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特許7129484１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物及びこれを用いた１，３－ＰＤＯの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-24
(45)【発行日】2022-09-01
(54)【発明の名称】１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物及びこれを用いた１，３－ＰＤＯの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220825BHJP
C12P 7/18 20060101ALI20220825BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20220825BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20220825BHJP
C12N 15/60 20060101ALN20220825BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20220825BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20220825BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/18
C12N15/53
C12N15/54
C12N15/60
C12N15/52 Z
C12N15/31
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020540381
(86)(22)【出願日】2019-01-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-13
(86)【国際出願番号】 KR2019000571
(87)【国際公開番号】W WO2019143089
(87)【国際公開日】2019-07-25
【審査請求日】2020-09-04
(31)【優先権主張番号】10-2018-0005451
(32)【優先日】2018-01-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514291196
【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(73)【特許権者】
【識別番号】520263899
【氏名又は名称】ハンファ ソルーションズ コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＷＨＡ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】イ サンヨプ
(72)【発明者】
【氏名】チョ ジェソン
(72)【発明者】
【氏名】キム ジェウン
(72)【発明者】
【氏名】コ ユソン
(72)【発明者】
【氏名】プラボウォ シンディ プリシリア スーリヤ
(72)【発明者】
【氏名】ハン テヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム ウィトク
(72)【発明者】
【氏名】チェ ジェウォン
(72)【発明者】
【氏名】チョ チャンヒ
(72)【発明者】
【氏名】イ チュンキュ
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０３０１９３５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／２００２３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2008, Vol.74, pp.6216-6222
【文献】SCIENTIFIC REPORTS, 2017, Vol.7, No.42246
【文献】Current Opinion in Biotechnology, 2003, Vol.14, pp.454-459
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
Ｃ１２Ｐ ７／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリセロールを単一炭素源として活用不可能なコリネバクテリウムグルタミクムに、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子であるｇｌｐＫ、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるｇｌｐＤ、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子であるｇｌｐＦ、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子とグリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子であるｄｈａＢ／ｇｄｒＡＢ及び大腸菌由来の１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子であるｙｑｈＤが導入され、グリセロールを含む炭素源から１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物。
【請求項2】
前記遺伝子は、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｈ３６及びｔｕｆからなる群から選ばれる強力なプロモーターによって過発現することを特徴とする、請求項１に記載の変異微生物。
【請求項3】
次の段階を含む、グリセロールから１，３－プロパンジオールを製造する方法：（ａ）請求項１又は２に記載の変異微生物をグリセロール含有培地で培養して１，３－プロパンジオールを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された１，３－プロパンジオールを得る段階。
【請求項4】
前記培地にブドウ糖を補助炭素源として添加することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記培地に添加されるブドウ糖：グリセロールが重量比で１：２～９であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、グリセロールから１，３－プロパンジオール（１，３－ＰＤＯ）生成能を有する変異微生物及びこれを用いた１，３－ＰＤＯの製造方法に関し、より詳細には、グリセロールを単一炭素源として活用不可能な微生物にグリセロール分解代謝回路及び１，３－ＰＤＯ生合成回路を導入した変異微生物及びこれを用いた１，３－ＰＤＯの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
１，３－プロパンジオール（１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ；１，３－ＰＤＯ）は、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリトリメチレンテレフタレート（ｐｏｌｙｔｒｉｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ；ＰＴＴ）のような高分子合成の単量体として用いられる化学物質である。１，３－ＰＤＯに対する既存の生産方法は主に化学的な合成方法であり、アクロレイン（ａｃｒｏｌｅｉｎ）の水和、エチレンオキシドをホスフィン（ｐｈｏｓｏｈｉｎｅ）の存在下でヒドロホルミル化（ｈｙｄｒｏｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ）する方法、或いはグリセロールを酵素的に転換する方法などが用いられている。このような化学的な生産方法は高費用である他に環境有害生産工程が含まれているため、限界がある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，４２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ）：９６３－９７２；米国登録特許第８，２３６，９９４Ｂ２）。
【0003】
生物学的な方法は微生物を用いて１，３－ＰＤＯを生産する方法であって、主にクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）などの微生物を用いて行う。これらはいずれも、グリセロールを連続した２つの代謝回路を経て１，３－ＰＤＯに直接転換し、グリセロールデヒドラターゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）でグリセロールを３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｒｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ，３－ＨＰＡ）に転換した後、１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼで３－ＨＰＡを１，３－ＰＤＯに還元させる代謝回路である（図１）。デュポン社は既に、前記代謝回路を大腸菌に導入して１，３－ＰＤＯの商業化に成功した。しかし、１，３－ＰＤＯを生合成する大腸菌を含む前記大部分の微生物は、ギ酸塩（ｆｏｒｍａｔｅ）、酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）、乳酸塩（ｌａｃｔａｔｅ）、エタノール、２，３－ブタンジオールなどの種々の副産物が共に生産されるという短所がある。
【0004】
