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▶ アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-22
(45)【発行日】2022-08-30
(54)【発明の名称】補体関連障害におけるＣ５ｂ－９沈着に関するアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20220823BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220823BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 R ZNA
G01N33/15 Z
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2019522906
(86)(22)【出願日】2017-10-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-30
(86)【国際出願番号】 US2017058496
(87)【国際公開番号】W WO2018081400
(87)【国際公開日】2018-05-03
【審査請求日】2020-10-23
(31)【優先権主張番号】62/413,614
(32)【優先日】2016-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】503102674
【氏名又は名称】アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ガルブセラ， ミリアム
(72)【発明者】
【氏名】ノリス， マリーナ
(72)【発明者】
【氏名】レムッツィ， ジュゼッペ
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－２７８８３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】NORIS Marina et al.，Dynamics of complement activation in aHUS and how to monitor eculizumab therapy，BLOOD，2014年09月11日，Vol.124, No.11，pp.1715-1726
【文献】JEON Hyungtaek et al.，Quantification of complement system activation by measuring C5b-9 cell surface deposition using a cell-ELISA technique，Journal of Immunological Methods，2014年12月15日，Vol.415，pp.57-62
【文献】GASTOLDI Sara et al.，C5a/C5aR interaction mediates complemental activation and thrombosis on endothelial cells in atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS)，Immunobiology，2012年，Vol.217，pp.1145-1146
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３，３３／６８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、（ａ）補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを測定することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程（ｂ）と（ｃ）が自動化されている、方法。
【請求項2】
Ｃ５ｂ－９沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、（ａ）前記患者から得られた生体試料をＣ５の阻害剤がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をＣ５の阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを測定することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程（ｃ）と（ｄ）が自動化されており、前記阻害剤がない状態でインキュベートした試料と比較した、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料でのＣ５ｂ－９沈着の減少が、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項3】
Ｃ５ｂ－９沈着レベルを、補体関連障害を有する患者がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得るかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、（ａ）前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを測定することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程（ｃ）と（ｄ）が自動化されており、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がない状態でインキュベートした試料と比較した、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートした生体試料でのＣ５ｂ－９沈着の減少が、前記患者がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項4】
Ｃ５ｂ－９沈着レベルを、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いかどうかの指標とする方法であって、前記方法が、（ａ）前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートし、そして、前記患者から得られた生体試料をエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを測定することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
工程（ｃ）と（ｄ）が自動化されており、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がない状態でインキュベートした試料と比較した、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０がある状態でインキュベートした生体試料でのＣ５ｂ－９沈着の減少が、前記患者がエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
【請求項5】
Ｃ５ｂ－９沈着レベルを、補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療されている患者をモニタリングするための指標とする方法であって、前記方法が、（ａ）前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを測定することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと
を含む方法であって、工程（ｂ）と（ｃ）が自動化されており、前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのＣ５ｂ－９沈着の、前記コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較した増加が、前記患者に投与する前記阻害剤の用量が増加させられ得ることを示す、方法。
【請求項6】
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを、前記コントロール試料のものと同レベルまたはそれより低くなるまで抑制するのに十分であるかどうかを判断する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｃ５の前記阻害剤は、エクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０などの抗体あるいはその抗原結合断片である、請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞が、固体プラットフォーム上で培養される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記固体プラットフォームが、９６ウェルマイクロプレートである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
前記細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±１０％の変化が包含される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記細胞は、ウェル当たり約１０，０００～約１２，５００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±１０％の変化が包含される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養され、約には、指定された値から最大±１０％の変化が包含される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記生体試料が血清を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記血清は、ａＨＵＳの患者、ａＨＵＳからの寛解の患者またはエクリズマブ未感作またはＡＬＸＮ１２１０未感作患者由来のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞は、前記生体試料と接触させられる前に、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞は、約１．５時間～約４時間、前記生体試料と接触させられ、約には、指定された値から最大±１０％の変化が包含される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記測定する工程の前に、固定液と共にインキュベートされる、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して測定される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体は、検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して測定される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
透過処理の後、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｉｎ、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ｓｔａｉｎからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、請求項１から３、および、５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
請求項２から４のいずれか一項に記載の方法に従ってエクリズマブまたはＡＬＸＮ１２１０での治療から利益を得ると示唆された患者において補体関連障害を治療する方法において使用するための組成物であって、前記組成物は、エクリズマブもしくはＡＬＸＮ１２１０またはその抗原結合断片を含み、前記方法は、治療有効量のエクリズマブもしくはＡＬＸＮ１２１０またはその抗原結合断片を前記患者に投与することを含む、組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮出願第６２／４１３，６１４号の優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮出願第６２／４１３，６１４号の優先権を主張する。前述の出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）は、非制限的内皮補体活性化の稀な疾患であり、これは最終的に腎臓微小血管血栓症を引き起こす。新患の発症率は、年間１００万人あたり１～２人である。
【0003】
薬剤ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））を用いたａＨＵＳ患者の治療は、米国および欧州で承認されている。しかしながら、これらの患者を治療するための効果的な薬剤の利用可能性にもかかわらず、ａＨＵＳ患者の診断と、疾患の治療の効能および過程のモニタリングは必要なままである。補体活性化の特異的マーカーおよび感受性マーカーがないことは、ａＨＵＳだけでなく、他の補体関連障害にも当てはまる。
以前の研究では、Ｃ５ｂ－９沈着を手動検出する試験について説明した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２４：１７１５－２６）。しかしながら、この試験は煩雑で時間がかかり、長い経験年数を持つ専門家の博士号の科学者または技術者によって、高度な試験研究環境でのみ実施できる。ａＨＵＳは慢性疾患であり、患者はエクリズマブおよび他の療法の有効性をモニタリングし、また患者の生涯にわたって内皮レベルで補体活性をモニタリングするのみならず、治療が間隔を置いているかまたは中断されるものであれば疾患の再発を予測するために反復検査がしばしば必要であるということを考慮すると、対費用効果が高く、再現性があり、効果的であり、精密であり、正確であり、また高度でない研究環境において容易に行うことができる（例えば、適切なトレーニングを受けた技術者によって）ような信頼できる検査が未だ要望されている。これにより、コストが著しく低減され、大掛かりな移動を必要とすることなく、患者がより迅速に結果を得ることができるようになるという重要な利点が提供される。このような検査はまた、外部委託を可能にし、分析時間を短縮し、それによって検査を診断に適切なものとし、治療のモニタリングおよび調整を行うことができる。本明細書に記載される方法は、未だ対処されていないこれらの要望に対処するものである。
以前の研究では、Ｃ５ｂ－９沈着を手動検出する試験について説明した（Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２４：１７１５－２６）。しかしながら、この試験は煩雑で時間がかかり、長い経験年数を持つ専門家の博士号の科学者または技術者によって、高度な試験研究環境でのみ実施できる。ａＨＵＳは慢性疾患であり、患者はエクリズマブおよび他の療法の有効性をモニタリングし、また患者の生涯にわたって内皮レベルで補体活性をモニタリングするのみならず、治療が間隔を置いているかまたは中断されるものであれば疾患の再発を予測するために反復検査がしばしば必要であるということを考慮すると、対費用効果が高く、再現性があり、効果的であり、精密であり、正確であり、また高度でない研究環境において容易に行うことができる（例えば、適切なトレーニングを受けた技術者によって）ような信頼できる検査が未だ要望されている。これにより、コストが著しく低減され、大掛かりな移動を必要とすることなく、患者がより迅速に結果を得ることができるようになるという重要な利点が提供される。このような検査はまた、外部委託を可能にし、分析時間を短縮し、それによって検査を診断に適切なものとし、治療のモニタリングおよび調整を行うことができる。本明細書に記載される方法は、未だ対処されていないこれらの要望に対処するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｎｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２４：１７１５－２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者における補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定するための方法が本明細書で提供される。
【0006】
一態様では、補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法が、本明細書で提供される。
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法が、本明細書で提供される。
【0007】
別の態様では、補体関連障害（例えば、ａＨＵＳ）である患者がＣ５の阻害剤（例えば、エクリズマブ）での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、該方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および該阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および該阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
【0008】
別の態様では、補体関連障害であり、Ｃ５の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、該方法が、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化すること、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）該細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化すること、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。
【0009】
一実施形態では、増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、増加した用量が細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する。
【0010】
別の態様では、本明細書に記載される方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに反応すると判断された患者内の補体関連障害を治療する方法が本明細書で提供され、該治療する方法は、治療有効量の阻害剤またはエクリズマブを患者に投与することを含む。
【0011】
一部の実施形態では、患者は非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する。
【0012】
特定の実施形態では、Ｃ５の阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である。
【0013】
一部の実施形態では、細胞は、マイクロプレート（例えば、９６ウェルマイクロプレート）などの固体プラットフォーム上で培養される。
【0014】
一部の実施形態では、疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、内皮細胞は、皮膚由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される。
【0015】
特定の実施形態では、細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される。他の実施形態では、細胞は、ウェル当たり約１０，０００細胞～約１２，５００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される。さらに他の実施形態では、細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される。一部の実施形態では、細胞は、生体試料（例えば、血清）と接触させる前にコンフルエントである。一部の実施形態では、血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者からのものである。
【0016】
一部の実施形態では、細胞は、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される。一部の実施形態では、細胞は、約１．５時間～約４時間生体試料と接触させる。一部の実施形態では、細胞は、接触させる工程の後であるが、評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液でインキュベートされる。
【0017】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法におけるＣ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して評価される。一部の実施形態では、抗Ｃ５ｂ－９抗体は、染料などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される。一部の実施形態では、Ｃ５ｂ－９沈着レベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される。特定の実施形態では、抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、細胞を透過処理する。他の実施形態では、抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、細胞を透過処理する。一部の実施形態では、透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に細胞をインキュベートする。例示的な薬剤としては、例えば、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ染料、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ緑色核酸染色試薬、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ染色試薬が挙げられる。
【0018】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法の一つ以上の工程は自動化される。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁によって提供されることとなる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
