特許 7136468 抗セクレトグラニンＩＩＩ（ＳＣＧ３）抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-05

(45)【発行日】2022-09-13

(54)【発明の名称】抗セクレトグラニンＩＩＩ（ＳＣＧ３）抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220906BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 17/12 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220906BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/18 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P27/02

A61P9/00

A61P27/06

A61P29/00

A61P7/00

A61P3/10

A61P35/00

A61P35/02

A61P19/02

A61P19/00

A61P25/00

A61P37/06

A61P9/10

A61P3/04

A61P17/06

A61P17/12

A61P17/00

A61P37/08

A61P31/18

A61P11/00

A61P11/06

A61P11/02

A61P1/04

A61P1/02

A61P1/16

A61P15/00

A61K39/395 N

【請求項の数】 34

(21)【出願番号】P 2019523840

(86)(22)【出願日】2017-11-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-12-12

(86)【国際出願番号】 US2017060189

(87)【国際公開番号】W WO2018089305

(87)【国際公開日】2018-05-17

【審査請求日】2020-11-05

(31)【優先権主張番号】62/419,195

(32)【優先日】2016-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514155153

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ マイアミ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100203828

【弁理士】

【氏名又は名称】喜多村 久美

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ リー

(72)【発明者】

【氏名】ミシェル イー．ルブラン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイウェン ワン

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ ジェイ．ローゼンフェルド

【審査官】吉門 沙央里

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００６／０１０５３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／０１４８１９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Yue Wang，Cancer Letters，2014年，352，169-178

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

参照抗体のセクレトグラニンＩＩＩとの結合を交差阻止する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記参照抗体が、配列番号１１～１６のＣＤＲを含む抗体である、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記参照抗体が、配列番号９を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

セクレトグラニンＩＩＩに結合し、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ｉ）（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１１を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１２を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１３を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１４を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号１５を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号１６を含むか；
（ｉｉ）（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含むか；
（ｉｉｉ）（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号３２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含むか；あるいは
（ｉｖ）（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号３を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含む、
抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号１１を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号１２を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号１３を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号１４を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号１５を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号１６を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号３２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号３を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２４を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

配列番号９を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

配列番号２５を含む重鎖可変領域および配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項10】

配列番号３０を含む重鎖可変領域および配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項11】

配列番号３８を含む重鎖可変領域および配列番号３３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項12】

配列番号３４を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号３３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；あるいは
配列番号３４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項３～７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項14】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～１３のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載の発現ベクターを遺伝子導入した宿主細胞。

【請求項18】

請求項１～１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび生理学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物。

【請求項19】

請求項１～１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項１８に記載の医薬組成物を含むキット。

【請求項20】

治療を必要としている対象の新生血管型加齢黄斑変性を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記医薬組成物が、脈絡膜新生血管またはポリープ状脈絡膜血管症を抑制するための有効量で投与される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

治療を必要としている対象の糖尿病性網膜症を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項23】

治療を必要としている対象の未熟児網膜症を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項24】

治療を必要としている対象の、場合により、血管新生緑内障、角膜血管新生、翼状片、網膜静脈閉塞症、ならびに近視、炎症状態、遺伝性網膜ジストロフィー、および鎌状赤血球網膜症由来の網膜および黄斑の血管新生から選択される眼の血管新生関連疾患を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記医薬組成物が、網膜血管漏出を低減するための有効量で投与される、請求項２２～２４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記医薬組成物が、網膜血管新生または脈絡膜新生血管を低減するための有効量で投与される、請求項２２～２５のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記医薬組成物が、硝子体内に投与される、請求項２０～２６のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項28】

治療を必要としている対象の癌を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記対象が、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、腎臓癌、白血病、肺癌、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、肝臓癌、口腔癌、中咽頭癌、食道癌、または胃癌から選択される癌を有する、請求項２８に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記対象が、網膜芽細胞腫、ぶどう膜黒色腫、および眼内リンパ腫から選択される眼癌である、請求項２９に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記医薬組成物が、細胞増殖を抑制するための有効量で投与される、請求項２０～３０のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項32】

治療を必要としている対象の、場合により、関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成、多発性硬化症、血管奇形、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、肥満症、乾癬、いぼ、アレルギー性皮膚炎、瘢痕ケロイド、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、ＡＩＤＳ患者におけるカポジ肉腫、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、炎症性腸疾患、歯周病、肝硬変、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、再狭窄、および嚢胞性繊維症から選択される血管新生関連疾患を治療するための、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、約５μｇ／（対象のｋｇ体重）～約４００ｍｇ／（対象のｋｇ体重）の量で投与される、請求項２０～３２のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、約０．０５ｍｇ～約１０ｍｇの量で、前記対象の眼に投与される、請求項２０～３２のいずれかに記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

政府の権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された米国国立衛生研究所認可番号第Ｒ０１ＧＭ０９４４４９号に基づく政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。

【0002】

関連出願への相互参照および電子申請データの参照による組み込み
本出願は、２０１６年１１月８日出願の米国特許仮出願第６２／４１９，１９５号の優先権を主張する。この開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本出願は、本開示の別の部分として、コンピュータ可読形式の配列表を含む。この配列表はその全体が参照により組み込まれ、次のように特定される：ファイル名：５１０８５Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ２３，９０５バイト；作成：２０１７年１１月６日。

【0004】

発明の分野
本開示は、概して抗セクレトグラニンＩＩＩ抗体およびその使用に関する。

【背景技術】

【0005】

糖尿病性網膜症（ＤＲ）および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、視力喪失の主要な原因である。ＤＲは、世界中で、約９３百万人を冒し、その内の約２８百万人は、視力を脅かす糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ）である。初期段階のＤＲは、内皮細胞（ＥＣ）および周皮細胞のアポトーシス、血管漏出ならびに白血球粘着を特徴とし、無細胞毛細血管、毛細血管瘤、網膜静脈閉塞症、ＤＭＥおよびＰＤＲに進行し得る。ＡＭＤには、乾燥型（萎縮型）および湿潤型（新生血管型または滲出型）の２種の臨床型がある。脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を有する新生血管型ＡＭＤ（ｎＡＭＤ）は、ＡＭＤに罹患した個体の１０～２０％が罹患するが、ＡＭＤによる重度視力喪失の全症例の約９０％がこの疾患に起因する。

【0006】

血管新生因子は、網膜血管漏出を有するＤＭＥ、網膜血管新生を有するＰＤＲ、およびｎＡＭＤの発病で重要な役割を果たす。ＬＵＣＥＮＴＩＳ（ラニビズマブ）およびＥＹＬＥＡ（アフリベルセプト）を含む、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の承認は、ＤＲおよびｎＡＭＤ治療法における大きなブレークスルーであった（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｅｍｅｒｇ Ｄｒｕｇｓ．２０１４；１９（３）：３９７－４０５；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１６；５５：１２５－３６）。しかし、抗ＶＥＧＦ療法は、効力が限られており、ＤＲおよびｎＡＭＤの５０％に満たない症例においてのみ視力を改善できるにすぎず（Ｄｅｄａｎｉａ ａｎｄ Ｂａｋｒｉ Ｃｌｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１５；９：５３３－４２）、その他の血管新生因子がこれらの疾患の発病に関与している可能性を示唆している。限られた選択肢のために、１つの抗ＶＥＧＦ薬物への反応が不十分な患者は、作用機序が類似であるにもかかわらず、別のＶＥＧＦ阻害剤に切り替えられることが多い（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ－Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ．２０１４；２３２（３）：１４９－５５）。さらに、ほとんどの血管新生因子は、正常および疾患の血管の両方の血管新生を調節するため、これらの標的に対する治療は、正常な血管および細胞に有害な影響を与え得る。したがって、全てのＶＥＧＦ阻害剤は、硝子体内投与によるＡＭＤ治療に対してのみ承認されている。単回の硝子体内注射では副作用の割合が低いにもかかわらず、反復硝子体内注射は、眼内炎、網膜剥離、眼圧上昇および白内障などの眼に対する有害作用の原因となる場合がある。初期段階または危険性が高い対象のＤＭＥ、ＰＤＲおよびｎＡＭＤの予防には、ＶＥＧＦ阻害剤の反復硝子体内注射が必要となる。したがって、抗ＶＥＧＦ療法は、ＤＭＥ、ＰＤＲまたはｎＡＭＤの予防用としては承認されていない。既存の治療のこの問題を解決するために、硝子体内注射の頻発を避けるまたは頻度を減らすために、局所的点眼によるまたは持続性のあるＤＲおよびＡＭＤに対する新規の治療法が必要である。