コリネバクテリウムグルタミクムは、グラム陽性の通性嫌気性菌であり、アミノ酸生産発酵工程に広く用いられており、また、コリネバクテリウムグルタミクムを用いて種々の化学物質、燃料などを生産するために、ブドウ糖、キシロースなどの種々の炭素源を摂取できるように代謝工学的に多く研究されてきたが、１，３－ＰＤＯを生産する研究は殆どなく、コリネバクテリウムグルタミクムにおいてブドウ糖及びグリセロールを炭素源として用い、ブドウ糖で細胞成長を図り、グリセロールで１，３－ＰＤＯを生産してグルタミン酸を同時生産する研究が報告されている（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：４２２４６，２０１７）。
【0005】
そこで、本発明者らはグリセロールを単一炭素源とし、より効率的に１，３－ＰＤＯを生産しようと努力した結果、グリセロールを単一炭素源として活用できない微生物にグリセロール分解代謝回路を構築するために、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、１，３－ＰＤＯ生合成のために、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子をさらに導入した変異微生物をグリセロール単一炭素源で培養する場合、１，３－ＰＤＯを生産することを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、グリセロール分解代謝回路が導入され、グリセロールを単一炭素源にして成長できる変異微生物を提供することにある。
【0007】
本発明の他の目的は、前記変異微生物への１，３－ＰＯＤ生合成経路の導入により、グリセロールを単一炭素源として活用して１，３－ＰＤＯを生成できる変異微生物を提供することにある。
【0008】
本発明のさらに他の目的は、グリセロールだけを単一炭素源として活用する変異微生物を用いた１，３－ＰＤＯの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するために、本発明は、グリセロールを単一炭素源として活用不可能な微生物に、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、グリセロールを単一炭素源にして成長可能である変異微生物を提供する。
【0010】
本発明はまた、グリセロールを単一炭素源として活用不可能な微生物に、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子、及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、グリセロールから１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物を提供する。
【0011】
本発明はまた、（ａ）グリセロールから１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して１，３－プロパンジオールを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された１，３－プロパンジオールを得る段階を含む、グリセロールから１，３－プロパンジオールを製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】コリネバクテリウムグルタミクム内の１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路及びグリセロール分解代謝回路を含む全体的な代謝回路模式図である。
【0013】
【図2】グリセロール分解代謝回路をコードするｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤ遺伝子が挿入されたｐＣＳｇｌｐＦＫＤ組換えベクターを示す図である。
【0014】
【図3】野生型コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株にｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターを導入し、初期グリセロール濃度１８ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び４０ｇ／Ｌに対してフラスコ培養時に観測された細胞成長結果を示す図である。
【0015】
【図4】ｐＣＳｇｌｐＦＫＤが導入された野生型コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株を用いて初期グリセロール濃度２０ｇ／Ｌから４０ｇ／ＬまでのＡＬＥ方法に対する模式図である。
【0016】
【図5】ＡＬＥ方法により、ｐＣＳｇｌｐＦＫＤが導入された野生型コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株の細胞成長速度がフラスコ培養時に初期グリセロール濃度４０ｇ／Ｌに対して大きく増加することを示す図である。
【0017】
【図6】３－ＨＰＡ生合成代謝回路の構築のためにグリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールリアクティバーゼをコードするｄｈａＢ１２３４／ｇｄｒＡＢ遺伝子クラスターを挿入して製造したｐＥＫ－ｄｇ組換えベクターを示す図である。
【0018】
【図7】３－ＨＰＡ生合成代謝回路の構築のためにグリセロールデヒドラターゼをコードするｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子クラスターを挿入して製造したｐＥＫ－ｐｄｕ組換えベクターを示す図である。
【0019】
【図8】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のために大腸菌１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードするｙｑｈＤ遺伝子をｐＥＫ－ｄｇベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｄｇｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0020】
【図9】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のためにクレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６ １，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子をｐＥＫ－ｄｇベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｄｇｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0021】
【図10】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のためにクレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６ １，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｄｈａＴ遺伝子をｐＥＫ－ｄｇベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｄｇｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0022】
【図11】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のために大腸菌１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子をｐＥＫ－ｐｄｕベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0023】
【図12】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のためにクレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６ １，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子をｐＥＫ－ｐｄｕベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0024】
【図13】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のためにクレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６ １，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｄｈａＴ遺伝子をｐＥＫ－ｐｄｕベクターに挿入して製造したｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ組換えベクターを示す図である。
【0025】
【図14】１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のために作製した６種の組換えベクター（ｐＥＫ－ｄｇｙＥ、ｐＥＫ－ｄｇｙＫ、ｐＥＫ－ｄｇｄＫ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＫ、ｐＥＫ－ｐｄｕｄＫ）が導入されたコリネバクテリウムグルタミクム変異微生物に対してフラスコ培養時に観測された１，３－ＰＤＯ生産結果を示す図である。
【0026】
【図15】フラスコ培養時にエアレーション条件によってＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の１，３－ＰＤＯ生産結果を示す図である。