(項目２)
補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および前記阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
前記阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目３)
補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目４)
非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目５)
補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療されている患者をモニタリングする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、前記コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより多い場合、前記患者に投与する前記阻害剤の用量を増加させることとを含む、方法。
(項目６)
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、項目５に記載の方法。
(項目７)
項目１から４のいずれか一項に記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに対して応答性であると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量の前記阻害剤またはエクリズマブを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目８)
前記Ｃ５の前記阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、項目２、５または６に記載の方法。
(項目９)
前記細胞が、マイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記固体プラットフォームが、９６ウェルマイクロプレートである、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記疾患関連細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、項目１１記載の方法。
(項目１３)
前記細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記細胞は、ウェル当たり約１０，０００～約１２，５００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
前記細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記生体試料が血清である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者由来のものである、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記細胞は、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記細胞は、約１．５時間～約４時間、前記生体試料と接触させられる、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液と共にインキュベートされる、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して評価される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体は、色素などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、項目２０記載の方法。
(項目２４)
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２７)
透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、項目２５または２６に記載の方法。
(項目２８)
前記薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｉｎ、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ｓｔａｉｎからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
一つ以上の工程が自動化されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、項目１から３、５から１７、および、１９から２９のいずれか一項に記載の方法。
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公開公報の写しは、請求および必要な料金の支払いにより米国特許庁によって提供されることとなる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、前記障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
(項目２)
補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および前記阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
前記阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、前記阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者が前記阻害剤での治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目３)
補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目４)
非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの前記生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着がより少ないということが、前記患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いことを示唆するものである、方法。
(項目５)
補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療されている患者をモニタリングする方法であって、前記方法が、
（ａ）前記患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）前記阻害剤で治療されている前記患者からの前記生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、前記コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより多い場合、前記患者に投与する前記阻害剤の用量を増加させることとを含む、方法。
(項目６)
増加させた用量の前記阻害剤を前記患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、前記増加させた用量が前記細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、項目５に記載の方法。
(項目７)
項目１から４のいずれか一項に記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに対して応答性であると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、前記方法は、治療有効量の前記阻害剤またはエクリズマブを前記患者に投与することを含む、方法。
(項目８)
前記Ｃ５の前記阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、項目２、５または６に記載の方法。
(項目９)
前記細胞が、マイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
(項目１０)
前記固体プラットフォームが、９６ウェルマイクロプレートである、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記疾患関連細胞は、皮膚起源由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、項目１１記載の方法。
(項目１３)
前記細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記細胞は、ウェル当たり約１０，０００～約１２，５００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
(項目１５)
前記細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔かれて、コンフルエントまで培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
細胞は、前記生体試料と接触させられる前にコンフルエントである、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
前記生体試料が血清である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者由来のものである、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記細胞は、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記細胞は、約１．５時間～約４時間、前記生体試料と接触させられる、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記細胞は、前記接触させる工程の後であるが、前記評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液と共にインキュベートされる、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して評価される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体は、色素などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、項目２０記載の方法。
(項目２４)
Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２６)
前記抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、前記細胞を透過処理する、項目２３に記載の方法。
(項目２７)
透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に前記細胞をインキュベートする、項目２５または２６に記載の方法。
(項目２８)
前記薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｉｎ、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ｓｔａｉｎからなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
一つ以上の工程が自動化されている、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
前記患者は、非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、項目１から３、５から１７、および、１９から２９のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、９６ウェルマイクロプレート上に播種後の様々な時点での培養中の３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，５００、および１０，０００個のＨＭＥＣ－１細胞の位相差顕微鏡画像を示す。最右列は、培養９６時間後にクリスタルバイオレット染色で染色された細胞の位相差顕微鏡画像を示す。
【図5A】図５Ａは、培地、コントロール血清、ａＨＵＳ１急性血清、ａＨＵＳ１急性血清＋ｓＣＲ１、およびａＨＵＳ２急性血清、と共にインキュベートされた休止ＨＭＥＣ－１細胞の染色を示す。二次抗体を１：６００希釈で使用した。左側は１００μＬのＰＢＳ／２％ＢＳＡブロッキング緩衝液であり、右側はＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液である。
【図5B】図５Ｂは、培地、コントロール血清、ａＨＵＳ１急性血清、ａＨＵＳ１急性血清＋ｓＣＲ１、およびａＨＵＳ２急性血清、と共にインキュベートされたＡＤＰ活性化ＨＭＥＣ－１細胞の染色を示す。二次抗体を１：６００希釈で使用した。左側は１００μＬのＰＢＳ／２％ＢＳＡブロッキング緩衝液であり、右側はＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液である。
【図5C】図５Ｃは、培地、コントロール血清、ａＨＵＳ１急性血清、ａＨＵＳ１急性血清＋ｓＣＲ１、およびａＨＵＳ２急性血清、と共にインキュベートされた休止ＨＭＥＣ－１細胞の染色を示す。二次抗体を１：１２００希釈で使用した。左側は１００μＬのＰＢＳ／２％ＢＳＡブロッキング緩衝液であり、右側はＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液である。
【図5D】図５Ｄは、培地、コントロール血清、ａＨＵＳ１急性血清、ａＨＵＳ１急性血清＋ｓＣＲ１、およびａＨＵＳ２急性血清、と共にインキュベートされたＡＤＰ活性化ＨＭＥＣ－１細胞の染色を示す。二次抗体を１：１２００希釈で使用した。左側は１００μＬのＰＢＳ／２％ＢＳＡブロッキング緩衝液であり、右側はＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書において、補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者の生体試料中に存在する因子によって促進される、細胞、例えば、内皮細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を検出するアッセイが開示される。このアッセイは、例えば、補体関連障害を有する患者を診断するため、Ｃ５の阻害剤（例えば、エクリズマブ）での治療で患者が利益を得る可能性が高いかどうかを判断するため、Ｃ５の阻害剤で治療している患者においてＣ５の阻害剤の投与量を漸増するため、および／または新規のＣ５阻害剤のスクリーニングを行うために、使用することができる。
【0021】
定義
本明細書がより簡単に理解できるように、以下の定義が提供される。
本明細書がより簡単に理解できるように、以下の定義が提供される。
【0022】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語は区別なく使用され、長さまたは翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。本明細書に記載されるタンパク質は、野生型タンパク質を含有もしくは野生型タンパク質であることが可能であり、または５０個以下（例えば、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１２個以下、１５個以下、２０個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下、４０個以下、または５０個以下）の保存的アミノ酸置換を有する変異体であることが可能である。保存的置換は通常、以下のグループの範囲内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リシン、ヒスチジンおよびアルギニン；フェニルアラニンおよびチロシン。
【0023】
本明細書において使用される場合、「抗体」という語は、全抗体および全抗体の抗原結合断片の両方を含む。全抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプが含まれる。「抗体」という語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、脱免疫化抗体、および完全ヒト抗体を含む。抗体は、例えば、ヒトなどの哺乳動物、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）、ハムスター、ラット、およびマウスなどの種々の種のいずれかにおいて作られるか、またはそれらから誘導することができる。抗体は、精製抗体または組換え抗体とすることができる。
【0024】
本明細書において使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という語、または類似の語は、標的抗原（例えば、ヒトＣ５）に結合して該標的抗原の活性を阻害する能力を保持する抗体の断片を指す。かかる断片としては、例えば、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。ｓｃＦｖ断片は、そこからｓｃＦｖが誘導される抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との両方を含む一本鎖ポリペプチドである。さらに、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、およびダイアボディもまた、抗体の定義内に含まれ、本明細書に記載の方法での使用に適合する。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１）：４７－６６；Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｋｏｒｔｔ （１９９９） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１）：１７７－１８９；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１－１１２３および、Ｒｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｍａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５１：２５７－２８３を参照されたく、またそのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0025】
「抗体」という語は、例えば、ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体等である単一ドメイン抗体を含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２６：２３０－２３５；Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ １：２５３－２６３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２３１：２５－３８；ＰＣＴ出願国際公開第９４／０４６７８号および第９４／２５５９１号および米国特許第６，００５，０７９号を参照されたく、このすべてはその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態においては、この開示は、単一ドメイン抗体が形成されるように修飾を有する二つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。「抗体」という語はまた、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有する二重特異性抗体および多重特異性抗体を含む。二重特異性抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ抗体を含む）は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する。
【0026】
本明細書で使用される場合、「個体」または「対象」という語を修飾するために使用される場合、「正常」という語は、特定の疾患もしくは症状（例えば、ａＨＵＳ）を有さず、かつ、疾患もしくは症状を発症するリスクを有するまたはあることが疑われない、個体または個体の群を指す。
【0027】
本明細書において使用される場合、「コントロール試料」または「参照試料」は、例えば、健康な対象からの試料、または評価される対象からの早期の試料等を含む、任意の臨床関連コントロールまたは参照試料を指す。例えば、コントロール試料または参照試料は、補体関連障害の発症前、疾患の早期段階、または治療の施術前の対象からのサンプルでありうる。
【0028】
本明細書で使用される場合、「コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）」という語は、実質的に全ての利用可能な表面が使用されるように、細胞がある面（例えば、マイクロプレートのウェルの表面）上に可干渉性の単細胞層を形成したことを意味する。「実質的にコンフルエント」という語は、使用可能な表面の約７０％超、例えば約９０％超が使用されるように、細胞が表面上に全体的に接触することを意味する。「利用可能な表面」は、細胞を収容するのに十分な表面積を意味する。
【0029】
本明細書で使用される場合、「補体関連障害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、病原体が補体系の異常な活性化に関与しているようなすべての疾患および病態を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「エクリズマブ未感作」は、エクリズマブで以前に治療されていない患者を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「生体試料」は、患者から単離された、流体、細胞、または組織、および／またはその組み合わせを指す。特定の実施形態においては、患者から単離された生体試料は、血清、血液、および尿からなる群から選択される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）」は、患者または対象の外側の環境を指す。
【0033】
