7129715 操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-25

(45)【発行日】2022-09-02

(54)【発明の名称】操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/60 20060101AFI20220826BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220826BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20220826BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220826BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220826BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220826BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220826BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220826BHJP

   A61K 38/51 20060101ALI20220826BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20220826BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220826BHJP

【ＦＩ】

C12N15/60 ZNA

C12N15/63 Z

C12N9/88

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

A61K38/51

A61P3/00

A61P43/00 111

【請求項の数】 26

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020138453

(22)【出願日】2020-08-19

(62)【分割の表示】P 2018149210の分割

【原出願日】2014-04-17

(65)【公開番号】P2020185016

(43)【公開日】2020-11-19

【審査請求日】2020-09-17

(31)【優先権主張番号】61/813,586

(32)【優先日】2013-04-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/897,932

(32)【優先日】2013-10-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502427921

【氏名又は名称】コデクシス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ジャルト ダブリュー． ユイスマン

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス ジェイ． アガード

(72)【発明者】

【氏名】ベンジャミン ミジツ

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン ブルーム

(72)【発明者】

【氏名】シユン ザン

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５２９８３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１３０２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Mol. Genet. Metab.，2010年01月，Vol.99, No.1，pp.4-9

【文献】Biochemistry，2007年01月30日，Vol.46, No.4，pp.1004-1012

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

参照配列の配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたポリペプチドであって、該アミノ酸配列が、位置２９０においてグリシンを含み、該操作されたポリペプチドが、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有し、該アミノ酸配列が、以下：
ａ）Ａ２５６Ｇ／Ｎ２９０Ｇ／Ｐ４０４Ａ／Ｌ４０７Ｖ／Ｎ４７４Ｑ／Ｋ５２２Ｆ、
ｂ）Ａ３９Ｖ／Ａ９１Ｖ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ１８０Ａ／Ｋ１９５Ｅ／Ａ２５６Ｇ／Ｎ２９０Ｇ／Ｓ３９９Ｎ／Ｙ４５９Ｆ／Ｔ４６３Ｎ、
ｃ）Ａ９１Ｖ／Ｙ１５８Ｈ／Ｔ２４３Ｉ／Ａ２５６Ｇ／Ｎ２９０Ｇ／Ｓ３９９Ｎ／Ｌ４０７Ｖ／Ｙ４５９Ｆ／Ｔ４６３Ｎ／Ｎ４７４Ｑ／Ｋ５２２Ｎ／Ｔ５２４Ｓ、
ｄ）Ａ３９Ｖ／Ａ９１Ｖ／Ａ２５６Ｇ／Ｎ２９０Ｇ／Ａ３９４Ｖ／Ｓ３９９Ｎ／Ｐ４０４Ａ／Ｌ４０７Ｖ／Ｋ５２２Ｙ／Ｔ５２４Ｓ、および
ｅ）Ａ３９Ｖ／Ａ９１Ｖ／Ａ２５６Ｇ／Ｎ２９０Ｇ／Ｓ３９９Ｎ／Ｐ４０４Ａ／Ｌ４０７Ｖ／Ｋ５２２Ｙ
から選択される置換を含み、該アミノ酸配列における該位置は、配列番号４を参照している、操作されたポリペプチド。

【請求項2】

前記操作されたポリペプチドが、参照配列の配列番号４と比較して、タンパク質分解に対する低下した感受性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、低下した免疫原性、またはそれらの組み合わせから選択される改善された特性を示す、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項3】

前記改善された特性が、タンパク質分解に対する低下した感受性および／または酸性ｐＨに対する増加した耐性から選択される、請求項２に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項4】

前記操作されたポリペプチドが、タンパク質分解に対して抵抗性であり、酸安定的であり、および／または脱免疫化されている、請求項１に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項5】

前記操作されたポリペプチドが、少なくとも１種の消化管酵素によるタンパク質分解に抵抗性であり、前記操作されたポリペプチドが、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼおよび／またはエラスターゼによるタンパク質分解に抵抗性である、請求項４に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項6】

前記操作されたポリペプチドが脱免疫化されている、請求項４に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項7】

前記ポリペプチドが精製されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチド。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む組成物。

【請求項9】

前記組成物が医薬組成物である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が、フェニルケトン尿症の処置に適している、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記組成物がヒトへの経口投与に適している、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記組成物が、丸剤、錠剤、カプセル、ジェルキャップ、液体またはエマルションの形態である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記丸剤、錠剤、カプセル、またはジェルキャップが、腸溶コーティングをさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記組成物が、ヒトへの非経口的注射に適している、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記組成物が、少なくとも１種の追加的な治療上有効な化合物と同時投与されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項16】

ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの配列が、請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチドの配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項18】

前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド。

【請求項19】

請求項１６～１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチドと、少なくとも１種の制御配列とを含む発現ベクター。

【請求項20】

前記制御配列が、プロモーターである、請求項１９に記載の発現ベクター。

【請求項21】

前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項２０に記載の発現ベクター。

【請求項22】

請求項１６～１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド、または請求項１９～２１のいずれか一項に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。

【請求項23】

前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２２に記載の宿主細胞。

【請求項24】

宿主細胞において操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１種の操作されたＰＡＬポリペプチドが産生されるように適した培養条件下で、請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチド、または請求項１６～１８のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド、または請求項１９～２１のいずれか一項に記載の少なくとも１種のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法。

【請求項25】

培養物および／または宿主細胞から、少なくとも１種の操作されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

産生された前記少なくとも１種の操作されたポリペプチドを精製するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１３年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／８１３，５８６号、および２０１３年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９７，９３２号に基づく優先権を主張し、その両方は、すべての目的についてその全体が参照によって組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された「配列表」、表またはコンピュータプログラム表付録の参照
２０１４年４月１５日に作成された、１２７，４１２バイト、マシンフォーマットＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ－ウィンドウズ（登録商標）オペレーティングシステムの、ファイルＣＸ７－１３１ＷＯ２＿ＳＴ２５．ＴＸＴにおいて書き出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強された触媒活性と共に、タンパク質分解に対する低下した感受性および酸性ｐＨレベルに対する増加した耐性をもたらすよう最適化される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、脱免疫化（deimmunized）されて
いる。本発明は、治療および産業目的のための、操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。

【背景技術】

【0003】

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と共に、芳香族アミノ酸リアーゼファミリーのメンバーである（ＥＣ４．３．１．２３～１．２５および４．３．１．３）。より詳細には、ＰＡＬ活性を有する酵素（ＥＣ４．３．１．２３～１．２５および以前に分類されたＥＣ４．３．１．５）は、Ｌ－フェニルアラニンの非酸化的脱アミノ化を触媒して（Ｅ）－桂皮酸とする。ＰＡＬは、植物に広く分布した非哺乳動物酵素であり、真菌および限られた数の細菌においても同定された。ＰＡＬ酵素は、代謝性障害、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の処置のための治療タンパク質として使用することができる。ＰＫＵは、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、または補助因子テトラヒドロビオプテリンの合成もしくは再利用に関与する酵素のうち１種もしくは複数が、相当する遺伝子のうち１種における突然変異のため非機能性となった常染色体代謝性遺伝障害である。このような機能性の欠如は、血流における高レベルのフェニルアラニンをもたらす。フェニルアラニンは、フェニルピルビン酸塩（フェニルケトン）および他の誘導体に変換される。ヒトにおいて、ＰＫＵが早期に処置されないと、高レベルのフェニルアラニンおよびその分解産物の一部が、知的障害、小頭症および発作を含む顕著な医学的問題を引き起こし得る。多数の研究が、酵素置換によるＰＫＵの処置におけるＰＡＬの使用に着目してきた（Ambrusら、Science ２０１巻：８３７～８３９頁［１９７８年］；Bourgetら、Appl. Biochem. Biotechnol.、１０巻：５７～５９頁［１９８４年］；およびSarkissianら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９６巻：２３３９～２３４４頁［１９９９年］）。

【0004】

血流中のフェニルアラニンを解毒する一方法は、注射用組換えＰＡＬおよびペグ化によって修飾されたＰＡＬバリアント（ＰＥＧ－ＰＡＬ）の使用である。ペグ化は、酵素半減期を改善し、対象の抗原応答を低下させることが示されてきた（例えば、ＷＯ２００８／１５３７７６、ＷＯ２０１１／０９７３３５および米国特許第７，５３１，３４１号を参照）。ＰＥＧ－ＰＡＬ組成物において有用なＰＡＬバリアントは、野生型Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐＰＡＬ）；Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（ＡｖＰＡＬ）およびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＲｔＰＡＬ）のバリアントとして記載されてきた。特に、位置６４、３１８、５０３および５６５におけるシステイン残基がセリンに置換された、野生型ＡｖＰＡＬのバリアントが記載されてきた（例えば、米国特許第７，７９０，４３３号；同第７，５６０，２６３号；および同第７，５３７，９２３号を参照）。

【0005】

ＰＫＵ対象におけるＬ－フェニルアラニンの血漿中濃度を低下させる手段としてのＰＡＬ投与の代替的経路は、経口製剤等、非観血的製剤である（Sarkissianら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ９６巻：２３３９～２３４４頁［１９９９年］）。ＰＡＬの経口送達の重要な利点は、酵素が免疫系へと曝露されるのを低下し、これにより、注射用ＰＥＧ－ＰＡＬに観察される免疫応答を最小化することである。しかし、ＰＡＬの経口製剤に関する主な制限は、胃および腸管腔における酵素活性の損失である。有効かつ機能的となるために、ＰＡＬは、タンパク質性の食物を正常に分解してオリゴペプチドおよびアミノ酸とする、酸性ｐＨならびにトリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼおよびペプシン等のプロテアーゼによる分解に抵抗しなければならない。いくつかの以前の研究（Sarkissian、上記参照）において、一部にはプロテアーゼによる酵素分解が原因で、また一部にはｐＨ７．０における相対的に低い特異的活性が原因で、ＰＡＬの経口投与の有意な効果を達成するためには、大量の酵素が必要とされた。消化によるＰＡＬ分解を抑制するために様々な手段が模索された（Kimら、Molec. Therap.、１０巻：２２０～２２４頁［２００４年］；および Shahら、Int. J. Pharmaceut.、３５６巻：６１～６８頁
［２００８年］）。

【0006】

消化管の過酷な条件下においてＰＡＬの有効性を増加させるための一アプローチは、固有の過酷な条件に耐容性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドを提供することである。Ｋａｎｇらは、ＡｖＰＡＬのキモトリプシン切断部位の部位特異的突然変異誘発および表面リシンのペグ化を使用して、タンパク質分解不活性化を低下させた（Kangら、Mol. Gen.
Metabol.、９９巻：４～９頁［２０１０年］を参照）。これらの研究において、１０個の切断部位を特異的に突然変異させ、これらの得られた突然変異体のうち２個（Ｆ１８ＡおよびＲ９４Ｇ）を除く全てが、本来の酵素活性の５０％超を失った。これらの突然変異体のうち、活性増加を示したものはなく、Ｆ１８Ａ突然変異体は、トリプシン抵抗性の僅かな増加を示した（Kangら、上記参照）。ＰＡＬによるさらに別の研究は、有効ではあったが、一般に、より長寿命の酵素をもたらさなかった。したがって、以前に記載されたＰＡＬ突然変異体およびその誘導体の経口投与は、有効なＰＫＵ処置をもたらさない。

【0007】

ＰＡＬの様々な製剤により為された進歩にもかかわらず、依然として、経口投与のために改善された特性を有するＰＡＬポリペプチドの必要がある。このような改善された特性は、より優れた半減期、増加した触媒活性、消化路における条件に対する改善された安定性および低下した凝集を限定することなく含む。

【0008】

治療適用に加えて、ＰＡＬ酵素は、Ｌ－フェニルアラニンおよび他の置換されたＬ－フェニルアラニン誘導体の産業的合成において使用することもできる。続いて、このような誘導体は、医薬品前駆物質として使用することができる（Glogeら、Chem.、６巻：３３８６～３３９０頁［２０００年］；Bartschら、Prot. Eng. Des. Sel.、２３巻：９２９～９３３頁［２０１０年］；およびTurner、Curr. Opin. Chem. Biol.、２３４～２４０頁［２０１１年］）。
ＰＡＬ酵素は、農業適用において使用することもできる。ＰＡＬは、植物、真菌および細菌におけるフェニルプロパノイド（フラボノイドおよびリグニン等）の生合成において顕著な役割を果たし、防御関連の酵素として作用することができる（Bateら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１巻：７６０８～７６１２頁［１９９４年］）。ＰＡＬ活性を有する組換えポリペプチドを使用することによるＰＡＬ活性のモジュレーションは、有効な除草剤をもたらす可能性がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】国際公開第２００８／１５３７７６号

【文献】国際公開第２０１１／０９７３３５号

【文献】米国特許第７，５３１，３４１号明細書

【文献】米国特許第７，７９０，４３３号明細書

【文献】米国特許第７，５６０，２６３号明細書

【文献】米国特許第７，５３７，９２３号明細書

【非特許文献】

【0010】

【文献】Ambrusら、Science ２０１巻：８３７～８３９頁［１９７８年］

【文献】Bourgetら、Appl. Biochem. Biotechnol.、１０巻：５７～５９頁［１９８４年］

【文献】Sarkissianら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９６巻：２３３９～２３４４頁［１９９９年］

【文献】Kimら、Molec. Therap.、１０巻：２２０～２２４頁［２００４年］

【文献】Shahら、Int. J. Pharmaceut.、３５６巻：６１～６８頁［２００８年］

【文献】Kangら、Mol. Gen. Metabol.、９９巻：４～９頁［２０１０年］

【文献】Glogeら、Chem.、６巻：３３８６～３３９０頁［２０００年］

【文献】Bartschら、Prot. Eng. Des. Sel.、２３巻：９２９～９３３頁［２０１０年］

【文献】Turner、Curr. Opin. Chem. Biol.、２３４～２４０頁［２０１１年］

【文献】Bateら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１巻：７６０８～７６１２頁［１９９４年］

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強された触媒活性と共に、タンパク質分解に対する低下した感受性および酸性ｐＨレベルに対する増加した耐性をもたらすよう最適化される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、脱免疫化されている。本発明は、また、治療および産業目的のための、操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用に関する。一部の実施形態において、本発明は、酸性ｐＨに対する増加した耐性および／またはタンパク質分解に対する低下した感受性等、改善された特性を有する、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドならびにその生物学的活性を有する断片および類似体を対象とする。

【0012】

本発明は、基本的に同じ条件下で野生型ＰＡＬ酵素または参照ＰＡＬポリペプチドと比較した場合に改善された特性を有する、操作されたＰＡＬポリペプチドならびにその生物学的活性を有する断片および類似体を対象とする。本発明は、治療的および／または産業的組成物ならびに治療および／または産業目的で斯かる組成物を使用する方法において、操作されたＰＡＬポリペプチドならびにその生物学的活性を有する断片および類似体を使用する方法をさらに対象とする。

【0013】

第１の態様において、本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドであって、基本的に同じ条件下で測定された参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）もしくはｉｖ）のいずれかの組合せの群から選択される改善された特性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。一部の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、２種の改善された特性を有する。他の特異的な実施形態において、改善された特性は、タンパク質分解に対する低下した感受性であり、さらに他の特異的な実施形態において、改善された特性は、酸性ｐＨに対する増加した耐性である。

【0014】

第２の態様において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４またはその機能的断片に対し少なくとも８５％のアミノ酸配列の同一性を含むタンパク質を含み、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、位置Ｘ３９；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５２２；Ｘ５２４；およびＸ５２８に相当する位置にアミノ酸残基の差異を含む。

【0015】

第１および第２の態様の一部の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、Ａ３９；Ａ９１；Ｙ１５８；Ｓ１８０；Ｋ１９５；Ｔ２４３；Ｉ２４５；Ａ２５６；Ｌ２５７；Ｎ２７０；Ｎ２９０；Ｈ３０７；Ｅ３０８；Ｉ３２６；Ｌ３４９；Ｌ３６４；Ａ３９４；Ｓ３９９；Ｎ４００；Ｐ４０４；Ｌ４０７；Ｆ４４３；Ｎ４５３；Ｙ４５９；Ｔ４６０；Ｔ４６３；Ｎ４７４；Ｋ５２２；Ｔ５２４；およびＰ５２８に相当する１個または複数のアミノ酸残基位置のアミノ酸残基の差異を少なくとも含む。一部の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む参照ポリペプチドから、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５および少なくとも２０個のアミノ酸残基の差異を含む。

【0016】

第１および第２の態様の他の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも９０％（少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％）のアミノ酸配列の同一性を含む。またさらなる特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも９０％（少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％）のアミノ酸配列の同一性を含み、次の置換Ａ３９Ｖ；Ａ９１Ｖ；Ｙ１５８Ｈ；Ｓ１８０Ａ；Ｋ１９５Ｅ；Ｔ２４３Ｉ／Ｌ；Ｉ２４５Ｌ；Ａ２５６Ｇ；Ｌ２５７Ｗ／Ａ；Ｎ２７０Ｋ；Ｎ２９０Ｇ；Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ；Ｅ３０８Ｑ；Ｉ３２６Ｆ；Ｌ３４９Ｍ；Ｌ３６４Ｑ；Ａ３９４Ｖ；Ｓ３９９Ｎ；Ｎ４００Ｋ；Ｐ４０４Ａ；Ｌ４０７Ｖ；Ｆ４４３Ｈ；Ｎ４５３Ｇ；Ｙ４５９Ｆ；Ｔ４６０Ｇ；Ｔ４６３Ｎ；Ｎ４７４Ｑ；Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ；Ｔ５２４Ｓ；およびＰ５２８Ｌのうち１種または複数を含む。

【0017】

他の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＰＡＬ（ＡＴＣＣ２９４１３；ＮＣＢＩタンパク質参照配列ＹＰ＿３２４４８８．１；配列番号４等）に由来する。

【0018】

第３の態様において、本発明に包含されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0019】

第４の態様において、本発明に包含されるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１、２、３、４、５もしくは６個またはそれを超えるアミノ酸位置に、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異をさらに含む。

【0020】

第５の態様において、本発明は、本明細書に記載されている操作されたＰＡＬポリペプチドのうちいずれか１種をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。

【0021】

第６の態様において、本発明は、本明細書に記載されている操作されたＰＡＬポリペプチドのうちいずれか１種を含む医薬組成物または産業的組成物を提供する。

【0022】

一部の実施形態において、本発明は、ａ）参照配列の配列番号４またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４またはその機能的断片と比較したアミノ酸残基の差異を含み、ｃ）参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）もしくはｉｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、１個または複数のアミノ酸位置は、配列番号４のアミノ酸配列と最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；Ｘ５６４；および／またはこれらの組合せから選択される。一部の追加的な実施形態において、改善された特性は、タンパク質分解に対する低下した感受性および／または酸性ｐＨに対する増加した耐性から選択される。さらに追加的な実施形態において、参照配列は、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓに由来する野生型ＰＡＬである。一部のさらなる実施形態において、配列番号４の参照配列のアミノ酸残基は、Ａ３９；Ｔ５４；Ｇ５９、Ｓ７３；Ａ９１；Ｙ１５８；Ｓ１８０；Ｋ１９５；Ａ１１２；Ｒ１３４；Ｑ２４０；Ｔ２４３；Ｉ２４５；Ａ２５６；Ｌ２５７；Ｎ２７０；Ｎ２９０；Ｙ３０４；Ｒ３０５；Ｈ３０７；Ｅ３０８；Ｉ３２６；Ｌ３４９；Ｄ３５３；Ｌ３６４；Ａ３９４；Ｓ３９９；Ｎ４００；Ｐ４０４；Ｌ４０７；Ｆ４４３；Ｎ４５３；Ｙ４５９；Ｔ４６０；Ｔ４６３；Ｎ４７４；Ｅ５０９；Ｑ５２１；Ｋ５２２；Ｔ５２４；Ｐ５２８；Ｓ５４６；および／またはＰ５６４に相当する。一部の実施形態において、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異は、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、次の置換Ａ３９Ｖ；Ｔ５４Ｋ；Ｇ５９Ｒ；Ｓ７３Ｋ；Ａ１１２Ｃ；Ｒ１３４Ｑ；Ａ９１Ｖ；Ｙ１５８Ｈ；Ｓ１８０Ａ；Ｋ１９５Ｅ；Ｑ２４０Ｒ／Ｗ；Ｔ２４３Ｉ／Ｌ；Ｉ２４５Ｌ；Ａ２５６Ｇ；Ｌ２５７Ｗ／Ａ；Ｎ２７０Ｋ；Ｎ２９０Ｇ；Ｙ３０４Ｈ；Ｒ３０５Ｍ；Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ；Ｅ３０８Ｑ；Ｉ３２６Ｆ；Ｌ３４９Ｍ；Ｄ３５３Ａ／Ｎ；Ｌ３６４Ｑ；Ａ３９４Ｖ；Ｓ３９９Ｎ；Ｎ４００Ｋ；Ｐ４０４Ａ；Ｌ４０７Ｖ；Ｆ４４３Ｈ；Ｎ４５３Ｇ；Ｙ４５９Ｆ；Ｔ４６０Ｇ；Ｔ４６３Ｎ；Ｎ４７４Ｑ；Ｅ５０９Ｌ；Ｑ５２１Ｋ／Ｓ；Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ；Ｔ５２４Ｓ；Ｐ５２８Ｌ；Ｓ５４６Ｒ；およびＰ５６４Ｇ／Ｌ／Ｍのうち１種または複数から選択される。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または約１００％の配列同一性を有する。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。一部の追加的な実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有する。一部の追加的な実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有し；位置Ｈ３０７にアミノ酸残基の差異を有する。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の追加的な実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し；位置Ｈ３０７にアミノ酸残基の差異を有する。一部の追加的な実施形態において、アミノ酸残基の差異は、Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍである。一部のさらなる実施形態において、アミノ酸残基の差異は、Ａ３９；Ａ９１；Ｑ２４０；Ａ２５６；Ｎ２９０；Ｙ３０４；Ｒ３０５；Ｈ３０７；Ｄ３５３；Ａ３９４；Ｓ３９９；Ｐ４０４；Ｌ４０７；Ｑ５２１；Ｋ５２２；およびＴ５２４のうち１種または複数の組合せから選択される。

【0023】

本発明は、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0024】

一部のさらなる実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0025】

本発明は、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し、少なくとも約少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のさらなる実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のさらなる実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0026】

本発明は、配列番号４またはその機能的断片に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、脱免疫化された操作されたポリペプチドも提供する。本発明は、配列番号４またはその機能的断片に対し、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、脱免疫化された操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４またはその機能的断片に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記操作されたポリペプチドは、脱免疫化されている。一部の追加的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、表９－１から９－７のいずれかに提示されているバリアントＰＡＬである。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する、脱免疫化された操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２および／または１４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0027】

