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▶ オプティカル バイオシステムズ ホールディング インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-01
(45)【発行日】2022-09-09
(54)【発明の名称】分子イメージングおよび関連する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6841 20180101AFI20220902BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20220902BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220902BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220902BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6841 Z
G01N33/483 C
G01N33/53 D
G01N33/53 M
G01N21/64 F
G01N21/64 E
【請求項の数】
8
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019071309
(22)【出願日】2019-04-03
(62)【分割の表示】P 2015561338の分割
【原出願日】2014-03-04
(65)【公開番号】P2019129843
(43)【公開日】2019-08-08
【審査請求日】2019-05-07
(31)【優先権主張番号】61/851,276
(32)【優先日】2013-03-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517118157
【氏名又は名称】オプティカル バイオシステムズ ホールディング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(72)【発明者】
【氏名】ビール マーク
(72)【発明者】
【氏名】クック ロナルド エム．
(72)【発明者】
【氏名】コアッシン ピーター ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】オージャロ アルトゥーロ
(72)【発明者】
【氏名】リュウ ジェクワン
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０１６７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２２８０６８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５１３１３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】OPTICS LETTERS, 2011, 36(2), pp.148-150
【文献】蛋白質 核酸 酵素、２００８年、５３巻、１５号、１９２６～１９３１頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
プローブと標的分子との分子複合体である単一分子のイメージングの方法であって、前記方法は、ａ）検査試料をプローブに露出することで、プローブと標的分子との分子複合体を得るステップであって、前記プローブは、標的分子に特異的に結合する第１の部分と、１つ以上の波長において光と相互作用する１つ以上の蛍光基の結果として検出可能である第２の部分とを備え、前記プローブは、複合体を提供するために標的分子に結合する、ステップと、
ｂ）前記検査試料の領域を前記１つ以上の蛍光基と相互作用する１つ以上の波長の光に露出するステップと、
ｃ）１つ以上のプローブと標的分子との分子複合体の画像を提供するために、２０×の対物レンズの倍率、および合成開口光学系を用いて、前記１つ以上の蛍光基と相互作用する１つ以上の波長の光の前記相互作用からの結果を検出するステップと、
を備え、
前記画像は、少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な解像度を保有し、
前記画像は、検出設定を何も変更しない単一の検出ステップにおいて得られ、
前記画像は、少なくとも２０個の細胞、および、プローブと標的分子との分子複合体を別個に少なくとも１×１０ ２ 個含み、
前記検査試料の厚さは、２μｍ以下である、
方法。
【請求項2】
干渉パターンが、少なくとも４つの光ビーム対の間で重なる部位における、前記検査試料の領域上に生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記標的分子は、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、染色体、ＢｒｄＵを備えるＤＮＡ鎖、ＥｄＵを備えるＤＮＡ鎖、たんぱく質、および小分子からなる標的分子の群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記蛍光基は、蛍光性有機色素、量子ドット、インターカレータ蛍光色素および発現可能な蛍光タンパク質からなる蛍光化合物の群から選択された蛍光化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記画像化面積は、少なくとも１×１０６μｍ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記標的分子はｍＲＮＡ分子であり、かつ、前記プローブは、１つ以上の蛍光基を有するオリゴヌクレオチドプローブである、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記プローブの前記第２の部分は、単一の蛍光標識を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
さらに、少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積を有する画像から、前記分子複合体を定量化するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月６日出願の米国特許仮出願第６１／８５１，２７６号の利益を主張する。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年３月６日出願の米国特許仮出願第６１／８５１，２７６号の利益を主張する。
【0002】
発明の分野
本発明は、一般に、単一分子、または単一分子の１つ以上のコレクションのイメージングと、イメージングに関連する方法とに関する。
本発明は、一般に、単一分子、または単一分子の１つ以上のコレクションのイメージングと、イメージングに関連する方法とに関する。
【背景技術】
【0003】
極小面積（すなわち、１０ｎｍ×１００ｎｍ未満の面積）において単一分子を約３００ｎｍの解像度で検出できる方法が報告されている。例として、蛍光インサイツ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、単一ｍＲＮＡ分子を検出するのに十分に高感度な遺伝子発現の測定方法である。Ｓｉｎｇｅｒによって最初に記載されたように、この方法は、５つのオリゴヌクレオチド・プローブの各ｍＲＮＡ標的への同時ハイブリダイゼーションを含む。非特許文献１。オリゴヌクレオチドは、それぞれ約５０ヌクレオチド長であり、５つまでのフルオロフォアを用いてそれぞれが標識される。ｍＲＮＡ標的は、ハイブリダイゼーションの際に蛍光顕微鏡を用いて回折限界蛍光スポットとして視認可能になる。
【0004】
変更されたＦＩＳＨ法は、Ｒａｊによって開発された。非特許文献２を参照。限られた数の複数標識プローブの代わりに多数の単一標識プローブを用いるこの方法は、Ｓｉｎｇｅｒの元のＦＩＳＨ手順によって提起された、いくつかの問題、すなわち、強く標識されたオリゴヌクレオチドは、合成および精製が難しい；あるフルオロフォアが同じオリゴヌクレオチド上の複数のコピー中に存在するときに、自己消光が生じる；信号が変動しやすい、という問題を克服するために用いられる。非特許文献３を参照。非特許文献４も参照。Ｒａｊの変更された方法は、比較的簡易なプローブ生成および精製を用いて、極めて小さい視野で識別できて正確なｍＲＮＡカウントを供給する均一な信号を生成する。
【0005】
ＳｉｎｇｅｒおよびＲａｊのような科学者の業績にも関わらず、本分野には改良された分子イメージングおよび関連する方法に対するニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｆｅｍｉｎｏ ＡＭ， Ｆａｙ ＦＳ， Ｆｏｇａｒｔｙ Ｋ， Ｓｉｎｇｅｒ ＲＨ． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｔｕ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９８；２８０：５８５－５９０
【文献】Ｒａｊ Ａ， ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｇａａｒｄ Ｐ， Ｒｉｆｋｉｎ ＳＡ， ｖａｎ Ｏｕｄｅｎａａｒｄｅｎ Ａ， Ｔｙａｇｉ Ｓ． Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｉｎｇｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００８；５；８７７－８７９
【文献】Ｆｅｍｉｎｏ ＡＭ， Ｆｏｇａｒｔｙ Ｋ， Ｌｉｆｓｈｉｔｚ ＬＭ， Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｗ， Ｓｉｎｇｅｒ ＲＨ． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００３：３６１；２４５－３９４
【文献】Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＪＢ， Ｗａｇｇｏｎｅｒ ＡＳ． Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｙ－ｌａｂｅｌｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＤＮ Ａ ｐｒｏｂｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７；２５；２９２３－２９２９
【発明の概要】
【0007】
方法の態様において、本発明は、単一分子のイメージングの方法を提供する。方法は、ａ）検査試料をプローブに露出するステップであって、プローブは、標的分子に特異的に結合する第１の部分と、１つ以上の波長において光と相互作用する１つ以上の化学基の結果として検出可能である第２の部分とを備え、プローブは、複合体を提供するために標的分子に結合する、ステップと、ｂ）複合体を１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光に露出するステップと、ｃ）１つ以上の単一分子の画像を提供するために、１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光の相互作用からの結果を検出するステップとを備える。画像は、少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な解像度を保有し、画像は、検出設定を何も変更しない単一の検出ステップにおいて得られる。
【0008】
別の方法の態様において、本発明は、単一分子のイメージングの方法を提供する。方法は、ａ）検査試料をプローブに露出するステップであって、プローブは、標的分子に特異的に結合する第１の部分と、１つ以上の波長において光と相互作用する１つ以上の化学基を含むように変更可能である第２の部分とを備え、プローブは、複合体を提供するために標的分子に結合する、ステップと、ｂ）プローブの第２の部分を光と相互作用する化学基のうちの１つ以上を含むように変更するステップと、ｃ）複合体を１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光に露出するステップと、ｄ）１つ以上の単一分子の画像を提供するために、１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光の相互作用からの結果を検出するステップとを備える。画像は、少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な解像度を保有し、画像は、検出設定を何も変更しない単一の検出ステップにおいて得られる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ＳＡＯイメージング・デバイスの一実施形態を示す。
【図2A】ＳＡＯイメージング・デバイスの別の実施形態を示す。
【図2B】一実施形態による、ＳＡＯイメージング・デバイスの照明パターン生成モジュールの内部構造を示す。
【図2C】別の実施形態による、ＳＡＯイメージング・デバイスの照明パターン生成モジュールの内部構造を示す。