【0007】

抗ＶＥＧＦ療法はまた、小児の失明の最もよくある原因である、未熟児網膜症（ＲＯＰ）の治療での使用に対しても評価されてきた。ＲＯＰは、米国で毎年１４，０００～１６，０００人の未熟児が罹患し、他の国でも同様の高率の発病である。ＲＯＰは、病理学的網膜血管新生（ＮＶ）を特徴とし、重度視力障害、さらには失明さえも伴う部分的または完全網膜剥離へと進行し得る。ＲＯＰの乳幼児は、成人期に、網膜剥離、近視、斜視、弱視および緑内障などの他の眼疾患を発症する高いリスクを有すると考えられている（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｑｕｉｎｎ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１１；１２７（２）：３３４－９）。ＲＯＰは現在、レーザー療法または寒冷療法により治療されている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２０１６；４０（３）：１８９－２０２）。都合の悪いことに、どちらの治療も、中心視野を確保するために周辺視野を破壊し、根底にある原因のＲＯＰに対処しない。ＶＥＧＦ阻害剤を用いたいくつかの臨床試験は、ＲＯＰに対して、限られた効力しか示さず（Ｓａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．２０１６；２：ＣＤ００９７３４）、また、ＲＯＰに対する抗ＶＥＧＦ療法の安全性は、大きな懸念である。ＶＥＧＦは、胎児および新生児段階での血管形態形成および網膜発生にとって非常に重要である。ＶＥＧＦ受容体１または２のホモ接合欠失を有するマウスは、子宮中で死亡する（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９５；３７６（６５３５）：６６－７０；Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９５；３７６（６５３５）：６２－６）。同様に、単一ＶＥＧＦアレルの欠失を有するマウスは、胎児期致死性である（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８０（６５７３）；４３９－４２）。ＲＯＰを治療するためのＶＥＧＦ阻害剤の認可外使用はまた、顕著な有害転帰と関連する（Ｂｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０１６；４０（３）１８９－２０２）。これらの知見は、未熟児における抗ＶＥＧＦ療法に関する大きな安全性の懸念を生じさせる。したがって、限られた効力および安全性が原因で、ＶＥＧＦ阻害剤は、ｎＡＭＤ対して承認後、１０年以上にわたり、ＲＯＰ療法に対しては承認されておらず、ＲＯＰに対するＦＤＡ認可薬物は現時点で存在しない。

【0008】

ＤＲ、ｎＡＭＤ、およびＲＯＰに対する、高い効力、ＶＥＧＦに依存しない機序、および柔軟な投与経路を有する新規抗血管新生治療薬の開発は、優先事項であり、また、癌を含む他の疾患の治療にとっても有効であり得る。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、セクレトグラニンＩＩＩ（Ｓｃｇ３）に特異的に結合する抗体、ならびにこれらのフラグメントおよび誘導体、ならびに糖尿病性網膜症（ＤＲ）、新生血管型加齢黄斑変性（ｎＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、および癌を含む疾患の治療におけるそれらの使用に関する。

【0010】

一態様では、本開示は、参照抗体のＳｃｇ３との結合を交差阻止する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、この参照抗体は、配列番号３～８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体；配列番号１１～１６のＣＤＲを含む抗体；配列番号１９～２４のＣＤＲを含む抗体；配列番号２７、４、２８、２２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体；配列番号２７、４、２８、３２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体；ならびに配列番号３、４、２８、２２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体からなる群より選択される。例えば、参照抗体は、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号９を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号２５を含む重鎖可変領域および配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号３０を含む重鎖可変領域および配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号３８を含む重鎖可変領域および配列番号３３を含む軽鎖可変領域を含む抗体；ならびに配列番号３４を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域を含む抗体からなる群より選択される。

【0011】

別の態様では、本開示は、セクレトグラニンＩＩＩに結合し、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号３、１１、１９、および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４、１２、および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号５、１３、２１、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号６、１４、２２、および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号７、１５、２３、および２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ならびに（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号８、１６、および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。一例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、を含む。

【0012】

別の態様では、本開示は、セクレトグラニンＩＩＩに結合し、配列番号１、９、１７、２５、３０、３８、または３４を含む重鎖可変領域および配列番号２、１０、１８、２６、３１、３３、または３５を含む重鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２を含む軽鎖可変領域を含む。別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む。一例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５を含む重鎖可変領域および配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含む。別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３０を含む重鎖可変領域および配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３８を含む重鎖可変領域および配列番号３３を含む軽鎖可変領域を含む。別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３４を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域を含む。別の態様では、本開示は、セクレトグラニンＩＩＩに結合し、配列番号１、９、１７、２５、３０、３８、または３４に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号２、１０、１８、２６、３１、３３、または３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0013】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターおよび前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

【0014】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび生理学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を含むキットを提供する。

【0015】

本開示は、本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメントの医学的使用も提供する。一態様では、治療有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物を投与すること含む、治療を必要としている対象のｎＡＭＤを治療する方法を提供する。例えば、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物が、ＣＮＶおよび／またはポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）を抑制するための有効量で投与される。これらの内の後者のＰＣＶは、ｎＡＭＤの変種であると考えられている。

【0016】

一態様では、治療を必要としている対象の糖尿病性網膜症を治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物を投与することを含む。別の態様では、治療を必要としている対象の未熟児網膜症を治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物を投与することを含む。例えば、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物は、網膜血管漏出および／または網膜血管新生および／または脈絡膜新生血管を低減するための有効量で投与される。

【0017】

一態様では、治療を必要としている対象の癌を治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物を投与することを含む。例えば、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物は、腫瘍量を低減させる（例えば、腫瘍サイズを低減させるまたは体内の癌細胞の数を低減させる）ための有効量で投与される。

【0018】

別の態様では、治療を必要としている対象の血管新生関連疾患を治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物を投与することを含む。例えば、血管新生関連疾患は、血管新生緑内障、角膜血管新生、翼状片、網膜静脈閉塞症、ならびに近視、炎症状態、遺伝性網膜ジストロフィー、および鎌状赤血球網膜症由来の網膜および黄斑の血管新生、関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成、多発性硬化症、血管奇形、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、肥満症、乾癬、いぼ、アレルギー性皮膚炎、瘢痕ケロイド、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、カポジ肉腫（例えば、ＡＩＤＳ患者における）、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、炎症性腸疾患、歯周病、肝硬変、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、再狭窄、および嚢胞性繊維症から選択される疾患である。

【0019】

前述の概要は、本発明の全ての態様を規定することを意図するものではなく、本開示の他の特徴および利点は、図面を含む以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本開示は、統合された文書として関連付けることを意図しており、たとえ、特徴の組み合わせが、本開示の同じ文章、段落、またはセクション中に一緒に認められない場合でも、本明細書に記載の特徴の全ての組み合わせが意図されていることを理解されたい。さらに、本開示は、追加の態様として、特に上記した変化よりも、多少とも狭い範囲の本発明の全ての実施形態を含む。「ａ」または「ａｎ」と共に記載または請求された本開示の態様に関しては、文脈からより限定された意味が明確に要求されない限り、これらの用語は、「１つまたは複数」を意味すると理解されたい。１セットの内の１つまたは複数として記載される要素に関しては、セット内の全ての組み合わせが意図されていると理解されたい。本開示の態様が、特徴「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として記載される場合、実施形態もまた、特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または特徴「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことが意図されている。本開示の態様が「治療の方法（ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」として記載される場合、参照された疾患または傷害のための開示抗体またはその抗原結合フラグメントの使用が意図されていることは理解されよう。例えば、本開示は、治療を必要としている対象の新生血管型加齢黄斑変性を治療する；治療を必要としている対象の糖尿病性網膜症を治療する；または治療を必要としている対象の未熟児網膜症を治療する；場合により、治療を必要としている対象の、血管新生緑内障、角膜血管新生、翼状片、網膜静脈閉塞症、近視、炎症状態、遺伝性網膜ジストロフィー、および鎌状赤血球網膜症由来の網膜および黄斑の血管新生から選択される眼の血管新生関連疾患を治療するための本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を意図している。本開示の追加の特徴および変形例は、本出願の全体から当業者には明白であり、全てのこのような特徴は、本開示の態様として意図されている。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1-1】血管新生因子としてのＳｃｇ３のインビトロ特性評価を示す。図１Ａは、４８ウェルプレート（ｎ＝４）中で、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）またはＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）により処理したヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた内皮増殖アッセイの結果を示し、図１Ｂは、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で処理した、または親和性精製抗Ｓｃｇ３ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）（２μｇ／ｍＬ）（ｎ＝８）で処理したヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）を用いた内皮増殖アッセイの結果を示す。細胞数は４８時間で定量化した。図１Ｃ～１Ｅは、ＨＵＶＥＣを用いた管形成アッセイおよび視野当たりの合計チューブ長さ（図１Ｃ）、視野当たりのチューブの数（図１Ｄ）および視野当たりの分岐点の数（ｎ＝４）（図１Ｅ）の定量の結果を示す。図１Ｆは、Ｓｃｇ３（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）、または抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）（ｎ＝８）で処理したＨＲＭＶＥＣのスフェロイド発芽（平均発芽長さ）を示す。図１Ｇは、ＶＥＧＦおよびＳｃｇ３（ｎ＝３）で処理したＨＲＭＶＥＣの移動を示す。