【0027】
【図16】グリセロールを単一炭素源として活用する時、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の流加式発酵培養結果を示す図である。
【0028】
【図17】ブドウ糖とグリセロールの重量比率によるＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株のフラスコ培養時に観測された１，３－ＰＤＯ生産結果を示す図である。
【0029】
【図18】ブドウ糖とグリセロールの重量比を１：３にして用いる時、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の流加式発酵培養結果を示す図である。
【0030】
【図19】ブドウ糖とグリセロールの重量比を１：２にして活用する時、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の流加式発酵培養結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
特に定義されない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
【0032】
本発明では、グリセロールを単一炭素源として活用してグリセロール分解代謝回路の構築によって細胞成長が可能であると同時に、１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築によって１，３－ＰＤＯ生産も図る変異微生物を作製した。本発明では、自然的にグリセロールを単一資源として活用できない微生物に対して、グリセロール分解代謝回路を担当するグリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入した変異微生物を作製し、該変異微生物がグリセロールを単一炭素源として含む培地で成長することを確認した。
【0033】
したがって、本発明は、一観点において、グリセロールを単一炭素源として活用できない微生物に、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されており、グリセロールを単一炭素源にして成長することができる変異微生物に関する。
【0034】
本発明において、前記グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、前記グリセロールキナーゼをコードする遺伝子及び前記グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はそれぞれ、大腸菌Ｗ３１１０由来ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤであることを特徴とし得る。
【0035】
本発明において、前記グリセロールを単一炭素源として活用できない微生物は、コリネバクテリウム属、ラクトバシルスパニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ）、クロストリジウムアセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウムベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、マイコバクテリウムチューバキュロウセス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ロドバクターカプスラティス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｉｓ）などの微生物を用いることができるが、これに限定されない。
【0036】
本発明において、前記遺伝子は、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｈ３６、ｔｕｆなどの強いプロモーターによって過発現することを特徴とし得る。
【0037】
本発明の一様態では、自然的にグリセロール拡散は可能である微生物であるが、単一炭素源として活用時に細胞成長が可能でない微生物であるコリネバクテリウムグルタミクムにグリセロール分解のために、グリセロールキナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼを導入し、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）はグリセロール取り込み率（ｕｐｔａｋｅ ｒａｔｅ）を増加させるために導入した。前記“導入”とは、コリネバクテリウムグルタミクムゲノムに挿入したり、或いは当該酵素を発現するベクターを導入して形質転換することを意味する。
【0038】
本発明の一態様では、グリセロール分解代謝回路が導入された微生物或いはグリセロールを活用時に細胞成長が非常に阻害されるか遅い微生物に対して取り込み率を増加させるためにＡＬＥ（ａｄａｐｔｉｖｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を施した。ＡＬＥは、細胞を新しい培地に持続的で連続的に移して培養することを意味し、細胞を移す時点は、前培養培地で細胞成長が観測された時に次の培養培地に前培養液を接種する。終わる時点は、所望のグリセロール濃度の下に単一炭素源で培養するとき、向上した細胞成長を示す時である。
【0039】
本発明は、（ａ）グリセロールを単一炭素源にして成長できる変異微生物を、グリセロールを単一炭素源として含有する培地で培養する段階；（ｂ）（ａ）段階で成長した変異微生物を含有する培養液の一部を、グリセロールを単一炭素源として含有する新しい培地に接種する段階；及び（ｃ）（ａ）及び（ｂ）を数回反復して誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）が減少した変異微生物を得る段階を含む、グリセロールを唯一炭素源とする培地で変異微生物の誘導期を短縮させる方法を提供する。
【0040】
本発明の一態様では、自然的にグリセロールを単一資源として活用できない微生物であるコリネバクテリウムグルタミクムで１，３－ＰＤＯ生産能を有する微生物において、グリセロールを用いて細胞成長が可能なように、グリセロール分解代謝経路を担当する遺伝子であるグリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、また、１，３－ＰＤＯの生合成を担当する酵素をコードする遺伝子であるグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子を導入して内在的活性に比べて強化されるように変形させて１，３－ＰＤＯ生産性の向上した変異微生物を作製し、該作製された変異微生物がグリセロールを単一炭素源とする条件で細胞成長と同時に１，３－ＰＤＯを生産することを確認した。
【0041】
したがって、本発明は他の観点において、グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子が導入されており、グリセロールから１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物に関する。
【0042】
本発明において、前記グリセロールファシリテーター（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）をコードする遺伝子、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子、及びグリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はそれぞれｇｌｐＦ、ｇｌｐＫ及びｇｌｐＤであることを特徴とし得る。
【0043】
本発明において、前記グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子はそれぞれ、ｐｄｕＣＤＥＧ及びｙｑｈＤであることを特徴とし得る。
【0044】
本発明において、前記グリセロールを単一炭素源として活用できない微生物は、コリネバクテリウム属、ラクトバシルスパニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｎｉｓ）、クロストリジウムアセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウムベエイジェリンキー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、マイコバクテリウムチューバキュロウセス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ロドバクターカプスラティス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｉｓ）などの微生物を用いることができるが、これに限定されない。
【0045】
本発明において、前記遺伝子は、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｈ３６及びｔｕｆから構成された群から選ばれる強いプロモーターによって過発現することを特徴とし得る。
【0046】
本発明の一態様において、１，３－ＰＤＯ生産能を付与又は強化するために導入されるグリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子、グリセロールリアクティバーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｒｅａｃｔｉｖａｓｅ）をコードする遺伝子及び１，３－プロパンジオールオキシドリダクターゼをコードする遺伝子は、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭＺ２０２６由来のものを使用し、このとき、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子及びグリセロールリアクティバーゼをコードする遺伝子は、遺伝子クラスター単位であるｄｈａＢ１２３４ｇｄｒＡＢ又はｐｄｕＣＤＥＧＨであり、１，３－ＰＤＯオキシドリダクターゼをコードする遺伝子はｙｑｈＤ又はｄｈａＴ、或いは大腸菌由来の１，３－ＰＤＯオキシドリダクターゼをコードする遺伝子はｙｑｈＤを使用することができる。