【図3】ＳＡＯの一般的な方法を示す。
【図4】２６ｍｍの視野数を有する光学顕微鏡を用いた視野の直径および面積の表を示す。
【図5】一定の開口数（０．９５）における解像度への光の波長の影響に関する表を示す。
【図6】標準的な蛍光顕微鏡を用いたｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのコレクションのイメージングの方法と、対照的に、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのコレクションを画像化するためにＳＡＯイメージング・デバイスを備えるシステムを用いた本発明の方法とを示す。
【図7】およそ１００個の細胞を含む画像領域（ｉｍａｇｅ ａｒｅａ）内のＴＯＰ１ ｍＲＮＡ（高輝度／白色／緑色ドット）のＳＡＯ画像の一部を示す。
【図8】ＴＯＰ１ ｍＲＮＡのＳＡＯ画像の関心領域の選択を示し、スポット強度および品質に基づく選択処理グラフを含む。
【図9】ＭＣＦ７ヒト乳腺癌細胞株からのＨＥＲ２ ｍＲＮＡ（高輝度／白色ドット）と関連付けられたＳＡＯ画像を示す。１００個超の細胞を含む画像領域（ｉｍａｇｅ ａｒｅａ）がその画像領域のおよそ２０個の細胞を含む選択画像とともに示される。２０個の細胞の画像について、平均すると各細胞がＨＥＲ２ ｍＲＮＡのおよそ７２個のコピーを含むことが示された。
【図10】標準的な蛍光顕微鏡（６０×／１．４１ＮＡ ０．１油浸）を用いて得られたＡ５４９細胞からのＦＫＢＰ５ ｍＲＮＡ（高輝度／白色ドット）と関連付けられた２つの画像を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルされた画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（およそ１３個の細胞）を示し、画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（およそ１４個の細胞）を示す。
【図11】ＳＡＯイメージング・デバイス（２０×）を備えるシステムを用いて得られたＡ５４９細胞からのＦＫＢＰ５ ｍＲＮＡ（高輝度／白色ドット））と関連付けられた２つの画像（全画像の１／１０）を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルされた画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（５０個超の細胞）を示し、画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（５０個超の細胞）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、一般に、単一分子または単一分子の１つ以上のコレクションのイメージング、およびイメージングに関連する方法に関する。
【0011】
単一分子のイメージングの方法は、典型的に、１）検査試料（例えば、生物体、エキソソーム、組織または細胞）をプローブに露出するステップであって－プローブは、標的分子（例えば、ＲＮＡ、タンパク質、小分子）に特異的に結合する部分と、１つ以上の波長において光と相互作用する１つ以上の化学基の結果として検出可能である部分、もしくは、１つ以上の波長において光と相互作用する１つ以上の化学基を含むように変更できて－複合体を提供するために標的分子に結合する－部分のいずれかとを含む、ステップと、２）複合体を１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光に露出するステップと、３）１つ以上の単一分子の画像を提供するために、１つ以上の化学基と相互作用する１つ以上の波長の光の相互作用からの結果を検出するステップとを含み、イメージング・システムは、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで（例えば、光学部品もカメラも移動しないで）収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供し、それによって、単一分子または単一分子のコレクションのイメージングを行う。イメージング・システムは、典型的に、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｅｒｔｕｒｅ ｏｐｔｉｃｓ ｉｍａｇｉｎｇ））または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムである。
【0012】
「ＳＡＯイメージング」は、イメージング機器、例えば、レンズおよびカメラの物理的制約条件によって設定されてしまうものを凌ぐ解像度を達成すべく、一連のパターン化または構造化した光パターンを用いてイメージング対象を照明する光学的イメージング方法を指す。ＳＡＯでは、標的に関する空間情報を検出するために、イメージング対象が選択的に励起される。周波数（またはフーリエ）ドメインと標的ドメインとの間に１対１の関係があるため、ＳＡＯは、その空間的な周波数情報を得ることによって元のイメージング対象を再構成できる。参照により本明細書に組み込まれる、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｐｅｒｔｕｒｅ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ Ｐａｔｔｅｒｎｓ」と題する、２０１０年３月１９日出願の米国特許出願第１２／７２８，１１０号を参照。
【0013】
「蛍光偏光」は、フルオロフォアによって放出された光が異なる偏光軸に沿って不均等な強度を有する現象を指す。本明細書において考察する顕微鏡法の用途において、蛍光偏光は、照明光の経路中に、さらに機器のイメージング部／カメラより前に偏光子を用いる。例えば、Ｌｏｋｏｗｉｃｚ， Ｊ．Ｒ．， ２００６． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （３ｒｄ ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｃｈａｐｔｅｒ １０－１２）を参照。さらに、Ｖａｌｅｕｒ， Ｂｅｒｎａｒｄ． ２００１． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｗｉｌｅｙ－ ＶＣＨ， ｐ． ２９も参照。
【0014】
図１は、ＳＡＯイメージング・デバイスの一実施形態を示す。デバイスは、複数ビーム対光学式スキャナである。このスキャナは、スキャンの取得速度を大幅に向上させる並列データ取得を可能にするため、有利である。ｎ個のビームで構成されたスキャナでは、並列データ取得の度合い、それゆえに既知の光学式スキャナを上回る取得速度の向上の度合いがｎの２乗オーダで増加する。これは、既知の光学式スキャナの取得速度が試料もしくは１つのビーム対の機械的回転速度によって制限されることを仮定している。
【0015】
複数ビーム対光学式スキャナ１０は、一実施形態において、試料１６に向けたｎ個のソース・ビーム、総体的に１４とする、からなるアーク１２を備え、ｎは１０に等しく、アーク１２は円である。ｎ個のソース・ビーム１４のそれぞれは、異なる位相配列または異なる光周波数を有しうる。ｎ個のソース・ビーム１４、１４’の各対間の位相配列または周波数差は、ｎ個のソース・ビーム１４の他の対間の位相配列または周波数差のうちで唯一であるように選ばれる。ｎ個のソース・ビーム１４は、空間２０の体積中で重なり合う。検出器１８は、アーク１２内の複数のビーム対のそれぞれからの情報を含む信号を検出して、この信号をその対の位相配列または周波数差に対応する固有の位相配列またはキャリア周波数を用いて符号化する。
【0016】
空間２０の体積を通過するｎ個のソース・ビーム１４を用いた複数ビーム対光学式スキャナ１０では、ｎ個のソース・ビーム１４が重なり合って試料１６と相互作用し、このスキャナの検出信号を当分野で知られた方法を用いて算出できる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１６，１９６号を参照。
【0017】
図２Ａは、一実施形態による、分子を選択的に励起するためのＳＡＯイメージング・デバイス（構造化照明機器）を示す。図２Ａに示される照明機器は、例示的であるに過ぎず、本発明によるＳＡＯ用照明機器の構成には様々な変更がなされてもよい。図２Ａにおける照明機器の例は、図の簡潔さのために２つの干渉パターン生成モジュール（ＩＰＧＭ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ）１１２、１１３のみを示すが、ある用途にはより多くのＩＰＧＭが存在することになろう。各ＩＰＧＭは、モジュール形態であり、ｋ－空間サンプリング点の１つの共役対に対応する所定のピッチおよび方位の１つの選択的励起パターンを生成するように構成される。従って、ＩＰＧＭおよび所定のピッチおよび方位の２‐Ｄ正弦曲線選択的励起パターンと、ｋ－空間サンプリング点の１つの共役対との間には１対１の関係が存在する。選択的励起パターンが多数（Ｎ）になるほど、より多くのＩＰＧＭがＳＡＯ照明機器に必要となるであろう。
【0018】
構造化照明機器１００は、複数の相互にコヒーレントなレーザビームを生成し、それらの干渉が干渉パターンを作り出す。かかる干渉パターンは、細胞が固定された基板１０４上に投射されて、観察１０２下の細胞および分子を選択的に励起する。干渉パターンを生成するために複数のレーザビームの干渉を用いることは、多くの理由で有利である。例えば、これは、ＦＯＶ（視野：Ｆｉｅｌｄ ｏｆ Ｖｉｅｗ）およびＤＯＦ（被写界深度：Ｄｅｐｔｈ ｏｆ Ｆｉｅｌｄ）が極めて大きい高解像度の励起パターンを可能にする。本明細書では図２Ａの構造化照明機器が分子のイメージング用励起パターンを生成する例とともに記載されるが、図２Ａの構造化照明装置は、任意の他のタイプの標的のイメージング用励起パターンを生成する、任意の他のタイプの用途にも使用できることに留意すべきである。
【0019】
図２Ａを参照すると、構造化照明機器１００は、レーザ１０２、ビームスプリッタ１０４、シャッタ１０５、１０７、ファイバカップラ１０８、１０９、一対の光ファイバ１１０、１１１（代わりに、レーザビームを送るためにフリービーム・アーキテクチャまたは任意の他の適切な方法を用いることもできるであろう）、および一対の干渉パターン生成モジュール（ＩＰＧＭ）１１２、１１３を含む。先に説明したように、各ＩＰＧＭ１１２、１１３は、ｋ－空間サンプリング点の１つの共役対に対応する干渉パターン（選択的励起パターン）を生成する。レーザ１０２のビーム１０３は、ビームスプリッタ１０４によって２つのビーム１４０、１４２に分割される。１対の高速シャッタ１０５、１０７は、各ビーム１４０、１４２をそれぞれスイッチ「オン」もしくは「オフ」するために、または各ビーム１４０、１４２の振幅をそれぞれ変調するために用いられる。このようにスイッチされたレーザビームは、ファイバカップラ１０９、１０８経由で一対の偏光維持型光ファイバ１１１、１１０へ結合される。各ファイバ１１１、１１０は、それぞれ対応する干渉パターン生成モジュール１１３、１１２に接続される。干渉パターン生成モジュール１１３は、コリメーティング・レンズ１１４’、ビームスプリッタ１１６’および平行移動ミラー１１８’を含み、同様に干渉パターン生成モジュール１１２は、コリメーティング・レンズ１１４、ビームスプリッタ１１６および平行移動ミラー１１８を含む。
【0020】
光ファイバ１１０からのビーム１４４は、コリメーティング・レンズ１１４によってコリメートされて、ビームスプリッタ１１６によって２つのビーム１２４、１２６に分割される。ミラー１１８は、ビーム１２６の光路長を変更するためにアクチュエータ１２０によって平行移動する。このように、ある１つのビーム１２６の光路長を変更することにより（すなわち、平行移動ミラー１１８の使用によってビーム１２６の光位相を変調することにより）パターンの位相が変化した干渉パターン１２２が基板１０４（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ２０４）上の２つのレーザビーム１２４、１２６間の重なり領域に生成される。
【0021】
同様に、光ファイバ１１１からのビーム１４６は、コリメーティング・レンズ１１４’によってコリメートされて、ビームスプリッタ１１６’によって２つのビーム１２８、１３０に分割される。ミラー１１８’は、ビーム１２８の光路長を変更するためにアクチュエータ１２０’によって平行移動する。このように、ある１つのビーム１２８の光路長を変更することにより（すなわち、平行移動ミラー１１８’の使用によってビーム１２８の光位相を変調することにより）パターンの位相が変化した干渉パターン１２２が基板１０４上の２つのレーザビーム１２８、１３０間の重なり領域に生成される。
【0022】
図２Ａに示されるように、各ＩＰＧＭ１１２、１１３は、本明細書の実施形態によるモジュール形態で実装され、１つのＩＰＧＭがｋ－空間点の１つの共役対に対応する干渉パターンを作り出す。ＩＰＧＭとｋ－空間点との間のこのモジュール化された１対１の関係は、本明細書の実施形態によるＳＡＯ用ハードウェアの設計プロセスを大幅に簡略化する。ＳＡＯに用いられる選択的励起パターンの数が増減するにつれて、ＳＡＯハードウェアは、専らＩＰＧＭの数をモジュール式に増減させることによって変化する。対照的に、従来のＳＡＯ機器は、個別的な干渉パターン生成モジュールは有さず、できるだけ多くの多重干渉を作り出す一連のスプリットビームを有していた。このようにＳＡＯ機器を設計する従来の方法は、最適化されない、もしくは冗長なパターンを作り出し、ＳＡＯシステムの動作を遅らせて複雑にした。
