特許 7132954 改善された免疫原性及び結合活性を提供する２価又は多価コンジュゲート多糖を含む多価コンジュゲートワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-30

(45)【発行日】2022-09-07

(54)【発明の名称】改善された免疫原性及び結合活性を提供する２価又は多価コンジュゲート多糖を含む多価コンジュゲートワクチン

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/315 20060101AFI20220831BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20220831BHJP

   A61K 39/09 20060101ALI20220831BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220831BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20220831BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20220831BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20220831BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/025 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/02 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/11 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/34 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/21 20060101ALN20220831BHJP

   C07K 14/245 20060101ALN20220831BHJP

【ＦＩ】

C07K14/315

A61K47/65

A61K39/09

A61P31/04

A61P37/04

A61K45/00

A61K39/39

A61K39/295

A61P31/16

C07K14/195

C07K14/025

C07K14/02

C07K14/11

C07K14/34

C07K14/21

C07K14/245

【請求項の数】 53

(21)【出願番号】P 2019567989

(86)(22)【出願日】2018-06-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-06

(86)【国際出願番号】 US2018036868

(87)【国際公開番号】W WO2018227177

(87)【国際公開日】2018-12-13

【審査請求日】2021-03-18

(31)【優先権主張番号】62/517,905

(32)【優先日】2017-06-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517358982

【氏名又は名称】インベントプライズ リミテッド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カプレ，スバッシュ・ブイ

(72)【発明者】

【氏名】ダッタ，アヌープ・ケイ

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５０９６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０５７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２４８３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１６９３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３２７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２２６９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５２５４２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０８５５８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０－５００３５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１７５３５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５２１３１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１８８９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５３２４３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３１３２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／２０７９０５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】HUANG, Q., et al.，"PEG as a spacer arm markedly increases the immunogenicity of meningococcal group Y polysaccharide conjugate vaccine."，JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE，2013年11月28日，Vol.172, No.1，pp.382-389，DOI: 10.1016/j.jconrel.2013.03.008，EPUB 17 March 2013

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫原性組成物であって、
第１の群のコンジュゲート及び第２の群のコンジュゲートを含み、
第１の群のコンジュゲートが、１価コンジュゲートの第１の集合物を含み、各１価コンジュゲートは、第１の担体タンパク質、及びストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｅｎｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖を含み、前記第１の集合物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの莢膜多糖を含み、
第２の群のコンジュゲートが、２価及び／又は多価コンジュゲートの第２の集合物を含み、各２価又は多価コンジュゲートは、第２の担体タンパク質、及びストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｖ、９Ｎ、９Ａ及び９Ｂ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ｂ、１５Ａ及び１５Ｃ、並びに、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９Ａ及び１９Ｆからなる群の１又は複数から選択されるストレプトコッカス・ニューモニエの少なくとも２つの莢膜多糖を含み、前記莢膜多糖の１又は複数が、二官能性リンカーにより連結され、前記多価コンジュゲートが、莢膜多糖の量よりも少ない担体タンパク質の量を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

第２の群のコンジュゲートが、２価である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

２価コンジュゲートが、式ＰＳ１－担体タンパク質－ＰＳ２で表される２つの免疫学的に交差反応性の血清型を含み、式中、ＰＳ１及びＰＳ２が異なる多糖を表し、担体タンパク質は、第２の担体タンパク質である、請求項２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

２価コンジュゲートが、同一の担体タンパク質に連続的に又は同時にコンジュゲートされる、請求項２に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

第２の群のコンジュゲートが、２価コンジュゲートを含み、前記２価コンジュゲートの莢膜多糖が、１０ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

二官能性リンカーが、９～４０Åのスペーサーアームをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

第１の担体タンパク質及び／又は第２の担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド断片（ＴＴＨｃ）、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タンパク質ＰｏｒＢ、ＲＳＶウイルスタンパク質、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）タンパク質、ペルツッシストキソイド（ＰＴ）、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）、ヒトパピローマウイルスタンパク質抗原、ヒトパピローマウイルス６９ＫＤａタンパク質、ヒトパピローマウイルスＶＬＰ型、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｂ型肝炎ウイルスＶＬＰ型、ＨＢｓＡｇの誘導体、及び／又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

１回投与量が、４マイクログラム未満を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

第１の担体タンパク質及び第２の担体タンパク質の量が、コンジュゲートの０．５重量％～０．８重量％である、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

第２の群のコンジュゲートが、２価コンジュゲートを含み、前記２価コンジュゲートの莢膜多糖が、３０ＫＤａ～１００ＫＤａの分子量を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

１価コンジュゲートの１又は複数が、リンカーを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

アルミニウム塩、リン酸カルシウム、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬＡ）のリポソーム、サポニンＱＳ－２１、及び強力なＴＬＲ７／８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

アルミニウム塩が、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項１２に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

第２の集合物が、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型９Ｖ、９Ｎ、９Ａ及び９Ｂ、ストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１５Ｂ、１５Ａ及び１５Ｃ、並びにストレプトコッカス・ニューモニエの血清型１９Ａ及び１９Ｆを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ａ型及び／若しくはｂ型、Ｂ群ストレプトコッカス、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）リポオリゴ多糖（ＬＯＳ）、無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＮＴＨｉ）並びに／又はネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）の一又は複数の血清型の莢膜多糖をさらに含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

第２の群のコンジュゲートが、２価コンジュゲートを含み、前記２価コンジュゲートの莢膜多糖が、１００ＫＤａ～３００ＫＤａの分子量を有する、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

１回投与量の投与が、同一の多糖の１価コンジュゲートのみを含む同様のコンジュゲートの投与と比べて、担体タンパク質に対するより低い免疫応答を生じる、請求項１の免疫原性組成物。

【請求項18】

第１の群の１価莢膜多糖、及び第２の群の２価又は多価莢膜多糖を含む免疫原性組成物であって、
前記第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、
前記第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ｖ、９Ｎ、９Ａ及び９Ｂ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ｂ、１５Ａ及び１５Ｃ、並びに、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９Ａ及び１９Ｆからなる群の１又は複数から選択される２以上の多糖を含み、
前記第１の群の１価莢膜多糖は、第１の担体タンパク質に連結した第１のＰＥＧリンカーにそれぞれ共有結合し、
前記第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、第２の担体タンパク質に連結した第２のＰＥＧリンカーにそれぞれ共有結合している、免疫原性組成物。

【請求項19】

２価又は多価莢膜多糖が、ストレプトコッカス・ニューモニエの２つの免疫学的に交差反応性の血清型を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、多糖－ＰＥＧ－担体タンパク質－ＰＥＧ－多糖の構造を含む、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

第２のＰＥＧリンカーに共有結合している２価又は多価莢膜多糖が、第２の担体タンパク質に連続的に又は同時に共有結合される、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

第１の群の１価莢膜多糖及び／又は第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、１０ｋＤａ～５０ｋＤａ、３０ｋＤａ～１００ｋＤａ、及び／又は１００ｋＤａ～３００ｋＤａの莢膜多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項23】

第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、６Ａ－ＰＥＧ－ＣＲＭ１９７－ＰＥＧ－６Ｂの構造を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項24】

第１の担体タンパク質及び／又は第２の担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド断片（ＴＴＨｃ）、ネイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タンパク質ＰｏｒＢ、ＲＳＶウイルスタンパク質、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）タンパク質、ペルツッシストキソイド（ＰＴ）、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）、ヒトパピローマウイルス６９ＫＤａタンパク質、ヒトパピローマウイルスタンパク質抗原、ヒトパピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）型、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｂ型肝炎ウイルスＶＬＰ型、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、及び／又はこれらの組合せを含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項25】

１回投与あたり４マイクログラム以下の総多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項26】

第１の担体タンパク質及び第２の担体タンパク質が、０．５重量％～０．８重量％含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項27】

総担体タンパク質に対して、重量で約等量の莢膜多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項28】

総担体タンパク質に対して、重量でより多い量の莢膜多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項29】

少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項30】

アジュバントが、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬＡ）のリポソーム、サポニンＱＳ－２１、ＴＬＲ７／８アゴニスト、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。

【請求項31】

アルミニウム塩が、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、及び水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ａ型若しくはｂ型、Ｂ群ストレプトコッカス、ネイセリア・メニンギティディス、又はその組み合わせの一又は複数の血清型をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項33】

