(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-30
(45)【発行日】2022-09-07
(54)【発明の名称】腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220831BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220831BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20220831BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220831BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20220831BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20220831BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12Q1/68 ZNA
C12Q1/6886 Z
C12M1/34 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
25
(21)【出願番号】P 2020565478
(86)(22)【出願日】2019-05-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-09
(86)【国際出願番号】 CN2019085583
(87)【国際公開番号】W WO2019223516
(87)【国際公開日】2019-11-28
【審査請求日】2020-11-20
(31)【優先権主張番号】201810494478.2
(32)【優先日】2018-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518221830
【氏名又は名称】広州康立明生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】劉相林
(72)【発明者】
【氏名】趙栄淞
(72)【発明者】
【氏名】鄒鴻志
【審査官】天野 皓己
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５４５４３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７７２７８６５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７３２６０６５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２００８－１１８９１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２２９８７６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０５５４３３５４（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１２－１４９９９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Epigenetics，2013年，Vol. 8, No. 9 ，921-934
【文献】BMC Cancer，2014年，Vol. 14, Article Number 54，P. 1-15
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
Ｃ１２Ｍ １／００ － ３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
上流プライマーは配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有し、下流プライマーは配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する、プライマーペア。
【請求項2】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する、核酸断片。
【請求項3】
配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、プローブ。
【請求項4】
ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出のための、核酸断片、プライマー及び／又はプローブを含み、前記核酸断片は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有し、
前記プライマーにおける上流プライマーは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有し、前記プライマーにおける下流プライマーは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有し、
前記プローブは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子メチル化検出試薬。
【請求項5】
請求項２に記載の核酸断片、請求項１に記載のプライマーペア、請求項３に記載のプローブ、又は請求項４に記載のメチル化検出試薬を含む、キット。
【請求項6】
前記核酸断片を含む第１容器と、増幅に使用される前記プライマーペアを含む第２容器と、前記プローブを含む第３容器とを含む、請求項５に記載のキット。
【請求項7】
腫瘍の検出キットの製造における請求項２に記載の核酸断片、請求項１に記載のプライマーペア、請求項３に記載のプローブ、又は請求項４に記載のメチル化検出試薬の使用であって、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍である、使用。
【請求項8】
腫瘍検出における請求項２に記載の核酸断片、請求項１に記載のプライマーペア、請求項３に記載のプローブ、請求項４に記載のメチル化検出試薬、又は請求項５に記載のキットの使用であって、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍である、使用。
【請求項9】
前記腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項10】
検出の対象となるサンプルは組織、体液又は排泄物である、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項11】
前記組織は腸組織である、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記体液は血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水である、請求項１０に記載の使用。
【請求項13】
前記排泄物は喀痰液、尿液、唾液又は糞便である、請求項１０に記載の使用。
【請求項14】
インビトロの腫瘍のリスクの決定方法であって、請求項２に記載の核酸断片、請求項１に記載のプライマーペア、請求項３に記載のプローブ、請求項４に記載のメチル化検出試薬又は請求項５に記載のキットにより、被験体から得られたサンプルのＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルを検出するステップ（１）と、
前記被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルと正常対照サンプルのメチル化レベルとを比較するステップ（２）と、
前記被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルが前記正常対照サンプルのメチル化レベルよりも高い場合、前記被験体が腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがあることを示し、正常サンプルと腫瘍サンプルを区別するステップ（３）と、
を含み、
前記腫瘍は結腸直腸腫瘍である、
方法。
【請求項15】
ステップ（１）において、被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルの検出が、磁気ビーズ捕捉法により被験サンプルのＤＮＡを抽出するステップａ）と、
被験サンプルのＤＮＡを亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩により転換するステップｂ）と、
メチル化特異的定量ＰＣＲにより検出するステップｃ）と、
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ステップａ）において、磁気ビーズ捕捉法による被験サンプルのＤＮＡの抽出は、被験サンプルを取り、保護液中で混合し、研磨し、遠心分離した後、上清を取るステップと、
上清を再度遠心分離し、上清を取り、溶解液及び特定の相補的なオリゴヌクレオチド核酸断片を有する磁気ビーズを上清液に入れ、インキュベートするステップと、
一部の上清を捨て、磁気ビーズを洗浄して除去し、清潔な遠沈管に移し、洗浄液を加え、室温、１００－２０００ｒｐｍで０．５－５ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、３回繰り返すステップと、