【0047】
本発明の他の態様では、まず、グリセロール分解代謝回路回路を、グリセロールファシリテーター、グリセロールキナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼを導入して構築し、ＡＬＥにより、約４０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度で単一炭素源として用いられる時に細胞成長が大きく増加することが確認できた。
【0048】
前記結果から、グリセロールを単一炭素源として用いる時、細胞成長に優れた菌株を選別した後、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールリアクティバーゼ、１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼを導入して１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路を構築し、約６種のＰＤＯ生合成代謝回路が構築又は強化された変異微生物に対してグリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールリアクティバーゼをコードするクレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭＺ２０２６由来ｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子、１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードする大腸菌由来ｙｑｈＤ遺伝子が最高レベルの１，３－ＰＤＯを生産することを確認した。
【0049】
前記結果から知られたグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールリアクティバーゼ、１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼの過発現による１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路が強化され、生産が可能であることが確認できた。
【0050】
したがって、本発明は更に他の観点において、（ａ）前記グリセロールから１，３－プロパンジオール生成能を有する変異微生物をグリセロール含有培地で培養して１，３－プロパンジオールを生成させる段階；及び（ｂ）前記生成された１，３－プロパンジオールを得る段階を含む、グリセロールから１，３－プロパンジオールを製造する方法に関する。
【0051】
本発明において、前記培地にブドウ糖を添加することを特徴とし、培地に添加されるブドウ糖：グリセロールは重量比で１：２～９であることを特徴とし得る。
【0052】
本発明の他の態様では、前記変異菌株培養時のエアレーション条件を最適化することによって、一定の微好気性（ｍｉｃｒｏ－ａｅｒｏｂｉｃ）条件の下に１，３－ＰＤＯ生産能が最も高いことが確認できた。前記作製したグリセロールを単一炭素源として活用するとき、細胞成長に優れるとともに１，３－ＰＤＯ生産能が付与又は強化された変異微生物を、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１と命名した。
【0053】
本発明のさらに他の態様では、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株を用いた流加式発酵培養を進行したが、最適化されたエアレーション条件に合わせるので特にこれに制限されないが、０．２５ｖｖｍ、６００ｒｐｍ下にｐＨ７、温度３０℃で培養した。当該条件下に約４７．３ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯがグリセロールを単一資源として用いる時に生産されることを確認した。前記結果から、約４４．０ｇ／Ｌの３－ＨＰが副産物として観測されたが、これはコリネバクテリウムグルタミクム内に自然的に存在する任意のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素が１，３－ＰＤＯ生産に必要な還元力を提供するべく内在的活性が生成又は強化されたものと判断した。したがって、一定比率のブドウ糖の添加によるペントースリン酸経路（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ）活性化とこれによる還元力の供給によって３－ＨＰ生産代謝回路の内在的活性を減らす目的でブドウ糖及びグリセロールを一定比率下に炭素源として用いて培養し、その結果、一定比率に対して３－ＨＰ生産量は減少し、１，３－ＰＤＯ生産量が増加することを確認した。これは、１，３－ＰＤＯ生産能が与えられた微生物のうち、３－ＨＰ生産能を示す微生物に限って３－ＨＰ生産代謝回路に関与するアルデヒドデヒドロゲナーゼを欠失又は弱化させる時に１，３－ＰＤＯ生産能が向上することを示す。
【0054】
このような結果から、ブドウ糖の添加による還元力供給が強化されてアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性が弱化したと判断し、観測された比率下に流加式発酵培養を進行した結果、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株において６０．３ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯが生産されることを確認した。このとき、ブドウ糖比率をより上げて還元力供給をより強化し、アルデヒドデヒドロゲナーゼの活性をより弱化させた結果、最終的に７７．３ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯが生産されることを確認した。
【0055】
本発明で使われる用語“内在的活性”とは、本来、微生物が変形されていない状態で持っている酵素の活性状態を意味し、“内在的活性に比べて強化されるように変形”されるという意味は、変形前の状態の酵素活性と比較して当該活性が新規に導入されたり或いはより向上したことを意味する。
【0056】
本発明において“酵素活性の強化”とは、酵素自体の活性が新しく導入されたり増大して本来機能以上の効果を導出することを含むだけでなく、内在的遺伝子活性の増加、内部又は外部要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子導入、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替又は変形及び遺伝子内突然変異による酵素活性の増加などによってその活性が増加することを含む。
【0057】
本発明において“内在的活性に比べて強化されるように変形”されたということは、活性を示す遺伝子が導入されたり又は当該遺伝子のコピー数の増加、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失又は発現調節配列の変形、例えば改良されたプロモーターの使用などのような操作がなされる前の微生物が有する活性に比べて、操作がなされた後の微生物が持っている活性が増加した状態を意味する。
【0058】
本発明において“欠失”とは、該当の遺伝子の一部又は全部の塩基を変異、置換又は削除させる方法を用いて当該遺伝子が発現しないようにするか或いは発現しても酵素活性を示さないようにすることを包括する概念であり、当該遺伝子の酵素が関与する生合成経路を遮断する全てを含む。
【0059】
本発明において“過発現”とは、普通の状態で細胞内該当の遺伝子が発現するレベルよりも高いレベルの発現のことを指し、遺伝体上に存在する遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換したり、或いは発現ベクターに該当の遺伝子をクローニングして細胞に形質転換させる方法を用いて発現量を増加させることなどを含む概念である。
【0060】
本発明において、“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は、適当な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適当な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムに関係なく複製し機能可能であるか、或いは一部の場合にはゲノム自体に統合され得る。現在、プラスミドがベクターの最も一般に用いられる形態であるので、本発明の明細書において“プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）”及び“ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）”は、しばしば同じ意味で使われる。本発明の目的上、プラスミドベクターを用いる方が好ましい。このような目的に使用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりに数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率よくなされるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜され得るようにする抗生剤耐性遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片が挿入され得る制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
