▶ 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院の特許一覧
特許7133159ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-31
(45)【発行日】2022-09-08
(54)【発明の名称】ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての使用方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20220901BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2022031344
(22)【出願日】2022-03-01
【審査請求日】2022-03-02
(31)【優先権主張番号】202210143790.3
(32)【優先日】2022-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522081152
【氏名又は名称】温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
(74)【代理人】
【識別番号】100216471
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬戸 麻希
(72)【発明者】
【氏名】孫維建
(72)【発明者】
【氏名】沈賢
(72)【発明者】
【氏名】南如斌
(72)【発明者】
【氏名】呉昊
(72)【発明者】
【氏名】劉帥
(72)【発明者】
【氏名】王旭輝
(72)【発明者】
【氏名】梁丹娜
(72)【発明者】
【氏名】易永東
(72)【発明者】
【氏名】陳江楠
(72)【発明者】
【氏名】盧建華
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１１９９６２５７（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２１７６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３５８５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３０４４９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ming Bai et al.，Identification of miR-135b as a novel regulator of TGFβ pathway in gastric cancer，Journal of Physiology and Biochemistry，2020年，Vol.76，pp.549-560
【文献】湯浅保仁，TGF-βシグナルの異常と消化管悪性腫瘍，現代医療，1999年，Vol.31, No.6，pp.75(1497)-80(1502)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の使用方法。
【請求項2】
前記ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質はヒトＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質である、ことを特徴とする請求項１に記載の胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ
ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の使用方法。
【請求項3】
前記診断製品は検出キットである、ことを特徴とする請求項１に記載の胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の
使用方法。
【請求項4】
ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用
に関する。
に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、胃癌のスクリーニング検査の方式には主に上部消化管内視鏡検査などがある。しか
し、上部消化管内視鏡検査は先進的な機器設備と専門の操作人員を備える必要があり、技
術要求が高く、費用が高い。また,被験者は比較的苦痛で,依存性が悪く,反復検査や集団
一般検査には適用されなかった。また、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori,Hp)
検出、血清ペプシンプロテアーゼ原(Pepsinogen,PG)検出、胃ペプチド(gastrin-17,G-17)
検出など、胃癌またはその前期病変をスクリーニングする方法もある。しかし、偽陽性率
が高く、感度が低いため、さらなる研究が必要である。
し、上部消化管内視鏡検査は先進的な機器設備と専門の操作人員を備える必要があり、技
術要求が高く、費用が高い。また,被験者は比較的苦痛で,依存性が悪く,反復検査や集団
一般検査には適用されなかった。また、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori,Hp)
検出、血清ペプシンプロテアーゼ原(Pepsinogen,PG)検出、胃ペプチド(gastrin-17,G-17)
検出など、胃癌またはその前期病変をスクリーニングする方法もある。しかし、偽陽性率
が高く、感度が低いため、さらなる研究が必要である。
【0003】
バイオマーカーとは、疾患診断、リスク評価および予後判断に用いられる生体分子を指す
。異なるタイプの癌患者の血漿/血清および尿タンパク質群学分析により、腫瘍の発生と
発展に関連する一連のタンパク質マーカーが発見された。これらのマーカーは、癌のスク
リーニング、診断、および予後モニタリングに用いることができる。臨床的に胃癌診断に