緩衝液で標的遺伝子ＤＮＡを溶出するステップと、
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
（１）ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出機構と、（２）データ処理機構と、
（３）結果出力機構と、
を含む腫瘍の検出システムであって、
前記メチル化検出機構は、請求項２に記載の核酸断片、請求項１に記載のプライマーペア、請求項３に記載のプローブ、請求項４に記載のメチル化検出試薬又は請求項５に記載のキットをさらに含み、
前記腫瘍は結腸直腸腫瘍である、腫瘍の検出システム。
【請求項18】
前記メチル化検出機構は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサーのうちの１種又は複数種を含む、請求項１７に記載の腫瘍の検出システム。
【請求項19】
前記データ処理機構は、ａ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、
ｂ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、
ｃ．同じタイプの被検サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、
ｄ．比較結果に基づいて、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように配置される、請求項１７に記載の腫瘍の検出システム。
【請求項20】
前記結果出力機構は、被験体が腫瘍に罹患する概率又は可能性を出力するために使用される、請求項１７に記載の腫瘍の検出システム。
【請求項21】
前記腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記方法により検出されるサンプルのタイプは、組織、体液又は排泄物である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記組織は腸組織である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記体液は血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水である、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記排泄物は喀痰液、尿液、唾液又は糞便である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、特に腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
結腸直腸がんは、大腸がんとも呼ばれ、消化管の一般的な悪性腫瘍である。中国では結腸直腸がんの発生率は年々増加しており、上海や広州など中国の一部の沿岸地域では、肺がんに次ぐ２位になった。腸がんの形成は、遺伝的欠陥及びエピジェネティックな欠陥の累積によるものであると考えられている。結腸直腸がんの早期発症は潜行性であり、多くの場合明らかな症状がなく、後期では血便、腹痛、下痢などの症状が現れることがある。通常、症状が現れると、既に後期段階になっており、患者に大きな痛みと高価な治療をもたらす。そこで、早期発見、早期診断、早期治療は、結腸直腸がんの発生率と死亡率を減らすための重要な手段である。
【0003】
スクリーニングにより、腸癌及び前癌病変を早期に検出し、病巣を除去することにより、腸癌の発生を防ぐことができる。結腸直腸がんの現在のスクリーニング方法には、主に潜血検査と大腸内視鏡検査が含まれる。しかし、潜血検査は、食物の影響を受けやすく、腺腫の検出率が高くないという問題がある。大腸内視鏡検査は腸がん診断のゴールドスタンダードであるが、スクリーニング方法として使用される場合、群集コンプライアンスが高くない。そのため、高正確性、高コンプライアンスの結腸直腸がんのスクリーニング法が必要である。
【0004】
腸がんの新しいスクリーニング法としての糞便遺伝子検査は、現在ますます注目を集めている。この方法（Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標））は、２０１６年に米国の腸がんスクリーニングガイドラインに組み込まれた。この方法は便利で非侵襲的であり、腸がん及び前がん性腺腫の検出率が高いなどの特徴を有する。結腸直腸がん検出用の高性能糞便遺伝子検出キットを作成するには、糞便ＤＮＡの抽出及びマーカーの選択の２つの主要な障害を克服する必要がある。糞便の組成は複雑であり、下流の反応に対する多くの阻害物があり、そして多くの細菌のＤＮＡがあり、このような混合物からヒト標的遺伝子を抽出するためには、高感度の遺伝子抽出及び精製方法が必要である。一方、ＤＮＡメチル化は腫瘍形成の初期事象であることが研究によって示されているため、腸がんに関連する多くのマーカー、特にＤＮＡメチル化マーカーがある。しかし、多くのメチル化マーカーは、細胞及び組織レベルで良好に機能するが、糞便や血液などのスクリーニング媒体に使用されると、腸がんに対する感度及び特異性は低下する。例えば、ｖｉｍｅｎｔｉｎ遺伝子は、組織において感度が８３％であるが、糞便検体において４６％に下がる。ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２などの遺伝子は同様である。このようなマーカーは、腸がんの臨床的検出に対する真の需要を満たすことができない。従って、糞便において腸がんに対して極めて高い検出感度及び特異性を有するマーカーを選択することは、腸がん糞便遺伝子検出の鍵であり、このようなマーカーは、腸がんの臨床検出に使用されることが期待される。
【発明の概要】
【0005】
上記状況に鑑み、本発明は、腫瘍マーカー、捕捉配列、プライマーペア、プローブ、メチル化検出試薬、キット及びその使用を提供する。糞便において腸がんに対する本発明の腫瘍マーカーの感度は、組織における感度に近く、組織の感度よりもさらに高い。
【0006】
本発明の別の目的は、腫瘍を非侵襲的に検出するマーカー、捕捉配列、プライマーペア、プローブ、メチル化検出試薬、キット及び方法を提供することである。上述した本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術案を提供する。
【0007】
本発明は、腫瘍マーカーの製造におけるＣＯＬ４Ａ１遺伝子の使用を提供する。
【0008】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の配列は、ジーンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００００１３．１１に示される配列と少なくとも９７．８％の同一性を有する。
【0009】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の配列は、ジーンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００００１３．１１に示される配列と少なくとも９８．９％の同一性を有する。
【0010】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の配列は、ジーンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００００１３．１１に示される配列と少なくとも９９．９％の同一性を有する。
【0011】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の配列は、ジーンバンクアクセッション番号ＮＣ＿００００１３．１１に示される配列と１００％の同一性を有する。
【0012】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記腫瘍は結腸直腸腫瘍又は腺腫である。
【0013】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、被検サンプルは組織、体液又は排泄物である。
【0014】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記組織は腸組織である。
【0015】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記体液は、血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含むが、これらに限定されない。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記排泄物は喀痰液、尿液、唾液又は糞便である。
【0016】
本発明は、腫瘍検出試薬又はキットの製造におけるＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬の使用をさらに提供する。
【0017】