【0061】
ライゲーション後に、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換される必要がある。本発明において、選好される宿主細胞は原核細胞である。適切な原核宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ－１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ２１などを含む。しかし、ＦＭＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８及びＮＭ５３９のようなＥ．ｃｏｌｉ菌株及び他の原核生物の種（ｓｐｅｉｃｅｓ）及び属（ｇｅｎｅｒａ）なども利用可能である。前述したＥ．ｃｏｌｉに加えて、アグロバクテリウムＡ４のようなアグロバクテリウム属菌株、バチルスサブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシリ（ ｂａｃｉｌｌｉ）、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のような他の腸内細菌及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の菌株が宿主細胞として用いられてもよい。
【0062】
原核細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａの１．８２セクションに記述されたカルシウムクロリド方法によって容易に達成可能である。選択的に、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１：８４１，１９８２）もこのような細胞の形質転換に用いられ得る。
【0063】
本発明に係る遺伝子の過発現のために用いられるベクターは、当業界に公知の発現ベクターであり得、ｐＥＴ系列ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いることが好ましい。前記ｐＥＴ系列ベクターを用いてクローニングを行えば、発現するタンパク質の末端にヒスチジン基が結合して出るので、前記タンパク質を効果的に精製することができる。クローニングされた遺伝子から発現しているタンパク質を分離するためには当業界に公知の一般的な方法を用いることができ、具体的に、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓ－結合レジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するクロマトグラフィー方法を用いて分離することができる。本発明において、前記組換えベクターはｐＥＴ－ＳＬＴＩ６６であることを特徴とし、前記宿主細胞は大腸菌又はアグロバクテリウムであることを特徴とし得る。
【0064】
本発明において“発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”という表現は、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター、かかる転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適切な調節配列はプロモーター、任意にオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを含む。プラスミドにおいて遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモーターである。高発現用のプロモーターとしてＳＲαプロモーターとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）由来プロモーターなどが好適に用いられる。本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に様々な発現調節配列のうち、いずれをもベクターに使用可能である。有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルスの初期及び後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ファージラムダの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコードタンパク質の調節領域、３－ホスホグリセレートキナーゼ又は他のグリコール分解酵素に対するプロモーター、前記フォスファターゼのプロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ－交配システムのプロモーター及び原核細胞又は真核細胞又はウイルスの遺伝子発現を調節するものと知られたその他の配列及びそれらの様々な組合せが含まれる。Ｔ７プロモーターは大腸菌において本発明のタンパク質を発現させるのに有用である。
【0065】
核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）は調節配列に結合する時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡはポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は翻訳を容易にするよう配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合は、接触しリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）は接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を用いる。
【0066】
本願明細書に使われた用語“発現ベクター”は、通常、異種のＤＮＡの断片が挿入された組換えキャリア（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｒｒｉｅｒ）であり、一般に二本鎖のＤＮＡの断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは、宿主細胞から天然的に発見されないＤＮＡである異型ＤＮＡを意味する。発現ベクターは、一旦宿主細胞内にあれば、宿主染色体ＤＮＡに関係なく複製することができ、ベクターの数個のコピー及びその挿入された（異種）ＤＮＡが生成され得る。
【0067】
当業界に周知のように、宿主細胞において形質感染遺伝子の発現レベルを高めるためには、当該遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能なように連結される必要がある。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる一つの発現ベクター内に含まれる。宿主細胞が真核細胞である場合には、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含む必要がある。
【0068】
上述した発現ベクターによって形質転換又は形質感染された宿主細胞は、本発明のさらに他の側面を構成する。本願明細書に使われた用語“形質転換”は、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体外の因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。本願明細書に使われた用語“形質感染”は、任意のコーディング配列が実際に発現しようとそうでなかろうと発現ベクターが宿主細胞によって収容されることを意味する。
【0069】
勿論、全てのベクターと発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現する上で全て同等に機能を発揮するわけではないことを理解すべきである。同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しで本発明の範囲を逸脱することなく様々ベクター、発現調節配列及び宿主の中から適切な選択が可能である。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその宿主内で複製されなければならないためである。ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。発現調節配列を選定するに当たっても様々な因子を考慮しなければならない。例えば、配列の相対的強度、調節可能性及び本発明のＤＮＡ配列との相溶性など、特に、可能性ある二次構造と関連して考慮する必要がある。単細胞宿主は、選ばれたベクター、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、分泌特性、タンパク質を正確にフォルディングさせ得る能力、培養及び発酵要件、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物を宿主から精製することの容易性などの因子を考慮して選ばれる必要がある。これらの変数の範囲内で、当業者は本発明のＤＮＡ配列を発酵又は大規模の動物培養において発現させ得る各種ベクター／発現調節配列／宿主組合せを選定することができる。発現クローニングによって本発明に係るタンパク質のｃＤＮＡをクローニングしようとする時のスクリーニング法として、バインディング法（ｂｉｎｄｉｎｇ）、パンニング法（ｐａｎｎｉｎｇ）、フィルムエマルジョン法（ｆｉｌｍ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）などが適用され得る。
【0070】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0071】