本発明は、本明細書に提示されているＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。本発明は、ＰＡＬ活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする、少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含むベクターをさらに提供する。本発明は、本明細書に提示されている、ＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列により形質転換された宿主細胞も提供する。

【0028】

本発明は、宿主細胞において操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、適した培養条件下で、少なくとも１種の操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法をさらに提供する。本発明は、宿主細胞において操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、適した培養条件下で、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法をさらに提供する。一部の実施形態において、本方法は、培養物および／または宿主細胞から操作されたＰＡＬポリペプチドを回収するステップをさらに含む。

【0029】

本発明は、本明細書に提示されている、ＰＡＬ活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である。本発明は、このような組成物の使用をさらに提供する。

【0030】

本発明は、ａ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する参照配列またはその機能的断片に対し、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する参照配列またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、参照配列は、原核生物のＰＡＬであるが、一部の他の実施形態において、参照配列は、真核生物のＰＡＬである。一部の実施形態において、参照配列は、細菌のＰＡＬ（例えば、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのＰＡＬ）であるが、一部の他の実施形態において、これは、ヒトまたは他のＰＡＬである。一部のさらなる実施形態において、参照配列は、野生型配列（例えば、野生型Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのＰＡＬ）であるが、一部の代替的実施形態において、参照配列は、バリアント酵素（例えば、ＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチド）である。

【0031】

一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、ａ）参照配列の配列番号４またはその機能的断片に対し、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号４と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す。

【0032】

一部の追加的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、ａ）参照配列の配列番号４またはその機能的断片に対し、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号４と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す。

【0033】

一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性（ＰＡＬ）を有する操作されたポリペプチドは、次のアミノ酸位置：２０、２４、２７、３９、４３、４５、４７、５４、５８、５９、６２、７０、７３、８０、８２、９１、９４、９８、１０４、１０５、１１０、１１２、１１５、１１７、１１８、１１９、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１８０、１８７、１９１、１９５、１９９、２０５、２０６、２１０、２１２、２１３、２１４、２３２、２４０、２４３、２４５、２４７、２４８、２５０、２５６、２５７、２６６、２７０、２７５、２７８、２７９、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、３０４、３０５、３０７、３０８、３０９、３１９、３２１、３２６、３３１、３３２、３３４、３４９、３５３、３５５、３６４、３６５、３６９、３７０、３７１、３７２、３７４、３７５、３７７、３７８、３７９、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３８９、３９４、３９６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４１７、４１８、４２５、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４３、４４６、４４７、４５３、４５６、４５９、４６０、４６１、４６３、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８２、４８３、５０３、５０７、５０９、５２１、５２２、５２４、５２５、５２８、５３８、５４６、５４７、５５１、５５８、５６０、５６４、５６５および／またはこれらのいずれかの組合せのうち１種または複数に少なくとも１個の置換（複数可）を含み、アミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされている。一部の実施形態において、配列番号４の参照配列のアミノ酸残基は、Ａ３９、Ｔ５４、Ｇ５９、Ｓ７３、Ａ９１、Ｙ１５８、Ｓ１８０、Ｋ１９５、Ａ１１２、Ｒ１３４、Ｑ２４０、Ｔ２４３、Ｉ２４５、Ａ２５６、Ｌ２５７、Ｎ２７０、Ｎ２９０、Ｙ３０４、Ｒ３０５、Ｈ３０７、Ｅ３０８、Ｉ３２６、Ｌ３４９、Ｄ３５３、Ｌ３６４、Ａ３９４、Ｓ３９９、Ｎ４００、Ｐ４０４、Ｌ４０７、Ｆ４４３、Ｎ４５３、Ｙ４５９、Ｔ４６０、Ｔ４６３、Ｎ４７４、Ｅ５０９、Ｑ５２１、Ｋ５２２、Ｔ５２４、Ｐ５２８、Ｓ５４６、および／またはＰ５６４に相当する。一部の追加的な実施形態において、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異は、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、次の置換Ａ３９Ｖ、Ｔ５４Ｋ、Ｇ５９Ｒ、Ｓ７３Ｋ、Ａ１１２Ｃ、Ｒ１３４Ｑ、Ａ９１Ｖ、Ｙ１５８Ｈ、Ｓ１８０Ａ、Ｋ１９５Ｅ、Ｑ２４０Ｒ／Ｗ、Ｔ２４３Ｉ／Ｌ、Ｉ２４５Ｌ、Ａ２５６Ｇ、Ｌ２５７Ｗ／Ａ、Ｎ２７０Ｋ、Ｎ２９０Ｇ、Ｙ３０４Ｈ、Ｒ３０５Ｍ、Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ、Ｅ３０８Ｑ、Ｉ３２６Ｆ、Ｌ３４９Ｍ、Ｄ３５３Ａ／Ｎ、Ｌ３６４Ｑ、Ａ３９４Ｖ、Ｓ３９９Ｎ、Ｎ４００Ｋ、Ｐ４０４Ａ、Ｌ４０７Ｖ、Ｆ４４３Ｈ、Ｎ４５３Ｇ、Ｙ４５９Ｆ、Ｔ４６０Ｇ、Ｔ４６３Ｎ、Ｎ４７４Ｑ、Ｅ５０９Ｌ、Ｑ５２１Ｋ／Ｓ、Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ、Ｔ５２４Ｓ、Ｐ５２８Ｌ、Ｓ５４６Ｒ、およびＰ５６４Ｇ／Ｌ／Ｍのうち１種または複数から選択される。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有し；位置Ｈ３０７にアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、アミノ酸残基の差異は、Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍである。一部のまたさらなる実施形態において、アミノ酸残基の差異は、Ａ３９、Ａ９１、Ｑ２４０、Ａ２５６、Ｎ２９０、Ｙ３０４、Ｒ３０５、Ｈ３０７、Ｄ３５３、Ａ３９４、Ｓ３９９、Ｐ４０４、Ｌ４０７、Ｑ５２１、Ｋ５２２およびＴ５２４のうち１種または複数の組合せから選択される。一部の追加的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性（ＰＡＬ）を有する操作されたポリペプチドの改善された特性は、タンパク質分解に対する低下した感受性および／または酸性ｐＨに対する増加した耐性から選択される。

【0034】

本発明は、ａ）参照配列の配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号１０またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号１０と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0035】

一部の実施形態において、本発明は、ａ）参照配列の配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号１０またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号１０と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0036】

一部の実施形態において、本発明は、ａ）参照配列の配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号１０またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号１０と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0037】

一部の実施形態において、本発明は、参照配列の配列番号１０に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１０と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含み、配列番号１０と比較して、増強された触媒活性、タンパク質分解に対する低下した感受性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、低下した凝集および／または低下した免疫原性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0038】

一部の実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：
I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/ A551D/ C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D; I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N; I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E; I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q; I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q; I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q; I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N; I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q; I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D; I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D;
I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q; I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N;
V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D;
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【0039】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｖ８０Ｉ／Ｒ１３４Ｃ／Ｐ５６４Ｑ；Ｖ１２１Ｃ；Ａ１２３Ｇ；Ａ１２４Ｇ；Ｍ１２５Ｌ；Ｌ１２６Ｉ／Ｔ；Ｌ１２６Ｍ／Ｒ１３４Ｌ；Ｌ１２７Ａ；Ａ１２９Ｇ／Ｌ；Ｎ１３０Ｑ；Ｎ１３０Ｃ／Ｍ３７０Ｉ Ｒ１３４Ｗ；Ｍ１３３Ｒ；Ｒ１３４Ｉ；Ｒ１３４Ｎ／Ｇ３０７Ｃ；Ｇ１３５Ｃ／Ｓ；および／またはＧ１３５Ａ／Ａ３９４Ｅのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0040】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｇ２０Ｓ／Ｉ１４４Ｌ；Ｒ４３Ｓ；Ｌ４７Ｍ／Ｉ１４４Ｌ；Ｌ４７Ｍ／Ｒ１４６Ｅ；Ｌ４７Ｍ／Ｍ１４７Ｇ／Ａ３８３Ｅ；Ｌ４７Ｍ／Ｐ１５７Ｃ；Ｑ５８Ｈ／Ｌ１４３Ｖ；Ｑ５８Ｋ／Ｐ１５７Ｄ／Ｇ３６９Ｃ；Ａ６２Ｓ／Ｍ１４７Ｖ；Ｓ８２Ｉ／Ｇ１３５Ｃ／Ｐ１５７Ｆ／Ｗ２７９Ｌ；Ｒ９４Ｃ／Ｉ１４９Ｅ；Ｔ１１０Ｉ／Ｉ１３９Ｒ；Ｌ１１８Ｍ／Ｌ１４１Ｈ；Ａ１１９Ｅ／Ｔ１５６Ｈ／Ａ２８９Ｄ；Ｉ１３９Ｍ／Ｖ；Ｒ１４０Ｄ／Ｇ／Ｍ；Ｒ１４０Ｎ／Ａ１９９Ｅ；Ｒ１４０Ｅ／Ａ３３４Ｓ／Ａ５５１Ｄ；Ｌ１４１Ｋ／Ｑ／Ｐ／Ｔ；Ｅ１４２Ｈ／Ｐ／Ｖ；Ｅ１４２Ｄ／Ｇ３７１Ｄ；Ｌ１４３Ｆ／Ｍ；Ｉ１４４Ｌ／Ｎ／Ｖ；Ｋ１４５Ｎ／Ｑ／Ｒ；Ｋ１４５Ｇ／Ｐ１５７Ｔ；Ｒ１４６Ｈ／Ｌ；Ｒ１４６Ｗ／Ｄ１９１Ｙ；Ｍ１４７Ａ；Ｉ１４９Ｌ／Ｒ；Ｆ１５０Ｋ／Ｌ／Ｍ；Ｌ１５１Ｍ；Ａ１５３Ｃ／Ｇ；Ａ１５３Ｓ／Ｈ２５０Ｎ；Ｇ１５４Ｒ；Ｇ１５４Ｙ／Ｌ１７４Ｍ／Ｑ３２１Ｋ／Ｓ４５６Ｉ／Ｇ４８３Ｃ；Ｔ１５６Ｋ／Ｇ４８３Ｃ；Ｐ１５７Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ；Ｙ１５８Ｅ；Ｖ１５９Ｃ／Ｈ／Ｌ／Ｍ；Ｍ２４７Ｉ；Ｌ３１９Ｍ；および／またはＱ３８９Ｋのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0041】

また一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｐ１１７Ｔ／Ｙ１７６Ｑ；Ｖ１７２Ｉ／Ｃ／Ｌ；Ｌ１７４Ｍ；Ｓ１７５Ｇ；Ｙ１７６Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｒ／Ｖ；Ｉ１７７Ｍ／Ｖ；Ｔ１７８Ｌ／Ａ４７７Ｓ；および／またはＳ１８０Ｃ／Ｔのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0042】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｒ４３Ｓ／Ｈ３７４Ｋ；Ｒ４３Ｓ／Ｈ３７４Ｒ；Ａ１１２Ｓ／Ｍ３７０Ａ／Ａ５０７Ｅ；Ｍ１４７Ｉ／Ｈ３７４Ｓ；Ｓ１８７Ｒ／Ｌ３８１Ｖ；Ｄ１９１Ｙ／Ｈ３８５Ｎ；Ａ２３２Ｓ；Ｑ２４０Ｋ／Ｈ３７４Ｒ；Ａ２５６Ｓ／Ｌ３８１Ｎ；Ｐ２７５Ｑ／Ｍ３７０Ｓ；Ｐ２７５Ｔ／Ｈ３７４Ｒ；Ｑ３３２Ｋ／Ｙ３７７Ｍ；Ａ３３４Ｓ／Ｈ３７４Ｖ；Ｌ３４９Ｍ；Ｑ３５５Ｋ／Ｈ３７４Ｓ；Ｍ３７０Ｇ／Ｉ／Ｓ；Ｇ３７１Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ；Ｍ３７２Ａ／Ｖ；Ｈ３７４Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ；Ｈ３７４Ｑ／Ｐ３９６Ｑ；Ｈ３７４Ｒ／Ｇ４１７Ｃ；Ｌ３７５Ｉ；Ｌ３７５Ｍ；Ｙ３７７Ｃ／Ｉ／Ｎ；Ｙ３７８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｓ；Ｙ３７８Ｆ／Ｐ４０４Ｑ；Ｉ３７９Ｃ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ；Ｌ３８１Ｇ／Ｖ；Ｌ３８１Ｍ／Ｑ５６０Ｋ；Ｌ３８２Ｃ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｓ；Ａ３８３Ｓ／Ｖ；Ｋ３８４Ｒ；Ｈ３８５Ｃ／Ｇ／Ｎ；Ｈ３８５Ｍ／Ｐ４０３Ｈ；Ｈ３８５Ｓ／Ｐ４０３Ｈ；Ｄ３８７Ｓ；Ｌ４１８Ｍ；Ｇ４２５Ｖ；Ａ４４７Ｓ；Ｓ４６１Ｇ；および／またはＳ５２５Ｌのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0043】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ａ２４Ｓ／Ｆ４３４Ｍ；Ａ６２Ｓ／Ｔ４３３Ｎ；Ｓ９８Ｉ；Ｌ２１３Ｍ／Ｓ４３８Ｌ；Ｑ２４０Ｋ／Ｔ４３３Ｙ；Ｓ２８６Ｒ／Ｙ４３５Ｔ；Ａ２８９Ｓ／Ｌ４３１Ｅ；Ｓ３３１Ｉ；Ｌ４３１Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｌ４３２Ｃ／Ｖ；Ｔ４３３Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｆ４３４Ｃ；Ｙ４３５Ｌ；Ｙ４３５Ｑ／Ｈ４４６Ｎ；Ｇ４３６Ｍ；Ｇ４３６Ｄ／Ｔ；Ｎ４３７Ｅ／Ｇ／Ｑ；Ｎ４３７Ｔ／Ｌ５３８Ｍ；Ｓ４３８Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｉ４３９Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｖ；および／またはＡ４７７Ｓのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0044】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ａ２４Ｅ；Ｑ５８Ｒ／Ｙ４７５Ｈ；Ａ７０Ｓ／Ｎ４７４Ｅ；Ｌ１０４Ｍ／Ｖ４７６Ｌ；Ａ１１９Ｅ／Ｇ３６５Ａ；Ｌ２０６Ｍ；Ｐ２７５Ｑ；Ｇ２７６Ｖ；Ｑ２９２Ｈ／Ａ４７９Ｇ；Ｑ３５５Ｈ／Ｉ４７８Ｃ；Ｐ４０４Ｔ／Ａ４７７Ｖ；Ｉ４７１Ｆ／Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ｆ４７２Ｇ；Ｑ４７３Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｒ／Ｓ；Ｑ４７３Ｈ／Ａ５０７Ｓ；Ｎ４７４Ａ／Ｈ／Ｒ／Ｗ；Ｎ４７４Ｄ／Ｒ４９０Ｈ；Ｙ４７５Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｑ；Ｖ４７６Ｃ／Ｉ／Ｌ；Ｉ４７８Ｎ／Ｓ；Ａ４７９Ｇ／Ｓ；Ｆ４８２Ｃ／Ｌ；Ｇ４８３Ｃ／Ｈ／Ｓ；Ｇ４８３Ａ／Ｓ５２４Ｉ；Ｇ４８３Ｒ／Ｇ５３７Ｃ；および／またはＡ５５８Ｓのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0045】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｖ３９Ａ／Ｋ１１５Ｅ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｌ３８１Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｇ２４８Ｃ／Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｌ３８１Ｇ；Ｖ３９Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｍ１３３Ｒ／Ｌ３８１Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ；Ｙ３７８Ｄ／Ｃ５０３Ｑ；Ｙ３７８Ｅ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２ＧＣ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；および／またはＦ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎのうち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0046】

また一部のさらなる実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D;
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A447S; S461G; S525L; A24S/F434M; A62S/T433N; S98I; L213M/S438L; Q240K/T433Y; S286R/Y435T; A289S/L431E; S331I; L431C/E/G/P/S/V; L432C/V; T433A/I/L/N/P/Q/R/S/V/W; F434C; Y435L; Y435Q/H446N; G436M; G436D/T; N437E/G/Q; N437T/L538M; S438C/F/M/R/T; I439C/F/L/V; A477S; A24E; Q58R/Y475H; A70S/N474E;
L104M/V476L; A119E/G365A; L206M; P275Q; G276V; Q292H/A479G; Q355H/I478C;
P404T/A477V; I471F/G/K/M/N/R/V/W; F472G; Q473H/K/M/R/S; Q473H/A507S; N474A/H/R/W; N474D/R490H; Y475C/F/L/Q; V476C/I/L; I478N/S; A479G/S; F482C/L; G483C/H/S; G483A/S524I; G483R/G537C; A558S; V39A/K115E/M133R/C565N; V39A/M133R/F472G/C503Q/C565N; V39A/M133R/F472G/C565N; V39A/M133R/C503Q; V39A/M133R/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/M147A/Y378E/C565N; V39A/M147A/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/L381G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C503Q/C565N; V39A/M147A/F472G/C565N; V39A/M147A/C565N; V39A/G248C/L381G/F472G/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C503Q/C565N; V39A/Y378E/C565N; V39A/L381G; V39A/F472G/C503Q/C565N; V39A/C503Q/C565N; M133R/L381G/C565N; M133R/C503Q; Y378D/C503Q; Y378E/F472G/C503Q/C565N; L381G/F472GC503Q/C565N;および/またはF472G/C503Q/C565Nの
うち１種または複数から選択される操作されたポリペプチドも提供する。

【0047】

本発明は、ａ）参照配列の配列番号２６またはその機能的断片に対し少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号２６またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号２６と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0048】

一部の実施形態において、本発明は、ａ）参照配列の配列番号２６またはその機能的断片に対し少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号２６またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号２６と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。

【0049】

一部の追加的な実施形態において、本発明は、ａ）参照配列の配列番号２６またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号２６またはその機能的断片と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）参照配列の配列番号２６と比較して、ｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号２６に対し少なくとも８５％の配列同一性、および配列番号１２６と比較して少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を有し、配列番号２６と比較して、増強された触媒活性、タンパク質分解に対する低下した感受性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、低下した凝集および／または低下した免疫原性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す、アミノ酸配列を含む。操作されたポリペプチドの一部の実施形態において、配列番号２６と比較したアミノ酸残基の差異は、次の置換または置換セットＡ２４Ｅ／Ｇ３８１Ｌ；Ｌ１２７Ｖ；Ａ１２９Ｉ／Ｖ；Ｓ１３１Ｃ／Ｔ；Ｈ１３２Ｌ／Ｓ；Ｒ１３４Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｋ；Ｒ１３４Ｈ／Ｙ３７８Ｅ／Ｇ３８１Ｌ；Ｒ１３４Ｈ／Ｙ３７８Ｅ／Ｇ３８１Ｌ／Ｖ３８８Ｔ；Ｒ１３４Ｈ／Ｖ３８８Ｔ；Ａ１３６Ｋ；Ａ２８９Ｓ；Ｍ３７２Ｌ；Ｈ３７４Ｇ／Ｍ／Ｑ；Ｇ３８１Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ａ３８３Ｃ／Ｍ；Ｖ３８８Ｃ／Ｔ；Ｌ４３１Ｍ；および／またはＬ５６３Ｍのうち１種または複数から選択される。

【0050】

一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するが、一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有するが、一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、参照配列の配列番号４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有するポリペプチド（例えば、本明細書の表に提示されているバリアントのいずれか）の機能的断片を含む。

【0051】

一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部のさらなる実施形態において、操作されたポリペプチドは、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有するポリペプチドの機能的断片（例えば、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６ならびに本明細書の表に提示されているバリアントのいずれかの機能的断片）を含む。

【0052】

本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドであって、表２－１から２－５および／または表９－１から９－７のいずれかに提示されているバリアントＰＡＬである操作されたポリペプチドも提供する。

【0053】

一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ酵素である。一部の追加的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、熱安定的である。一部の実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、タンパク質分解に対し抵抗性である。一部の追加的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、少なくとも１種の消化管酵素によるタンパク質分解に対し抵抗性である。一部のさらなる実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼおよび／またはエラスターゼによるタンパク質分解に対し抵抗性である。一部のさらなる実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドは、酸安定的である。

【0054】

本発明は、脱免疫化された、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチドも提供する。一部の実施形態において、脱免疫化された操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の追加的な実施形態において、脱免疫化された操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、脱免疫化された操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、脱免疫化された操作されたポリペプチドは、配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0055】

また一部のさらなる実施形態において、本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する、精製された操作されたポリペプチドを提供する。

【0056】

本発明は、本明細書に表記されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部の追加的な実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。

【0057】

本発明は、本明細書に提示されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする、少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態において、発現ベクターは、少なくとも１種の制御配列をさらに含む。一部の実施形態において、制御配列は、プロモーターである。一部の追加的な実施形態において、プロモーターは、異種プロモーターである。

【0058】

本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列、および／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列および少なくとも１種の制御配列を含む少なくとも１種の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞も提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、コドン最適化された、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む。一部の実施形態において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。

【0059】

本発明は、宿主細胞において少なくとも１種の操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、操作されたＰＡＬポリペプチドが産生されるように、適した培養条件下で、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド、および／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列および少なくとも１種の制御配列を含む少なくとも１種の発現ベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態において、方法は、培養物および／または宿主細胞から、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む。一部のさらなる実施形態において、方法は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを精製するステップをさらに含む。

【0060】

本発明は、本明細書に提示されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む組成物も提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬組成物である。一部の実施形態において、組成物は、食物性および／または栄養性補助食品である。一部のさらなる実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む。一部の追加的な実施形態において、組成物は、フェニルケトン尿症の処置に適する。一部のさらなる実施形態において、医薬組成物は、ヒトへの経口投与に適する。一部の実施形態において、組成物は、丸剤、錠剤、カプセル、ジェルキャップ、液体またはエマルションの形態である。なお一部のさらなる実施形態において、丸剤、錠剤、カプセルまたはジェルキャップは、腸溶コーティングをさらに含む。一部の追加的な実施形態において、医薬組成物は、ヒトへの非経口的注射に適する。一部の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の追加的な治療上有効な化合物と同時投与される。一部のさらなる実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の追加的な治療上有効な化合物を含む。一部の追加的な実施形態において、医薬組成物は、食物性および／または栄養性補助食品中に存在する。