第１の群の１価莢膜多糖及び／又は第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ａ／ｂ／ｃ／ｄ／ｅ／ｆ、無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＮＴＨｉ）多糖、モラクセラ・カタラーリスリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、又はその組み合わせに由来する、請求項１８に記載の組成物。

【請求項34】

第１の群の１価莢膜多糖及び／又は第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、Ｎ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ－１３５又はＸの莢膜多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項35】

第１の群の１価莢膜多糖及び／又は第２の群の２価又は多価莢膜多糖が、Ｂ群ストレプトコッカス血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＮの莢膜多糖を含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項36】

第１の群の１価莢膜多糖が、第２の群の２価又は多価莢膜多糖と、重量でほぼ等量である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項37】

対象に投与すると、同一の多糖に含まれる１価コンジュゲートと比較して、担体タンパク質に対してより低い免疫応答を生じる、請求項１８に記載の組成物。

【請求項38】

ストレプトコッカスによる感染の効果的な治療又は予防を提供する、請求項１８に記載の組成物。

【請求項39】

治療有効量の薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項40】

ヘモフィルス・インフルエンザ、ネイセリア・メニンギティディス、Ｂ群ストレプトコッカス、及びその組み合わせの莢膜多糖をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項41】

第１の群の１価莢膜多糖、及び第２の群の２価又は多価莢膜多糖を含む免疫原性組成物であって、
前記第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、
前記第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ａ、９Ｂ、９Ｎ及び９Ｖ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃ、並びに、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９Ａ及び１９Ｆからなる群の１又は複数から選択される２以上の多糖を含み、
前記第２の群に含まれないストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１９Ａ及び１９Ｆの多糖は、前記第１の群に含まれ、
前記第１の群の１価莢膜多糖は、第１の担体タンパク質に連結した第１のＰＥＧリンカーにそれぞれ共有結合し、
前記第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、第２の担体タンパク質に連結した第２のＰＥＧリンカーにそれぞれ共有結合している、免疫原性組成物。

【請求項42】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ及び９Ｖの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項44】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、１９Ａ及び１９Ｆの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項45】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項46】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１９Ａ及び１９Ｆの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項47】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１９Ａ及び１９Ｆの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項48】

第１の群の１価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの多糖を含み、第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、９Ａ、９Ｂ、９Ｎ、９Ｖ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１９Ａ及び１９Ｆの多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項49】

第１の群の１価莢膜多糖及び／又は第２の群の２価又は多価莢膜多糖は、１０ｋＤａ～５０ｋＤａ、３０ｋＤａ～１００ｋＤａ、及び／又は１００ｋＤａ～３００ｋＤａの莢膜多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項50】

１回投与当たり、４マイクログラム以下の総多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項51】

第１の担体タンパク質及び第２の担体タンパク質の含量が、０．５重量％～０．７重量％含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項52】

総担体タンパク質に対して、重量で約等量の莢膜多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【請求項53】

総担体タンパク質に対して、重量でより多い量の莢膜多糖を含む、請求項４１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、この全体を特に参照により本明細書に組み込む、２０１７年６月１０日に出願された米国仮出願第６２／５１７，９０５号の優先権を主張するものである。

【0002】

本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートされている細菌莢膜多糖を含む多価コンジュゲート、免疫原性組成物及びワクチン並びにこれらの使用を対象とする。具体的には、本発明の組成物は、１価及び多価の細菌莢膜多糖－タンパク質コンジュゲートを含み、細菌莢膜多糖及びオリゴ糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型に由来する。担体タンパク質は、好ましくは定義された長さの単官能性並びに二官能性リンカーを介して、細菌莢膜多糖とコンジュゲートされ、単官能性又は二官能性リンカーは、ホモ単官能性、ホモ二官能性、ヘテロ単官能性又はヘテロ二官能性でありうる。

【背景技術】

【0003】

ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺炎、菌血症、髄膜炎及び急性中耳炎のような侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）の原因である、グラム陽性病原体である。肺炎は最も一般的な侵襲性肺炎球菌疾患の兆候であり、他方で、気道内に細菌が蔓延すると、中耳感染、副鼻腔炎又は再発性気管支炎をもたらすことがある。肺炎球菌は、化学的に結合した多糖でカプセル化されており、これにより血清型特異性がもたらされる。少なくとも９０個の肺炎球菌の血清型が知られており、約２３個が侵襲性疾患の９０％を占め、莢膜多糖は、貧弱な免疫原である。

【0004】

現在、世界市場で入手可能な３つのＰＣＶワクチン、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）及びＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）が存在する。ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）において見出されない血清型のため及び経時的な血清型置換の可能性のために、肺炎球菌疾患の適用範囲について残存する満たされていない医学的必要性に対処することが必要とされている。ヒトにおいて及び２歳未満の小児において、さらなるストレプトコッカス・ニューモニエ血清型に対する免疫反応を誘導するために使用することができる、免疫原性組成物が必要とされている。

【0005】

莢膜多糖（ＣＰＳ）は、主要な病原性決定基であり、概して、幼児及び小児においてＴ細胞依存性免疫反応を誘導するためには免疫原性が不十分である。担体タンパク質のＣＰＳとのコンジュゲーションは、クラススイッチを受ける免疫反応を誘導することができる。したがって、７価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ－７、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）、１０価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（Ｓｙｎｆｌｏｒｏｘ－１０、ＧＳＫワクチン）及び１３価の肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ－１３、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）が、ＩＰＤの発生を効率的に予防するために開発されている。還元的アミノ化化学及びシアニル化化学は、コンジュゲートワクチンを調製するために、広く使用されている。

【0006】

これらのコンジュゲートにおいて、ＣＰＳと担体タンパク質との間の短いＣ－Ｎ結合（２．１Å）は、担体タンパク質及び低いＣＰＳ／タンパク質比により、ＣＰＳエピトープの立体遮蔽をもたらす。現在のワクチンの不利益を最小化するために、重要なパラメーターが必要とされている。

【0007】

米国特許第９，４９２，５５９号は、コンジュゲートされている莢膜多糖抗原を含む免疫原性組成物及びその使用を開示している。開示された免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物を含む。７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５価の肺炎球菌コンジュゲート組成物も開示されている。

【0008】

国際出願公開第２０１４／０９７０９９Ａ２号は、Ｐｒｅｅｖｎａｒ－１３価コンジュゲートに加えて、数種の血清型を対象とするグリココンジュゲーション方法を開示している。新規の多糖コンジュゲートが、ワクチンの有効性を増加させるために、製剤に加えられる。

【0009】

米国特許出願公開第２０１１／０２３５２６号は、１５価肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチン組成物を開示している。この特許は、現在入手可能な１～３つのワクチンに２つ以上の血清型を加えることにより作製された、１５価コンジュゲートワクチンを対象とする。

【0010】

国際出願公開第２０１６／２０７９０５号は、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを開示している。この出願は、１３価以上のコンジュゲートワクチン及び血清型６Ａの欠失を対象とする。

【0011】

米国特許出願公開第２０１７／００７７１３号は、官能性が強化された、（（２－オキソエチル）チオ）を含有するリンカーを開示している。

【0012】

国際出願公開第２０１４／０９２３７７号は、１２個の血清型が、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択され、１つが１２又は９Ｎから選択される、１３価組成物を開示している。

【0013】

国際出願公開第２０１４／０９２３７８号は、１３個の異なる多糖－タンパク質コンジュゲートを有し、各コンジュゲートが、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群から選択される１２個の血清型並びに血清型２２Ｆ又は３３Ｆから単離された莢膜多糖を含有する、免疫原性組成物を開示している。

【0014】

中国出願公開第１０１５９０２２４号は、血清型１、２、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆを含有する、１４価肺炎球菌多糖－タンパク質コンジュゲートワクチンを開示している。

【0015】

中国出願公開第１０４０６９４８８号は、１４個の血清型が１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆであった、１４価多糖タンパク質コンジュゲートを開示している。

【0016】

国際出願公開第２０１６２０７９０５号は、ＣＲＭ １９７と血清型１、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆから選択される少なくとも１４個の莢膜多糖のコンジュゲートとを含む、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを開示している。米国特許第８，１９２，７４６号は、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートされている、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに由来する莢膜多糖を含む、１５価免疫原性組成物を開示している。