「細胞数によるＣ５ｂ－９沈着レベルの正規化」という文脈で使用される場合、「正規化（する）」という語は、細胞試料（例えば、９６ウェルマイクロプレートのあるウェル）中にある生のＣ５ｂ－９信号レベルを獲得して、その値を同じ細胞試料中の細胞数で除算することを指す。Ｃ５の阻害剤の用量を漸増する（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）文脈では、「正規化」という語は、Ｃ５ｂ－９沈着のレベルがコントロール試料（すなわち、ベースラインまたはバックグラウンドのレベル）のそれと本質的に同様であるか、またはそれよりも低くなるまで、阻害剤の用量を増加することを指す。特定の実施形態では、コントロール試料のレベルと本質的に同様であるＣ５ｂ－９沈着のレベルは、コントロールのレベルよりも低いＣ５ｂ－９のレベルを示しうるか、または、高い場合には、コントロールのレベルよりも約１～２０％高く、例えば約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％高いレベルを示しうる。
【0034】
本明細書で使用される場合、「患者」は、予防的または治療的な治療いずれかを受けるヒトまたは他の哺乳類の対象を指す。
【0035】
本明細書において使用される場合、「対象」とは、任意のヒト動物または非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」とは、例えば哺乳類、および非哺乳類である全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを指す。
【0036】
「治療有効量」または「治療上有効な用量」または本明細書において使用される類似の語は、所望の生物学的または医学的応答（例えば、ａＨＵＳの一つ以上の症状の改善）を引き出すような、薬剤（例えば、ヒトＣ５の阻害剤）の量を意味することが意図されている。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、治療有効量のヒト補体成分Ｃ５の阻害剤を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、補体成分Ｃ５タンパク質に結合する、治療有効量の抗体又はその抗原結合断片の阻害剤を含有する。一部の実施形態では、組成物は、全体として治療上有効であるように、２種以上（例えば、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、または１１種以上）のヒト補体成分Ｃ５の異なる阻害剤を含有する。例えば、組成物は、ヒトＣ５タンパク質に結合する抗体と、ヒトＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡと結合し、該ｍＲＮＡの分解を促進するｓｉＲＮＡとに結合する抗体を含有することができ、ここで抗体およびｓｉＲＮＡはそれぞれ組み合わされたときに治療的に有効である濃度である。一部の実施形態では、組成物は、組成物全体として治療的に有効であるように、阻害剤および一つ以上の第二の活性薬剤を含有する。例えば、組成物は、ヒトＣ５タンパク質に結合する抗体、およびａＨＵＳなどの補体関連障害の治療または予防に有用な別の薬剤を含むことができる。
【0037】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により別途明示していない限り、複数の指示対象を含む。「または」または「および」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。また、「含むこと」という語ならびに「含む」、「含む」、および「含まれる」などのその他の形態の使用を制限しない。
【0038】
本明細書で使用される場合、「約」は、量、時間的期間等の測定可能な値に言及するとき、指定された値から最大±１０％の変化を包含する。別途示さない限り、分子量、反応条件、スコアシステムのスコアなど、本明細書で使用される成分、性質の量を表すすべての数字は、「約」という語によって修飾されているものとして理解される。
【0039】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の説明、実施例、および請求項から明らかであろう。
【0040】
Ｉ．補体系の概要
補体系は、体の他の免疫系と共に作用することで、細胞病原体およびウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも２５個の補体タンパク質があり、これは血漿タンパク質および膜因子の複合集合（ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）として見出される。血漿タンパク質は、脊椎動物血清中のグロブリンの約１０％を占める。補体成分は、複雑だが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントにおいて相互作用することにより、それらの免疫防御機能を達成する。その結果である補体カスケードが、オプソニン作用、免疫調節作用および溶解作用を有する産物の産生を導く。補体活性化に関連付けられた生物学的活性の簡潔な要約が、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎで提供される。
補体系は、体の他の免疫系と共に作用することで、細胞病原体およびウイルス病原体の侵入に対して防御する。少なくとも２５個の補体タンパク質があり、これは血漿タンパク質および膜因子の複合集合（ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）として見出される。血漿タンパク質は、脊椎動物血清中のグロブリンの約１０％を占める。補体成分は、複雑だが正確な一連の酵素的切断および膜結合イベントにおいて相互作用することにより、それらの免疫防御機能を達成する。その結果である補体カスケードが、オプソニン作用、免疫調節作用および溶解作用を有する産物の産生を導く。補体活性化に関連付けられた生物学的活性の簡潔な要約が、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎで提供される。
【0041】
補体カスケードは、古典経路、副経路、またはレクチン経路を経て進行する。これらの経路は多くの成分を共有し、それらはそれらの初期ステップで異なっているが、標的細胞の活性化および破壊に重要な役割を担う同一の「終末補体」成分（Ｃ５～Ｃ９）に収束して、それを共有する。
【0042】
古典経路（ＣＰ）は、典型的には、標的細胞上の抗原部位の抗体認識および該抗原部位への結合によって開始される。副経路（ＡＰ）は抗体と独立であることができ、病原体表面上の特定の分子によって開始されうる。さらに、レクチン経路は典型的には、高マンノースである基質にマンノース結合レクチン（「ＭＢＬ」）が結合することにより開始される。これら経路は、補体成分Ｃ３が活性プロテアーゼによって切断されてＣ３ａおよびＣ３ｂが得られる点において収束する。補体攻撃を活性化する他の経路は、後に補体機能の様々な態様を導く事象のシーケンスにおいて作用することができる。Ｃ３ａはアナフィラトキシンである。Ｃ３ｂは細菌および他の細胞のみならず、特定のウイルスおよび免疫複合体に結合し、循環からの除去のためにそれらにタグを付ける。このＣ３ｂのオプソニン作用は、概して、補体系の最も重要な抗感染作用であると考えられている。Ｃ３ｂはまた、補体成分Ｃ５（以下「Ｃ５」と称する）をＣ５ａおよびＣ５ｂに切断する、古典経路又は副経路のＣ５転換酵素を形成するために、各経路に固有である他の成分と複合体を形成する。
【0043】
Ｃ５の切断は、例えばＣ５ａ、強力なアナフィラトキシンおよび化学的因子、およびＣ５ｂなどの生物学的活性種を放出するが、これは一連のタンパク質相互作用を通して溶解性終末補体複合体Ｃ５ｂ－９の形成につながる。Ｃ５ａおよびＣ５ｂ－９はまた、加水分解酵素、活性酸素種、アラキドン酸代謝産物、および様々なサイトカインなどの下流炎症因子の放出を増幅することによって、多面発現的な細胞活性化特性も有する。
【0044】
Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８と複合化して、Ｃ５ｂ－８複合体を標的細胞表面で形成する。いくつかのＣ９分子が結合すると、膜侵襲複合体（ＭＡＣ、終末補体複合体ＴＣＣであるＣ５ｂ－９）が形成される。標的細胞膜に十分な数のＭＡＣを挿入すると、それらが作り出す開口（ＭＡＣポア）が、標的細胞の急速な浸透圧溶解を媒介する。非溶解（ｎｏｎ－ｌｙｔｉｃ）性の濃度の低いＭＡＣは、その他の影響を生じうる。特に、内皮細胞および血小板への少数のＣ５ｂ－９複合体の膜内挿入は、有害な細胞活性化を引き起こす可能性がある。一部の事例では、活性化が細胞溶解に先行しうる。
【0045】
上述のように、Ｃ３ａおよびＣ５ａは活性化された補体成分である。これらは、好塩基球および肥満細胞からのヒスタミン、ならびに、平滑筋収縮、血管透過性亢進、白血球活性化、および、細胞過形成をもたらす細胞増殖を含めた他の炎症性の現象をもたらす他の炎症の介在物質が放出される、肥満細胞の脱顆粒を誘発することができる。Ｃ５ａはまた、炎症促進性顆粒球を補体活性化部位に引き寄せる働きをする走化性ペプチドとして機能する。Ｃ５ａ受容体は、気管支および肺胞の上皮細胞ならびに気管支の平滑筋細胞の表面上で発見される。Ｃ５ａ受容体は、好酸球、肥満細胞、単球、好中球、および活性化リンパ球上でも発見されている。
【0046】
ＩＩ．生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でのＣ５ｂ－９沈着の検出
本明細書において、細胞（例えば、内皮細胞）上のＣ５ｂ－９の沈着を検出するための新しい生体外アッセイを提供する。こうしたアッセイは、抗Ｃ５抗体療法に反応するであろう、補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者を特定するために特に有用である（例えば、このような患者からの生体試料について細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を促進する能力を試験することによって）。かかるアッセイはまた、例えばＣ５の候補阻害剤などの補体副経路の候補阻害剤をスクリーニングするためにも有用である。
本明細書において、細胞（例えば、内皮細胞）上のＣ５ｂ－９の沈着を検出するための新しい生体外アッセイを提供する。こうしたアッセイは、抗Ｃ５抗体療法に反応するであろう、補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者を特定するために特に有用である（例えば、このような患者からの生体試料について細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を促進する能力を試験することによって）。かかるアッセイはまた、例えばＣ５の候補阻害剤などの補体副経路の候補阻害剤をスクリーニングするためにも有用である。
【0047】
概して、細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を検出するアッセイは、以下の工程：
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、関心の特定の障害に関連する細胞型と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む。
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、関心の特定の障害に関連する細胞型と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む。
【0048】
接触させる工程は、関心の補体関連障害に関連する細胞を生体外で提供することと、補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料を細胞と接触させることとが必要である。理論に束縛されるものではないが、生体試料中に存在する補体分子は、細胞におけるＣ５ｂ－９の生成および沈着を促進する。好ましい実施形態では、関心の疾患はａＨＵＳであり、患者からの生体試料（例えば、血清）は内皮細胞と接触させる。一実施形態では、内皮細胞はＨＭＥＣ－１細胞である。別の実施形態では、内皮細胞は初代内皮細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）である。またその他の実施形態では、内皮細胞は、皮膚起源のヒト内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、包皮からの内皮細胞、または肝臓腺癌からの内皮細胞である。
【0049】
一実施形態では、足細胞またはメサンギウム細胞を、Ｃ３糸球体症などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、網膜色素上皮細胞を、加齢性黄斑変性症などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、軟骨細胞を、関節炎などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、ニューロンおよびグリア細胞を、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、ならびに虚血性および外傷性の脳障害などの補体関連障害であるか、または該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、赤血球を、発作性夜間血色素尿症などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、骨格筋細胞を、重症筋無力症などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。別の実施形態では、心筋細胞を、心筋梗塞などの補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる患者からの生体試料と接触させる。同様の様式で、補体関連障害に関与することが知られている任意の細胞型を、本明細書に記載の方法で使用して、障害を有する患者からの生体試料のＣ５ｂ－９沈着を促進する能力を試験することができる。本明細書で提供するガイダンス（特に、実施例において）により、当業者は、本明細書に記載される方法において特定の細胞型を使用するのに必要な条件を容易に決定することができる。
【0050】
患者からの生体試料は、例えば、全血とすることができる。一部の実施形態では、生物学的流体は、血液分画、例えば、血清または血漿である。一部の実施形態では、生物学的流体は尿である。追加的な適切な生体試料には、組織、細胞溶解物、リンパ液、唾液、脳脊髄液、滑液、鼻の分泌物、およびその他の体液を含む試料が含まれる。本明細書に記載される方法で使用するための生体試料は典型的には新鮮であるが、凍結保存することができる。Ｃ５ｂ－９複合体の生成を可能にする／サポートする任意の生体試料は、本明細書に記載の方法での使用に適している。生体試料がＣ５ｂ－９複合体の生成を可能にする／サポートするかどうかは、当技術分野で公知である方法を用いて、陽性コントロール（例えば、ａＨＵＳなどの補体関連障害を有することがわかっている患者からの生体試料）および陰性コントロール（健康なコントロールからの生体試料）と比較して判断することができる。
【0051】
一部の実施形態では、アッセイは、固体支持体上で培養された細胞上で実施される。固体支持体は、例えば、ビーズ、チューブ、チップ、樹脂、プレート、ウェル、フィルム、またはマイクロプレートとすることができる。固体支持体のための模範的な材料には、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、金属、セルロース、ゲル、ポリスチレン、ポリエステル、およびデキストランが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、細胞は９６ウェルマイクロプレートなどの標準の複数ウェルのマイクロプレート上で培養される。
【0052】
特定の実施形態では、患者は、関節リウマチ（ＲＡ）；抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）；ループス腎炎；虚血再灌流損傷；ａＨＵＳ；志賀毒素産生性大腸菌感染症（ＳＴＥＣ－ＨＵＳ）に関連する典型的な（下痢性または感染性とも呼ばれる）溶血性尿毒症症候群；デンスデポジット病（ＤＤＤ）；視神経脊髄炎（ＮＭＯ）；多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）；多発性硬化症（ＭＳ）；黄斑変性症（例えば、加齢性黄斑変性症）；溶血、肝酵素上昇および血小板低下の症候群（ＨＥＬＬＰ）；血小板減少性血栓性紫斑病（ＴＴＰ）；自然死産；血管炎（例えば、Ｐａｕｃｉ－ｉｍｍｕｎｅ血管炎）；糸球体症（例えば、Ｃ３糸球体症）；表皮水疱症；慢性同種移植片拒絶反応；習慣性流産；外傷性脳障害；ならびに、心筋梗塞、心肺バイパスおよび血液透析から生じる障害、からなる群から選択される補体関連障害であるかまたは該障害であることが疑われる。一部の実施形態では、補体関連障害は、心血管障害、心筋炎、脳血管障害、末梢（例えば、筋骨格）血管障害、腎血管障害、腸間膜／腸血管障害、血管炎、シェンラインヘノッホ紫斑病腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチ関連血管障炎、免疫複合体性血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、川崎病（動脈炎）、静脈ガス塞栓症（ＶＧＥ）ならびにステント留置、回転性のアテレクトミーおよび経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）の後の再狭窄などである補体関連血管障害である。さらなる補体関連障害には、重症筋無力症（ＭＧ）、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、皮膚筋炎、発作性寒冷ヘモグロビン尿症（ＰＣＨ）、バセドウ病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、全身性炎症反応性敗血症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック、脊髄障害、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グッドパスチャー症候群、デゴス病、および劇症型ＡＰＳ（ＣＡＰＳ）が挙げられるがこれに限定されない。好ましい実施形態では、患者はａＨＵＳを有するかもしくはａＨＵＳであることが疑われる、または寛解している。
【0053】
一部の実施形態では、細胞が固体支持体上にコンフルエントな単層を形成したら、患者からの生体試料と細胞を接触させる。例えば、一実施形態では、内皮細胞を、９６ウェルマイクロプレート上に５，０００細胞／ウェルの密度で蒔いて、生体試料と接触させる前にコンフルエントに到達させる。細胞培養条件によるが、９６ウェルマイクロプレート上に約５，０００細胞／ウェルの密度で播種したＨＭＥＣ－１細胞は、典型的には、約９６時間かかってコンフルエントに達する。特定の実施形態では、内皮細胞は、９６ウェルマイクロプレート上に約１５，０００細胞／ウェルの密度で蒔く。ここでも細胞培養条件によるが、９６ウェルマイクロプレート上に約１５，０００細胞／ウェルの密度で播種したＨＭＥＣ－１細胞は、約１６～２４時間でコンフルエントになる。特定の実施形態では、内皮細胞は、９６ウェルマイクロプレート上に約１０，０００または約１２，５００細胞／ウェルの密度で蒔く。細胞培養条件によるが、ウェルあたり約１０，０００または約１２，５００細胞で播種したＨＭＥＣ－１細胞は、典型的には、約４８時間かかってコンフルエントに達する。細胞を蒔いてからコンフルエントに達するまでの時間は、細胞型に依存し、本明細書で提供するガイダンスに基づいて当業者によって容易に決定されうる。
【0054】
さらなる実施形態では、生体試料と接触させる前に、細胞を活性化させる。一部の実施形態では、生体試料と接触させる前に、細胞（例えば、内皮細胞）がアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、リポ多糖、またはトロンビンを使用して活性化される。他の実施形態では、細胞は休止状態で使用される（すなわち、細胞は活性化されない）。
【0055】
一部の実施形態では、細胞は、増殖培地（すなわち、血清を含有する培地）中でマイクロプレート上に播種され、活性化または生体試料との接触の前に血清を含まない培地中で特定の期間（例えば、２４時間）培養される。
【0056】
一部の実施形態では、接触させる工程のために、生体試料（例えば、試験血清）は、約１：１～約１：１０であって、例えば約１：１～約１：８、約１：１～約１：６、約１：１～約１：４、または約１：１～約１：２の体積／体積比で培地（例えば、細胞培養培地）と混合される。一部の実施形態では、接触させる工程のために、生体試料は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９または約１：１０の体積／体積比で培地と混合される。一実施形態では、生体試料は約１：２の比で培地と混合される。生体試料と培地との混合物は、本明細書で「試験試料／試験培地混合物」と呼称される。一部の実施形態では、試験培地は、例えば、１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロースに、０．５％ＢＳＡを添加した組成を有するＨａｎｋ緩衝生理食塩水である。その他の適切なタイプの試験培地には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。必要ではないが、細胞は典型的には、試験試料／試験培地混合物との培養の前に、試験培地で洗浄（例えば、１、２、３または４回）される。
【0057】
一部の実施形態では、細胞は、約３０分～１２時間であって、例えば、約１時間～８時間、約２時間～６時間、または約３時間～４時間の間、生体試料（例えば、試験試料／試験培地混合物）と接触させる。特定の実施形態では、細胞は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間の間、生体試料と接触させる。好ましい実施形態では、細胞は４時間の間、生体試料と接触させる。
【0058】
接触させる工程に続いて、細胞は、特に後に免疫染色手順を受けることとなる場合には、Ｃ５ｂ－９沈着の検出の前に固定されうる。適切な非限定的な固定液としては、例えば、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、酢酸、アセトン、四酸化オスミウム、クロム酸、塩化第二水銀、ピクリン酸、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール）、Ｇｅｎｄｒｅ’ｓ液、ロスマン液、Ｂ５固定液、Ｂｏｕｉｎ液、Ｃａｒｎｏｙ固定液、およびｍｅｔｈａｃａｒｎ液が挙げられる。好ましい実施形態では、細胞はパラホルムアルデヒド中で固定される。一実施形態では、細胞は４％パラホルムアルデヒド中で固定される。細胞は典型的には、例えばリン酸緩衝生理食塩水である、適切な緩衝液での固定後に洗浄される。