用いられるバイオマーカーの欠乏、特に非侵入性バイオマーカーの発見は意義が大きい。
。異なるタイプの癌患者の血漿/血清および尿タンパク質群学分析により、腫瘍の発生と
発展に関連する一連のタンパク質マーカーが発見された。これらのマーカーは、癌のスク
リーニング、診断、および予後モニタリングに用いることができる。臨床的に胃癌診断に
用いられるバイオマーカーの欠乏、特に非侵入性バイオマーカーの発見は意義が大きい。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク
質の免疫グロブリンＧ抗体の応用を提供する。
さらに、前記ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質はヒトＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質である
。
さらに、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用である。
胃癌血清バイオマーカーは、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質を含む。
本願の選択案は、独立した案としても、相互に組み合わせてもよい。本願のいずれかの態
様における構成は、独立した態様としてもよいし、他の態様と組み合わせてもよい。
さらに、非診断目的の胃癌診断における胃癌血清バイオマーカーとするＴＧＦｂ ＲＩＩ
Ｉタンパク質の応用である。
質の免疫グロブリンＧ抗体の応用を提供する。
さらに、前記ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質はヒトＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質である
。
さらに、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用である。
胃癌血清バイオマーカーは、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質を含む。
本願の選択案は、独立した案としても、相互に組み合わせてもよい。本願のいずれかの態
様における構成は、独立した態様としてもよいし、他の態様と組み合わせてもよい。
さらに、非診断目的の胃癌診断における胃癌血清バイオマーカーとするＴＧＦｂ ＲＩＩ
Ｉタンパク質の応用である。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】各種のサンプルにおけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の含有量および差異を示す図である。
【図2】健康－進行胃癌患者ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図3】ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の含有量およびグループ間差異を示す図である。
【図4】健康－胃癌患者ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質のＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
「ＲＯＣ曲線」または「ＲＯＣプロット」とは、判別閾値に応じる二項分類器システムの
性能変化を示すグラフ曲線である。この曲線は、個々の閾値の設定で真陽性率対偽陽性率
のグラフをプロットすることによって作成される。真陽性率は感度とも呼ばれる。偽陽性
率は１特異性として算出した。このため、ＲＯＣ曲線は、一連の切捨値の範囲内における
真陽性率対偽陽性率（感度ｖｓ（１特異性））をグラフィカルに表示し、臨床的に使用す
る最適な切捨値を選択する方法である。精度をＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）として表すと
、テスト性能を比較するための有用なパラメータが提供される。１に近いＡＵＣは、テス
トが高感度で非常に特異的であることを示し、ＡＵＣが０．５に近い場合、テストは敏感
でも特異的でもないことを示す。
性能変化を示すグラフ曲線である。この曲線は、個々の閾値の設定で真陽性率対偽陽性率
のグラフをプロットすることによって作成される。真陽性率は感度とも呼ばれる。偽陽性
率は１特異性として算出した。このため、ＲＯＣ曲線は、一連の切捨値の範囲内における
真陽性率対偽陽性率（感度ｖｓ（１特異性））をグラフィカルに表示し、臨床的に使用す
る最適な切捨値を選択する方法である。精度をＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）として表すと
、テスト性能を比較するための有用なパラメータが提供される。１に近いＡＵＣは、テス
トが高感度で非常に特異的であることを示し、ＡＵＣが０．５に近い場合、テストは敏感
でも特異的でもないことを示す。
【0007】
「統計学的差異」または「統計学的意義」という用語は、試験試料と対照試料または参照
試料との差異に関し、適切な統計分析を用いる場合、各群の同じ確率が5%未満(例えばp<0
.05)の場合を指す。すなわち,完全ランダムに基づいて同じ結果を得る確率は100回の試み
で5回未満である。当業者は適切な統計分析をどのように選択するかを知っている。典型
的には、研究された変数が正規分布を有するか否かに基づいて(例えば、Kolmogorov-Smir
nov検査を用いる)と同分散性が存在するかどうか(例えばLevene検査を用いる)は、適切な
統計分析を決定する。好ましくは、t検査またはANOVA検査のようなパラメータモデルは、
正規分布および同分散が存在する場合に使用される。また、この2つの要件のうちの少な
くとも1つの要件が満たされていない場合、非パラメータモデルが一般的に使用される。
例えばMannWhitney UチェックやKruskal-Wallis検査である。