【図1-2】図１Ｈは、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＳｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）（ｎ＝３）で処理した細胞の内皮透過性を示す。ＰＢＳ、ＶＥＧＦ、またはＳｃｇ３と共にＦＩＴＣ－デキストランをトランスウェルインサートを備えた下段チャンバーに加え、２４時間後、上段チャンバーから培地を集め、漏出ＦＩＴＣを定量した。図１Ｉは、Ｓｃｇ３（１５ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）、または抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）（ｎ＝８）で処理したＨＵＶＥＣのスフェロイド発芽（平均発芽長さ）を示す。

【図2】糖尿病のおよび健康な動物の角膜血管新生の定量化を示す。図２Ａは、ＰＢＳ、Ｓｃｇ３、ヘパトーマ由来成長因子関連タンパク質３（ＨＲＰ－３またはＨｄｇｆｒｐ３）、およびＶＥＧＦで処理した健康なおよび糖尿病のマウスの角膜血管の合計数を示す（左側のバー＝健康なマウス；右側のバー＝糖尿病マウス）。図２Ｂは、血管分岐点の数を示す。図２Ｃは、合計血管新生スコアを示す。試験は盲検法で行い、ｎ値は、分析した角膜の数を示す。統計的有意性は、１元配置分散分析検定を用いて計算した。

【図3-1】糖尿病性網膜症の抗Ｓｃｇ３治療を示す。図３Ａは、硝子体内注射を介して、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、無関係の抗原に対する模擬アフィニティー精製ｐＡｂ、抗Ｓｃｇ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン４９（全て０．３６μｇ／μＬ／眼）、アフリベルセプト（２μｇ／μＬ／眼）またはＰＢＳで処理した、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病マウスのＤＲの抗Ｓｃｇ３治療を示す。図３Ｂは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂが、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、または抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）（ｎ＝３）で処理した細胞中のＳｃｇ－３－誘導ＨＲＭＶＥＣ増殖を抑制したことを示す。図３Ｃは、対照ウサギＩｇＧ（０．３６μｇ／μＬ／眼）、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９）（０．３６μｇ／μＬ／眼）、またはアフリベルセプト（２μｇ／μＬ／眼）（ｎ＝３～４）で処理した、Ｉｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}糖尿病マウスのＤＲの抗Ｓｃｇ３治療を示す。

【図3-2】図３Ｄは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン７８（０．３６μｇ／μＬ／眼、ｎ＝４）で処理した、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスのＤＲの抗Ｓｃｇ３治療を示す。統計的有意性は、１元配置分散分析検定を用いて計算した。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ クローン７、クローン１６、クローン４９、クローン１５３、クローン１６２、およびクローン１９０の存在下での、図３ＥはＳｃｇ３に対するクローン４９との競合的結合、および図３ＦはＳｃｇ３に対するクローン７８との競合的結合を示す（ｎ＝３）。単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）単独に対するｔ検定で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図3-3】図３Ｄは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン７８（０．３６μｇ／μＬ／眼、ｎ＝４）で処理した、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスのＤＲの抗Ｓｃｇ３治療を示す。統計的有意性は、１元配置分散分析検定を用いて計算した。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ クローン７、クローン１６、クローン４９、クローン１５３、クローン１６２、およびクローン１９０の存在下での、図３ＥはＳｃｇ３に対するクローン４９との競合的結合、および図３ＦはＳｃｇ３に対するクローン７８との競合的結合を示す（ｎ＝３）。単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）単独に対するｔ検定で、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【図4】ＯＩＲの抗Ｓｃｇ３治療を示す。図４Ａは、対照ウサギＩｇＧ（０．３６μｇ／μＬ／眼）、アフリベルセプト（２μｇ／μＬ／眼）、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ（０．３６μｇ／μＬ／眼）または抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９）（０．３６μｇ／μＬ／眼）（ｎ＝４～１３）で処理した、Ｉｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}糖尿病マウスのＯＩＲの代表的画像を示す。矢頭は、血管新生（ＮＶ）およびＮＶタフトを示す。図４Ｂは、ＮＶの定量、図４ＣはＮＶタフト数を示し、図４Ｄは分岐点の定量化を示す。統計的有意性は、１元配置分散分析検定を用いて計算した。

【図5-1】レーザー誘導ＣＮＶ漏出の抗Ｓｃｇ３治療を示す。マウスは、０日目にレーザー光凝固で処理された。ＰＢＳ対照ウサギＩｇＧ（０．３６μｇ／μＬ／眼）、アフリベルセプト（２μｇ／μＬ／眼）、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ（０．３６μｇ／μＬ／眼）または抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９）（０．３６μｇ／μＬ／眼）を３日目に硝子体内に注射した。図５Ａは、７日目のフルオレセイン血管造影画像を示し、図５Ｂは、図５ＡのＣＮＶ蛍光強度の定量化を示す。８日目にマウスを屠殺した。

【図5-2】図５ＣはＣＮＶ ３Ｄ体積の定量化を示し、図５ＤはＣＮＶ病変部サイズの定量化を示し、図５ＥはＣＮＶ血管密度（すなわち、蛍光強度）を示す。レーザースポットの数は、バーの下部に示されており、対照ＩｇＧに対する統計的有意性は１元配置分散分析検定を用いて計算した。

【図6】抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂによるＳｃｇ３機能活性の中和を示す。図６Ａは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂがＨＲＭＶＥＣのＳｃｇ３誘導増殖を抑制したことを示す。細胞を、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）と共に、抗Ｓｃｇ３クローン４９ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で４８時間インキュベートした。ウェル当たりの細胞数を定量化した（ｎ＝６）。図６Ｂは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂが、ＳｒｃキナーゼのＳｃｇ３誘導活性化を阻止したことを示す。ＨＲＭＶＥＣを、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）と共に、抗Ｓｃｇ３クローン４９ ｍＡｂ（２μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で１０分間インキュベートし、ウェスタンブロットにより分析した。図６Ｃは、リン酸化Ｓｒｃ（Ｐ－Ｓｒｃ）シグナル強度（ｎ＝５）の定量化を示す。

【図7-1】マトリゲル誘導ＣＮＶの抗Ｓｃｇ３治療を示す。図７Ａは、代表的なフルオレセイン血管造影画像を示す。０日目にマトリゲルを網膜下に注射した。ウサギ対照ＩｇＧ（２５μｇ／ｋｇ体重）、マウス対照ＩｇＧ１（２５μｇ／ｋｇ）、アフリベルセプト（２５０μｇ／ｋｇ）、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ（２５μｇ／ｋｇ）または抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン４９もしくはクローン７８（２５μｇ／ｋｇ）を０、２、および４日目に皮下に注射した。フルオレセイン血管造影を７日目に実施し、ＣＮＶ漏出を分析した。図７Ｂは、ウサギ対照ＩｇＧ、マウス対照ＩｇＧ１、アフリベルセプト、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂまたは抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン４９で処理したマウスのＣＮＶ漏出の定量化を示す。試験したマウスの数は、バーの下部に示されており、統計的有意性は１元配置分散分析検定を用いて計算した。

【図7-2】図７Ｃは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン７８で処理したマウスの代表的なフルオレセイン血管造影画像を示す。図７Ｄは、対照ＩｇＧおよび抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン７８で処理したマウスのＣＮＶ漏出の定量化を示す。