【0059】
評価する工程は典型的に、細胞（例えば、内皮細胞）におけるＣ５ｂ－９沈着の検出を伴う。特定の実施形態では、評価する工程は、Ｃ５ｂ－９を特異的に認識する抗体（例えば、抗Ｃ５ｂ－９抗体）での免疫染色（例えば、免疫細胞化学）を伴う（すなわち、一次抗体）。かかる抗体は、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から市販されているか、または当技術分野で公知の標準の抗体産生方法を使用して新規に生成することができる。
【0060】
Ｃ５ｂ－９沈着の検出前に、細胞をブロッキング溶液でインキュベートすることができる。例示的な非限定的なブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清、魚皮ゼラチン、ウマ血清、ブタ血清、ロバ血清、ウサギ血清、またはＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などの任意の適切な市販のブロッキング剤が挙げられる。
【0061】
Ｃ５ｂ－９沈着の検出は、一次抗体および二次抗体を使用する免疫染色を伴いうる。一部の実施形態では、一次抗体は、Ｃ５ｂ－９（例えば、ヒトＣ５ｂ－９）を特異的に認識する抗体である。一実施形態では、一次抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、一次抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、一次抗体は、任意の種、例えば、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、モルモット、ヒトなどからのものとすることができる。
【0062】
特定の実施形態では、一次抗体は、少なくとも１：５０であって、例えば、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：２５００、１：３０００、１：３５００、１：４０００、１：４５００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、または約１：１０，０００、およびその間のすべての範囲および値を含む、約１：５０～約１：１０，０００で、適切な緩衝液中で希釈される。適切な緩衝液は当業者に周知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、およびこれに類するものを含む。一部の実施形態では、緩衝液は、例えば、約０．０５％～約０．３％であって、例えば約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．２５％、およびその間の全ての範囲および値の最終濃度で、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＮＰ－４０等である界面活性剤、ならびに／またはブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ）が補われる。
【0063】
一次抗体と抗原との間の結合を検出するために二次抗体を使用することは周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，２００１を参照されたい）。二次抗体は、一次抗体の起源の種に基づいて選択され、例えば、一次抗体がマウス抗体であれば、その場合二次抗体は例えば、ウサギ抗マウス抗体であることになる。
【0064】
二次抗体は、典型的には検出可能な部分に結合（例えば、抱合または融合）される。検出可能な部分は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して、二次抗体に抱合されることができる。適切な検出可能な部分には、発光標識、蛍光標識、放射性標識、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、グルコース酸化酵素、アセチルコリン転移酵素）、発色団標識、エピトープ標識、リン光性標識、ＥＣＬ標識、染料、ハプテン、ビオテン（ｂｉｏｔｅｎ）、光親和性標識等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法で使用するための検出可能な部分に抱合される二次抗体も市販されている。
【0065】
一部の実施形態では、一次抗体は検出可能部分に抱合され、二次抗体はＣ５ｂ－９沈着物を検出するために使用されない。検出可能部分を付加することは、その標的抗原（例えば、Ｃ５ｂ－９）の一次抗体との結合に干渉しない。検出可能部分を一次抗体に抱合する方法は、当技術分野ではルーチンである。
【0066】
抗体複合体（一次／二次抗体複合体）の抗原との結合後、細胞上の抗体－抗原複合体から生成される信号を定量化することによってＣ５ｂ－９沈着を評価することができる。検出手段は、使用される特定の標識によって決定される。例えば、定量化は、共焦点顕微鏡下で一次抗体または二次抗体に抱合された蛍光染料によって生成される信号を測定することを含みうる。さらに、測定は、Ｃ５ｂ－９に特異的に結合しない抗体を洗浄溶液を使用して洗浄した後に実施されうる。洗浄溶液は、例えば、水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、生理食塩水、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されうる。特定の実施形態では、測定する工程は、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸプラットフォームを使用したＯｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイなどの自動化システムを使用して実施される。Ｏｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイを実施および最適化する方法の詳細は製造元のウェブサイト（ｗｗｗ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ）で利用可能である。一実施形態において、Ｏｎ－Ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイを使用する場合、二次抗体はＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＬＩ－ＣＯＲ社）であり、約１：５００～約１：１５００であって、例えば約１：６００または約１：１２００の希釈で使用される。
【0067】
使用される検出可能部分に適した手段でＣ５ｂ－９沈着のレベルを定量化したら、細胞数の相違による変動を除去するために、Ｃ５ｂ－９のレベルを試料中の細胞の数で正規化する。このことは、例えばＤＮＡに結合する染料（例えば、ＤＡＰＩ）を使用することを伴うことができ、その信号を試料中の細胞数を決定するために使用できる。試料中の細胞数を定量化するためのその他の適切な薬剤には、例えば、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ染料、ヘキスト３３２５８、ＳＹＴＯＸ緑色核酸染色試料、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙＥｃｙｃｌｅ染色試料が含まれる。例示的な市販の染色試薬には、ＬＩ－ＣＯＲおよびＴＯ－ＰＲＯ３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）からのＣｅｌｌＴａｇ ７００染色試薬が含まれる。
【0068】
固定後で、かつ、Ｃ５ｂ－９沈着検出前の細胞は、細胞浸透性が増し、試料中の細胞数を決定するために使用される薬剤が細胞内の区画（例えば、核）にアクセス可能にするような処理が供されうる。細胞透過性を増加させるために使用できる非限定的な薬剤としては、例えば、メタノールおよびアセトンなどの有機溶媒、または、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００、サポニン、およびＴｗｅｅｎ－２０などの界面活性剤が挙げられる。一実施形態では、検出可能部位に抱合された二次抗体で抗Ｃ５ｂ－９抗体を検出した後で、細胞を透過処理する。別の実施形態では、抗Ｃ５ｂ－９抗体自体が検出可能部分を含む場合には、抗Ｃ５ｂ－９抗体でＣ５ｂ－９沈着を検出した後で、細胞を透過処理する。さらに別の実施形態では、二次抗体で抗Ｃ５ｂ－９抗体を検出する前に、または抗Ｃ５ｂ－９抗体自体が検出可能部分を含む場合には、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を検出する前に、細胞を透過処理する。
【0069】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法の一つ以上の工程（例えば、上述の測定する工程）は、試料中の抗体染色パターンを検出および定量化するために、例えば自動化装置を使用して自動化される。一部の実施形態では、固体支持体上の細胞のプレーティングが自動化される。一部の実施形態では、生体試料との細胞の接触が自動化される。特定の実施形態では、Ｃ５ｂ－９沈着物を検出するための免疫染色が自動化される（例えば、免疫染色すること）。一部の実施形態では、Ｃ５ｂ－９沈着のレベルを測定することは、例えばＥｎＳｉｇｈｔマルチモードプレートリーダー（パーキンエルマー社）、サイテルイメージングシステム（Ｃｙｔｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＧＥヘルスケア社）で、自動化される（例えば、ＬＩ－ＣＯＲ社のＯｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸプラットフォームまたは蛍光染料などの検出可能な部分の自動化された検出／定量化を可能にするその他任意のプラットフォームを伴うＯｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎ（商標）アッセイを使用して）。一部の工程では、細胞数によるＣ５ｂ－９沈着のレベルを正規化することが自動化される。一部の実施形態では、すべての工程が自動化される。
【0070】
本明細書に記載の方法は典型的に、参照試料またはコントロール試料と併せて実施される。一部の実施形態では、コントロール試料または参照試料は、健康な個体からの対応する生体試料である。他の実施形態では、コントロール試料または参照試料は、患者が補体関連障害を発症する前に得られた生体試料である。これらのコントロール試料または参照試料は、生体試料によって促進されるＣ５ｂ－９沈着の量に対する標準化された参照を提供することができる。本明細書に記載される方法は、例えば、補体関連障害を有することがわかっている患者からの生体試料など、陽性コントロールと併せて実施することもできる。
【0071】
ＩＩＩ．診断、モニタリング、および治療方法
本明細書においては、補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
本明細書においては、補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
【0072】
特定の実施形態では、補体関連障害および細胞型は、前述のセクションに列記されたもののいずれかである。好ましい実施形態では、補体関連障害はａＨＵＳである。一実施形態では、内皮細胞はＨＭＥＣ－１細胞である。
【0073】
一部の実施形態では、Ｃ５の阻害剤はエクリズマブである。したがって、本明細書においては、補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
【0074】
一部の実施形態では、補体関連障害はａＨＵＳである。したがって、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法が、本明細書で提供される。
【0075】
本明細書に記載される方法を使用して、補体関連障害であるまたは該障害であることが疑われる患者が、Ｃ５の阻害剤（例えば、エクリズマブ）での治療から利益を得る可能性が高いと特定されると、この患者に対して、アッセイで使用される阻害剤（例えば、エクリズマブ）などのＣ５の治療阻害剤で治療することができる。
【0076】
したがって、本明細書においては、本明細書に開示される方法を使用して、障害または疾患に関連する細胞型（例えば、ａＨＵＳの内皮細胞）におけるＣ５ｂ－９沈着のレベルによって決定されるように、補体関連障害であるまたは該障害であることが疑われる患者を治療する方法が提供され、該方法は、Ｃ５の阻害剤、例えばエクリズマブまたは次のセクションに記載されるＣ５の阻害剤のいずれかを、治療有効量で患者に投与することを含む。補体関連障害を有する患者へのＣ５の阻害剤の投与に関する詳細は、例えば、国際公開第２０１００５４４０３号および国際公開第２０１５／０２１１６６号に見ることが可能であり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0077】
補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤を用いて治療を受けている患者に関して、例えば患者に投与する阻害剤の投薬量が本明細書に記載される生体外アッセイにおける内皮細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を正規化に十分であるかどうかを判断することによって、治療の効能をモニタリングする方法もまた本明細書で提供する。したがって、補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療している患者の治療の効能をモニタリングする方法であって、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、工程（ｄ）の結果に基づいて、増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、増加した用量が細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する。これら工程は、Ｃ５ｂ－９沈着のレベルを正規化するのに十分な投薬量が決定されるまで繰り返すことができる。正規化された、細胞におけるＣ５ｂ－９沈着のレベルは、コントロール試料で観察されたＣ５ｂ－９沈着に対して本質的に類似したＣ５ｂ－９沈着のレベルに関する。一部の実施形態では、コントロール試料のレベルに相対的な正規化されたレベルが、コントロールのレベルよりも低いＣ５ｂ－９のレベルを示しうるか、または、高い場合、コントロールのレベルよりも約１～２０％高く、例えば約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％高いレベルを示しうる。
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、工程（ｄ）の結果に基づいて、増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、増加した用量が細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する。これら工程は、Ｃ５ｂ－９沈着のレベルを正規化するのに十分な投薬量が決定されるまで繰り返すことができる。正規化された、細胞におけるＣ５ｂ－９沈着のレベルは、コントロール試料で観察されたＣ５ｂ－９沈着に対して本質的に類似したＣ５ｂ－９沈着のレベルに関する。一部の実施形態では、コントロール試料のレベルに相対的な正規化されたレベルが、コントロールのレベルよりも低いＣ５ｂ－９のレベルを示しうるか、または、高い場合、コントロールのレベルよりも約１～２０％高く、例えば約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または約２０％高いレベルを示しうる。
【0078】
また、以下を含むＣ５の候補阻害剤をスクリーニングする方法も本明細書で提供される：
（ａ）補体関連障害を有することがわかっている患者からの生体試料を、候補阻害剤がある状態および候補阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、候補阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、候補阻害剤が抗Ｃ５活性を有するということを示唆する。こうした方法は、例えば既知の検証された阻害活性を有するＣ５の阻害剤である、陽性コントロールと並行して実施することができる。
（ａ）補体関連障害を有することがわかっている患者からの生体試料を、候補阻害剤がある状態および候補阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、候補阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、候補阻害剤が抗Ｃ５活性を有するということを示唆する。こうした方法は、例えば既知の検証された阻害活性を有するＣ５の阻害剤である、陽性コントロールと並行して実施することができる。
【0079】
本明細書に記載される方法での使用に適したＣ５の例示的な阻害剤は、次のセクションに記載している。
【0080】
ＩＶ．ヒト補体成分Ｃ５の阻害剤
本明細書に記載される方法で使用するためのヒト補体成分Ｃ５の適切な阻害剤（「Ｃ５の阻害剤」）には、任意の阻害剤がＣ５ｂ－９の生成および／またはＣ５の活性に結合またはそうでなければ阻害する任意の分子である任意の阻害剤を含むことが可能である。例えば、「Ｃ５の阻害剤」は、以下を阻害する任意の薬剤とすることができる：（ｉ）補体成分Ｃ５タンパク質の発現、もしくは、ある細胞によるタンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌；（ｉｉ）Ｃ５切断断片Ｃ５ａもしくはＣ５ｂの活性（例えば、Ｃ５ａのその同族細胞受容体への結合、またはＣ５ｂのＣ６および／もしくは終末補体複合体のその他の成分への結合、上記参照）；（ｉｉｉ）Ｃ５ａおよびＣ５ｂを形成するヒトＣ５タンパク質の切断；（ｉｖ）ある細胞による、補体成分Ｃ５タンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌；または（ｖ）Ｃ５タンパク質もしくはＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性。補体成分Ｃ５タンパク質発現の阻害には、ヒトＣ５タンパク質をコードする遺伝子の転写の阻害；ヒトＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの分解の増加；ヒトＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害；ヒトＣ５タンパク質の分解の増加；プレプロヒトＣ５タンパク質の適切なプロセシングの阻害；またはヒトＣ５タンパク質の細胞による適切な輸送もしくは分泌の阻害が含まれる。候補薬剤がヒト補体成分Ｃ５の阻害剤であるかどうかを判断する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。Ｃ３転換酵素および／もしくはＣ５転換酵素の減衰を形成または誘導を防止する任意の補体阻害剤を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることができる。
本明細書に記載される方法で使用するためのヒト補体成分Ｃ５の適切な阻害剤（「Ｃ５の阻害剤」）には、任意の阻害剤がＣ５ｂ－９の生成および／またはＣ５の活性に結合またはそうでなければ阻害する任意の分子である任意の阻害剤を含むことが可能である。例えば、「Ｃ５の阻害剤」は、以下を阻害する任意の薬剤とすることができる：（ｉ）補体成分Ｃ５タンパク質の発現、もしくは、ある細胞によるタンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌；（ｉｉ）Ｃ５切断断片Ｃ５ａもしくはＣ５ｂの活性（例えば、Ｃ５ａのその同族細胞受容体への結合、またはＣ５ｂのＣ６および／もしくは終末補体複合体のその他の成分への結合、上記参照）；（ｉｉｉ）Ｃ５ａおよびＣ５ｂを形成するヒトＣ５タンパク質の切断；（ｉｖ）ある細胞による、補体成分Ｃ５タンパク質の適切な細胞内輸送もしくは分泌；または（ｖ）Ｃ５タンパク質もしくはＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性。補体成分Ｃ５タンパク質発現の阻害には、ヒトＣ５タンパク質をコードする遺伝子の転写の阻害；ヒトＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの分解の増加；ヒトＣ５タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害；ヒトＣ５タンパク質の分解の増加；プレプロヒトＣ５タンパク質の適切なプロセシングの阻害；またはヒトＣ５タンパク質の細胞による適切な輸送もしくは分泌の阻害が含まれる。候補薬剤がヒト補体成分Ｃ５の阻害剤であるかどうかを判断する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。Ｃ３転換酵素および／もしくはＣ５転換酵素の減衰を形成または誘導を防止する任意の補体阻害剤を、本明細書に記載の方法を使用してスクリーニングすることができる。
【0081】
阻害剤はまた、天然または可溶性形態の補体Ｃ５阻害性化合物を含むことができる。補体Ｃ５に結合する、またはそうでなければ補体Ｃ５の生成および／もしくは活性を阻害するのために利用されうる他の阻害剤は、例えば、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、小分子、ＡＲＣ１８７を含むＲＮＡアプタマー（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ａｒｃｈｅｍｉｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から市販されている）、Ｌ－ＲＮＡアプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、アンチセンス化合物、セリンプロテアーゼ阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で利用されうる、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）阻害剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）阻害剤などを含む二本鎖ＲＮＡ等の分子などである。
【0082】