試料との差異に関し、適切な統計分析を用いる場合、各群の同じ確率が5%未満(例えばp<0
.05)の場合を指す。すなわち,完全ランダムに基づいて同じ結果を得る確率は100回の試み
で5回未満である。当業者は適切な統計分析をどのように選択するかを知っている。典型
的には、研究された変数が正規分布を有するか否かに基づいて(例えば、Kolmogorov-Smir
nov検査を用いる)と同分散性が存在するかどうか(例えばLevene検査を用いる)は、適切な
統計分析を決定する。好ましくは、t検査またはANOVA検査のようなパラメータモデルは、
正規分布および同分散が存在する場合に使用される。また、この2つの要件のうちの少な
くとも1つの要件が満たされていない場合、非パラメータモデルが一般的に使用される。
例えばMannWhitney UチェックやKruskal-Wallis検査である。
【0008】
本願におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質は、ヒトタンパク質ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ（ｔ
ｙｐｅ ＩＩＩ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ（ＩＩＩ型形質転換成長因子－β受容体）、ベータグリーカンとも呼ばれる）
であり、染色体１の１ｐ３１－３２上のＴＧＦｂ ＲＩＩＩ遺伝子によってコードされ、
ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ遺伝子は１６個のエクソンからなり、２つのプロモーター、近位プロ
モーター、および遠位プロモーターを有する。それらは２つのｍＲＮＡを生成する。ＴＧ
Ｆｂ ＲＩＩＩは、８５１アミノ酸膜貫通タンパク質ポリ糖であり、大きい７６６アミノ
酸細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、および短い４２アミノ酸細胞質ドメインを含
む。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩは、非共有結合ホモダイマーとして細胞表面に発現する。
ｙｐｅ ＩＩＩ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｒｅｃ
ｅｐｔｏｒ（ＩＩＩ型形質転換成長因子－β受容体）、ベータグリーカンとも呼ばれる）
であり、染色体１の１ｐ３１－３２上のＴＧＦｂ ＲＩＩＩ遺伝子によってコードされ、
ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ遺伝子は１６個のエクソンからなり、２つのプロモーター、近位プロ
モーター、および遠位プロモーターを有する。それらは２つのｍＲＮＡを生成する。ＴＧ
Ｆｂ ＲＩＩＩは、８５１アミノ酸膜貫通タンパク質ポリ糖であり、大きい７６６アミノ
酸細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン、および短い４２アミノ酸細胞質ドメインを含
む。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩは、非共有結合ホモダイマーとして細胞表面に発現する。
【0009】
以下、図面を参照して、本願の好ましい態様について詳細に説明する。以下、本発明の実
施の形態における技術的態様について、本発明の実施の形態における図面と併せて、本発
明の実施の形態における技術的態様を明確かつ完全に説明する。以下の実施形態は、本発
明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されない。実施
例において、特定の条件が記載されていない実験方法は、通常、従来の条件、または製造
業者が提案した条件に従う。
施の形態における技術的態様について、本発明の実施の形態における図面と併せて、本発
明の実施の形態における技術的態様を明確かつ完全に説明する。以下の実施形態は、本発
明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されない。実施
例において、特定の条件が記載されていない実験方法は、通常、従来の条件、または製造
業者が提案した条件に従う。
【実施例1】
【0010】
一 血清サンプル取得
募集により、被験者の血清サンプルの合計３３０例が得られ、そのうち３９例が健常者、
１２８例が早期癌、８０例が進行胃癌、１３例が胃炎、２２例が肝臓癌、３２例が結腸直
腸癌、１９例が乳癌であった。
二 血清検測
本実施例では、各被験者の血清試料をＱＡＨ－ＣＵＳＴキットを用いて検出し、各血清試
料中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質含有量を求め、このＱＡＨ－ＣＵＳＴキットは、定
量チップ（Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｘａｘ Ｇｌａｓｓ Ｃｈｉｐ：クォティボディ
・アルキマックス・ガラスチップ）、サンプル希釈液（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ）
、２０×洗浄液Ｉ（２０×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ：ウォッシュバッファＩ）、２０
×洗浄液ＩＩ（２０×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ：ウォッシュバッファＩＩ）、標準
品混合物（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘ＊：
凍結乾燥サイトカイン・スタンダードミックス））、検出抗体混合物（Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｃｋｔａｉｌ：検出抗体カクテル）、Ｃｙ３－ストレプトア