【図8】抗Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦ発現の調節を示す。図８Ａは、Ｓｃｇ３がＶＥＧＦ発現を調節しない、またはその逆も同じであることを示す、Ｓｃｇ３（１μｇ／ｍＬ）およびＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理したＨＲＭＶＥＣのウェスタンブロットを示す（ｎ＝６）。図８Ｂは、Ｓｃｇ３発現の定量化を示す（ｎ＝５）。図８Ｃは、ＶＥＧＦ発現の定量化を示す（ｎ＝３）。

【図9-1】癌の抗Ｓｃｇ３治療を示す。図９Ａは、Ｓｃｇ３が腫瘍関連内皮リガンドであることを示す、比較リガンドミクス分析を示す。

【図9-2】図９Ｂは、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂの腹腔内投与が、対照マウスＩｇＧ１に比べて、マウス中のヒト乳癌異種移植片のサイズを有意に小さくすることを示す（ｎ＝４）。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本開示は、抗Ｓｃｇ３抗体、ならびにそれらのフラグメントおよび誘導体、ならびに例えば、ＤＲ、ｎＡＭＤ、ＲＯＰ、および癌の治療におけるそれらの使用法を提供する。

【0022】

セクレトグラニンＩＩＩ（Ｓｃｇ３または１Ｂ１０７５）は、グラニンファミリーに属し、これは、分泌顆粒の生合成を調節する（Ｈｏｓａｋａ ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｊｏｕｒｎａｌ．２０１０；５７（４）：２７５－８６；Ｔａｕｐｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００３；３４８（１２）：１１３４－４９）。グラニンファミリーの他のメンバーには、クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）、クロモグラニンＢ（ＣｇＢ）およびセクレトグラニンＩＩ～ＶＩＩ（Ｓｃｇ２～７）が挙げられる（Ｈｅｌｌｅ ＫＢ．Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ Ｃａｍｂ Ｐｈｉｌｏｓ Ｓｏｃ．２００４；７９（４）：７６９－９４）。ＣｇＡは、血管新生を調節する（Ｈｅｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｒｔｉ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１５；７２（２）：３３９－４８）。Ｓｃｇ３は、ＣｇＡの結合相手であり、分泌顆粒生合成およびペプチドホルモン分泌において重要な役割を果たす（Ｈｏｓａｋａ ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｊｏｕｒｎａｌ．２０１０；５７（４）：２７５－８６）。Ｓｃｇ３は、機能障害性β－細胞から分泌される報告されており、そのため、１型糖尿病で発現上昇され得る（Ｄｏｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００８；２９（２０）：４１４１－９）。Ｓｃｇ３は、糖尿病の血管合併症（Ｒａｓｋ－Ｍａｄｓｅｎ ａｎｄ Ｋｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１３；１７（１）：２０－３３）の内の１つである、動脈硬化病変中で活性化血小板から放出される（Ｃｏｐｐｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００４；１０３（６）：２０９６－１０４）。それの他のファミリーメンバーと同様に、Ｓｃｇ３は、細胞外間隙中の分泌され得る古典的なシグナルペプチドである（Ｄｏｗｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００８；２９（２０）：４１４１－９）。

【0023】

Ｓｃｇ３は、細胞リガンドまたは血管新生因子としては報告されてこなかった。抗血管新生療法の標的としてのＳｃｇ３は、米国特許出願第１４／７０８，０７３号で考察されている。この特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、抗Ｓｃｇ３療法、例えば、ＤＲ、ｎＡＭＤ、および癌の治療および予防のための、特有の疾患関連活性、高い効力、最小限の副作用、柔軟な投与経路およびＶＥＧＦからの明確なシグナル伝達経路の利点を提供する抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂに関する。

【0024】

次の定義は、熟練開業医の本開示の理解を支援するのに有用であろう。別に定めのない限り、本開示で使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数形の用語は、複数を含み、複数形の用語は、単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載の、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使われる、およびこれらの技術で使われる命名法は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。本発明の実施には、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学における、当業者の範囲内にある多くの従来技術が使用される。このような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｆ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｌｖｙｎ Ｌｉｔｔｌｅ，ｅｄ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ ２００９；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）にさらに詳細に記載されている。 製造業者の説明書を含む、当業者に広く知られ、信頼されている標準的プロトコルを含むこれらの文献およびその他の文献の内容は、本開示の一部として、参照により本明細書に組み込まれる。

【0025】

本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（複数形）（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、生化学的および生物工学的技術におけるそれらの通常の意味を有する。本明細書で使われる場合の用語の意味内の抗体に含まれるのは、内在性遺伝子を活性化することを伴うプロセス、ならびに細胞培養で作られた抗体および遺伝子導入植物および動物中で作られたものを含む外来性発現構築物の発現を伴うプロセスにより作られたものを含む、生物源から単離されたもの、例えば、ハイブリドーマにより産生された抗体、組換えＤＮＡ技術により作製された抗体（時には、本明細書では組換え抗体とも呼ばれる）、ならびにペプチド合成および半合成を含む、化学合成を含む方法により作製された抗体である。別義が明示的に記載されている場合を除き、本明細書で使われる場合にこの用語の範囲内に入るものは特に、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および多価（例えば、二重特異性）抗体である。一態様では、抗体はポリクローナル抗体ではない。プロトタイプの抗体は、ジスルフィド結合により一緒に連結された、２つの同一の軽鎖－重鎖二量体からなる四量体糖タンパク質である。２種のタイプの脊椎動物軽鎖、カッパおよびラムダが存在する。各軽鎖は、定常領域および可変領域からなる。カッパおよびラムダ軽鎖は、それらの定常領域配列で区別される。５種のタイプの脊椎動物重鎖：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューがあり、これらは抗体の、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとしてのアイソタイプを定義する。各重鎖は、可変領域および定常領域からなり、これらは通常３つのドメインを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、ＣＤＲと呼ばれる超可変性領域と、その領域の間に介在するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に、さらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖は、２つの領域：可変（Ｆｖ）領域とも呼ばれるＦａｂ（フラグメント、抗原結合）領域、およびＦｃ（フラグメント、結晶性）領域、を形成する。重鎖および軽鎖の可変領域（Ｆｖ）は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常（Ｆｃ）領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への結合を媒介し得る。本明細書において参照される場合、用語の「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（複数形）（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、全体の、完全長抗体（例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する免疫グロブリン）を含む。本明細書に記載の抗体の特徴はまた、その抗原結合領域（単一または複数）または単鎖が保持される、その任意のフラグメントまたはこれらの誘導体にも当てはまることは理解されよう。

【0026】

用語の抗体の「抗原結合領域」は、抗原特異性を付与する領域または部分を意味し、したがって、～の抗原結合フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の部分（例えば、ＨＬＡ－ペプチド複合体）を含む。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語の「フラグメント」は、対応する完全長抗体に比較して、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを意味する。用語の「フラグメント」内に包含される抗体フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；単離ＣＤＲ；ならびにｓｃＦｖが含まれる。

【0028】

用語の「誘導体」は、例えば、別の化学部分（例えば、ポリエチレングリコールまたはアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンなど）への結合、リン酸化、および／またはグリコシル化により化学修飾されている抗体またはその抗原結合フラグメントを意味する。

【0029】

「ｓｃＦｖ」は、組換え法を用いて、ＦｖフラグメントのＶＬおよびＶＨの２つのドメインを合成リンカーで連結することにより改変できる一価分子である（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４２：４２３－４２６；ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８８；８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。このような単鎖抗原結合ペプチドも、用語の「抗体」内に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来技術を使用して得られ、フラグメントは完全な抗体の場合と同じ方法で有用性に関しスクリーニングされる。

【0030】

用語の「交差阻止する（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋ）」、「交差阻止された（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋｅｄ）」および「交差阻止（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」は、本明細書では同じ意味で用いられ、抗体またはその他の抗原結合タンパク質のその他の抗体または抗原結合タンパク質のＳｃｇ３への結合を妨げる（例えば、抑制する）能力を意味する。交差阻止の検出方法については以下に記載する。