【0061】

本発明は、対象におけるフェニルケトン尿症の症状を処置および／または防止するための方法であって、フェニルケトン尿症を有する対象を用意するステップと、本明細書に提示されている少なくとも１種の組成物を対象に与えるステップとを含む方法も提供する。一部の実施形態において、組成物は、医薬組成物を含むが、一部の代替的実施形態において、組成物は、食物性／栄養性補助食品を含む。方法の一部の実施形態において、フェニルケトン尿症の症状は寛解される。一部の追加的な実施形態において、処置された対象は、フェニルアラニンの症状を示す対象に必要とされる食事よりも、そのメチオニン、フェニルアラニンおよび／またはチロシン含量が制限されない食事を摂ることができる。一部の実施形態において、処置された対象（即ち、本明細書に提示されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む少なくとも１種の組成物を与えた対象）は、本明細書に提示されている少なくとも１種の組成物を与えなかった対象に必要とされる食事よりも、そのメチオニン、フェニルアラニンおよび／またはチロシン含量が制限されない食事を摂ることができる。一部の実施形態において、対象に与えられる組成物は、医薬組成物を含むが、一部の代替的実施形態において、組成物は、食物性／栄養性補助食品を含む。本発明は、処置された対象であって、本明細書に提示されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む少なくとも１種の組成物および／または医薬組成物を投与した対象も提供する。一部の実施形態において、対象は、霊長類、齧歯類およびウサギ目動物（lagamorph）から選択される動物である。一部の追加的な
実施形態において、対象は、マウスである。一部のさらなる実施形態において、対象は、ヒトである。また一部のさらなる実施形態において、対象は、ヒト乳児または小児であるが、一部の代替的実施形態において、対象は、ヒト成人または若年成人である。Ｉ

【0062】

本発明は、本明細書に提示されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む組成物の使用も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ａ）参照配列の配列番号４またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４またはその機能的断片と比較した少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）該参照配列の配列番号４と比較してｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２）
前記１個または複数のアミノ酸位置が、２０、２４、２７、３９、４３、４５、４７、５４、５８、５９、６２、７０、７３、８０、８２、９１、９４、９８、１０４、１０５、１１０、１１２、１１５、１１７、１１８、１１９、１２１、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５０、１５１、１５３、１５４、１５６、１５７、１５８、１５９、１７２、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１８０、１８７、１９１、１９５、１９９、２０５、２０６、２１０、２１２、２１３、２１４、２３２、２４０、２４３、２４５、２４７、２４８、２５０、２５６、２５７、２６６、２７０、２７５、２７８、２７９、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、３０４、３０５、３０７、３０８、３０９、３１９、３２１、３２６、３３１、３３２、３３４、３４９、３５３、３５５、３６４、３６５、３６９、３７０、３７１、３７２、３７４、３７５、３７７、３７８、３７９、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８７、３８９、３９４、３９６、３９９、４００、４０３、４０４、４０７、４１７、４１８、４２５、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４３、４４６、４４７、４５３、４５６、４５９、４６０、４６１、４６３、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８２、４８３、５０３、５０７、５０９、５２１、５２２、５２４、５２５、５２８、５３８、５４６、５４７、５５１、５５８、５６０、５６４、５６５および／またはこれらのいずれかの組合せから選択され、前記アミノ酸位置が、配列番号４を参照して番号付けされている、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目３）
配列番号４の前記参照配列の前記アミノ酸残基が、Ａ３９、Ｔ５４、Ｇ５９、Ｓ７３、Ａ９１、Ｙ１５８、Ｓ１８０、Ｋ１９５、Ａ１１２、Ｒ１３４、Ｑ２４０、Ｔ２４３、Ｉ２４５、Ａ２５６、Ｌ２５７、Ｎ２７０、Ｎ２９０、Ｙ３０４、Ｒ３０５、Ｈ３０７、Ｅ３０８、Ｉ３２６、Ｌ３４９、Ｄ３５３、Ｌ３６４、Ａ３９４、Ｓ３９９、Ｎ４００、Ｐ４０４、Ｌ４０７、Ｆ４４３、Ｎ４５３、Ｙ４５９、Ｔ４６０、Ｔ４６３、Ｎ４７４、Ｅ５０９、Ｑ５２１、Ｋ５２２、Ｔ５２４、Ｐ５２８、Ｓ５４６、および／またはＰ５６４に相当する、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目４）
配列番号４と比較した前記アミノ酸残基の差異が、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、次の置換Ａ３９Ｖ、Ｔ５４Ｋ、Ｇ５９Ｒ、Ｓ７３Ｋ、Ａ１１２Ｃ、Ｒ１３４Ｑ、Ａ９１Ｖ、Ｙ１５８Ｈ、Ｓ１８０Ａ、Ｋ１９５Ｅ、Ｑ２４０Ｒ／Ｗ、Ｔ２４３Ｉ／Ｌ、Ｉ２４５Ｌ、Ａ２５６Ｇ、Ｌ２５７Ｗ／Ａ、Ｎ２７０Ｋ、Ｎ２９０Ｇ、Ｙ３０４Ｈ、Ｒ３０５Ｍ、Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ、Ｅ３０８Ｑ、Ｉ３２６Ｆ、Ｌ３４９Ｍ、Ｄ３５３Ａ／Ｎ、Ｌ３６４Ｑ、Ａ３９４Ｖ、Ｓ３９９Ｎ、Ｎ４００Ｋ、Ｐ４０４Ａ、Ｌ４０７Ｖ、Ｆ４４３Ｈ、Ｎ４５３Ｇ、Ｙ４５９Ｆ、Ｔ４６０Ｇ、Ｔ４６３Ｎ、Ｎ４７４Ｑ、Ｅ５０９Ｌ、Ｑ５２１Ｋ／Ｓ、Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ、Ｔ５２４Ｓ、Ｐ５２８Ｌ、Ｓ５４６Ｒ、およびＰ５６４Ｇ／Ｌ／Ｍのうち１種または複数から選択される、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目５）
前記アミノ酸残基の差異が、Ａ３９、Ａ９１、Ｑ２４０、Ａ２５６、Ｎ２９０、Ｙ３０４、Ｒ３０５、Ｈ３０７、Ｄ３５３、Ａ３９４、Ｓ３９９、Ｐ４０４、Ｌ４０７、Ｑ５２１、Ｋ５２２およびＴ５２４のうち１種または複数の組合せから選択される、項目１～４のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目６）
配列番号４に対する少なくとも約９０％の配列同一性；および位置Ｈ３０７におけるアミノ酸残基の差異を有する、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目７）
前記アミノ酸残基の差異が、Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍである、項目６に記載の操作されたポリペプチド。
（項目８）
前記改善された特性が、タンパク質分解に対する低下した感受性および／または酸性ｐＨに対する増加した耐性から選択される、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目９）
前記参照配列が、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓに由来する野生型ＰＡＬである、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目１０）
ａ）参照配列の配列番号１０またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号１０またはその機能的断片と比較した少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）該参照配列の配列番号１０と比較してｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目１１）
参照配列の配列番号１０に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号１０と比較した少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含み、配列番号１０と比較して増強された触媒活性、タンパク質分解に対する低下した感受性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、低下した凝集および／または低下した免疫原性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目１２）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：I27E/V39A; I27E/V39A/R43L/V105C/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q; I27E/V39A/R43L/L214E/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A112C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P210C/P266H/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/A112C/Q205T/P266H/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A112C/L214E/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/S131N/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/A153R/P210C/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/P210C/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L214E/A551D/C565N;
I27E/V39A/V105C/R134Q/Q205T/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/P266H/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/I285E/C503Q; I27E/V39A/V105C/R134Q/L278D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/I285E/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/R134Q/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/A153R/L214E; I27E/V39A/V105C/A153R/I285E; I27E/V39A/V105C/A153R/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/A153R/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L214E/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/C503Q; I27E/V39A/V105C/Q205T/P210C/L278D/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L214E/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/Q205T/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/V105C/P210C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/V105C/P210C/L214E/P266H/L278D; I27E/V39A/V105C/L214E/P266H/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/L214E/L278D/L309P/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/V105C/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/V105C/I285E/A547D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A551D; I27E/V39A/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/Q205T/P210C/L214E/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/A112C/R134Q/P266H/I285E; I27E/V39A/A112C/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/A112C/Q205T/L278D/I285E; I27E/V39A/A112C/L214E; I27E/V39A/A112C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/A112C/I285E; I27E/V39A/A112C/A547D; I27E/V39A/R134Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q; I27E/V39A/R134Q/A153R/P210C/L214E/L278D/I285E/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/R134Q/A153G/L214E/P266H/I285E/C503Q/ A551D/
C565N; I27E/V39A/R134Q/A153R/L214E/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D;
I27E/V39A/R134Q/A153R/L278D/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/A153R/A547D; I27E/V39A/R134Q/Q205T/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/Q205T/P266H/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/R134Q/P210C/L214E/C503Q; I27E/V39A/R134Q/P210C/C503Q/A551D; I27E/V39A/R134Q/L214E/P266H/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D; I27E/V39A/R134Q/L278D/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/C503Q/A547D; I27E/V39A/R134Q/A547D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L214E/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/I285E/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/P266H/A551D; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/V39A/Q205T/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/Q205T/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/P210C/T212S; I27E/V39A/P210C/L214E/L278D/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/L214E/I285E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P210C/P266H/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/P210C/P266H/C503Q/A551D; I27E/V39A/L214E; I27E/V39A/L214E/P266H/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q; I27E/V39A/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; I27E/V39A/L214E/C503Q/A551D; I27E/V39A/P266H; I27E/V39A/P266H/L278D; I27E/V39A/L278D; I27E/V39A/L278D/A547D; I27E/V39A/L278D/I285E/C503Q/A547D; I27E/V39A/L278D/C503Q/C565N; I27E/V39A/C503Q; I27E/G45D/Q205T/P266H/C565N; I27E/V105C; I27E/V105C/R134Q/A153R/P210C/L214E/C503Q/A547D;
I27E/V105C/R134Q/A153R/I285E/A547D; I27E/V105C/R134Q/A153R/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/P210C/C503Q; I27E/V105C/R134Q/Q205T/L214E/P266H/L278D/C503Q/C565N;
I27E/V105C/Q205T/P266H/C503Q; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/P266H/L278D/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/L214E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/P210C/P266H/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D;
I27E/V105C/R134Q/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H; I27E/V105C/Q205T/L214E/P266H/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/Q205T/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E; I27E/V105C/L214E/P266H/C503Q; I27E/V105C/L214E/I285E/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/L214E/A551D/C565N; I27E/V105C/P266H; I27E/V105C/P266H/I285E/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/L278D/A547D; I27E/V105C/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/C565N; I27E/V105C/C503Q/A547D/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/A153R/L214E/P266H/C503Q; I27E/A112C/R134Q/L278D/I285E/C503Q/A551D/C565N; I27E/A112C/R134Q/Q205T/L278D/C503Q; I27E/A112C/R134Q/Q205T/I285E/C503Q; I27E/A112C/Q205T/P266H/L278D/I285E/C503Q; I27E/A112C/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q; I27E/R134Q/A153R/I285E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/Q205T/I285E/C503Q/A551D; I27E/R134Q/Q205T/P266H/L278D/A547D; I27E/R134Q/P210C; I27E/R134Q/L214E/C503Q; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; I27E/R134Q/L214E/C503Q/C565N; I27E/R134Q/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/R134Q/I285E/C503Q; I27E/A153R/L214E/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/A153R/L214E/L278D/A551D; I27E/Q205T; I27E/Q205T/L214E/L278D/I285E/C503Q/C565N; I27E/Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/Q205T/P266H/L278D/I285E/A551D/C565N; I27E/Q205T/L278D/A551D; I27E/P210C; I27E/P210C/L214E/C503Q/A547D; I27E/P210C/L278D/C503Q; I27E/P210C/C503Q; I27E/P210C/C503Q/C565N; I27E/P210C/A551D; I27E/L214E; I27E/L214E/P266H/L278D/I285E/A551D; I27E/L214E/L278D; I27E/L214E/L278D/C503Q; I27E/L214E/C503Q; I27E/L214E/C503Q/A547D; I27E/L214E/C503Q/A547D/C565N; I27E/L214E/A551D; I27E/P266H/L278D/C503Q;
I27E/P266H/A547D/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D; I27E/L278D/C503Q/A551D/C565N; I27E/A547D/C565N; V39A/G45S/L278D/C503Q/A551D; V39A/V105C/R134Q/A153R/Q205T/A551D; V39A/V105C/R134Q/P210C/L214E/A551D; V39A/V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/V105C/A153R/P266H/A547D/A551D; V39A/V105C/Q205T/C503Q; V39A/V105C/Q205T/A551D; V39A/V105C/P210C/A547D; V39A/V105C/L214E/P266H/A547D/C565N; V39A/V105C/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; V39A/A112C/R134Q/Q205T/L214E/L278D; V39A/A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V39A/A112C/A153R/Q205T/L278D/C503Q/A547D; V39A/R134Q; V39A/R134Q/Q205T/L214E/C503Q/C565N; V39A/R134Q/P210C/L214E/A547D/C565N; V39A/A153R/C503Q/A547D; V39A/Q205T/L278D/A547D/A551D; V39A/P210C/L214E/L278D/I285E/C503Q/A551D; V39A/P266H; V39A/P275R/L278D/C503Q/A551D; V39A/C503Q; V39A/C503Q/A551D/C565N; V105C; V105C/A112C/R134Q/Q205T/L214E/Y492H/C503Q/A547D; V105C/R134Q/A153R/Q205T/L214E/C503Q; V105C/R134Q/Q205T/L214E/A547D; V105C/R134Q/Q205T/P266H/L278D; V105C/R134Q/L214E/P266H/I285E/C503Q/A551D/C565N;
V105C/R134Q/L214E/L278D/C565N; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D; V105C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D; V105C/R134Q/C503Q; V105C/R134Q/C503Q/A547D; V105C/R134Q/C503Q/A547D/C565N; V105C/A153R/Q205T/L214E/P266H/C503Q/A547D; V105C/A153R/Q205T/P266H/I285E/A547D/C565N; V105C/Q205T/P210C/L214E/C503Q/A547D; V105C/Q205T/L214E/L278D; V105C/Q205T/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/Q205T/C503Q/A551D; V105C/L214E/P266H/L278D/A547D; V105C/L214E/L278D/C503Q/A547D/A551D; V105C/L214E/I285E; V105C/L214E/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; V105C/L214E/I285E/A547D/C565N; V105C/L278D/C503Q/A551D; V105C/I285E; V105C/I285E/A547D; V105C/C503Q; V105C/A547D/A551D; A112C/R134Q/A153R/L214E/L278D/I285E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/R134Q/L214E/C503Q/A547D/A551D/C565N; A112C/L214E/L278D; A112C/L278D/C503Q/A547D; R134Q/Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D/C565N; R134Q/Q205T/C503Q; R134Q/P210C/L214E/L278D/C503Q/A547D/C565N; R134Q/P210C/L214E/C503Q/A547D/A551D;
R134Q/L214E; R134Q/L214E/L278D/C503Q; R134Q/L214E/L278D/C503Q/A551D; R134Q/L214E/I285E/C503Q; R134Q/C503Q; R134Q/C503Q/A547D/A551D; A153R; Q205T/L214E/I285E/C503Q/A551D; Q205T/L214E/I285E/C503Q/C565N; Q205T/L214E/C503Q/A547D/C565N; Q205T/L278D/I285E/A547D/A551D; P210C/L214E; P210C/L214E/P266H; L214E/P266H; L214E/P266H/C503Q/A547D/A551D/C565N; L214E/C503Q/A547D; L214E/A547D; P266H/L278D/C503Q; P266H/C565N; L278D/A547D; C503Q; C503Q/A547D; C503Q/A547D/A551D/C565N; C503Q/A547D/C565N; C503Q/A551D; C503Q/A551D/C565N; A547D;および/
またはC565Nのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載
の操作されたポリペプチド。
（項目１３）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｖ８０Ｉ／Ｒ１３４Ｃ／Ｐ５６４Ｑ；Ｖ１２１Ｃ；Ａ１２３Ｇ；Ａ１２４Ｇ；Ｍ１２５Ｌ；Ｌ１２６Ｉ／Ｔ；Ｌ１２６Ｍ／Ｒ１３４Ｌ；Ｌ１２７Ａ；Ａ１２９Ｇ／Ｌ；Ｎ１３０Ｑ；Ｎ１３０Ｃ／Ｍ３７０Ｉ Ｒ１３４Ｗ；Ｍ１３３Ｒ；Ｒ１３４Ｉ；Ｒ１３４Ｎ／Ｇ３０７Ｃ；Ｇ１３５Ｃ／Ｓ；および／またはＧ１３５Ａ／Ａ３９４Ｅのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１４）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｇ２０Ｓ／Ｉ１４４Ｌ；Ｒ４３Ｓ；Ｌ４７Ｍ／Ｉ１４４Ｌ；Ｌ４７Ｍ／Ｒ１４６Ｅ；Ｌ４７Ｍ／Ｍ１４７Ｇ／Ａ３８３Ｅ；Ｌ４７Ｍ／Ｐ１５７Ｃ；Ｑ５８Ｈ／Ｌ１４３Ｖ；Ｑ５８Ｋ／Ｐ１５７Ｄ／Ｇ３６９Ｃ；Ａ６２Ｓ／Ｍ１４７Ｖ；Ｓ８２Ｉ／Ｇ１３５Ｃ／Ｐ１５７Ｆ／Ｗ２７９Ｌ；Ｒ９４Ｃ／Ｉ１４９Ｅ；Ｔ１１０Ｉ／Ｉ１３９Ｒ；Ｌ１１８Ｍ／Ｌ１４１Ｈ；Ａ１１９Ｅ／Ｔ１５６Ｈ／Ａ２８９Ｄ；Ｉ１３９Ｍ／Ｖ；Ｒ１４０Ｄ／Ｇ／Ｍ；Ｒ１４０Ｎ／Ａ１９９Ｅ；Ｒ１４０Ｅ／Ａ３３４Ｓ／Ａ５５１Ｄ；Ｌ１４１Ｋ／Ｑ／Ｐ／Ｔ；Ｅ１４２Ｈ／Ｐ／Ｖ；Ｅ１４２Ｄ／Ｇ３７１Ｄ；Ｌ１４３Ｆ／Ｍ；Ｉ１４４Ｌ／Ｎ／Ｖ；Ｋ１４５Ｎ／Ｑ／Ｒ；Ｋ１４５Ｇ／Ｐ１５７Ｔ；Ｒ１４６Ｈ／Ｌ；Ｒ１４６Ｗ／Ｄ１９１Ｙ；Ｍ１４７Ａ；Ｉ１４９Ｌ／Ｒ；Ｆ１５０Ｋ／Ｌ／Ｍ；Ｌ１５１Ｍ；Ａ１５３Ｃ／Ｇ；Ａ１５３Ｓ／Ｈ２５０Ｎ；Ｇ１５４Ｒ；Ｇ１５４Ｙ／Ｌ１７４Ｍ／Ｑ３２１Ｋ／Ｓ４５６Ｉ／Ｇ４８３Ｃ；Ｔ１５６Ｋ／Ｇ４８３Ｃ；Ｐ１５７Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｙ；Ｙ１５８Ｅ；Ｖ１５９Ｃ／Ｈ／Ｌ／Ｍ；Ｍ２４７Ｉ；Ｌ３１９Ｍ；および／またはＱ３８９Ｋのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。（項目１５）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｐ１１７Ｔ／Ｙ１７６Ｑ；Ｖ１７２Ｉ／Ｃ／Ｌ；Ｌ１７４Ｍ；Ｓ１７５Ｇ；Ｙ１７６Ｅ／Ｉ／Ｍ／Ｒ／Ｖ；Ｉ１７７Ｍ／Ｖ；Ｔ１７８Ｌ／Ａ４７７Ｓ；および／またはＳ１８０Ｃ／Ｔのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１６）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｒ４３Ｓ／Ｈ３７４Ｋ；Ｒ４３Ｓ／Ｈ３７４Ｒ；Ａ１１２Ｓ／Ｍ３７０Ａ／Ａ５０７Ｅ；Ｍ１４７Ｉ／Ｈ３７４Ｓ；Ｓ１８７Ｒ／Ｌ３８１Ｖ；Ｄ１９１Ｙ／Ｈ３８５Ｎ；Ａ２３２Ｓ；Ｑ２４０Ｋ／Ｈ３７４Ｒ；Ａ２５６Ｓ／Ｌ３８１Ｎ；Ｐ２７５Ｑ／Ｍ３７０Ｓ；Ｐ２７５Ｔ／Ｈ３７４Ｒ；Ｑ３３２Ｋ／Ｙ３７７Ｍ；Ａ３３４Ｓ／Ｈ３７４Ｖ；Ｌ３４９Ｍ；Ｑ３５５Ｋ／Ｈ３７４Ｓ；Ｍ３７０Ｇ／Ｉ／Ｓ；Ｇ３７１Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ；Ｍ３７２Ａ／Ｖ；Ｈ３７４Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｌ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ；Ｈ３７４Ｑ／Ｐ３９６Ｑ；Ｈ３７４Ｒ／Ｇ４１７Ｃ；Ｌ３７５Ｉ；Ｌ３７５Ｍ；Ｙ３７７Ｃ／Ｉ／Ｎ；Ｙ３７８Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｓ；Ｙ３７８Ｆ／Ｐ４０４Ｑ；Ｉ３７９Ｃ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｎ；Ｌ３８１Ｇ／Ｖ；Ｌ３８１Ｍ／Ｑ５６０Ｋ；Ｌ３８２Ｃ／Ｈ／Ｉ／Ｍ／Ｓ；Ａ３８３Ｓ／Ｖ；Ｋ３８４Ｒ；Ｈ３８５Ｃ／Ｇ／Ｎ；Ｈ３８５Ｍ／Ｐ４０３Ｈ；Ｈ３８５Ｓ／Ｐ４０３Ｈ；Ｄ３８７Ｓ；Ｌ４１８Ｍ；Ｇ４２５Ｖ；Ａ４４７Ｓ；Ｓ４６１Ｇ；および／またはＳ５２５Ｌのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１７）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ａ２４Ｓ／Ｆ４３４Ｍ；Ａ６２Ｓ／Ｔ４３３Ｎ；Ｓ９８Ｉ；Ｌ２１３Ｍ／Ｓ４３８Ｌ；Ｑ２４０Ｋ／Ｔ４３３Ｙ；Ｓ２８６Ｒ／Ｙ４３５Ｔ；Ａ２８９Ｓ／Ｌ４３１Ｅ；Ｓ３３１Ｉ；Ｌ４３１Ｃ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｓ／Ｖ；Ｌ４３２Ｃ／Ｖ；Ｔ４３３Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｗ；Ｆ４３４Ｃ；Ｙ４３５Ｌ；Ｙ４３５Ｑ／Ｈ４４６Ｎ；Ｇ４３６Ｍ；Ｇ４３６Ｄ／Ｔ；Ｎ４３７Ｅ／Ｇ／Ｑ；Ｎ４３７Ｔ／Ｌ５３８Ｍ；Ｓ４３８Ｃ／Ｆ／Ｍ／Ｒ／Ｔ；Ｉ４３９Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｖ；および／またはＡ４７７Ｓのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１８）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ａ２４Ｅ；Ｑ５８Ｒ／Ｙ４７５Ｈ；Ａ７０Ｓ／Ｎ４７４Ｅ；Ｌ１０４Ｍ／Ｖ４７６Ｌ；Ａ１１９Ｅ／Ｇ３６５Ａ；Ｌ２０６Ｍ；Ｐ２７５Ｑ；Ｇ２７６Ｖ；Ｑ２９２Ｈ／Ａ４７９Ｇ；Ｑ３５５Ｈ／Ｉ４７８Ｃ；Ｐ４０４Ｔ／Ａ４７７Ｖ；Ｉ４７１Ｆ／Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｖ／Ｗ；Ｆ４７２Ｇ；Ｑ４７３Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｒ／Ｓ；Ｑ４７３Ｈ／Ａ５０７Ｓ；Ｎ４７４Ａ／Ｈ／Ｒ／Ｗ；Ｎ４７４Ｄ／Ｒ４９０Ｈ；Ｙ４７５Ｃ／Ｆ／Ｌ／Ｑ；Ｖ４７６Ｃ／Ｉ／Ｌ；Ｉ４７８Ｎ／Ｓ；Ａ４７９Ｇ／Ｓ；Ｆ４８２Ｃ／Ｌ；Ｇ４８３Ｃ／Ｈ／Ｓ；Ｇ４８３Ａ／Ｓ５２４Ｉ；Ｇ４８３Ｒ／Ｇ５３７Ｃ；および／またはＡ５５８Ｓのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１９）
配列番号１０と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ｖ３９Ａ／Ｋ１１５Ｅ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｌ３８１Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｍ１４７Ａ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｇ２４８Ｃ／Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｙ３７８Ｅ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｌ３８１Ｇ；Ｖ３９Ａ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｖ３９Ａ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｍ１３３Ｒ／Ｌ３８１Ｇ／Ｃ５６５Ｎ；Ｍ１３３Ｒ／Ｃ５０３Ｑ；Ｙ３７８Ｄ／Ｃ５０３Ｑ；Ｙ３７８Ｅ／Ｆ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；Ｌ３８１Ｇ／Ｆ４７２ＧＣ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎ；および／またはＦ４７２Ｇ／Ｃ５０３Ｑ／Ｃ５６５Ｎのうち１種または複数から選択される、項目１０および／または１１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２０）
ａ）参照配列の配列番号２６またはその機能的断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号２６またはその機能的断片と比較した少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含むポリペプチド配列を含み、ｃ）該参照配列の配列番号２６と比較してｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）タンパク質分解に対する低下した感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、ｖ）低下した免疫原性、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）もしくはｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２１）
参照配列の配列番号２６に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号２６と比較した少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含み、配列番号２６と比較して増強された触媒活性、タンパク質分解に対する低下した感受性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、低下した凝集および／または低下した免疫原性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２２）
配列番号２６と比較した前記アミノ酸残基の差異が、次の置換または置換セット：Ａ２４Ｅ／Ｇ３８１Ｌ；Ｌ１２７Ｖ；Ａ１２９Ｉ／Ｖ；Ｓ１３１Ｃ／Ｔ；Ｈ１３２Ｌ／Ｓ；Ｒ１３４Ｃ／Ｆ／Ｈ／Ｋ；Ｒ１３４Ｈ／Ｙ３７８Ｅ／Ｇ３８１Ｌ；Ｒ１３４Ｈ／Ｙ３７８Ｅ／Ｇ３８１Ｌ／Ｖ３８８Ｔ；Ｒ１３４Ｈ／Ｖ３８８Ｔ；Ａ１３６Ｋ；Ａ２８９Ｓ；Ｍ３７２Ｌ；Ｈ３７４Ｇ／Ｍ／Ｑ；Ｇ３８１Ａ／Ｃ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；Ａ３８３Ｃ／Ｍ；Ｖ３８８Ｃ／Ｔ；Ｌ４３１Ｍ；および／またはＬ５６３Ｍのうち１種または複数から選択される、項目２０および／または２１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２３）
参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有する、先行する項目のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目２４）
参照配列の配列番号４に対し少なくとも約９５％の配列同一性を有する、項目２３に記載の操作されたポリペプチド。
（項目２５）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２６）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６、またはこれらの機能的断片に対し少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２５に記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２７）
表２－１から表２－５および／または表９－１から表９－７のいずれかに示されているバリアントＰＡＬである、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２８）
Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ酵素である、項目１～２７のいずれかに記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２９）
熱安定的である、項目１～２８のいずれかに記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目３０）
タンパク質分解に対し抵抗性である、項目１～２９のいずれかに記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目３１）
少なくとも１種の消化管酵素によるタンパク質分解に対し抵抗性である、項目３０に記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目３２）
キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼおよび／またはエラスターゼによるタンパク質分解に対し抵抗性である、項目３１に記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目３３）
酸安定的である、項目１～３２のいずれかに記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目３４）
脱免疫化されている、項目１～３３のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目３５）
配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４および／または２６に対し少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の脱免疫化された操作されたポリペプチド。
（項目３６）
精製されている、項目１～３５のいずれかに記載の操作されたポリペプチド。
（項目３７）
先行する項目１～３６のいずれか一項に記載の少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
（項目３８）
制御配列に作動可能に連結されている、項目３７に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目３９）
前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、項目３７および／または３８に記載のポリヌクレオチド配列。
（項目４０）
項目３７～３９のいずれかに記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド配列と、少なくとも１種の制御配列とを含む発現ベクター。
（項目４１）
前記制御配列が、プロモーターである、項目４０に記載の発現ベクター。
（項目４２）
前記プロモーターが、異種プロモーターである、項目４１に記載の発現ベクター。
（項目４３）
項目３５～３７のいずれかに記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド配列および／または項目４０～４２のいずれかに記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（項目４４）
Ｅ．ｃｏｌｉである、項目４３に記載の宿主細胞。
（項目４５）
宿主細胞において操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、少なくとも１種の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドが産生されるように適した培養条件下で、項目１～３６のいずれかに記載のＰＡＬ活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド、および／または項目３７および／または３９に記載の少なくとも１種のポリヌクレオチド配列、および／または項目４０～４２のいずれかに記載の少なくとも１種のベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む方法。
（項目４６）
培養物および／または宿主細胞から、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
産生されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を有する前記少なくとも１種の操作されたポリペプチドを精製するステップをさらに含む、項目４６に記載の方法。（項目４８）
項目１～３６のいずれかに記載のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む組成物。
（項目４９）
医薬組成物である、項目４８に記載の組成物。
（項目５０）
少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤および／または担体をさらに含む、項目４９に記載の医薬組成物。
（項目５１）
フェニルケトン尿症の処置に適した、項目４８～５０のいずれかに記載の組成物。
（項目５２）
ヒトへの経口投与に適した、項目４９～５１のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目５３）
丸剤、錠剤、カプセル、ジェルキャップ、液体またはエマルションの形態である、項目４９～５２のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目５４）
前記丸剤、錠剤、カプセルまたはジェルキャップが、腸溶コーティングをさらに含む、項目５３に記載の医薬組成物。
（項目５５）
ヒトへの非経口的注射に適した、項目４９～５１のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目５６）
少なくとも１種の追加的な治療上有効な化合物と同時投与される、項目４９～５５のいずれかに記載の医薬組成物。
（項目５７）
少なくとも１種の追加的な治療上有効な化合物を含む、項目５６に記載の医薬組成物。（項目５８）
対象におけるフェニルケトン尿症の症状を処置および／または防止するための方法であって、フェニルケトン尿症を有する対象を用意するステップと、項目４９～５７のいずれかに記載の医薬組成物を前記対象に与えるステップとを含む方法。
（項目５９）
フェニルケトン尿症の前記症状が寛解される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記対象が、項目１～３６に表記されているフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）活性を有する少なくとも１種の操作されたポリペプチドを含む少なくとも１種の医薬組成物を与えられなかった対象に必要とされる食事よりも、メチオニン、フェニルアラニンおよび／またはチロシン含量が制限されない食事を摂ることができる、項目５８および／または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記対象が、乳児または小児である、項目５８～６０のいずれかに記載の方法。
（項目６２）
前記対象が、成人または若年成人である、項目５８～６０のいずれかに記載の方法。
（項目６３）
項目４８～５７のいずれかに示されている組成物の使用。

