特許7134261乳酸菌由来Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトを含む大腸疾患の治療または予防用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-01
(45)【発行日】2022-09-09
(54)【発明の名称】乳酸菌由来Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトを含む大腸疾患の治療または予防用組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20220902BHJP
C12N 15/67 20060101ALI20220902BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220902BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220902BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220902BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220902BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220902BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220902BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220902BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220902BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220902BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z
C12N15/67 Z
A61K48/00
A61K38/16
A61K31/7088
A61P1/00
A61P35/00
A61P1/04
A61P9/10
A61P31/04
C12N15/31 ZNA
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020567088
(86)(22)【出願日】2020-08-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-11
(86)【国際出願番号】 KR2020010432
(87)【国際公開番号】W WO2021049764
(87)【国際公開日】2021-03-18
【審査請求日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】10-2019-0112682
(32)【優先日】2019-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517002731
【氏名又は名称】セル バイオテック カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】ミョンジュン・チョン
【審査官】佐久 敬
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１３９２２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－１４１０８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－２５４９１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１９２２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５２１０８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１３９２２７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｐ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）プロモーター；および（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含み、前記Ｐ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列であり、
前記プロモーターは、真核細胞発現用プロモーターである、大腸疾患の治療または予防用Ｐ８タンパク質の発現コンストラクト。
【請求項2】
前記発現コンストラクトは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターベースの発現コンストラクトであることを特徴とする、請求項１に記載のＰ８タンパク質の発現コンストラクト。
【請求項3】
（ａ）プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含むＰ８タンパク質の発現コンストラクトの治療学的有効量；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含み、
前記Ｐ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列であり、
前記プロモーターは、真核細胞発現用プロモーターである、大腸疾患の治療または予防用薬学的組成物。
【請求項4】
前記発現コンストラクトは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターベースの発現コンストラクトであることを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記大腸疾患は、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症侯群、およびクローン病からなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳酸菌由来Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトおよびこれを含む大腸疾患の治療または予防用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
２０１８年、米国で約１４５，６００人の成人が大膓癌の診断を受けており、約５１，０２０人が大膓癌で死亡した。米国で大膓癌５年生存率は約６５％である。大膓癌は身体の他の部分に侵入したり広がりかねない。大膓癌の治療には手術、放射線療法、化学療法および標的療法の組合せが含まれる。大膓癌に対する化学療法は、進行を抑制または予防する天然、合成または生物学的物質を含む。しかし、多くの化学療法剤は正常細胞に毒性がある。
【0003】
深刻な副作用のない新たなバイオ治療剤を見出すために、プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）に関する多くの研究が進められている。人間の腸内微生物とプロバイオティクスは一般的に安全と見なされるため、プロバイオティクスから分離されたタンパク質は抗－大膓癌効果を有し、かつ、全身毒性は減少させることができる。実際に、大膓癌を抑制するプロバイオティクス由来タンパク質は副作用がほとんどない（非特許文献１及び２）。一般的に食品等級のバクテリアは安全に摂取できる。歴史的に当該微生物は有害な病理的異常現象の発展とは関連がなかった。実際に、それらの健康に対する肯定的な影響はヒトと動物性食品の生産の脈絡できちんと文書化されている。したがって、プロバイオティクス由来タンパク質が相対的に安全と結論を出すことができる。
【0004】