ビジン（Ｃｙ３ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｙｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａ
ｖｉｄｉｎ：Ｃｙ３等価色素共役ストレプトアビジン）、スライド洗浄および乾燥機（Ｓ
ｌｉｄｅ ｗａｓｈｅｒ／Ｄｒｙｅｒ）、およびシールバーを含む。具体的な検出方法は
、次の手順で構成される。
ステップ１：定量チップ乾燥
定量チップをケースから取り出し、室温で２０～３０ｍｉｎ放置した後、包装袋を開け、
シールストリップを外し、その後、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥した
。
ステップ２：標準品調製
ステップ２１：５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標
準混合物を再溶解した。チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末
を上下に軽く吹き、このチューブレットをＳｔｄ１とマークした。
ステップ２２：６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ
５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加した
。
ステップ２３：Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液を
Ｓｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、次いでＳｔｄ２とマークした遠心管から抽出
した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、
このようにＳｔｄ７とマークしたた遠心管まで勾配希釈し、標準液を得た。
ステップ２４：Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を別の新しい遠心管
に抽出し、ＣＮＴＲＬとマークし陰性対照とした。
ステップ３：定量チップの操作手順
ステップ３１：定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を加え、室温でシェ
ーカー上で１ｈインキュベートし、定量チップを封止した。
ステップ３２：各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ＣＮＴＲＬとマークした遠心管か
ら８０μＬの標準液を採取し、血清サンプル（サンプル２倍希釈）とともにウェルに添加
し、４°Ｃで一晩インキュベートした。
ステップ３３：定量チップ（スライド）を洗浄した。本実施例ではチップウェルウォッシ
ャーＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｅｌｌｗａｓｈ Ｖｅｒｓａ（セモス・チ
ェンティフィッチ・ヴェルヴァシュヴェーザ）を用いて、２段階に分けるとした。まず、
１×洗浄液Ｉで洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬの１×洗浄液Ｉで１０回洗浄し、毎回
１０ｓシェーク１０し、シェーク強度がハイレベルとし、脱イオン水で２０×洗浄液Ｉ希
釈した。次いで、流路を１×洗浄液ＩＩで洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬの１×洗浄
液ＩＩで６回洗浄し、毎回１０ｓシェーク１０し、シェーク強度がハイレベルとし、脱イ
オン水で２０×洗浄液ＩＩ希釈した。
ステップ３４：検出抗体混合物の孵育
検出抗体混合物を充填したチューブレットを遠心分離し、次いで１．４ｍｌのサンプル希
釈液を添加し、混合後再度速やかに遠心分離し、次いで各ウェルに検出抗体混合物を８０
μＬ添加し、ＲＴシェーカーで２時間インキュベートした。
ステップ３５：洗浄。ステップ３３と同様。
ステップ３６：Ｃｙ３－ストレプトアビジンのインキュベーション
Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離し、その後、サンプル
希釈液１．４ｍｌを加え、再度速遠心分離後、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各
ウェルに添加し、定量チップ（スライド）をアルミ箔紙で包み込み、光を避けてＲＴシェ
ーカーで１時間インキュベートした。
ステップ３７：洗浄。ステップ３３と同様。
ステップ３８：蛍光検出
レーザースキャナで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネル（励起周波数＝
５３２ｎｍ）を用いた。
本実施例では、InnoScan 300、機器型番:InnoScan 300 MicroarrayScanner;メーカー：In
nopsys;産地:Parc d'Activites Activestre;31 390 Carbonne - France；スキャンパラメ
ータ:WaveLengh:532 nm;Resolution：10μmを採用する。
ステップ３９：ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、
各血清サンプル中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の含有量を求めた。
三 実験結果
図１に示すように、進行胃癌グループにおけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質のレベルが
上昇し、他グループとの統計的意義を有する（ここで、図１の健常グループと胃癌進行グ
ループとの＊＊＊は、統計的差異Ｐ値が０．００１未満であることを示す）をさらにデー
タ解析し、ＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ：受信者操作特性曲線）は、図２に示すように、進行患者のＴＧＦ