【0017】

国際出願公開第２０１３／１９１４５９号は、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆの血清型由来のＳ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖を含む、１５価組成物を開示している。

【0018】

中国出願公開第１０３６５６６３２号は、血清型６Ａ並びに１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、ｌ０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆからなる群から選択される少なくとも１つの追加の血清型を含有し、２４個の異なる肺炎球菌血清型に対する防御を提供する、多価肺炎球菌莢膜多糖組成物を開示している。

【0019】

中国出願公開第１０３６５６６３１号は、２４個の異なる血清型、すなわち、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、ｌ０Ａ、ｌｌＡ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの肺炎球菌の莢膜多糖を含む、多価肺炎球菌莢膜多糖－タンパク質コンジュゲート組成物を開示している。

【0020】

米国特許出願公開第２０１６／０３２４９５０号は、Ｂ群ストレプトコッカス（ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＢＳ）とも称される、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来の莢膜多糖（ＣＰ）及び担体タンパク質を含み、ＣＰが血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸからなる群から選択される、免疫原性多糖－タンパク質コンジュゲートを開示している。これは、慢性糖尿病、がん、心不全、神経学的及び泌尿器科学的状態の治療のためであった。担体タンパク質莢膜多糖コンジュゲートは多様であった。

【0021】

米国特許第５，３６０，８９７号は、少なくとも２つのカルボニル基を有する、細菌病原体であるＳ．ニューモニエのインタクトな莢膜ポリマーの還元的アミノ化生成物及び細胞毒素又はトキソイドを含む免疫原性コンジュゲートであって、莢膜ポリマーと毒素又はトキソイドとの間に直接共有結合が存在する架橋コンジュゲートを含む、免疫原性コンジュゲートを開示している。

【0022】

米国特許第７，８６２，８２３号は、少なくとも２つの異なる担体タンパク質を含む、多価コンジュゲートワクチン組成物を記述している。

【0023】

米国特許第８，８０８，７０８号は、血清型が１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなり、担体タンパク質がＣＲＭＩ９７である、多糖－タンパク質コンジュゲートからなる１３価免疫原性組成物を開示している。

【0024】

米国特許出願公開第２００９／００１７０５９号は、血清型１９Ａ及び１９Ｆが異なる細菌トキソイドとコンジュゲートされている、免疫原性組成物を開示している。

【0025】

国際出願公開第２０１１／１１０２４１号は、免疫原性組成物又はワクチンの異なる成分について異なるコンジュゲーション化学が使用された、肺炎球菌コンジュゲート免疫原性組成物又はワクチンを記述している。少なくとも１つの血清型のコンジュゲーションについて還元的アミノ化が使用され、異なる血清型のコンジュゲーションについて還元的アミノ化以外のコンジュゲーションが使用されていた。異なる血清型について選択されるコンジュゲーション方法により、糖エピトープを最も良好に提示させるコンジュゲーション方法を使用して、各血清型が提示された。いくつかの肺炎球菌糖は、還元的アミノ化を使用して良好にコンジュゲートされ、一方、他の肺炎球菌糖は異なってコンジュゲートされ、環構造を壊れないままにさせ、より良い結果を提供する。

【0026】

米国特許第７，９５５，６０５号は、血清型１９Ａからなる担体タンパク質多糖コンジュゲートを作製する方法であって、活性化血清型１９Ａ多糖及び担体タンパク質をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁させて、コンジュゲートを形成する方法を開示している。

【0027】

米国特許出願公開第２０１０／００７４９２２号は、１０個以上の血清型を含有する免疫原性組成物であって、１９Ｆ莢膜糖が、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）とコンジュゲートされ、血清型１８Ｃ莢膜糖が、破傷風トキソイドとコンジュゲートされ、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４及び２３Ｆ莢膜糖が、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）由来のタンパク質Ｄとコンジュゲートされている、免疫原性組成物を開示している。

【0028】

米国特許出願公開第２０１０／０２３９６０４号は、多価Ｓ．ニューモニエ莢膜糖コンジュゲートを含む組成物であって、血清型１９Ａが、第１の細菌トキソイドとコンジュゲートされ、１９Ｆが、第２の細菌トキソイドとコンジュゲートされ、Ｓ．ニューモニエ莢膜糖の２～９つが、タンパク質Ｄとコンジュゲートされている、組成物を開示している。より多数の血清型に対する防御を提供するワクチンの開発による防御の範囲の増加とは別に、合成の新規の方法を開発することに集中した取り組みがなされている。

【0029】

米国特許第７，７０９，００１号は、莢膜多糖の担体タンパク質コンジュゲートの合成の方法であって、１）精製した多糖を弱酸と反応させて小型化をもたらすステップ、２）２価陽イオンの存在下で、ステップ１の多糖を酸化剤と反応させて、活性化多糖をもたらすステップ、３）活性化多糖を担体タンパク質と化合させるステップ、４）ステップ３の活性化多糖及び担体タンパク質を還元剤と反応させて、多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップ及び５）ステップ４の生成物中の未反応のアルデヒドをキャッピングして、免疫原性多糖－担体タンパク質コンジュゲートを得るステップからなる、方法を記述している。

【0030】

国際出願公開第２０１４／０９７０９９号は、担体タンパク質コンジュゲートを合成する方法であって、ａ）水性溶媒中で、糖を２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）及びＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化糖を生成するステップ並びにｂ）活性化糖を、１つ以上のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップを含む、方法を開示している。

【0031】

米国特許出願公開第２０１２／３２１６５８号は、血清型１、３、１９Ａ及び１９Ｆが、還元的アミノ化以外の化学によって直接的又は間接的のいずれかで、タンパク質担体に結合結合しており、１つ以上の異なる糖が、還元的アミノ化によりタンパク質担体）と結合結合している血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ及び２３Ｆからなる第２の群から選択される、免疫原性組成物を開示している。

【0032】

肺炎球菌ワクチンは、１）肺炎球菌多糖ワクチン及び２）肺炎球菌コンジュゲートワクチンをベースとする。Ｍｅｒｃｋから販売されているＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）は、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８ｅ、１９Ｆ、１９Ａ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆに属する非コンジュゲート多糖を含んでなる。幼児及び低年齢小児は、大半の肺炎球菌多糖に不十分にしか反応しない。不十分な免疫原の免疫原性は、担体タンパク質とコンジュゲートすることにより強化される。多糖タンパク質コンジュゲートワクチンは、タンパク質担体と結合している莢膜多糖を使用して作製される。コンジュゲートは、特定の血清型に対するＴ細胞依存性の強化された免疫反応を誘導する。

【0033】

コンジュゲートは、さまざまな長さのホモ二官能性、ヘテロ二官能性リンカーのような多様な試薬を使用して合成される。３つの肺炎球菌コンジュゲートワクチン、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）及びＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）が、市場で入手可能である。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は、ＣＲＭ１９７と名付けられている担体タンパク質とそれぞれコンジュゲートしている、血清型４、６Ｂ、９Ｙ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖を含有する、７価ワクチンである。ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）は、ＮＴＨｉ由来のタンパク質Ｄとコンジュゲートされている１０個の莢膜多糖を組み込んだ、３つのさらなる肺炎球菌株である血清型１、５及び７Ｆに対する適用範囲を提供する、ＧＳＫ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの１０価ワクチンである。ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）は、ＣＲＭ１９７と名付けられている担体タンパク質とコンジュゲートされている、ストレプトコッカス・ニューモニエの１３個の血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｙ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆ）から調製されている１３個の莢膜多糖を含有する、１３価ワクチンである。

【0034】

増加しつつある抗生物質への微生物耐性及び増加しつつある免疫不全者の数は、さらなるより広い防御を有する肺炎球菌ワクチンの開発を必要とし、これにより、特に、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）において見出されない血清型による肺炎球菌疾患の適用範囲について、より多くの血清型に対して有効な多価ワクチンの開発がもたらされてきた。特定の血清型についての必要性は、地域及び発生した抗生物質耐性に依存する。したがって、米国特許第８１９２７４６号は、１５個の別個の多糖－タンパク質コンジュゲートを有する、多価免疫原性組成物を報告している。各コンジュゲートは、担体タンパク質ＣＲＭ１９７とコンジュゲートされている、ストレプトコッカス・ニューモニエ（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９＼１、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ又は３３Ｆ）の血清型から調製された莢膜多糖からなる。血清型１５Ｂ、１５Ｃ及び１５Ａに対する免疫反応を誘導するワクチンが必要とされている。