【0023】
この図２Ａに示される実装は、その簡便さゆえに用いられるが、様々な他のアプローチを本発明の範囲内で用いることができる。例えば、励起パターン１２２を変化させるために、ビーム１２４、１２６、１２８、１３０の１つ以上の光振幅および位相に加えてまたはその代わりに、振幅、偏光、方向および波長を変調できる。さらに、励起パターンを変化させるために、固定された細胞に対して構造化照明を専ら平行移動できる。同様に、励起パターンを変化させるために、構造化照明に対して固定された細胞を平行移動できる。さらに、平行移動ミラー１１８、１１８’に加えてまたはその代わりに様々なタイプの光変調器、例えば、音響光学変調器、電気光学変調器、ガルバノメータにより変調された回転窓、および微小電気機械システム（ＭＥＭＳ：ｍｉｃｒｏ－ｅｌｅｃｔｒｏ－ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）変調器を用いることができる。加えて、図２Ａの構造化照明機器は、コヒーレント電磁放射用の照明光源としてレーザ１０２を用いることが本明細書には記載されるが、レーザ１０２の代わりに他のタイプのコヒーレント電磁放射光源、例えば、ＳＬＤ（スーパールミネセントダイオード：ｓｕｐｅｒ－ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｉｏｄｅ）を用いてもよい。
【0024】
さらに、図２Ａは、干渉パターン１２２を生成するための４つのビーム１２４、１２６、１２８、１３０の使用を示すが、光源レーザビームを２つより多いビームに分割することによって、より多数のレーザビームを用いることができる。例えば、干渉パターン１２２を生成するために６４のビームを用いてもよい。加えて、ビームの組み合わせが対による組み合わせに制限される必要はない。例えば、干渉パターン１２２を生成するために３つのビーム１２４、１２６、１２８、もしくは３つのビーム１２４、１２６、１３０、または３つのビーム１２４、１２８、１３０、もしくは３つのビーム１２６、１２８、１３０（ｔｈｒｅｅ ｂｅａｍｓ １２６，１２９，１３０）、あるいはすべての４つのビーム１２４、１２６、１２８、１３０を用いることができる。通常は、速度を最大にするために必要なビーム組み合わせの最小セット（２つのビーム）が選ばれる。さらに、ビームは、コリメートする、収束させる、または発散させることができる。図２Ａの具体的な実装とは異なるが、異なる用途に関しては、（ｉ）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｅａｍ Ｐａｉｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ」と題する、２０００年１月１８日にＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎが特許を取得した米国特許第６，０１６，１９６号、（ｉｉ）「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｐｅｒｔｕｒｅ Ａｒｒａｙ」と題する、２０００年１０月３１日にＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎが特許を取得した米国特許第６，１４０，６６０号、および（ｉｉｉ）「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｐｅｒｔｕｒｅ Ａｒｒａｙ」と題する、２００３年４月１５日にＭｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎが特許を取得した米国特許第６，５４８，８２０号において複数のビーム対を用いた干渉パターンの生成に関する追加の背景情報を見ることができ、これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【0025】
図２Ｂは、一実施形態による、照明パターン生成モジュールの内部構造を示す。図２Ｂの実施形態は、ミラー１６２の後に配置された回転窓１６０をＩＰＧＭ１５０内に有する。光ファイバ１１０からのビーム１７０は、コリメーティング・レンズ１５４によってコリメートされ、コリメートされたビーム１４４は、ビームスプリッタ１５６によって２つのビーム１７３、１７４に分割される（代わりに、ビームをミラーへ送るためにフリービーム・アーキテクチャを用いることもできるであろう）。ビーム１７３は、ミラー１５８によって反射され、反射されたビーム１７８は、イメージング対象へ投射されて干渉パターン１８０を生成する。ビーム１７４は、ミラー１６２によって反射され、反射されたビーム１７６の光路長がガルバノメータを用いて回転される光学窓１６０により変調され、それによって対応するビーム１７６の光位相を変調して、変調されたビーム１７７を生成する。２つのレーザビーム１７７、１７８間の重なり領域において干渉パターン１８０が生成され、このパターンは、ある１つのビーム１７７の光路長を変更することによって変化する。回転窓１６０をミラー１６２の後に配置することにより、以下に示される図２Ａおよび図２Ｃの実施形態に比較して、ＩＰＧＭ１５０の幅ＷＩＰＧＭおよびサイズを縮小できる。このように、例えば、ＩＰＧＭの幅ＷＩＰＧＭが半リングの半径に直接に影響するため、ＩＰＧＭを保持する半リング状構造１６２をよりコンパクトにできる。
【0026】
図２Ｃは、別の実施形態による、照明パターン生成モジュールの内部構造を示す。図２Ａおよび２Ｂの実施形態におけるＩＰＧＭは、イメージング対象での干渉点と分離点（すなわち、ビームスプリッタ）との間で等しい経路長を有さない、２つのビームを作り出すであろう。非等経路長は、比較的短いコヒーレンス長のレーザを用いた場合には正弦曲線状コントラストを著しく低下させかねず、さらに、ＳＡＯシステムの適用性を特定の波長（例えば、５３２ｎｍ緑色レーザ）のみに制限する。これは、良好な正弦曲線状コントラストのためにかかる非等経路ＩＰＧＭとともに用いることができる十分に長いコヒーレンス長を有するのは特定の波長をもつ少数のレーザのみであるためである。図２Ａの実施形態と比較して、図２Ｃの実施形態は、２つのスプリットビーム間で等しい経路を達成するために追加の折り畳みミラーを用いる。レーザビーム１４４は、ビームスプリッタ１５６によってビーム１８１、１８０に分割される。ビーム１８１は、ミラー１８２によって反射され、その光路長は、ビーム１８８を生成するための回転窓１６０によって変調される。他方、ビーム１８０は、２つのミラー１８４、１８７によって２回反射されて、反射されたビーム１８９を生成する。ビーム１８８および１８９は、イメージング対象において最終的に干渉して、選択的励起パターンを生成する。２つのミラー１８４、１８６の使用によって、光路１４４－１８０－１８５－１８９は、光路１８１－１８３－１８８の長さに実質的に等しい長さを有するように構成される。この等しい経路方式は、高コントラストをもつ干渉パターンを短いコヒーレンス長をもつレーザを用いて生成することを可能にする。そのうえ、この等しい経路方式は、ＳＡＯシステムを５３２ｎｍ以外の波長とともに用いることを可能にし、結果として多色ＳＡＯを実用的にする。
【0027】
図３は、ＳＡＯの一般的な一方法を示す。選択的励起（または照明）１０４がイメージング対象１０２に加えられ、イメージング対象１０２から散乱されるかまたは蛍光を発した光が光学的イメージング１０６によって取り込まれる。選択的励起１０４は、イメージング対象１０２上で２つの光ビームの干渉を引き起こすように構成された照明機器によってイメージング対象１０２に加えられる。励起された対象１０２は、信号（またはフォトン）を放出し、放出された信号は、対物レンズおよびイメージング・センサ（またはイメージャ）を含む光学的イメージング・システム１０６に取り込まれる。２Ｄ正弦曲線励起パターンの全Ｍ位相に対応する画像が得られたかどうかが判定される（ステップ４０８）。
【0028】
２Ｄ正弦曲線励起パターンの全位相に対応する画像がステップ４０８において得られなかった場合、励起位相を変化させて（ステップ４０２）、変化した励起位相に対してステップ１０４、１０６、４０８が繰り返される。２Ｄ正弦曲線励起パターンの全位相に対応する画像がステップ４０８において得られた場合には、全２Ｄ正弦曲線励起パターンに対応する画像が得られたかどうかが判定される（ステップ４１０）。全２Ｄ正弦曲線励起パターンに対応する画像がステップ４１０において得られなかった場合、異なる空間周波数を用いる（例えば、２Ｄ正弦曲線パターンのピッチおよび方位φを変化させる）ことにより励起パターンを変化させて、ステップ１０４、１０６、４０８、４０２、４１０、４０４が次の選択的励起パターンに対して繰り返される。全２Ｄ正弦曲線励起パターンに対応する画像がステップ４１０において得られた場合には、取り込まれたより低解像度の生画像からイメージング対象１０２の高解像度画像１１４を得るべくＳＡＯ後処理４１２および視覚化のために、取り込まれた画像がコンピュータに送られる。先に説明したように、光学的イメージング１０６によって取り込まれた生画像は、イメージング対象１０２上の目標物を解像するのに不十分な解像度を有し、一方でＳＡＯ後処理（ステップ４１２）により再構成された高解像度画像１１４は、イメージング対象１０２上の目標物を解像するのに十分な解像度を有する。
【0029】
「解像度」は、観察者またはイメージング・システムにより２つの別個の実体として区別できる検査試料／検体中の２点間の最短距離を指す。光学顕微鏡の解像度については、開口数、波長および解像度の間の関係を表すために導出された、いくつかの数式がある、すなわち、
解像度（ｒ）＝λ／（２ＮＡ） （１）
解像度（ｒ）＝０．６１λ／ＮＡ （２）
解像度（ｒ）＝１．２２λ／（ＮＡ（ｏｂｊ）＋ＮＡ（ｃｏｎｄ）） （３）、
ここで「ｒ」は、解像度（２つの目標物間の最小解像可能距離）であり、「ＮＡ」は、顕微鏡の開口数に関する一般的な用語であり、「λ」は、イメージング波長であり、「ＮＡ（ｏｂｊ）」が対物レンズの開口数に等しく、「ＮＡ（ｃｏｎｄ）」は、集光レンズの開口数である。
解像度（ｒ）＝λ／（２ＮＡ） （１）
解像度（ｒ）＝０．６１λ／ＮＡ （２）
解像度（ｒ）＝１．２２λ／（ＮＡ（ｏｂｊ）＋ＮＡ（ｃｏｎｄ）） （３）、
ここで「ｒ」は、解像度（２つの目標物間の最小解像可能距離）であり、「ＮＡ」は、顕微鏡の開口数に関する一般的な用語であり、「λ」は、イメージング波長であり、「ＮＡ（ｏｂｊ）」が対物レンズの開口数に等しく、「ＮＡ（ｃｏｎｄ）」は、集光レンズの開口数である。
【0030】
顕微鏡の対物レンズの「開口数」は、対物レンズが集光して、一定の物体距離において微細な試料の詳細を解像するその能力の尺度である。
【0031】
「視野」は、光学顕微鏡の中間面で測定されて、ミリメートル単位で表された視野の直径である。「視野数（ｆｉｅｌｄ－ｏｆ－ｖｉｅｗ ｎｕｍｂｅｒ）」、または「視野数（ｆｉｅｌｄ ｎｕｍｂｅｒ）」は、ミリメートル単位で表され、倍率で除したときに実ＦＯＶ（ａｃｔｕａｌ ＦＯＶ：実視野）を与える。
【0032】
図４は、２６ｍｍの視野数を有する光学顕微鏡を用いた視野の直径および面積の表を示す。
【0033】
図５は、一定の開口数（０．９５）における解像度への光の波長の影響（ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）に関する表を示す。
【0034】
本発明の方法を用いて画像化される分子の非限定の例は、メッセンジャー・リボ核酸（ｍＲＮＡｓ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）；長鎖ノンコーディング・リボ核酸（ｌｎｃＲＮＡｓ：ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）；核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡｓ：ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）；サブゲノム・リボ核酸（ｓｇＲＮＡ：ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）；ウイルスＲＮＡ；低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡ）；トランスファー・メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ：ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）；マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）；ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｒＮＡ））； 核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）；アンチセンスＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）；ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ：ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）；染色体（例えば、染色体彩色による）；２本鎖および１本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）；増殖している細胞の複製ＤＮＡ鎖中に取り込まれたＢｒｄＵまたはＥＤＵ；タンパク質；グリカン；生体および非生体小分子を含む。
