏ１１０、Ｎｅｗ Ｂｕｒｎｓｗｉｃｋ、Ｅｎｆｉｅｌｄ、ＣＴ）を用いて、Ｈ2７０ｍｏｌ％、Ｏ2２０ｍｏｌ％、およびＣＯ2１０ｍｏｌ％のガス混合物で、カプリアビダス・ネカトールを培養した。図７に、極めて一般的な微生物発酵用バイオリアクターである、リアクターの概略構造を示す。気泡から懸濁させた微生物細胞へのガス物質移動は、機械的撹拌器による媒地溶液の撹拌を介してもたらされる。予め調製した溶液である、リン酸カリウム２．３ｇ／Ｌ、リン酸一水素ナトリウム４．３７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、重炭酸ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、クエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）０．０５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）０．０１ｇ／Ｌ、および微量ミネラル１ｍＬからなる無機溶液（１．５Ｌ）を、液体媒地として用いた。最大物質移動をもたらすために、撹拌速度を９００ｒｐｍで維持した。ガススパージャーを用いて、ガス流を溶液中に分散させた。バイオリアクターの媒地が安定な状態（ｐＨおよび温度）に達すると、瓶培養を植菌した。ｐＨおよび温度を、それぞれ６．９および３０℃で維持した。ＤＯ、ｐＨ、温度、および撹拌速度などの作動条件を追跡した。排出ガスは、ガス分析器（ＴＡＮＤＥＭ Ｐｒｏ、Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ）を用いて追跡した。液体試料を収集し、光学密度（６２０ｎｍでのＯＤ）、細胞密度、およびＰＨＢ含量について分析した。
従来の卓上バイオリアクター（全容積３リットル、ＢｉｏＦｌｏ１１０、Ｎｅｗ Ｂｕｒｎｓｗｉｃｋ、Ｅｎｆｉｅｌｄ、ＣＴ）を用いて、Ｈ2７０ｍｏｌ％、Ｏ2２０ｍｏｌ％、およびＣＯ2１０ｍｏｌ％のガス混合物で、カプリアビダス・ネカトールを培養した。図７に、極めて一般的な微生物発酵用バイオリアクターである、リアクターの概略構造を示す。気泡から懸濁させた微生物細胞へのガス物質移動は、機械的撹拌器による媒地溶液の撹拌を介してもたらされる。予め調製した溶液である、リン酸カリウム２．３ｇ／Ｌ、リン酸一水素ナトリウム４．３７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、重炭酸ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、クエン酸第二鉄アンモニウム（ＦＡＣ）０．０５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）０．０１ｇ／Ｌ、および微量ミネラル１ｍＬからなる無機溶液（１．５Ｌ）を、液体媒地として用いた。最大物質移動をもたらすために、撹拌速度を９００ｒｐｍで維持した。ガススパージャーを用いて、ガス流を溶液中に分散させた。バイオリアクターの媒地が安定な状態（ｐＨおよび温度）に達すると、瓶培養を植菌した。ｐＨおよび温度を、それぞれ６．９および３０℃で維持した。ＤＯ、ｐＨ、温度、および撹拌速度などの作動条件を追跡した。排出ガスは、ガス分析器（ＴＡＮＤＥＭ Ｐｒｏ、Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ）を用いて追跡した。液体試料を収集し、光学密度（６２０ｎｍでのＯＤ）、細胞密度、およびＰＨＢ含量について分析した。
【0041】
空気流（Ｏ2２１ｍｏｌ％）からのＯ2の容積物質移動係数（ｋLａ）を、上記と同じ溶液で測定し、様々なバイオリアクターのガス物質移動の比較用の指標として用いた。表５は、この従来のバイオリアクターの結果を示す。発酵産業において、ガス流量は、しばしば「ｖｖｍ」、すなわち液体容積あたりのガス容積毎分で表される。最大ｋLａ２３４／時間は、空気流量４．５Ｌ／分（３．０ｖｖｍ）を用いて、９００ｒｐｍで得られた。空気流量を減らすことによって、ｋLａの有意な減少が生じた。例えば、空気流量０．７５Ｌ／分（０．５ｖｖｍ）および撹拌速度９００ｒｐｍで、ｋLａは、わずか１４４／時間であるか、または３８％の減少であった。
【0042】
【表5】
図８に、発酵時間に伴う光学密度の変化を示す。最大ＯＤ７２．８が、発酵の１０３時間後に観測された。開始溶存酸素（ＤＯ）は、およそ７５％であり、作動４５時間後、０％まで徐々に低下し、細胞増殖がガス物質移動速度によって制限されたことを示した。最大比増殖速度（μmax）０．０８／時間が、発酵の２０～６０時間で観測された。次いで、比増殖速度が０．０３／時間まで減少し、その後プラトーに達した。実験の最後に、最大細胞密度およびＰＨＢ含量は、それぞれ２４．１６ｇ／Ｌおよび５９％と記録された。