【0031】

用語の「治療的に有効な」または「有効な」は、対象の状態および投与される特定の抗体またはその抗原結合フラグメントに依存する。この用語は、目的の臨床的効果を達成するのに有効な量を意味する。有効量は、治療される状態の性質、活性が望まれる時間の長さ、ならびに対象の年齢および状態で変化し、最終的には、医療提供者により決定される。種々の態様では、治療有効量は、血管新生（例えば、ＰＤＲ）、内皮細胞および／または周皮細胞のアポトーシス、血管漏出（例えば、網膜血管漏出）、白血球粘着、無細胞毛細血管、毛細血管瘤、網膜静脈閉塞症、血管新生（例えば、脈絡膜および網膜）、視力喪失および前述のいずれかの組み合わせを含む本明細書に記載の疾患または障害（例えば、ＤＲ、ｎＡＭＤ、ＲＯＰ、および過剰の血管新生に関連する疾患）に関連する症状の発症を防ぐ、遅らせる、またはその症状の重症度を下げるのに効果的な量である。別の態様では、治療有効量は、腫瘍量を減らす、細胞増殖（例えば、癌細胞増殖）を抑制する、腫瘍サイズを小さくする、腫瘍増殖を抑制するのに、または前述のいずれかの組み合わせに効果的な量である。

【0032】

用語の「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などは、防止的（例えば、予防的）、対症的、救済的、および治癒的療法を含む。

【0033】

本開示は、Ｓｃｇ３に特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメント、例えば、抗Ｓｃｇ３モノクローナル抗体を提供する。一態様では、Ｓｃｇ３に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号３、１１、１９、および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４、１２、および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号５、１３、２１、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号６、１４、２２、および３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号７、１５、２３、および２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ならびに（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号８、１６、および２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、セクレトグラニンＩＩＩに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１、９、１７、２５、３０、３８、または３４に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号２、１０、１８、２６、３１、３３、または３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0034】

本明細書に記載の抗体および抗原結合フラグメントに関する配列情報は、表１に提供される（ＣＤＲ配列は下線を付けた）。

【表1-1】

【表1-2】

【0035】

一例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号３を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号５を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号６を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号７を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号８を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0036】

別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１１を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号１２を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１３を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号１４を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号１５を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号１６を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0037】

さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１９を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２０を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２１を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２３を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２４を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0038】

一例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２４を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0039】

別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２７を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号３２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２４を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３０に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３１に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0040】

さらに別の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、（ａ）ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号３を含み；（ｂ）ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号４を含み；（ｃ）ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２８を含み；（ｄ）ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２２を含み；（ｅ）ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２９を含み；および（ｆ）ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２４を含む。場合により、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３８または３４に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３３または３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0041】

配列番号１、９、１７、２５、３０、３８、または３４に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号２、１０、１８、２６、３１、３３、または３５に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む本明細書で開示の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかに関して、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変領域は、前述の配列番号の１つに、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。

【0042】

一態様では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはｓｃＦｖである。

【0043】

別の態様では、本開示は、参照抗体のセクレトグラニンＩＩＩとの結合を交差阻止する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、この参照抗体は、配列番号３～８のＣＤＲを含む抗体；配列番号１１～１６のＣＤＲを含む抗体；配列番号１９～２４のＣＤＲを含む抗体；配列番号２７、４、２８、２２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体；配列番号２７、４、２８、３２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体；ならびに配列番号３、４、２８、２２、２９、および２４のＣＤＲを含む抗体からなる群より選択される。例えば、参照抗体は、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号２を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号９を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号１８を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号２５を含む重鎖可変領域および配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号３０を含む重鎖可変領域および配列番号３１を含む軽鎖可変領域を含む抗体；配列番号３８を含む重鎖可変領域および配列番号３３を含む軽鎖可変領域を含む抗体；ならびに配列番号３４を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域を含む抗体からなる群より選択される。

【0044】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の好適な方法を使用して、例えば、免疫された動物から単離して、組換えでまたは人工的に生成して、または遺伝子改変により産生される。例えば、特異的抗原に結合するモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法により得ることが可能である（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５，１９７５；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：２．５．１２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）；米国再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、および同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ ９３（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、中のＰｉｃｋｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ，”を参照されたい）。モノクローナル抗体は、例えば、当技術分野において既知の遺伝子導入またはノックアウトを含む、動物、例えば、ラット、ハムスター、ウサギ、または好ましくはマウスに、ヒトＳｃｇ３またはそのフラグメントを含む免疫原を、当該技術分野において既知の方法および本明細書に記載の方法に従って注射することにより得ることができる。特異的抗体産生の存在は、最初の注射後、または追加抗原注射後に、血清試料を採取して、当該技術分野において既知のおよび本明細書に記載のいずれかの免疫検出方法を用いて、ヒトＳｃｇ３またはペプチドに結合する抗体の存在を検出することによりモニターし得る。目的の抗体を産生する動物から、リンパ系細胞、最も一般的には脾臓またはリンパ節由来の細胞を取り出して、Ｂリンパ球を得る。Ｂリンパ球はその後、薬物感作された骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは免疫された動物と同系で、必要に応じ、その他の望ましい特性（例えば、内在性Ｉｇ遺伝子産物、例えば、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５８０）；ＮＳＯ、ＳＰ２０を発現できない性質）を有するものと融合されて、不死真核細胞株のハイブリドーマを産生する。リンパ系（例えば、脾臓）細胞および骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコールまたは非イオン洗剤などの膜融合促進剤と共に数分間混合され、その後、ハイブリドーマの増殖を促進するが融合していない骨髄腫細胞の増殖は促進しない選択培地上に低密度で播種され得る。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間、通常は約１～２週間の後に、細胞のコロニーが観察される。単一コロニーが単離され、細胞により産生された抗体は、当該技術分野において既知のおよび本明細書に記載の種々のイムノアッセイの内のいずれか１つを用いて、ヒトＳｃｇ３に対する結合活性の試験がなされ得る。ハイブリドーマは、クローニングされ（例えば、限界希釈クローニングまたは軟寒天プラーク単離により）、Ｓｃｇ３特異的抗体を産生する陽性クローンが選択され、培養される。ハイブリドーマ培養由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から単離し得る。マウスモノクローナル抗体の産生のための別法は、ハイブリドーマ細胞を同系マウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹水の形成を促進するように処理された（例えば、プリスタンで初回抗原刺激を受けた）マウスの腹膜腔中に注射することである。モノクローナル抗体は、単離して、種々の十分に確立された技術により精製できる。このような単離技術には、タンパク質－Ａセファロースを用いた親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１－２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ２．９．１－２．９．３；Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ），” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９－１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい）。モノクローナル抗体は、特定の抗体の性質（例えば、重鎖または軽鎖アイソタイプ、結合特異性、など）に基づいて選択された適切なリガンドを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製され得る。固体支持体上に固定される好適なリガンドの例には、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖または重鎖）抗体抗イディオタイプ抗体、およびＴＧＦベータ結合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは変種が挙げられる。

【0045】

抗体のフラグメント、誘導体、または類似体はまた、当該技術分野において既知の技術を用いて容易に作製できる。抗体由来の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質加水分解、例えば、従来の方法による完全抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ’）_２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得ることによって産生できる。このフラグメントは、チオール還元剤を使用してさらに切断して、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを産生することができる。必要に応じ、この切断反応は、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用して実施できる。別の方法として、パパインを使用する酵素切断により、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントが直接的に産生される。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）中の、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００３），ｐａｇｅｓ ２．８．１－２．８．１０ ａｎｄ ２．１０Ａ．１－２．１０Ａ．５中の、Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．により記載されている。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖－重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的な技術などもまた、フラグメントが、完全な抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用し得る。

【0046】

抗体またはそのフラグメントはまた、遺伝子的に改変することもできる。例えば、種々の態様では、抗体または抗体フラグメントは、例えば、組換えＤＮＡ操作技術により生成された可変領域ドメインを含む。これに関しては、抗体可変領域は、必要に応じ、抗体のアミノ酸配列中の挿入、欠失、または変更により改変されて、目的の抗体が産生される。目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として使用して、ポリメラーゼ連鎖反応または可変領域を合成する遺伝子合成を用いて、作製される（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）中の、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）中の、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”；およびＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：１０６－１１０，１９９１中の、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓを参照されたい）。現在の抗体操作技術は、少なくとも１つのＣＤＲおよび必要に応じ、１つまたは複数の第１の抗体由来のフレームワークアミノ酸および第２の抗体由来の可変領域ドメインの残りの部分を含有する遺伝子改変可変領域ドメインの構築を可能とする。このような技術は、例えば、抗体をヒト化するまたは結合標的に対するその親和性を改善するために使用される。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖のＣＤＲが、ヒト可変ドメイン中に移されている抗体である。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合は、種々の実施形態では、それらは、必要に応じ、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５～９０％、約９５％またはそれ超同一である。したがって、いくつかの事例では、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、場合によりＣＤＲを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、一態様では、ヒト化抗体は、宿主抗体の高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは目的の特異性、親和性および能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト種からの高頻度可変領域の残基（ドナー抗体）によって置換されているヒト免疫グロブリン（宿主抗体）である。