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1-1】図１は、野生型ＰＡＬタンパク質配列のアライメントを提示する：Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＰＡＬ（ＮＣＢＩ ＹＰ＿３２４４８８．１（配列番号４））；Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅフェニルアラニン／ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＮｐＰＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００１８６５６３１．１（配列番号３０）；Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＲｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７０５６０９６．１（配列番号３１）；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「Ｏｓｐ ＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿０７１０８４８２．１（配列番号３２）；およびＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＧｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７１２７０５４．１）（配列番号３３）。

【0064】

【図1-2】図１は、野生型ＰＡＬタンパク質配列のアライメントを提示する：Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＰＡＬ（ＮＣＢＩ ＹＰ＿３２４４８８．１（配列番号４））；Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅフェニルアラニン／ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＮｐＰＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００１８６５６３１．１（配列番号３０）；Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＲｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７０５６０９６．１（配列番号３１）；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「Ｏｓｐ ＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿０７１０８４８２．１（配列番号３２）；およびＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＧｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７１２７０５４．１）（配列番号３３）。

【0065】

【図2】図２Ａは、実施例４にさらに記載されている通りの、野生型ＡｖＰＡＬと比較した、バリアント番号２２（配列番号８）、バリアント番号３０（配列番号６）およびバリアント番号３６（配列番号１０）に関するｐＨ７．０で検査したタンパク質分解に対する低下した感受性（キモトリプシンおよびトリプシン耐性として発現）を示す。図２Ｂは、実施例４にさらに記載されている通りの、野生型ＡｖＰＡＬと比較した、バリアント番号２２、３０および３６に関するｐＨ４．０～５．２で検査した酸性ｐＨに対する増加した耐性を示すグラフを提示する。

【0066】

【図3】図３は、野生型ＰＡＬおよびバリアント番号３６のＫ_Ｍ結果を提示する。

【0067】

【図4】図４は、野生型ＰＡＬおよびバリアント番号３６のアミノ酸特異性を示すデータを提示する。

【0068】

【図5】図５は、ヒトキモトリプシンおよびトリプシンに曝露された野生型ＰＡＬおよびバリアント番号３６の相対的安定性を示す結果を提示する。

【0069】

【図6】図６は、ブタ膵臓抽出物に曝露された野生型ＰＡＬならびにバリアント番号３６、４２および４３の相対的安定性を示す結果を提示する。

【図7】 図７は、実施例５について得られた結果を示すグラフを提示する。

【図8】 図８は、実施例８について得られた結果を示すグラフを提示する。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチド、その突然変異体、生物学的活性を有する断片および類似体、ならびにこれを含む医薬および産業的組成物を提供する。

【0071】

本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、増強された触媒活性と共に、タンパク質分解に対する低下した感受性および酸性ｐＨレベルに対する増加した耐性をもたらすよう最適化される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、脱免疫化されている。本発明は、治療および産業目的のための、操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物の使用にも関する。

【0072】

略語および定義：
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書に使用されている命名法ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室の手順は、周知であり、本技術分野において一般的に用いられている。斯かる技法は周知であり、当業者に周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

【0073】

本明細書に記載されているものと同様または均等のいかなる適した方法および材料も、本発明の実施における使用を見出すが、一部の方法および材料を本明細書に記載する。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によってこれらが使用される文脈に応じて変動し得るため、本発明が、記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。したがって、このすぐ下に定義されている用語は、本願を全体として参照することにより、より十分に説明される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

【0074】

また、本明細書において、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそれ以外の事柄を明らかに示さない限り、複数の参照を含む。

【0075】

数の範囲は、範囲を規定する数を包括する。よって、本明細書に開示されている全ての数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記述されているかのように、より広い数値範囲内に収まるより狭い数値範囲を全て包含するよう企図される。本明細書に開示されている全ての最大（または最小）数値限界が、下限（または上限）の数値限界が本明細書に明確に記述されているかのように、全ての下限（または上限）の数値限界を含むことも企図される。

【0076】

用語「約」は、特定の値に許容される誤差を意味する。一部の事例において、「約」は、所定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の事例において、「約」は、所定の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。

【0077】

さらに、本明細書に提示されている見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本願を全体として参照することにより分かる。したがって、このすぐ下に定義されている用語は、本願を全体として参照することにより、より十分に定義される。にもかかわらず、本発明の理解を助けるために、多数の用語を下に定義する。

【0078】

他に断りがなければ、それぞれ、核酸は、５’から３’の向きで左から右に書かれる；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで左から右に書かれる。

【0079】

本明細書において、用語「を含む（comprising）」およびその同族言語は、その包括的な意味において使用される（即ち、用語「含む（including）」およびその相当する同族
言語と均等）。

【0080】

「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会（Nomenclature Committee
of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学的分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素の数的分類体系である。

【0081】

「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。

【0082】

「ＮＣＢＩ」は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biological Information）およびそれに提供される配列データベースを指す。

【0083】

本明細書において、用語「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチド」は、芳香族アミノ酸リアーゼファミリー内の酵素のクラスを指し（ＥＣ４．３．１．２３、ＥＣ４．３．１．２４およびＥＣ４．３．１．２５）、このファミリーは、ヒスチジンアンモニアリアーゼおよびチロシンアンモニアリアーゼも含む。一部のＰＡＬ酵素は、フェニルアラニンと同様にチロシンを基質として使用することができるため、ＰＡＬポリペプチドは、フェニルアラニン／チロシンアンモニアリアーゼと称されることもある。しかし、本明細書に開示および請求されているＡｖＰＡＬおよびバリアントは、基質としてチロシンを使用しない。ＰＡＬポリペプチドは、Ｌ－フェニルアラニンからトランス－桂皮酸およびアンモニアへの変換を触媒する。ＰＡＬ活性は、ＰＡＬポリペプチドの酵素活性を指す。一部の好ましい実施形態において、ＰＡＬ酵素は、補助因子３，５－ジヒドロ－５－メチリデン－４Ｈ－イミダゾール－４－オン（ＭＩＯ）も含有する。この補助因子は、触媒活性に要求される場合があり、保存された活性部位Ａｌａ１６７－Ｓｅｒ１６８－Ｇｌｙ１６９トリペプチドセグメントの環化および脱水によって形成される。

【0084】

「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわりなく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを表示するよう、本明細書において互換的に使用される。

【0085】

「アミノ酸」は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）によって推奨される、その一般的に公知の３文字記号
または１文字記号のいずれかで言及されている。ヌクレオチドも同様に、その一般的に受け入れられた一文字コードで言及することができる。

【0086】

用語「操作された」、「組換え」、「非天然起源の」および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、他の仕方では自然に存在しない様式で修飾されたまたはそれと同一であるが産生されたまたは合成材料に由来するおよび／または組換え技法を使用した操作による、材料または該材料の天然もしくはネイティブ型に相当する材料を指す。

【0087】

本明細書において、「野生型」および「天然起源の」は、自然に存在する形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然における供給源から単離することができる、ヒトの操作によって意図的に修飾されていない、生物に存在する配列である。

【0088】

「脱免疫化」は、本明細書において、野生型または参照タンパク質ほど免疫原性ではないバリアントを作製するためのタンパク質の操作を指す。一部の実施形態において、バリアントタンパク質が、該バリアントタンパク質が投与された患者における免疫応答を刺激しないという点において、脱免疫化は完全である。この応答は、タンパク質の投与による中和（即ち、抗薬物抗体）の存在もしくは存在量、アナフィラキシー応答の存在、またはサイトカイン放出の普及もしくは強度等が挙げられるがこれらに限定されない、様々な方法によって測定することができる。一部の実施形態において、バリアントタンパク質は、野生型または参照タンパク質よりも免疫原性が低い。一部の実施形態において、脱免疫化は、Ｔ細胞受容体によって認識されるタンパク質（例えば、エピトープ）の修飾に関与する。一部の実施形態において、脱免疫化されたバリアントタンパク質を産生するために、Ｔ細胞エピトープが、野生型または参照タンパク質から除去される。一部の実施形態において、脱免疫化されたタンパク質は、樹状細胞Ｔ細胞活性化アッセイまたはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ペプチド結合アッセイを含む、ヒト免疫学的応答の生化学的および細胞生物学的予測因子においてより低いレベルの応答を示す。

【0089】

「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の部分（例えば、遺伝子）を指す。

【0090】

用語「パーセント（％）の配列同一性」は、本明細書において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すよう使用され、比較ウィンドウにわたり２種の最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適アライメントのための参照配列と比較して付加または欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列に同一核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。あるいは、パーセンテージは、両方の配列に同一核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、あるいは核酸塩基またはアミノ酸残基がギャップと共に整列されて、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、この結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。当業者であれば、２配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、本技術分野において公知の通り、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math.、２巻：４８２頁［１９８１年］）、Ｎｅｅｄｌ
ｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８巻：４４３頁［１９７０年］）、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性探索方法（PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：２
４４４頁［１９８８年］）、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理された実行（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査により行うことができる。パーセントの配列同一性および配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例として、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム（例えば、Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３～４１０頁［１９９０年］；およびAltschulら、Nucleic Acids
Res.、３３８９～３４０２頁［１９７７年］を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）ウェブサイトによって
公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列における同じ長さのワードと整列すると、ある正の値の閾値スコア「Ｔ」にマッチするまたは満たす、問い合わせ配列における長さ「Ｗ」の短いワードを同定することによる、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）の同定に関与する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Altschulら、上記参照）。このような初期近隣ワードヒットは、これを含有するより長いＨＳＰを発見するための探索を開始するためのシーズとして作用する。次に、ワードヒットは、累積的アライメントスコアが増加できるところまで、各配列に沿って両方向に伸長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータ「Ｍ」（マッチする残基ペアのための報酬スコア；常に＞０）および「Ｎ」（ミスマッチ残基のための罰則スコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列に関して、スコアリングマトリックスを使用して、累積的スコアを計算する。累積的アライメントスコアが、その最大達成値から含量「Ｘ」だけ離れる；１または複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積により、累積的スコアがゼロまたはそれを下回る；あるいはいずれかの配列の終わりに達した場合に、各方向におけるワードヒットの伸長は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、予想（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のため、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、予想（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（例えば、HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻：１０９１５頁［１９８９年］を参照）を使用する。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されているデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ウィスコンシン州マディソン）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。

【0091】

「参照配列」は、配列比較のための基盤として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大型の配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントとなり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さであるまたは核酸もしくはポリペプチドの全長である。２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２配列の間で類似の配列（即ち、完全配列の一部）を含むことができ、（２）２配列間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、２種（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、「比較ウィンドウ」にわたり２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより典型的に行われる。一部の実施形態において、「参照配列」は、参照配列が一次配列に１個または複数の変化を有し得る配列である、一次アミノ酸配列に基づくことができる。例えば、語句「Ｘ３９に相当する残基にバリンを有する配列番号４に基づく参照配列」は、配列番号４における位置Ｘ３９における相当する残基（例えば、アラニン）がバリンに変化した参照配列を指す。

【0092】

「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の近接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウにおける配列の一部は、２配列の最適アライメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれに満たない付加または欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の近接残基よりも長くなることができ、任意選択で３０、４０、５０、１００またはそれよりも長いウィンドウを含む。

【0093】

「に相当する」、「を参照」および「と比べて」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用される場合、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される際の指定の参照配列の残基のナンバリングを指す。換言すると、所定のポリマーの残基数または残基位置は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなく、参照配列に関して命名される。例えば、操作されたＰＡＬの配列等、所定のアミノ酸配列は、ギャップを導入して、２配列間の残基マッチを最適化することにより、参照配列と整列することができる。このような場合、ギャップが存在していても、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、それと整列された参照配列に関して為される。

【0094】

「アミノ酸の差異」および「残基の差異」は、参照配列の相当する位置におけるアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は一般に、本明細書において、「Ｘｎ」（式中、ｎは、残基の差異が基づく参照配列における相当する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号４と比較した位置Ｘ９１における残基の差異」は、配列番号４の位置９１に相当するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。よって、配列番号４の参照ポリペプチドが、位置９１にアラニンを有する場合、「配列番号４と比較した位置Ｘ９１における残基の差異」は、配列番号４の位置９１に相当するポリペプチドの位置におけるアラニン以外のいずれかの残基のアミノ酸置換を指す。本明細書における大部分の事例において、ある位置における特異的なアミノ酸残基の差異は、「ＸｎＹ」（式中、「Ｘｎ」は、参照ポリペプチドの相当する残基および位置を指定し（上述通り）、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに存在するアミノ酸の一文字識別子である（即ち、参照ポリペプチドのものとは異なる残基））と示す。一部の事例において（例えば、実施例中の表における）、本開示は、従来の表示法「ＡｎＢ」（式中、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の数であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である）によって表示される、特異的なアミノ酸の差異も提示する。一部の事例において、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１個または複数のアミノ酸残基の差異を含むことができ、これは、参照配列と比べて残基の差異が存在する指定の位置のリストによって示される。一部の実施形態において、ポリペプチドの特異的な残基位置において２種以上のアミノ酸が使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」によって隔てられる（例えば、Ｘ３０７Ｇ／Ｘ３０７ＱまたはＸ３０７Ｇ／Ｑ）。本開示は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか一方／または両方を含む、１個または複数のアミノ酸の差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。

【0095】

用語「アミノ酸置換セット」および「置換セット」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。一部の実施形態において、置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、置換セットは、実施例中の表のいずれかに収載されているバリアントＡｖＰＡＬポリペプチドのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。例えば、バリアント３６に存在する置換セットは、Ａ３９Ｖ／Ａ９１Ｖ／Ｎ２９０Ｇ／Ｈ３０７Ｇ／Ｌ４０７Ｖ／Ｔ５２４Ｓであり、アミノ酸位置は、配列番号４と比べたものである。

【0096】

「保存的アミノ酸置換」は、同様の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、よって、典型的に、同じまたは同様の定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸による、ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換に関与する。限定するのではなく例として、脂肪族側鎖内のアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）と置換することができ；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびスレオニン）と置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）と置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性（basis）側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）と
置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換され；疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸に置き換えられる。

【0097】

「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸による、ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換の区域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに対しプロリン）；（ｂ）電荷もしくは疎水性；および／または（ｃ）側鎖の体積に影響を与え得る。限定するのではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸に置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸に置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸に置換された親水性アミノ酸を含む。