ｂ ＲＩＩＩタンパク質のＡＵＣ（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（曲線下面
積）、ＡＵＣ値はＲＯＣ曲線で覆われた領域面積であり、ＡＵＣが大きいほど、２つのグ
ループ区別効果がよりよい）値は０．７９７であった。
募集により、被験者の血清サンプルの合計３３０例が得られ、そのうち３９例が健常者、
１２８例が早期癌、８０例が進行胃癌、１３例が胃炎、２２例が肝臓癌、３２例が結腸直
腸癌、１９例が乳癌であった。
二 血清検測
本実施例では、各被験者の血清試料をＱＡＨ－ＣＵＳＴキットを用いて検出し、各血清試
料中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質含有量を求め、このＱＡＨ－ＣＵＳＴキットは、定
量チップ（Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｘａｘ Ｇｌａｓｓ Ｃｈｉｐ：クォティボディ
・アルキマックス・ガラスチップ）、サンプル希釈液（Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ）
、２０×洗浄液Ｉ（２０×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ：ウォッシュバッファＩ）、２０
×洗浄液ＩＩ（２０×Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ：ウォッシュバッファＩＩ）、標準
品混合物（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｉｘ＊：
凍結乾燥サイトカイン・スタンダードミックス））、検出抗体混合物（Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｃｋｔａｉｌ：検出抗体カクテル）、Ｃｙ３－ストレプトア
ビジン（Ｃｙ３ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｙｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａ
ｖｉｄｉｎ：Ｃｙ３等価色素共役ストレプトアビジン）、スライド洗浄および乾燥機（Ｓ
ｌｉｄｅ ｗａｓｈｅｒ／Ｄｒｙｅｒ）、およびシールバーを含む。具体的な検出方法は
、次の手順で構成される。
ステップ１：定量チップ乾燥
定量チップをケースから取り出し、室温で２０～３０ｍｉｎ放置した後、包装袋を開け、
シールストリップを外し、その後、定量チップを乾燥器または室温で１～２時間乾燥した
。
ステップ２：標準品調製
ステップ２１：５００μＬのサンプル希釈液を標準混合物のチューブレットに添加し、標
準混合物を再溶解した。チューブレットを開く前に、最初に迅速に遠心分離し、溶解粉末
を上下に軽く吹き、このチューブレットをＳｔｄ１とマークした。
ステップ２２：６つのきれいな遠心管をそれぞれＳｔｄ２、Ｓｔｄ３、Ｓｔｄ４、Ｓｔｄ
５、Ｓｔｄ６、Ｓｔｄ７とマークし、各遠心管に２００μＬのサンプル希釈液を添加した
。
ステップ２３：Ｓｔｄ１とマークした遠心管から抽出した１００μＬのサンプル希釈液を
Ｓｔｄ２とマークした遠心管に軽く混合し、次いでＳｔｄ２とマークした遠心管から抽出
した１００μＬのサンプル希釈液をＳｔｄ３とマークした遠心管に添加し、順次類推し、
このようにＳｔｄ７とマークしたた遠心管まで勾配希釈し、標準液を得た。
ステップ２４：Ｓｔｄ７とマークした遠心管から１００μＬの標準液を別の新しい遠心管
に抽出し、ＣＮＴＲＬとマークし陰性対照とした。
ステップ３：定量チップの操作手順
ステップ３１：定量チップの各ウェルに１００μＬのサンプル希釈液を加え、室温でシェ
ーカー上で１ｈインキュベートし、定量チップを封止した。
ステップ３２：各ウェルからサンプル希釈液を吸引し、ＣＮＴＲＬとマークした遠心管か
ら８０μＬの標準液を採取し、血清サンプル（サンプル２倍希釈）とともにウェルに添加
し、４°Ｃで一晩インキュベートした。
ステップ３３：定量チップ（スライド）を洗浄した。本実施例ではチップウェルウォッシ
ャーＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｅｌｌｗａｓｈ Ｖｅｒｓａ（セモス・チ
ェンティフィッチ・ヴェルヴァシュヴェーザ）を用いて、２段階に分けるとした。まず、
１×洗浄液Ｉで洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬの１×洗浄液Ｉで１０回洗浄し、毎回
１０ｓシェーク１０し、シェーク強度がハイレベルとし、脱イオン水で２０×洗浄液Ｉ希
釈した。次いで、流路を１×洗浄液ＩＩで洗浄し、１ウェルあたり２５０μＬの１×洗浄
液ＩＩで６回洗浄し、毎回１０ｓシェーク１０し、シェーク強度がハイレベルとし、脱イ
オン水で２０×洗浄液ＩＩ希釈した。
ステップ３４：検出抗体混合物の孵育
検出抗体混合物を充填したチューブレットを遠心分離し、次いで１．４ｍｌのサンプル希
釈液を添加し、混合後再度速やかに遠心分離し、次いで各ウェルに検出抗体混合物を８０
μＬ添加し、ＲＴシェーカーで２時間インキュベートした。
ステップ３５：洗浄。ステップ３３と同様。
ステップ３６：Ｃｙ３－ストレプトアビジンのインキュベーション
Ｃｙ３－ストレプトアビジンを充填したチューブレットを遠心分離し、その後、サンプル
希釈液１．４ｍｌを加え、再度速遠心分離後、Ｃｙ３－ストレプトアビジン８０μＬを各
ウェルに添加し、定量チップ（スライド）をアルミ箔紙で包み込み、光を避けてＲＴシェ
ーカーで１時間インキュベートした。
ステップ３７：洗浄。ステップ３３と同様。
ステップ３８：蛍光検出
レーザースキャナで信号をスキャンし、Ｃｙ３またはグリーンチャンネル（励起周波数＝
５３２ｎｍ）を用いた。
本実施例では、InnoScan 300、機器型番:InnoScan 300 MicroarrayScanner;メーカー：In