大膓癌に対する新規の治療タンパク質を確認するために、実験室でプロバイオティクスが選別された（非特許文献３）。このような選別過程でラクトバチルスラムノサス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＬＲ）ＫＣＴＣ １２２０２ＢＰから分離された８ｋＤａタンパク質（以下、「Ｐ８タンパク質」）を発見し、このタンパク質が大膓癌細胞の成長を抑制することが確認された。ＤＬＤ－１細胞を用いてＰ８タンパク質が腫瘍の成長を抑制し、抗－増殖および抗－移動活性（ａｎｔｉ－ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有することを発見した。しかし、このような抗癌活性は、Ｐ８タンパク質が細胞内部に効率良く浸透しないため、非常に弱かった。したがって、細胞内へのＰ８タンパク質の伝達を改善するための新たな治療法が要求される。
【0005】
本明細書で言及された特許文献および参考文献は、それぞれの文献が参照によって個別的で明確に特定されたものと同じ程度に本明細書に参照として組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｗｉｄａｋｏｗｉｃｈ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．， Ａ．Ｒｅｖｉｅｗ：Ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ２００７，１２，１４４３－１４５５
【文献】Ｓｔｅｉｄｌｅｒ，Ｌ．；Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ，Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ：Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００６，５９，１４０－１４６．
【文献】Ａｎ，Ｂ．Ｃ．；Ｒｙｕ，Ｙ．；Ｙｏｏｎ，Ｙ．－Ｓ．；Ｃｈｏｉ，Ｏ．；Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．；Ｋｉｍ，Ｔ．Ｙ．；Ｃｈｕｎｇ，Ｍ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａ Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＳＬ４ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐ８．Ｍｏｌｌ．Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ ｒｅｖｉｅｗ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、Ｐ８タンパク質の抗癌活性を増大させる新たな薬物伝達システムを開発するために鋭意研究してきた。その結果、Ｐ８タンパク質を哺乳動物細胞で安定して発現させる遺伝子発現コンストラクトを開発し、この開発されたＰ８タンパク質の発現コンストラクトを大膓癌細胞で発現に成功すれば、Ｐ８タンパク質の大膓癌細胞に対する抗癌効果を向上させることができることを、実験的に確認して、本発明を完成した。
【0008】
そのため、本発明の目的は、（ａ）プロモーター；および（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含む、Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトを提供することである。
【0009】
本発明の他の目的は、（ａ）プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含むＰ８タンパク質の発現コンストラクトの治療学的有効量；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、大腸疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供することである。
【0010】
本発明の他の目的および技術的特徴は、以下の発明の詳細な説明、請求の範囲および図面によってより具体的に提示される。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一態様によれば、本発明は、（ａ）プロモーター；および（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含む、Ｐ８タンパク質の発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供する。
【0012】
本発明は、「Ｐ８タンパク質」を哺乳動物細胞内で、好ましくは、哺乳動物の癌細胞内で内因的に発現させてその抗癌活性を向上させるための発現システムに関する。
【0013】
本発明において、「Ｐ８タンパク質」は、本発明者によってラクトバチルスラムノサス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＬＲ）ＫＣＴＣ １２２０２ＢＰから分離された８ｋＤａの大きさのタンパク質であり、優れた抗癌活性があることが確認された。
【0014】
本発明において、Ｐ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列は、真核細胞における発現のためにコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）された配列である。
【0015】
本発明の一実施形態によれば、本発明において、Ｐ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列である。
【0016】
本発明で使われる用語「発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、発現目的のヌクレオチド配列および該配列の発現を誘導する発現配列、例えば、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含む発現のための最小限の要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）を意味する。このような発現コンストラクトは、好ましくは、転写調節配列－発現目的のヌクレオチド配列－ポリアデニル化配列を含むことができる。
【0017】
本発明で使われる用語「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、タンパク質または核酸分子エンコーディングヌクレオチド配列または機能的ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を意味する。より好ましくは、本発明の「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、真核細胞において発現目的の遺伝子（ポリヌクレオチド配列）の転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を誘導できる転写調節配列を意味する。真核細胞において作動可能なプロモーター配列は、例えば、サイトメガロウイルスの即時初期型プロモーター、ＳＶ４０のプロモーター（ＳＶ４０後期型プロモーターおよびＳＶ４０初期型プロモーター）、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）のｔｋプロモーター、アデノウイルス２主要後期型プロモーター（Ａｄｅｎｏ ２ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＰＡｄｍｌ）、アデノウイルス２初期型プロモーター（ＰＡｄＥ２）、ＡＡＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）のｐ１９プロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、マウスのメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター（ＭＴプロモーター）、ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、β－アクチンプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子のプロモーター、ヒトリンポトキシン遺伝子のプロモーターおよびヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、そしてヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これに限定されるものではない。