【0043】
微生物ガス培養のための従来のガス吸収装置
充填層カラムを備えた、従来のガス吸収装置を、カプリアビダス・ネカトールの微生物ガス培養用のバイオリアクターに改造した。図９は、実験の構成の模式図を示す。リアクター（３Ｌ）を、上記と同じ液体媒地１．５Ｌで満たした。実験の間、水溶液を、外部ループを通じて再循環させ、ガラスビーズの２０ｃｍ充填層カラムの頂上に分散させた。その層は、ガスと液体との接触領域をもたらした。再循環ループの正置換ポンプにより、流量５．３Ｌ／分が生じた。ガス流（Ｈ2７０％、Ｏ2２０％、およびＣＯ2１０％）１．５Ｌ／分は、頂上のガス注入口からリアクターへ導入され、排出ガス放出口を通じて、共在の液体と接触させた後、廃棄された。排出ガスのＣＯ2およびＯ2の正確な濃度は、ガス分析器を用いて追跡された。シード（ｓｅｅｄ）溶液１００ｍＬで植菌した後、従来のバイオリアクターと同じ増殖条件を維持した。液体試料を、ＯＤ、細胞密度、およびＰＨＢ含量について、時間と共に収集した。
図１０は、従来のガス吸収装置の、発酵時間に伴うＯＤの変化を示す。最も高いＯＤ１４．０は、発酵期間９０時間中に観測された。１２時間の誘導期の後、細胞は、初めの２５時間、最大比増殖速度（μmax）０．１３／時間で、指数関数的な増殖を示した。次いで、比増殖速度を徐々に０．０３／時間まで低下させて、細胞密度の線形的な増加、物質移動限界の指標をもたらした。最大細胞密度は、発酵期間９０時間の後、対応するＯＤ１４で、およそ４．２ｇ／Ｌであった。
充填層カラムを備えた、従来のガス吸収装置を、カプリアビダス・ネカトールの微生物ガス培養用のバイオリアクターに改造した。図９は、実験の構成の模式図を示す。リアクター（３Ｌ）を、上記と同じ液体媒地１．５Ｌで満たした。実験の間、水溶液を、外部ループを通じて再循環させ、ガラスビーズの２０ｃｍ充填層カラムの頂上に分散させた。その層は、ガスと液体との接触領域をもたらした。再循環ループの正置換ポンプにより、流量５．３Ｌ／分が生じた。ガス流（Ｈ2７０％、Ｏ2２０％、およびＣＯ2１０％）１．５Ｌ／分は、頂上のガス注入口からリアクターへ導入され、排出ガス放出口を通じて、共在の液体と接触させた後、廃棄された。排出ガスのＣＯ2およびＯ2の正確な濃度は、ガス分析器を用いて追跡された。シード（ｓｅｅｄ）溶液１００ｍＬで植菌した後、従来のバイオリアクターと同じ増殖条件を維持した。液体試料を、ＯＤ、細胞密度、およびＰＨＢ含量について、時間と共に収集した。
図１０は、従来のガス吸収装置の、発酵時間に伴うＯＤの変化を示す。最も高いＯＤ１４．０は、発酵期間９０時間中に観測された。１２時間の誘導期の後、細胞は、初めの２５時間、最大比増殖速度（μmax）０．１３／時間で、指数関数的な増殖を示した。次いで、比増殖速度を徐々に０．０３／時間まで低下させて、細胞密度の線形的な増加、物質移動限界の指標をもたらした。最大細胞密度は、発酵期間９０時間の後、対応するＯＤ１４で、およそ４．２ｇ／Ｌであった。
【0044】
本発明の噴霧ノズルバイオリアクター（ＳＮＢＲ）の性能
従来のバイオリアクターおよびガス吸収装置では、ガスを、液体の連続相中に分散させた。低いガス溶解度ゆえに、ガスは急速に気泡を形成し、液体溶液から出て、その結果、物質移動の接触時間が短くなる。水溶液中の高いガスホールドアップを維持するために、高いガス流量が必要とされ、その結果、大量のガス廃棄となる。こうした欠点に対処するために、本発明のバイオリアクターは、図１に示すように、逆のガス中液体分布を特徴とする。媒地溶液１１を、外部ループ６を通じて３．１Ｌ／分で循環させ、噴霧ノズル１２（オリフィス０．１８ｃｍ、Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を通じて、ごく小さい液滴として気相中に噴霧する。ガス状基質１４を、導管２５を通じて、所望の流量で、バイオリアクターに含まれるオーバーヘッド気相１５中に導入した。ガス／液体接触は、溶液中のガスホールドアップによるものではなく、液滴によって決定されるので、ガス流は、微生物細胞によってガスがどの程度速く利用され得るかに応じて、極めて低い流量で制御することができる。より重要なことには、高い物質移動速度（ｋLａ）は、ガス流量に関係なく維持することができる。ガス流の保持時間は、バイオリアクターのオーバーヘッド空間の容積を変えることによって調整することもできる。この実証の場合、噴霧ノズルは、液面よりも１０ｃｍ上に位置する。