一部の実施形態では、阻害剤は補体の活性化を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、補体の副経路および／もしくは古典経路のＣ３転換酵素および／もしくはＣ５転換酵素の形成または構築を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、例えばＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成である終末補体形成を阻害する。例えば、抗体補体阻害剤は、抗Ｃ５抗体を含みうる。かかる抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ｂの形成および／または生理機能を阻害するように、Ｃ５および／またはＣ５ｂと直接相互作用しうる。
【0083】
Ｃ５の阻害剤は、例えば、小分子、ポリペプチド、ポリペプチドアナログ、核酸、または核酸アナログとすることができる。
【0084】
本明細書で使用される場合、「小分子」とは、好ましくは約６ｋＤａ未満、最も好ましくは約２．５ｋＤａ未満の分子量を持つ薬剤を指すことを意味する。多くの医薬品企業は、しばしば真菌、細菌、または藻類の抽出物である小分子の配列を含む、化学的混合物および／または生物学的混合物の広範なライブラリーを持つが、それはこの出願のアッセイのいずれかでスクリーニングできる。本出願は、特に、小型化学ライブラリー、ペプチドライブラリー、または天然産物のコレクションの使用を意図している。Ｔａｎらは、小型化した細胞ベースアッセイと互換性がある、２００万個以上の合成化合物を含むライブラリーについて記述した（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９９８）１２０：８５６５－８５６６）。このようなライブラリーを、関心の標的抗原に結合する薬剤（例えば、補体成分Ｃ５）をスクリーニングするために使用しうることは、本出願の範囲内である。Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ ＤＩＶＥＲＳｅｔなど、多数の市販の化合物ライブラリーが存在する。ライブラリーはまた、ＮＣＩ開発治療プログラムのＤｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔなど、学術的調査機関から利用することもできる。合理的薬物設計（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ）も用いることができる。例えば、合理的薬物設計では、ヒト補体成分Ｃ５タンパク質についての、結晶構造または溶解構造の情報の使用を採用することができる。例えば、Ｈａｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３（１２）：７７６３－７５およびＺｕｉｄｅｒｗｅｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１）：１７２－８５に記載の構造を参照されたい。合理的薬物設計はまた、公知の化合物、例えば、公知のＣ５の阻害剤（例えば、ヒト補体成分Ｃ５タンパク質に結合する抗体、またはその抗原結合断片）に基づいて達成されうる。
【0085】
ペプチド模倣薬は、対象のポリペプチドの少なくとも一部分が改変され、ペプチド模倣薬の三次元構造が対象のポリペプチドの構造と実質的に同一のままである化合物でありうる。ペプチド模倣薬は、対象のポリペプチド配列内の一つ以上の置換またはその他の修飾を含むそれ自体のポリペプチドである、開示の対象のポリペプチドの類似体でありうる。あるいは、対象のポリペプチド配列の少なくとも一部分は、対象のポリペプチドの三次元構造が実質的に保持されるように、非ペプチド構造で置換されていてもよい。言い換えれば、対象のポリペプチド配列内の一つ、二つまたは三つのアミノ酸残基が、非ペプチド構造によって置換されていてもよい。さらに、対象のポリペプチドのその他のペプチド部分は、非ペプチド構造で置換されていてもよいが、必要ではない。ペプチド模倣薬（ペプチド類似体および非ペプチジル類似体の両方）は、改善された特性（例えば、タンパク分解の減少、保持性の増加または生物学的利用度の増加）を持ちうる。ペプチド模倣薬は概して、改善された経口利用性を持ち、これらは特にヒトまたは動物の障害の治療に適するようにさせる。ペプチド模倣薬は、類似した二次元化学構造を有してもよく、または有さなくてもよいが、共通の三次元構造的な特徴および形状を共有していることに留意されたい。各ペプチド模倣薬は、一つ以上の一意的な追加的結合成分をさらに有してもよい。
【0086】
Ｃ５の核酸阻害剤を使用して、Ｃ５に結合してＣ５を阻害することができる。核酸拮抗薬は、例えば、アプタマーとすることができる。アプタマーは、細胞表面タンパク質を含むほぼあらゆる分子を認識して特異的に結合するために使用することができる短いオリゴヌクレオチド配列である。ＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）プロセスは強力であり、かかるアプタータを容易に特定するために使用できる。アプタマーは、成長因子および細胞表面抗原など、治療ならびに診断に重要な幅広いタンパク質に対して作られうる。これらのオリゴヌクレオチドは、抗体がなすままの同様の親和性および特異性でそれらの標的に結合する（例えば、Ｕｌｒｉｃｈ（２００６）Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：３０５－３２６を参照のこと）。
【0087】
一部の実施形態では、Ｃ５の阻害剤は非抗体足場タンパク質である。これらのタンパク質は、概して、既存の抗原結合タンパク質についてコンビナトリアルケミストリーに基づいた適応を介して得られる。例えば、ヒトトランスフェリン受容体に対するヒトトランスフェリンの結合部位は、コンビナトリアルケミストリーを使用して改変されて、トランスフェリン変異体の多様なライブラリーを作り出すものであって、その一部は異なる抗原に対する親和性を取得している。Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：２４０６６－２４０７３。受容体の結合に関与していないヒトトランスフェリンの一部は、変化しないまま、抗体のフレームワーク領域のように足場としての役割を果たし、変異結合部位を提示する。次いで、上記ライブラリーは、標的抗原に対して最適な選択性および親和性を有するそれらの変異体を特定する関心の標的抗原に対して、抗体ライブラリーであるとしてスクリーニングされる。非抗体足場タンパク質は、抗体と機能は類似であるが、抗体と比較して多くの利点を有するとされて、この利点は、特に増強された溶解性および組織浸透性、製造コストの軽減、および関心の他の分子との複合化の容易さを含む。Ｈｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）ＴＲＥＮＤＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３（１０）：５１４－５２２。
【0088】
当業者であれば、非抗体足場タンパク質の足場部分が、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＺドメイン、ヒトトランスフェリン、ヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ヒトトリプシン阻害剤のｋｕｎｉｔｚドメイン、ヒトＣＴＬＡ－４、アンキリンリピートタンパク質、ヒトリポカリン、ヒトクリスタリン、ヒトユビキチン、またはテッポウウリ（Ｅ．ｅｌａｔｅｒｉｕｍ．Ｉｄ）からのトリプシン阻害剤のうちの全てまたは一部を含むことができることを理解するであろう。
【0089】
一部の実施形態では、Ｃ５の阻害剤は抗体またはその抗原結合断片であり、それはヒト補体成分Ｃ５タンパク質に結合する。本発明での使用に適した抗Ｃ５抗体（またはそれから誘導されるＶＨ／ＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗Ｃ５抗体を使用できる。Ｃ５に結合する、これら当技術分野で認識されている抗体のいずれかと競合する抗体もまた使用できる。
【0090】
一実施形態では、抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ａに関連するアナフィラトキシン活性の生成、および／または膜侵襲複合体Ｃ５ｂ－９の構築を防止することを防ぐ。別の実施形態においては、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、補体成分Ｃ５（例えばヒトＣ５）に結合し、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ断片へのＣ５の切断を阻害する。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体はヒト補体成分Ｃ５タンパク質のアルファ鎖内のエピトープに結合することができる。Ｃ５のアルファ鎖に結合する抗体は、例えば、国際公開第２０１０／０１５６０８号および米国特許第６，３５５，２４５号に記載されている。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体はヒト補体成分Ｃ５タンパク質のベータ鎖内のエピトープに結合することができる。Ｃ５ベータ鎖に結合する抗体は、例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７；Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３、およびＭｏｌｌｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：３０７－３１２に記載されている。一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、米国特許第９，０７９，９４９号に記載される抗体であり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0091】
ヒト補体成分Ｃ５のさらなる例示的な抗原性断片が、例えば、米国特許第６，３５５，２４５号に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0092】
本明細書に記載される方法での使用に適したさらなる抗Ｃ５抗体、およびその抗原結合断片は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１０／０１５６０８号に記載されており、その開示は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【0093】
一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体は、ヒト補体成分Ｃ５タンパク質（例えば、配列番号１で示すアミノ酸配列を有するヒトＣ５タンパク質）に特異的に結合する。「特異的結合」または「特異的に結合する」という語は、生理学的条件下で比較的安定している複合体（例えば、抗体と補体成分Ｃ５タンパク質との間の複合体）を形成する二つの分子を指す。通常、結合は、会合定数（Ｋａ）が１０６ Ｍ－１よりも高いときに特異的であるとみなす。したがって、抗体は、少なくとも（またはこれよりも大きい）１０６Ｍ－１（例えば、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１１０１２、１０１３、１０１４または１０１５またはそれ以上）のＫａでＣ５タンパク質と特異的に結合することができる。ヒト補体成分Ｃ５タンパク質に特異的に結合する抗体の例は、例えば、米国特許第６，３５５，２４５号に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0094】
本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、補体成分Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のＣ５ａおよび／もしくはＣ５ｂ活性断片の生成または活性を阻害することに活性を有することができる。この阻害作用を通じて、この抗Ｃ５抗体は、例えばＣ５ａの炎症誘発効果および細胞の表面におけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の生成等をさらに阻害する。Ｃ５ａの生成を阻害する能力を有する抗Ｃ５抗体は、例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７およびＭｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３に記載されている。
【0095】
一部の実施形態では、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合性断片は、Ｃ５タンパク質の、５０（例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５またはそれ以上）％を超えてヒト補体成分Ｃ３ｂ（例えば、ＡＰまたはＣＰのＣ５転換酵素複合体中に存在するＣ３ｂ）に結合する能力を減少させうる。一部の実施形態では、Ｃ５タンパク質に結合すると、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合性断片は、Ｃ５タンパク質の、５０（例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５またはそれ以上）％を超えて補体成分Ｃ４ｂ（例えば、ＣＰのＣ５転換酵素中に存在するＣ４ｂ）に結合する能力を減少させうる。抗体が、補体成分Ｃ５タンパク質のＣ５ａおよび／もしくはＣ５ｂ活性断片の生成もしくは活性、または補体成分Ｃ４ｂもしくはＣ３ｂへの結合を阻害できるかどうかを判断する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，３５５，２４５号およびＷｕｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８－３４０に記載されている。
【0096】
例示的な抗Ｃ５抗体は、エクリズマブ（ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）；アレクシオンファーマ社（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、コネチカット州チェシャー）または、エクリズマブと同じＣ５上のエピトープに結合するかもしくはＣ５への結合に関してエクリズマブと競合する抗体（例えば、Ｋａｐｌａｎ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（７）：１０１７－２３；Ｈｉｌｌ（２００５）Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ３（１１）：８４９－５０および、Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（１１）：１２５６－１４８８を参照のこと）である。ソリリス（登録商標）は、マウス骨髄腫細胞培養により産生され、標準バイオプロセス技術により精製された組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ２／４κ抗体であるエクリズマブの剤形である。エクリズマブは、ヒトＩｇＧ２配列およびヒトＩｇＧ４配列からのヒト定常領域と、ヒトのフレームワーク軽鎖可変領域と重鎖可変領域とに対して移植されたマウスの相補性決定領域とを含有する。エクリズマブは、二つの４４８個のアミノ酸重鎖と二つの２１４個のアミノ酸軽鎖から構成され、およそ１４８ｋＤａの分子量を有する。エクリズマブは、それぞれ配列番号１０および１１で示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列、それぞれ配列番号７および８で示す重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ならびに、それぞれ配列番号１、２、および３および４、５、および６で示す重鎖可変領域ＣＤＲ１－３および軽鎖可変領域ＣＤＲ１－３配列を含む。
【0097】
別の例示的な抗体は、パキセリズマブ（アレクシオンファーマ社（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、コネチカット州チェシャー）、またはパキセリズマブと同じＣ５上のエピトープに結合するかもしくはＣ５への結合に関してパキセリズマブと競合する抗体（例えば、Ｗｈｉｓｓ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ３（６）：８７０－７；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｄｒｕｇｓ Ｔｏｄａｙ（Ｂａｒｃ）４１（３）：１６５－７０およびＴｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７－１８）：１３８９－４０１を参照のこと）である。
【0098】
別の例示的な抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号１４および１１で示す配列を有する重鎖および軽鎖を含む抗体ＢＮＪ４４１であるか、またはその抗原結合断片および変異体である。ＢＮＪ４４１（ＡＬＸＮ１２１０としても知られる）は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５号および米国特許第９，０７９，９４９号に記載されているが、その教示は参照により本明細書に援用される。ＢＮＪ４４１は、エクリズマブ（ソリリス（登録商標））と構造的に関連するヒト化モノクローナル抗体である。ＢＮＪ４４１はヒト補体タンパク質Ｃ５に選択的に結合し、補体活性化の間にＣ５がＣ５ａとＣ５ｂに切断されることを阻害する。この阻害により、炎症促進性メディエーターＣ５ａの放出と、細胞溶解性の孔を形成する膜侵襲複合体Ｃ５ｂ－９の形成が妨害される一方で、微生物のオプソニン化と免疫複合体のクリアランスに必須である、補体活性化の基部の成分または早期の成分（例えばＣ３およびＣ３ｂ）は保存される。
【0099】
他の実施形態では、抗体は、ＢＮＪ４４１の重鎖および軽鎖のＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって一つの実施形態では、抗体は、配列番号１２で示す配列を有するＢＮＪ４４１のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号８で示す配列を有するＢＮＪ４４１のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１９、１８および３で示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、それぞれ配列番号４、５、および６で示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号８で示すアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【0100】
さらに別の例示的な抗Ｃ５抗体は、それぞれ配列番号２０および１１で示す配列を有する重鎖および軽鎖を含む抗体ＢＮＪ４２１であるか、またはその抗原結合断片および変異体である。ＢＮＪ４２１（ＡＬＸＮ１２１１としても知られる）は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５号および米国特許第９，０７９，９４９号に記載されているが、その教示は参照により本明細書に援用される。
【0101】
他の実施形態では、抗体は、ＢＮＪ４２１の重鎖および軽鎖のＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって一つの実施形態では、抗体は、配列番号１２で示す配列を有するＢＮＪ４２１のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号８で示す配列を有するＢＮＪ４２１のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１９、１８および３に記載された配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、それぞれ配列番号４、５、および６に記載された配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１２および配列番号８で示すアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【0102】
ＣＤＲの正確な境界は、異なる方法に従って様々に定義されている。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメイン内のＣＤＲまたはフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔらの［（１９９１）“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．”ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ］によって規定されているとおりとすることが可能である。このような場合には、ＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ（カバットＣＤＲ）」（例えば、「Ｋａｂａｔ ＬＣＤＲ２」または「Ｋａｂａｔ ＨＣＤＲ１」）と称することがある。一部の実施形態では、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３によって規定されているとおりとすることができる。したがって、これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」（例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＬＣＤＲ２」または「Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＣＤＲ３」）と称することがある。一部の実施形態では、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとを（Ｋａｂａｔ－Ｃｈｏｔｈｉａ）組み合わせた定義によって規定されているとおりとすることができる。このような実施形態では、これらの領域を「Ｋａｂａｔ－Ｃｈｏｔｈｉａ複合ＣＤＲ」と称することがある。Ｔｈｏｍａｓら［（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７／１８）：１３８９－１４０１］は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義に従うＣＤＲ境界の特定を例示する。