前記ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬は、従来技術におけるメチル化検出試薬であってもよい。従来技術には、標的遺伝子のメチル化を検出可能な方法が多くあり、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質のＰＣＲ、定量ＰＣＲ及びＤＮＡチップ、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、重亜硫酸塩シーケンシング法又はパイロシーケンシング法などが挙げられる。各検出方法には、それぞれ対応する試薬があり、これらの試薬は、いずれも本発明のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化の検出に使用できる。
【0018】
本発明は、捕捉配列をさらに提供する。前記捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
ＩＩＩ：与配列番号１に示されるヌクレオチド配列具有少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一性的配列又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＩＶ：Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
Ｉ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
ＩＩＩ：与配列番号１に示されるヌクレオチド配列具有少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一性的配列又は配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＩＶ：Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0019】
本発明は、プライマーペアをさらに提供する。
上流プライマーは、
Ｖ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列、
ＶＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＶＩＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号２に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＶＩＩＩ：Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
Ｘ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＩ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号３に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＩＩ：ＩＸ、Ｘ又はＸＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
上流プライマーは、
Ｖ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列、
ＶＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＶＩＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号２に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＶＩＩＩ：Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
Ｘ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＩ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号３に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＩＩ：ＩＸ、Ｘ又はＸＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0020】
本発明は、プローブをさらに提供する。
前記プローブは、
ＸＩＩＩ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列、
ＸＩＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号４に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＶＩ：ＸＩＩＩ、ＸＩＶ又はＸＶに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
前記プローブは、
ＸＩＩＩ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列、
ＸＩＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号４に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＶＩ：ＸＩＩＩ、ＸＩＶ又はＸＶに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0021】
本発明は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出に対する捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含むＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬をさらに提供する。
【0022】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のＣｐＧアイランドに対して得られた捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
【0023】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、プライマー及び／又はプローブは、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ，ｑＭＳＰ）によりＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化を検出する。
【0024】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のゲノソーム、遺伝子間領域、又はプロモーター領域及びびプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出する。
【0025】
腫瘍組織に存在するメチル化は、潜在的な臨床的価値を有するＤＮＡエピジェネティックな修飾であると考えられている。ゲノソーム、遺伝子間領域、プロモーター領域又はそれに近い領域のいずれにもメチル化が存在し、かつこれらの領域のメチル化はいずれも腫瘍に関連する可能性がある。現在、多くの腫瘍において、腫瘍抑制遺伝子プロモーター又はそれに近い領域のＣｐＧアイランドの異常メチルにより転写の不活性化を引き起こすことが実証された。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のプロモーター領域又は前記プロモーター領域に近い領域のＣｐＧアイランドに対して得られた捕捉配列、プライマー及び／又はプローブを含む。
【0026】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬における前記捕捉配列は、
Ｉ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
ＩＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＩＶ：Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
Ｉ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、
ＩＩＩ：配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号１に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＩＶ：Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0027】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬では、前記プライマーにおける上流プライマーは、
Ｖ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列、
ＶＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＶＩＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号２に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＶＩＩＩ：Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