【0035】
標的分子に特異的に結合するプローブの部分は、典型的に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、アンチセンス・オリゴマーまたはポリマー）；ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体（例えば、非天然ヌクレオチドの包含）；抗体またはアプタマーである。プローブの検出可能な部分は、通常、蛍光群（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）である。かかる蛍光群の非限定の例は、蛍光性有機色素、例えば、キサンチン（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、シアニン、発光基（例えば、ランタノイド、キレート、ルテニウムなど）、クマリン、ピレン、ボディピー色素およびＦＬＡｓｈ；非有機クロモフォア、例えば、半導体ナノ結晶（量子ドット）、シリコン、金および金属ナノ粒子；インターカレータ色素、例えば、ＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ－５、およびヘキスト３３３４２；発現可能な蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色ＦＰ，赤色ＦＰなどを含む。
【0036】
ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体の非限定の例は、以下を保有するものを含む、すなわち、スペルミン・テイル；ＭＧＢ；ＬＮＡ；ＰＮＡ；ＲＮＡ２’改質糖；アミド化主鎖；モルフォリノ主鎖；チオエート主鎖；およびＴＳＱ色素修正物質。
【0037】
蛍光色素標識された核酸プローブ・タイプの非限定の例は、シンガー・プローブ（多重標識）；ステラリス・プローブ（単一標識）；ＤＯＰＥ－ＦＩＳＨプローブ（２重標識）；ＭＴＲＴＰプローブ；蛍光標識ＢＡＣプローブ；ＦＲＥＴ消光プローブ（例えば、分子ビーコン、リニアＦ－Ｑプローブ、Ｈｙｂプローブ）；ＥＣＨＯプローブ；色素標識デンドリマ；トリガード・フルオレセンス（例えば、Ｋｏｏｌプローブ、ライゲーション活性化）；ケージド・プローブ（例えば、光トリガＦＩ）；プロフルオレセント色素（例えば、化学的に活性化－酸化性、還元性、酸、塩基など）を含む。
【0038】
プローブ／標的分子複合体の検出は、典型的に、光源から異なる光波長を吸収した後のプローブからの１つの光波長の蛍光信号の生成を伴う。蛍光信号生成の非限定の例は、アプタマー消光および酵素により生成された蛍光を含む。信号は、ハイブリダイゼーション・キャプチャ；ローリングサークル増幅；Ｂ－ＤＮＡ；ポリメラーゼ連鎖反応；および酸素により生成された蛍光を含むが、それらに限定されない様々な技術を用いて生成または増幅することもできる。
【0039】
プローブが光と相互作用する化合物を含むように変更されるところでは、化学結合の分野で知られる任意の適切な処理を用いることができる。かかる処理の非限定の例は、ホスホラミダイト、ホスホン酸エステル、トリエステル中間体などを経由した溶液または固相オリゴ合成；クリックケミストリー（銅触媒および銅フリー）；ディールス・アルダー反応；シュタウディンガー・ライゲーション；ヒドラゾン・ライゲーション；オキシム・ライゲーション；ネイティブ・ケミカル・ライゲーション；テトラジン・ライゲーション；マレイミド－チオール・ライゲーション；活性エステル－アミン・ライゲーション；カルボジイミド（ＥＤＣ）ホスファートまたはカルボキシ結合を含む。
【0040】
一態様において、方法は、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのコレクションを画像化するために用いられる。この方法は、典型的に、１）単一標識オリゴヌクレオチドのセットを提供するために、各オリゴヌクレオチドが単一の蛍光標識を含む、１つ以上のｍＲＮＡ標的にハイブリダイズすることが可能な多数のオリゴヌクレオチドを得るステップと、２）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、３）オリゴヌクレオチド－ｍＲＮＡハイブリッド生成物のセットを産出するために、実質的な数の単一標識オリゴヌクレオチドが細胞内の１つ以上のｍＲＮＡ標的とハイブリダイズするように、単一標識オリゴヌクレオチドのセットが試料調製物と相互作用することを可能にするステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで（例えば、光学部品もカメラも移動しないで）収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるイメージング・システムを用いてオリゴヌクレオチド－ｍＲＮＡハイブリッド生成物のセットを画像化することによって、オリゴヌクレオチド－ｍＲＮＡハイブリッド生成物のセットを検出するステップとを含む。
【0041】
図６は、標準的な蛍光顕微鏡を用いたｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのコレクションのイメージングの方法と、対照的に、ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのコレクションを画像化するために合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）を実現するデバイスを備えるイメージング・システムを用いた本発明の方法とを示す。
【0042】
プローブを構築するための方法に用いられる多くのオリゴヌクレオチドは、典型的に、少なくとも３０個の異なるオリゴヌクレオチドを含む。しばしば、４０から６０個のオリゴヌクレオチドが用いられ、一般に４８個が使用される。オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの数は、通常、１５および４０個の間である。１５～２０、１７～２２または１７～２５個を含むオリゴヌクレオチドがしばしば用いられる。
【0043】
プローブのオリゴヌクレオチドは、典型的に、適切なソフトウェア・パッケージ、例えば、Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて設計される。ｗｗｗ．ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｆｉｓｈ．ｃｏｍを参照。オリゴヌクレオチドは、自動化されたＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いた固相合成を含めて、任意の然るべき方法によって合成できる。プローブを供給する１つの蛍光標識のオリゴヌクレオチドへの付着は、通常、オリゴヌクレオチドをプールして、それぞれを同じ反応で単一のフルオロフォアにカップリングすることによって行われる。
【0044】
別の態様では、方法は、ｌｎｃＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡのコレクションを画像化するために用いられる。この方法は、典型的に、１）１つ以上のｌｎｃＲＮＡプローブを提供するために、各オリゴヌクレオチドが１つ以上の蛍光標識を含む、１つ以上のｌｎｃＲＮＡ標的にハイブリダイズすることが可能な１つ以上のオリゴヌクレオチドを得るステップと、２）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、３）プローブ－ｌｎｃＲＮＡハイブリッド生成物のセットを産出するために、実質的な数のプローブが細胞内の１つ以上のｌｎｃＲＮＡ標的にハイブリダイズするように、１つ以上のｌｎｃＲＮＡプローブが試料調製物と相互作用することを可能にするステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムを用いてプローブ－ｌｎｃＲＮＡハイブリッド生成物のセットを画像化することによって、プローブ－ｌｎｃＲＮＡハイブリッド生成物のセットを検出するステップとを含む。
【0045】
別の態様では、方法は、ｓｎＲＮＡまたはｓｎＲＮＡのコレクションを画像化するために用いられる。この方法は、典型的に、１）１つ以上のｓｎＲＮＡプローブを提供するために、各オリゴヌクレオチドが１つ以上の蛍光標識を含む、１つ以上のｓｎＲＮＡ標的にハイブリダイズすることが可能な１つ以上のオリゴヌクレオチドを得るステップと、２）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、３）プローブ－ｓｎＲＮＡハイブリッド生成物を産出するために、実質的な数のプローブが細胞内の１つ以上のｓｎＲＮＡ標的にハイブリダイズするように、１つ以上のｓｎＲＮＡプローブが試料調製物と相互作用することを可能にするステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムを用いてプローブ－ｓｎＲＮＡハイブリッド生成物のセットを画像化することによって、プローブ－ｓｎＲＮＡハイブリッド生成物のセットを検出するステップとを含む。
【0046】
別の態様では、方法は、１つの染色体のすべて、または一部を画像化するために用いられる。方法は、典型的に、１）１つ以上の染色体プローブを提供するために、各オリゴヌクレオチドが１つ以上の蛍光標識を含む、標的染色体内の１つ以上の位置にハイブリダイズすることが可能な１つ以上のオリゴヌクレオチドを得るステップと、２）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、３）プローブ－染色体ハイブリッド生成物のセットを産出するために、実質的な数のプローブが細胞内の染色体標的内の１つ以上の位置にハイブリダイズするように、１つ以上の染色体プローブが試料調製物と相互作用することを可能にするステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムを用いてそれらを画像化することによって、プローブ－染色体ハイブリッド生成物のセットを検出するステップとを含む。
【0047】
別の様態では、方法は、細胞の複製ＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取り込みを用いて、細胞増殖を画像化するために用いられる。この方法は、典型的に、１）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、２）ある量のＢｒｄＵを試料調製物に供給して、増殖している細胞中に実質的な量のＢｒｄＵが取り込まれることを可能にする期間にわたって、供給されたＢｒｄＵを試料調製物とともにインキュベートするステップと、３）１つ以上の蛍光基を備えるある量の抗ＢｒｄＵ抗体を試料調製物に供給して、実質的な量の抗体の、複製ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵへの結合を可能にする期間にわたって、供給された抗体を試料調製物とともにインキュベートするステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムを用いてＢｒｄＵに結合された抗体を画像化することによって、ＢｒｄＵに結合された抗体を検出するステップとを含む。
【0048】
別の様態では、方法は、細胞の複製ＤＮＡ鎖へのＥｄＵの取り込みを用いて細胞増殖を画像化するために用いられる。この方法は、典型的に、１）試料調製物（例えば、複数の生細胞を含む調製物）を得るステップと、２）ある量のＥｄＵを試料調製物に供給して、増殖している細胞中に実質的な量のＥｄＵが取り込まれることを可能にする期間にわたって、供給されたＥｄＵを試料調製物とともにインキュベートするステップと、３）ある量の蛍光標識されたアジド系クリック試薬を、取り込まれたＥｄＵとクリック試薬との間の反応を可能にする条件下で供給するステップと、４）イメージング・システム、例えば、単一の検出ステップ（すなわち、１つのデータ・セットが検出設定を何も変更しないで収集される）において少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍより良好な検出解像度を提供する、合成開口光学系（ＳＡＯイメージング）または蛍光偏光を実現するデバイスを備えるシステムを用いてＥｄＵ－クリック試薬生成物を画像化することによって、ＥｄＵ－クリック試薬生成物を検出するステップとを含む。
【0049】