【0047】

抗体の抗原結合フラグメントの１つの形態は、１個または複数の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲ（「最小認識単位」または「高頻度可変領域」とも呼ばれる）は、目的のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることができる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として用いて可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより調製される（例えば、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６，１９９１中の、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）中の、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ－Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”；およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）中の、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”を参照されたい）。

【0048】

したがって、一実施形態では、その抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の通り、少なくとも１つの本明細書に記載のＣＤＲを含む。その抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの、３つの、４つの、５つのまたは６つの本明細書に記載のＣＤＲを含み得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含み得る。可変領域ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物のものでよく、一般に、具体的に本明細書に記載され、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているまたはインフレームである、ヒトＳｃｇ３への結合に関与する少なくとも１つのＣＤＲ配列、例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３および／または軽鎖ＣＤＲを含む。一般論として、可変（Ｖ）領域ドメインは、任意の好適な配列の免疫グロブリン重（Ｖ_Ｈ）鎖可変ドメインおよび／または軽（Ｖ_Ｌ）鎖可変ドメインであり得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、単量体であってよく、また、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインであってよく、これは、以下に記載のように、少なくとも１ｘ１０^－７Ｍ以下の親和性でＳｃｇ３に独立に結合できる。あるいは、Ｖ領域ドメインは、二量体であってよく、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含み得る。Ｖ領域二量体は、非共有結合で結合した、少なくとも１つのＶ_Ｈおよび少なくとも１つのＶ_Ｌ鎖を含む（以降では、Ｆｖと呼ぶ）。必要に応じ、鎖は、直接に、例えば、ジスルフィド結合を介して２つの可変ドメイン間で共有結合して、またはリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して、共有結合して、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し得る。

【0049】

可変領域ドメインは、任意の天然の可変ドメインまたはその遺伝子改変型であってよい。遺伝子改変型は、組換えＤＮＡ操作技術を用いて生成された可変領域ドメインを意味する。このような遺伝子改変型には、例えば、特異的抗体のアミノ酸配列中でまたはアミノ酸配列に対し、挿入、欠失、または変更により、特異的抗体可変領域から、生成したものを含む。特定の例としては、少なくとも１つのＣＤＲおよび必要に応じ、１つまたは複数の第１の抗体由来のフレームワークアミノ酸および第２の抗体由来の可変領域ドメインの残りの部分を含有する遺伝子改変可変領域ドメインが含まれる。

【0050】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリマー、脂質、またはその他の部分と化学結合し得る。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールを含む、１個または複数の水溶性ポリマー付加物を含み得る。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；および同第４，１７９，３３７号を参照されたい。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント誘導体は、１種または複数のモノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、またはその他の炭水化物系ポリマー、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、ならびにこのようなポリマーの混合物を含む。特定の実施形態では、１種または複数の水溶性ポリマーは、１つまたは複数の側鎖にランダムに結合される。特定の実施形態では、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療能力を改善するように作用し得る。特定のこのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号で考察されている。この特許は、目的に応じて、参照により本明細書に組み込まれる。

【0051】

抗体またはそのフラグメントは、Ｓｃｇ３に優先的に結合し、これは、抗体またはそのフラグメントが、無関係の対照タンパク質に対する結合よりも高い親和性でＳｃｇ３に結合することを意味する。より好ましくは抗体またはそのフラグメントは、Ｓｃｇ３またはその一部を特異的に認識し、結合する。「特異的結合」は、抗体またはそのフラグメントが、無関係の対照タンパク質に対する親和性よりも、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、または１０，０００倍大きい親和性で、Ｓｃｇ３に対し結合することを意味する。いくつかの変形例では、抗体またはそのフラグメントは、実質的に独占的にＳｃｇ３に結合する、すなわち、結合親和性の測定可能な差異のおかげで、その他の既知のポリペプチド（例えば、その他のグラニン）からＳｃｇ３を区別できる。抗体またはそのフラグメントは、１ｘ１０^－７以下、１ｘ１０^－８以下、１ｘ１０^－９以下、１ｘ１０^－１０以下、１ｘ１０^－１１以下、または１ｘ１０^－１２以下のＳｃｇ３に対する結合親和性を有し得る。親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイにより測定し得る。特定の実施形態では、親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）またはＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）アッセイにより測定し得る。特定の実施形態では、親和性は、速度論的方法により測定し得る。特定の実施形態では、親和性は、平衡／溶液法により測定し得る。このような方法は、本明細書でさらに詳細に記載される、または当該技術分野において既知である。

【0052】

種々の態様では、抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の細胞ベースアッセイ、および／または本明細書に記載のインビボアッセイでＳｃｇ３機能を調節する、および／または本出願で記載の１つの抗体の結合を交差阻止する、および／または本出願に記載の抗体の１つにより、Ｓｃｇ３結合から交差阻止される。したがって、このような抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、特定できる。

【0053】

本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、結合剤が結合特異性を保持する限りにおいて、本明細書で提供されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１個のアミノ酸置換を有し得ることは理解されよう。したがって、抗体またはその抗原結合フラグメントに対する改変は、本発明の範囲に包含される。これらには、抗体またはその抗原結合フラグメントのＳｃｇ３結合機能を破壊しない、保存的または非保存的であり得る、アミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物学的システムによって合成されるのではなく、化学的ペプチド合成によって通常組み込まれる非天然のアミノ酸残基も包含し得る。これらには、ペプチド模倣体およびその他の逆転型または反転型のアミノ酸部分が含まれる。保存的アミノ酸置換は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどあるいはまったく影響しないように天然のアミノ酸残基の標準的残基による置換を含み得る。非保存的置換は、１つのクラスのアミノ酸またはアミノ酸模倣物質のメンバーの異なった物理的性質（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を有する別のクラス由来のメンバーとの交換を含み得る。このような置換残基は、非ヒト抗体と相同なヒト抗体領域に、または分子の非相同領域中に導入され得る。

【0054】

さらに、当業者なら、それぞれの目的のアミノ酸残基の位置に１つのアミノ酸置換を含む試験変種を生成し得る。その後、当業者に既知の活性アッセイを用いて変種をスクリーニングできる。このような変種を用いて、好適な変種に関する情報を収集し得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変更により活性の破壊、望ましくない活性の低下または不適切な活性を生じることがわかった場合、このような変更を有する変種は回避され得る。換言すれば、このような定型的な実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独でまたはその他の変異と組み合わせてさらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に特定できる。

【0055】

当業者なら、よく知られた技術を用いて、本明細書に記載のポリペプチドの好適な変種を決定できるであろう。特定の実施形態では、当業者なら、活性にとって重要でないと考えられている部位を標的とすることにより、活性を破壊することなく、変更し得る好適な分子の部分を特定し得る。特定の実施形態では、類似のポリペプチド中で保存されている残基および分子の部分を特定できる。特定の実施形態では、生物活性または構造に重要であり得る部分であっても、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供し得る。

【0056】

さらに、当業者なら、類似のポリペプチド中の活性または構造に重要な残基を特定する構造－機能研究を再検討できる。このような比較を考慮すれば、類似のタンパク質中の活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者ならこのように予測された重要なアミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選択し得る。

【0057】

また、当業者なら、類似のポリペプチドの三次元構造に関連して、当該ポリペプチドの三次元構造およびアミノ酸配列を解析できる。このような情報を考慮すれば、当業者なら、抗体の三次元構造に関連して、抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。特定の実施形態では、当業者なら、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基に対して根本的な変更を生じないように選択し得る。理由は、このような残基がその他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。