nopsys;産地:Parc d'Activites Activestre;31 390 Carbonne - France；スキャンパラメ
ータ:WaveLengh:532 nm;Resolution：10μmを採用する。
ステップ３９：ＱＡＨ－ＣＵＳＴのデータ解析ソフトウェアを用いてデータ解析を行い、
各血清サンプル中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の含有量を求めた。
三 実験結果
図１に示すように、進行胃癌グループにおけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質のレベルが
上昇し、他グループとの統計的意義を有する（ここで、図１の健常グループと胃癌進行グ
ループとの＊＊＊は、統計的差異Ｐ値が０．００１未満であることを示す）をさらにデー
タ解析し、ＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ：受信者操作特性曲線）は、図２に示すように、進行患者のＴＧＦ
ｂ ＲＩＩＩタンパク質のＡＵＣ（Ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ（曲線下面
積）、ＡＵＣ値はＲＯＣ曲線で覆われた領域面積であり、ＡＵＣが大きいほど、２つのグ
ループ区別効果がよりよい）値は０．７９７であった。
【実施例2】
【0011】
結果の信頼性をさらに証明するために、さらに健常１０例、早期癌１０例、後期癌４０例
の６０人の被験者が採用された。被験者の血清を採取した後、Ｅｌｉｓａ（エリサ）検査
を行った。
本実施例では、各被験者の血清サンプルをＴＧＦｂ ＲＩＩＩ検出キットを用いて検出し
、各血清サンプル中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質含量を求め、このキットは、以下の
成分を含む。
・ TGFb RIII Microplate (Item A): ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ（抗ヒト）ＴＧＦｂ ＲＩＩ
Ｉ抗体で包まれた９６ウェルプレート
・ Wash Buffer Concentrate (20x) (Item B): ２５ｍｌ，２０×濃縮洗浄液
・ Standards (Item C): 再編成Ｈｕｍａｎ（ヒト）ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ標準品
・ Assay Diluent (Item E2): 標準およびサンプルの希釈に使用される１５ｍｌ，５×濃
縮物
・ Detection Antibody TGFb RIII (Item F): ビオチン標識抗ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ抗体
・ HRP-Streptavidin concentrate (Item G): ２００μＬの２００×濃縮ＨＲＰ－ストレ
プトマイシン
・ TMB One-Step Substrate Reagent (Item H): 12 ml of 3,3’,5,5’-tetramethylbenz
idine (TMB)
・ Stop Solution (Item I): ８ｍｌの０．２Ｍ硫酸
一 試薬の準備
１ キットと血清サンプルを室温（１８～２５°Ｃ）にバランスさせた。
２予実験血清サンプルに基づいて２倍に希釈しローディングした。
３ 希釈液（Ｉｔｅｍ（イタム）Ｅ２）を脱イオン水で５倍に希釈した。
４ 標準品（Ｉｔｅｍ Ｃ）調製：標準品（Ｉｔｅｍ Ｃ）を充填したチューブレットを
遠心分離し、その後、４００μＬ，１×希釈液（Ｉｔｅｍ Ｅ２）を標準品（Ｉｔｅｍ
Ｃ）を充填したチューブレットに添加し、均一に混合した後、５００００ｐｇ／ｍｌの標
準貯蔵液となった。標準貯蔵液１００μＬを吸引し、４００μＬ，１×希釈液（Ｉｔｅｍ
Ｅ２）を充填した遠心管に添加し、混合し、ＳＴＤ１とマークした。７つの１．５ｍｌ小
遠心管を準備し、７つのチューブに３００μＬ，１×希釈液（ＩｔｅｍＥ２）を加えて緩
衝液とした。その後、７つの１．５ｍｌの小遠心管を順次ＳＴＤ２、ＳＴＤ３、ＳＴＤ４
、ＳＴＤ５、ＳＴＤ６、ＳＴＤ７、ＳＴＤ８とマークした。そして、ＳＴＤ１の１０００
０ｐｇ／ｍｌの標準貯蔵液を勾配希釈した。２００μＬ，１００００ｐｇ／ｍｌの標準貯
蔵液（即ちＳＴＤ１）をＳＴＤ２チューブレットに添加し、均一に混合した後、ＳＴＤ２
チューブレットの２００μＬ溶液を抽出し、ＳＴＤ３チューブレットに添加し、均一に混
合した。このように順次にＳＴＤ７、ＳＴＤ８が３００μＬ，１ｘ希釈液（ＩｔｅｍＥ２
）となったまで進んで、標準品０ｐｇ／ｍｌを調製した。
５ 濃縮洗浄液（ＩｔｅｍＢ）希釈：濃縮洗浄液（ＩｔｅｍＢ）を脱イオン水で２０倍希
釈し、洗浄バッファーに予備した。
６ 遠心ＴＧＦｂ ＲＩＩＩの抗体（ＩｔｅｍＦ）検出：１００μＬ，１×希釈液（Ｉｔ
ｅｍＥ２）を加えて十分に溶解し、ピペットで上下に軽く吹き、その後、１×希釈液（Ｉ
ｔｅｍＥ２）で８０倍希釈した後、予備にした。
７ ＨＲＰ―ストレプトアビジン（ＩｔｅｍＧ）を遠心分離し、１×希釈液（ＩｔｅｍＥ
２）で２００倍希釈した後、予備した。
二 操作手順
１ 抗体で包んだＥＬＩＳＡプレート（ＩｔｅｍＡ）を室温まで平衡化した後、１００μ
Ｌの標準貯蔵液（ＳＴＤ７）と血清サンプルを対応するウェルに添加し、プレート全体を
シーソーで密封し、４°Ｃで一晩インキュベートした。
２ 調製した１×洗浄バッファーをウェルウォッシャーに添加し、ウェルウォッシャーに
よりプレートを４回洗浄した。洗浄時に各ウェルに３００μＬの洗浄バッファーを加えた
。
３ プレートを洗浄した後、各ウェルに１００μＬの調製したＴＧＦｂ ＲＩＩＩ検出抗
体（ＩｔｅｍＦ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。
４ 洗浄。ステップ２と同様。
５ １ウェルあたり１００μＬのＨＲＰストレプトアビジン（イテムＧ）を室温で４５分