【0018】
本発明で使われる用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、他のヌクレオチド配列の転写（ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）および／または解読（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を調節する。
【0019】
本発明の発現コンストラクトには、転写終結配列として、ポリアデニル化配列が含まれ、例えば、ウシ成長ホルモンターミネータ（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６９８３－６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：５３８６－５３９３（１９９２））、ＨＩＶ－１ ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１８７０－１８７６（１９９８））、β－グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．．ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ４９：３９９－４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫ ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２１０４－２１１３（１９８５））またはポリオーマウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂ ａｎｄ Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３－４７９０（１９９５））を含むが、これに限定されるものではない。
【0020】
また、本発明の発現コンストラクトには、選択標識として、当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含むことができ、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン（Ｇ４１８）、ネオマイシン、またはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含むことができる。
【0021】
本発明の発現コンストラクトは多様な形態で作製可能であり、例えば、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ベクターまたはウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）システムで作製されてもよい。
【0022】
本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含むＰ８タンパク質の発現コンストラクトの治療学的有効量；および（ｂ）薬学的に許容される担体を含む、大腸疾患の治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【0023】
本発明の薬学的組成物において、「Ｐ８タンパク質の発現コンストラクト」に関する内容は、本発明の他の態様である、「（ａ）プロモーター；および（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＰ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列を含む、Ｐ８タンパク質の発現コンストラクト」に関して説明された内容と同一であるので、重複して説明しない。
【0024】
本発明の一実施形態によれば、前記Ｐ８タンパク質コーディングヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列である。
【0025】
本発明の他の実施形態によれば、前記プロモーターは、真核細胞発現用プロモーターである。
【0026】
本発明の他の実施形態によれば、前記発現コンストラクトは、プラスミドベクターまたはウイルスベクターベースの発現コンストラクトである。
【0027】
本発明の薬学的組成物において、用語「治療学的有効量」は、大腸疾患に対する治療または予防効果を達成するのに十分な量を意味する。
【0028】
本発明で使われる「薬学的に許容される担体」は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでもよい。
【0029】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、または局所投与を利用して投与することができる。
【0030】
本発明の薬学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病の症状の程度、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、および反応感応性のような要因によって異なり、通常熟練した医師は目的の治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。
【0031】
本発明の薬学的組成物は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化されることで、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に入れて製造されてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含んでもよい。
【0032】
本発明の一具体例において、「大腸疾患」とは、大腸に発生する疾病を総称する意味であって、好ましくは、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症侯群、クローン病などを含むが、これに限定されず、最も好ましくは、大膓癌である。
【発明の効果】
【0033】
本発明は、乳酸菌由来Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトおよびこれを含む大腸疾患の治療または予防用組成物に関する。本発明のＰ８タンパク質の発現コンストラクトは、Ｐ８タンパク質を癌細胞内で内因的に発現させることで、細胞周期停止活性により抗癌効果を大きく向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1A】コドン－最適化されたＰ８タンパク質コーディング遺伝子をｐＣＩ－ｎｅｏ発現プラスミド（ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ）にクローニングした模式図である。
【図1B】Ｐ８タンパク質の内因性発現をウェスタンブロッティングで確認した結果である［レーン１：ｒ－ｐ８（１００ｎｇ）、レーン２：ＤＬＤ－１細胞抽出物（３０μｇ）、レーン３：ＥＶ細胞株抽出物（３０μｇ）、レーン４：Ｐ８細胞株抽出物（３０μｇ）］。ＧＡＰＤＨは内部対照群として用いた。
【図1C】内因性Ｐ８タンパク質の発現をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点顕微鏡（６０Ｘ）によって細胞内で観察した結果である。細胞を染色してｐ８（緑色）、細胞膜マーカーＥｐＣＡＭ（赤色）または核（ＤＡＰＩ：青色）を検出した。
【図1D】核においてＰ８タンパク質の内因性発現を確認した結果である。上パネルは核抽出物のウェスタンブロッティングの結果であり、下パネルは核抽出物のＥＬＩＳＡ分析の結果である。Ｌａｍｉｎ Ｂ１を内部対照群として用いた。
【図1E】分離された核分画における細胞質の汚染がないことをウェスタンブロッティングにより確認した結果である［レーン１：ＤＬＤ－１細胞溶解物（３０μｇ）、レーン２：細胞質分画（３０μｇ）、レーン３：核分画（３０μｇ）］。ＧＡＰＤＨは細胞質プローブとして用いられた。