Ｖ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列、
ＶＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＶＩＩ：配列番号２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号２に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＶＩＩＩ：Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0028】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬では、前記プライマーにおける下流プライマーは、
ＩＸ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
Ｘ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＩ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号３に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＩＩ：ＩＸ、Ｘ又はＸＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
ＩＸ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
Ｘ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＩ：配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号３に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＩＩ：ＩＸ、Ｘ又はＸＩに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0029】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるメチル化検出試薬の前記プローブは、
ＸＩＩＩ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列、
ＸＩＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号４に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＶＩ：ＸＩＩＩ、ＸＩＶ又はＸＶに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
ＸＩＩＩ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列、
ＸＩＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列において１つ又は複数の塩基が修飾、置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、
ＸＶ：配列番号４に示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、或いは配列番号４に示されるヌクレオチド配列のＣｐＧアイランドを有して得られた機能が類似するヌクレオチド配列、及び
ＸＶＩ：ＸＩＩＩ、ＸＩＶ又はＸＶに示される配列の相補的な配列、
のうちのいずれか１つを有する。
【0030】
本発明は、前記捕捉配列、プライマーペア、プローブ又はメチル化検出試薬を含む腫瘍の検出キットをさらに提供する。
【0031】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるキットは、内部が試薬を収容するように区画される１つ又は複数の容器を含む。
【0032】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるキットは、捕捉配列を含む第１容器と、増幅に使用されるプライマーペアを含む第２容器と、プローブを含む第３容器と、を含む。
【0033】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供されるキットは、キットに一般的に使用される試薬、例えば、ｑＭＳＰに一般的に使用される転換剤を含む。このような試薬により、非メチル化のシトシン塩基はウラシルに転換し、メチル化シトシン塩基は変化しない。前記転換剤は、亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩などを含むが、これらに限定されない。また、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の増幅に一般的に使用されるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋イオン及び緩衝液などもある。
【0034】
本発明は、前記捕捉配列、プライマーペア、プローブ、メチル化検出試薬、腫瘍検出におけるキットの使用をさらに提供する。
【0035】
本発明は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルを検出することで、正常サンプルと腫瘍サンプルを区分する腫瘍の検出方法をさらに提供する。
【0036】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、
被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルを検出するステップ（１）と、
被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルと正常対照サンプルのメチル化レベルとを比較するステップ（２）と、
前記被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルが前記正常対照サンプルのメチル化レベルよりも高い場合、前記被験体が腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがあることを示し、正常サンプルと腫瘍サンプルを区別するステップ（３）と、を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のゲノソーム、遺伝子間領域、又はプロモーター領域及びびプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出することで正常サンプルと腫瘍サンプルを区別する。
被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルを検出するステップ（１）と、
被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルと正常対照サンプルのメチル化レベルとを比較するステップ（２）と、
前記被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルが前記正常対照サンプルのメチル化レベルよりも高い場合、前記被験体が腫瘍に罹患しているか又は腫瘍に罹患するリスクがあることを示し、正常サンプルと腫瘍サンプルを区別するステップ（３）と、を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のゲノソーム、遺伝子間領域、又はプロモーター領域及びびプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出することで正常サンプルと腫瘍サンプルを区別する。
【0037】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明は、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子プロモーター領域及びプロモーター領域に近い領域のメチル化レベルを検出することで正常サンプルと腫瘍サンプルを区別する。
【0038】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化レベルは、メチル化特異的ＰＣＲ、又はメチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）、又はメチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質的ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、及びＤＮＡチップ、又はメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、又は重亜硫酸塩シーケンシング法、又はパイロシーケンシング法により検出される。
【0039】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記のメチル化レベルは、メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により検出される。