特に、下記実施例では、コリネバクテリウムグルタミクムを宿主微生物として用いたが、他の大腸菌や、バクテリア、酵母及びかびを使用してもよいことは当業者にとって自明な事項であろう。また、下記実施例では導入対象遺伝子として特定菌株由来の遺伝子だけを例示したが、導入される宿主細胞で発現して同一活性を示すものであれば制限がないということは当業者にとって明らかであろう。
【0072】
実施例１：グリセロールを単一炭素源にして成長可能な組換えコリネバクテリウムグルタミクムの製造
【0073】
１－１：グリセロール分解代謝回路の構築のためのｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクター作製
【0074】
コリネバクテリウムグルタミクムはグリセロールを単一炭素源として用いて細胞成長できないものとして知られている。したがって、グリセロール分解代謝回路を構築するためにまず、大腸菌Ｗ３１１０由来のグリセロール分解代謝回路を担当する酵素をコードする遺伝子を、コリネバクテリウムグルタミクムシャトルベクターであるｐＣＥＳ２０８ｓ－Ｈ３６－Ｓ３を用いて発現させた。
【0075】
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロールファシリテーターとグリセロールキナーゼオペロン酵素をコードするｇｌｐＦＫ遺伝子切片を得、配列番号３及び４のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロール―３－リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｌｐＤ遺伝子切片を得た。前記ｇｌｐＦＫ遺伝子切片（配列番号１９）と前記ｇｌｐＤ遺伝子切片（配列番号２０）を接合させるために配列番号１及び４のプライマーでオーバーラッピングＰＣＲを行ってｇｌｐＦＫＤ遺伝子切片を作製した。ｐＣＥＳ２０８ｓ－Ｈ３６－Ｓ３ベクター（ｐＣＥＳ２０８－Ｈ３６ベクター（大韓民国特許公開第１０－２０１３－００２２６９１号又はＹｉｍ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：２９５９，２０１３）のＫｍ抗生剤をスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）抗生剤に置換したベクター、配列番号２１）を線形化させるために配列番号５及び６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、また、前記製造されたｇｌｐＦＫＤ遺伝子切片とギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）方法を用いてｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターを作製した（図２）。
【0076】
【表1】
【0077】
１－２：組換えコリネバクテリウムグルタミクムの作製及びグリセロール分解による細菌成長の向上
【0078】
野生型コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２菌株に、１－１で作製したｐＣＳｇｌｐＦＫＤベクターを導入して、ｇｌｐＦＫＤ遺伝子が導入された組換え菌株ライブラリーを作製し、またグリセロールを炭素源とし、グリセロール分解による細胞成長を確認するためにフラスコ培養を行った。
【0079】
まず、前記ｇｌｐＦＫＤ遺伝子が導入された組換え菌株ライブラリーを１０ｍＬのＢＨＩＳ培地（３７ｇ／Ｌブレインハートインフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ；ＢＨＩ）、９１ｇ／Ｌソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ））が含まれたテストチューブに接種して３０℃で１６時間前培養させた後、前培養した培養液１ｍＬを２５０ｍＬバッフルフラスコ（Ｂａｆｆｌｅ ｆｌａｓｋ）で２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地（表２）に接種して培養した。培地の初期グリセロール濃度は１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び４０ｇ／Ｌに設定し、３倍数フラスコ培養を４８時間行った。
【0080】
その結果、図３に示すように、組換え菌株ライブラリーの全ての菌株が非常に長い誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）を有しており、２０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度下に培養された菌株のうち、最も早い細胞成長を示すＷＳＧ２０１菌株を選別した。該選別されたＷＳＧ２０１菌株のグリセロール取り込み率を高めるために、ＡＬＥ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を行った。
【0081】
ＡＬＥは、図４に示すように、前培養した培養液２５０μＬを、２５０ｍＬフラスコで２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に接種して培養した。ＡＬＥは２０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度から始めて合計８つのジェネレーション（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を行ったが、５番目のジェネレーションから４０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度を使用した。
【0082】
その結果、図５に示すように、グリセロール含有培地で培養時に非常に長かった菌株の誘導期が大きく減少し、細胞成長も増加することが確認できた。すなわち、このような結果は、ＡＬＥにより、前記形質転換された組換え菌株が４０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度下に誘導期が大きく減少し、細胞成長が非常に向上したということがわかる。
【0083】
【表2】
【0084】
実施例２：組換えコリネバクテリウムグルタミクムにおいてグリセロールを単一炭素源として用いる時に１，３－ＰＤＯ生産確認及び生産最適化
【0085】
２－１：１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築のためのｐＥＫ－ｄｇｙＥ、ｐＥＫ－ｄｇｙＫ、ｐＥＫ－ｄｇｄｋ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙｋ、ｐＥＫ－ｐｄｕｄｋベクターの作製
【0086】
実施例１－２においてグリセロールを単一炭素源として用いて細胞成長が確認された組換えコリネバクテリウムグルタミクムに１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路を構築するために、コリネバクテリウムグルタミクムのｐＥＫＥｘ１シャトルベクター（Ｅｉｋｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０２：９３，１９９１、配列番号２２）を用いてクレブシエラニュモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭＺ２０２６（ＫＣＴＣ４９５２）と大腸菌Ｗ３１１０由来の外来酵素を発現させた。
【0087】
まず、クレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８のプライマーでＰＣＲを行って、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールリアクティバーゼをコードするｄｈａＢ１２３４／ｇｄｒＡＢ遺伝子クラスター（ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ）切片を得た。また、クレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０のプライマーでＰＣＲを行って、他のグリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールリアクティバーゼをコードするｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子クラスター切片を得た。前記得られたｄｈａＢ１２３４／ｇｄｒＡＢ遺伝子切片及びｐｄｕＣＤＥＧＨ遺伝子切片をシャトルベクターｐＥＫＥｘ１ベクターに接合させるために制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで処理した後、ギブソンアセンブリで接合させてｐＥＫ－ｄｇベクター（図６）及びｐＥＫ－ｐｄｕベクター（図７）をそれぞれ作製した。
【0088】
ｐＴａｃ１５ｋｙｑｈＤ組換えベクター（ｐＴａｃ１５ｋベクター（ｐ１５Ａ ｏｒｉｇｉｎ，ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＫｍＲ）にＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０由来ｙｑｈＤが挿入されている組換えベクター、配列番号２３）を鋳型とし、配列番号１１及び１２のプライマーでＰＣＲを行って１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子切片を得、クレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１３のプライマー、配列番号１１及び１４のプライマーでそれぞれＰＣＲを行って、他の１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子及びｄｈａＴ遺伝子切片をそれぞれ得た。
【0089】