【図2A】内因性発現によって内因性Ｐ８タンパク質発現の抗癌活性を向上させるか否かを調べるために、ＭＴＴ分析により抗増殖効果を調べた結果である。
【図2B】Ｐ８タンパク質の内因性発現後におけるコロニー形成の測定結果である。クリスタルバイオレットで染色して決定した。
【図2C】Ｐ８タンパク質の内因性発現による抗－移動活性（ａｎｔｉ－ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した結果である。抗－移動活性は傷治癒分析により決定した。傷回復をイメージＪを用いて分析した。
【図2D】Ｐ８タンパク質の内因性発現の抗癌効能をＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点顕微鏡下で調べた結果である。生細胞／死細胞のマーカーとしてＳｙｔｏ９（緑色）／ＥｔｈＤ－１（赤色）を、または総細胞マーカーとしてＨｏｅｃｈｓｔ（青色）を用いて細胞を染色した。
【図2E】外因性Ｐ８タンパク質の処理によるアポトーシス特性を測定した結果である。Ｐ８タンパク質（４０μＭ）を、７２時間、ＤＬＤ－１細胞（３×１０３細胞／ウェル）とともにインキュベーションした後、２つの細胞［対照群およびｒ－ｐ８（４０μＭ）処理］をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞で染色した。マーカーＳｙｔｏ９（緑色）／ＥｔｈＤ－１（赤色）、または全体セルマーカーＨｏｅｃｈｓｔ（青色）を用いた。
【図3A】ＤＬＤ－１細胞においてＧ２停止に関連する分子に対する内因性Ｐ８タンパク質発現の効果を示すウェスタンブロッティングの結果である（ＥＶ、空ベクター）。
【図3B】細胞周期に対する内因性Ｐ８タンパク質発現の効果を決定するために、細胞を回収し、フローサイトメトリー分析法で行った結果である。内因性Ｐ８タンパク質はＧ２－期においてＤＬＤ－１細胞の停止を誘導した。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本明細書で説明された具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態または例示を代表する意味であり、これによって本発明の範囲が限定されない。本発明の変形と他の用途が本明細書の特許請求の範囲に記載の発明の範囲を逸脱しないことは当業者にとって自明である。
【実施例】
【0036】
実験方法
１．バクテリア菌株およびその培養
Ｐ８タンパク質はヒトの糞便から分離したラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＬＲ）ＫＣＴＣ １２２０２ＢＰ菌株から得た。ＬＲはプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）であり、セルバイオテック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（金浦、韓国）で保持されている培養から得た。Ｐ８タンパク質の内因性発現のための伝達運搬体としてｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターを使用した。細胞はＤｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ ａｇａｒ（ＭＲＳ）ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で１８～２４時間培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５αおよびＣ４１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）はＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて３７℃で１８～２４時間培養した。
１．バクテリア菌株およびその培養
Ｐ８タンパク質はヒトの糞便から分離したラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）（ＬＲ）ＫＣＴＣ １２２０２ＢＰ菌株から得た。ＬＲはプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）であり、セルバイオテック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ（金浦、韓国）で保持されている培養から得た。Ｐ８タンパク質の内因性発現のための伝達運搬体としてｐＣＩ－ｎｅｏ発現ベクターを使用した。細胞はＤｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ ａｇａｒ（ＭＲＳ）ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で１８～２４時間培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５αおよびＣ４１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）はＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を用いて３７℃で１８～２４時間培養した。
【0037】
【表1】
【0038】
２．コドン最適化Ｈｉｓ－タグＰ８タンパク質の作製、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＰ８タンパク質を発現させるために、ヘキサ－ヒスチジン（６Ｘ Ｈｉｓ）タグおよびＴｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（３０５ｂｐ）を含む、コドン最適化されたＰ８タンパク質遺伝子を合成した（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ））（表１）。Ｐ８タンパク質は発現ベクターｐＥＴ－２８ａを用いて発現させた。Ｐ８のコンストラクトを、Ｍ９培地にＯ．Ｄ．値０．６に至るまで培養したＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｃ４１（ＤＥ３）に形質転換させた。（ＳｅＭｅｔ：ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）－Ｐ８タンパク質の過発現は０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して４時間行った。
細胞を収集した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌで再懸濁させた。超音波処理後に、遠心分離して細胞上澄液を得た。Ｐ８タンパク質はＮｉ２＋－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に結合させ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭイミダゾールで洗浄して精製した。６Ｘ Ｈｉｓタグは１ｍＭ ＤＴＴの存在下でＴＥＶプロテアーゼによって除去した。ＳｅＭｅｔ Ｐ８タンパク質の均一性はサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてチェックした。
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞においてＰ８タンパク質を発現させるために、ヘキサ－ヒスチジン（６Ｘ Ｈｉｓ）タグおよびＴｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位（３０５ｂｐ）を含む、コドン最適化されたＰ８タンパク質遺伝子を合成した（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ））（表１）。Ｐ８タンパク質は発現ベクターｐＥＴ－２８ａを用いて発現させた。Ｐ８のコンストラクトを、Ｍ９培地にＯ．Ｄ．値０．６に至るまで培養したＥ．ｃｏｌｉ菌株Ｃ４１（ＤＥ３）に形質転換させた。（ＳｅＭｅｔ：ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）－Ｐ８タンパク質の過発現は０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して４時間行った。