【0040】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、メチル化レベルは、前記捕捉配列、プライマーペア、プローブ、メチル化検出試薬又は前記キットにより検出される。
【0041】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ステップ（１）では、被験体のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化レベルの検出は、
磁気ビーズ捕捉法により被検サンプルのＤＮＡを抽出するステップａ）と、
被検サンプルのＤＮＡを亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩により転換するステップｂ）と、
メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により検出するステップｃ）と、
を含む。
磁気ビーズ捕捉法により被検サンプルのＤＮＡを抽出するステップａ）と、
被検サンプルのＤＮＡを亜硫酸水素塩、重亜硫酸水素塩又はヒドラジン塩により転換するステップｂ）と、
メチル化特異的定量ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により検出するステップｃ）と、
を含む。
【0042】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、ステップａ）では、磁気ビーズ捕捉法による被検サンプルのＤＮＡの抽出は、
被検サンプルを取り、保護液中で混合し、研磨し、遠心分離した後、上清を取るステップと、
上清を再度遠心分離し、上清を取り、溶解液及び特定の相補的なオリゴヌクレオチド捕捉配列を有する磁気ビーズを上清液に入れ、インキュベートするステップと、
一部の上清を捨て、磁気ビーズを洗浄して除去し、清潔な遠沈管に移し、洗浄液を加え、室温、１００－２０００ｒｐｍで０．５－５ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、３回繰り返すステップと、
緩衝液で標的遺伝子ＤＮＡを溶出するステップと、
を含む。
被検サンプルを取り、保護液中で混合し、研磨し、遠心分離した後、上清を取るステップと、
上清を再度遠心分離し、上清を取り、溶解液及び特定の相補的なオリゴヌクレオチド捕捉配列を有する磁気ビーズを上清液に入れ、インキュベートするステップと、
一部の上清を捨て、磁気ビーズを洗浄して除去し、清潔な遠沈管に移し、洗浄液を加え、室温、１００－２０００ｒｐｍで０．５－５ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、３回繰り返すステップと、
緩衝液で標的遺伝子ＤＮＡを溶出するステップと、
を含む。
【0043】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、検出基準は以下の通りである。限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断し、糞便検体においてＣｔ値の限界値は３２～４２であり、好ましくは、糞便検体においてＣｔ値の限界値は３５．２である。前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値より小さい場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常検体として判断される。組織検体においてメチル化レベル値の限界値は１～１０であり、好ましくは、組織検体においてメチル化レベル値の限界値は３．９である。前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より大きい場合、腫瘍検体として判断され、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以下である場合、正常検体として判断される。この限界値は、実際の状況に応じて調整することができる。
【0044】
本発明は、腫瘍的検出システムをさらに提供する。前記システムは、
（１）ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出機構と、
（２）データ処理機構と、
（３）結果出力機構と、
を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出機構は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサーのうちの１種又は複数種を含む。
（１）ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出機構と、
（２）データ処理機構と、
（３）結果出力機構と、
を含む。
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出機構は、蛍光定量ＰＣＲ装置、ＰＣＲ装置、シーケンサーのうちの１種又は複数種を含む。
【0045】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記メチル化検出機構は、前記捕捉配列、プライマーペア、プローブ、メチル化検出試薬又はキットをさらに含む。
【0046】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記データ処理機構は、
ａ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、
ｂ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、
ｃ．同じタイプの被検サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、
ｄ．比較結果に基づいて、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように配置される。
ａ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを受信し、
ｂ．被検サンプル及び正常対照サンプルのテストデータを記憶し、
ｃ．同じタイプの被検サンプルと正常対照サンプルのテストデータを比較し、
ｄ．比較結果に基づいて、被験体が腫瘍に罹患する確率又は可能性を判断するように配置される。
【0047】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記結果出力機構は、被験体が腫瘍に罹患する概率又は可能性を出力するために使用される。
【0048】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、データ処理機構の判断基準は、以下の通りである。
限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断する。糞便検体においてＣｔ値の限界値は３２～４２であり、好ましくは、糞便検体においてＣｔ値の限界値は３５．２である。前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値より小さい場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常検体として判断される。組織検体においてメチル化レベル値の限界値は１～１０であり、好ましくは、組織検体においてメチル化レベル値の限界値は３．９である。前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より大きい場合、腫瘍検体として判断され、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以下である場合、正常検体として判断される。この限界値は、実際の状況に応じて調整することができる。
限界値に基づいて腫瘍検体及び正常検体を判断する。糞便検体においてＣｔ値の限界値は３２～４２であり、好ましくは、糞便検体においてＣｔ値の限界値は３５．２である。前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値より小さい場合、腫瘍検体として判断され、前記糞便検体のＣｔ値が前記Ｃｔ値の限界値以上である場合、正常検体として判断される。組織検体においてメチル化レベル値の限界値は１～１０であり、好ましくは、組織検体においてメチル化レベル値の限界値は３．９である。前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値より大きい場合、腫瘍検体として判断され、前記組織検体のメチル化レベル値が前記メチル化レベル値の限界値以下である場合、正常検体として判断される。この限界値は、実際の状況に応じて調整することができる。
【0049】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の腫瘍は結腸直腸腫瘍である。
【0050】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明に記載の腫瘍は結腸直腸がん又は腺腫である。
【0051】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、本発明で提供される被検サンプル又はサンプルのタイプは組織、体液又は排泄物である。