前記得られた遺伝子切片をそれぞれｐＥＫ－ｄｇベクターに接合させるために制限酵素ＳｔｕＩを処理し、ギブソンアセンブリで接合させて、ｐＥＫ－ｄｇｙＥベクター（図８）、ｐＥＫ－ｄｇｙＫベクター（図９）、ｐＥＫ－ｄｇｄＫベクター（図１０）をそれぞれ作製した。
【0090】
前記ｐＴａｃ１５ｋｙｑｈＤ組換えベクターを鋳型とし、配列番号１５及び１６のプライマーでＰＣＲを行って、１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子切片を得、クレブシエラニュモニエＤＳＭＺ２０２６菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１７のプライマー、配列番号１５及び１８のプライマーでそれぞれＰＣＲを行って、他の１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼをコードするｙｑｈＤとｄｈａＴ遺伝子切片をそれぞれ得た。
【0091】
前記得られた遺伝子切片をそれぞれｐＥＫ－ｐｄｕベクターに接合させるために制限酵素ＤｒａＩを処理し、ギブソンアセンブリで接合させて、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＥベクター（図１１）、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＫベクター（図１２）及びｐＥＫ－ｐｄｕｄＫベクター（図１３）をそれぞれ作製した。
【0092】
【表3】
【0093】
２－２：グリセロールから１，３－ＰＤＯを生産する変異微生物の作製
【0094】
実施例２－１で作製された総６種の組換えベクターｐＥＫ－ｄｇｙＥ、ｐＥＫ－ｄｇｙＫ、ｐＥＫ－ｄｇｄｋ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＥ、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＫ及びｐＥＫ－ｐｄｕｄＫを、実施例１－２で確保した（ＡＬＥにより４０ｇ／Ｌの初期グリセロール濃度下に誘導期が大きく減少し、細胞成長が向上した）組換え菌株に導入した後、２５μｇ／Ｌカナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が添加されたＢＨＩＳ平板培地（３７ｇ／Ｌブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）、９１ｇ／Ｌソルビトール、１５ｇ／Ｌ寒天）で選別した。
【0095】
前記選別された６種の組換え菌株を１０ｍＬのＢＨＩＳ培地（３７ｇ／Ｌブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）、９１ｇ／Ｌソルビトール）が含まれたテストチューブに接種して３０℃で１６時間前培養した後、前培養した培養液１ｍＬを２５０ｍＬバッフルフラスコに２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に接種して培養した。初期グリセロール濃度は４０ｇ／Ｌに設定し、培地に酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、３倍数フラスコ培養を４８時間行った。
【0096】
その結果、図１４に示すように、ｐＥＫ－ｐｄｕｙＥベクターを導入した組換え菌株がグリセロールを単一炭素源として用いて最も高い１，３－ＰＤＯを生産することを確認し、該菌株をＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１と命名した。
【0097】
２－３：１，３－ＰＤＯ増産のためのフラスコ培養条件の最適化
【0098】
実施例２－２においてグリセロールを単一炭素源として用いる時に細胞成長と共に１，３－ＰＤＯ生産能を確認した後、１，３－ＰＤＯ生産を向上させるためにフラスコ培養条件を最適化した。
【0099】
１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路に関与するグリセロールデヒドラターゼと１，３－ＰＤＯオキシドレダクターゼの活性化濃度が酸素濃度に敏感（反比例関係）であると知られており、よって、フラスコ種類及びフラスコを閉じる栓の種類によってエアレーション条件に変化を与えてフラスコ培養を行った。
【0100】
まず、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株を１０ｍＬのＢＨＩＳ培地が含まれているテストチューブに接種して３０℃で１６時間前培養を行った後、前培養した培養液１ｍＬを２５０ｍＬバッフルフラスコ又は２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）で２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に接種して培養した。初期グリセロール濃度は４０ｇ／Ｌに設定し、培地に酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、３倍数フラスコ培養を４８時間行った。この時、フラスコ種類としてバッフルフラスコ及びエアレーションが相対的に低いエルレンマイヤーフラスコを選択し、栓としては綿栓及びエアレーションが相対的に低いシリコン栓（ＳｉｌｉＳｔｏｐｐｅｒ）を選択した。
【0101】
その結果、図１５に示すように、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株をエルレンマイヤーフラスコ及び綿栓を使用した時（やや微好気性条件）に最も多量の１，３－ＰＤＯが生産されることを確認した。このような結果は、１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路に関与する２つの酵素がエアレーション条件に影響を受け、最適化されたエアレーション条件で１，３－ＰＤＯ生産が増加することを示す。
【0102】
２－４：流加式発酵培養を用いた１，３－ＰＤＯを生産する変異微生物
【0103】
実施例２－３で確立されたフラスコ種類及びエアレーション条件でＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の１，３－ＰＤＯ生産能を調べるために流加式培養を行った。
【0104】
まず、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株をカナマイシン及びスペクチノマイシンが添加されたＢＨＩＳ平板培地（３７ｇ／Ｌブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）、９１ｇ／Ｌソルビトール、１５ｇ／Ｌ寒天）に塗抹して３０℃で４８時間培養し、形成されたコロニーを実施例２－３で選別した２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに綿栓を使用して５０ｍＬのＢＨＩＳ培地に接種した後、１６時間３０℃で培養した。前培養液は４個の２５０ｍＬバッフルフラスコ（発酵器シード）でそれぞれ５０ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に（培養液開始ＯＤ６００＝０．１）接種し、２００ｒｐｍの振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に３０℃で２４時間培養した。この時、ＣＧＸＩＩ培地に初期グリセロール濃度は４０ｇ／Ｌに設定し、酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、ＭＯＰＳは除外した。次に、総２００ｍＬの前培養液は１．８ＬのＣＧＸＩＩ発酵培地（総体積６Ｌ発酵器）に接種し（開始ＯＤ６００＝３．０～４．０）、開始グリセロールは４０ｇ／Ｌを添加し、酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、ＭＯＰＳは除外した。また、ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、チアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）、プロトカテク酸（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ ａｃｉｄ）、カナマイシン、スペクチノマイシンはそれぞれ濾過後に添加した。また、１ｍＭのＩＰＴＧをバッチ期間（ｂａｔｃｈ ｐｅｒｉｏｄ）が終わって最初フィーディング時に添加した。
【0105】
流加式発酵培養時にアンモニア水（２８％、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてｐＨ７．０に維持し、温度及び撹拌はＰ－Ｉ－Ｄモード（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ－ｉｎｔｅｇｒａｌ－ｄｅｒｉｖａｉｖｅ）でそれぞれ３０℃及び６００ｒｐｍに維持させた。エアレーション速度（Ａｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）は０．２５ｖｖｍを維持し、培養時に発生する泡はａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。フィーディング溶液の組成は８００ｇ／Ｌグリセロールであり、残余グリセロール濃度が１０ｇ／Ｌに減少する時に１００ｍＬを添加した。
【0106】
その結果、図１６に示すように、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株において流加式発酵培養時にグリセロールを単一炭素源として用いて約４７．３ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯが生産されることを確認した。したがって、グリセロール代謝分解回路及び１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路の構築を用いて、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株が細胞成長と共に１，３－ＰＤＯを生産できることを確認した。