細胞を収集した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌで再懸濁させた。超音波処理後に、遠心分離して細胞上澄液を得た。Ｐ８タンパク質はＮｉ２＋－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に結合させ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭイミダゾールで洗浄して精製した。６Ｘ Ｈｉｓタグは１ｍＭ ＤＴＴの存在下でＴＥＶプロテアーゼによって除去した。ＳｅＭｅｔ Ｐ８タンパク質の均一性はサイズ排除クロマトグラフィー（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてチェックした。
【0039】
３．ＤＬＤ－１細胞内におけるコドン－最適化Ｐ８タンパク質の発現
哺乳動物細胞内において発現のためのＰ８タンパク質遺伝子コドンを合成した（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）。Ｐ８ ＤＮＡ断片（２３６ｂｐ）をＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで切断した後、ｐＣＩ－ｎｅｏベクターのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイト内にクローニングした（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（表１）。作製したコンストラクトをその増幅のためにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換させた。使用したすべての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。大膓癌細胞（ＤＬＤ－１）をプラスミドＤＮＡ（ｐＣＩ－ｎｅｏおよびｐＣＩ－ｎｅｏ－ｐ８）で形質転換させた。形質転換前に、ＤＬＤ－１細胞はウェルあたり７×１０５細胞の密度で６－ウェルプレートにプレーティングした。一晩培養した後、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造会社の指示書に従って形質転換させた。形質転換された細胞は抗生剤Ｇ－４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で選別した。
哺乳動物細胞内において発現のためのＰ８タンパク質遺伝子コドンを合成した（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）。Ｐ８ ＤＮＡ断片（２３６ｂｐ）をＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで切断した後、ｐＣＩ－ｎｅｏベクターのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩサイト内にクローニングした（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）（表１）。作製したコンストラクトをその増幅のためにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換させた。使用したすべての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。大膓癌細胞（ＤＬＤ－１）をプラスミドＤＮＡ（ｐＣＩ－ｎｅｏおよびｐＣＩ－ｎｅｏ－ｐ８）で形質転換させた。形質転換前に、ＤＬＤ－１細胞はウェルあたり７×１０５細胞の密度で６－ウェルプレートにプレーティングした。一晩培養した後、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造会社の指示書に従って形質転換させた。形質転換された細胞は抗生剤Ｇ－４１８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で選別した。
【0040】
４．細胞培養
ヒトＣＲＣ（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；大膓癌）細胞株ＤＬＤ－１はＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ；Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入して、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で、５％ＣＯ２／３７℃で保持した。
ヒトＣＲＣ（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ；大膓癌）細胞株ＤＬＤ－１はＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ；Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）から購入して、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で、５％ＣＯ２／３７℃で保持した。
【0041】
５．細胞増殖分析
ＤＬＤ－１細胞株（ｐＣＩ－ｎｅｏ（ＥＶ）およびｐＣＩ－ｎｅｏ－Ｐ８（Ｐ８））を９６－ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に接種し、３７℃でインキュベーションした。７２時間後に、細胞生存能をＭＴＴ分析（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。吸光度はｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
ＤＬＤ－１細胞株（ｐＣＩ－ｎｅｏ（ＥＶ）およびｐＣＩ－ｎｅｏ－Ｐ８（Ｐ８））を９６－ウェルプレート（１×１０３細胞／ウェル）に接種し、３７℃でインキュベーションした。７２時間後に、細胞生存能をＭＴＴ分析（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。吸光度はｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【0042】
６．傷治癒分析（Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）
ＤＬＤ－１細胞株（ＥＶおよびＰ８）を６－ウェルプレート（ウェルあたり５×１０６細胞）に接種した。接種２４時間後に、ピペットチップを用いてプレートの中央を引っ掻いた。次いで、細胞をホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３日間、３７℃で培養した。傷治癒は顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で毎日観察した。
ＤＬＤ－１細胞株（ＥＶおよびＰ８）を６－ウェルプレート（ウェルあたり５×１０６細胞）に接種した。接種２４時間後に、ピペットチップを用いてプレートの中央を引っ掻いた。次いで、細胞をホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３日間、３７℃で培養した。傷治癒は顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で毎日観察した。
【0043】
７．ＥＬＩＳＡ分析