【0098】

「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドの修飾を指す。欠失は、酵素活性を保持しつつ、および／または操作されたトランスアミナーゼ酵素の改善された特性を保持しつつ、参照酵素を構成する１個もしくはそれを超えるアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸総数の最大１０％またはアミノ酸総数の最大２０％の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とすることができる。様々な実施形態において、欠失は、連続的セグメントを含むことができる、あるいは不連続となり得る。

【0099】

「挿入」は、参照ポリペプチドへの１個または複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分において為しても、カルボキシまたはアミノ末端に為してもよい。挿入は、本明細書において、本技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の近接セグメントであっても、天然起源のポリペプチドにおける１個または複数のアミノ酸に隔てられてもよい。

【0100】

用語「機能的断片」および「生物学的活性を有する断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失（複数可）および／または内部欠失を有するが、残るアミノ酸配列が、これと比較されている配列（例えば、本発明の全長の操作されたＰＡＬ）における相当する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性を実質的に全て保持する、ポリペプチドを指すよう本明細書において互換的に使用される。

【0101】

「単離されたポリペプチド」は、天然においてはこれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然起源の環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包接する。組換えＰＡＬポリペプチドは、細胞内に存在し得る、細胞培地に存在し得る、あるいはライセートまたは単離された調製物等、様々な形態で調製され得る。そのようなものとして、一部の実施形態において、本明細書に提示されている組換えＰＡＬポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。

【0102】

「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である（即ち、モル濃度または重量基盤で、組成物中の他のいかなる個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、対象種が、モルまたは％重量で存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、一般に、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＰＡＬ組成物は、モルまたは％重量で組成物中に存在する全高分子種の約６０％またはそれ超、約７０％またはそれ超、約８０％またはそれ超、約９０％またはそれ超、約９５％またはそれ超および約９８％またはそれ超を構成することになる。一部の実施形態において、対象種は、本質的均一性となるまで（即ち、従来の検出方法によって組成物中に夾雑物種を検出できなくなるまで）精製され、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種と考慮されない。一部の実施形態において、単離された組換えＰＡＬポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。

【0103】

「改善された酵素特性」は、野生型ＰＡＬポリペプチド（例えば、配列番号４を有するＡｖＰＡＬ野生型）または別の操作されたＰＡＬポリペプチド等、参照ＰＡＬポリペプチドと比較していずれかの酵素特性における改善を示す、操作されたＰＡＬポリペプチドを指す。改善された特性として、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性および／または親和性、増加した特異的活性、基質および／または最終産物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された官能基選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（即ち、タンパク質分解に対する低下した感受性）、低下した凝集、増加した溶解度、低下した免疫原性ならびに変更された温度プロファイル等の特性が挙げられるがこれらに限定されない。

【0104】

「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたＰＡＬポリペプチドの改善された特性を指し、これは、参照ＰＡＬ酵素（例えば、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の操作されたＡｖＰＡＬ）と比較した、特異的活性（例えば、産生される産物／時間／重量タンパク質）の増加および／または基質から産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定された量のＰＡＬを使用した指定された期間における基質の出発量から産物へのパーセント変換）によって表すことができる。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提示されている。その変化が酵素活性の増加をもたらし得る、Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいかなる特性が影響されてもよい。酵素活性における改善は、相当する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、ＰＡＬポリペプチドが由来する天然起源のＰＡＬまたは別の操作されたＰＡＬの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超える大きさの酵素活性となり得る。

【0105】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、少なくとも０．１／秒、少なくとも０．２／秒、少なくとも０．３／秒、少なくとも０．５／秒、少なくとも１．０／秒、一部の好ましい実施形態においては、１．０／秒を超えるｋ_ｃａｔを有する。一部の実施形態において、Ｋ_ｍは、約１μｍ～約５ｍＭの範囲内；約５μｍ～約２ｍＭの範囲内；約１０μｍ～約２ｍＭの範囲内；または約１０μｍ～約１ｍＭの範囲内である。一部の特異的な実施形態において、操作されたＰＡＬ酵素は、参照ＰＡＬ酵素の１．５～１０倍、１．５～２５倍、１．５～５０倍、１．５～１００倍またはそれを超える範囲内の改善された酵素活性を示す。ＰＡＬ活性は、本技術分野において公知のいずれかの標準アッセイにより測定することができる（例えば、反応物または産物の分光光度的特性の変化をモニターすることにより）。一部の実施形態において、産生された産物の量は、直接的にまたはｏ－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化後に、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離により測定される。一部の実施形態において、酵素活性の比較は、本明細書において詳細にさらに記載されている通り、定義された酵素調製物、セット条件下の定義されたアッセイおよび１種または複数の定義された基質を使用して為される。一般に、ライセートが比較される場合、宿主細胞によって産生され、ライセート中に存在する酵素の量の変動を最小化するために、同一発現系および同一宿主細胞を使用すると共に、細胞の数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。

【0106】

用語「酸性ｐＨに対する改善された耐性」は、本発明に係る組換えＰＡＬが、参照ＰＡＬと比較して増加した安定性を示すことを意味する（即ち、指定された期間［１時間、最大２４時間］酸性ｐＨに曝露した後の、約ｐＨ７．０におけるより高い保持活性）。

【0107】

「生理的ｐＨ」は、本明細書において、対象（例えば、ヒト）の小腸に一般に存在するｐＨ範囲を意味する。通常、幽門弁から大腸へと、約６．０～７．５の範囲内の勾配ｐＨが存在する。

【0108】

酸性ｐＨ条件に対する改善された安定性または酸性ｐＨに対する増加した耐性に関して使用される用語「酸性ｐＨ」は、約１．５～６．８のｐＨ範囲を意味する。

【0109】

本明細書において互換的に使用される用語「タンパク質分解活性」および「タンパク質分解」は、タンパク質のより小型のポリペプチドまたはアミノ酸への分解を指す。タンパク質の分解は、一般に、プロテアーゼ（プロテイナーゼ）酵素によるペプチド結合の加水分解の結果である。プロテアーゼ酵素として、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ；カルボキシペプチダーゼＡおよびＢならびにペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0110】

語句「タンパク質分解に対する感受性を低下」および「タンパク質分解感受性を低下」は、本明細書において互換的に使用されており、本発明に係る操作されたＰＡＬポリペプチドが、１種または複数のプロテアーゼで処理した後に、標準アッセイ（例えば、実施例に開示）において参照ＰＡＬと比較してより高い酵素活性を有することになることを意味する。

【0111】

「凝集」は、ＰＡＬポリペプチドの集塊または沈殿を意味する。凝集は、酵素の不活性化をもたらし得る。用語「低下した凝集」は、操作されたＰＡＬポリペプチドが、参照ＰＡＬと比較して、凝集する傾向が少なくなることを意味する。凝集を評価するための方法が、本技術分野において公知であり、適切な色素（例えば、チオフラビンＴまたはナイルレッド）による蛍光顕微鏡の使用、動的光散乱、適切な色素（例えば、ボディパイ）によるフローサイトメトリー、濾過ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロッティングによる分析、蛍光相関分光測定、ならびに電子顕微鏡等が挙げられるがこれらに限定されない。凝集を評価するための市販のキットが存在する（例えば、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）タンパク質凝集アッセイキット［Ｅｎｚｏ］）。

【0112】

「変換」は、基質（複数可）から相当する産物（複数可）への酵素変換（または生体内変換）を指す。「パーセント変換」は、指定された条件下である期間内に産物へと変換される基質のパーセントを指す。よって、ＰＡＬポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特異的な期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。

【0113】

「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて変動するがより高いストリンジェンシーの洗浄が為される。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡに対し約６０％同一性、好ましくは、約７５％同一性、約８５％同一性、標的ポリヌクレオチドに対し約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に、標的ＤＮＡが結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Denhart）溶液、５×ＳＳＰＥ、０
．２％ＳＤＳにおける４２℃のハイブリダイゼーションと、続く０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける４２℃の洗浄に均等な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定される熱融解温度Ｔ_ｍから約１０℃またはそれより低い条件を指す。一部の実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおいて６５℃で安定的ハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（即ち、０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおける６５℃でハイブリッドが安定的でない場合、本明細書で考慮される高ストリンジェンシー条件下で安定的ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Denhart）溶液、５×ＳＳ
ＰＥ、０．２％ＳＤＳ、４２℃に均等な条件におけるハイブリダイゼーションと、続く０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにおける６５℃の洗浄により示すことができる。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおける６５℃のハイブリダイズに均等な条件におけるハイブリダイズおよび０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおける６５℃の洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と共に中程度にストリンジェントな条件は、上に引用されている参考文献に記載されている。

【0114】

「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が、特定の生物においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、該生物において優先的に使用されるコドンに変化させることを指す。「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれる複数のコドンによって大部分のアミノ酸が表されるという点において、遺伝暗号は縮重するが、特定の生物によるコドン使用が非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏向していることが周知である。このようなコドン使用の偏向は、所定の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質対低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集したタンパク質コード領域に関してより高くなり得る。一部の実施形態において、ＰＡＬ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化される。

【0115】

「制御配列」は、本明細書において、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なあらゆる構成成分を含むことを指す。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。斯かる制御配列として、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられるがこれらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーターならびに転写および翻訳終止シグナルを含む。一部の実施形態において、制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のリンカーと共に与えられる。

【0116】

「作動可能に連結」は、本明細書において、制御配列が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を方向づけるまたは調節するように、目的のポリヌクレオチドに応じた位置に制御配列が適切に（即ち、機能的関係性で）配置された構成として定義される。

【0117】

「プロモーター配列」は、コード配列等、目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示すいかなる核酸配列となることもでき、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

【0118】

「適した反応条件」は、本開示のＰＡＬポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することができる、酵素変換反応溶液における条件を指す（例えば、酵素ロード、基質ロードの範囲、温度、ｐＨ、バッファー、共溶媒等）。例示的な「適した反応条件」は、本明細書に提示されている（実施例を参照）。

【0119】

「化合物ロード」または「酵素ロード」等における「ロード」は、反応開始の際の反応混合物における構成成分の濃度または量を指す。酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ＰＡＬポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。酵素変換プロセスの文脈における「産物」は、基質におけるＰＡＬポリペプチドの作用に起因する化合物または分子を指す。

【0120】

本明細書において、用語「培養」は、いずれか適した培地（例えば、液体、ゲルまたは固体）を使用した、適した条件下での微生物細胞の集団の育成を指す。

【0121】

組換えポリペプチド（例えば、ＰＡＬ酵素バリアント）は、本技術分野において公知のいずれか適した方法を使用して産生することができる。例えば、当業者に周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法が存在する。加えて、多くの商業的分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットを入手することもできる。定義されたアミノ酸における特異的な置換（部位特異的）、遺伝子の局在化された領域における特異的もしくはランダム突然変異（領域（regio）特異的）または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発（例えば、飽
和突然変異誘発）を作製するための方法を利用することができる。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学的飽和突然変異誘発、または本技術分野において公知の他のいずれかの適した方法等が挙げられるがこれらに限定されない、酵素バリアントを作製するための多数の適した方法が当業者に公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作のために使用される方法の非限定例は、次の特許に示されている：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後に、バリアントは、いずれか所望の特性に関してスクリーニングすることができる（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低下した活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）。一部の実施形態において、「組換えＰＡＬポリペプチド」（本明細書において、「操作されたＰＡＬポリペプチド」、「バリアントＰＡＬ酵素」および「ＰＡＬバリアント」とも称される）は、使用を見出す。

【0122】

本明細書において、「ベクター」は、細胞にＤＮＡ配列を導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態において、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの適した宿主における発現をもたらすことができる適した制御配列に作動可能に連結した発現ベクターである。一部の実施形態において、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するために、ＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結したプロモーター配列を有し、一部の実施形態において、転写ターミネーター配列も含む。

【0123】

本明細書において、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾等が挙げられるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態において、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

【0124】

本明細書において、用語「産生」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語が、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾等が挙げられるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが企図される。一部の実施形態において、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

【0125】

本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）が、これと作動可能に連結した別の配列と自然において関連していない場合、この２配列は「異種」である。

【0126】

本明細書において、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書に提示されているＤＮＡ（例えば、少なくとも１種のＡｖＰＡＬバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターに適した宿主を指す。一部の実施形態において、宿主細胞は、本技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。

【0127】

用語「類似体」は、参照ポリペプチドと７０％を超える配列同一性だが１００％に満たない配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態において、類似体は、天然起源のアミノ酸と共に、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリン等が挙げられるがこれらに限定されない非天然起源のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、類似体は、１種または複数のＤ－アミノ酸残基と共に、２個またはそれを超えるアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。

【0128】

用語「治療薬」は、有益なまたは望ましい医学的効果を有する、病理の徴候または症状を示す対象に投与される化合物を指す。

【0129】

用語「医薬組成物」は、本発明に包含される薬学的有効量の操作されたＰＡＬポリペプチドと、許容される担体とを含む、哺乳動物対象（例えば、ヒト）における医薬品使用に適した組成物を指す。

【0130】

用語「有効量」は、所望の結果を生じるために十分な量を意味する。当業者であれば、ルーチン実験法を使用することにより有効量について決定することができる。

【0131】

用語「単離された」および「精製された」は、それと天然において関連する少なくとも１種の他の構成成分から除去された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求するものではなく、むしろ相対的な定義として企図される。

【0132】

用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマルおよび研究用動物（例えば、齧歯類およびウサギ目動物）等、哺乳動物を包含する。この用語は、雌と雄とを包含することが企図される。

【0133】

本明細書において、用語「患者」は、疾患を評価されている、これを処置されている、またはこれを経験しているいずれかの対象を意味する。

【0134】

用語「乳児」は、生後１カ月からおよそ一（１）歳の期間の小児を指す。本明細書において、用語「新生児」は、出生から生後２８日目の期間の小児を指す。用語「未熟児」は、妊娠期間満２０週目の後に、ただし満期の前に産まれた、一般に、出生時にほぼ５００～ほぼ２４９９グラムの体重の乳児を指す。「極低出生時体重乳児」は、出生時に１５００ｇ未満の体重の乳児である。

【0135】

本明細書において、用語「小児」は、処置または研究手順の同意のための法定年齢に達していない者を指す。一部の実施形態において、この用語は、出生時と青年期との間にある者を指す。

【0136】

本明細書において、用語「成人」は、関連する管轄権の法定年齢に達した者を指す（例えば、米国では１８歳）。一部の実施形態において、この用語は、いずれかの完全に成長し成熟した生物を指す。一部の実施形態において、用語「若年成人」は、１８歳未満の、ただし性的成熟に達した者を指す。

【0137】

本明細書において、「組成物」および「製剤」は、いずれか適した使用（例えば、医薬組成物、食物性／栄養性補助食品、飼料等）のために企図された、本発明の少なくとも１種の操作されたＰＡＬを含む産物を包含する。

【0138】

組成物の「投与」およびこれを「投与する」という用語は、本発明の組成物を対象（例えば、ＰＫＵの効果を患う者）に与えることを意味する。

【0139】

用語「担体」は、医薬組成物に関して使用される場合、安定剤、保存剤およびアジュバント等、標準医薬品担体、バッファーおよび賦形剤のいずれかを意味する。

【0140】

用語「薬学的に許容される」は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、またはこれが含有される構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく対象に投与することができ、所望の生物学的活性を保有する材料を意味する。

【0141】

本明細書において、用語「賦形剤」は、活性医薬品成分（ＡＰＩ；例えば、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチド）以外の、いずれかの薬学的に許容される添加物、担体、希釈剤、アジュバントまたは他の成分を指す。賦形剤は、典型的に、製剤化および／または投与目的のために含まれる。

【0142】

用語「治療有効量」は、疾患／状態の症状に関して使用される場合、疾患／状態の１種または複数の症状を寛解、減弱または排除する、あるいは症状（複数可）（例えば、ＰＫＵ）の発病を防止または遅延する、化合物（例えば、操作されたＰＡＬポリペプチド）の量および／または濃度を指す。一部の実施形態において、この用語は、研究者、医師、獣医師または他の臨床医によって探索される、組織、系または動物対象による生物学的（例えば、医学的）応答を誘発する組成物の量に関する使用である。

【0143】

用語「治療有効量」は、疾患／状態に関して使用される場合、疾患／状態を寛解、減弱または排除する、組成物の量および／または濃度を指す。

【0144】

用語「処置している」、「処置する」および「処置」は、防止的（例えば、予防的）および対症的処置を包含することが企図される。

【0145】

操作されたＰＡＬポリペプチド：
本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドが由来する親ＰＡＬポリペプチドは、Ａｎａｂａｅｎａ（例えば、Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、Ｎｏｓｔｏｃ（例えば、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓまたはＳ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．およびＲｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．等、細菌株を含む。これらの株に由来するＰＡＬ酵素が同定されており、周知のものである。Ａｎａｂａｅｎａ（Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ ２９４１３およびＮＣＢＩ ＹＰ＿３２４４８８．１；Ｎｏｓｔｏｃ（Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＡＴＣＣ ２９１３３およびＮＣＢＩ ＹＰ＿００１８６５６３．１；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ＰＣＣ ６５０６およびＮＣＢＩ ＺＰ＿０７１０８４８２．１ならびにＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．ＰＣＣ７４２８およびＮＣＢＩ ＹＰ＿００７１２７０５４．１由来の相同酵素配列を図１に示す。Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅフェニルアラニン／ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＮｐＰＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００１８６５６３１．１（配列番号３０）；Ｒｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＲｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７０５６０９６．１（配列番号３１）；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「Ｏｓｐ ＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿０７１０８４８２．１（配列番号３２）；およびＧｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐ．ヒスチジンアンモニアリアーゼ「ＧｓｐＨＡＬ」（ＮＣＢＩ ＹＰ＿００７１２７０５４．１）（配列番号３３）は、ＡｖＰＡＬ（配列番号４）と７０％を超える相同性を有する。

【0146】

さらに、特定のＰＡＬバリアント（即ち、操作されたＰＡＬポリペプチド）が、野生型ＰＡＬまたは参照ＰＡＬの配列における特定のアミノ酸残基の修飾の参照により言及される場合、均等な位置（複数可）（それぞれのアミノ酸配列間の任意選択のアミノ酸配列アライメントから決定される）において修飾された別のＰＡＬのバリアントが、本明細書に包含されることを理解されたい。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、上述の細菌株（即ち、Ｎｏｓｔｏｃ［Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ］、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ［Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ［Ｓ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓまたはＳ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ］、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ
ｓｐ．、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ ｓｐおよびＲｉｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．）に収載されているポリペプチドのうちいずれか１種に由来する。一部の追加的な実施形態において、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、保存された活性部位Ａｌａ１６７－Ｓｅｒ１６８－Ｇｌｙ１６９を含み、配列番号４に対し少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＰＡＬ活性を含むだけではなく、チロシンおよび／またはヒスチジン基質における活性も含む。

【0147】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、少なくとも１種の操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む微生物を、操作されたＰＡＬポリペプチドの産生の助けになる条件下で培養することにより産生される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、その結果得られた培養培地および／または細胞からその後回収される。

【0148】

本発明は、ＰＡＬ活性を有する例示的な操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。実施例は、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能活性と特異的アミノ酸配列特色を相関させる、配列構造情報を示す表を提供する。この構造－機能相関情報は、配列番号４の参照の操作されたポリペプチドと比べた特異的アミノ酸残基の差異と共に、例示的な操作されたＰＡＬポリペプチドの関連する実験的に決定された活性データの形態で提供される。

【0149】

一部の実施形態において、ＰＡＬ活性を有する本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ａ）参照配列の配列番号４に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；ｂ）１個または複数のアミノ酸位置における配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を含み、ｃ）参照配列と比較してｉ）増強された触媒活性、ｉｉ）低下したタンパク質分解感受性、ｉｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性、ｉｖ）低下した凝集、またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）もしくはｉｖ）のいずれかの組合せから選択される改善された特性を示す。

【0150】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、１個または複数のアミノ酸位置（配列番号４、または配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、１個または複数の位置における配列番号４と比較した残基の差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、実施例に提示されている表に収載されたポリペプチドである。

【0151】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、１個または複数のアミノ酸位置における配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異は、配列番号４のアミノ酸配列と最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；Ｘ５６４；またはこれらのいずれかの組合せから選択される。一部の実施形態において、アミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個またはそれを超えるアミノ酸位置である。

【0152】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％（少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、位置Ｈ３０７におけるアミノ酸残基の差異と、任意選択で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の差異を含む。一部の実施形態において、位置３０７におけるアミノ酸残基の差異は、Ｈ３０７／Ｇ／Ｑ／Ｍである。

【0153】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％（少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、Ａ３９；Ｔ５４；Ｇ５９、Ｓ７３；Ａ９１；Ｙ１５８；Ｓ１８０；Ｋ１９５；Ａ１１２；Ｒ１３４；Ｑ２４０；Ｔ２４３；Ｉ２４５；Ａ２５６；Ｌ２５７；Ｎ２７０；Ｎ２９０；Ｙ３０４；Ｒ３０５；Ｈ３０７；Ｅ３０８；Ｉ３２６；Ｌ３４９；Ｄ３５３；Ｌ３６４；Ａ３９４；Ｓ３９９；Ｎ４００；Ｐ４０４；Ｌ４０７；Ｆ４４３；Ｎ４５３；Ｙ４５９；Ｔ４６０；Ｔ４６３；Ｎ４７４；Ｅ５０９；Ｑ５２１；Ｋ５２２；Ｔ５２４；Ｐ５２８；Ｓ５４６；および／またはＰ５６４のうち１種または複数の組合せから選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の差異を含む。一部の追加的な実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置に、アミノ酸残基の差異が存在する。

【0154】

一部の実施形態において、改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％（少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、配列番号４と最適に整列された場合、Ａ３９Ｖ；Ｔ５４Ｋ；Ｇ５９Ｒ；Ｓ７３Ｋ；Ａ１１２Ｃ；Ｒ１３４Ｑ；Ａ９１Ｖ；Ｙ１５８Ｈ；Ｓ１８０Ａ；Ｋ１９５Ｅ；Ｑ２４０Ｒ／Ｗ；Ｔ２４３Ｉ／Ｌ；Ｉ２４５Ｌ；Ａ２５６Ｇ；Ｌ２５７Ｗ／Ａ；Ｎ２７０Ｋ；Ｎ２９０Ｇ；Ｙ３０４Ｈ；Ｒ３０５Ｍ；Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ；Ｅ３０８Ｑ；Ｉ３２６Ｆ；Ｌ３４９Ｍ；Ｄ３５３Ａ／Ｎ；Ｌ３６４Ｑ；Ａ３９４Ｖ；Ｓ３９９Ｎ；Ｎ４００Ｋ；Ｐ４０４Ａ；Ｌ４０７Ｖ；Ｆ４４３Ｈ；Ｎ４５３Ｇ；Ｙ４５９Ｆ；Ｔ４６０Ｇ；Ｔ４６３Ｎ；Ｎ４７４Ｑ；Ｅ５０９Ｌ；Ｑ５２１Ｋ／Ｓ；Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ；Ｔ５２４Ｓ；Ｐ５２８Ｌ；Ｓ５４６Ｒ；およびＰ５６４Ｇ／Ｌ／Ｍのうち１種または複数の組合せから選択されるアミノ酸残基の差異を含む。