【0107】
実施例３：組換えコリネバクテリウムグルタミクムにおいてグリセロール及びブドウ糖を炭素源として用いる時に１，３－ＰＤＯ増産
【0108】
３－１：組換えコリネバクテリウムグルタミクムにおいてグリセロールとブドウ糖の比率最適化を用いた１，３－ＰＤＯ増産
【0109】
実施例２－４に実施した流加式発酵培養結果のように、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株はグリセロールを単一炭素源として用いて細胞成長と共に高い量の１，３－ＰＤＯを生産した。しかし、前記条件では１，３－ＰＤＯと類似な量の３－ＨＰを副産物として生産することが見られた。
【0110】
１，３－ＰＤＯ生合成代謝回路及び３－ＨＰ生合成代謝回路に関与する酵素が補助因子として使用する酸化還元バランス（ｒｅｄｏｘ ｂａｌａｎｃｅ）を考慮するとき、１，３－ＰＤＯ生産に必要な還元力（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ）であるＮＡＤＰＨを供給するために、コリネバクテリウムグルタミクム内に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素が３－ＨＰ生合成代謝回路を活性化させたと判断した（図１）。これは、グリセロールを単一炭素源として用いる時にペントースリン酸（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）代謝回路を使用できず、不足したＮＡＤＰＨを供給するために３－ＨＰ生合成代謝回路がより活性化されたものと判断した（図１）。
【0111】
コリネバクテリウムグルタミクムは、ペントースリン酸代謝回路を通じて約７０％のＮＡＤＰＨを供給すると知られており、よって、ブドウ糖を添加する場合、１，３－ＰＤＯの生産が増加するかどうかを調べるために、フラスコ培養比較実験を行った。
【0112】
まず、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株を１０ｍＬのＢＨＩＳ培地が含まれたチューブに接種して３０℃で１６時間前培養した後、前培養した培養液１ｍＬを２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに２５ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に接種して培養した。初期ブドウ糖とグリセロールの比率は重量比で１：１、１：３、１：９及び１：１９添加し、培地に酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、３倍数フラスコ培養を４８時間行った。
【0113】
その結果、図１７に示すように、ブドウ糖とグリセロールを重量比１：３で使用した時、菌株の１，３－ＰＤＯ生産が最高を示し、３－ＨＰは生産されないことを確認した。また、ブドウ糖に対するグリセロール比率が増加するほど（ブドウ糖量が減少するほど）３－ＨＰ生産が増加することを確認し、逆に、減少するほど（ブドウ糖量が増加するほど）３－ＨＰ生産が減少することを確認した。すなわち、このような結果は、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株がグリセロールを単一炭素源として使用するとき、１，３－ＰＤＯを生産するのに必要な還元力を３－ＨＰ生合成代謝回路を活性化させつつ提供されることを示し、一定のブドウ糖とグリセロールの比率が１，３－ＰＤＯ増産に効率的であることを示す。
【0114】
３－２：ブドウ糖とグリセロールを１：３で添加時に流加式発酵培養を用いた１，３－ＰＤＯを生産する変異微生物
【0115】
実施例３－１で選別したブドウ糖とグリセロールの重量比を適用して、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の１，３－ＰＤＯ生産能を調べるために流加式培養を行った。
【0116】
まず、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株をカナマイシン及びスペクチノマイシンが添加されたＢＨＩＳ平板培地に塗抹して３０℃で４８時間培養して形成されたコロニーを、実施例２－３で選別した２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに綿栓を用いて５０ｍＬのＢＨＩＳ培地に接種した後、１６時間３０℃で培養した。前培養液は、４個の２５０ｍＬバッフルフラスコ（発酵器シード）でそれぞれ５０ｍＬのＣＧＸＩＩ培地に（培養液開始ＯＤ６００＝０．１）接種し、２００ｒｐｍの振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に３０℃で２４時間培養した。この時、ＣＧＸＩＩ培地の初期グリセロール濃度は４０ｇ／Ｌに設定し、酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、ＭＯＰＳは除外した。次に、総２００ｍＬの前培養液は１．８ＬのＣＧＸＩＩ発酵培地（総体積６Ｌ発酵器）に接種し（開始ＯＤ６００＝３．０～４．０）、開始グリセロールは４０ｇ／Ｌを添加し、酵母エキス１０ｇ／Ｌを追加し、ＭＯＰＳは除外した。また、ＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、ビオチン、チアミン、プロトカテク酸、カナマイシン、スペクチノマイシンはそれぞれ濾過した後に添加した。また、１ｍＭのＩＰＴＧをバッチ期間が終わって最初のフィーディング時に添加した。
【0117】
流加式発酵培養時にアンモニア水（２８％、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてｐＨを７．０に維持し、温度及び撹拌はＰ－Ｉ－Ｄモード（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ－ｉｎｔｅｇｒａｌ－ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）でそれぞれ３０℃及び６００ｒｐｍに維持した。エアレーション速度は０．２５ｖｖｍを維持し、培養時に発生する泡はａｎｔｉｆｏａｍ ２０４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。フィーディング溶液は８００ｇ／Ｌグリセロール溶液及び８００ｇ／Ｌブドウ糖溶液を準備した後、残余グリセロール濃度が１０ｇ／Ｌに減少する時にそれぞれ５０ｍＬずつ添加した。
【0118】
その結果、図１８に示すように、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株において流加式発酵培養時にブドウ糖とグリセロールを重量比で１：３添加し、約６０．１ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯが生産されることが確認できた。すなわち、ブドウ糖とグリセロールを重量比で１：３添加した時、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株が細胞成長と共に、より効率よく１，３－ＰＤＯを生産することを確認した。
【0119】
３－３：ブドウ糖とグリセロール重量比１：２添加時に流加式発酵培養を用いた１，３－ＰＤＯを生産する変異微生物
【0120】
実施例３－２においてブドウ糖とグリセロールを重量比で１：３添加した後、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の１，３－ＰＤＯ生産能を、流加式発酵培養から確認した。しかし、依然として多量の３－ＨＰが副産物として生産されることを確認し、実施例３－１に示したブドウ糖量が増加するにつれて３－ＨＰが減少した現象を適用させるためにブドウ糖とグリセロールを重量比１：２で添加してＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株の流加式発酵培養を行った。
【0121】
流加式培養は実施例３－２と同一に行い、フィーディング（Ｆｅｅｄｉｎｇ）溶液は８００ｇ／Ｌグリセロール溶液と８００ｇ／Ｌブドウ糖溶液、２００ｇ／ＬのＭｇＳＯ４－７Ｈ２Ｏ、２００Ｘ ＴＭＳ溶液を準備した後、残余グリセロール濃度が１０ｇ／Ｌに減少する時にそれぞれ５０ｍＬ、１００ｍＬ、５ｍＬ及び５ｍＬ添加した。このとき、使用したＴＭＳ溶液組成は次の通りである。
【0122】
【表4】
【0123】
その結果、図１９に示すように、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株において流加式発酵培養時に、ブドウ糖とグリセロールを重量比１：２で添加して約７７．５ｇ／Ｌの１，３－ＰＤＯが生産されることを確認した。また、３－ＨＰは約７．２ｇ／Ｌと大きく減少したことを確認した。すなわち、ブドウ糖とグリセロールを重量比１：２で添加した時、ＭＢＥＬ－ＨＣＣ－Ｃ－１３ＰＤＯ１菌株が細胞成長と共に、より効率よく１，３－ＰＤＯを生産することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0124】
本発明によれば、低価の原料であるグリセロールを単一炭素源として用いて、１，３－ＰＤＯ生産能を有する変異微生物を成長させると同時に、１，３－ＰＤＯを生産することができ、経済的に１，３－ＰＤＯを生産するのに有用である。
【0125】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述してきたところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は、明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】