最適化されたＥＬＩＳＡ手順は次のように行った：９６－ウェルポリスチレンプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、韓国・京畿道・抱川市）を１００μＬの希釈した抗－Ｐ８ ＩｇＧ（１：５５００）（ポリクロナール－ウサギ；Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、韓国、ソウル）を用いて、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）内で４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを３００μＬ洗浄緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を有する１Ｘ Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ－Ｓａｌｉｎｅ緩衝液（ＴＢＳ）（ＴＢＳ－Ｔ）］で２回洗浄した後、３００μＬブロッキング緩衝液（１Ｘ ＰＢＳおよび５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ））で常温で１時間ブロッキングした。タンパク質サンプル（核抽出物：１００μＬ）を添加する前に、３００μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した後、室温で１５０分間培養した。サンプルを結合した後、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、室温で９０分間、１Ｘ ＰＢＳ／５％ＦＢＳ中に１００μＬ抗－Ｐ８ ＩｇＧ－ビオチン（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を添加した。次に、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、常温で３０分間、１Ｘ ＰＢＳ／２．５％ＦＢＳ内の１００μＬストレプトアビジン－ＨＲＰ（１６６ｐｇ／ｍｌ）（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を添加した。次に、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１溶液（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）を室温の暗（ｄａｒｋ）条件で２０分間添加した後に発色させた。５０μＬの停止緩衝剤（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応を停止させた。多機能マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定した。Ｐ８タンパク質に対する標準曲線を構築するために、マウス血清（２倍希釈：１０００ｎｇ／ｍＬ～１５．６２５ｎｇ／ｍＬ）を３回分析した。それぞれのサンプルを２つの異なる希釈で分析し、２回行った。内因性Ｐ８タンパク質についての結果はナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）で報告された。
最適化されたＥＬＩＳＡ手順は次のように行った：９６－ウェルポリスチレンプレート（ＳＰＬ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、韓国・京畿道・抱川市）を１００μＬの希釈した抗－Ｐ８ ＩｇＧ（１：５５００）（ポリクロナール－ウサギ；Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、韓国、ソウル）を用いて、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）内で４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを３００μＬ洗浄緩衝液［０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を有する１Ｘ Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ－Ｓａｌｉｎｅ緩衝液（ＴＢＳ）（ＴＢＳ－Ｔ）］で２回洗浄した後、３００μＬブロッキング緩衝液（１Ｘ ＰＢＳおよび５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ））で常温で１時間ブロッキングした。タンパク質サンプル（核抽出物：１００μＬ）を添加する前に、３００μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した後、室温で１５０分間培養した。サンプルを結合した後、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、室温で９０分間、１Ｘ ＰＢＳ／５％ＦＢＳ中に１００μＬ抗－Ｐ８ ＩｇＧ－ビオチン（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を添加した。次に、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、常温で３０分間、１Ｘ ＰＢＳ／２．５％ＦＢＳ内の１００μＬストレプトアビジン－ＨＲＰ（１６６ｐｇ／ｍｌ）（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を添加した。次に、ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ）で４回洗浄した後、１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１溶液（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）を室温の暗（ｄａｒｋ）条件で２０分間添加した後に発色させた。５０μＬの停止緩衝剤（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加して反応を停止させた。多機能マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を測定した。Ｐ８タンパク質に対する標準曲線を構築するために、マウス血清（２倍希釈：１０００ｎｇ／ｍＬ～１５．６２５ｎｇ／ｍＬ）を３回分析した。それぞれのサンプルを２つの異なる希釈で分析し、２回行った。内因性Ｐ８タンパク質についての結果はナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）で報告された。
【0044】
８．ウェスタンブロッティング分析
ＤＬＤ－１細胞をプロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液に溶解させた。次に、タンパク質（計４０μｇ）をソジウムドデシルスルフェート－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移した。ブロッティングされた膜を５％脱脂乳／Ｔ－ＴＢＳで遮断した後、適切な一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベーションした；すべての抗体は１：１０００で希釈した。膜をＴ－ＴＢＳで３回（各１５分間）洗浄した後、５％脱脂乳／Ｔ－ＴＢＳで遮断した。次いで、膜をＨＲＰ－連結された二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で１時間培養した。内部対照群としてグリセルアルデヒド３－ホスフェート脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を使用した。タンパク質バンドはＥｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した後、Ｃｈｅｍｉ－ｄｏｃＴＭ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて放射能写真撮影を行った。