【0052】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記組織は腸組織である。
【0053】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記体液は、血液、血清、血漿、細胞外液、組織液、リンパ液、脳脊髄液又は房水を含む。
【0054】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、前記排泄物は喀痰液、尿液、唾液又は糞便である。
【0055】
本発明では、研究により、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子プロモーター領域のメチル化レベルを検出することで、健常者の糞便検体から結腸直腸がん検体が良好に区別されることが発見された。本発明は、この遺伝子を含むメチル化検出試薬により結腸直腸がんを検出するとともに、腸がんの検出感度及び特異性が非常に高い。
【0056】
従来の腸がん検出マーカーに比べ、本発明で提供されるマーカー及び技術案により、非常の高い感度及び特異性で結腸直腸がんを検出できるとともに、糞便における結腸直腸がんに対する検出率が組織検体よりも高い。具体的には、以下の利点を有する。
１、前記技術案の１つでは、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬は、糞便検体において特異性が９５．２％である場合、８５％の結腸直腸がんを検出することができ、結腸直腸がんに対する検出率は組織検体よりも高く、簡単に糞便を検出サンプルとして結腸直腸がんに対して信頼性の高い診断を行うことができる。糞便サンプルは入手され易く、サンプリングが非侵襲的で簡単であり、患者に痛みや不便を与えることはない
１、前記技術案の１つでは、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬は、糞便検体において特異性が９５．２％である場合、８５％の結腸直腸がんを検出することができ、結腸直腸がんに対する検出率は組織検体よりも高く、簡単に糞便を検出サンプルとして結腸直腸がんに対して信頼性の高い診断を行うことができる。糞便サンプルは入手され易く、サンプリングが非侵襲的で簡単であり、患者に痛みや不便を与えることはない
【0057】
２、前記技術案の１つでは、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化検出試薬は、組織検体において特異性が９５．２％である場合、８０％の結腸直腸がんを検出することができる。
【0058】
３、前記技術案の１つでは、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子を含むメチル化検出試薬及び抽出検出方法により、結腸直腸がんと健常者を非常に便利で正確に判断することができる。この遺伝子のメチル化検出試薬は、糞便遺伝子検出キット及び腸がんの臨床検出への使用が期待され得る。
【0059】
４、前記技術案の１つにおける試薬／キットは、メチル化レベルによりがんを検出及び診断する。多くの研究により、メチル化変化は腫瘍発生過程における初期段階であり、異常なメチル化の検出により初期病変がより簡単に発見されることが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【0060】
本発明の実施例又は先行技術における技術案をより明確に説明するために、以下は、実施例又は先行技術の説明に使用される必要がある図面を簡単に紹介する。
【0061】
【図1】実施例１の糞便実験でＣＯＬ４Ａ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線である。
【図2】実施例１の糞便実験におけるＣＯＬ４Ａ１遺伝子の標準曲線増幅スペクトルである。
【図3】実施例２の組織実験におけるＣＯＬ４Ａ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線である。
【図4】比較例２の１９ペアの組織実験におけるＳＦＲＰ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線である。
【図5】比較例２の３６例の糞便実験におけるＳＦＲＰ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0062】
本発明は、腫瘍マーカー、メチル化検出試薬、キット及びその使用を開示し、当業者が本明細書の内容に基づいてプロセスパラメータを適切に改善することができる。すべての同様の置換及び修正は当技術分野の当業者には明らかであり、それらはすべて本発明に含まれるとみなされる。本発明の方法及び使用は、好ましい実施例を通して説明される。当業者は、本発明の内容、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び使用を適切に変更及び組み合わせることで本発明の技術を実現及び使用することができる。
【0063】
本発明で提供される腫瘍マーカー、メチル化試薬、キット及びその使用に用いる原料、補助材料及び試薬はすべて、市場で購入又は合成することができる。
【0064】
差異性メチル化を検出可能なＣｐＧ部位があれば、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のいずれかの核酸断片も本発明に使用できる。ＣｐＧアイランドは核酸配列におけるＣｐＧリッチ領域である。ＣｐＧアイランドは、プロモーターの上流から下流に向かって転写領域まで延びる。プロモーター上のＣｐＧアイランドのメチル化は、通常遺伝子の発現を抑制する。プロモーター内のＣｐＧアイランドは、メチル化の一部であり、ゲノソームにおけるＣｐＧ ｏｐｅｎ ｓｅａには、保存されたＤＮＡメチル化ターゲットが存在する。最近の研究により、非プロモーター領域（例えば、ゲノソーム及びＵＴＲ）メチル化の遺伝子発現に対する相乗効果が発見され、ゲノソームのメチル化は、がんの潜在的な治療標的となる可能性がある。
【0065】
一般的に、CpGアイランドは、CpGが多く含まれるジヌクレオチドのいくつかの領域であり、通常、プロモーター及びその近くの領域に位置する。本発明のCpGアイランドは、CpGジヌクレオチドが多く含まれるプロモーター及びその近くの領域を指すだけでなく、ヘテロメチル化ＣｐＧ部位又は孤立したＣｐＧ部位も含む。
【0066】
通常、ＣｐＧを含む核酸はＤＮＡである。しかし、本発明では、例えば、ＤＮＡ、又はＤＮＡ及びｍＲＮＡ含有ＲＮＡを含むサンプルが適用できる。ＤＮＡ又はＲＮＡは、一本鎖と二本鎖であってもよい。ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド鎖もサンプルに含まれてもよい。
【0067】
本発明における「プライマー」又は「プローブ」は、オリゴヌクレオチドを指し、標的核酸分子（例えば、標的遺伝子）の少なくとも６つの連続したヌクレオチドの配列に相補的な領域を含む。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９又は少なくとも２０個の連続又は非連続のブロックヌクレオチドの配列に相補的な領域を含む。プライマー又はプローブが標的分子の少なくともｘ個の連続したヌクレオチドに相補的な領域を含む場合、前記プライマー又はプローブは、標的分子の少なくともｘ個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％相補的である。いくつかの実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％相補的である。
【0068】
本発明における「検出」は、診断と同様に、結腸直腸腫瘍の早期診断を除いて、結腸直腸腫瘍の中期及び後期診断も含み、また、結腸直腸腫瘍のスクリーニング、リスク評価、予後、疾患の同定、病期の診断、及び治療標的の選択をさらに含む。
【0069】
結腸直腸腫瘍マーカーＣＯＬ４Ａ１の使用により、結腸直腸腫瘍の早期診断は可能になる。がん細胞中でメチル化された遺伝子が臨床的又は形態学的に正常な細胞中でメチル化されたと確定された場合、正常な細胞ががんへ発展していることを示す。このように、結腸直腸がんは、外観が正常な細胞における結腸直腸腫瘍特異的遺伝子ＣＯＬ４Ａ１のメチル化によって早期に診断することができる。
【0070】
早期診断とは、転移前、好ましくは組織又は細胞の形態の観察可能な変化の前にがんの可能性を発見することを指す。
【0071】
結腸直腸腫瘍の早期診断に加え、本発明の試薬／キットは、結腸直腸腫瘍のスクリーニング、リスク評価、予後診断、疾患同定、病期の診断、及び治療標的の選択のために使用されることが期待される。
【0072】
疾患の病期の代替実施形態として、異なる病期又は期間における結腸直腸腫瘍の進行においてサンプルから得られたＣＯＬ４Ａ１のメチル化の程度を測定することによって診断を行うことができる。結腸直腸がんの各段階のサンプルから分離された核酸のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化程度と、異常な細胞増殖がない腸組織におけるサンプルから分離された１つ又は複数の核酸のＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化程度とを比較することにより、サンプルにおける結腸直腸腫瘍の具体的段階を検出することができる。