【0035】

多価コンジュゲートワクチン製剤における多糖抗原数の増加と共に、担体タンパク質の含有量が増加する。この増加は、全身的な過剰負荷を引き起こすことがある、担体タンパク質に対する免疫反応の増加をもたらす。

【0036】

したがって、増加しつつある血清型数に対して防御を提供する、肺炎球菌ワクチンを開発する必要がある。コンジュゲーションによるより高い価のワクチンは非常に望ましいが、担体タンパク質に対する免疫反応も低下させることが好ましい。さらなる血清型への防御の範囲を広げる多価ワクチンの開発において、コンジュゲートワクチンの免疫原性及び結合活性を改善し、すべてに対する免疫反応を損なうことなく、増えつつある血清型数を受け入れる必要があり、これは従来のコンジュゲーション方法では不可能である。増えつつある血清型数に対する防御に加え、増えつつある血清型数にさえ対する免疫反応を改善し、並びに担体タンパク質反応を低下させる（及び立体障害も避ける）ために、コンジュゲーションのための新規のリンカーを開発する必要もある。

【0037】

多数の参考文献が現在入手可能なワクチンの有効性を唱えているが、複数の新規の血清型を加えると、元の血清型に対する数の増加に伴い、免疫反応は低下する。免疫反応の有効性を増加させるための、さらなる血清型が必要とされている。加えて、より大きな有効性は、好ましくは、担体タンパク質に対する免疫反応の低下を含むべきである。したがって、世界中で感染に対する障壁を提供するための、より高い価数の肺炎球菌コンジュゲートワクチンについての大きな必要性が残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0038】

【文献】米国特許第９，４９２，５５９号明細書

【文献】国際公開第２０１４／０９７０９９号

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２３５２６号明細書

【文献】国際公開第２０１６／２０７９０５号

【文献】米国特許出願公開第２０１７／００７７１３号明細書

【文献】国際公開第２０１４／０９２３７７号

【文献】国際公開第２０１４／０９２３７８号

【文献】中国特許出願公開第１０１５９０２２４号明細書

【文献】中国特許出願公開第１０４０６９４８８号明細書

【文献】米国特許第８，１９２，７４６号明細書

【文献】国際公開第２０１３／１９１４５９号

【文献】中国特許出願公開第１０３６５６６３２号明細書

【文献】中国特許出願公開第１０３６５６６３１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３２４９５０号明細書

【文献】米国特許第５，３６０，８９７号明細書

【文献】米国特許第７，８６２，８２３号明細書

【文献】米国特許第８，８０８，７０８号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００９／００１７０５９号明細書

【文献】国際公開第２０１１／１１０２４１号

【文献】米国特許第７，９５５，６０５号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００７４９２２号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２３９６０４号明細書

【文献】米国特許第７，７０９，００１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１２／３２１６５８号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0039】

本発明は、現在の方策及び設計に関連する問題及び不利益を克服し、コンジュゲートされている莢膜糖を含む新規の免疫原性組成物及びこの使用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0040】

本発明の一実施形態は、２つの群のコンジュゲートを含み、群１が１価細菌莢膜多糖コンジュゲートを含み、群２が交差反応性を有する２価細菌莢膜多糖のコンジュゲートを含有する多価コンジュゲートを含む、多価Ｓ．ニューモニエコンジュゲートワクチンを対象とする。好ましくは、群１のコンジュゲートは、１つ以上のＳ．ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１７Ｆ、１８Ｃ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂの１価莢膜多糖コンジュゲートから構成されている。好ましくは、群２のコンジュゲートは、Ｓ．ニューモニエ血清型６Ａ／６Ｂ／６Ｃ／６Ｄの１つ若しくは２つ以上、Ｓ．ニューモニエ血清型９Ｖ／９Ｎ／９Ａ／９Ｂの１つ、若しくは２つ以上、Ｓ．ニューモニエ血清型１５Ｂ／１５Ａ／１５Ｃの１つ、若しくは２つ以上又はＳ．ニューモニエ血清型１９Ａ／１９Ｆの交差反応性血清型の２価又は多価莢膜多糖コンジュゲート、及び担体タンパク質から構成されている。好ましくは、多価Ｓ．ニューモニエコンジュゲートワクチンを構成する第２の群は、Ｓ．ニューモニエ交差反応性血清型の多価コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、２価の単分子であり、細菌莢膜多糖に由来する。好ましくは、ワクチンは、同一の担体タンパク質に連続的に又は同時にコンジュゲートされている、２つの免疫学的に交差反応性の血清型の莢膜多糖を含む。好ましくは、第１の又は第２の群の１価細菌莢膜多糖コンジュゲートは、１０ＫＤａ～５０ＫＤａ、３０ＫＤａ～１００ＫＤａ又は１００ＫＤａ～３００ＫＤａの範囲の分子量で、天然の細菌莢膜多糖から合成される。

【0041】

好ましくは、２つの免疫学的に交差反応性の血清型の２価莢膜多糖は、式ＰＳ１－担体タンパク質－ＰＳ２で表され、また好ましくは、コンジュゲートは６ＡＰＳ－ＣＲＭ１９７－６ＢＰＳを含む。好ましくは、担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド断片（ＴＴＨｃ）、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）タンパク質ＰｏｒＢ、ＲＳＶウイルスタンパク質、Ｂ．ペルツッシス（Ｂ．Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）タンパク質、ペルツッシストキソイド（ＰＴ）、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）、６９ＫＤａタンパク質、ヒトパピローマウイルスタンパク質抗原、ヒトパピローマウイルスＶＬＰ型、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原、Ｂ型肝炎ウイルスＶＬＰ型、ＨＢｓＡｇの誘導体又はこれらの組合せを含む。好ましくは、２価交差反応性多糖コンジュゲートの単回用量は、４マイクログラム以上である同一の２つの多糖ワクチンの１価コンジュゲートと比較して、４マイクログラム未満を含む。

【0042】

好ましくは、多価コンジュゲートワクチン中の総担体タンパク質量は、同一の交差反応性血清型の、各個の多糖のモノコンジュゲートにおいて使用される量よりも、有意に少ない。好ましくは、本発明のワクチンにおいて、２価交差反応性多糖とコンジュゲートされている担体タンパク質の量は、同一の２つの多糖の１価コンジュゲートの担体タンパク質の量と比較して、血清型あたり少ないタンパク質を有するので、したがって、ワクチンにより発生する担体タンパク質免疫反応は、他の、別個の多糖のモノコンジュゲートを含有するものにより作製されたワクチンの担体タンパク質への反応よりも低い。好ましくは、多価コンジュゲートワクチン中の総担体タンパク質含有量は、同一の交差反応性血清型の各個の多糖のモノコンジュゲートの０．５～０．７重量％である（ＰＳ：担体タンパク質の間の比が１：１である）。好ましくは、コンジュゲートワクチンは、アルミニウム若しくはアルミニウム塩、リン酸カルシウム、一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬＡ）のリポソーム、サポニンＱＳ－２１及び／又は強力なＴＬＲ７／８アゴニストからなる群から選択される、少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。好ましくは、少なくとも１つのアジュバントは、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び水酸化アルミニウムからなる群から選択される、アルミニウムアジュバントを含む。好ましくは、細菌多糖は、Ｓ．ニューモニエ及びＨ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ａ、ｂ血清型、Ｓ．ニューモニエ及びＢ群ストレプトコッカス血清型、Ｈ．インフルエンザａ、ｂ血清型又はＮ．メニンギティディス血清型を含む、異なる細菌莢膜多糖及び／又は細菌多糖由来の交差反応性の２つ以上の血清型からなる群から選択される。好ましくは、莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、Ｎ．メニンギティディス、Ｂ群ストレプトコッカス又はモラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）リポオリゴ糖（ＬＯＳ）に由来する多糖を含む。また好ましくは、Ｓ．ニューモニエ莢膜多糖は、６Ａ／６Ｂ／６Ｃ／６Ｄ、９Ｖ／９Ａ／９Ｂ．９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ、１９Ａ／１９Ｆからなる群から選択される血清型及び同様の種類の交差反応性多糖と、免疫化学的に交差反応性である。好ましくは、莢膜多糖は、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型ａ／ｂ／ｃ／ｄ／ｅ／ｆ、無莢膜型ヘモフィルス・インフルエンザ（ＮＴＨｉ）多糖又はモラクセラ・カタラーリスリポオリゴ糖（ＬＯＳ）又はＮ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ、Ｗ－１３５若しくはＸ又はＢ群ストレプトコッカス血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ．ＩＸ及びＮ並びにＮ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｘ及びＷ－１３５に由来する。