【0103】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ１を含む：ＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱ（配列番号１９）。
【0104】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含むまたはアミノ酸配列からなる、重鎖ＣＤＲ２を含む：ＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤ（配列番号１８）。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＨＩＦＳＮＹＷＩＱＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＧＨＴＥＹＴＥＮＦＫＤＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）。
【0105】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＧＡＳＥＮＩＹＧＡＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＶＬＮＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号８）。
【0106】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｃ５抗体は、そこから変異ヒトＦｃ定常領域が誘導される天然のヒトＦｃ定常領域の親和性よりも高い親和性を有するヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異ヒトＦｃ定常領域を含むことができる。例えば、Ｆｃ定常領域は、そこから変異ヒトＦｃ定常領域が誘導される天然のヒトＦｃ定常領域と比べて、一つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含むことができる。置換により、相互作用のｐＨ依存性を維持しながら、ｐＨ６．０における変異Ｆｃ定常領域を含有するＩｇＧ抗体のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることができる。抗体のＦｃ定常領域内の一つ以上の置換が、ｐＨ６．０におけるＦｃＲｎに対するＦｃ定常領域の親和性を増加させる（相互作用のｐＨ依存性を維持しながら）か否かを試験する方法は、当技術分野で公知であり、実施例に例証する。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２２５号および米国特許第９，０７９９４９号を参照されたく、このそれぞれの開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【0107】
ＦｃＲｎに対する抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を高める置換は、当技術分野において公知であり、例えば、（１）Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２３５２４に記載されるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅの三つの置換、（２）Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３－６２１６およびＨｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６－３５６に記載のＭ４２８ＬまたはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌの置換、ならびに（３）Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１２）：１７５９－６９に記載されるＮ４３４ＡまたはＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａの置換を含む。さらなる置換の組み合わせとしては、Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４ＨおよびＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈが、例えば、Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（３）：１７０９－１７１７に記載されており、その開示はその全体が参照により本明細書に援用される。
【0108】
一部の実施形態では、変異定常領域（ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、ＥＵアミノ酸残基２５５における、バリンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３０９における、アスパラギンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３１２における、イソロイシンに対する置換を有する。一部の実施形態では、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６における置換を有する。
【0109】
一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、そこから誘導されたネイティブ定常領域と比べて、３０以下（例えば、２９以下、２８以下、２７以下、２６以下、２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下）のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、以下からなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０ＩおよびＶ３０８Ｆ。一部の実施形態では、変異ヒトＦｃ定常領域は、それぞれＥＵナンバリングで、４２８位にメチオニンと４３４位にアスパラギンを含む。一部の実施形態では、変異Ｆｃ定常領域は、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に記載される４２８Ｌ／４３４Ｓの二つの置換を含む。
【0110】
いくつかの実施形態では、これらの変異の正確な位置は、抗体エンジニアリングによって天然のヒトＦｃ定常領域位置からシフトされてもよい。例えば、ＩｇＧ２／４キメラＦｃで使用される場合、４２８Ｌ／４３４Ｓの二つの置換は、ＢＮＪ４４１に見られてその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，０７９，９４９号に記載されているＭ４２９ＬおよびＮ４３５Ｓ変異体のように、４２９Ｌおよび４３５Ｓに対応し得る。
【0111】
一部の実施形態では、変異定常領域は、ネイティブヒトＦｃ定常領域と比べて、アミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、または４３６（ＥＵナンバリング）における置換を含む。一部の実施形態では、置換は、２３７位におけるグリシンに対するメチオニン；２３８位におけるプロリンに対するアラニン；２３９位におけるセリンに対するリシン；２４８位におけるリシンに対するイソロイシン；２５０位におけるトレオニンに対する、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；２５２位におけるメチオニンに対する、フェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン；２５４位におけるセリンに対するトレオニン；２５５位におけるアルギニンに対するグルタミン酸；２５６位におけるトレオニンに対する、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミン；２５７位におけるプロリンに対する、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはバリン；２５８位におけるグルタミン酸に対するヒスチジン；２６５位におけるアスパラギン酸に対するアラニン；２７０位におけるアスパラギン酸に対するフェニルアラニン；２８６位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはグルタミン酸；２８９位におけるトレオニンに対するヒスチジン；２９７位におけるアスパラギンに対するアラニン；２９８位におけるセリンに対するグリシン；３０３位におけるバリンに対するアラニン；３０５位におけるバリンに対するアラニン；３０７位におけるトレオニンに対する、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、３０８位におけるバリンに対する、アラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、またはトレオニン；３０９位におけるロイシンまたはバリンに対する、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、もしくはアルギニン；３１１位におけるグルタミンに対する、アラニン、ヒスチジン、またはイソロイシン；３１２位におけるアスパラギン酸に対する、アラニンまたはヒスチジン；３１４位におけるロイシンに対する、リシンまたはアルギニン；３１５位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはヒスチジン；３１７位におけるリシンに対するアラニン；３２５位におけるアスパラギンに対するグリシン；３３２位におけるイソロイシンに対するバリン；３３４位におけるリシンに対するロイシン；３６０位におけるリシンに対するヒスチジン；３７６位におけるアスパラギン酸に対するアラニン；３８０位におけるグルタミン酸に対するアラニン；３８２位におけるグルタミン酸に対するアラニン；３８４位におけるアスパラギンまたはセリンに対するアラニン；３８５位におけるグリシンに対するアスパラギン酸またはヒスチジン；３８６位におけるグルタミンに対するプロリン；３８７位におけるプロリンに対するグルタミン酸；３８９位におけるアスパラギンに対する、アラニンまたはセリン；４２４位におけるセリンに対するアラニン；４２８位におけるメチオニンに対する、アラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシン；４３３位におけるヒスチジンに対するリシン；４３４位におけるアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン；および、４３６位におけるチロシンまたはフェニルアラニンに対するヒスチジン、からなる群からのために選択され、すべてＥＵナンバリングによる。
【0112】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための抗Ｃ５抗体に適したものは、配列番号１４で示すアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、および／または配列番号１１で示すアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。あるいは、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための抗Ｃ５抗体は、配列番号２０で示すアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、および／または配列番号１１で示すアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。
【0113】
一部の実施形態では、Ｃ５阻害剤は、Ｃ５ａに結合する抗体（本明細書では「抗Ｃ５ａ抗体」と呼称される場合がある）である。一部の実施形態では、抗体はＣ５ａに結合するが、完全長Ｃ５には結合しない。一部の実施形態では、Ｃ５ａへの抗体の結合は、Ｃ５ａの生物活性を阻害することができる。Ｃ５ａ活性を測定するための方法には、例えば化学走性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡが含まれる（例えば、Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｚｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５０（３）：６０６－１６およびＷｕｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８－３４０を参照のこと）。一部の実施形態では、Ｃ５ａへの抗体の結合は、Ｃ５ａおよびＣ５ａＲ１間の相互作用を阻害することができる。Ｃ５ａとＣ５ａＲ１の相互作用（抗体の存在下および不在下で）を検出および／または測定するための適切な方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍａｒｙ ａｎｄ Ｂｏｕｌａｙ（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ５１（５）：２８２－２８７；Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１）：１４９－１５４；Ｇｉａｎｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０（３２）：１９１６６－１９１７２および米国特許出願公開公報第２００６０１６０７２６号に記載されている。例えば、検出可能に標識された（例えば、放射活性物質で標識された）Ｃ５ａのＣ５ａＲ１発現末梢血単核細胞への結合は、抗体の存在および不在下において評価することができる。抗体存在下でのＣ５ａＲ１に結合する検出可能に標識されたＣ５ａの量が、抗体不在下での結合量と比べて減少するということは、抗体がＣ５ａとＣ５ａＲ１との間の相互作用を阻害するということの表れである。一部の実施形態では、Ｃ５ａへの抗体の結合は、Ｃ５ａおよびＣ５Ｌ２間の相互作用を阻害することができる（以下を参照のこと）。Ｃ５ａとＣ５Ｌ２との間の相互作用を検出および／または測定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｗａｒｄ（２００９）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８７（４）：３７５－３７８およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ ４４６（７１３２）：２０３－２０７（以下を参照のこと）に記載されている。
【0114】
例示的な抗Ｃ５ａ抗体は、それぞれ配列番号２６および２１で示す配列を有する重鎖および軽鎖を含む抗体ＢＮＪ３８３、またはその抗原結合断片および変異体である。ＢＮＪ３８３（ＡＬＸＮ１００７としても知られる）は、国際公開第２０１１／１３７３９５号および米国特許第９，０１１，８５２号に記載されているが、その教示は参照により本明細書に援用される。一実施形態では、抗Ｃ５ａ抗体は、ＢＮＪ３８３の重鎖および軽鎖のＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって一実施形態では、抗体は、配列番号２７で示す配列を有するＢＮＪ３８３のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、配列番号２２で示す配列を有するＢＮＪ３８３のＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２８、２９、および３０で示す配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、それぞれ配列番号２３、２４、および２５で示す配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２７および配列番号２２で示すアミノ酸配列を有するＶＨおよびＶＬ領域を含む。
【0115】
一部の実施形態では、Ｃ５阻害剤は、Ｃ５ｂに結合する抗体（本明細書では「抗Ｃ５ｂ抗体」と呼称される場合がある）である。一部の実施形態では、抗体はＣ５ｂに結合するが、完全長Ｃ５には結合しない。Ｃ５ｂの構造は、例えば、Ｍｕｌｌｅｒ－Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｓｙｍｐ ５０：２３５－２４６およびＹａｍａｍｏｔｏ ａｎｄ Ｇｅｗｕｒｚ（１９７８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２０（６）：２００８－２０１５に記載されている。上記したように、Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８と複合化して、Ｃ５ｂ－８複合体を標的細胞表面で形成する。一連の複合化の間に形成されたタンパク質複合体中間体には、Ｃ５ｂ－６（Ｃ５ｂおよびＣ６を含む）、Ｃ５ｂ－７（Ｃ５ｂ、Ｃ６、およびＣ７）、およびＣ５ｂ－８（Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８）が含まれる。いくつかのＣ９分子が結合すると、膜侵襲複合体（ＭＡＣ、終末補体複合体（ＴＣＣ）であるＣ５ｂ－９）が形成される。標的細胞膜に十分な数のＭＡＣを挿入すると、それらが作り出す開口（ＭＡＣポア）が、標的細胞の急速な浸透圧溶解を媒介する。
【0116】
一部の実施形態では、Ｃ５ｂへの抗体の結合は、Ｃ５ｂおよびＣ６間の相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、Ｃ５ｂへの抗体の結合は、Ｃ５ｂ－９ ＭＡＣ－ＴＣＣの構築または活性を阻害することができる。一部の実施形態では、Ｃ５ｂへの抗体の結合は、補体依存性細胞溶解（例えば、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、および／または、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で）を阻害することができる。抗体が補体依存性溶解を阻害するかどうかを評価するための適切な方法には、例えば、溶血性アッセイまたは可溶性Ｃ５ｂ－９の活性を検出するための他の機能アッセイが含まれる。例えば、抗体の存在下での補体の細胞溶解能の低下は、Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ．），“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，”１３５－２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＣＣ Ｔｈｏｍａｓ（１９６１），ｐａｇｅｓ １３５－１３９によって記載される溶血性アッセイ、または、Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２によって記載されるニワトリ赤血球の溶血法等の従来の種々の方法で測定することができる。
【0117】
Ｃ５ｂに結合する抗体、ならびにこうした抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。市販の抗Ｃ５ｂ抗体は、例えば、ハイカルト社（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（カタログ番号：ＨＭ２０８０、クローン５６８）およびＡｂｃａｍ（商標）社（ａｂ４６１５１またはａｂ４６１６８）等をいくつかのメーカーから入手可能である。
【0118】
本明細書に記載される方法での使用に好適である抗体、またはその抗原結合断片は、当技術分野において認識される様々な技術を使用して生成することができる。モノクローナル抗体は、当業者によく知られている様々な技術によって得られうる。簡潔に述べると、所望の抗原で免疫化された動物由来の脾臓細胞は、通常、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１－５１９（１９７６）を参照のこと）。代替的な不死化法としては、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルス、または当技術分野で周知の他の方法を用いた形質転換が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対して所望の特異性および親和性をもつ抗体の産生のためにスクリーニングされ、かかる細胞によって産生されるモノクローナル抗体の産生量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注射を含めた様々な技術によって増強されてもよい。あるいは、Ｈｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）により概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離してもよい。
【0119】
特定の薬剤がヒト補体成分Ｃ５の阻害剤であるかどうかを判断する方法は、本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。例えば、体液中のＣ５ａおよびＣ５ｂの濃度および／または生理学的活性は、当技術分野において周知の方法によって測定することができる。Ｃ５ａの濃度または活性を測定するための方法には、例えば化学走性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡが含まれる（例えば、Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｚｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５０（３）：６０６－１６およびＷｕｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８－３４０を参照のこと）。Ｃ５ｂについては、溶血性アッセイまたは本明細書に記載される溶解性Ｃ５ｂ－９に対するアッセイを使用することができる。当技術分野で公知の他のアッセイも使用することができる。これらまたはその他の適切なタイプのアッセイを使用して、抗Ｃ５抗体などのヒト補体成分Ｃ５を阻害することができる候補薬剤は、例えば、本明細書に記載される方法で有用な化合物を特定し、かかる化合物の適切な投与量レベルを決定するためにスクリーニングすることができる。
【0120】