【0073】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１
１６３例の糞便検体（８０例の結腸直腸がん、８３例の正常検体；全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された）を研磨して遠心分離し、１００ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の捕捉配列を含む）を加え、以下の手順に従って操作した。
実施例１
１６３例の糞便検体（８０例の結腸直腸がん、８３例の正常検体；全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された）を研磨して遠心分離し、１００ｕｌ捕捉磁気ビーズ（ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の捕捉配列を含む）を加え、以下の手順に従って操作した。
【0074】
手順は以下の通りである。
１）大腸内視鏡結果を有する健常者及び結腸直腸腫瘍患者の糞便検体を収集し、１ｇ糞便：４ｍＬ保護液で混合して研磨した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、沈殿を捨てた。
２）１０ｍＬ上清を取り、再度遠心分離し、上清３．２ｍＬを取り、２ｍＬ溶解液及び１００ｕｌ捕捉磁気ビーズＭ１を加え、９２℃で１０ｍｉｎインキュベートし、その後、室温で１時間放置した。
３）磁気スタンドに置き、一部の上清を捨てた後、磁気ビーズを洗浄して除去し、２ｍＬ遠沈管に移し、８００ｕｌ洗浄液Ｗ１を加え、室温、１３００ｒｐｍで１ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、３回繰り返した。
４）５５ｕｌ溶出液を加え、９２℃、１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、３ｍｉｎ内で５０ｕｌ溶出液を新しいＥＰ管に移した。
５）ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により前のステップにおけるＤＮＡ断片をメチル化処理し、最後の溶出液１５ｕｌをｑＭＳＰ検出に使用した。
最後に、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで転換された後のＤＮＡを１５ｕｌ得た。次に、ｑＭＳＰによりＣＯＬ４Ａ１のメチル化のレベルを検出した。
１）大腸内視鏡結果を有する健常者及び結腸直腸腫瘍患者の糞便検体を収集し、１ｇ糞便：４ｍＬ保護液で混合して研磨した後、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取り、沈殿を捨てた。
２）１０ｍＬ上清を取り、再度遠心分離し、上清３．２ｍＬを取り、２ｍＬ溶解液及び１００ｕｌ捕捉磁気ビーズＭ１を加え、９２℃で１０ｍｉｎインキュベートし、その後、室温で１時間放置した。
３）磁気スタンドに置き、一部の上清を捨てた後、磁気ビーズを洗浄して除去し、２ｍＬ遠沈管に移し、８００ｕｌ洗浄液Ｗ１を加え、室温、１３００ｒｐｍで１ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、上清を吸って除去し、３回繰り返した。
４）５５ｕｌ溶出液を加え、９２℃、１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎインキュベートし、磁気スタンドに置き、３ｍｉｎ内で５０ｕｌ溶出液を新しいＥＰ管に移した。
５）ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により前のステップにおけるＤＮＡ断片をメチル化処理し、最後の溶出液１５ｕｌをｑＭＳＰ検出に使用した。
最後に、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅで転換された後のＤＮＡを１５ｕｌ得た。次に、ｑＭＳＰによりＣＯＬ４Ａ１のメチル化のレベルを検出した。
【0075】
ｑＭＳＰ反応系：２５ｕｌ（ヌクレアーゼフリー水８．２ｕｌ、５×Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ＧｏＴａｑ Ｆｌｅｘｉ Ｂｕｆｆｅｒ ５ｕｌ、ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）５ｕｌ、ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）１ｕｌ、ＧｏＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５ｕｌ、フォワードプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（１００ｕＭ））０．１２５ｕｌ、リバースプライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（１００ｕＭ））０．１２５ｕｌ、プローブ（Ｐｒｏｂｅ（１００ｕＭ））０．０５ｕｌ、ＤＮＡ ５ｕｌ）。反応プログラム：９５℃４ｍｉｎ（９５℃２０ｓ、５６℃３０ｓ、７２℃３０ｓ）×４５Ｃｙｃｌｅｓ、３７℃３０ｓ。
【0076】
最後に、標準曲線に基づいて検体における遺伝子のコピー数を計算した。
【0077】
ＣＯＬ４Ａ１遺伝子のメチル化が発生した部位は相対的一定であり、主にプロモーター領域又はその近くのＣｐＧアイランドに位置する。これらの領域に対して１群の捕捉配列、プライマー及びプローブを設計し、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子メチル化検出試薬に使用した。
【0078】
試薬に含まれる捕捉配列、プライマープローブは以下の通りである。
ＣＯＬ４Ａ１の捕捉配列（配列番号１）：５’－ＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣ－３’
ＣＯＬ４Ａ１のｑＭＳＰプライマープローブ：
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）：５’－ＣＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＴＡＴＴＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）：５’－ＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＣＧ－３’
Ｐｒｏｂｅ（配列番号４）：５’－ＣＧＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴ－３’
糞便実験では、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図１に示す。
結腸直腸がんについては、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の検出感度は８３.８％（６７／８０）、特異性は９５．２％（７９／８３）、ＲＯＣ曲線下面積は０．９６５であった（９５％ＣＩ：０．９４１－０．９８９、ｐ＜０．０００１）。
糞便実験では、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の標準曲線増幅スペクトルを図に示す。
標準曲線増幅効率は１０３％、線形性はＲ２＝０．９９３であった。
ＣＯＬ４Ａ１の捕捉配列（配列番号１）：５’－ＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣ－３’
ＣＯＬ４Ａ１のｑＭＳＰプライマープローブ：
Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２）：５’－ＣＧＴＴＴＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＴＡＴＴＣ－３’
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３）：５’－ＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＣＧ－３’
Ｐｒｏｂｅ（配列番号４）：５’－ＣＧＴＡＧＣＧＴＴＧＧＡＡＧＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴ－３’
糞便実験では、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図１に示す。
結腸直腸がんについては、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の検出感度は８３.８％（６７／８０）、特異性は９５．２％（７９／８３）、ＲＯＣ曲線下面積は０．９６５であった（９５％ＣＩ：０．９４１－０．９８９、ｐ＜０．０００１）。
糞便実験では、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の標準曲線増幅スペクトルを図に示す。
標準曲線増幅効率は１０３％、線形性はＲ２＝０．９９３であった。