【0155】

一部の実施形態において、アミノ酸残基の差異は、配列番号４と最適に整列された場合、Ａ３９Ｖ；Ａ９１Ｖ；Ａ２５６Ｇ；Ｎ２９０Ｇ；Ａ３９４Ｖ；Ｓ３９９Ｎ；Ｐ４０４Ａ；Ｌ４０７Ｖ；Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ；および／またはＴ５２４Ｓのうち１種または複数の組合せから選択される。

【0156】

一部の実施形態において、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態において、機能的断片は、これが由来する操作されたＰＡＬポリペプチド（即ち、親操作されたＰＡＬ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を構成する。一部の実施形態において、機能的断片は、操作されたＰＡＬの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を構成する。一部の実施形態において、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満および５０個未満のアミノ酸がトランケートされることになる。

【0157】

一部の実施形態において、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態において、機能的断片は、これが由来する操作されたＰＡＬポリペプチド（即ち、親操作されたＰＡＬ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を構成する。一部の実施形態において、機能的断片は、操作されたＰＡＬの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を構成する。一部の実施形態において、機能的断片は、５個未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満または７０個未満のアミノ酸がトランケートされることになる。

【0158】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号６、または配列番号６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号６と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号６に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号６と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号６の配列からなる。

【0159】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１０またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１０、または配列番号１０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１０と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１０に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１０と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１０の配列からなる。

【0160】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１２、または配列番号１２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１２に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１２と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１２の配列からなる。

【0161】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１４、または配列番号１４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１４に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１４と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１４の配列からなる。

【0162】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１６、または配列番号１６と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１６と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１６に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１６と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１６の配列からなる。

【0163】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１８、または配列番号１８と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１８と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１８に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１８と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１８の配列からなる。

【0164】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２０またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号２０、または配列番号２０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号２０と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号２０に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号２０と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２０の配列からなる。

【0165】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２２またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号２２、または配列番号２２と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号２２と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号２２に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号２２と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２２の配列からなる。

【0166】

一部の実施形態において、少なくとも１種の改善された特性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２４またはその機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号２４、または配列番号２４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号２４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号２４と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号２４の配列からなる。

【0167】

タンパク質分解に対する低下した感受性を有するバリアント：
一部の実施形態において、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＰＡＬ活性を有し、タンパク質分解に対する低下した感受性を示し、ａ）参照配列の配列番号４に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；およびｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を含む。

【0168】

一部の実施形態において、タンパク質分解に対する低下した感受性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、１個または複数のアミノ酸位置（配列番号４、または配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。

【0169】

一部の実施形態において、タンパク質分解に対する低下した感受性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号４のアミノ酸配列と最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；Ｘ５６４；またはこれらのいずれかの組合せから選択される１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、アミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個またはそれを超えるアミノ酸位置である。

【0170】

一部の実施形態において、タンパク質分解に対する低下した感受性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％、少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、位置Ｘ３０７；Ｘ３２６；Ｘ４６０；Ｘ３０７；および／またはＸ５２８におけるアミノ酸残基の差異、ならびに任意選択で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の差異を含む。一部の実施形態において、アミノ酸残基の差異は、配列番号４と整列された場合、Ｙ３０４Ｈ／Ｗ；Ｒ３０５Ｌ／Ｍ；Ｈ３０７Ｇ／Ｍ／Ｑ；Ｉ３２６Ｆ；Ｑ２４０Ｗ；Ｔ４６０Ｇ；Ｐ５２８Ｌ；および組合せたこれらの置換のいずれかから選択される。

【0171】

一部の実施形態において、タンパク質分解に対する低下した感受性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４、またはこれらの機能的断片のうちいずれかと少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４、あるいは配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置の、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４と比較したアミノ酸の差異を含む。一部の実施形態において、ＰＡＬは、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および／または２４の配列を含むまたはこれからなる。

【0172】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドのタンパク質分解感受性は、野生型ＰＡＬ（例えば、配列番号４を有するＡｖＰＡＬ）の、または基本的に同じ条件下で参照ＰＡＬポリペプチドと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低下する。タンパク質分解活性は、実施例に記載されている方法等が挙げられるがこれらに限定されない、本技術分野において公知のいずれか適した方法を使用して測定することができる。

【0173】

一部の実施形態において、参照ＰＡＬおよび低下した感受性を有する操作されたＰＡＬの両方が比較され、基本的に同じ条件下で基本的に同じ量および種類のプロテアーゼに曝露される場合、タンパク質分解に対する低下した感受性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、ペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼおよびエンテロペプチダーゼ）等が挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数のプロテアーゼを含む組成物に対する低下した感受性を有する。

【0174】

一部の実施形態において、タンパク質分解に対する低下した感受性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、参照ＰＡＬ（例えば、ＡｖＰＡＬ）の酵素活性の約１．０倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超える酵素活性レベルを有する。一部の実施形態において、活性が、４．５～７．５のｐＨ範囲において測定される場合；活性が、４．５～６．５のｐＨ範囲において測定される場合；活性が、５．０～７．５のｐＨ範囲において測定される場合；活性が、５．０～６．５のｐＨ範囲において測定される場合；活性が、５．５～７．５のｐＨ範囲において測定される場合；および／または同様に活性が、５．５～６．５のｐＨ範囲において測定される場合、操作されたポリペプチドは、参照ＰＡＬと比較してより大きい酵素活性を有する。一部の他の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、１μＭ～５ｍＭの範囲内のＫ_ｍ値を有する。

【0175】

酸性ｐＨに対する増加した耐性を有するバリアント：
一部の実施形態において、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＰＡＬ活性を有し、酸性ｐＨレベルに耐容性を示し、ａ）参照配列の配列番号４またはその断片に対し少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；およびｂ）１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を含む。

【0176】

一部の実施形態において、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の参照ポリペプチドと比較して酸性ｐＨに対する増加した耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号４、または配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列と比較した１個または複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０個またはそれを超えるアミノ酸位置等）に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。

【0177】

一部の実施形態において、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の参照ポリペプチドと比較して酸性ｐＨに対する増加した耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有し、配列番号４のアミノ酸配列と最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；Ｘ５６４；またはこれらのいずれかの組合せから選択される１個または複数のアミノ酸位置に、配列番号４と比較したアミノ酸残基の差異を有する。一部の実施形態において、アミノ酸の差異は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個またはそれを超えるアミノ酸位置である。

【0178】

一部の実施形態において、野生型ＡｖＰＡＬおよび／または別の参照ポリペプチドと比較して酸性ｐＨに対する増加した耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％、少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、位置Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；Ｘ５６４；またはこれらのいずれかの組合せにおけるアミノ酸残基の差異；および任意選択で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の差異を含む。一部の実施形態において、アミノ酸残基の差異は、配列番号４と整列した場合、Ａ３９；Ｔ５４；Ｇ５９、Ｓ７３；Ａ９１；Ｙ１５８；Ｓ１８０；Ｋ１９５；Ａ１１２；Ｒ１３４；Ｑ２４０；Ｔ２４３；Ｉ２４５；Ａ２５６；Ｌ２５７；Ｎ２７０；Ｎ２９０；Ｙ３０４；Ｒ３０５；Ｈ３０７；Ｅ３０８；Ｉ３２６；Ｌ３４９；Ｄ３５３；Ｌ３６４；Ａ３９４；Ｓ３９９；Ｎ４００；Ｐ４０４；Ｌ４０７；Ｆ４４３；Ｎ４５３；Ｙ４５９；Ｔ４６０；Ｔ４６３；Ｎ４７４；Ｅ５０９；Ｑ５２１；Ｋ５２２；Ｔ５２４；Ｐ５２８；Ｓ５４６；および／またはＰ５６４である。一部の実施形態において、酸性ｐＨに対する増加した耐性を示す操作されたＰＡＬポリペプチドは、配列番号４に対し少なくとも８５％、少なくとも８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、配列番号４と整列された場合、１個または複数の位置Ａ３９Ｖ；Ｔ５４Ｋ；Ｇ５９Ｒ；Ｓ７３Ｋ；Ａ１１２Ｃ；Ｒ１３４Ｑ；Ａ９１Ｖ；Ｙ１５８Ｈ；Ｓ１８０Ａ；Ｋ１９５Ｅ；Ｑ２４０Ｒ／Ｗ；Ｔ２４３Ｉ／Ｌ；Ｉ２４５Ｌ；Ａ２５６Ｇ；Ｌ２５７Ｗ／Ａ；Ｎ２７０Ｋ；Ｎ２９０Ｇ；Ｙ３０４Ｈ；Ｒ３０５Ｍ；Ｈ３０７Ｇ／Ｑ／Ｍ；Ｅ３０８Ｑ；Ｉ３２６Ｆ；Ｌ３４９Ｍ；Ｄ３５３Ａ／Ｎ；Ｌ３６４Ｑ；Ａ３９４Ｖ；Ｓ３９９Ｎ；Ｎ４００Ｋ；Ｐ４０４Ａ；Ｌ４０７Ｖ；Ｆ４４３Ｈ；Ｎ４５３Ｇ；Ｙ４５９Ｆ；Ｔ４６０Ｇ；Ｔ４６３Ｎ；Ｎ４７４Ｑ；Ｅ５０９Ｌ；Ｑ５２１Ｋ／Ｓ；Ｋ５２２Ｙ／Ｆ／Ｎ；Ｔ５２４Ｓ；Ｐ５２８Ｌ；Ｓ５４６Ｒ；および／またはＰ５６４Ｇ／Ｌ／Ｍにアミノ酸残基の差異を含む。

【0179】

一部の実施形態において、他のあらゆるアッセイ条件が基本的に同じである場合、参照ＰＡＬポリペプチドと比較して酸性ｐＨに対する増加した耐性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、１．５～６．５の間；１．５～５．０の間；２．０～５．５の間；３．０～６．８の間；３．０～５．５の間；４．０～６．５の間；４．０～４．５の間；４．５～５．０の間；４．５～５．５の間、４．５～６．０の間；４．５～６．５の間；５．０～６．５の間；５．０～６．０の間；５．０～５．５の間；５．５～６．０の間；６．０～６．５の間；および／または６．５～７．０の間のｐＨ範囲において増加した耐性を有する。一部の実施形態において、酸性ｐＨに対する増加した耐性は、約３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０および／または６．５のｐＨにおいて示される。

【0180】

一部の実施形態において、酸性ｐＨに対する増加した耐性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、標準アッセイにより測定する場合、参照ＰＡＬと比較してより優れたＰＡＬ活性も示す。本明細書に提示されているアッセイ等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれか適したアッセイが、本発明における使用を見出す。

【0181】

例示的な操作されたポリペプチド（即ち、バリアント番号１～バリアント番号１０１０）のいずれかが、例えば、本明細書に記載されている他のポリペプチドおよび他の残基位置から様々なアミノ酸の差異の新たな組合せを加えることによる進化のその後のラウンドにより、他の操作されたＰＡＬポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列としての使用を見出すことがさらに考慮される。一部の実施形態において、進化のより初期のラウンドを通して未変化として維持された残基位置にアミノ酸の差異を含むことにより、追加的な改善が為される。本明細書に提示されている方法等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれか適した方法が使用を見出すため、本発明が、操作されたＰＡＬポリペプチドを産生するためのいずれか特定の方法に限定されることは企図されない。

【0182】

操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載されている操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する１種または複数の異種調節配列に動作可能に連結されている。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチド（複数可）をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物が、適切な宿主細胞に導入されて、相当するＰＡＬポリペプチド（複数可）を発現する。

【0183】

当業者には明らかな通り、タンパク質配列の利用能および様々なアミノ酸に相当するコドンの知識は、対象ポリペプチドをコードすることができるあらゆるポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が、代替的または同義コドンによってコードされるという遺伝暗号の縮重は、その全てが操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする極めて多数の核酸が作製されることを可能にする。よって、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することにより本明細書に記載されているＰＡＬポリペプチドをコードするよう作製することができる、ＰＡＬポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変種の産生のための方法および組成物を提供し、斯かる変種は全て、実施例に（例えば、様々な表中で）示されているアミノ酸配列を含む、本明細書に記載されているいずれかのポリペプチドのために特に開示されていると考慮されるべきである。

【0184】

一部の実施形態において、コドンは、好ましくは、タンパク質産生に選ばれた宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために典型的に使用される。結果的に、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域におけるコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％超に好ましいコドンを含有する。

【0185】

一部の実施形態において、ＰＡＬポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている特性を有するＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３から選択される参照配列、またはいずれかのバリアント（例えば、実施例に提示）のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３の参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示されているいずれかのバリアントのアミノ酸配列と比較して１個または複数の残基の差異を含む（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸残基位置）ポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、参照配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３から選択される。

【0186】

一部の実施形態において、ＰＡＬポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている特性を有するＰＡＬ活性を有する操作されたポリペプチドであって、参照配列の配列番号４に対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号４のポリペプチドと最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；および／またはＸ５６４の残基位置に、配列番号４と比較した１個または複数の残基の差異を含むポリペプチドをコードする。

【0187】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３から選択されるポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基同一性を有する。

【0188】

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および／または２３から選択される参照ポリヌクレオチド配列またはその相補体、または本明細書に提示されているバリアントＰＡＬポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、Ｘ３９；Ｘ５４；Ｘ５９；Ｘ７３；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１１２、Ｘ１３４、Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４０；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０４、Ｘ３０５；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３５３；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５０９；Ｘ５２１；Ｘ５２２；Ｘ５２４；Ｘ５２８；Ｘ５４６；および／またはＸ５６４から選択される残基位置に、配列番号４と比較した１個または複数の残基の差異を有するアミノ酸配列を含むＰＡＬポリペプチドをコードする。

【0189】

一部の実施形態において、本明細書における操作されたＰＡＬポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、種々の仕方で操作されて、ＰＡＬポリペプチドの発現を容易にする。一部の実施形態において、ＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＰＡＬポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するための１種または複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。ベクターへのその挿入に先立つ単離されたポリヌクレオチドの操作は、利用される発現ベクターに応じて望ましくまたは必要となり得る。組換えＤＮＡ方法を利用した、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、本技術分野において周知のものである。一部の実施形態において、制御配列は、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターをとりわけ含む。一部の実施形態において、適したプロモーターは、宿主細胞選択に基づき選択される。細菌宿主細胞に関して、本開示の核酸構築物の転写を導くために適したプロモーターとして、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成型アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Villa-Kamaroffら、Proc. Natl Acad. Sci. USA ７５巻：３７
２７～３７３１頁［１９７８年］を参照）と共にｔａｃプロモーター（例えば、DeBoerら、Proc. Natl Acad. Sci. USA ８０巻：２１～２５頁［１９８３年］を参照）が挙
げられるがこれらに限定されない。糸状真菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定的アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参照）と共にＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの突然変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、本技術分野において公知である（例えば、Romanosら、Yeast ８巻：４２３～４８８頁［１９９２年］を参照）。

【0190】

一部の実施形態において、制御配列は、適した転写ターミネーター配列（即ち、転写を終結させるよう宿主細胞に認識される配列）でもある。一部の実施形態において、ターミネーター配列は、ＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能的ないずれか適したターミネーターは、本発明における使用を見出す。糸状真菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸合成酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素の遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、本技術分野において公知である（例えば、Romanosら、
上記参照）。

【0191】

一部の実施形態において、制御配列は、適したリーダー配列（即ち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態において、リーダー配列は、ＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能的ないずれか適したリーダー配列は、本発明における使用を見出す。糸状真菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に適したリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。

【0192】

一部の実施形態において、制御配列は、ポリアデニル化配列（即ち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。最適な宿主細胞において機能的ないずれか適したポリアデニル化配列は、本発明における使用を見出す。糸状真菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸合成酵素、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、公知のものである（例えば、GuoおよびSherman、Mol. Cell. Bio.、１５巻：５９８３～５９９０頁［１９９５
年］を参照）。

【0193】

一部の実施形態において、制御配列は、シグナルペプチド（即ち、ポリペプチドのアミノ末端に連結され、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へと方向づける、アミノ酸配列をコードするコード領域）でもある。一部の実施形態において、核酸配列のコード配列の５’端は、分泌型ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠において天然に連結された、シグナルペプチドコード領域を固有に含有する。あるいは、一部の実施形態において、コード配列の５’端は、該コード配列にとって外来性のシグナルペプチドコード領域を含有する。最適な宿主細胞の分泌経路へと発現されたポリペプチドを方向づけるいずれか適したシグナルペプチドコード領域は、操作されたポリペプチド（複数可）の発現のための使用を見出す。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ １１８３７マルトース生成型アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られる領域等が挙げられるがこれらに限定されないシグナルペプチドコード領域である。さらに別のシグナルペプチドは、本技術分野において公知である（例えば、SimonenおよびPalva、Microbiol. Rev.、５７巻：１０９～１３７頁［１９９３年］を参照）。一部の実施形態において、糸状真菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のシグナルペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。

【0194】

一部の実施形態において、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコード領域でもある。その結果得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒性または自己触媒性切断によって、成熟活性ポリペプチドへと変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれか適した供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照）。ポリペプチドのアミノ末端にシグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方が存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。

【0195】

一部の実施形態において、調節配列も利用される。この配列は、宿主細胞の増殖に対するポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする調節系である。原核生物宿主細胞において、適した調節配列として、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞において、適した調節系として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられるがこれらに限定されない。糸状真菌において、適した調節配列として、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。

【0196】

別の態様において、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、これを導入しようとする宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター等の１種または複数の発現調節領域や複製起点等とを含む組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態において、本明細書に記載されている様々な核酸および制御配列が一体に連接されて、当該部位にＰＡＬポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする、１種または複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生する。あるいは、一部の実施形態において、本発明の核酸配列は、発現のための適切なベクターへと核酸配列または該配列を含む核酸構築物を挿入することにより発現される。一部の実施形態において、発現ベクターの作製に関与して、コード配列は、該コード配列が、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結され得るように、ベクター内に位置する。

【0197】

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に付され、ＰＡＬポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、いずれか適したベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）となり得る。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、該ベクターを導入しようとする宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、直鎖状または閉環状プラスミドとなり得る。

【0198】

一部の実施形態において、発現ベクターは、自律的に複製するベクター（即ち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体等、染色体外の実体として存在するベクターであり、その複製は、染色体の複製から独立している）である。ベクターは、自己複製を保証するためのいずれかの手段を含有することができる。一部の代替的実施形態において、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と共に複製されるベクターである。さらに、一部の実施形態において、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを共に含有する２個もしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが利用される。

【0199】

一部の実施形態において、発現ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、１種または複数の選択可能マーカーを含有する。「選択可能マーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に原栄養性その他をもたらす遺伝子である。細菌の選択可能マーカーの例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性等、抗生物質抵抗性を付与するマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための適したマーカーとして、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられるがこれらに限定されない。糸状真菌宿主細胞における使用のための選択可能マーカーとして、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅに由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅに由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）ならびにこれらの均等物が挙げられるがこれらに限定されない。別の態様において、本発明は、本発明の少なくとも１種の操作されたＰＡＬポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドであって、宿主細胞における操作されたＰＡＬ酵素（複数可）の発現のための１種または複数の制御配列に動作可能に連結されているポリヌクレオチド（複数可）を含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターにコードされるポリペプチドの発現における使用に適した宿主細胞は、本技術分野において周知のものであり、その例として、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞等、細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））等、真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞等、昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞等、動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な宿主細胞は、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。

【0200】

したがって、別の態様において、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現に適した条件下で、操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、本明細書に記載されているＰＡＬポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。

【0201】

宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、本技術分野において周知のものである。ＰＡＬポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを細胞に導入するためのいずれか適した方法が、本発明において使用を見出すことが考慮される。適した技法として、エレクトロポレーション、遺伝子銃・微粒子銃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられるがこれらに限定されない。

【0202】

本明細書に開示されている特性を有する操作されたＰＡＬポリペプチドは、天然起源または操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、本技術分野において公知のおよび／または本明細書に記載されているいずれか適した突然変異誘発および／または定向進化方法に付すことにより得ることができる。例示的な定向進化技法は、突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Stemmer、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA ９１巻：１０７４７～１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号を参照）。使用することができる他の定向進化手順は、ねじれ型伸長プロセス（ステップ）、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Zhaoら、Nat. Biotechnol.、１６巻：２５８～２６１頁
［１９９８］を参照）、変異原性ＰＣＲ（例えば、Caldwellら、PCR Methods Appl.、
３巻：Ｓ１３６～Ｓ１４０頁［１９９４年］を参照）およびカセット突然変異誘発（例えば、Blackら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３巻：３５２５～３５２９頁［１９
９６年］を参照）をとりわけ含む。