【0058】

抗体またはその抗原結合フラグメントが、上記表１の少なくとも１つのＣＤＲと、および／または表１の少なくとも１つの抗体のＳｃｇ３との結合を交差阻止する、および／または表１の少なくとも１つの抗体によりＳｃｇ３に対する結合から交差阻止される、抗Ｓｃｇ３抗体のＣＤＲと、および／または抗Ｓｃｇ３抗体のＣＤＲと、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有する場合、この抗体またはその抗原結合フラグメントは、本開示の範囲内にある。この場合、細胞ベースアッセイで、抗Ｓｃｇ３抗体は、Ｓｃｇ３の効果を阻止できる。抗体またはその抗原結合フラグメントが、上記表１の少なくとも１つの抗体の可変領域と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有し、表１の少なくとも１つの抗体のＳｃｇ３との結合を交差阻止し、および／または表１の少なくとも１つの抗体によりＳｃｇ３との結合を交差阻止され、および／または細胞ベースアッセイでＳｃｇ３の効果を阻止できる場合、この抗体またはその抗原結合フラグメントは同様に、本発明の範囲内にある。

【0059】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。本開示はまた、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。各ＣＤＲ配列をコードする核酸は、ＣＤＲのアミノ酸配列を基準にして決定し得、オリゴヌクレオチド合成技術、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を必要に応じて用いて、任意の所望の抗体可変領域フレームワークおよび定常領域ポリヌクレオチド配列と一緒に合成され得る。可変領域フレームワークおよび定常領域のコーディングは、ジェンバンクなどの遺伝子配列データベースから、当業者に広く利用可能である。

【0060】

一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする発現ベクターまたは核酸を遺伝子導入された宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、抗体フラグメントの発現は、大腸菌などの原核生物宿主細胞中で実施するのが好ましい場合がある（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９；１７８：４９７－５１５を参照されたい）。特定のその他の実施形態では、抗体またはそのフラグメントの発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または植物細胞を含む真核生物宿主細胞中で実施するのが好ましい場合がある。好適な動物細胞の例には、骨髄腫（マウスＮＳＯ系統など）、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞の例には、タバコ、トウモロコシ、大豆、およびイネ細胞が挙げられる。このようにして抗体を産生させるための特定の方法は、一般に周知であり、日常的に使用されている。例えば、基本的分子生物学的手順は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されている。また、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２００１）も参照されたい。ＤＮＡ塩基配列決定法を実施でき（例えば、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９７７；７４：５４６３に記載のように）、部位特異的変異誘発が当該技術分野において既知の方法に従って実施できる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８４；１２：９４４１；Ｋｕｎｋｅｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８５；８２：４８８－９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：３６７－８２）。さらに、多くの刊行物に、ＤＮＡ操作、発現ベクターの生成ならびに適切な細胞の形質転換および培養による抗体の作製に適した技術が記載されている（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ａ ａｎｄ Ａｄａｉｒ，Ｊ Ｒ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ（ｅｄ．Ｔｏｍｂｓ，Ｍ Ｐ，１０，Ｃｈａｐｔｅｒ １，１９９２，Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。抗体などのいくつかのタンパク質は、種々の翻訳後修飾を受け得ることは、当業者に理解されよう。これらの修飾のタイプと程度は、多くの場合、タンパク質発現に使用される宿主細胞株ならびに培養条件に依存する。このような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミド化におけるバラツキを含み得る。高頻度な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に起因するカルボキシ末端塩基性残基（リシンまたはアルギニンなど）の損失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １９９５；７０５：１２９－１３４に記載のように）。

【0061】

必要に応じ、抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性は、いくつかの親和性成熟プロトコルのいずれかにより改善され、これらのプロトコルには、ＣＤＲの維持（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５；２５４：３９２－４０３）、チェーンシャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２；１０：７７９－７８３）、大腸菌の変異株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５０－３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４－７３３，１９９７）、およびファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７－８８，１９９６）が挙げられる。他の親和性成熟の方法は、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６，５３５－５３９で考察されている。

【0062】

抗体またはそのフラグメントの親和性、ならびに抗体またはそのフラグメントが結合を抑制する程度は、従来技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０－６７２（１９４９）に記載の技術を使用して、または表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ：Ｂｉａｃｏｒｅ）またはＯｃｔｅｔアッセイを用いて、当業者により決定できる。ＳＰＲでは、標的分子は固相上に固定され、フローセルに沿って流れる移動相中のリガンドに曝露される。固定された標的へのリガンドの結合が生じると、局所的屈折率が変化し、ＳＰＲ角度の変化に繋がり、反射光の強度の変化を検出することにより、この変化をリアルタイムでモニターできる。ＳＰＲシグナルの変化の速度が分析でき、結合相と解離相に対する見かけの速度定数が得られる。これらの値の比は、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０－６５（１９９３）を参照されたい）。Ｏｃｔｅｔ親和性定量化では、抗原はビオチンで標識され、プローブ上のストレプトアビジンに結合する。抗原への抗体結合は、反射光の強度の変化により、Ｂｉａｃｏｒｅの場合と類似の方式で定量される。抗体結合親和性は、類似の方法で定量できる（Ｅｓｔｅｐ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．５：２７０－２７８（２０１３））。

【0063】

本発明による抗体は、いずれかの免疫グロブリンクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＡに属し得る。種々の実施形態では、抗体はＩｇＧ２またはＩｇＧ４などのＩｇＧである。これは、動物、例えば、家禽（例えば、ニワトリ）および、限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはその他のげっ歯類、雌ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ヒト、またはその他の霊長類を含む哺乳動物から得られる、またはそれらに由来し得る。抗体は内在化する抗体であってよい。抗体の産生は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１４６８８８Ａ１号に広範な視点から開示されている。

【0064】

抗体またはその他の結合剤が別のもののＳｃｇ３への結合を妨害できる程度、および、その結果として、本発明に従って交差阻止すると言えるかどうかは、競合結合アッセイを用いて決定できる。１つの特に好適な定量アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定できる、Ｂｉａｃｏｒｅの装置を使用する。別の好適な定量的交差阻止アッセイはＯｃｔｅｔアッセイである。別の好適な定量的交差阻止アッセイは、ＥＬＩＳＡ系手法を使用して、Ｓｃｇ３への結合の観点から、抗体間、または他の結合剤間の競合を測定する。交差阻止（すなわち、競合）アッセイは、国際公開第２００６／１１９１０７号などにおけるような、当該技術分野においてに記載されている。

【0065】

一態様では、本開示は、薬学的および生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤と共に、本明細書に記載の抗Ｓｃｇ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。抗Ｓｃｇ３抗体を含む組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、移植片、デポー、液剤、貼付剤、トローチ剤、クリーム剤、ゲル、軟膏、ローション、噴霧剤、点耳剤、および点眼薬を含む任意の好適な剤形であり得る。採用される特定の担体は、溶解度および抗体または共療法剤との反応性のないことなどの物理化学的考慮によって、および投与経路によってのみ制限される。生理学的に許容可能な担体は、当該技術分野で周知である。注射用途に適した例示的剤型としては、無菌水溶液もしくは水分散液、および無菌の注射可能溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。注射可能製剤は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ．ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）でさらに記載されている。一態様では、抗Ｓｃｇ３抗体を含む医薬組成物は、例えば、キット中で、このような医薬組成物の使用に関する説明書を提供する包装材料と共に、容器内に入れられる。通常、このような説明書は、試薬濃度、ならびに、特定の実施形態では、医薬組成物の再構成に必要となり得る、賦形剤成分または希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対量を記載する明白な表現を含む。担体は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビークル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド、などをさらに含み得る。薬剤的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と相いれない場合を除き、治療用組成物中でのそれらの使用が意図されている。補充用の有効成分も、組成物中に組み入れることができる。語句の「薬学的に許容可能な」は、ヒトに投与される場合、アレルギー性または類似の不都合な反応を生じない、分子実体および組成物を意味する。