インキュベートした。
６ 洗浄。ステップ２と同様。
７ １００μＬのＴＭＢ発色液（イテムＨ）を各ウェルに添加し、室温で３０ｍｉｎの避
光インキュベートを行った。
８ ターミネーター（イテムＩ）５０μＬを各ウェルに添加した後、酵素マーカー（４５
０ｎｍ）で直ちに結果を読み取った。
９ ソフトウェアｓｉｇｍａｐｌｏｔ１２．０により濃度値を算出した。
得た結果が、図３に示すようになった。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の発現レベルが統
計的に異なることが分かった（図３の健常グループと胃癌初期グループとの間の＊＊は統
計的差異Ｐ値が０．０１未満を示し、胃癌早期群と胃癌後期群との間の＊＊は統計的差異
Ｐ値が０．０１未満を示し、健常群と胃癌後期群との間の＊＊＊は統計的差異Ｐ値が０．
００１未満であることを示した）。さらに胃癌集団と健常集団とのＲＯＣプロット図をプ
ロットし、その胃癌と健常集団を区別するためのＡＵＣ値は０．９８４に達してなった。
血清値が５７５２．９０９ｐｇ／ｍｌを超える血清タンパク質濃度は、２つの集団を区別
するための閾値として使用することができ、すなわち、このＥｌｉｓａキットが血清を検
出するとき、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ発現量が５７５２．９０９ｐｇ／ｍｌを超える集団は胃
癌集団であった。
の６０人の被験者が採用された。被験者の血清を採取した後、Ｅｌｉｓａ（エリサ）検査
を行った。
本実施例では、各被験者の血清サンプルをＴＧＦｂ ＲＩＩＩ検出キットを用いて検出し
、各血清サンプル中のＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質含量を求め、このキットは、以下の
成分を含む。
・ TGFb RIII Microplate (Item A): ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ（抗ヒト）ＴＧＦｂ ＲＩＩ
Ｉ抗体で包まれた９６ウェルプレート
・ Wash Buffer Concentrate (20x) (Item B): ２５ｍｌ，２０×濃縮洗浄液
・ Standards (Item C): 再編成Ｈｕｍａｎ（ヒト）ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ標準品
・ Assay Diluent (Item E2): 標準およびサンプルの希釈に使用される１５ｍｌ，５×濃
縮物
・ Detection Antibody TGFb RIII (Item F): ビオチン標識抗ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ抗体
・ HRP-Streptavidin concentrate (Item G): ２００μＬの２００×濃縮ＨＲＰ－ストレ
プトマイシン
・ TMB One-Step Substrate Reagent (Item H): 12 ml of 3,3’,5,5’-tetramethylbenz
idine (TMB)
・ Stop Solution (Item I): ８ｍｌの０．２Ｍ硫酸
一 試薬の準備
１ キットと血清サンプルを室温（１８～２５°Ｃ）にバランスさせた。
２予実験血清サンプルに基づいて２倍に希釈しローディングした。
３ 希釈液（Ｉｔｅｍ（イタム）Ｅ２）を脱イオン水で５倍に希釈した。
４ 標準品（Ｉｔｅｍ Ｃ）調製：標準品（Ｉｔｅｍ Ｃ）を充填したチューブレットを
遠心分離し、その後、４００μＬ，１×希釈液（Ｉｔｅｍ Ｅ２）を標準品（Ｉｔｅｍ
Ｃ）を充填したチューブレットに添加し、均一に混合した後、５００００ｐｇ／ｍｌの標
準貯蔵液となった。標準貯蔵液１００μＬを吸引し、４００μＬ，１×希釈液（Ｉｔｅｍ
Ｅ２）を充填した遠心管に添加し、混合し、ＳＴＤ１とマークした。７つの１．５ｍｌ小
遠心管を準備し、７つのチューブに３００μＬ，１×希釈液（ＩｔｅｍＥ２）を加えて緩
衝液とした。その後、７つの１．５ｍｌの小遠心管を順次ＳＴＤ２、ＳＴＤ３、ＳＴＤ４
、ＳＴＤ５、ＳＴＤ６、ＳＴＤ７、ＳＴＤ８とマークした。そして、ＳＴＤ１の１０００
０ｐｇ／ｍｌの標準貯蔵液を勾配希釈した。２００μＬ，１００００ｐｇ／ｍｌの標準貯
蔵液（即ちＳＴＤ１）をＳＴＤ２チューブレットに添加し、均一に混合した後、ＳＴＤ２
チューブレットの２００μＬ溶液を抽出し、ＳＴＤ３チューブレットに添加し、均一に混
合した。このように順次にＳＴＤ７、ＳＴＤ８が３００μＬ，１ｘ希釈液（ＩｔｅｍＥ２
）となったまで進んで、標準品０ｐｇ／ｍｌを調製した。
５ 濃縮洗浄液（ＩｔｅｍＢ）希釈：濃縮洗浄液（ＩｔｅｍＢ）を脱イオン水で２０倍希
釈し、洗浄バッファーに予備した。
６ 遠心ＴＧＦｂ ＲＩＩＩの抗体（ＩｔｅｍＦ）検出：１００μＬ，１×希釈液（Ｉｔ
ｅｍＥ２）を加えて十分に溶解し、ピペットで上下に軽く吹き、その後、１×希釈液（Ｉ
ｔｅｍＥ２）で８０倍希釈した後、予備にした。
７ ＨＲＰ―ストレプトアビジン（ＩｔｅｍＧ）を遠心分離し、１×希釈液（ＩｔｅｍＥ
２）で２００倍希釈した後、予備した。
二 操作手順
１ 抗体で包んだＥＬＩＳＡプレート（ＩｔｅｍＡ）を室温まで平衡化した後、１００μ
Ｌの標準貯蔵液（ＳＴＤ７）と血清サンプルを対応するウェルに添加し、プレート全体を
シーソーで密封し、４°Ｃで一晩インキュベートした。
２ 調製した１×洗浄バッファーをウェルウォッシャーに添加し、ウェルウォッシャーに
よりプレートを４回洗浄した。洗浄時に各ウェルに３００μＬの洗浄バッファーを加えた
。
３ プレートを洗浄した後、各ウェルに１００μＬの調製したＴＧＦｂ ＲＩＩＩ検出抗
体（ＩｔｅｍＦ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。
４ 洗浄。ステップ２と同様。
５ １ウェルあたり１００μＬのＨＲＰストレプトアビジン（イテムＧ）を室温で４５分
インキュベートした。
６ 洗浄。ステップ２と同様。