【0043】

本発明の別の実施形態は、治療有効量の本発明のコンジュゲートワクチン及び、任意選択的に、薬学的に許容される担体を含む、グラム陽性又はグラム陰性病原体による感染の治療又は予防のためのコンジュゲートワクチンを対象とする。好ましくは、莢膜多糖は、ヘモフィルス・インフルエンザ、Ｎ．メニンギティディス、Ｂ群ストレプトコッカス、Ｎ．メニンギティディス、Ｈ．インフルエンザ、モラクセラ・カタラーリスリポオリゴ糖（ＬＯＳ）及びこれらの組合せに由来する。

【0044】

本発明の別の実施形態は、多糖を担体タンパク質とカップリングさせるための方法であって、多糖を活性化するステップ、約２．０～４０Åの定義された長さのスペーサーアームを活性化多糖に付着させるステップ、及び活性化多糖が付着したスペーサーアームを担体タンパク質に付着させるステップを含む、方法を対象とする。

【0045】

本発明の別の実施形態は、担体タンパク質を多糖とカップリングさせる方法であって、前記担体タンパク質を活性化するステップ、担体タンパク質ジスルフィドを還元して、スルフヒドリル基を生成する、好ましくは２－イミノチオラン（２－ＩＴ）、二官能性リンカーのようなＳＭＰＨを使用してスルフヒドリル基を生成するステップ、４～４０Åの定義された長さのスペーサーアームを活性化担体タンパク質に付着させるステップ、及び多糖を活性化担体タンパク質に付着したスペーサーアームに付着させるステップを含む、方法を対象とする。好ましくは、活性化担体タンパク質は、Ｃ．ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）から得られた若しくはこれに由来する交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）又はＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）若しくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られた若しくはこれらに由来する組換えＣＲＭ１９７からなる群から選択される。

【0046】

本発明の別の実施形態は、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性である二官能性リンカーを対象とする。

【0047】

本発明の別の実施形態は、担体タンパク質が、Ｃ．ジフテリアから得られた交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）、Ｐ．フルオレッセンスから得られた組換えＣＲＭ１９７又はＥ．コリから得られた組換えＣＲＭ１９７である、多価Ｓ．ニューモニエコンジュゲートワクチンを対象とする。

【0048】

本発明の他の実施形態及び利益は、一部には、本明細書の以下の部分において記載されており、一部には、この説明から明らかとすることができ、又は本発明を実践することから学習することができる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1A】血清型６Ａの小型化した莢膜多糖の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）－ＮＭＲデータが、天然のＰＳと比較して構造統合性の喪失がないことを示す図である。

【図1B】血清型６Ｂの小型化した莢膜多糖の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）－ＮＭＲデータが、天然のＰＳと比較して構造統合性の喪失がないことを示す図である。

【図2A】マルチプレックスビーズベースアッセイ手順を使用した（これらのコンジュゲートについて使用した多糖は１０～５０ＫＤａの範囲である）莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）の図である。

【図2B】マルチプレックスビーズベースアッセイ手順を使用した莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）であり、多糖が２００～３００ＫＤａ以上の範囲である、図である。

【図2C】マルチプレックスビーズベースアッセイ手順を使用した６Ａ及び６Ｂ莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）の２価コンジュゲートであり、多糖が１０～５０ＫＤａ及び２００～４００ＫＤａの範囲である、図である。

【図3A】１価コンジュゲート合成の作業フローチャートである。

【図3B】リンカーを用いたＰＳ１及びＰＳ２活性化のフローチャートである。

【図4A】２価単分子コンジュゲート及び２価コンジュゲート合成の作業フローチャートである。

【図4B】ＣＲＭ化学カップリングの図である。

【図5】ＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート、シアヌル酸クロリド（２，４，６－トリクロロ－１，３，５－トリアジン）、臭化シアン（ＣＮＢｒ）の図である。

【図6】イミノチオレンとＣＲＭ１９７のチオール化の図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺炎、菌血症、髄膜炎及び急性中耳炎のような疾患を引き起こすことがある、グラム陽性細菌である。肺炎球菌は、化学的に結合した多糖でカプセル化されており、これにより血清型特異性がもたらされる。少なくとも９０個の肺炎球菌の血清型が知られており、約２３個が侵襲性疾患の９０％を占める。侵襲性肺炎球菌疾患に対する防御は、莢膜多糖に特異的な抗体と関連し、したがって、防御は血清特異的である。

【0051】

担体タンパク質と多糖との間のリンカーを含んでなり、２つの群のコンジュゲートを形成し、群１が１価細菌莢膜多糖コンジュゲートを含み、他の群が多価担体タンパク質コンジュゲートを含む、多価Ｓ．ニューモニエコンジュゲートワクチンが、実質的に改善された結果をもたらすことが、驚くべきことに発見された。特に、２価コンジュゲート及び２価単分子コンジュゲートは、好ましくは、担体タンパク質と、交差反応性Ｓ．ニューモニエ血清型に付着した二官能性リンカーとの間の反応により合成される。達成された結果は、リンカーの代わりに２つの間に直接的なコンジュゲーションを有する同数の血清型を有する、１価細菌莢膜多糖コンジュゲートを含有する、多価Ｓ．ニューモニエコンジュゲートワクチンを含有するワクチンと比較して、実質的に改善された。

【0052】

本発明の一実施形態は、免疫原性が強化された、２価多糖タンパク質コンジュゲートを含んでなる、多価コンジュゲートワクチンを対象とする。一般構造ＰＳ１－担体タンパク質－ＰＳ２を有する２価コンジュゲートは、ＰＳ１及びＰＳ２がグラム陰性及びグラム陽性細菌病原体に由来する２つの異なる血清型多糖である、同様の１価コンジュゲートと比較して、より高い免疫原性を有する。２価コンジュゲートワクチンを開発することにより、ワクチンの有効性は増加し、担体の免疫原性は低下する。本明細書に開示される化学は、コンジュゲートの免疫原性を実質的に増加させ、同時に、担体タンパク質の負荷を低下させる。

【0053】

本発明の別の実施形態は、より低い分子量の多糖及びより長いアームの二官能性リンカーを有し、好ましくは免疫原性が強化された、ワクチンを対象とする。本発明の別の実施形態は、２価コンジュゲートのより高い免疫原性及び結合活性並びに、担体タンパク質のより低い免疫原性を提供することを対象とする。本発明の別の実施形態は、より高い免疫原性により、コンジュゲートワクチンの用量を減少させることを対象とする。

【0054】

本明細書で開示されるように、従来のワクチンの不利益を最小化するために、４つのパラメーターが導入されている。
・多糖のサイズは、好ましくは１０～５０ＫＤａである。
・交差反応性多糖の、担体タンパク質との同時のコンジュゲーション。
・２つ以上の交差反応血清型は、同時に担体タンパク質とコンジュゲートされている。
・好ましくは２～４０Å（また、２～４０Å、４～４０Å、１０～４０Å、２０～４０Å、９～２０Å、５～２０Å、５～３０Å）の、長いヘテロ又はホモ二官能性スペーサーアーム。
これらの４つのパラメーターは、一緒になって、コンジュゲートの多糖／タンパク質比を増加させるため、担体タンパク質の負荷を低下させるため並びに免疫原性及び結合活性に数倍の増加をもたらすために、おおいに有効である。