候補化合物がヒトＣ５の形態Ｃ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害するかどうかを判断する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７；Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３；Ｉｓｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４（１）：３２６－３１；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７－１８）：１３８９－４０１およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２（１６）：１１８３－９５に記載されている。さらに、本明細書に記載される方法を使用して、Ｃ５の候補阻害剤をスクリーニング、すなわち、生体外で細胞（例えば、内皮細胞）のＣ５ｂ－９沈着を阻害する分子のスクリーニングを行うことができる。
【0121】
ヒト補体成分Ｃ５の阻害はまた、対象の体液中の補体の細胞溶解能を低下させることもできる。存在する補体の細胞溶解能のかかる低下は、例えば、Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ），“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，”１３５－２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ， ＣＣ Ｔｈｏｍａｓ （１９６１），ｐａｇｅｓ １３５－１３９に記載される溶血性アッセイなどの従来の溶血性アッセイ、または、例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２によって記載されるニワトリ赤血球の溶血法等の従来の種々のアッセイ等である、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。
【0122】
Ｖ．診断キット
本明細書においては、本明細書に記載する方法を実行するための構成要素および使用説明書を含むキットも提供される。したがって、一部の実施形態では、このキットは、関心の補体関連障害または補体関連疾患に関連する細胞と、抗Ｃ５ｂ－９抗体と、検出可能部分を含む二次抗体などの抗Ｃ５ｂ－９抗体を検出するための手段とを含む。こうしたキットは、緩衝液、安定剤、基質、免疫検出試薬（一次および二次抗体）、および／または方法を実施するために必要な補因子など、少なくとも一つの追加的試薬を含みうる。一部の実施形態では、キットは、患者から生体試料を収集するための手段を含む。こうした手段は、例えば、患者から流体または組織試料を得るために使用できる試薬または容器を含むことができる。キットはまた、例えば、市販の自動化されたプラットフォーム（例えば、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸプラットフォーム）と併せてこの方法を使用する方法に関する指針を提供することによって、アッセイを自動化するための説明書を含みうる。
本明細書においては、本明細書に記載する方法を実行するための構成要素および使用説明書を含むキットも提供される。したがって、一部の実施形態では、このキットは、関心の補体関連障害または補体関連疾患に関連する細胞と、抗Ｃ５ｂ－９抗体と、検出可能部分を含む二次抗体などの抗Ｃ５ｂ－９抗体を検出するための手段とを含む。こうしたキットは、緩衝液、安定剤、基質、免疫検出試薬（一次および二次抗体）、および／または方法を実施するために必要な補因子など、少なくとも一つの追加的試薬を含みうる。一部の実施形態では、キットは、患者から生体試料を収集するための手段を含む。こうした手段は、例えば、患者から流体または組織試料を得るために使用できる試薬または容器を含むことができる。キットはまた、例えば、市販の自動化されたプラットフォーム（例えば、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸプラットフォーム）と併せてこの方法を使用する方法に関する指針を提供することによって、アッセイを自動化するための説明書を含みうる。
【0123】
例示的な方法および材料は、以下に記載されているが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料も、本開示の方法および組成物の実施または試験で使用することができる。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。特に、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６３９２９号（国際公開第２０１０／０５４４０３号）および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４９９５７号（国際公開第２０１５／０２１１６６号）は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【0124】
ＶＩ．例示的な実施形態
１．補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法。
２．補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３．補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
４．非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
５．補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
６．増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、増加した用量が細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、実施形態５に記載の方法。
７．実施形態１から４のいずれか一つに記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに反応すると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、方法は、治療有効量の阻害剤またはエクリズマブを患者に投与することを含む方法。
８．Ｃ５の阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、実施形態２、５または６に記載の方法。
９．細胞がマイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１０．固体プラットフォームが９６ウェルマイクロプレートである、実施形態９に記載の方法。
１１．疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１２．疾患関連細胞は、皮膚由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、実施形態１１に記載の方法。
１３．細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１４．細胞は、ウェル当たり約１０，０００細胞～約１２，５００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１５．細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の方法。
１６．細胞は、生体試料と接触させる前にコンフルエントである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１７．生体試料が血清である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１８．血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者からのものである、実施形態１７に記載の方法。
１９．細胞は、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２０．細胞は、約１．５時間～約４時間生体試料と接触させる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２１．細胞は、接触させる工程の後であるが評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液でインキュベートされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２２．Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２３．抗Ｃ５ｂ－９抗体は、染料などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、実施形態２０に記載の方法。
２４．Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２５．抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、細胞を透過処理する、実施形態２３に記載の方法。
２６．抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、細胞を透過処理する、実施形態２３に記載の方法。
２７．透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に細胞をインキュベートする、実施形態２５または２６に記載の方法。
２８．薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ染料、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ緑色核酸染色試薬、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ染色試薬からなる群から選択される、実施形態２７記載の方法。
２９．一つ以上の工程が自動化されている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３０．患者は非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、実施形態１から３、５から１７、および、１９から２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
３２．補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３３．補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３４．非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３５．補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
（ｅ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
１．補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法。
２．補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３．補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
４．非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
５．補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、
（ｄ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
６．増加した用量の阻害剤を患者に投与する場合、工程（ａ）から（ｃ）を繰り返して、増加した用量が細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化するのに十分であるかどうかを判断する、実施形態５に記載の方法。
７．実施形態１から４のいずれか一つに記載の方法に従ってＣ５の阻害剤またはエクリズマブに反応すると判断された患者において補体関連障害を治療する方法であって、方法は、治療有効量の阻害剤またはエクリズマブを患者に投与することを含む方法。
８．Ｃ５の阻害剤は、エクリズマブなどの抗体である、実施形態２、５または６に記載の方法。
９．細胞がマイクロプレートなどの固体プラットフォーム上で培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１０．固体プラットフォームが９６ウェルマイクロプレートである、実施形態９に記載の方法。
１１．疾患関連細胞は、内皮細胞、網膜色素上皮細胞、軟骨細胞、ニューロン、グリア細胞、骨格筋細胞、および心筋細胞からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１２．疾患関連細胞は、皮膚由来のヒト微小血管内皮細胞、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、包皮の内皮細胞、および肝臓腺癌由来の内皮細胞からなる群から選択される内皮細胞である、実施形態１１に記載の方法。
１３．細胞は、ウェル当たり約５，０００～約６，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１４．細胞は、ウェル当たり約１０，０００細胞～約１２，５００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１５．細胞は、ウェル当たり約１５，０００細胞の密度で蒔いて、コンフルエントまで培養される、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の方法。
１６．細胞は、生体試料と接触させる前にコンフルエントである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１７．生体試料が血清である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１８．血清は、ａＨＵＳの患者、寛解の患者またはエクリズマブ未感作患者からのものである、実施形態１７に記載の方法。
１９．細胞は、アデノシン５’－二リン酸、トロンビン、またはリポ多糖で活性化される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２０．細胞は、約１．５時間～約４時間生体試料と接触させる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２１．細胞は、接触させる工程の後であるが評価する工程の前に、パラホルムアルデヒドなどの固定液でインキュベートされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２２．Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、抗Ｃ５ｂ－９抗体を使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２３．抗Ｃ５ｂ－９抗体は、染料などの検出可能な標識を含む二次抗体で検出される、実施形態２０に記載の方法。
２４．Ｃ５ｂ－９沈着のレベルは、Ｏｎ－ｃｅｌｌ Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して評価される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２５．抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出された後で、細胞を透過処理する、実施形態２３に記載の方法。
２６．抗Ｃ５ｂ－９抗体が二次抗体で検出される前に、細胞を透過処理する、実施形態２３に記載の方法。
２７．透過処理の後、ＤＮＡを染色する薬剤などである、核に蓄積する薬剤と共に細胞をインキュベートする、実施形態２５または２６に記載の方法。
２８．薬剤が、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｄｙｅ染料、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ緑色核酸染色試薬、およびＶｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ染色試薬からなる群から選択される、実施形態２７記載の方法。
２９．一つ以上の工程が自動化されている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３０．患者は非典型溶血性尿毒症症候群、ＳＴＥＣ－ＨＵＳ、糖尿病、ループス腎炎、血管炎、または慢性の同種移植片拒絶反応を有する、実施形態１から３、５から１７、および、１９から２９のいずれか一つに記載の方法。
３１．補体Ｃ５ｂ－９沈着を測定する方法であって、
（ａ）補体関連障害であるか、または、該障害であることが疑われる患者から得られた生体試料を、疾患関連細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｃ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む、方法。
３２．補体関連障害を有する患者がＣ５の阻害剤での治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、Ｃ５の阻害剤がある状態および阻害剤がない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
阻害剤がない状態でのインキュベートと比較して、阻害剤がある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者が阻害剤での治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３３．補体関連障害を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得るかどうかを判断する方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３４．非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）を有する患者がエクリズマブでの治療から利益を得る可能性が高いかどうかを判断するための方法であって、方法が、
（ａ）患者から得られた生体試料を、エクリズマブがある状態およびエクリズマブがない状態でインキュベートすることと、
（ｂ）工程（ａ）からの生体試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｄ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｅ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含む方法であって、
エクリズマブがない状態でのインキュベートと比較して、エクリズマブがある状態でインキュベートした生体試料ではＣ５ｂ－９沈着が少ないということが、患者がエクリズマブでの治療から利益が得られる可能性が高いことを示唆するものである方法。
３５．補体関連障害を有し、Ｃ５の阻害剤で治療している患者をモニタリングする方法であって、方法が、
（ａ）患者からの生体試料およびコントロール試料を、内皮細胞と生体外で接触させることと、
（ｂ）細胞におけるＣ５ｂ－９沈着レベルを評価することと、
（ｃ）細胞におけるＣ５ｂ－９レベルの評価前または評価後に細胞を透過処理することと、
（ｄ）細胞数によってＣ５ｂ－９沈着レベルを正規化することと、を含み、
（ｅ）阻害剤で治療している患者からの生体試料でのＣ５ｂ－９沈着が、コントロール試料でのＣ５ｂ－９沈着と比較してより大きい場合、患者に投与する阻害剤の用量を増加させることとを含む方法。
【実施例】
【0125】
実施例１ マイクロプレートにおけるＨＭＥＣ－１培養条件の決定
以下に記述した実験を、内皮細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を検出するためのアッセイを自動化する目的で行った。
以下に記述した実験を、内皮細胞におけるＣ５ｂ－９沈着を検出するためのアッセイを自動化する目的で行った。
【0126】
この第一の実験では、条件を、Ｎｏｒｉｓら（Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２４：１７１５－２６）が記載の「典型的な方法」で用いられるガラス支持体（すなわち、ガラス製カバーガラス）から、プラスチックの９６ウェルマイクロプレートへ内皮細胞（ＨＭＥＣ－１）の培養を移すために最適化した。
【0127】
皮膚起源のヒト微小血管内皮細胞株（ＨＭＥＣ－１）を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社）を補ったＭＣＤＢ１３１（ニューヨーク州グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ社）、１０μｇ／ｍｌヒドロコルチゾンｆ．ｃ．、１００Ｕ／ｍｌペニシリンｆ．ｃ．、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンｆ．ｃ．、２ｍＭグルタミンｆ．ｃ．（Ｇｉｂｃｏ社）、および５０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長因子ｆ．ｃ．、からなる増殖培地中で培養した。
【0128】
最初に、９６ウェルマイクロプレートを用いる細胞の播種からのコンフルエントまでが９６時間である期間に関して、培養条件を決定した。具体的には、９６ウェルマイクロプレートにウェルあたり３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，５００、または１０，０００細胞で播種した。増殖培地中で培養２４、４８、７２、および９６時間後に位相差顕微鏡を使用して、細胞を観察した。三つの独立した実験では、ウェル当たり５，０００細胞の播種は、９６時間でコンフルエントな単層を達成した（図１）。実際に、９６時間で、３，０００～４，０００個のＨＭＥＣ－１細胞で播種されたウェルはコンフルエントに達しなかった。ウェル当たり７，５００個または１０，０００個の細胞で播種された場合、ＨＭＥＣ－１細胞は複数層を形成した。５，０００個または６，０００個の細胞で播種されたウェルにおいて、９６時間でコンフルエントが得られた。
【0129】
細胞の播種からコンフルエントまでに必要な時間を減少させるために、さらなる条件を試験した。具体的には、ウェル当たり１０，０００、１２，５００、および１５，０００細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、増殖培地中での培養一晩後、２４時間後および４８時間後に位相差顕微鏡で増殖細胞を観察した。１０，０００細胞および１２，５００細胞で播種したウェルが、４８時間後にコンフルエントに達した（図２Ａ）。ウェル当たり１５，０００個で播種した場合、培養一晩後、２４時間後にコンフルエントな単層が再現可能に現れた（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【0130】