【0203】

突然変異誘発および定向進化方法をＰＡＬコードポリヌクレオチドに容易に適用して、発現、スクリーニングおよびアッセイすることができるバリアントライブラリーを作製することができる。いずれか適した突然変異誘発および定向進化方法が、本発明における使用を見出し、これは本技術分野において周知のものである（例えば、これら全てここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８３０，７２１号、同第６，１３２，９７０号、同第６，４２０，１７５号、同第６，２７７，６３８号、同第６，３６５，４０８号、同第６，６０２，９８６号、同第７，２８８，３７５号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２９７，０５３号、同第６，５７６，４６７号、同第６，４４４，４６８号、同第５，８１１２３８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２９１，２４２号、同第６，９９５，０１７号、同第６，３９５，５４７号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５０６，６０３号、同第６，４１３，７７４号、同第６，５７３，０９８号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３７２，４９７号、同第７，８６８，１３８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，９２８，９０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，０９６，５４８号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３５８，７４２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，３３５，１６０号、同第６，６５３，０７２号、同第６，３５５，４８４号、同第６，０３，３４４号、同第６，３１９，７１３号、同第６，６１３，５１４号、同第６，４５５，２５３号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，４０６，８５５号、同第６，９４６，２９６号、同第７，５３４，５６４号、同第７，７７６，５９８号、同第５，８３７，４５８号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３０９，８８３号、同第７，１０５，２９７号、同第７，７９５，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，２５１，６７４号、同第６，７１６，６３１号、同第６，５２８，３１１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３７９，９６４号、同第７，１４８，０５４号、同第７，６２９，１７０号、同第７，６２０，５００号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３５８，７４０号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４３６，６７５号、同第６，９６１，６６４号、同第７，４３０，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４７９，６５２号、同第６，３１９，７１４号、同第６，５２１，４５３号、同第６，３６８，８６１号、同第７，４２１，３４７号、同第７，０５８，５１５号、同第７，０２４，３１２号、同第７，６２０，５０２号、同第７，８５３，４１０号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９０４，２４９号ならびにあらゆる関連する非米国特許対応文献；Lingら、Anal. Biochem.、２５４巻（２号）：１５７～７８頁［１９９７年］
；Daleら、Meth. Mol. Biol.、５７巻：３６９～７４頁［１９９６年］；Smith、Ann.
Rev. Genet.、１９巻：４２３～４６２頁［１９８５年］；Botsteinら、Science、２
２９巻：１１９３～１２０１頁［１９８５年］；Carter、Biochem. J.、２３７巻：１～７頁［１９８６年］；Kramerら、Cell、３８巻：８７９～８８７頁［１９８４年］；Wellsら、Gene、３４巻：３１５～３２３頁［１９８５年］；Minshullら、Curr. Op. Chem.
Biol.、３巻：２８４～２９０頁［１９９９年］；Christiansら、Nat. Biotechnol.、１７巻：２５９～２６４頁［１９９９年］；Crameriら、Nature、３９１巻：２８８～２
９１頁［１９９８年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１５巻：４３６～４３８頁［１９９７年］；Zhangら、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、９４巻：４５０４～４５０
９頁［１９９７年］；Crameriら、Nat. Biotechnol.、１４巻：３１５～３１９頁［１９９６年］；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９～３９１頁［１９９４年］；Stemmer、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、９１巻：１０７４７～１０７５１頁［１９９４年］；Ｗ
Ｏ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；ＷＯ２００９／１５２３３６および米国特許第６，５３７，７４６号を参照）。

【0204】

一部の実施形態において、突然変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を規定の温度（または他のアッセイ条件）に付し、熱処理または他の適したアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによりスクリーニングされる。次に、遺伝子からＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列変化（あるとすれば）を同定し、宿主細胞における酵素の発現に使用する。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、本技術分野において公知のいずれか適した方法（例えば、ＨＰＬＣ分析等、標準生化学技法）を使用して行うことができる。

【0205】

公知配列の操作されたポリペプチドのため、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知合成方法に従った標準固相方法により調製することができる。一部の実施形態において、最大約１００塩基の断片を個々に合成し、続いて連接（例えば、酵素もしくは化学的ライゲーション（litigation）方法またはポリメラーゼ媒介性方法により）して、いずれか所望の連続的配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されているポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動合成方法において典型的に実施されることから、古典的ホスホラミダイト方法（例えば、Beaucageら、Tet. Lett.、２２巻：１８５
９～６９頁［１９８１年］；およびMatthesら、EMBO J.、３巻：８０１～０５頁［１９
８４年］を参照）を使用した化学合成により調製することができる。ホスホラミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドは、合成（例えば、自動ＤＮＡ合成機において、精製、アニール、ライゲーションおよび適切なベクターにクローニング）される。

【0206】

したがって、一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）本明細書に記載されているいずれかのバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドにコードされたＰＡＬポリペプチドを発現させるステップを含むことができる。本方法の一部の実施形態において、ポリヌクレオチドにコードされたアミノ酸配列は、１個または数個（例えば、最大３、４、５または最大１０個）のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を任意選択で有することができる。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を任意選択で有する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を任意選択で有する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を任意選択で有する。一部の実施形態において、置換は、保存的または非保存的置換である。

【0207】

発現された操作されたＰＡＬポリペプチドは、本明細書に記載されているアッセイおよび条件等が挙げられるがこれらに限定されない、本技術分野において公知のいずれか適したアッセイを使用して、いずれか所望の改善された特性または特性の組合せ（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性等）に関して評価することができる。

【0208】

一部の実施形態において、宿主細胞において発現された操作されたＰＡＬポリペプチドのいずれかは、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心およびクロマトグラフィーをとりわけ含む、タンパク質精製のための周知技法のうちいずれか１種または複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。

【0209】

ＰＡＬポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法は、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーをとりわけ含む。特定の酵素を精製するための条件は、一部には、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等の因子に依存し、当業者であれば明らかとなる。一部の実施形態において、親和性技法を使用して、改善されたＰＡＬ酵素を単離することができる。アフィニティークロマトグラフィー精製のため、目的のＰＡＬポリペプチドに特異的に結合するいずれかの抗体が、使用を見出すことができる。抗体の産生のため、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられるがこれらに限定されない様々な宿主動物が、ＰＡＬポリペプチドまたはその断片の注射により免疫化される。一部の実施形態において、ＰＡＬポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に取り付けられたリンカーによって、ＢＳＡ等の適した担体に取り付けられる。

【0210】

一部の実施形態において、本明細書に記載されている操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、操作されたＰＡＬポリペプチドの産生の助けになる条件下で培養するステップと、細胞および／または培養培地から操作されたＰＡＬポリペプチドを回収するステップとを含む方法によって、操作されたＰＡＬポリペプチドは、宿主細胞において産生される。一部の実施形態において、宿主細胞は、２種以上の操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する。

【0211】

一部の実施形態において、本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する方法であって、参照配列の配列番号４に対し少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、配列番号４のアミノ酸配列と最適に整列された場合、Ｘ３９；Ｘ９１；Ｘ１５８；Ｘ１８０；Ｘ１９５；Ｘ２４３；Ｘ２４５；Ｘ２５６；Ｘ２５７；Ｘ２７０；Ｘ２９０；Ｘ３０７；Ｘ３０８；Ｘ３２６；Ｘ３４９；Ｘ３６４；Ｘ３９４；Ｘ３９９；Ｘ４００；Ｘ４０４；Ｘ４０７；Ｘ４４３；Ｘ４５３；Ｘ４５９；Ｘ４６０；Ｘ４６３；Ｘ４７４；Ｘ５２２；Ｘ５２４；およびＸ５２８またはこれらの組合せから選択される、配列番号４と比較した１個または複数のアミノ酸残基の差異を有する操作されたＰＡＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え細菌細胞を、操作されたＰＡＬポリペプチドの産生に適した培養条件下で培養するステップと、培養物および／または培養された細菌細胞から操作されたＰＡＬポリペプチドを任意選択で回収するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態において、宿主細胞は、２種以上の操作されたＰＡＬポリペプチドを産生する。

【0212】

一部の実施形態において、組換え宿主細胞および／または培養培地から操作されたＰＡＬポリペプチドが回収されたら、本技術分野において公知のいずれか適した方法（複数可）によりこれをさらに精製する。一部の追加的な実施形態において、精製されたＴＡＬポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされて、異なる適用および使用（例えば、医薬組成物）の必要に応じて、操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物および製剤をもたらす。

【0213】

組成物：
本発明は、多数の組成物における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。このような組成物は、医薬品、食物性／栄養性補助食品、食物、飼料および精製化学製品産生等が挙げられるがこれらに限定されない、多くの分野における使用を見出す。例えば、一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１種の操作されたＰＡＬバリアントおよび／または少なくとも１種のＰＡＬバリアントをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド配列を含む食物および／または飼料を提供する。一部の実施形態において、本発明は、少なくとも１種の操作されたＰＡＬバリアントを含む飲料を提供する。

【0214】

一部の実施形態において、食物、飼料および／または栄養性／食物性補助食品における操作されたＰＡＬバリアントは、グリコシル化されている。さらに、操作されたＰＡＬバリアントは、いずれか適した食用酵素送達マトリックスにおける使用を見出す。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬバリアントは、バリアント摂取後の動物の消化管内におけるＰＡＬバリアントの迅速な分散のために設計された食用酵素送達マトリックス中に存在する。

【0215】

本発明は、精製化学製品および他の産業的に重要な化合物の産生における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドも提供する（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０３４０１１９号、同第２０１３／０００５０１２号および同第２００５／０２６０７２４号ならびにＷＯ２０１２／１２２３３３を参照）。

【0216】

医薬品および他の組成物
本発明は、食物性／栄養性補助食品等、医薬品および他の組成物における使用に適した操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。

【0217】

投与機序に応じて、本発明に係る治療有効量の操作されたＰＡＬを含むこのような組成物は、固体、半固体または液体の形態である。一部の実施形態において、組成物は、希釈剤、バッファー、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤および他の成分等、他の薬学的に許容される構成成分を含む。製剤および投与のための技法に関する詳細は、本技術分野において周知のものであり、文献に記載されている。

【0218】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、経口医薬組成物における使用のために製剤化される。操作されたＰＡＬポリペプチドの送達における使用のためのいずれか適した形式が、本発明における使用を見出し、その例として、丸剤、錠剤、ジェルタブ、カプセル、ロゼンジ、糖衣錠、粉末、軟ゲル、ゾル－ゲル、ゲル、エマルション、植込剤、パッチ、スプレー、軟膏、リニメント、クリーム、ペースト、ゼリー、ペイント、エアゾール、チューインガム、粘滑剤、スティック、懸濁液（油ベースの懸濁液、水中油型エマルションが挙げられるがこれらに限定されない）、スラリー、シロップ、制御放出製剤、坐剤等が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、注射に適した形式で提供される（即ち、注射用製剤において）。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、シリカベースの（例えば、オキシシラン）ゾル－ゲルを含むゾル－ゲル等、生体適合性マトリックス中に提供される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、カプセル包埋される。一部の代替的実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ナノ構造（例えば、ナノチューブ、ナノ細管、ナノカプセルまたはマイクロカプセル、マイクロスフェア、リポソーム等）中にカプセル包埋される。実際に、本発明が、いずれか特定の送達製剤および／または送達手段に限定されることは企図されない。操作されたＰＡＬポリペプチドが、非経口、経口、外用、経皮、鼻腔内、眼内、くも膜下腔内、植込剤経由等が挙げられるがこれらに限定されない、本技術分野において公知のいずれか適した手段により投与されることが企図される。

【0219】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、グリコシル化、ペグ化（即ち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］または活性化されたＰＥＧ等により修飾）または他の化合物によって化学修飾される（例えば、Ikeda、Amino Acids ２９巻：２８３
～２８７頁［２００５年］；米国特許第７，５３１，３４１号、同第７，５３４，５９５号、同第７，５６０，２６３号および同第７，５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、同第２０１２／０１７７７２２号等を参照）。実際に、本発明が、いずれか特定の送達方法および／または機構に限定されることは企図されない。

【0220】

一部の追加的な実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、マトリックス安定化された酵素結晶を含む製剤中に提供される。一部の実施形態において、製剤は、架橋された結晶性の操作されたＰＡＬ酵素と、酵素結晶に接着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明は、ポリマーにおける操作されたＰＡＬポリペプチドも提供する。

【0221】

一部の実施形態において、本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドを含む組成物は、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび／またはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物のデンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシ－メチルセルロース）、ガム（例えば、アラビア、トラガント、グアー等）および／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲン等）等が挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数の一般的に使用される担体化合物を含む。経口製剤における追加的な構成成分は、着色および／または甘味料（例えば、グルコース、スクロースおよびマンニトール）および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）ならびに腸溶コーティング（例えば、メタクリレートポリマー、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレートおよび／または本技術分野において公知の他のいずれかの適した腸溶コーティング）を含むことができる。一部の実施形態において、崩壊または可溶化剤が含まれる（例えば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウム等のその塩）。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸および／または乳化剤（特に液体製剤において）等が挙げられるがこれらに限定されない、様々な追加的な構成成分と組み合わされる。

【0222】

一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸および／または乳化剤（特に液体製剤において）等が挙げられるがこれらに限定されない、様々な追加的な構成成分と組み合わされる。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、ＫＵＶＡＮ（登録商標）テトラヒドロビオプテリン（ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノバト）、制酸剤（例えば、オメプラゾール、エソメプラゾールおよび他のプラゾール類）および他のいずれか適した化合物等が挙げられるがこれらに限定されない、ＰＫＵの処置において使用される他の化合物と組み合わせて対象に投与される。

【0223】

一部の実施形態において、本発明は、血液や脳脊髄液等の流体におけるフェニルアラニンの濃度の減少における使用に適した、操作されたＰＡＬポリペプチドを提供する。動物に投与される操作されたＰＡＬポリペプチド（複数可）の投薬量は、動物の状態または疾患、全身状態および当業者に公知の他の因子に依存する。一部の実施形態において、組成物は、動物への単一または複数投与に企図される。一部の実施形態において、動物（例えば、ＰＫＵのヒト）に投与される組成物（複数可）における操作されたＰＡＬポリペプチド（複数可）の濃度は、疾患（例えば、ＰＫＵおよび／またはＰＫＵ関連の状態、疾患および／または症状）を有効に処置、寛解および／または防止するのに十分であることが考慮される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、他の医薬品および／または食物性組成物と組み合わせて投与される。

【0224】

産業的組成物
本発明の操作されたＰＡＬポリペプチドが、産業的組成物における使用を見出すことが考慮される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、食品および／または飼料産業における使用のために製剤化される。一部の実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、追加的な酵素（例えば、セルラーゼ、ラッカーゼおよびアミラーゼ）等、動物飼料構成成分と混合される、顆粒化またはペレット化された産物において製剤化される。一部の代替的実施形態において、操作されたＰＡＬポリペプチドは、液体の動物飼料組成物（例えば、水性または油ベースのスラリー）において使用される。よって、一部の実施形態において、本発明の操作されたＰＡＬバリアントは、ペレットおよび他の加工される飼料／食品の産生に使用される処理に耐えるために十分に熱耐性および熱安定的である。

【0225】

本発明の操作されたＰＡＬバリアントは、フェニルアラニンおよび／またはフェニルアラニン誘導体の産生においても使用を見出す。

【0226】

本発明の前述および他の態様は、次の非限定例に関してよりよく理解することができる。実施例は、単なる説明目的のために提供されており、決して本発明の範囲の限定を企図するものではない。

【0227】

実験
実験および達成された結果を含む次の実施例は、単なる説明目的のために提供されており、本発明を限定するものと解釈するべきではない。

【0228】

後述する実験の開示において、次の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒間）；ｍｉｎ（複数可）（分間（複数可））；ｈ（複数可）およびｈｒ（複数可）（時間（複数可））；Ｕ（ユニット）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド／平方インチ）；℃（セ氏温度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般的に使用される研究用Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、コネチカット州ニューヘイブンから入手）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＣＦＳＥ（カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＰＨＥおよびｐｈｅ（フェニルアラニン）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）；ＰＫＵ（フェニルケトン尿症）；ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）；ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）；ＨＬＡ－ＤＲ（染色体番号６におけるＨＬＡ複合体にコードされる、ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照を上回る倍数改善）；ＬＢ（ルリアブロス（Luria broth））；Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ジョージア州アセンズ）；ＰｒｏＳｐｅｃ（ＰｒｏＳｐｅｃ Ｔａｎｙ Ｔｅｃｈｎｏｇｅｎｅ、ニュージャージー州イーストブランズウィック）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）；Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ヨンカーズ）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｌ， Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州ポートワシントン）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ビレリカ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミシガン州デトロイト）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ、カリフォルニア州サニーベール）；Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ、ＡＧ、スイス、バーゼル）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州テュークスベリー）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒｐ．の一部、ニューヨーク州グランドアイランド）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、マサチューセッツ州ウォルサム）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）；Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．、英国ダベントリー）；Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、アイルランド、ウィックロー）；Ｅｎｚｏ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ファーミングデール）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）；Ｈａｒｌａｎ（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）；ＡＢ Ｓｃｉｅｘ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ、マサチューセッツ州フレイミングハム）；ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）。

【0229】

次のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、本発明における使用を見出す。場合によっては（下に示す通り）、ポリヌクレオチド配列に続き、コードされるポリペプチドを記す。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

【実施例】

【0230】

（実施例１）
ＰＡＬ遺伝子獲得および発現ベクターの構築
Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｖＰＡＬ）プラスミドＤＮＡを得て、ＡｖＰＡＬをコードする合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ１６ｂにクローニングして、ｐＥＴ１６ｂ－ＡｖＰＡＬ（配列番号１）を用意した。オリゴヌクレオチド：ＰＡＬ－ｐＣＫ－ＦおよびＰＡＬ－ｐＣＫ－Ｒを使用したＰＣＲにより、ＡｖＰＡＬオープンリーディングフレーム（配列番号２）を増幅し、発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（配列番号２７）にサブクローニングした。

【表1】

【0231】

このプラスミド構築物でＷ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換した。当業者によって一般に公知の定向進化技法を使用して、このプラスミド構築物から遺伝子バリアントのライブラリーを作製した（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号およびＷＯ２０１０／１４４１０３を参照）。

【0232】

（実施例２）
ハイスループット（ＨＴＰ）増殖およびアッセイ
ＰＡＬおよびＰＡＬバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）増殖
１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングすることにより、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を選択した。３７℃における一晩インキュベーション後に、ＮＵＮＣ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した１８０μｌ／ウェルのＬＢを充填した９６ウェル浅平底プレートのウェルにコロニーを置いた。振盪機（２００ｒｐｍ、３０℃、８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）において培養物を一晩、１８～２０時間育成させた。一晩育成した試料（２０μＬ）を、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した３８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスを充填したＣｏｓｔａｒ９６ウェル深プレートに移した。振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）においてプレートを１３５分間インキュベートした。次に、滅菌水に溶解した４０μＬの１０ｍＭ ＩＰＴＧで細胞を誘導し、振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）において一晩、２０～２４時間インキュベートした。２回複製した培養物を組み合わせ、細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分間）、上清を廃棄し、分析に先立ち細胞を－８０℃で凍結した。

【0233】

ＨＴＰペレットの溶解
先ず、５００μＬの溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび０．５ｍｇ／ｍｌポリミキシンＢ硫酸塩）を細胞ペレットに加えた。この混合物を１．５時間室温で揺動し、本明細書に記載されている様々なＨＴＰアッセイにおける清澄化ライセートの使用に先立ち、ペレット化した（４０００ｒｐｍ×５分間）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるこのようなライセートの分析は、ほぼ６０ｋＤａの見かけ上のＭＷにおける過剰発現されたタンパク質の存在を明らかにし、これは、ＰＡＬの予想されるＭＷと一貫した。

【0234】

清澄化ライセートの分析
経時的に２９０ｎｍにおける吸光度の変化によって決定される桂皮酸の生成を測定することにより、ＰＡＬバリアント活性を決定した。本アッセイのため、１００μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭフェニルアラニン、ｐＨ７．５または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０のいずれか、８０μＬの水および２０μＬの清澄化ライセートを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。

【0235】

プロテアーゼで前処理した清澄化ライセートのＨＴＰ分析
ＰＡＬバリアントに、キモトリプシンおよびトリプシンを負荷して、腸管下部の環境をシミュレートした。先ず、３０μＬのプロテアーゼミックス（０．０１～１００ｍｇ／ｍｌキモトリプシン（Ｃ４１２９ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１～１００ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｔ７４０９ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭ ＣａＣｌ_２および１ｍＭ ＨＣｌ）、５００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解した０～３０μＬの２０ｍＭタウロコール酸ナトリウムおよび９０～１２０μＬの清澄化ライセートを、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。このプレートを封着し、分析に先立ち３７℃、４００ｒｐｍ、１”スロー（throw）で
１時間インキュベートした。アッセイのため、１００μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．５または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０のいずれかおよび１００μＬのプロテアーゼ処理ライセートを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を次表に示す。

【0236】

酸で前処理した清澄化ライセートのＨＴＰ分析
本アッセイにおいて、胃の環境をシミュレートするために、ＰＡＬバリアントを酸性条件下で負荷した。先ず、２０μＬの１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．７～４．５）および３０μＬの水または５０μＬの４００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．７～４．８および５０ｕＬの清澄化ライセートを、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。このプレートを封着し、分析に先立ち３７℃、４００ｒｐｍ、１”スローで１時間インキュベートした。アッセイのため、１００μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．５および８０μＬ １Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０および８０μＬ １．０Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０のいずれかならびに２０μＬの酸処理ライセートを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を次表に示す。

【0237】

ペプシンで前処理した清澄化ライセートのＨＴＰ分析
追加的なアッセイにおいて、ＰＡＬバリアントに、酸性条件およびペプシンを負荷して、胃内環境を模倣する条件下でバリアントをさらに検査する。先ず、４００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ１．５～４に溶解した５０μＬの０．０１～１００ｍｇ／ｍｌペプシンおよび５０μＬの清澄化ライセートを、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３７９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。このプレートを封着し、分析に先立ち３７℃、４００ｒｐｍ、１”スローで１～１２時間インキュベートする。アッセイのため、１００μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．５および８０μＬ １Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５または２００ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０のいずれかならびに２０μＬの酸処理ライセートを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加える。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定する（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。

【表2-1-1】

【表2-1-2】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5-1】

【表2-5-2】

【表2-5-3】

【0238】

（実施例３）
ＰＡＬバリアントのタンパク質凝集を決定するためのアッセイ
凝集するＰＡＬバリアントの傾向は、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）タンパク質凝集アッセイキット（Ｅｎｚｏ）を使用してメーカーの説明書に従って決定される。簡潔に説明すると、０～１００μＭの精製されたＰＡＬを、ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）検出試薬（１：２０００）と混合し、フローサイトメトリーにより分析する。本技術分野において公知のＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）凝集標準と一貫して、蛍光に関して試料を評価する（例えば、Bershteinら、Mol. Cell、１３３～１４４頁［２０１３年を参
照］）。

【0239】

（実施例４）
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物から凍結乾燥されたライセート
上述の通り育成した選択されたＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、一晩３７℃で育成した。各培養物から単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有する５０ｍｌのＬＢに移した。１８時間３０℃、２５０ｒｐｍで培養物を育成し、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを有する２５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃブロスにおいておよそ１：１０の希釈で継代培養して、最終ＯＤ６００を０．２とした。１３５分間３０℃、２５０ｒｐｍで培養物をインキュベートして、ＯＤ６００を０．６とし、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導された培養物を２０時間、３０℃、２５０ｒｐｍでインキュベートした。このインキュベーション期間の後に、培養物を４０００ｒｐｍ×１０分間で遠心分離した。上清を廃棄し、３０ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５にペレットを再懸濁した。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×１０分間）、１２ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５に再懸濁し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎシステム（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１７，０００ｐｓｉで使用して溶解させた。ライセートをペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×３０分間）、上清を凍結および凍結乾燥して、酵素含有粉末を生成した。

【0240】

振盪フラスコ培養物からのＰＡＬの精製
上述の通り、飽和するまで振盪フラスコ培養においてＰＡＬバリアント番号４２を育成した。飽和した培養物を遠心分離（４０００ｒｐｍ×２０分間）によりペレット化し、精製に先立ち細胞ペレットを－８０℃で貯蔵した。細胞ペレットを室温で解凍し、５ｍＬバッファー／１ｇ細胞となるよう、１３０ｍＭ ＮａＣｌを有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に再懸濁した。圧力設定１１０ｐｓｉのマイクロフルイダイザーを使用して、この試料スラリーを溶解した。１０，０００ｒｐｍ、１時間の遠心分離と、続く０．２μｍ ＰＥＳフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通した濾過により、得られたライセートを清澄化した。