従来のバイオリアクターおよびガス吸収装置では、ガスを、液体の連続相中に分散させた。低いガス溶解度ゆえに、ガスは急速に気泡を形成し、液体溶液から出て、その結果、物質移動の接触時間が短くなる。水溶液中の高いガスホールドアップを維持するために、高いガス流量が必要とされ、その結果、大量のガス廃棄となる。こうした欠点に対処するために、本発明のバイオリアクターは、図１に示すように、逆のガス中液体分布を特徴とする。媒地溶液１１を、外部ループ６を通じて３．１Ｌ／分で循環させ、噴霧ノズル１２（オリフィス０．１８ｃｍ、Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を通じて、ごく小さい液滴として気相中に噴霧する。ガス状基質１４を、導管２５を通じて、所望の流量で、バイオリアクターに含まれるオーバーヘッド気相１５中に導入した。ガス／液体接触は、溶液中のガスホールドアップによるものではなく、液滴によって決定されるので、ガス流は、微生物細胞によってガスがどの程度速く利用され得るかに応じて、極めて低い流量で制御することができる。より重要なことには、高い物質移動速度（ｋLａ）は、ガス流量に関係なく維持することができる。ガス流の保持時間は、バイオリアクターのオーバーヘッド空間の容積を変えることによって調整することもできる。この実証の場合、噴霧ノズルは、液面よりも１０ｃｍ上に位置する。
【0045】
従来のバイオリアクターおよび上記のガス吸収装置の実験と同様に、同じ液体溶液１．５Ｌをノズル噴霧式バイオリアクター（全容積３Ｌ）で用いた。シード溶液１００ｍＬで植菌した後、細胞は、ガス流０．４５Ｌ／分で増殖した。ｐＨおよび温度は、それぞれ６．９および３０．０℃で維持した。ノズル前後の圧力降下は、デジタル圧力計（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）を用いて測定した。前述の実験と同様に、液体試料を、ＯＤ、細胞密度、およびＰＨＢ含量について分析した。排出ガスの成分をガス分析器によって追跡した。
図１１は、発酵時間に伴う、細胞増殖または光学密度の増加を示す。最も高いＯＤ３２．２が、発酵の７２時間後に記録された。対応する細胞密度は、１２．７ｇ／Ｌであった。最大比増殖速度（μmax）０．１５／時間が、発酵の初めの２４時間の期間中に観測され、その後、０．０４／時間まで徐々に低下し、推定のガス物質移動限界を示した。ノズル前後の圧力降下は、３０．６～３０．９ｐｓｉで維持された。
図１１は、発酵時間に伴う、細胞増殖または光学密度の増加を示す。最も高いＯＤ３２．２が、発酵の７２時間後に記録された。対応する細胞密度は、１２．７ｇ／Ｌであった。最大比増殖速度（μmax）０．１５／時間が、発酵の初めの２４時間の期間中に観測され、その後、０．０４／時間まで徐々に低下し、推定のガス物質移動限界を示した。ノズル前後の圧力降下は、３０．６～３０．９ｐｓｉで維持された。
【0046】
酸素の容積物質移動係数（ｋLａ）は、様々な流量で空気流と共に測定された。具体的には、空気流量０．７５Ｌ／分で、最も高いｋLａ２３０／時間が観測された。従来のバイオリアクター（表１）と比較して、これにより、ガス節約およびエネルギー消費の低減について、有意に改善される。
噴霧ノズルスタティックミキサーバイオリアクター（ＳＮＳＭＢＲ）の性能
図１に示すように、上記の噴霧ノズルバイオリアクターを、液体循環ループ６にスタティックミキサー７を添加し、ポンプ４とミキサー７との間にガス流１４を導入することによって、さらに改良した。ガスおよび液体流をスタティックミキサー（この場合２個）で予め混合し、その接触を、ノズルの高いせん断応力の下、有意に増大させた。液体－ガス混合物の細かい液滴により、ガス物質移動速度が有意に増加する。ｋLａは、低い空気流量０．７５Ｌ／分で３７７／時間まで増加した。図１の噴霧ノズルリアクター（ＳＮＢＲ）と比較して、図２のＳＮＳＭＢＲは、同じガス流量で６０％の増加を示す。従来のバイオリアクターのｋLａデータの比較によって（表１）、ＳＮＳＭＢＲにより、ｋLａの１５０％の増加がもたらされる（空気流量０．７５Ｌ／分および撹拌９００ｒｐｍ）。
噴霧ノズルスタティックミキサーバイオリアクター（ＳＮＳＭＢＲ）の性能
図１に示すように、上記の噴霧ノズルバイオリアクターを、液体循環ループ６にスタティックミキサー７を添加し、ポンプ４とミキサー７との間にガス流１４を導入することによって、さらに改良した。ガスおよび液体流をスタティックミキサー（この場合２個）で予め混合し、その接触を、ノズルの高いせん断応力の下、有意に増大させた。液体－ガス混合物の細かい液滴により、ガス物質移動速度が有意に増加する。ｋLａは、低い空気流量０．７５Ｌ／分で３７７／時間まで増加した。図１の噴霧ノズルリアクター（ＳＮＢＲ）と比較して、図２のＳＮＳＭＢＲは、同じガス流量で６０％の増加を示す。従来のバイオリアクターのｋLａデータの比較によって（表１）、ＳＮＳＭＢＲにより、ｋLａの１５０％の増加がもたらされる（空気流量０．７５Ｌ／分および撹拌９００ｒｐｍ）。