本発明の方法は、細胞の細胞質および核内の個別の分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、染色体、ＢｒｄＵまたはＥｄＵを含んだＤＮＡ鎖、たんぱく質、グリカン、小分子）を定量化する手段を提供する。個別の分子の画像は、４５０ｎｍ、４００ｎｍ、３５０ｎｍ、３００ｎｍ、または２５０ｎｍより良好な解像度で解像される。しばしば、個別の分子は、２００ｎｍ、１５０ｎｍまたは１００ｎｍより良好な解像度で解像される。これらの解像度は、単一の検出ステップにおいて少なくとも１×１０５μｍ２の画像化面積にわたって達成可能である。いくつかの場合には、解像度は、少なくとも１×１０６μｍ２、５×１０６μｍ２、１×１０７μｍ２または５×１０７μｍ２の画像化面積に適用される。これらの面積は、数百から数千個の細胞の領域に対応する。
【0050】
本発明の方法は、広い視野面積にわたって高解像度を達成するために、極めて高い分子密度の１つ以上のフルオロフォアは必要としない。例として、個別の分子の画像は、視野面積におけるフルオロフォアの密度がたとえμｍ２当たり１０，０００分子未満であっても、単一の検出ステップにおいて少なくとも１×１０５μｍ２、１×１０６μｍ２、５×１０６μｍ２、１×１０７μｍ２または５×１０７μｍ２の画像化面積が４５０ｎｍ、４００ｎｍ、３５０ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍまたは１００ｎｍより良好な解像度で解像される。典型的に、この解像度は、領域におけるフルオロフォアの密度がμｍ２当たり１０００分子未満、μｍ２当たり１００分子未満またはμｍ２当たり１０分子未満のところでも達成される。
【0051】
先に考察した面積にわたって、方法は、典型的に、単一の検出ステップにおいて少なくとも１×１０２個の別個の分子複合体を検出することが可能であり、これらの複合体は、１つの標的分子に結合した少なくとも１つのプローブを備える。ある場合には、本方法は、単一の検出ステップにおいて少なくとも１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９個の別個の分子複合体を検出できる。
【0052】
さらに、先に考察した面積に関係して、方法は、典型的に、単一の検出ステップにおいて２０個より多い細胞（標準的な２０×対物レンズでのＳＡＯ画像）を検出／画像化することが可能である。ある場合には、方法は、単一の検出ステップにおいて５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００個より多い細胞を検出／画像化することが可能である。
【0053】
方法の別の利点は、装置の対物レンズの長い作動距離であり、これにより標準的な６０×または１００×油浸レンズに対して（機械的に）制約された面積の高解像度画像を得ることが可能である。長い作動距離は、本方法の大きい被写界深度とともに、所望の面積を画像化するために厚い基板を通して焦点を合わせることを可能にする。本方法は、例えば、０．１ｍｍより厚い試料（例えば、プラスチック試料（ＣＯＰ））を通して画像を得ることができる。ある場合には、本方法は、０．２５ｍｍ、０．５０ｍｍ、０．７５ｍｍまたは１．０ｍｍより厚い試料を通して画像を得ることができる。
【0054】
本発明の方法によって与えられる定量化は、いくつかの異なる態様を含む。細胞の試料全体にわたって、試料の異なる細胞内、および試料の各細胞の異なる領域内で遺伝子発現を定量化できる。同じ細胞もしくは異なる細胞内の特定の遺伝子多様性（例えば、ＳＮＰ）または変異を定量化できる。さらに、多座遺伝子合成；遺伝要素の転座；および細胞増殖の速度も定量化できる。
【0055】
ある場合には、１つより多いタイプのプローブが方法に同時に用いられる（すなわち、多重化）。これらのプローブ・タイプは、特異的結合部分および化学検出部分の両方が異なる。非限定の例として、単一ｍＲＮＡの検出のための方法に、各セットがその標識として１つの異なるフルオロフォアを有する、１つより多いセットの単一標識オリゴヌクレオチドを用いることができる。複数の異なるｍＲＮＡ標的の使用は、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の遺伝子の発現を同時に定量化して、比較することを可能にする。
【0056】
本発明の方法によって提供される定量化は、細胞領域内の分子複合体の数を定量化することを越えてさらに広がり、方法は、多重化を用いた、分子複合体間、または異なるプローブと複合体を形成した１つの染色体の複数の領域間の距離の定量化を提供する。４５０ｎｍ、４００ｎｍ、３５０ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎ、２００ｎｍ、１５０ｎｍまたは１００ｎｍ以下の複合体間の距離を測定できる。この測定方法を用いると、例えば、単一の染色体上の位置間の距離、または異なる染色体の領域間の距離を定量化することが可能である。これらのタイプの測定は、染色体の「クロストーク」、すなわち、異なる染色体領域が機能活性、例えば、遺伝子発現に対して相互にいかに作用するかを明らかにできる。
【0057】
先に考察したように、本発明の方法は、遺伝子に関するいくつかの異なるタイプの情報（例えば、発現レベル）を得るために用いることができる。本方法を用いて調べられる遺伝子の非限定の例は、ＡＢＬ１；ＡＢＬ２；ＡＣＳＬ３；ＡＦ１５Ｑ１４；ＡＦ１Ｑ；ＡＦ３ｐ２１；ＡＦ５ｑ３１；ＡＫＡＰ９；ＡＫＴ１；ＡＫＴ２；ＡＬＤＨ２；ＡＬＫ；ＡＬＯ１７；ＡＰＣ；ＡＲＨＧＥＦ１２；ＡＲＨＨ；ＡＲＩＤ１Ａ；ＡＲＩＤ２；ＡＲＮＴ；ＡＳＰＳＣＲ１；ＡＳＸＬ１；ＡＴＦ１；ＡＴＩＣ；ＡＴＭ；ＡＴＲＸ；ＢＡＰ１；ＢＣＬ１０；ＢＣＬ１１Ａ；ＢＣＬ１１Ｂ；ＢＣＬ２；ＢＣＬ３；ＢＣＬ５；ＢＣＬ６；ＢＣＬ７Ａ；ＢＣＬ９；ＢＣＯＲ；ＢＣＲ；ＢＨＤ；ＢＩＲＣ３；ＢＬＭ；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＲＡＦ；ＢＲＣＡ１；ＢＲＣＡ２；ＢＲＤ３；ＢＲＤ４；ＢＲＩＰ１；ＢＴＧ１；ＢＵＢ１Ｂ；Ｃ１２ｏｒｆ９；Ｃ１５ｏｒｆ２１；Ｃ１５ｏｒｆ５５；Ｃ１６ｏｒｆ７５；Ｃ２ｏｒｆ４４；ＣＡＭＴＡ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＲＤ１１；ＣＡＲＳ；ＣＢＦＡ２Ｔ１；ＣＢＦＡ２Ｔ３；ＣＢＦＢ；ＣＢＬ；ＣＢＬＢ；ＣＢＬＣ；ＣＣＤＣ６；ＣＣＮＢ１ＩＰ１；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＤ２；ＣＣＮＤ３；ＣＣＮＥ１；ＣＤ２７３；ＣＤ２７４；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＨ１；ＣＤＨ１１；ＣＤＫ１２；ＣＤＫ４；ＣＤＫ６；ＣＤＫＮ２Ａ；ＣＤＫＮ２ａ（ｐ１４）；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＸ２；ＣＥＢＰＡ；ＣＥＰ１；ＣＨＣＨＤ７；ＣＨＥＫ２；ＣＨＩＣ２；ＣＨＮ１；ＣＩＣ；ＣＩＩＴＡ；ＣＬＴＣ；ＣＬＴＣＬ１；ＣＭＫＯＲ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＰＥＢ；ＣＯＸ６Ｃ；ＣＲＥＢ１；ＣＲＥＢ３Ｌ１；ＣＲＥＢ３Ｌ２；ＣＲＥＢＢＰ；ＣＲＬＦ２；ＣＲＴＣ３；ＣＴＮＮＢ１；ＣＹＬＤ；Ｄ１０Ｓ１７０；ＤＡＸＸ；ＤＤＢ２；ＤＤＩＴ３；ＤＤＸ１０；ＤＤＸ５；ＤＤＸ６；ＤＥＫ；ＤＩＣＥＲ１；ＤＮＭ２；ＤＮＭＴ３Ａ；ＤＵＸ４；ＥＢＦ１；ＥＣＴ２Ｌ；ＥＧＦＲ；ＥＩＦ４Ａ２；ＥＬＦ４；ＥＬＫ４；ＥＬＫＳ；ＥＬＬ；ＥＬＮ；ＥＭＬ４；ＥＰ３００；ＥＰＳ１５；ＥＲＢＢ２；ＥＲＣＣ２；ＥＲＣＣ３；ＥＲＣＣ４；ＥＲＣＣ５；ＥＲＧ；ＥＴＶ１；ＥＴＶ４；ＥＴＶ５；ＥＴＶ６；ＥＶＩ１；ＥＷＳＲ１；ＥＸＴ１；ＥＸＴ２；ＥＺＨ２；ＥＺＲ；ＦＡＣＬ６；ＦＡＭ２２Ａ；ＦＡＭ２２Ｂ；ＦＡＭ４６Ｃ；ＦＡＮＣＡ；ＦＡＮＣＣ；ＦＡＮＣＤ２；ＦＡＮＣＥ；ＦＡＮＣＦ；ＦＡＮＣＧ；ＦＢＸＯ１１；ＦＢＸＷ７；ＦＣＧＲ２Ｂ；ＦＥＶ；ＦＧＦＲ１；ＦＧＦＲ１ＯＰ；ＦＧＦＲ２；ＦＧＦＲ３；ＦＨ；ＦＨＩＴ；ＦＩＰ１Ｌ１；ＦＬＩ１；ＦＬＪ２７３５２；ＦＬＴ３；ＦＮＢＰ１；ＦＯＸＬ２；ＦＯＸＯ１Ａ；ＦＯＸＯ３Ａ；ＦＯＸＰ１；ＦＳＴＬ３；ＦＵＢＰ１；ＦＵＳ；ＦＶＴ１；ＧＡＳ７；ＧＡＴＡ１；ＧＡＴＡ２；ＧＡＴＡ３；ＧＭＰＳ；ＧＮＡ１１；ＧＮＡＱ；ＧＮＡＳ；ＧＯＬＧＡ５；ＧＯＰＣ；ＧＰＣ３；ＧＰＨＮ；ＧＲＡＦ；Ｈ３Ｆ３Ａ；ＨＣＭＯＧＴ－１；ＨＥＡＢ；ＨＥＲＰＵＤ１；ＨＥＹ１；ＨＩＰ１；ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ；ＨＬＦ；ＨＬＸＢ９；ＨＭＧＡ１；ＨＭＧＡ２；ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１；ＨＯＯＫ３；ＨＯＸＡ１１；ＨＯＸＡ１３；ＨＯＸＡ９；ＨＯＸＣ１１；ＨＯＸＣ１３；ＨＯＸＤ１１；ＨＯＸＤ１３；ＨＲＡＳ；ＨＲＰＴ２；ＨＳＰＣＡ；ＨＳＰＣＢ；ＩＤＨ１；ＩＤＨ２；ＩＧＨ＠；ＩＧＫ＠；ＩＧＬ＠；ＩＫＺＦ１；ＩＬ２；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ６ＳＴ；ＩＬ７Ｒ；ＩＲＦ４；ＩＲＴＡ１；ＩＴＫ；ＪＡＫ１；ＪＡＫ２；ＪＡＫ３；ＪＡＺＦ１；ＪＵＮ；ＫＤＭ５Ａ；ＫＤＭ５Ｃ；ＫＤＭ６Ａ；ＫＤＲ；ＫＩＡＡ１５４９；ＫＩＦ５Ｂ；ＫＩＴ；ＫＬＫ２；ＫＲＡＳ；ＫＴＮ１；ＬＡＦ４；ＬＡＳＰ１；ＬＣＫ；ＬＣＰ１；ＬＣＸ；ＬＨＦＰ；ＬＩＦＲ；ＬＭＯ１；ＬＭＯ２；ＬＰＰ；ＬＲＩＧ３；ＬＹＬ１；ＭＡＤＨ４；ＭＡＦ；ＭＡＦＢ；ＭＡＬＴ１；ＭＡＭＬ２；ＭＡＰ２Ｋ４；ＭＤＭ２；ＭＤＭ４；ＭＤＳ１；ＭＤＳ２；ＭＥＣＴ１；ＭＥＤ１２；ＭＥＮ１；ＭＥＴ；ＭＩＴＦ；ＭＫＬ１；ＭＬＦ１；ＭＬＨ１；ＭＬＬ；ＭＬＬ２；ＭＬＬ３；ＭＬＬＴ１；ＭＬＬＴ１０；ＭＬＬＴ２；ＭＬＬＴ３；ＭＬＬＴ４；ＭＬＬＴ６；ＭＬＬＴ７；ＭＮ１；ＭＰＬ；ＭＳＦ；ＭＳＨ２；ＭＳＨ６；ＭＳＩ２；ＭＳＮ；ＭＴＣＰ１；ＭＵＣ１；ＭＵＴＹＨ；ＭＹＢ；ＭＹＣ；ＭＹＣＬ１；ＭＹＣＮ；ＭＹＤ８８；ＭＹＨ１１；ＭＹＨ９；ＭＹＳＴ４；ＮＡＣＡ；ＮＢＳ１；ＮＣＯＡ１；ＮＣＯＡ２；ＮＣＯＡ４；ＮＤＲＧ１；ＮＦ１；ＮＦ２；ＮＦＥ２Ｌ２；ＮＦＩＢ；ＮＦＫＢ２；ＮＩＮ；ＮＫＸ２－１；ＮＯＮＯ；ＮＯＴＣＨ１；ＮＯＴＣＨ２；ＮＰＭ１；ＮＰ４Ａ３；ＮＲＡＳ；ＮＳＤ１；ＮＴＲＫ３；ＮＵＭＡ１；ＮＵＰ２１４；ＮＵＰ９８；ＯＬＩＧ２；ＯＭＤ；Ｐ２ＲＹ８；ＰＡＦＡＨ１Ｂ２；ＰＡＬＢ２；ＰＡＸ３；ＰＡＸ５；ＰＡＸ７；ＰＡＸ８；ＰＢＲＭ１；ＰＢＸ１；ＰＣＭ１；ＰＣＳＫ７；ＰＤＥ４ＤＩＰ；ＰＤＧＦＢ；ＰＤＧＦＲＡ；ＰＤＧＦＲＢ；ＰＥＲ１；ＰＨＦ６；ＰＨＯＸ２Ｂ；ＰＩＣＡＬＭ；ＰＩＫ３ＣＡ；ＰＩＫ３Ｒ１；ＰＩＭ１；ＰＬＡＧ１；ＰＭＬ；ＰＭＳ１；ＰＭＳ２；ＰＭＸ１；ＰＮＵＴＬ１；ＰＯＵ２ＡＦ１；ＰＯＵ５Ｆ１；ＰＰＡＲＧ；ＰＰＰ２Ｒ１Ａ；ＰＲＣＣ；ＰＲＤＭ１；ＰＲＤＭ１６；ＰＲＦ１；ＰＲＫＡＲ１Ａ；ＰＲＯ１０７３；ＰＳＩＰ２；ＰＴＣＨ；ＰＴＥＮ；ＰＴＰＮ１１；ＲＡＢ５ＥＰ；ＲＡＳ５１Ｌ１；ＲＡＦ１；ＲＡＬＧＤＳ；ＲＡＮＢＰ１７；ＲＡＰ１ＧＤＳ１；ＲＡＲＡ；ＲＢ１；ＲＢＭ１５；ＲＥＣＱＬ４；ＲＥＬ；ＲＥＴ；ＲＯＳ１；ＲＰＬ２２；ＲＰＮ１；ＲＵＮＤＣ２Ａ；ＲＵＮＸ１；ＲＵＮＸＢＰ２；ＳＢＤＳ；ＳＤＣ４；ＳＤＨ５；ＳＤＨＢ；ＳＤＨＣ；ＳＤＨＤ；ＳＥＰＴ６；ＳＥＴ；ＳＥＴＤ２；ＳＦ３Ｂ１；ＳＦＰＱ；ＳＦＲＳ３；ＳＨ３ＧＬ１；ＳＩＬ；ＳＬＣ３４Ａ２；ＳＬＣ４５Ａ３；ＳＭＡＲＣＡ４；ＳＭＡＲＣＢ１；ＳＭＯ；ＳＯＣＳ１；ＳＯＸ２；ＳＲＧＡＰ３；ＳＲＳＦ２；ＳＳ１８；ＳＳ１８Ｌ１；ＳＳＨ３ＢＰ１；ＳＳＸ１；ＳＳＸ２；ＳＳＸ４；ＳＴＫ１１；ＳＴＬ；ＳＵＦＵ；ＳＵＺ１２；ＳＹＫ；ＴＡＦ１５；ＴＡＬ１；ＴＡＬ２；ＴＣＥＡ１；ＴＣＦ１；ＴＣＦ１２；ＴＣＦ３；ＴＣＦ７Ｌ２；ＴＣＬ１Ａ；ＴＣＬ６；ＴＥＴ２；ＴＦＥ３；ＴＦＥＢ；ＴＦＧ；ＴＦＰＴ；ＴＦＲＣ；ＴＨＲＡＰ３；ＴＩＦ１；ＴＬＸ１；ＴＬＸ３；ＴＭＰＲＳＳ２；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦ１４；ＴＮＦＲＳＦ１７；ＴＮＦＲＳＦ６；ＴＯＰ１；ＴＰ５３；ＴＰＭ３；ＴＰＭ４；ＴＰＲ；ＴＲＡ＠；ＴＲＢ＠；ＴＲＤ＠；ＴＲＩＭ２７；ＴＲＩＭ３３；ＴＲＩＰ１１；ＴＳＣ１；ＴＳＣ２；ＴＳＨＲ；ＴＴＬ；Ｕ２ＡＦ１；ＵＳＰ６；ＶＨＬ；ＶＴＩ１Ａ；ＷＡＳ；ＷＨＳＣ１；ＷＨＳＣ１Ｌ１；ＷＩＦ１；ＷＲＮ；ＷＴ１；ＷＴＸ；ＷＷＴＲ１；ＸＰＡ；ＸＰＣ；ＸＰＯ１；ＹＷＨＡＥ；ＺＮＦ１４５；ＺＮＦ１９８；ＺＮＦ２７８；ＺＮＦ３３１；ＺＮＦ３８４；ＺＮＦ５２１；ＺＮＦ９；ＺＲＳＲ２を含む。
【0058】
方法の標的分子がｍＲＮＡであるところでは、標的とされるｍＲＮＡの非限定の例は、ＣＣＮＢ１ ｍＲＮＡ、ＣＥＮＰＥ ｍＲＮＡ、ＡＵＲＫＢ ｍＲＮＡ、ＰＬＫ１ ｍＲＮＡ、ＰＬＫ４ ｍＲＮＡ、ＴＡＧＬＮ ｍＲＮＡ、ＡＣＴＧ２ ｍＲＮＡ、ＴＰＭ１ ｍＲＮＡ、ＭＹＨ１１１ ｍＲＮＡ、ＤＥＳ ｍＲＮＡ、ＥＩＦ１ＡＸ ｍＲＮＡ、ＡＲ ｍＲＮＡ、ＨＳＰＤ１ ｍＲＮＡ、ＨＳＰＣＡ ｍＲＮＡ、Ｋ－ＡＬＰＨＡ１ ｍＲＮＡ、ＭＬＬ５ ｍＲＮＡ、ＵＧＴ２Ｂ１５ ｍＲＮＡ、ＷＮＴ５Ｂ５ ｍＲＮＡ、ＡＮＸＡ１１ ｍＲＮＡ、ＦＯＳ ｍＲＮＡ、ＳＦＲＰ１ ｍＲＮＡ、ＦＮ１ ｍＲＮＡ、ＩＴＧＢ８ ｍＲＮＡ、ＴＨＢＳ２ ｍＲＮＡ、ＨＮＴ ｍＲＮＡ、ＣＤＨ１０ ｍＲＮＡ、ＢＭＰ４ ｍＲＮＡ、ＡＮＫＨ ｍＲＮＡ、ＳＥＰ４ ｍＲＮＡ、ＳＥＰ７ ｍＲＮＡ、ＰＴＮ ｍＲＮＡ、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ、ＳＲＹ ｍＲＮＡ、ＥＧＲ３ ｍＲＮＡ、ＦｏｘＰ１ ｍＲＮＡ、ＦｏｘＭ１ ｍＲＮＡ、ＴＧＣＴ１ ｍＲＮＡ、ＩＴＰＫＢ ｍＲＮＡ、ＲＧＳ４ ｍＲＮＡ、およびＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡを含む。