【0241】

濾過後に、得られたライセートを、１０ｍＭ Ｐｈｅの存在または非存在下において７０～８５℃で１．５～２時間加熱した。ライセートを熱から取り出し、１０，０００ｒｐｍ、４℃、１時間の遠心分離により清澄化した。次に、クロマトグラフィーカラムへのロードに先立ち、可溶性ＰＡＬを含有する上清を、０．２μｍ ＰＥＳフィルターを通して濾過した。

【0242】

８０～１００ｍｇの総タンパク質を含有する、熱処理し濾過したライセートを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８と１．２Ｍ硫酸アンモニウムを使用して２倍に希釈した。２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８と０．６Ｍ硫酸アンモニウムで前平衡化したＨｉＰｒｅｐ１６／１０フェニルＦＦ（ｈｉ ｓｕｂ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に試料をロードした。試料ロード後に、３カラム容量の同じバッファーと、続いて１カラム容量の２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８に溶解した直線勾配の０．６Ｍ～０Ｍ硫酸アンモニウムでカラムを洗浄した。３カラム容量の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８による定組成溶離を使用して、緊密に結合したＰＡＬをカラムから溶出した。活性および純粋ＰＡＬを含有する画分をプールした。

【0243】

フェニルカラムから得た精製されたＰＡＬを０．５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５へとバッファー交換し、濃縮した。濃縮されたＰＡＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析したところ、ほぼ６０ｋＤａのバンドに存在することを見出した。０．４５μｍ ＰＥＳフィルターを使用して、精製されたＰＡＬ試料を濾過し、使用準備が整うまで－８０℃で貯蔵した。

【0244】

（実施例５）
精製されたＰＡＬおよびＰＡＬバリアントの特徴付け
本実施例において、野生型およびバリアントＰＡＬを特徴付けるために行われたアッセイが記載されている。

【0245】

酸性ｐＨに対する耐性：
ＰＡＬバリアントを含有する凍結乾燥された粉末を、２ｇ／Ｌとなるよう２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解した。次に、この酵素溶液の５０μＬを、５０μＬの４００ｍＭクエン酸（ｐＨ４．０～５．２）または１００ｍＭリン酸ナトリウムと混合し、反応物を３７℃で１時間、４００ｒｐｍ（１”スロー）にてインキュベートした。続いて、この溶液の２０μＬを、８０μＬの１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．０および１００μＬの２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．５と短時間混合した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより、酸性条件下の酵素活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図２に示す。図２に示す通り、バリアント番号３０および３６は、野生型ＰＡＬと比較して、ｐＨおよそ４～４．８でインキュベートされた後により高い活性を維持した。

【0246】

Ｋ_Ｍの決定：
バリアントＰＡＬにおける突然変異が、フェニルアラニンに対するＰＡＬバリアントの親和性を変更したか評価するために、野生型酵素およびバリアント３６のミカエリス定数を決定した。先ず、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に溶解した１００μＬの１５μｇ／ｍｌ ＰＡＬおよび１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に溶解した１００μＬの０～３２ｍＭフェニルアラニンを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６２５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより初速度を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。本技術分野において公知のラインウィーバーバーク（Lineweaver-Burke）プロットにデータを適合させることにより、検査したＰＡＬバリアント毎のＫ_Ｍを決定した。結果を図３に示す。図示されている通り、Ｋ_Ｍは、野生型酵素は７４μＭ、バリアント３６は６０μＭであった。

【0247】

アミノ酸特異性：
いくつかのフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、フェニルアラニンに加えてチロシンおよび／またはヒスチジンに対する活性を実証する。ＰＡＬバリアントに存在する突然変異が、フェニルアラニンに対するＰＡＬバリアントの特異性を変更したか評価するために、これらの３アミノ酸における野生型酵素およびバリアント３６の活性を評価した。先ず、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解した１００μＬの５ｇ／Ｌ ＰＡＬ含有凍結乾燥粉末および２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５に溶解した１００μＬの５０ｍＭフェニルアラニンもしくはヒスチジンまたは２．５ｍＭチロシンを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加えた。溶液を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより初速度を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図４に示す。図示されている通り、ＷＴ酵素またはバリアント番号３６のいずれに対しても、ヒスチジンまたはチロシンによる検出可能な活性は観察されず、これらの酵素がフェニルアラニンに特異的であることを示す。

【0248】

ブタおよびウシプロテアーゼに対する抵抗性：
実施例４に記載されている通りに調製されたＰＡＬバリアント試料を、２ｇ／Ｌとなるよう１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解した。ブタトリプシンおよびウシキモトリプシン（各１００ｍｇ）を２ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解し、１００ｍＭリン酸ナトリウムにおいて１１回２倍系列希釈した。次に、８０μＬのＰＡＬバリアント酵素溶液を、２０μＬのトリプシンおよびキモトリプシン溶液と混合した。反応混合物を３７℃で１時間４００ｒｐｍ（１”スロー）にてインキュベートした。続いて、２０μＬの反応物を、８０μＬの水および１００μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０と混合した。各溶液を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図２に示す。この図に示されている通り、検査したバリアントは全て、野生型ＰＡＬと比較して改善したプロテアーゼ抵抗性を示し、タンパク質分解に対しバリアント番号３６が最も安定的であった。

【0249】

ヒトプロテアーゼに対する抵抗性：
上述の通り、いくつかの進化したＰＡＬバリアントをブタトリプシンおよびウシキモトリプシンに対しスクリーニングして、胃腸管に存在する酵素によるタンパク質分解に対するその抵抗性を評価した。進化したＰＡＬバリアントのうちいくつかは、ヒト酵素を使用して検査して、これらがブタまたはウシ酵素のヒトホモログに対し抵抗性であることも確認した。これらのアッセイにおいて、ＷＴ ＰＡＬおよびバリアント番号３６の凍結乾燥した粉末（２．４ｇ／Ｌとなるよう１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に溶解）をヒトキモトリプシン（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）０～８０ＢＴＥＥユニット／ｍｌまたはヒトトリプシン（ＰｒｏＳｐｅｃ）（０～１０，０００ＢＡＥＥユニット／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。次に、この混合物の１００μＬをポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに加え、続いて１００μＬの５０ｍＭフェニルアラニン、２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を加えた。溶液を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより初速度を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図５に示す。図５に示す通り、バリアント番号３６は、野生型ＰＡＬ酵素よりも安定的であった。

【0250】

粗膵臓抽出物に対する抵抗性：
進化したＰＡＬバリアントを検査して、膵臓酵素に対するその抵抗性も決定した。ＷＴ
ＰＡＬの凍結乾燥した粉末、バリアント番号３６、バリアント番号４２およびバリアント番号４３の凍結乾燥した粉末（実施例４に記載されている通りに調製；１２ｇ／Ｌとなるよう５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８に溶解）を、ブタパンクレアチン（４×Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）と１：１混合し、３７℃で振盪しつつ（４００ｒｐｍ、１”スロー）最大２３時間インキュベートした。表示の時点において、反応物の１０μＬアリコートを、ポリアクリレート９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ番号３６３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェル内の１９０μＬの５０ｍＭフェニルアラニン、１９０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に加えた。反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより初速度を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図６に示す。図６に示す通り、バリアント番号３６、バリアント番号４２およびバリアント番号４３は全て、野生型ＰＡＬ酵素と比較して、このようなアッセイ条件下で有意な安定性を示した。

【0251】

腸洗浄剤の影響：
進化したＰＡＬバリアントを、腸胆汁酸および脂肪酸の存在または非存在下におけるタンパク質分解に対するその感受性に関して検査して、これらの酸が、その安定性に影響を与えるかも評価した。バリアント番号３６を含有する凍結乾燥された粉末（実施例４に記載されている通りに調製）を、５０μｇ／ｍｌとなるよう０～１６ｍＭタウロコール酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に溶解した。ブタトリプシンおよびウシキモトリプシン（各８０ｍｇ）を２ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０に溶解し、１００ｍＭリン酸ナトリウムにおいて１１回２倍系列希釈した。このアッセイのため、５０μＬのＰＡＬ溶液を、５０μＬのプロテアーゼ溶液と混合した。この混合物を３７℃で１時間、４００ｒｐｍ（１”スロー）にてインキュベートした。次に、この混合物の５０μＬを１５０μＬの２００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭフェニルアラニンｐＨ７．０と混合した。各反応物を短時間混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｐｌｕｓ^３８４またはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）吸光度マイクロプレートリーダーを使用して、２９０ｎｍにおける吸光度を経時的に追跡することにより活性を決定した（５～２０分間にわたり１２～２０秒毎に）。結果を図７に示す。この図に示す通り、追加的なタウロコール酸ナトリウムは、タンパク質分解に対するバリアント番号３６の感受性を増加させる。

【0252】

（実施例６）
バリアントＰＡＬの腸安定性
動物の腸を通過する際のＰＡＬバリアントの安定性および活性を評価するために、マウスに精製した酵素バリアントを経管栄養で与えた。１０～１２週齢、２０～２６ｇの体重の健康なＣ５７Ｂｌ／６マウスをメタボリックケージ内で維持し、１５時間絶食させた。水は適宜与えた。一晩絶食後に、２１ゲージ経管栄養針を使用して、動物に０．３ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５および８ｍｇ／ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５に溶解したＷＴ ＰＡＬ（実施例４に記載されている通りに調製）または８ｍｇ／ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５に溶解したバリアント番号４２（実施例４に記載されている通りに調製）の混合物を経管栄養した。経管栄養後０．５、２または６時間目に、動物を断頭し、グリーントップ（green-top）キャピラリー血液
採取チューブ（Ｒａｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して血漿を採取し、胃、十二指腸（胃からほぼ１～８ｃｍ）、空腸（胃からほぼ１０～１８ｃｍ）、回腸（盲腸のほぼ８ｃｍ上）および結腸（盲腸のほぼ５ｃｍ下）の内容物を採取した。これらの内容物の重量を記録し、分析に先立ち内容物を－８０℃で貯蔵した。

【0253】

胃または腸の内容物を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で４×希釈し、短時間混合し、１４，０００ｒｐｍ×２分間で遠心分離した。上清を３５０μＬ、０．４５μＭ ＡｃｒｏＰｒｅｐ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ９６ウェルフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ）に移し、真空濾過により微粒子を除去した。清澄化した濾液を、以前の実施例に記載されている通りに酵素活性に関して、また、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりインタクトＰＡＬタンパク質の存在に関して評価した。結果は、十二指腸および空腸における酵素活性が、野生型ＰＡＬ酵素および陰性対照と比較して、進化したＰＡＬバリアントの方がより高いと思われることを示した。

【0254】

（実施例７）
血漿フェニルアラニンレベル
実施例６に記載されているマウスから採取された血漿試料を評価して、検査したマウスの血流中に存在するフェニルアラニンの含量を決定した。マウス血漿（５０μＬ）を、０．６ｍＭのｄｌ－フェニルアラニン（Ｒｉｎｇ Ｄ_５）（即ち、芳香環炭素と結合した水素ではなく重水素を含む同位体標識バージョンのフェニルアラニン；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する２５０μＬのアセトニトリル（acetontrile）と組み合わせた。この試料をＲＴで５分間混合し、３２００×ｇで１０
分間、４℃で遠心分離し、上清を試料分析のためのプレートに移した。分析のため、１０μＬの各試料をａ３２００ ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）に注射し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）Ｃ_１８カラム（１５０×２．１ｍＭ、５μｍビーズ）（Ｓｕｐｅｌｃｏ、現Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を通して、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）における０．１％ギ酸で溶出させた。５分間の勾配（ｔ＝０、９７％Ａ；３分、５０％Ａ；３．５分、５％Ａ；４分、９７％Ａ；５分、９５％Ａ）を通して試料を溶出させて、内在性フェニルアラニンは１６６から１２０、同位体標識した標準は１７１から１２５の移行を探す。結果は、血漿フェニルアラニンレベルが、野生型ＰＡＬ酵素および陰性対照と比較して、進化したＰＡＬバリアント（即ち、バリアント番号４２）を与えたマウス由来の試料において３０分間の時点でより低かったことを示した。

【0255】

（実施例８）
バリアントＰＡＬの治療機能
ＰＡＬバリアントが、ｉｎ ｖｉｖｏで血清Ｐｈｅレベルを低下させるか評価するために、ＰＫＵのマウスモデルを使用した。これらの実験において、ＰＡＬタンパク質を経管栄養で罹患動物に与えた。先ず、食事から３日間Ｐｈｅを除去し、続いて公知含量のＰｈｅ含有溶液を注射することにより、マウスにおける一貫したベースラインＰｈｅレベルを確立した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドを有する３～６月齢のホモ接合性ＰＡＨ ｅｎｕ－２マウス（McDonaldら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８７巻：１９６５～１９６７頁［１９９０年］を参照）を、フェニルアラニンフリーの食事（ＴＤ．９７１５２， Ｈａｒｌａｎ）と飲料水に入れた０．０３ｇ／ＬのＰｈｅに７２時間移した。時間＝０時間目に処置を開始する前に、マウスに、０．１５ｍｇ／ｇ体重のＰｈｅ（１０ｇ／ＬのＰｈｅ水溶液から調製）を注射した。注射後５５分目に、およそ２０μＬの血液を尾静脈穿刺により採取し、濾紙上にスポットした。その後、注射後１時間、３時間および５時間目に、マウスに０．３ｍｌの５０～１００ｇ／ＬのＷＴ ＡｖＰＡＬ、ＷＴ ＡｖＰＡＬプラスアプロチニン、ＢＳＡまたはバリアント番号４２を経管栄養で与えた。注射後６時間、７時間および９時間目に、追加的な血液スポットを濾紙上に採取した。血液スポットを乾燥させ、本技術分野において公知の方法を使用したＰｈｅおよびＴｙｒレベルのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に先立ち－２０℃で貯蔵した（Chaseら、Clin. Chem.、３９巻：６
６～７１頁［１９９３年］を参照）。

【0256】

結果を図８に示す。この図に示す通り、不活性タンパク質（ＢＳＡ）の経管栄養は、血清Ｐｈｅレベルの増加をもたらした。対照的に、タンパク質分解感受性ＷＴ ＡｖＰＡＬによる処置は、一定のＰｈｅレベルを生じた一方、プロテアーゼ阻害剤アプロチニンと組み合わせた同じタンパク質は、Ｐｈｅレベルの有意な降下を生じた。結果は、操作されたＰＡＬバリアント番号４２の投与が、プロテアーゼ阻害剤の非存在下で血清Ｐｈｅレベルの減少を生じたことも示す。

【0257】

（実施例９）
ＰＡＬの脱免疫化
本実施例において、ＰＡＬからＴ細胞エピトープを除去することになる多様性を同定するために行われた実験が記載されている。

【0258】

脱免疫化多様性の同定：
突然変異されるとＴ細胞エピトープを除去することができるアミノ酸を同定するために、計算的方法を使用して、Ｔ細胞応答を誘発することが予測されるＰＡＬ配列を同定した。並行して、特に、未負荷アッセイ（例えば、実施例２に記載されているアッセイ）においてタンパク質活性を維持するアミノ酸に関して、許容できる有害でない突然変異の実験による探索も行った。次に、予測される免疫原性における突然変異の効果に関して活性バリアントを分析した。

【0259】

バリアントＡｖＰＡＬにおける推定Ｔ細胞エピトープの計算的同定：
本技術分野において公知のＩｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ；Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅウェブサイト）ツールおよび専用の統計分析ツール（例えば、iedb.orgおよびVitaら、Nucl. Acids Res.、３８巻（データベース版）：Ｄ８５４～６２頁［２０１０年］Ｅｐｕｂ２００９年１１月１１日］を参照）を使用して、ＡｖＰＡＬバリアント番号３６における推定Ｔ細胞エピトープを同定した。ＡｖＰＡＬバリアントをあらゆる可能な１５－ｍｅｒ分析フレームへと構文解析し、各フレームは、最後が１４アミノ酸重複する。ＩＥＤＢウェブサイトにおいて推奨される方法を使用して、ヒトの人口のほぼ９５％をまとめて網羅する８種の共通クラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲアレル（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１およびＤＲＢ１＊１５０１）への予測される結合に関してその９－ｍｅｒコア領域をスコアリングすることにより、免疫原性潜在力に関して１５－ｍｅｒ分析フレームを評価した（例えば、Southwoodら、J. Immunol.、１
６０巻：３３６３～３３７３頁［１９９８年］を参照）。本技術分野において公知の統計分析ツールを使用して、バリアントＡｖＰＡＬ内に含有される潜在的Ｔ細胞エピトープクラスター（即ち、免疫原性の異常に高い潜在力を有するバリアントＡｖＰＡＬ内に含有されるサブ領域）を同定した。公知エピトープのＩＥＤＢデータベースおよびＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースに対し、同定されたＴ細胞エピトープクラスターをスクリーニングした。これらのスクリーニングは、バリアントＡｖＰＡＬバリアント番号３６における１０（十）個の推定Ｔ細胞エピトープを同定した。これらのエピトープは、後述するＴＣＥ－Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸと称される。

【0260】

脱免疫化ライブラリーの設計：
先ず、上述通りに同定された１０個の推定Ｔ細胞エピトープ領域における、バリアントＡｖＰＡＬの作製に使用された定向進化のラウンドから同定された、あらゆる中立で有益な突然変異を含有するコンビナトリアルライブラリーを開発した。８種の共通クラスＩＩ
ＨＬＡ－ＤＲアレルへの予測される結合におけるこれらの突然変異の効果を分析した。複数の突然変異が、ＴＣＥ－Ｉ、ＩＩ、ＶＩ、ＶＩＩを除去または低下させると予測された。これらの突然変異をコンビナトリアルライブラリーにおいて組み合わせた。次に、飽和突然変異誘発を使用してライブラリーを設計して、残る６種のＴ細胞エピトープ（即ち、ＴＣＥ－ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸ）内の全単一アミノ酸に突然変異を誘発した。最後に、ＰＡＬバリアントの凝集状態に影響を与えることが報告された２個のアミノ酸であるＣ５０３およびＣ５６５と共に、ＴＣＥ－Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩＩおよびＸを標的とした複数ラウンドの進化から同定された有益な多様性を含有する、コンビナトリアルライブラリーを作製した。このライブラリー由来の最良のヒットを、ＴＣＥ－ＩＩＩおよびＶＩＩＩを標的とするさらなる飽和突然変異誘発ならびに数個の位置における追加的な標的化突然変異誘発に付した。

【0261】

脱免疫化ライブラリーの構築およびスクリーニング：
上述通りに設計されたコンビナトリアルおよび飽和突然変異誘発ライブラリーを本技術分野において公知の方法により構築し、実施例２に記載されている未負荷アッセイにおける活性に関して検査した。活性バリアントを同定し、配列決定した。ＡｖＰＡＬバリアント番号３６および多数のＡｖＰＡＬバリアントに関するその活性および突然変異を、下表９－１から９－７に示す。

【0262】

脱免疫化多様性の同定：
上述の８種の共通クラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲアレルへのその結合を評価することにより、活性バリアントをその免疫原性レベルに関して分析した。総免疫原性スコアおよび免疫原性ヒットカウントを表９－１から９－７に示す。総免疫原性スコアは、バリアントの全体的な予測される免疫原性を反映する（即ち、より高いスコアは、より高いレベルの予測される免疫原性を示す）。免疫原性「ヒットカウント」は、免疫原性の異常に高い潜在力を有する１５－ｍｅｒ分析フレームの数を示す（即ち、より高いヒットカウントは、免疫原性のより高い潜在力を示す）。より低い総予測免疫原性スコアおよび／または参照バリアントに満たない免疫原性ヒットカウントを有する突然変異は、「脱免疫化突然変異」と考慮した。最良であると同定された脱免疫化突然変異を組換えて、活性を有し、出発参照バリアントＡｖＰＡＬよりも有意に免疫原性が低いと予測される多数のバリアントを作製した。次表において、ＦＩＯＰ結果は、未負荷アッセイから得られ；総免疫原性スコア（ＴＩＳ）および免疫原性ヒットカウント（ＩＨＣ）に関して、ＰＡＬタンパク質全体（表９－１、９－８および９－９）または表示のエピトープ（表９－２から９－７）の結果を示す。

【表9-1-1】

【表9-1-2】

【表9-1-3】

【表9-1-4】

【表9-1-5】

【表9-1-6】

【表9-1-7】

【表9-2】

【表9-3-1】

【表9-3-2】

【表9-4】

【表9-5-1】

【表9-5-2】

【表9-6】

【表9-7】

【表9-8】

【表9-9】

【0263】

脱免疫化ＰＡＬバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ検査：
樹状Ｔ細胞アッセイにおいて脱免疫化ＰＡＬバリアントを検査して、Ｔ細胞応答を誘発するその能力を経験的に検査する。標準技法を使用して、ヒトドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。この細胞は、未成熟樹状細胞を作製するために限定培地において培養され単球の供給源として使用する。この未成熟樹状細胞（ＤＣ）に、脱免疫化ＰＡＬバリアントをロードし、続いて限定培地においてさらに培養することにより、より成熟した表現型に誘導して、抗原刺激されたＤＣをもたらす。ＤＣと同じドナー試料から得られたＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇されたドナーＰＢＭＣを、ＣＦＳＥで標識し、続いて抗原刺激されたＤＣと共に７日間培養し、その後８回複製物（octuplicate）を検査する。各ＤＣ－
Ｔ細胞培養物は、未処理対照（即ち、陰性対照）のセットを含む。アッセイは、２種の強力な全タンパク質抗原を含む参照抗原対照（即ち、陽性対照）も取り込む。多様な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩアレルを有する５０名のヒトドナーから単離された細胞を利用するアッセイは、Ｔ細胞応答を誘発するＰＡＬバリアントの能力の統計的に関連する評価をもたらす。

【0264】

特異的な実施形態を参照しつつ本発明について記載してきたが、様々な変更を行うことができ、均等物に置換して、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップ（単数または複数）に適応させることができ、これにより、特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の利益を達成することができる。

【0265】

アメリカ合衆国におけるあらゆる目的のため、本開示に引用されているありとあらゆる刊行物および特許文書は、あたかも斯かる刊行物または文書のそれぞれが、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用されていると特にかつ個々に示されているかのように、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する。刊行物および特許文書の引用は、斯かる文書のいずれかが関連する先行技術であるという指示として企図されておらず、また、その内容または日付に関する承認を構成するものでもない。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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