【0047】
ＳＮＢＲで実施される実験の同じ微生物培養は、図２に示されるＳＮＳＭＢＲバイオリアクターで試験された。ｐＨおよび温度などの作動パラメーターは、前述の実験と同じであった。リアクターの媒地溶液は１．５Ｌであり、再循環流量は３．１Ｌ／分であり、液体保持時間０．４８分をもたらした。注入ガス流量を、０．２～０．３Ｌ／分（ガス供給速度０．１３～０．２ｖｖｍ、表面ガス速度０．０００１９～０．０００２８ｍ／秒）で維持し、ガス混合物組成は、前述の実験（Ｈ2７０％、Ｏ2２０％、およびＣＯ2１０％）と同様であった。液体試料を、ＯＤ、細胞密度、およびＰＨＢ含量について分析した。排出ガスの組成を、ガス分析器によって追跡した。
図１２は、ＳＮＳＭＢＲにおいて、発酵時間に伴う、細胞増殖の時間経過または光学密度増加を示す。シード溶液１００ｍＬで植菌した後、発酵ブロスの光学密度は、比増殖速度０．１６／時間で指数関数的に増加した。最も高いＯＤ７０は、発酵６５時間で達した。対応する細胞密度は２６．７４ｇ／Ｌであり、乾燥細胞塊の最終ＰＨＢ含量は５２％であった。ＳＮＳＭＢＲリアクターシステムの最も重要な功績は、極めて低いガス流量（＜０．３Ｌ／分）の使用であった。したがって、従来のバイオリアクターと比較して、ガス廃棄は有意に減少した。これにより、特にＣＯ2およびＯ2を含む煙道ガスが原料として用いられる場合、ガス状基質からのＰＨＢ製造の最も高価な原料と考えられるＨ2ガスが節約される。
図１２は、ＳＮＳＭＢＲにおいて、発酵時間に伴う、細胞増殖の時間経過または光学密度増加を示す。シード溶液１００ｍＬで植菌した後、発酵ブロスの光学密度は、比増殖速度０．１６／時間で指数関数的に増加した。最も高いＯＤ７０は、発酵６５時間で達した。対応する細胞密度は２６．７４ｇ／Ｌであり、乾燥細胞塊の最終ＰＨＢ含量は５２％であった。ＳＮＳＭＢＲリアクターシステムの最も重要な功績は、極めて低いガス流量（＜０．３Ｌ／分）の使用であった。したがって、従来のバイオリアクターと比較して、ガス廃棄は有意に減少した。これにより、特にＣＯ2およびＯ2を含む煙道ガスが原料として用いられる場合、ガス状基質からのＰＨＢ製造の最も高価な原料と考えられるＨ2ガスが節約される。
【0048】
微生物ガス培養のバイオリアクター性能の比較
表６は、上記の、２種の従来のバイオリアクター（ＣＢＲおよびＣＧＡ）と、本発明の２種のバイオリアクター（ＳＮＢＲおよびＳＮＳＭＢＲ）との比較である。
表６は、上記の、２種の従来のバイオリアクター（ＣＢＲおよびＣＧＡ）と、本発明の２種のバイオリアクター（ＳＮＢＲおよびＳＮＳＭＢＲ）との比較である。
【表6】
【0049】
従来のバイオリアクター（ＣＢＲ）と比較して、ＳＮＳＭＢＲは、はるかに高い細胞生産性およびＰＨＢ生産性をもたらすが、はるかに少ない水素を使用する。バイオリアクターに供給される水素の量に対する乾燥細胞塊収量は、１０倍超に増加する。 本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器（２）から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を供給するステップと、
ｄ）前記気相（１５）中で、噴霧された液滴形態の前記液体発酵ブロス（１１）を前記ガス状基質（１４）と接触させることによって、前記ガス状基質（１４）を、前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｅ）前記ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔２〕前記〔１〕に記載の、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を供給し、前記ガス状基質（１４）を、前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｄ）こうして得られた気液混合物を前記ガス発酵容器（２）中に噴霧し、前記ガス発酵微生物を培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔３〕前記〔１〕に記載の、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器（２）から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を、前記気相（１５）へ供給するステップと、