ＤＬＤ－１細胞をプロテアーゼ抑制剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液に溶解させた。次に、タンパク質（計４０μｇ）をソジウムドデシルスルフェート－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移した。ブロッティングされた膜を５％脱脂乳／Ｔ－ＴＢＳで遮断した後、適切な一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベーションした；すべての抗体は１：１０００で希釈した。膜をＴ－ＴＢＳで３回（各１５分間）洗浄した後、５％脱脂乳／Ｔ－ＴＢＳで遮断した。次いで、膜をＨＲＰ－連結された二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で１時間培養した。内部対照群としてグリセルアルデヒド３－ホスフェート脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を使用した。タンパク質バンドはＥｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した後、Ｃｈｅｍｉ－ｄｏｃＴＭ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて放射能写真撮影を行った。
【0045】
９．ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点顕微鏡を用いた免疫細胞化学
大膓癌細胞（ＤＬＤ－１）を６－ウェルプレートに配置されたカバースリップに接種した。２４時間後、Ｐ８タンパク質（０～４０μＭ）を追加的に７２時間各ウェルに添加した。細胞を室温で３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に１５分間固定させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで２分間培養して細胞を透過させた後、洗浄した。背景信号を減少させるために、細胞をＰＢＳ中に４％ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。次いで、細胞をウサギポリクロナール抗－Ｐ８抗体（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）とともに４℃で一晩インキュベーションするか、またはマウスモノクロナール抗－ＥｐＣＡＭ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で２時間インキュベーションした。タンパク質の局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）はＦＩＴＣ－接合されたヤギ抗－ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰＡ，ＵＳＡ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８－接合されたロバ抗－マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて視覚化した。核染色は、細胞を５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３，２５８（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した後、装着した。イメージはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて得た。
大膓癌細胞（ＤＬＤ－１）を６－ウェルプレートに配置されたカバースリップに接種した。２４時間後、Ｐ８タンパク質（０～４０μＭ）を追加的に７２時間各ウェルに添加した。細胞を室温で３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に１５分間固定させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで２分間培養して細胞を透過させた後、洗浄した。背景信号を減少させるために、細胞をＰＢＳ中に４％ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。次いで、細胞をウサギポリクロナール抗－Ｐ８抗体（Ｙｏｕｎｇ Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）とともに４℃で一晩インキュベーションするか、またはマウスモノクロナール抗－ＥｐＣＡＭ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに４℃で２時間インキュベーションした。タンパク質の局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）はＦＩＴＣ－接合されたヤギ抗－ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＰＡ，ＵＳＡ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８－接合されたロバ抗－マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて視覚化した。核染色は、細胞を５μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３，２５８（Ｓｉｇｍａ）とともに室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗浄した後、装着した。イメージはＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓマイクロ共焦点顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて得た。
【0046】
１０．フローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｓｓａｙ）
細胞周期段階の分布に対する内因性Ｐ８タンパク質の効果を調べるために、細胞をフローサイトメトリー分析により分析した。ＤＬＤ－１細胞株（ＥＶおよびＰ８）をプレーティングし、４８時間培養した。ＤＬＤ－１細胞をトリプシン処理によって培養皿から除去し、遠心分離して収集した後、ＰＢＳで洗浄した。各サンプルから５×１０５個の細胞を氷－冷却させた７０％エタノールに固定させ、３０分間以上氷上でインキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、４００μＬ ＰＢＳに再懸濁させ、５０μＬ ＲＮＡｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）および５０μＬヨウ化プロピジウム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。インキュベーション後（常温で１時間）、染色された核をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で分析した。細胞周期の分布を分析した。
細胞周期段階の分布に対する内因性Ｐ８タンパク質の効果を調べるために、細胞をフローサイトメトリー分析により分析した。ＤＬＤ－１細胞株（ＥＶおよびＰ８）をプレーティングし、４８時間培養した。ＤＬＤ－１細胞をトリプシン処理によって培養皿から除去し、遠心分離して収集した後、ＰＢＳで洗浄した。各サンプルから５×１０５個の細胞を氷－冷却させた７０％エタノールに固定させ、３０分間以上氷上でインキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、４００μＬ ＰＢＳに再懸濁させ、５０μＬ ＲＮＡｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）および５０μＬヨウ化プロピジウム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。インキュベーション後（常温で１時間）、染色された核をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で分析した。細胞周期の分布を分析した。
【0047】
実験結果
１．内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）Ｐ８タンパク質の発現