【0055】

本発明は、免疫原性が強化され、有意に高い抗体力価を示す、多糖－タンパク質コンジュゲートを対象とする。担体タンパク質は、例えば、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド断片（ＴＴＨｃ）、Ｎ．メニンギティディスタンパク質ＰｏｒＢ、ＲＳＶウイルスタンパク質、ペルツッシストキソイド（ＰＴ）などのＢ．ペルツッシスタンパク質、アデニル酸シクラーゼ毒素（ＡＣＴ）、６９ＫＤａタンパク質及びヒトパピローマウイルスタンパク質抗原若しくはこのＶＬＰ型、Ｂ型肝炎コア抗原若しくはこのＶＬＰ型又はＨＢｓＡｇの誘導体並びに他の従来の担体から得られる。多糖断片は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の群、好ましくはＳ．ニューモニエの免疫化学的に交差反応性の多糖から得られる。本発明は、担体タンパク質が、切断及び脱重合された最適な鎖長の多糖断片と反応する、多糖－タンパク質コンジュゲートを調製する方法も対象とする。

【0056】

本発明の免疫原性組成物は、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）及びＳＹＮＦＬＯＲＩＸ－１０（登録商標）において見出されない、Ｓ．ニューモニエ血清型に対する適切なレベル及び改善された防御を提供する。

【0057】

本試験において、短鎖分子サイズ（１０～５０ＫＤａ）を有する、Ｓ．ニューモニエ血清型（６Ａ／６Ｂ、９Ｖ／９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ及び１９Ａ／１９Ｆ並びに同様の交差反応性血清型）の交差反応性多糖を有する２価コンジュゲートを使用して、１６～２６価肺炎球菌ＣＰＳコンジュゲートワクチンを調製した。肺炎球菌６Ａ及び６Ｂ型多糖を、モデル交差反応性ＣＰＳとして使用した。臨床的受容性のために、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した。

【0058】

多価モノコンジュゲートも、担体タンパク質ＣＲＭ１９７を伴うホモ又はヘテロ二官能性ＰＥＧ又は非ＰＥＧリンカーと共に、より短いＰＳ鎖長（０～５０ＫＤａ）、長いスペーサーアーム（９～４０Å）を使用して、調製されている。

【0059】

ＣＰＳを、酸化又はシアニル化化学のいずれかにより活性化し、過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化し、ＣＰＳ中の－反応性アルデヒド又はイソチオシアネート（－ＯＣＮ）基のいずれかに導入した。

【0060】

２つの方策（短い及び長いリンカー、短い及び長いＣＰＳ）を、それぞれ、導入のために使用した。この後、２価コンジュゲートワクチンの物理化学的及び免疫学的特性を、独立して又は多価コンジュゲート製剤と組み合わせて研究した。

【0061】

以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するが、本発明の範囲を限定するものとしてみなすべきではない。

【実施例】

【0062】

［実施例１］ 多価Ｓ．ニューモニエ血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ及び３５Ｂについての、多糖の小型化、活性化及びコンジュゲーション方法

【0063】

６Ａ及び６Ｂ多糖
各々１００ｍｇのＳ．ニューモニエ６Ａ及び６Ｂの莢膜多糖を、ｐＨ２．５～３．０の１０ｍＭ酢酸又は０．１Ｍ ＨＣｌを含有する１０ｍｌの水溶液に溶解し、溶液を６０～８５℃の温度に６０～１２０分間維持することにより、加水分解を実行する。中和後、このように得られたオリゴ糖を、３～１０ＫＤａ ＴＦＦ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを使用して透析ろ過した。^１Ｈ ＮＭＲ分析（図１Ａ及び１Ｂ）すると、形成されたオリゴ糖は、構造統合性エピトープの喪失又は繰り返し単位構造の喪失を示さない。アントロンアッセイを使用して多糖を測定し、得られた分子サイズ分布（ＫＤａ）は、１０～５０ＫＤａ、３０～１００ＫＤａ及び１００～３００ＫＤａの範囲である。

【0064】

ＣＰＳ（５０ｍｇ）部分（≧２００～５００ＫＤａの間のサイズの天然の多糖又は１０～５０ＫＤａの間の小型化した多糖）は、活性化方法において一般的に使用される活性化シアニル化試薬であった（表１）。多糖分子サイズ分布を、（１０～１０００ＫＤａ）Ｐｏｌｌｕｌａｎ混合物を参照基準（Ｓｈｏｄｅｘ、 ＵＳＡからのＰｏｌｌｕｌａｎ基準）として使用した分析で、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ｓｈｏｄｅｘ ＳＢ－４０５及びＳＢ－４０６ ＳＥＣカラム）を使用して決定した。

【0065】

短いスペーサーアームを、ｐＨ５．６～６．０で、３～５時間の、５～８倍モル過剰のＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）との反応により、ＰＳに導入した。長いスペーサーアーム（二官能性リンカー又は長い４アームリンカー）を、ｐＨ５．６～６．０で、３～５時間の、５～１０倍モル過剰との反応により、ＰＳに導入した。

【0066】

【表1】

【0067】

活性化ＰＳは、短いアームリンカー（アジピン酸ジ－ヒドラジド、ＡＤＨ、１７４．２ｇ／ｍｏｌｅ）、サイズが２～４Å～８～２０Åで変動するもう１つのスペーサーアームリンカー（６００ｇ／ｍｏｌ～３．５ｇ／ｍｏｌｅ）とさらに誘導体化する。

【0068】

ジアミン官能基を有するホモ又はヘテロ二官能性ＰＥＧリンカー、例えばＮＨ_２－ＰＥＧ０．６Ｋ－ＮＨ_２、ＮＨ_２－ＰＥＧ３．５Ｋ－ＣＯＯＨが、付着する（表２）。

【0069】

【表2】

【0070】

誘導体化したＣＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）の各２ｍｌの２つのアリコートを、２つのＣＲＭ１９７タンパク質試料（１０ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌのアリコートと、４℃で８～１２時間、混合した。長い及び短いスペーサーアームを有するコンジュゲートを、１００～３００ＫＤａ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した（表３）。

【0071】

【表3】

【0072】

［実施例２］ 異なる分子量の小型化した多糖の活性化
実施例１に記述されたように、合成された異なる分子量のオリゴ糖を活性化した。シアニル化試薬を、活性化方法において一般的に使用した。

【0073】

ＣＤＡＰ（１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ））シアヌル酸クロリド（２，４，６－トリクロロ－１，３，５－トリアジン）又は臭化シアン（ＣＮＢｒ）及びカップリング担体タンパク質（図５及び６を参照）。

【0074】

多糖溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を、２Ｍ ＮａＣｌ又は２００～３００ｍＭ 重炭酸緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中１００ｍｇ／ｍｌ）と共に、ＲＴで４～６分間インキュベートした。１ＮのＮａＯＨ又は１ＮのＨＣｌのいずれかを使用して、ｐＨを１０～１０．５に維持した。この後、ｐＨを８．１～８．２に調整し、ペグ化リンカー（Ｈｚ－ＰＥＧ－ＨＺ）を、ＣＤＡＰで処理したＰＳと８～１２時間、ＲＴで反応させた。反応混合物をデプスフィルターにかけ、続いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌを使用して、１００～３００ＫＤａカットオフｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターに５～８回かけた。

【0075】

小型化した活性化多糖の誘導体化
活性化オリゴ糖を、短鎖ホモ二官能性ヒドラジドリンカーを用いてさらに誘導体化した。典型的な試薬は、アジピン酸ジ－ヒドラジド、ＡＤＨ、分子量１７４．２ｇ／ｍｏｌｅ）であった。ジ－アミン、ジ－ヒドラジド又はアミン若しくはヒドラジド－カルボン酸／アルデヒド官能基を有するホモ又はヘテロ二官能性ＰＥＧリンカー、例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ（１Ｋ～３．５Ｋ）－ＮＨ２、ＨＺ－ＰＥＧ（１～３．５Ｋ）－ＨＺ、ＮＨ２－ＰＥＧ３．５Ｋ－ＣＯＯＨを使用した（表２）。数種の他のホモ又はヘテロ二官能性スペーサーアームも、誘導体化のために使用することができる（表２）。ｐＨ５．８～６．０で３～５時間の５～８倍モル過剰のアジピン酸ジ－ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ）との反応により、短いスペーサーアームをオリゴ糖に導入した。ｐＨ５．８～６．０で、３～５時間、ＲＴでの、５～１０倍モル過剰のリンカーとオリゴ糖との反応により、長鎖リンカー（二官能性リンカー又は長い四官能性リンカー（表２）、番号１２ ４アームリンカー）を多糖に導入した。