次に、異なるサイズのプラスチックマイクロプレート上で、増殖培地中で、ＨＭＥＣ－１細胞の成長速度（９６、２４、１２、および６ウェル／マイクロプレート）が決定された。ＨＭＥＣ－１細胞（１５，６２５細胞／ｃｍ２）を播種し、９６時間培養した。最終的に、接着細胞をトリプシン処理によって分離し、二回計数した。トリパンブルーを加えて、死細胞を評価した。表１に示すように、細胞の再現性のある増殖が、９６、２４、１２および６ウェル／マイクロプレートで達成され、その結果、最終細胞数は播種された細胞数とウェル表面とに比例した。トリパンブルー排除法により、単層内に無視できる数の死細胞が示された。
【0131】
表１ ９６、２４、１２および６ウェル／マイクロプレート上の二つの培養実験の結果の平均。
９６ウェルマイクロプレート上に播種した、ウェル当たり５，０００個のＨＭＥＣ－１細胞の成長速度も決定された。細胞をウェル当たり５，０００細胞で播種し、２４、４８、７２、および９６時間用の別々のプレートで培養した。細胞は、９６時間用プレート中の細胞を除いて、増殖培地中で維持されたが、９６時間用プレート中の細胞は、次いで「典型的」アッセイで使用された条件を再現するために、増殖培地で７２時間培養され、最後の２４時間は血清なしの培地に移動した。２４、４８、７２、および９６時間で、ＭＴＳ試薬［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、内塩］を追加の３時間に添加し、次いでマイクロプレート分光光度計リーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。図３に示されるように、細胞は分析された各時点で良好に成長した。
【表1】
【0132】
９６ウェルマイクロプレート上で成長した細胞が生育可能かどうかをさらに確立するために、５，０００個のＨＭＥＣ－１をマイクロプレート上に播種し、９６時間培養した。培養期間の終了時に、培地を除去し、ＰＢＳ中のアクリジンオレンジおよびヨウ化ピプロジウムを細胞に添加した。アクリジンオレンジ（ＡＯ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、細胞生存率を測定するために使用できる核酸結合染料である。ＡＯは細胞透過性であるため、染色されたすべての核酸細胞は緑色蛍光を発生する。ＰＩは膜障害を有する細胞にのみ入り、したがって、ＰＩで染色された瀕死有核細胞、死有核細胞、および壊死性の有核細胞が赤色蛍光を発生する。赤色および緑色の細胞を計数し、赤色の死細胞の割合を計算した。図４および表２に示されるように、三つの独立した実験では、細胞の大部分は生存していた。
【0133】
表２ 高倍率視野あたりの細胞数および９６時間培養後の死細胞のパーセンテージ（ｎ＝３の実験の平均±ＳＤ）。
【表2】
【0134】
実施例２：ＨＭＥＣ－１細胞におけるコントロール血清とのインキュベーション効果の評価
この実験では、細胞数および生存率におけるＡＤＰまたはトロンビンを用いたＨＭＥＣ－１細胞の活性化の効果が評価された。５，０００個のＨＭＥＣ－１細胞を９６ウェルマイクロプレート上に播種し、９６時間培養した（増殖培地で７２時間、および血清なしの培地で最後の２４時間）。ＨＭＥＣ－１細胞単層を、試験培地（ＨＢＳＳ：１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロース；０．５％ＢＳＡ添加）で三回洗浄し、その後１０分間試験培地中で１０μＭのＡＤＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて活性化（ＡＤＰ活性化細胞）、もしくはトロンビン（２Ｕ／ｍｌ、１０分）を用いて活性化するか、 または試験培地単独でインキュベートした（細胞の静止）。ＡＤＰまたはトロンビンで予め活性化された休止細胞または細胞を、５０％のコントロール血清（ＨＢＳＳ中、７５μＬ最終量）で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、接着細胞数および生存率を、生／死細胞生存率アッセイを用いて評価した。
この実験では、細胞数および生存率におけるＡＤＰまたはトロンビンを用いたＨＭＥＣ－１細胞の活性化の効果が評価された。５，０００個のＨＭＥＣ－１細胞を９６ウェルマイクロプレート上に播種し、９６時間培養した（増殖培地で７２時間、および血清なしの培地で最後の２４時間）。ＨＭＥＣ－１細胞単層を、試験培地（ＨＢＳＳ：１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロース；０．５％ＢＳＡ添加）で三回洗浄し、その後１０分間試験培地中で１０μＭのＡＤＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて活性化（ＡＤＰ活性化細胞）、もしくはトロンビン（２Ｕ／ｍｌ、１０分）を用いて活性化するか、 または試験培地単独でインキュベートした（細胞の静止）。ＡＤＰまたはトロンビンで予め活性化された休止細胞または細胞を、５０％のコントロール血清（ＨＢＳＳ中、７５μＬ最終量）で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、接着細胞数および生存率を、生／死細胞生存率アッセイを用いて評価した。
【0135】
表３に示されるように、二つの独立した実験では、細胞の総数はすべての条件 で比較可能であり、死細胞のパーセンテージは低く、また培地単独で観察される割合に匹敵する。
【0136】
表３ 高倍率視野あたりの細胞数およびコントロール血清と４時間培養後の死細胞のパーセンテージ（それぞれ３ウェルの平均±ＳＤ）。
同様の実験を異なる細胞密度で行った。ＨＭＥＣ－１細胞をウェル当たり１０，０００および１２，５００細胞で播種し、９６ウェルマイクロプレートで４８時間培養した。ウェル当たり１５，０００細胞で播種された細胞を一晩または２４時間培養した。コンフルエントなＨＭＥＣ－１細胞を、試験培地（ＨＢＳＳ：１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロース；０．５％ＢＳＡ添加）で三回洗浄し、その後１０分間試験培地中で１０μＭのＡＤＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて活性化（ＡＤＰ活性化細胞）、もしくはトロンビン（２Ｕ／ｍｌ、１０分）を用いて活性化するか、または試験培地単独でインキュベートした（細胞の静止）。
【表3】
【0137】
ＡＤＰまたはトロンビンで予め活性化された休止細胞または細胞を、５０％のコントロール血清（ＨＢＳＳ中、７５マイクロリットルの最終量）で４時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、生／死細胞生存率アッセイを実施するために、アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピシジウムを添加して細胞の生存率を検証した。
【0138】
表４（１０，０００および１２，５００細胞／ウェル）、表５（１５，０００細胞／ウェル）および表６（１５，０００細胞／ウェルのデュプリケート実験）に示されるように、大多数の細胞が生存した。
【0139】
表４
【表4】
【0140】
表５
【表5】
【0141】
表６
【表6】
【0142】
実施例３：患者由来試料および９６時間の細胞培養による血清誘導Ｃ５ｂ－９沈着物の評価
上記の実施例で決定された最適な培養条件を使用して、プラットフォームがＨＭＥＣ－１細胞におけるＣ５ｂ－９沈着の新しい自動化アッセイを開発するために使用できるか否かを評価する目的で、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸスキャナーを使用してパイロット試験を行った。
上記の実施例で決定された最適な培養条件を使用して、プラットフォームがＨＭＥＣ－１細胞におけるＣ５ｂ－９沈着の新しい自動化アッセイを開発するために使用できるか否かを評価する目的で、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬＸスキャナーを使用してパイロット試験を行った。
【0143】
ＨＭＥＣ－１細胞を９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり５，０００細胞で播種して、播種の９６時間後に使用した。ＨＭＥＣ－１細胞単層を、試験培地（ＨＢＳＳ：１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロース；０．５％ＢＳＡ添加）で三回洗浄し、その後１０分間試験培地中で１０μＭのＡＤＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて活性化（ＡＤＰ活性化細胞）するか、または試験培地単独でインキュベートした（細胞の静止）。次いで、細胞を試験培地で三回洗浄して、試験培地で１：２希釈した（最終量７５μＬ）、コントロールからの血清または別個の二人のａＨＵＳ患者からの血清（疾患の急性期中に採取し）と共に、ｓＣＲ１（一般的な補体阻害剤）の存在下または不在下で４時間インキュベートした。培養工程の終了時に、細胞を、ＰＢＳで二回洗浄し、３％のパラホルムアルデヒド中に固定し、次いでＰＢＳで二回洗浄した。
【0144】
細胞は、２％ＢＳＡを有する１００μｌのＰＢＳ（すなわち、「典型的」アッセイで使用されるブロッキング緩衝液）、またはＯｄｙｓｓｅｙ ｏｎ－ｃｅｌｌ ｗｅｓｔｅｒｎプロトコルで提案される１００μｌの市販のブロッキング緩衝液（Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液、ＬＩ－ＣＯＲ社）で一時間ブロッキングした。二つのブロッキング緩衝液は、比較的良好な結果を与えた（図５Ａから５Ｄ）。細胞を、ウサギ抗ヒト補体Ｃ５ｂ－９複合体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて染色し、続いて二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ－ＣＯＲ社）で染色した。二次抗体の二つの異なる希釈１：６００、および１：１２００が試験された。
【0145】
細胞数で蛍光強度を正規化するために、二次抗体染色の獲得後、細胞はＰＢＳ １ｘ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、その後、各ウェルの細胞数の計算を可能にする、近赤外蛍光、非特異的な細胞染色であるＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬で攻撃した。細胞の透過処理はＤＮＡ染色に必要であるが、「典型的」バージョンのＣ５ｂ－９アッセイでは、細胞を透過処理することはない。透過処理工程がＣ５ｂ－９染色に影響を及ぼす可能性があるかどうかを試験するために、二回のＣ５ｂ－９蛍光の検出を実施した：一方が、二次抗体染色後（８００ｎｍ）であり、もう一方が、透過処理およびＤＮＡ染色後（７００および８００ｎｍの両方）である。これら二つの条件下では、Ｃ５ｂ－９信号の差異は観察されなかった。
【0146】
各試料および各条件について、以下のように三つ組みで試験された。
・ プレート１：休止セル；培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／６００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ａ）。
・ プレート２：ＡＤＰ活性化細胞：培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／６００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｂ）。
・ プレート３：休止セル；培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／１２００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｃ）。
・ プレート４：ＡＤＰ活性化細胞：培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／１２００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｄ）。
・ プレート１：休止セル；培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／６００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ａ）。
・ プレート２：ＡＤＰ活性化細胞：培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／６００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｂ）。
・ プレート３：休止セル；培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／１２００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｃ）。
・ プレート４：ＡＤＰ活性化細胞：培地、コントロール血清、ａＨＵＳ １急性、ａＨＵＳ １急性＋ｓＣＲ１、ａＨＵＳ ２急性、二次抗体１／１２００、左側：作製したブロッキング緩衝液、右側：市販のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（図５Ｄ）。
【0147】
表７にまとめた結果は、ａＨＵＳ患者からの血清が、コントロール血清よりも、静止するまたはＡＤＰ活性化されたＨＭＥＣ－１細胞のいずれかにおいてより多くのＣ５ｂ－９沈着物を誘発したことを示し、沈着物はｓＣＲ１によって大幅に減少された。最良の結果は、二次抗体の１：１２００希釈で得られ、同じ患者からの血清の別のアリコートを使用した「典型的」アッセイで得られたものと非常に同等であった。唯一の例外は、患者のａＨＵＳ ２が、「典型的」アッセイと比較して新しいアッセイでのＡＤＰ活性化ＨＭＥＣ－１細胞におけるＣ５ｂ－９沈着物（コントロール血清でのＣ５ｂ－９沈着物のパーセンテージ）の増加が小さかったということであった（事前に解凍された血清のアリコートはこの患者に使用された）。
【0148】
表７ 並行して行った対応するコントロール血清によって誘導された沈着のパーセンテージとして表したＣ５ｂ－９沈着物。
【表7】
【0149】
実施例４：自動化されたＣ５ｂ－９沈着アッセイおよびＨＭＥＣ－１との短時間（１６および２４時間）培養での患者由来試料の評価
本実施例は、ａＨＵＳ患者（＃３：エクリズマブ治療中のａＨＵＳ患者、＃４：寛解状態で治療されていないａＨＵＳ患者、＃５：エクリズマブ治療中のａＨＵＳ患者）および健康なコントロール（健康な対象２０人からプールした血清）からの血清試料での、自動化したＣ５ｂ－９沈着アッセイの使用について説明する。
本実施例は、ａＨＵＳ患者（＃３：エクリズマブ治療中のａＨＵＳ患者、＃４：寛解状態で治療されていないａＨＵＳ患者、＃５：エクリズマブ治療中のａＨＵＳ患者）および健康なコントロール（健康な対象２０人からプールした血清）からの血清試料での、自動化したＣ５ｂ－９沈着アッセイの使用について説明する。
【0150】
ＨＭＥＣ－１細胞を９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり１５，０００細胞で播種して、培養の一晩（約１６時間）または２４時間後に使用した。ＨＭＥＣ－１細胞単層を、試験培地（ＨＢＳＳ：１３７ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、０．７ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２ＨＰＯ４、０．７３ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１．９ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４、２８ｍｍｏｌ／ｌのトリス塩基（Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ）ｐＨ７．３、０．１％デキストロース；０．５％ＢＳＡ添加）で三回洗浄し、その後１０分間試験培地中で１０μＭのＡＤＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて活性化（ＡＤＰ活性化細胞）するか、または試験培地単独でインキュベートした（細胞の静止）。これに続いて、細胞を試験培地で三回洗浄し、その後、試験培地で１：２で希釈（最終量：７５μＬ）した、コントロールからまたは別個のａＨＵＳ患者３人からの血清と共に４時間インキュベートした。インキュベーション工程の終了時に、ＨＭＥＣ－１を、ＰＢＳで二回洗浄し、３％のパラホルムアルデヒド中に固定し、次いで再度ＰＢＳで二回洗浄した。細胞を、１００μｌの市販のブロッキング緩衝液（Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液、ＬＩ－ＣＯＲ社）で一時間ブロックし、続いて、ウサギ抗ヒト補体Ｃ５ｂ－９複合体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）で、続いて二次抗体ＩＲＤｙｅ ８００ ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ－ＣＯＲ社）を１：８００希釈で染色した。
【0151】
細胞数で蛍光強度を正規化するために、二次抗体染色の獲得後、細胞はＰＢＳ １ｘ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、その後、各ウェルの細胞数の計算を可能にする、近赤外蛍光、非特異的な細胞染色であるＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬で攻撃した。その後、Ｃ５ｂ－９蛍光の検出を８００ｎｍで行い、ＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬の検出を７００ｎｍで行った。８００ｎｍにおける信号を７００ｎｍ（細胞数）での信号に対して補正した。コントロールプール血清とインキュベートされたＨＭＥＣ－１を用いたウェルからの補正信号を１００％として採取し、結果をコントロールの％として表した。各試料および各条件について三つ組で試験して、三つの複製の平均を計算した。
【0152】
各ウェルの全体の面積に対応するグリッドを使用して、信号の強度を最初に検出した（標準グリッド、ＨＭＥＣ－１細胞核および細胞質を標識するＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬を７００ｎｍで中心にした、図６Ａ）。しかしながら、各ウェルにおけるＣｅｌｌＴａｇ ７００ Ｓｔａｉｎ染色試薬の赤色蛍光分布は、周辺領域におけるよりもウェルの中央領域でより均一であった。したがって、分析は、ウェルの中央領域のみを分析するもうひとつのグリッドを使用して繰り返した（減少させたグリッド、図６Ｂ）。
【0153】
自動化された試験およびＨＭＥＣ－１の一晩培養で得られた結果と、のうち良好な一致があり、およびＨＭＥＣ－１が一晩培養された結果と、「典型的」Ｃ５ｂ－９沈着試験（ＨＭＥＣ－１の９６時間培養およびＣ５ｂ－９沈着物の共焦点顕微鏡検出）により同一の血清試料を用いて得られた結果とで、良好な一致があった（表８）。両方の方法で実際に、患者＃３および＃５（エクリズマブ治療中）が少ないＣ５ｂ－９沈着物を示し、患者＃４（寛解、治療なし）は、休止およびＡＤＰ活性化ＨＭＥＣ－１細胞における正常のＣ５ｂ－９沈着物よりも多いことを示した。特に、患者＃４は明らかな臨床寛解であったが、試験では、典型的方法と自動化された方法との両方で休止ＨＭＥＣ－１細胞におけるＣ５ｂ－９沈着物について陽性であった。これらの結果は、血清誘導Ｃ５ｂ－９沈着試験が無症候性疾患の活性を強調することができることを示しており、これはａＨＵＳ患者の習慣的なモニタリングにとって非常に適切なこととなる。
【0154】
【表8】
【0155】
類似の実験を、２４時間培養されたＨＭＥＣ－１細胞を用いて行った（表９）が、結果は、一晩培養された細胞で得られたものと類似していた。自動化試験で得られた結果と、「典型的」Ｃ５ｂ－９沈着試験を用いた同じ血清試料を使用して得られた先の結果とにおいて、良好な一致が観察された。
【0156】
【表9】
【0157】
上記の結果に基づいて、その後の実験は、蛍光信号の分析のために、各ウェルの全体の面積を覆う標準グリッドを使用した。
【0158】
実施例５：自動化Ｃ５ｂ－９沈着アッセイの検証
この実施例では、自動化されたＣ５ｂ－９沈着アッセイは、三人の追加のａＨＵＳ患者からの血清試料を使用して検証された。
この実施例では、自動化されたＣ５ｂ－９沈着アッセイは、三人の追加のａＨＵＳ患者からの血清試料を使用して検証された。
【0159】
ＨＭＥＣ－１細胞を９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり１５，０００細胞で播種して、培養の一晩（約１６時間）または２４時間後に使用した。ＨＭＥＣ－１細胞（休止またはＡＤＰ活性化のいずれか）を、３人の追加のａＨＵＳ患者から血清と共にインキュベートした：ａＨＵＳである＃６は治療前の急性期であり、ａＨＵＳである＃７は寛解、治療なしであり、ａＨＵＳである＃８はエクリズマブ治療中である。健康な対象２０人からの血清のプールを、コントロールとして並行して試験した。試料は三つの組で実行され、標準グリッドを使用して上述したように分析された。
【0160】
これら追加の３人の患者からの血清で得られた結果は、一晩培養のＨＭＥＣ－１で実施された典型的試験の結果と自動化された試験の結果との間の良好な一致を確認した（表１０および図９）。注目すべきことに、患者＃６および＃７は、両方の試験で休止ＨＭＥＣ－１およびＡＤＰ活性化ＨＭＥＣ－１におけるＣ５ｂ－９沈着物の増加を示した。
【0161】
【表10】
【0162】
均等物
当業者は、本明細書に開示される特定の実施形態の多くの均等物を通常の実験以外に使用することを認識し、または確認することができる。こうした均等物は、以下の請求項に包含されることが意図されている。
当業者は、本明細書に開示される特定の実施形態の多くの均等物を通常の実験以外に使用することを認識し、または確認することができる。こうした均等物は、以下の請求項に包含されることが意図されている。
【0163】
配列の概要
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【表11-4】
【表11-5】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】