ｄ）前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）を、前記気相（１５）中へ噴霧するステップと、
ｅ）前記ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔４〕前記液体発酵ブロス（１１）が、２Ｌ／分以上、好ましくは３Ｌ／分以上の循環速度で、抜き出され、前記ガス発酵容器（２）に再び導入される、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、前記〔４〕に記載の方法。
〔７〕前記ガス状基質（１４）と混合してもよい、前記液体発酵ブロス（１１）の噴霧が、それぞれ、圧力降下が１．０・１０ 5 Ｐａ以下の、１個または複数のノズル（１２）を通じて実施される、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記ガス状基質（１４）を少なくとも１個のスタティックミキサー（７）において、前記ガス発酵容器から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合し、その後循環させ、前記ガス発酵容器（２）中に噴霧する、前記〔２〕に記載の方法。
〔９〕前記ガス状基質（１４）が煙道ガスである、前記〔１〕に記載の方法。
〔１０〕－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記気相（１５）中に１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記容器（２）の内部と連通した注入導管（２５）を通じて、前記気相（１５）へ接続されている、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）。
〔１１〕－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）中に、１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記循環ライン（６）に接続されることにより、こうして得られた気液混合物が、前記噴霧ノズル（１２）によって、前記容器（２）に存在する前記気相（１５）中に噴霧される、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）。
〔１２〕前記循環ライン（６）が、前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と前記ガス状基質（１４）を混合して、前記気液混合物を生成するための、少なくとも１個のスタティックミキサー（７）を備える、前記〔１１〕に記載のガス発酵バイオリアクター（１）。
〔１〕ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器（２）から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を供給するステップと、
ｄ）前記気相（１５）中で、噴霧された液滴形態の前記液体発酵ブロス（１１）を前記ガス状基質（１４）と接触させることによって、前記ガス状基質（１４）を、前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｅ）前記ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔２〕前記〔１〕に記載の、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を供給し、前記ガス状基質（１４）を、前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合するステップと、
ｄ）こうして得られた気液混合物を前記ガス発酵容器（２）中に噴霧し、前記ガス発酵微生物を培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｅ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔３〕前記〔１〕に記載の、ガス発酵によって少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを製造する方法であって、
ａ）
－ 水、
－ 少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを産生できる、懸濁させたガス発酵微生物、
－ 前記ガス発酵微生物用の栄養分