【0059】
ある場合には、本発明の方法、および関連するキットは、核酸、タンパク質、抗体またはハプテンのインビボ、インビトロ、および／またはインサイツ分析に用いられる。かかる核酸は、限定なしに、ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体フラグメントおよび遺伝子（ＤＮＡ～ＦＩＳＨ）を含む。核酸またはタンパク質が分析される方法の非限定の例は、ＰＣＲ；インサイツＰＣＲ；フローサイトメトリー；蛍光顕微鏡；化学発光；免疫組織化学；仮想的核型；遺伝子アッセイ；ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、アレイ比較ゲノム・ハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ：ａｒｒａｙ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ））；遺伝子発現プロファイリング；遺伝子ＩＤ；タイリングアレイ；免疫蛍光；ＦＩＳＳＥＱ（蛍光インサイツ・シーケンシング：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｉｔｕ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）；およびインサイツ・ハイブリダイゼーション、例えば、ＦＩＳＨ、ＳＩＳＨおよびＣＩＳＨを含む。
【0060】
ある場合には、本発明の方法、および関連するキットは、染色体異常に関する核酸のインビボ、インビトロまたはインサイツ分析に用いられる。かかる異常の非限定の例は、異数性；潜在的切断点；挿入；反転；欠失；重複；遺伝子増幅；再配列および転座を含む。かかる異常は、しばしば正常状態または疾患（例えば、先天性疾患、癌または感染）と関連付けられる。
【0061】
方法のための検査試料は、限定なしに、ヒト、動物または植物供給源を含む、任意の適切な供給源から得られてもよい。試料は、典型的に、細胞を含み、試料供給源から（インビトロに）取り出されてもよく、または供給源中に（インビボに）保持されてもよい。例えば、試料は、組織生検、血液、尿、排泄物、唾液および汗から導出されてもよい。ある場合には、試料は、試料基板（例えば、スライド、フローセル、マイクロプレート）に固定される。
【0062】
本発明の方法は、疾患または他の状態の診断、モニタリングおよび／または予後診断に用いられる。例として、組織試料内の１つ以上の特異的遺伝子の活性を評価することにより特定の疾患（例えば、乳癌；大腸癌；前立腺癌；精巣癌；感染；およびアルツハイマー病）を診断できる。
【0063】
１つの非限定的な場合には、本発明は、染色体異常と関連付けられた先天的障害、癌、感染を診断する方法を提供する。方法は、組織試料が核酸配列を備える当該組織、エキソソームまたは細胞試料を被検体から得るステップと、核酸配列中に染色体異常が存在するかどうかを判定するステップと、組織、エキソソームまたは細胞試料中に染色体異常が存在する場合に先天的遺伝性障害、癌、または感染を診断するステップとを備える。組織、エキソソームまたは細胞試料は、典型的に、哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する。
【0064】
疾患診断については、方法は、（すべての目的で参照により本明細書に組み込まれる）以下のサイトにおいて議論される疾患を診断できる、すなわち、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ａｚ／ａ．ｈｔｍ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｉｃｉｎｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｄｉｓｅａｓｅｓ＿－ａｎｄ＿ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ａｌｐｈａ＿ａ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｌｉｓｔｓ＿ｏｆ＿ｄｉｓｅａｓｅｓ；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｇｈｔｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ｃｏｍ／ｌｉｓｔｓ／＃ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ。
【0065】
本発明の方法によって診断できる癌のタイプの非限定の例は、膀胱癌；乳癌； 大腸癌；直腸癌；子宮内膜癌；腎臓（腎および細胞）癌；白血病；肺癌；メラノーマ；非ホジキンリンパ腫；膵癌；前立腺癌；および甲状腺癌を含む。
【0066】
本発明の方法によって診断できるウイルスに基づく疾患の非限定の例は、トリインフルエンザ（Ｆｌｕ：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）；ＨＩＶ／ＡＩＤＳ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（ブタインフルエンザ）；アデノウイルス感染；呼吸器合胞体疾患；ライノウイルス感染；単純ヘルペス；水疱（水痘）；麻疹（はしか）；風疹（三日ばしか ）；おたふく風邪（流行性耳下腺炎（Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｐｒｏｔｉｔｉｓ））；天然痘（痘瘡）；疣贅川崎病；黄熱病；デング熱；ウイルス性胃腸炎；ウイルス熱；サイトメガロウイルス性疾患；狂犬病；ポリオ；遅発性ウイルス感染症およびアルボウイルス脳炎（Ｅｎｅｐｈａｌｉｔｉｓ）を含む。前述の疾患に関して検出／診断できるウイルスの非限定の例は、アデノウイルス；コクサッキーウイルス；エプスタイン・バーウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；単純ヘルペスウイルス１型；単純ヘルペスウイルス２型；サイトメガロウイルス；ヒトヘルペスウイルス８型；ＨＩＶ；インフルエンザウイルス；麻疹ウイルス；おたふく風邪ウイルス；ヒトパピローマウイルス；パラインフルエンザウイルス；ポリオウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）；風疹ウイルス；および水痘帯状疱疹ウイルスを含む。
【0067】
本発明の方法を用いて診断できる寄生虫病の非限定の例は、（ホスト－例えば、イヌ、ムシ、トリ、植物、動物、ヒトによらず）、アカントアメーバ角膜炎；アメーバ症（赤痢アメーバその他）；回虫症（回虫）；バベシア症；アライグマ回虫症；シャーガス病（クルーズトリパノソーマ）；肝吸虫症；コクリオミイヤ；クリプトスポリジウム症；裂頭条虫症；メジナ虫症（メジナ虫によって生じる）；エキノコックス症；象皮症；腸蟯虫症；肝蛭症；肥大吸虫症；フィラリア症；ジアルジア症；顎口虫症；膜様条虫症；鉤虫；イソスポーラ症；片山熱；リーシュマニア症；マラリア（熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫および二日熱マラリア原虫）；横川吸虫症；ハエ幼虫症；オンコセルカ症；シラミ寄生症；疥癬；住血吸虫症；睡眠病；糞線虫症；テニア症（嚢虫症によって生じる）；トキソカラ症；トキソプラズマ症（トキソプラズマ原虫）；旋毛虫症；および鞭虫症を含む。方法を用いて検出できる関連する病原体の非限定の例は、アカントアメーバ；アニサキス；回虫；ウマバエ；大腸バランチジウム；トコジラミ；条虫（サナダムシ）；ツツガムシ；ラセンウジバエ；赤痢アメーバ；肝蛭；ランブル鞭毛虫；鉤虫；レーシュマニア；イヌシタムシ；肝蛭；ロア糸状虫；パラゴニムス－肺吸虫；蟯虫；熱帯熱マラリア原虫；住血吸虫；糞線虫 ；ダニ；サナダムシ；トキソプラズマ原虫；トリパノソーマ；鞭虫；およびバンクロフト糸状虫を含む。
【0068】
本発明の方法を用いて検出できるバクテリアの非限定の例は、アシネトバクター；炭疽菌；カンピロバクター；淋病；Ｂ群連鎖球菌；肺炎桿菌；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）；髄膜炎菌；サルモネラ菌；非チフス性セロタイプ；赤痢菌；肺炎球菌；結核；腸チフス熱；バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ：Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）；バンコマイシン中等度／耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ／ＶＲＳＡ：Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ）を含む。
【0069】
別の非限定的な場合には、本発明の方法、および関連するキットは、ＲＮＡ発現レベル－例えば、ｍＲＮＡおよびその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）における変化の検出に用いられる。構成は、インビトロ、インビボまたはインサイツ試料（例えば、哺乳動物試料、ヒト試料）上で用いられてもよい。かかる試料は、限定なしに、骨髄スミア；血液スミア；パラフィン埋込型組織調製物；酵素的に分離された組織試料；骨髄；羊膜細胞；サイトスピン・調製物；およびインプリントを含む。
【0070】
別の非限定的な場合には、組織試料は、固定および透過処理され、疾患と関連付けられた標的ＲＮＡに特異的な単一標識プローブを用いてプロービングされ、少なくとも１×１０６μｍ２の画像化面積にわたって４５０ｎｍもしくはより良好な（例えば、３００ｎｍ、または１５０ｎｍの）解像度を有するＳＡＯイメージングに供される。
【0071】
予後アッセイ（コンパニオン診断）も本発明の方法を用いて実行できる。例えば、ＥＲＧおよびＥＴＶ１遺伝子の再編成を検出して、かつＰＴＥＮ遺伝子の欠失を測定するために、ＦＩＳＨまたは変更されたＦＩＳＨを用いることができる。前立腺癌患者に対して化学療法が成功することになるかどうかの指標として、ＰＴＥＮ遺伝子の存在または非存在下でのＥＲＧ／ＥＴＶ１遺伝子異常の度合いを用いることができる。本発明の方法を用いたコンパニオン診断法の他の非限定の例は、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ：Ｐｏｌｙ ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）阻害剤のような治療法に、より反応しやすい患者を同定するためのＢＲＡＣＡｎａｌｙｓｉｓ；前立腺癌の攻撃性を評価するための細胞周期増殖；患者が治療に反応しやすいかどうかを示すための様々な癌治療に対する腫瘍細胞の安定性を含む。
【0072】
本発明の方法は、遺伝子発現に対する小分子または大分子の活性を確定するために用いることもできる。かかる場合には、透過処理およびオリゴヌクレオチド・プローブを含む混合物中への浸漬に先立って、１つ以上の小分子または大分子が細胞試料とともに典型的にインキュベートされる。次に、遺伝子発現に対する分子の効果と病状に対する潜在的な治療活性とを相互に関連付けることができる。
【0073】
本方法に用いられるイメージングの速度は、遺伝子発現に対するそれらの効果と関連する小分子および／または大分子の高スループット・スクリーニングも可能にする。典型的に、同じイメージング用ＳＡＯシステムを用いて２４時間で少なくとも５０個の小分子（ＭＷ＜１０００ｇ／ｍ）および／または大分子（ＭＷ＞１０００ｇ／ｍ）をスクリーニングできる。ある場合には、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００個の小分子および／または大分子をスクリーニングできる。
【0074】
本発明の方法は、さらに遺伝子バーコーディング（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡバーコーディング）に用いることができる。このように、様々な種を迅速に認識、同定および発見するための診断法として本方法を用いることができる。
【0075】
実験方法
以下の材料、機器および一般的な方法は、本発明の方法の諸態様を示すものである。これらは、開示される発明（単数または複数）を決して限定するものではない。
以下の材料、機器および一般的な方法は、本発明の方法の諸態様を示すものである。これらは、開示される発明（単数または複数）を決して限定するものではない。
【0076】
材料および機器