【0076】

短い又は長いリンカーを用いた担体タンパク質の誘導体化
担体タンパク質ＣＲＭ１９７を、短鎖ホモ二官能性ヒドラジドリンカーを用いて、さらに誘導体化した。典型的な試薬は、アジピン酸ジ－ヒドラジド、ＡＤＨ、分子量１７４．２ｇ／ｍｏｌｅ）であった。ジ－アミン、ジ－ヒドラジド若しくはアミン又はヒドラジド－カルボン酸／アルデヒド官能基を有するホモ又はヘテロ二官能性ＰＥＧリンカー、例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ（１Ｋ～３．５Ｋ）－ＮＨ２、ＨＺ－ＰＥＧ（１～３．５Ｋ）－ＨＺ、ＮＨ２－ＰＥＧ３．５Ｋ－ＣＯＯＨを使用した（表２）。数種の他のホモ又はヘテロ二官能性スペーサーアームも、表２において列挙されているような誘導体化のために使用することができる。ｐＨ５．８～６．２で、３００～６００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中、３～５時間、ＲＴでの５～８倍モル過剰のアジピン酸ジ－ヒドラジド（Ｓｉｇｍａ）との反応により、短いスペーサーアームを担体タンパク質ＣＲＭ１９７に導入した。ｐＨ５．８～６．２で、３００～６００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中、３～５時間、ＲＴ（室温）での５～１０倍モル過剰のリンカーとオリゴ糖との反応により、長鎖リンカー（二官能性リンカー又は長い四官能性リンカー（表２、番号１２ ４アームリンカー）を担体タンパク質に導入した。

【0077】

［実施例３］ 交差反応性多糖血清型の活性化及び短い又は長いスペーサーアームリンカーの付着（対象の血清型は、６Ａ／６Ｂ、９Ｖ／９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ及び１９Ａ／１９Ｆ又は任意の他の交差反応性血清型である）。

【0078】

Ｓ．ニューモニエ６Ａ及び６Ｂ型の莢膜多糖のＣＲＭ１９７とのコンジュゲーションに由来するオリゴ糖の活性化並びに一級アミノ基のオリゴ糖への導入は、同時である。

【0079】

血清型６Ａ及び６Ｂの天然の又は小型化した多糖（≧２００～４００ＫＤａ）を、実施例１及び２に記述されたような同一の手順を使用して、コンジュゲートした。

【0080】

実施例１において報告されたような、このようにして得られたオリゴ糖混合物を、ＷＦＩ中に溶解し、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌとする。反応の終了時に、３～１０ＫＤａ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを使用した透析ろ過により、オリゴ糖を精製する。

【0081】

アミノ基が導入されたオリゴ糖を、ＤＭＳＯの水溶液（２０～３０％ｖ／ｖ）中、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈して、ＡＤＨの短いリンカー又は長いスペーサーアームリンカーを含有するＤＭＳＯを、オリゴ糖中に導入されたアミノ基に対してモル過剰とする（通常は５～１０：１）。溶液を４～１２時間、ＲＴに維持することにより、反応を実行した。期間の終了時に、３～１０ＫＤａ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを使用して、オリゴ糖を再び精製した。

【0082】

［実施例４］ 肺炎球菌多糖１価コンジュゲートの合成
同一であり又は異なり小型化した２つの別個のアリコート、及び実施例３において合成したような、誘導体化した小型化した多糖（短いスペーサーアームＡＤＨ及び長いスペーサーアームＨＺ－ＰＥＧ－ＨＺを有する）（１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＲＭ１９７タンパク質試料（１０ｍｇ／ｍｌ）の１ｍｌのアリコートと、４℃で８～１２時間、混合した。１００～３００ＫＤａ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、長鎖又は短鎖リンカーの両方を含有するコンジュゲートを精製した。各１価コンジュゲートを、アントロン又はウロン酸アッセイのいずれかにより総多糖含有量について、ＢＣＡ又はＬｏｗｒｙアッセイにより総タンパク質含有量について、アッセイした（表４）。

【0083】

すべての他の交差反応性多糖コンジュゲートは、上記のような同一の手順を使用して作製される。

【0084】

【表4】

【0085】

［実施例４］ １６Ｖ以上の価の肺炎球菌コンジュゲートワクチンの実験製剤
１、３、５、７Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂを含有する血清型についてのニューモ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート及び交差反応性多糖コンジュゲート６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、９Ｎ、１５Ａ、１５Ｂ、１９Ａ及び１９Ｆを組み合わせて、４．０μｇ ＰＳ／ｍＬの最終抗原濃度を得た。塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）溶液、１０～２０ｍＭヒスチジン、コハク酸及び０．００１％ Ｔｗｅｅｎ－２０も、製剤方法中に希釈剤として使用し、リン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ＵＳＡ）を、実験アジュバントとして使用した。１６－Ｖコンジュゲートを、２ｍＬの滅菌バイアルに無菌で充填した。ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）又はＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）を、２つの対照市販ワクチン製剤として使用した。

【0086】

［実施例５］ コンジュゲートの免疫原性試験
ニュージーランド白ウサギモデル（ＮＺＷ）を、この作業において選択し、ニューモＰＳ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの免疫原性を比較した。すべての群からのウサギ（１６－Ｖ｛価｝、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）及びＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標））を、免疫化期間の前後の臨床徴候について試験した。すべての群について、予備免疫、追加抗原投与（７及び１４日）及び終末期の出血（２８日）を回収し、アリコートし、使用までマイナス８０℃で保存した。総ＩｇＧの決定のためのマルチプレックス免疫原性アッセイを、参照標準血清００７（ＣＢＥＲ、ＦＤＡ、ＵＳＡ）を使用する標準プロトコールに従って実施した。参照血清及びウサギ血清を希釈し、肺炎球菌ＣＷＰＳ及び２２Ｆ ＰＳ又は２５ＰＳのいずれかの処置により、交差反応性抗体についてあらかじめ吸着した。ヒトモノクローナル抗多糖抗体（Ｐａｍｌｉｃｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、ＵＳＡ）を、総ＩｇＧ推定のために使用した。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。マルチプレックスリーダーを、製造元の指示に従って使用した（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃを参照）。

【0087】

［実施例５］ Ｓ．ニューモニエ交差反応性莢膜多糖血清型の活性化並びに短い及び長いスペーサーリンカーの付着
交差反応性血清型である血清型６Ａ／６Ｂ、９Ｖ／９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ及び１９Ａ／１９Ｆを、莢膜多糖及び担体タンパク質を含有する２価コンジュゲートの合成のために使用する。定義上、２価コンジュゲートは、ＣＲＭ １９７に同時に又は並行して付着した２つの莢膜多糖を含有する。

【0088】

Ｓ．ニューモニエ６Ａ及び６Ｂ型の莢膜多糖に由来する小型化した多糖の活性化、ＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション並びに一級アミノ基又はヒドラジド基のオリゴ糖への導入を、同時に実行した。

【0089】

血清型６Ａ及び６Ｂの天然の多糖又は小型化したオリゴ糖（≧２００～４００ＫＤａ）を、実施例１～４に記述されたような同一の手順を使用して、コンジュゲートした。

【0090】

このようにして得られた小型化した多糖混合物を、注入のために、最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように、水に溶解した。アミノ又はヒドラジド基が導入された、小型化した多糖を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の水溶液中、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＤＭＳＯのパーセンテージは２０～３０％（ｖ／ｖ）の範囲であった。これを、表２において記述されているような、ＡＤＨのような短鎖リンカー又は長鎖リンカーを含有するＤＭＳＯに、小型化した多糖中に導入されたアミノ／ヒドラジド基に対して、モル過剰で（通常は５：１又は１０：１）、より具体的には、８：１で加えた。

【0091】

溶液を室温で４～１２時間の期間、反応を実行した。反応期間の終了時に、３～１０ＫＤａ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを使用して、反応生成物を再び精製した。