を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する、少なくとも１個のガス発酵容器（２）を用意するステップであり、
前記ガス発酵容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、ステップと、
ｂ）前記ガス発酵容器（２）から前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量を連続的に抜き出すステップと、
ｃ）ＣＯ 2 、Ｈ 2 、およびＯ 2 を含むガス状基質（１４）を、前記気相（１５）へ供給するステップと、
ｄ）前記ガス発酵容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）を、前記気相（１５）中へ噴霧するステップと、
ｅ）前記ガス発酵微生物を、ステップｄで得られた気液混合物と共に培養して、少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを含む細胞塊を形成するステップと、
ｆ）前記細胞塊から前記少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエートを回収するステップと
を含む、方法。
〔４〕前記液体発酵ブロス（１１）が、２Ｌ／分以上、好ましくは３Ｌ／分以上の循環速度で、抜き出され、前記ガス発酵容器（２）に再び導入される、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕前記ガス状基質（１４）が、０．００１ｍ／秒以下の、好ましくは０．０００５ｍ／秒以下のガス供給速度で、前記ガス発酵容器（２）に供給される、前記〔４〕に記載の方法。
〔７〕前記ガス状基質（１４）と混合してもよい、前記液体発酵ブロス（１１）の噴霧が、それぞれ、圧力降下が１．０・１０ 5 Ｐａ以下の、１個または複数のノズル（１２）を通じて実施される、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記ガス状基質（１４）を少なくとも１個のスタティックミキサー（７）において、前記ガス発酵容器から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と混合し、その後循環させ、前記ガス発酵容器（２）中に噴霧する、前記〔２〕に記載の方法。
〔９〕前記ガス状基質（１４）が煙道ガスである、前記〔１〕に記載の方法。
〔１０〕－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記気相（１５）中に１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記容器（２）の内部と連通した注入導管（２５）を通じて、前記気相（１５）へ接続されている、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）。
〔１１〕－ ガス発酵微生物および発酵性媒地を含む液体発酵ブロス（１１）で部分的に満たされた内部容積を有する容器（２）であって、前記容器（２）の容積の残りの部分が、気相（１５）で満たされている、容器（２）
－ 前記容器（２）の内部と連通し、それによって前記液体発酵ブロス（１１）の一定分量が抜き出される、少なくとも１つの排出液循環導管（１９）であって、前記導管（１９）が、前記液体発酵ブロス（１１）の前記一定分量を、前記容器（２）の外部で循環させ、次いで、前記容器（２）に含まれる前記気相（１５）中に再び導入するための循環ライン（６）に接続されている、導管（１９）
－ 前記液体発酵ブロス（１１）を前記気相（１５）中に噴霧するための、前記排出液循環ライン（６）に接続された、少なくとも１個の噴霧ノズル（１２）
－ 前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）中に、１種または複数のガスを含むガス状基質（１４）を供給して、前記ガス発酵微生物を培養するための供給システム（３０）であって、前記循環ライン（６）に接続されることにより、こうして得られた気液混合物が、前記噴霧ノズル（１２）によって、前記容器（２）に存在する前記気相（１５）中に噴霧される、供給システム（３０）
を備える、ガス発酵バイオリアクター（１）。
〔１２〕前記循環ライン（６）が、前記容器（２）から抜き出された前記液体発酵ブロス（１１）と前記ガス状基質（１４）を混合して、前記気液混合物を生成するための、少なくとも１個のスタティックミキサー（７）を備える、前記〔１１〕に記載のガス発酵バイオリアクター（１）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】