【0079】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
注：「増幅なし」は、増幅曲線がなく、Ｃｔデータがなく、限界値より大きい範囲に属することを示す。
【0080】
実施例２
１０５ペアの結腸直腸がんと傍がん正常組織検体（全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された）を選択し、Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って、それぞれＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により組織ＤＮＡを抽出した後、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でＤＮＡを転換した。
１０５ペアの結腸直腸がんと傍がん正常組織検体（全て大腸内視鏡検査又は病理的検査により確診された）を選択し、Ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って、それぞれＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により組織ＤＮＡを抽出した後、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でＤＮＡを転換した。
【0081】
次に、ｑＭＳＰによりＣＯＬ４Ａ１のメチル化レベルを検出した。
【0082】
ｑＭＳＰ反応系及びステップは、実施例１の糞便実験と同様である。最後、標準曲線に基づいて検体における遺伝子のメチル化値：（Ｔａｒｇｅｔ／ＡＣＴＢ）＊１００を計算した。用いたｑＭＳＰプライマープローブは実施例１と同様であった。
【0083】
組織実験では、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図３に示す。
結腸直腸がんについては、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の検出感度は８１.９％（８６／１０５）、特異性は９５．２％（１００／１０５）、ＲＯＣ曲線下面積は０．８８４であった（９５％ＣＩ：０．８２９－０．９３９、ｐ＜０．０００１）。
結腸直腸がんについては、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の検出感度は８１.９％（８６／１０５）、特異性は９５．２％（１００／１０５）、ＲＯＣ曲線下面積は０．８８４であった（９５％ＣＩ：０．８２９－０．９３９、ｐ＜０．０００１）。
【0084】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【0085】
比較例１
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により糞便検体のＤＮＡを抽出し、次に、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）又は定量メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により検体中のマーカーのレベルを定性又は定量的に検出する研究がある。この研究では、ＭＳＰにより結腸直腸がんを検出し、電気泳動を実行する必要があるので、操作が不便であり、製品汚染のリスクがある。また、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔにより抽出された糞便中のＤＮＡは、ヒトと細菌の総ＤＮＡであり、ヒトの腫瘍ＤＮＡは極めて少なく、後続のＰＣＲ検出に不利である。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により糞便検体のＤＮＡを抽出し、次に、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）又は定量メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）により検体中のマーカーのレベルを定性又は定量的に検出する研究がある。この研究では、ＭＳＰにより結腸直腸がんを検出し、電気泳動を実行する必要があるので、操作が不便であり、製品汚染のリスクがある。また、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔにより抽出された糞便中のＤＮＡは、ヒトと細菌の総ＤＮＡであり、ヒトの腫瘍ＤＮＡは極めて少なく、後続のＰＣＲ検出に不利である。
【0086】
比較例２
研究によりＳＦＲＰ１遺伝子のメチル化は腸がんに関係があり、糞便においてこの遺伝子のメチル化の程度を検出することにより結腸直腸がんを検出できることが分かった。５３例の糞便検体（２９例の腸がん検体、７例の腺腫検体、１７例の正常検体）実験では、特異性が８６％である場合、８９％の結腸直腸腫瘍を検出することができる（Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｂａｕｅｒ Ｍ， Ｃｒｏｎｅｒ ＲＳ，Ｐｅｌｚ ＪＯ，Ｌｏｄｙｇｉｎ Ｄ，Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ Ｈ，Ｓｔｕｒｚｌ Ｍ，Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｗ，Ｍａｔｚｅｌ ＫＥ．ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ： Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ ｇｅｎｅ．ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＯＬＯＮ＆ＲＥＣＴＵＭ ２００７；５０（１０）：１６１８－２６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １６２６－７．）。
研究によりＳＦＲＰ１遺伝子のメチル化は腸がんに関係があり、糞便においてこの遺伝子のメチル化の程度を検出することにより結腸直腸がんを検出できることが分かった。５３例の糞便検体（２９例の腸がん検体、７例の腺腫検体、１７例の正常検体）実験では、特異性が８６％である場合、８９％の結腸直腸腫瘍を検出することができる（Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｂａｕｅｒ Ｍ， Ｃｒｏｎｅｒ ＲＳ，Ｐｅｌｚ ＪＯ，Ｌｏｄｙｇｉｎ Ｄ，Ｈｅｒｍｅｋｉｎｇ Ｈ，Ｓｔｕｒｚｌ Ｍ，Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｗ，Ｍａｔｚｅｌ ＫＥ．ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ： Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｉｚｚｌｅｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－１ ｇｅｎｅ．ＤＩＳＥＡＳＥＳ ＯＦ ＴＨＥ ＣＯＬＯＮ＆ＲＥＣＴＵＭ ２００７；５０（１０）：１６１８－２６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １６２６－７．）。
【0087】
１９ペアの組織及び３６例の糞便検体において同様にＳＦＲＰ１遺伝子のメチル化レベルが検出された。標的遺伝子の抽出方法は実施例１、２と同様である。１９ペアの組織実験では、ＳＦＲＰ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図４に示す。
結腸直腸がん組織については、ＳＦＲＰ１遺伝子の検出感度は８９％、特異性は９５％、ＲＯＣ曲線下面積は０．９７２であった（９５％ＣＩ：０．９２９－１、ｐ＜０．００１）。
３６例の糞便実験では、ＳＦＲＰ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図５に示す。
結腸直腸がんについては、ＳＦＲＰ１遺伝子の検出感度は６７％、特異性は９４％、ＲＯＣ曲線下面積は０．８９２であった（９５％ＣＩ：０．７９０－０．９９４、ｐ＜０．０００１）。
結腸直腸がん組織については、ＳＦＲＰ１遺伝子の検出感度は８９％、特異性は９５％、ＲＯＣ曲線下面積は０．９７２であった（９５％ＣＩ：０．９２９－１、ｐ＜０．００１）。
３６例の糞便実験では、ＳＦＲＰ１遺伝子により結腸直腸がんを検出したＲＯＣ曲線を図５に示す。
結腸直腸がんについては、ＳＦＲＰ１遺伝子の検出感度は６７％、特異性は９４％、ＲＯＣ曲線下面積は０．８９２であった（９５％ＣＩ：０．７９０－０．９９４、ｐ＜０．０００１）。
【0088】
以上より、ＳＦＲＰ１遺伝子は、結腸直腸がん組織に対して比較的高い検出感度及び特異性を有し、糞便検体においてその感度は大幅に低下した。
【0089】
以上の説明は本発明の好ましい実施形態に過ぎない。当業者は、本発明の原理から逸脱しない限り、いくつかの改良及び修飾を行うことができ、これらの改良及び修飾も本発明の保護範囲に含まれるとみなされるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】