オリゴマー・プローブは、典型的に、然るべきソフトウェア・パッケージ、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｆｉｓｈ．ｃｏｍにおいてバイオサーチテクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通じて利用可能なＰｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて設計される。プローブは、自動化されたＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００上を含む、任意の適切な方法で合成されてもよい。
オリゴマー・プローブは、典型的に、然るべきソフトウェア・パッケージ、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｆｉｓｈ．ｃｏｍにおいてバイオサーチテクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通じて利用可能なＰｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて設計される。プローブは、自動化されたＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８７００上を含む、任意の適切な方法で合成されてもよい。
【0077】
フルオロフォアは、典型的に、それらの各供給元から購入される。かかるフルオロフォアの非限定の例は、バイオサーチテクノロジーズから入手可能な、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（登録商標）およびＱＵＡＳＡＲ（登録商標）色素、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から入手可能な、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、およびモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手可能な、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を含む。
【0078】
１つの蛍光標識をオリゴヌクレオチドに付着させ、それによって単一標識プローブを作り出すために、オリゴヌクレオチドをプールし、単一の反応において１つのフルオロフォアに結合させて、その後、非結合オリゴヌクレオチドおよび残りの遊離フルオロフォアをＨＰＬＣ精製によって除去する。米国特許出願第２０１２／０１２９１６５号（Ａｒｊｉｎ Ｒａｊ等）を参照。
【0079】
スライドガラスは、任意の適切な供給元から購入するとよい。非限定の例は、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）からのカタログ番号１２－５１８－１０３である。
【0080】
複数の単一標識プローブを用いた個別のｍＲＮＡ分子のイメージングは、典型的に、標的プローブ－ｍＲＮＡハイブリッド上で合成開口光学系（ＳＡＯ）を実現するシステムを用いて達成される。例えば、国際公開第２０１１／１１６１７５号を参照。１つのシステムに関する性能仕様は、次の通りである、すなわち、解像度－０．３０μｍ；イメージングＦＯＶ－０．８３ｍｍ×０．７ｍｍ；作動距離－７．０ｍｍ；被写界深度－１．３６μｍ；試料厚さ－≦２μｍ；ｚ区分数－１～３；対象媒体－２５ｍｍ×７５ｍｍ基板（例えば、顕微鏡スライド）。「解像度」は、５３２ｎｍ励起および６００ｎｍ放出波長に対する点広がり関数（ＰＳＦ：ｐｏｉｎｔ－ｓｐｒｅａｄ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の半値全幅（ＦＷＨＭ）として定義される。解像度は、例えば、４ビーム、６ビーム、または１０ビーム送りの解像度を用いることによって向上する。「イメージングＦＯＣ」は、対物レンズの倍率が２０×のｓＣＭＯＳカメラ（センサ・サイズ１６．６ｍｍ×１４ｍｍ）に基づく。
【0081】
ＳＡＯシステムの構成の観点から、以下のサブシステムおよび主要コンポーネントが典型的に用いられる、すなわち、光源－４０５ｎｍダイオード・レーザ（１００ｍＷ）、５３２ｎｍレーザ（１Ｗ、ＭＰＢ／２ＲＵ－ＶＦＬ－Ｐ－１０００－５３２－Ｒ）、６４２ ｎｍレーザ（１Ｗ、ＭＰＢ／２ＲＵ－ＶＧＬ－Ｐ－１０００－６４２－Ｒ）；照明－ビームエキスパンダ／コンバイナ（ＬＳＧ）、光スイッチ（レオニ（Ｌｅｏｎｉ）／ｅｏｌ １×４ ＰＭ）またはフリービーム・アーキテクチャ、パターン生成器（ＬＳＧ）；イメージング－対物レンズ‐２０×／０．４５ＮＡ（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）ＭＲＨ０８２３０）、カメラ‐（アンドール（Ａｎｄｏｒ）／ＤＧ１５２×－Ｃ０Ｅ－ＦＩ）、フィルタホイール（１０スロット、サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）／Ｌａｍｄａ １０－Ｂ）、フィルタ（サムロック（Ｓａｍｒｏｃｋ））、ＰＩ－ＦＯＣ（ＰＩ／Ｐ－７２５．４ＣＤ）；試料／貯蔵－Ｚステージ（電動式、ＰＩ／Ｐ－７３６．ＺＲ２Ｓ）、ＸＹステージ（電動式、ＰＩ／Ｍ２６８２１ＬＯＪ）、スライドまたは３５ｍｍ皿用試料マウント（ＰＩ／Ｐ－５４５．ＳＨ３）；機器制御－制御盤（ＬＳＧ）、制御ソフトウェア（ＬＳＧ）；データ解析／ＵＩ－解析ソフトウェア（ＬＳＧ）；メインコンピュータ－デスクトップコンピュータ（デル（Ｄｅｌｌ）／ＸＰＳ８３００）； テーブル－防振テーブル（ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）／ＶＩＳ３６６０－ＲＧ４－３２５Ａ）。
【0082】
実験方法
細胞試料を調製するための方法の非限定の例は、次の通りである。ｗｗｗ．ｓｉｎｇｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓにオンラインで公開されたＳｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（シンガーラボ・プロトコル）を参照。
細胞試料を調製するための方法の非限定の例は、次の通りである。ｗｗｗ．ｓｉｎｇｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓにオンラインで公開されたＳｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（シンガーラボ・プロトコル）を参照。
【0083】
溶液調製
０．５％ゼラチン中のカバーガラス：カバーガラスを０．１Ｎ ＨＣｌ中で２０分間煮沸することにより一箱分のカバーガラスを滅菌する。２回蒸留した水（「ＤＤＷ：ｄｏｕｂｌｙ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ」中でカバーガラスを数回リンスおよび洗浄する。ゼラチン（１．０ｇ）を秤量して２００ｍｌのＤＤＷに加える。結果として生じた混合物を攪拌し、温めて溶解を完了する。滅菌したカバーガラスをゼラチン溶液に移して、２０分間オートクレーブする。１０×ＰＢＳストック：５００ｍｌの１０×ＰＢＳに２５０μＬのＤＥＰＣを加える。混合物を溶解させるために攪拌し、次にオートクレーブする。１Ｍ ＭｇＣｌ２ストック：ＭｇＣｌ２（２０．３ｇ）を秤量して、ＤＤＷに加える。洗浄溶液（ＰＢＳＭ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２ストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈する。抽出溶媒（ＰＢＳＴ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈し、静かに攪拌して溶解を完了する。固定液（４％ ＰＦＡ）：１０ｍｌバイアルの２０％パラホルムアルデヒド・ストックに５ｍｌの１０×ＰＢＳストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで５０ｍｌに希釈する。
０．５％ゼラチン中のカバーガラス：カバーガラスを０．１Ｎ ＨＣｌ中で２０分間煮沸することにより一箱分のカバーガラスを滅菌する。２回蒸留した水（「ＤＤＷ：ｄｏｕｂｌｙ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ」中でカバーガラスを数回リンスおよび洗浄する。ゼラチン（１．０ｇ）を秤量して２００ｍｌのＤＤＷに加える。結果として生じた混合物を攪拌し、温めて溶解を完了する。滅菌したカバーガラスをゼラチン溶液に移して、２０分間オートクレーブする。１０×ＰＢＳストック：５００ｍｌの１０×ＰＢＳに２５０μＬのＤＥＰＣを加える。混合物を溶解させるために攪拌し、次にオートクレーブする。１Ｍ ＭｇＣｌ２ストック：ＭｇＣｌ２（２０．３ｇ）を秤量して、ＤＤＷに加える。洗浄溶液（ＰＢＳＭ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２ストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈する。抽出溶媒（ＰＢＳＴ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈し、静かに攪拌して溶解を完了する。固定液（４％ ＰＦＡ）：１０ｍｌバイアルの２０％パラホルムアルデヒド・ストックに５ｍｌの１０×ＰＢＳストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで５０ｍｌに希釈する。
【0084】
細胞および試料調製
細胞を標準的な条件下で成長させて、ペトリ皿におけるゼラチン化したカバーガラス上に播種する。任意の処理ステップ、例えば、飢餓および刺激を行う。細胞を氷冷ＰＢＳＭで手短かに洗浄する。細胞を室温においてＰＢＳＴ中で６０秒間抽出する。細胞を氷冷ＰＢＳＭで２回手短かに洗浄する。細胞を室温においてＰＦＡ固定液で２０分間固定する。細胞を氷冷ＰＢＳＭで２回手短かに洗浄する。固定済カバーガラスをＰＢＳＭ中に４℃で使用まで貯蔵する。
細胞を標準的な条件下で成長させて、ペトリ皿におけるゼラチン化したカバーガラス上に播種する。任意の処理ステップ、例えば、飢餓および刺激を行う。細胞を氷冷ＰＢＳＭで手短かに洗浄する。細胞を室温においてＰＢＳＴ中で６０秒間抽出する。細胞を氷冷ＰＢＳＭで２回手短かに洗浄する。細胞を室温においてＰＦＡ固定液で２０分間固定する。細胞を氷冷ＰＢＳＭで２回手短かに洗浄する。固定済カバーガラスをＰＢＳＭ中に４℃で使用まで貯蔵する。
【0085】
オリゴヌクレオチド・プローブを標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするための方法の非限定の例は、次の通りである。ｗｗｗ．ｓｉｎｇｅｒｌａｂ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓにオンラインで公開されたＳｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを参照。さらに、Ｆｅｍｉｎｏ ＡＭ， Ｆａｙ ＦＳ， Ｆｏｇａｒｔｙ Ｋ， ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ ＲＨ． Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ ｓｉｔｕ． １９９８． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８０：５８５－９０，及びＬｅｖｓｋｙ ＪＭ， Ｓｈｅｎｏｙ ＳＭ， Ｐｅｚｏ ＲＣ ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ ＲＨ． ２００２． Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２９７：８３６－４０を参照。
【0086】
溶液調製
洗浄溶液（ＰＢＳＭ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２ストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈する。プレ／ポストハイブリダイゼーション洗浄液（５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ）：２５０ｍｌホルムアミドに５０ｍｌの２０×ＳＳＣストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで５００ｍＬに希釈する。プローブ競合溶液（ｓｓＤＮＡ／ｔＲＮＡ）：５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡを加える。ハイブリダイゼーション用バッファー：６０μｌのＤＤＷに２０μｌのＢＳＡおよび２０μｌの２０×ＳＳＣストックを加える。低塩濃度洗浄溶液（２×ＳＳＣ）：５０ｍｌの２０×ＳＳＣストックに４５０ｍｌのＤＤＷを加える。核染色溶液（ＤＡＰＩ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＤＡＰＩストック（１０ｍｇを１．０ｍｌのＤＤＷに加えることにより固体から調製）を加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈し、振盪してＤＡＰＩを溶解させる。封入剤：適切なキットの要素、例えば、Ｐｒｏｌｏｎｇキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を調製するか、または等価な方法を用いる。