Ｐ８タンパク質の抗癌活性をより増大させるために、コドン－最適化させた配列とｐＣＩ－ｎｅｏベクターを用いて哺乳動物細胞においてＰ８タンパク質を内因的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）発現させた（図１Ａ）。ウェスタンブロッティング方法で内因性Ｐ８タンパク質の発現を測定し（図１Ｂ）、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ共焦点顕微鏡を用いて内因性Ｐ８タンパク質の細胞内の位置を視覚化した（図１Ｃ）。内因的に発現したＰ８タンパク質は細胞質および核ともにおいて観察された（図１Ｃ）。核抽出物のウェスタンブロッティング分析およびＥＬＩＳＡ分析（ｂｅｌｏｗ ｐａｎｅｌ）により、内因的に発現したＰ８タンパク質が細胞質から核に移動したことを確認した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。
１．内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）Ｐ８タンパク質の発現
Ｐ８タンパク質の抗癌活性をより増大させるために、コドン－最適化させた配列とｐＣＩ－ｎｅｏベクターを用いて哺乳動物細胞においてＰ８タンパク質を内因的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）発現させた（図１Ａ）。ウェスタンブロッティング方法で内因性Ｐ８タンパク質の発現を測定し（図１Ｂ）、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ共焦点顕微鏡を用いて内因性Ｐ８タンパク質の細胞内の位置を視覚化した（図１Ｃ）。内因的に発現したＰ８タンパク質は細胞質および核ともにおいて観察された（図１Ｃ）。核抽出物のウェスタンブロッティング分析およびＥＬＩＳＡ分析（ｂｅｌｏｗ ｐａｎｅｌ）により、内因的に発現したＰ８タンパク質が細胞質から核に移動したことを確認した（図１Ｄおよび図１Ｅ）。
【0048】
２．内因性Ｐ８タンパク質の発現による抗癌活性の著しい増加
内因性Ｐ８タンパク質の発現がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で抗癌特性を増加させるかを評価するために、癌細胞の増殖を抑制するかについて測定した。実験結果、内因性Ｐ８タンパク質の発現によって腫瘍細胞の増殖を～４０％減少させたが（図２Ａ）、この結果は、４０μＭの外因性Ｐ８タンパク質の処理による効果よりも２倍大きい効果であった。また、内因性Ｐ８タンパク質の発現は、対照群と対比して、ＤＬＤ－１細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を抑制し（図２Ｂ）、移動活性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を抑制した（図２Ｃ）。このような実験結果により、Ｐ８タンパク質の抗癌活性は細胞内に移動するタンパク質の量に依存することが分かった。
Ｐ８タンパク質が多様な信号伝達経路に及ぼす影響を測定するために、敏感な表現型の増殖に関連する信号伝達経路を検査した。まず、Ｐ８タンパク質がＤＬＤ－１細胞においてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または細胞周期停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を誘導するか否かを検査した。４０μＭの外因性Ｐ８タンパク質で処理した後の死滅細胞の数は対照群のものと類似する程度であった（図２Ｅ）。しかし、死滅細胞の数は外因性Ｐ８タンパク質の処理濃度が増加した後に変化した。次いで、内因性Ｐ８タンパク質の発現の影響を検査した（図２Ｄ）。処理群および対照群における死滅細胞の数は類似していたが、これは、内因性Ｐ８タンパク質がアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導しないことを意味する。
内因性Ｐ８タンパク質の発現がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で抗癌特性を増加させるかを評価するために、癌細胞の増殖を抑制するかについて測定した。実験結果、内因性Ｐ８タンパク質の発現によって腫瘍細胞の増殖を～４０％減少させたが（図２Ａ）、この結果は、４０μＭの外因性Ｐ８タンパク質の処理による効果よりも２倍大きい効果であった。また、内因性Ｐ８タンパク質の発現は、対照群と対比して、ＤＬＤ－１細胞のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を抑制し（図２Ｂ）、移動活性（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を抑制した（図２Ｃ）。このような実験結果により、Ｐ８タンパク質の抗癌活性は細胞内に移動するタンパク質の量に依存することが分かった。
Ｐ８タンパク質が多様な信号伝達経路に及ぼす影響を測定するために、敏感な表現型の増殖に関連する信号伝達経路を検査した。まず、Ｐ８タンパク質がＤＬＤ－１細胞においてアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）または細胞周期停止（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ）を誘導するか否かを検査した。４０μＭの外因性Ｐ８タンパク質で処理した後の死滅細胞の数は対照群のものと類似する程度であった（図２Ｅ）。しかし、死滅細胞の数は外因性Ｐ８タンパク質の処理濃度が増加した後に変化した。次いで、内因性Ｐ８タンパク質の発現の影響を検査した（図２Ｄ）。処理群および対照群における死滅細胞の数は類似していたが、これは、内因性Ｐ８タンパク質がアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導しないことを意味する。
【0049】
３．ＤＬＤ－１細胞における抗癌信号伝達経路上に及ぼすＰ８タンパク質の影響
次いで、発明者らは、細胞周期関連タンパク質の発現を検出するためのウェスタンブロッティングを利用して、内因性Ｐ８タンパク質の発現が細胞周期に及ぼす影響を調べた（図３Ａ）。内因性Ｐ８タンパク質の発現がＤＬＤ－１細胞内においてＣｙｃｌｉｎ Ｂ１およびそのパートナータンパク質であるＣｄｋ１の発現を強く減少させることを発見した。また、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１／Ｃｄｋ１を抑制するｐ２１の発現が著しく増加することを発見した。ｐ２１のポジティブアップストリーム調節子であるｐ５３の発現も誘導されることが観察された。このような実験結果は、内因性Ｐ８タンパク質がｐ５３－ｐ２１信号伝達経路上にブレーキをかけて、Ｇ２においてＤＬＤ－１細胞を停止させる結果をもたらすということを暗示する。細胞周期上に内因性Ｐ８タンパク質の発現が及ぼす影響を評価するために、フローサイトメーターを用いて変化を測定した。内因性Ｐ８タンパク質の発現はＧ２において著しい成長停止を誘導した（図３Ｂ）。
次いで、発明者らは、細胞周期関連タンパク質の発現を検出するためのウェスタンブロッティングを利用して、内因性Ｐ８タンパク質の発現が細胞周期に及ぼす影響を調べた（図３Ａ）。内因性Ｐ８タンパク質の発現がＤＬＤ－１細胞内においてＣｙｃｌｉｎ Ｂ１およびそのパートナータンパク質であるＣｄｋ１の発現を強く減少させることを発見した。また、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１／Ｃｄｋ１を抑制するｐ２１の発現が著しく増加することを発見した。ｐ２１のポジティブアップストリーム調節子であるｐ５３の発現も誘導されることが観察された。このような実験結果は、内因性Ｐ８タンパク質がｐ５３－ｐ２１信号伝達経路上にブレーキをかけて、Ｇ２においてＤＬＤ－１細胞を停止させる結果をもたらすということを暗示する。細胞周期上に内因性Ｐ８タンパク質の発現が及ぼす影響を評価するために、フローサイトメーターを用いて変化を測定した。内因性Ｐ８タンパク質の発現はＧ２において著しい成長停止を誘導した（図３Ｂ）。
【0050】
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【0051】
本発明は、乳酸菌由来Ｐ８タンパク質の発現コンストラクトおよびこれを含む大腸疾患の治療または予防用組成物に関する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【配列表】