７ １００μＬのＴＭＢ発色液（イテムＨ）を各ウェルに添加し、室温で３０ｍｉｎの避
光インキュベートを行った。
８ ターミネーター（イテムＩ）５０μＬを各ウェルに添加した後、酵素マーカー（４５
０ｎｍ）で直ちに結果を読み取った。
９ ソフトウェアｓｉｇｍａｐｌｏｔ１２．０により濃度値を算出した。
得た結果が、図３に示すようになった。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の発現レベルが統
計的に異なることが分かった（図３の健常グループと胃癌初期グループとの間の＊＊は統
計的差異Ｐ値が０．０１未満を示し、胃癌早期群と胃癌後期群との間の＊＊は統計的差異
Ｐ値が０．０１未満を示し、健常群と胃癌後期群との間の＊＊＊は統計的差異Ｐ値が０．
００１未満であることを示した）。さらに胃癌集団と健常集団とのＲＯＣプロット図をプ
ロットし、その胃癌と健常集団を区別するためのＡＵＣ値は０．９８４に達してなった。
血清値が５７５２．９０９ｐｇ／ｍｌを超える血清タンパク質濃度は、２つの集団を区別
するための閾値として使用することができ、すなわち、このＥｌｉｓａキットが血清を検
出するとき、ＴＧＦｂ ＲＩＩＩ発現量が５７５２．９０９ｐｇ／ｍｌを超える集団は胃
癌集団であった。
【0012】
本願の任意の実施形態は、独立した技術案としてもよいし、他の実施形態と組み合わせて
もよい。本願明細書に記載されたすべての特許及び出版物は、これらが当業者の開示技術
であることを示しており、本願は使用することができる。ここで引用されるすべての特許
および出版物は、それぞれの出版物が具体的に単独で参照されるのと同様に、参照文献に
同様に列挙される。本明細書の本願は、任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の
制限が欠けている場合に実施することができ、ここでは特に説明しない。ここで用いられ
る用語および表現は、それらに限定されるものではなく、記述されたこれらの用語および
解釈を示す意図もなく、いかなる同等の特徴も排除されるものではない。しかし、本願お
よび請求項の範囲内で任意の適切な変更または修正が可能であることが分かる。本明細書
に記載された実施形態は、いくつかの実施形態におけるいくつかの実施形態および特徴で
あることが理解される。当業者は、本明細書の説明の真髄に従って、変更および変更を行
うことができる。これらの変更および変更は、本願の範囲および独立請求項および従属請
求項によって制限される範囲内に属するものとみなされる。
もよい。本願明細書に記載されたすべての特許及び出版物は、これらが当業者の開示技術
であることを示しており、本願は使用することができる。ここで引用されるすべての特許
および出版物は、それぞれの出版物が具体的に単独で参照されるのと同様に、参照文献に
同様に列挙される。本明細書の本願は、任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の
制限が欠けている場合に実施することができ、ここでは特に説明しない。ここで用いられ
る用語および表現は、それらに限定されるものではなく、記述されたこれらの用語および
解釈を示す意図もなく、いかなる同等の特徴も排除されるものではない。しかし、本願お
よび請求項の範囲内で任意の適切な変更または修正が可能であることが分かる。本明細書
に記載された実施形態は、いくつかの実施形態におけるいくつかの実施形態および特徴で
あることが理解される。当業者は、本明細書の説明の真髄に従って、変更および変更を行
うことができる。これらの変更および変更は、本願の範囲および独立請求項および従属請
求項によって制限される範囲内に属するものとみなされる。
【要約】 （修正有）
【課題】ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用に関する。
【解決手段】胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。前記ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質はヒトＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質である、ことを特徴とする胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。前記診断製品は検出キットである、ことを特徴とする胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用。非診断目的の胃癌診断における胃癌血清バイオマーカーとするＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の応用。
【選択図】図１
【解決手段】胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。前記ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質はヒトＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質である、ことを特徴とする胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。前記診断製品は検出キットである、ことを特徴とする胃癌血清バイオマーカー診断製品の調製におけるＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の免疫グロブリンＧ抗体の応用。ＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の胃癌血清バイオマーカーとしての応用。非診断目的の胃癌診断における胃癌血清バイオマーカーとするＴＧＦｂ ＲＩＩＩタンパク質の応用。
【選択図】図１
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