洗浄溶液（ＰＢＳＭ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５ｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２ストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈する。プレ／ポストハイブリダイゼーション洗浄液（５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ）：２５０ｍｌホルムアミドに５０ｍｌの２０×ＳＳＣストックを加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで５００ｍＬに希釈する。プローブ競合溶液（ｓｓＤＮＡ／ｔＲＮＡ）：５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ大腸菌ｔＲＮＡを加える。ハイブリダイゼーション用バッファー：６０μｌのＤＤＷに２０μｌのＢＳＡおよび２０μｌの２０×ＳＳＣストックを加える。低塩濃度洗浄溶液（２×ＳＳＣ）：５０ｍｌの２０×ＳＳＣストックに４５０ｍｌのＤＤＷを加える。核染色溶液（ＤＡＰＩ）：１００ｍｌの１０×ＰＢＳストックに５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＤＡＰＩストック（１０ｍｇを１．０ｍｌのＤＤＷに加えることにより固体から調製）を加える。結果として生じた混合物をＤＤＷで１Ｌに希釈し、振盪してＤＡＰＩを溶解させる。封入剤：適切なキットの要素、例えば、Ｐｒｏｌｏｎｇキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を調製するか、または等価な方法を用いる。
【0087】
ハイブリダイゼーション・ステップ
カラーコーディングおよび複数の転写物の検出に先立って、ハイブリダイゼーションの検査を行う。転写部位を示すために２つの高輝度色素を用いる。次に、色素の組み合わせを用いて各遺伝子に任意のカラーコードを割り当て、１つずつ検査を行う。固定したカバーガラスを、ピンセットを用いてコプリン・ジャー中に垂直に配置する。固定した細胞を再水和し、室温においてＰＢＳＭ中で１０分間洗浄する。細胞をプレハイブリダイゼーション溶液中で１０分間平衡化する。アッセイされることになる標的の異なる組み合わせごとに、一定分量のオリゴヌクレオチド・プローブ混合物をチューブに加える。競合溶液を１００倍超でプローブ混合物（単数または複数）に加える。混合物を真空乾燥する。乾燥したペレットを１０μｌホルムアミドに再懸濁して、チューブを加熱ブロック上に８５℃で５～１０分間置き、その後即座に氷上に置く。１０μｌのハイブリダイゼーション用バッファーを各チューブに加えて、２０μｌの反応体積を確保する。ガラス・プレートをパラフィルムで包み、反応のための作用空間に充てる。カバーガラスを重ねることなく各体積を覆って配置できるように、各２０μｌの反応体積を十分遠く離してプレート上に点在させる。カバーガラスをプレハイブリダイゼーション溶液から取り出して、過剰な液体を拭い取る。各カバーガラスを、細胞側を下にしてプレート上に点在するハイブリダイゼーション・ミックス上に置く。反応を封じ込めるために、プレートおよびカバーガラスをパラフィルムの別の層で包む。ハイブリダイゼーション後にカバーガラスを２回洗浄するのに十分な量のプレハイブリダイゼーション溶液とともにプレートを３７℃で３時間インキュベートする。カバーガラスの除去を可能にするためにパラフィルムの上部層を除去して下部層を外す。カバーガラスを予熱した洗浄液とともにコプリン・ジャー中に戻して３７℃で２０分間インキュベートする。洗浄液を変えて、２０分間繰り返す。溶液を２×ＳＳＣに変えて、室温で１０分間インキュベートする。溶液をＰＢＳＭに変えて、室温で１０分間インキュベートする。溶液を調製したＤＡＰＩに変えて、室温で１分間インキュベートし、次にＰＢＳＭで洗浄することにより核を対比染色する。ＰＢＳＭを変えて、取り付けまで室温で保持する。新たに調製した退色防止封入剤を用い、各カバーガラスを細胞側を下にしてスライドガラス上に取り付ける。過剰な液体を拭い取り、スライドを－２０℃で保存する。
カラーコーディングおよび複数の転写物の検出に先立って、ハイブリダイゼーションの検査を行う。転写部位を示すために２つの高輝度色素を用いる。次に、色素の組み合わせを用いて各遺伝子に任意のカラーコードを割り当て、１つずつ検査を行う。固定したカバーガラスを、ピンセットを用いてコプリン・ジャー中に垂直に配置する。固定した細胞を再水和し、室温においてＰＢＳＭ中で１０分間洗浄する。細胞をプレハイブリダイゼーション溶液中で１０分間平衡化する。アッセイされることになる標的の異なる組み合わせごとに、一定分量のオリゴヌクレオチド・プローブ混合物をチューブに加える。競合溶液を１００倍超でプローブ混合物（単数または複数）に加える。混合物を真空乾燥する。乾燥したペレットを１０μｌホルムアミドに再懸濁して、チューブを加熱ブロック上に８５℃で５～１０分間置き、その後即座に氷上に置く。１０μｌのハイブリダイゼーション用バッファーを各チューブに加えて、２０μｌの反応体積を確保する。ガラス・プレートをパラフィルムで包み、反応のための作用空間に充てる。カバーガラスを重ねることなく各体積を覆って配置できるように、各２０μｌの反応体積を十分遠く離してプレート上に点在させる。カバーガラスをプレハイブリダイゼーション溶液から取り出して、過剰な液体を拭い取る。各カバーガラスを、細胞側を下にしてプレート上に点在するハイブリダイゼーション・ミックス上に置く。反応を封じ込めるために、プレートおよびカバーガラスをパラフィルムの別の層で包む。ハイブリダイゼーション後にカバーガラスを２回洗浄するのに十分な量のプレハイブリダイゼーション溶液とともにプレートを３７℃で３時間インキュベートする。カバーガラスの除去を可能にするためにパラフィルムの上部層を除去して下部層を外す。カバーガラスを予熱した洗浄液とともにコプリン・ジャー中に戻して３７℃で２０分間インキュベートする。洗浄液を変えて、２０分間繰り返す。溶液を２×ＳＳＣに変えて、室温で１０分間インキュベートする。溶液をＰＢＳＭに変えて、室温で１０分間インキュベートする。溶液を調製したＤＡＰＩに変えて、室温で１分間インキュベートし、次にＰＢＳＭで洗浄することにより核を対比染色する。ＰＢＳＭを変えて、取り付けまで室温で保持する。新たに調製した退色防止封入剤を用い、各カバーガラスを細胞側を下にしてスライドガラス上に取り付ける。過剰な液体を拭い取り、スライドを－２０℃で保存する。
【0088】
オリゴヌクレオチド・プローブ－標的ｍＲＮＡハイブリッドの検出は、上記のようにＳＡＯシステムを用いて行う。
【0089】
ＴＯＰ１ ｍＲＮＡの定量化
ＴＯＰ１（トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）１）の発現をＡ５４９細胞におけるＦＩＳＨによって分析し、ＳＡＯシステム（２０×）を用いて画像化／定量化した。ＳＡＯイメージング条件は、次の通りである、すなわち、５００ｍＷ主出力（５３２ｎｍ）；５００ｍｓ露出／フレーム。ＳＡＯ画像の一部を図７に示す。画像は、およそ１００個の細胞を含み、ｍＲＮＡは、画像中に高輝度／白色／緑色ドットとして現れる。画像内の２０個の細胞のサンプリングは、次のｍＲＡカウントを示した、すなわち、５６；５９；５８；５４；６９；６０；６３；５４；７４；６５；９５；５２；６０；８５；６６；６７；４６；３６；６５；５３。図８は、ＴＯＰ１ ｍＲＮＡのＳＡＯ画像の関心領域の選択を示し、スポット強度および品質に基づく選択処理グラフを含む。
ＴＯＰ１（トポイソメラーゼ（ＤＮＡ）１）の発現をＡ５４９細胞におけるＦＩＳＨによって分析し、ＳＡＯシステム（２０×）を用いて画像化／定量化した。ＳＡＯイメージング条件は、次の通りである、すなわち、５００ｍＷ主出力（５３２ｎｍ）；５００ｍｓ露出／フレーム。ＳＡＯ画像の一部を図７に示す。画像は、およそ１００個の細胞を含み、ｍＲＮＡは、画像中に高輝度／白色／緑色ドットとして現れる。画像内の２０個の細胞のサンプリングは、次のｍＲＡカウントを示した、すなわち、５６；５９；５８；５４；６９；６０；６３；５４；７４；６５；９５；５２；６０；８５；６６；６７；４６；３６；６５；５３。図８は、ＴＯＰ１ ｍＲＮＡのＳＡＯ画像の関心領域の選択を示し、スポット強度および品質に基づく選択処理グラフを含む。
【0090】
ＨＥＲ２ ｍＲＮＡの定量化
ＨＥＲ２の発現をＭＣＦ７細胞（ヒト乳腺癌細胞株）におけるＦＩＳＨによって分析し、ＳＡＯシステム（２０×）を用いて画像化／定量化した。ＳＡＯイメージング条件は、次の通りである、すなわち、５００ｍＷ主出力（５３２ｎｍ）；５００ｍｓ露光／フレーム。結果を図９に示す。右上の画像は、１００個超の細胞を含み、ｍＲＮＡは、画像中に高輝度／白色ドットとして現れる。他の画像は、およそ２０個の細胞を示す選択部である。２０個の細胞のサンプリングは、次のカウントを示した、すなわち、６２、６１、７１、９７、７４、６６、６９、４８、５８、８７、３７、９２、１０３、８０、９０、２１、３７、１０９、５７、１２２（平均７２）。
ＨＥＲ２の発現をＭＣＦ７細胞（ヒト乳腺癌細胞株）におけるＦＩＳＨによって分析し、ＳＡＯシステム（２０×）を用いて画像化／定量化した。ＳＡＯイメージング条件は、次の通りである、すなわち、５００ｍＷ主出力（５３２ｎｍ）；５００ｍｓ露光／フレーム。結果を図９に示す。右上の画像は、１００個超の細胞を含み、ｍＲＮＡは、画像中に高輝度／白色ドットとして現れる。他の画像は、およそ２０個の細胞を示す選択部である。２０個の細胞のサンプリングは、次のカウントを示した、すなわち、６２、６１、７１、９７、７４、６６、６９、４８、５８、８７、３７、９２、１０３、８０、９０、２１、３７、１０９、５７、１２２（平均７２）。
【0091】
ＦＫＢＰ５ ｍＲＮＡの定量化
ＦＫＢＰ５の発現をＡ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞株）におけるＦＩＳＨによって分析した。図１０は、標準的な蛍光顕微鏡（６０×／１．４１ ＮＡ０．１油浸）からの２つの画像を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルされた画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（およそ１３個の細胞）を示す；画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（およそ１４個の細胞）を示す。大きい方の、ほぼ卵形の構造は、細胞核であり、個別の検出分子が核中および周りの高輝度／白色ドットとして示される。図１１は、ＳＡＯイメージング・デバイス（２０×）を備えるシステムを用いた２つの画像（得られた全画像の１／１０）を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルした画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（およそ５０個の細胞）を示し、画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（およそ５０個の細胞）を示す。大きい方の、ほぼ卵形の構造は、細胞核であり、個別の検出分子が核中および周りの高輝度／白色ドットとして示される。
ＦＫＢＰ５の発現をＡ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞株）におけるＦＩＳＨによって分析した。図１０は、標準的な蛍光顕微鏡（６０×／１．４１ ＮＡ０．１油浸）からの２つの画像を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルされた画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（およそ１３個の細胞）を示す；画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（およそ１４個の細胞）を示す。大きい方の、ほぼ卵形の構造は、細胞核であり、個別の検出分子が核中および周りの高輝度／白色ドットとして示される。図１１は、ＳＡＯイメージング・デバイス（２０×）を備えるシステムを用いた２つの画像（得られた全画像の１／１０）を示す。「Ｍｉｎｕｓ Ｄｅｘ」とラベルした画像は、２４ｎＭデキサメタゾンの添加によるアップレギュレーションより前の細胞（およそ５０個の細胞）を示し、画像「Ｐｌｕｓ Ｄｅｘ」は、８時間にわたる２４ｎＭデキサメタゾンの添加後の細胞（およそ５０個の細胞）を示す。大きい方の、ほぼ卵形の構造は、細胞核であり、個別の検出分子が核中および周りの高輝度／白色ドットとして示される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】