【0092】

［実施例６］ ２価コンジュゲート製造としての、６Ａ型及び６Ｂ型のＳ．ニューモニエオリゴ糖とＣＲＭ１９７担体タンパク質との同時の又は並行するコンジュゲーション
１５ｍｇ／ｍｌのＣＲＭ１９７を含有する水溶液を、Ｓ．ニューモニエ６Ａ型の莢膜多糖に由来する、リンカーが付着したオリゴ糖（水中２０～３０％）を含有するＤＭＳＯに加えた。リンカーが付着したオリゴ糖の、ＣＲＭ１９７に対する比は、１：１、２：１、１：２から選択した。このようにして得られた混合物を、緩やかな撹拌下、８～１２時間、室温に維持した。前記時間の終了時、Ｓ．ニューモニエ６Ｂの莢膜多糖に由来する誘導体化オリゴ糖を含有する溶液を加えた。Ｓ．ニューモニエ６Ｂの莢膜多糖の、ＣＲＭ１９７に対するモル比は、１：１、２：１、１：２）から選択した。結果として生じた混合物を、８～１２時間、室温に維持した（表５）。コンジュゲーション反応は、それぞれ、Ｓ．ニューモニエ６Ａ型の莢膜多糖及びＳ．ニューモニエ６Ｂ型の莢膜多糖に由来する、２つの活性化オリゴ糖を、同時に（並行して）ＣＲＭ１９７含有溶液に加えることによっても実行することができる。このようにして得られたオリゴ糖－タンパク質コンジュゲートを、１００～３００ＫＤａ透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂ、ＵＳＡ）を使用して透析し、０．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝６．６～７．０）を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液中に調節し、最終的に０．２２μｍフィルターを介してろ過した。

【0093】

すべての他の交差反応性多糖コンジュゲートは、上記で使用されたような同一の手順を使用して作製された。反応順序は、図３Ａ、３Ｂ、４Ａ及び４Ｂに図示されている。

【0094】

【表5】

【0095】

［実施例７］ １８価以上の価数の肺炎球菌コンジュゲートワクチンの実験的製剤。

【0096】

１、３、５、７Ｆ、１４、１８Ｃ、２２Ｆ、２３Ｆ、３３Ｆ、３５Ｂ（１０個の血清型多糖）を含有する血清型についての肺炎球菌多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲート並びに（６Ａ、６Ｂ）、（９Ｖ、９Ｎ）、（１５Ａ、１５Ｂ）及び（１９Ａ、１９Ｆ）（８つの血清型）の交差反応性多糖コンジュゲートを組み合わせて、２．２～４．４μｇ ＰＳ／ｍＬ（１．１～２．２μｇ／ヒト用量、０．５ｍＬ）の最終多糖濃度を得た。塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）溶液、１０～２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳ緩衝液及び０．００１％ Ｔｗｅｅｎ－２０も、製剤方法中に希釈剤として使用し、リン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ－Ｐｈｏｓ、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、ＵＳＡ）を、実験アジュバントとして使用した。

【0097】

１８価以上の価数（＞２０Ｖ～２４Ｖ）のコンジュゲートを、２ｍＬの滅菌バイアルに無菌で充填した。ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）及び／又はＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ、ＵＳＡ）を、対照として使用した。

【0098】

［実施例９］ コンジュゲートの免疫原性試験。

【0099】

ニュージーランド白ウサギモデル（ＮＺＷ）を、この作業において選択し、肺炎球菌ＰＳ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの免疫原性を比較した。すべての群からのウサギ（１８価以上の価のコンジュゲート、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ及びＰＮＥＵＭＯＶＡＸ（登録商標）－２３（Ｍｅｒｃｋ ＵＳＡ）を、免疫化期間の前後の血清学的力価について試験した。すべての群について、予備免疫、追加抗原投与（７及び１４日）及び終末期時出血（２８日）を回収し、アリコートし、使用まで－８０℃で保存する。総ＩｇＧの決定のための免疫原性アッセイを、参照標準血清００７（ＣＢＥＲ、ＦＤＡ、ＵＳＡ）を使用する標準プロトコールに従って実施した。参照血清及びウサギ血清を希釈し、肺炎球菌ＣＷＰＳ及び非ワクチン血清型２５ＰＳの処置により、交差反応性抗体についてあらかじめ吸着した。ヒト／ウサギ／マウスモノクローナル抗多糖抗体を、総ＩｇＧ推定のために使用した。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ２００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）リーダーを、製造元の指示に従って使用した。

【0100】

ビーズベースＥＬＩＳＡアッセイ方法を使用して測定した、コンジュゲートの免疫原性、すなわち、莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）を、表６に示した。総ＩｇＧ値を、ウサギの免疫原性データにおいて、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）と突き合わせて比較した。１４日のデータは、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）ワクチンと比較した、ＩＶＴ－１８Ｖ－１ワクチンの力価における著しい増加を示している。同様に、ＩＶＴ－１８Ｖ－１のデータは、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）と比較して、ＩｇＧ値に対する著しい追加抗原刺激を有する（表６）。

【0101】

【表6】

【0102】

ビーズベースＥＬＩＳＡアッセイ方法を使用して測定した、コンジュゲートの免疫原性、莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）を表７に示した。総ＩｇＧ値を、ウサギの免疫原性データにおいて、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）と突き合わせて比較した。１４日のデータは、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）ワクチンと比較した、ＩＶＴ－１８Ｖ－２ワクチンの力価における著しい増加を示す。興味深いことに、２価コンジュゲート血清型についてのＩＶＴ－１８Ｖ－２の総ＩｇＧデータ（例えば、６Ａ／６Ｂ、９Ｖ／９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ及び１９Ａ／１９Ｆ）は、１価コンジュゲートを有するＩＶＴ－１８Ｖ－１製剤と比較して、ＩｇＧ値に対する著しい追加抗原刺激を有する。したがって、２価コンジュゲートは、１価コンジュゲートと比較して、より良好な免疫原性を有すると結論づけることができる（表７）。したがって、ＩＶＴ－１８Ｖ－２コンジュゲートワクチン製剤は、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）に対してだけでなく、ＩＶＴ－１８Ｖ－１製剤に対しても、優れた免疫原性を有する。１～３．５Ｋリンカー（ＨＺ－ＰＥＧ－ＨＺ）のいずれかとコンジュゲートされている多糖は、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）におけるような、短いリンカー（ＡＤＨ）又はリンカーのないコンジュゲートと比較して、はるかに高い免疫原性を誘発する。

【0103】

【表7】

【0104】

マルチプレックスビーズベースＥＬＩＳＡアッセイ方法を使用して測定した、コンジュゲートの免疫原性、すなわち、莢膜多糖特異的抗体（総ＩｇＧ）を表８に示した。総ＩｇＧ値を、ウサギの免疫原性データにおいて、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）と突き合わせて比較した。１４日のデータは、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）ワクチンと比較した、ＩＶＴ－１８Ｖ－３ワクチンの力価における著しい増加を示す。興味深いことに、低用量（２．２対１．１ｕｇ用量）のＩＶＴ－１８Ｖ－３製剤の、２価コンジュゲート血清型（例えば、６Ａ／６Ｂ、９Ｖ／９Ｎ、１５Ａ／１５Ｂ及び１９Ａ／１９Ｆ）についての総ＩｇＧデータは、２価コンジュゲート血清型についてのＩＶＴ－１８Ｖ－２製剤と比較して類似したＩｇＧ値を有する。したがって、２価コンジュゲートは、低用量の１価コンジュゲートと比較して、より良好な免疫原性を有すると結論づけることができる。したがって、ＩＶＴ－１８Ｖ－２コンジュゲートワクチン製剤は、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）に対してだけでなく、ＩＶＴ－１８Ｖ－１製剤に対しても、優れた免疫原性を有する。１～３．５Ｋリンカー（ＨＺ－ＰＥＧ－ＨＺ）のいずれかとコンジュゲートされている多糖は、ＰＲＥＶＮＡＲ－１３（登録商標）におけるような、短いリンカー（ＡＤＨ）又はリンカーのないコンジュゲートと比較して、はるかに高い免疫原性を誘発する（表８）。

【0105】

【表8】

【0106】

本発明の他の実施形態及び使用は、本明細書で開示される本発明の仕様及び実践の考慮から、当業者に明らかとなる。すべての刊行物、米国及び外国の特許及び特許出願を含む、本明細書に引用されているすべての参照を、具体的に及び全体的に参照により組み込む。仕様及び実施例が、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲及び精神によってのみ、例示的に考慮されることが意図されている。さらに、「含んでなる」という用語は、「からなる」及び「本質的に～からなる」という用語を含む。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】