【0066】

このような医薬組成物の好適な投与方法は、当該技術分野において周知である。２種以上の経路が薬剤（本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントなど）の投与に使用できるが、特定の経路により、別の経路より速やかな、およびより効果的な反応が得られる場合がある。状況に応じて、抗Ｓｃｇ３抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、体腔中に適用または注入される、皮膚または粘膜を通して、吸収される、摂取される、吸入される、眼に投与される、および／または循環中に導入される。例えば、特定の状況では、薬剤を含む医薬組成物を、経口で、静脈内、皮下、腹腔内の、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、尿道、腟、または直腸手段により、徐放システムにより、埋め込み装置により注入または点滴を介して、送達するのが望ましいであろう。必要に応じ、組成物（または抗体もしくはその抗原結合フラグメント）は、関心領域に供給する動脈内または静脈内投与を介して限局的に投与される。あるいは、組成物は、目的の分子が吸収または封入されている膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みにより、例えば、Ｍｙｌｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．Ｅｐｕｂ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ９，２０１６，ａｎｄ Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１３；１５６（２）：２８３－２９２に記載のように、局所投与される。埋め込み装置が使われる場合、一態様では、その装置は、任意の好適な組織または器官中に埋め込まれ、目的の分子の送達は、例えば、拡散、時限放出ボーラス、または継続投与による。他の態様では、薬剤は、腫瘍切除またはその他の外科手術中に、露出組織に直接に投与される。一態様では、医薬組成物は、眼に局所投与され、例えば、眼科的に、眼内に、結膜に、角膜内に、硝子体内に、および／または眼球後方に投与される。治療薬送達手法は、当業者には周知であり、そのいくつかは、例えば、米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載されている。

【0067】

特定の対象に対する特定の投与計画は、一部は、使用される抗体または抗原結合フラグメント、投与される抗体または抗原結合フラグメントの量、投与経路、および何らかの副作用の原因と程度に依存する。本発明では、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に対する抗体または抗体フラグメントの量は、適度な時間枠にわたり目的の応答を達成するのに十分である必要がある。種々の態様では、方法は、例えば、約０．１μｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超（例えば、０．１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ超）を投与することを含む。例えば、投与量は、約０．１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ；または約５μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ；または約１０μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ；または約１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ；または約２ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ；または約３ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ；または約３ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ；または約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ；または約１０ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ；または約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ；または約５０ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ；または約１００ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ；または約１００ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。種々の態様では、方法は、例えば、約０．０５ｍｇ～約１０ｍｇをヒト対象の眼に、例えば、約０．１ｍｇ～約０．５ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約１ｍｇ、約０．２ｍｇ～約２ｍｇ、約０．５ｍｇ～約２．５ｍｇ、約２ｍｇ～約４ｍｇ、または約１ｍｇ～約５ｍｇをヒト対象の眼に投与することを含む。一部の状態または病状は、長期の治療を必要とし、これには、複数の投与（例えば、毎日、週３回、週１回、２週毎に１回、または毎月１回を、３日間、７日間、２週間、３週間、１ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１２ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２１ヶ月間、２年間、またはそれ超の治療期間にわたる投与）に対し、複数用量の抗Ｓｃｇ３療法剤の投与を必要としても、そうでなくてもよい。

【0068】

一態様では、本開示は、治療を必要としている対象の新生血管型加齢黄斑変性を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。一態様では、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物は、脈絡膜新生血管を抑制するための有効量で投与される。

【0069】

別の態様では、本開示は、治療を必要としている対象の糖尿病性網膜症（糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および／または増殖糖尿病網膜症（ＰＤＲ））または未熟児網膜症を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。一態様では、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物は、網膜血管漏出および／または網膜血管新生を抑制するための有効量で投与される。

【0070】

一態様では、抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物は、脈絡膜新生血管および／または網膜血管新生を抑制するための有効量で投与される。脈絡膜新生血管および／または網膜血管新生は、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物の投与前に比べて、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または、少なくとも１００％抑制される。脈絡膜および／または網膜血管新生を測定する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、血管造影を含む画像処理技術（例えば、フルオレセインまたはインドシアニングリーンを使って）、および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を含む。

【0071】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物は、治療前に比べて、網膜血管漏出を低減するための有効量で投与される。網膜血管漏出は、抗体、その抗原結合フラグメント、または医薬組成物の投与前に比べて、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または、少なくとも１００％抑制される。網膜血管漏出を測定する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、網膜透過性アッセイ（例えば、エバンスブルー色素または蛍光標識を使って）、ならびに血管造影を含む画像処理技術（例えば、フルオレセインまたはインドシアニングリーンを使って）、およびＯＣＴを含む。

【0072】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物は、癌を治療するための有効量で投与される。この方法は、癌細胞を、一定量の本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれを含む医薬組成物と接触させて、癌細胞の増殖を抑制または腫瘍増殖を調節することを含む。いくつかの実施形態では、癌細胞は対象中にあり、接触させることが治療有効量の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは医薬組成物をその対象に投与することを含む。本開示の抗体およびその抗原結合フラグメントは、癌細胞増殖をインビトロおよびインビボで抑制する方法で（例えば、対象の癌を治療する方法で）使用できる。癌および腫瘍の例には、限定されないが、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌（例えば、網膜芽細胞腫、ぶどう膜黒色腫、および眼内リンパ腫）、腎臓癌、白血病、肺癌、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、肝臓癌、口腔癌、中咽頭癌、食道癌、および胃癌が挙げられる。

【0073】

癌細胞増殖を「抑制すること」は、増殖の１００％の防止を必要とするものではない。任意の増殖速度の低下が意図されている。同様に、腫瘍増殖を「調節すること」は、腫瘍のサイズを小さくすること、腫瘍増殖を遅らせること、または既存の腫瘍のサイズの増大を抑制することを意味する。腫瘍の完全な消滅は要求されない；何らかの腫瘍サイズの縮小または腫瘍増殖の緩徐化は、対象における有益な生物学的効果と見なされる。腫瘍量、容積、および／または長さは、当該技術分野において既知の方法、例えば、ノギス、超音波撮像、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）法、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、光学撮像（例えば、バイオルミネセンスおよび／または蛍光撮像）、デジタルサブトラクション血管造影（ＤＳＡ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）法および／またはその他の画像分析を使用して評価できる。腫瘍細胞増殖はまた、例えば、ＤＮＡ合成、代謝作用、細胞増殖に関連する抗原、および／またはＡＴＰを測定する、細胞アッセイを使って分析できる。種々の実施形態では、本開示の方法は、腫瘍サイズを、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％）減少させる。これに関しては、癌細胞増殖は、例えば、本発明の方法を使用しない場合（例えば、本開示の抗体または抗原結合フラグメントに曝露されない生物学的対応対照の対象または供試体）に観察される増殖のレベルに比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％または少なくとも約２０％抑制される。効果は、例えば、腫瘍サイズの減少、癌マーカーのレベルの低下もしくは維持、または細胞集団の縮小もしくは維持により検出される。いくつかの実施形態では、増殖は、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントの非存在下での増殖に比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ超（約１００％）低減される。

【0074】

別の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物は、過剰血管新生に関連する疾患を治療するための有効量で投与される。血管新生関連疾患の例には、限定されないが、血管新生緑内障、角膜血管新生、翼状片、網膜静脈閉塞症、ならびに近視、炎症状態、遺伝性網膜ジストロフィー、および鎌状赤血球網膜症由来の網膜および黄斑の血管新生を含む眼の疾患；ならびに関節炎、滑膜炎、骨髄炎、骨棘形成、多発性硬化症、血管奇形、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、移植動脈症、肥満症、乾癬、いぼ、アレルギー性皮膚炎、瘢痕ケロイド、化膿性肉芽腫、水疱形成疾患、カポジ肉腫（例えば、ＡＩＤＳ患者における）、原発性肺高血圧症、喘息、鼻ポリープ、炎症性腸疾患、歯周病、肝硬変、腹水、腹膜癒着、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、再狭窄、および嚢胞性繊維症を含む非眼疾患が挙げられる（例えば、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００３；９（６）：６５４－６６０ ；ａｎｄ Ｈｏｕｔｍａｎ，ＦＡＳＥＢ Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０；ｐ．１－１７を参照されたい）。

【0075】

人体に対し実施される方法の特許化を禁止する司法管区では、ヒト対象に対する組成物の「投与」の意味は、ヒト対象が任意の技術（例えば、経口、吸入、局所投与、注射、挿入など）により自己投与する制御された物質の処方に限定されるものとする。種々の態様では、本開示は、抗体またはその抗原結合フラグメントの、本明細書に記載の糖尿病性網膜症および脈絡膜新生血管およびその他の眼関連の病気を含む眼障害の治療のための、ならびに、本明細書に記載の癌の治療のための薬物の調製における使用を提供する。本開示は、抗体またはその抗原結合フラグメントの、本明細書に記載の糖尿病性網膜症および脈絡膜新生血管およびその他の眼関連の病気を含む眼障害の治療、ならびに、本明細書に記載の癌の治療における使用をさらに提供する。本明細書に記載の糖尿病性網膜症および脈絡膜新生血管およびその他の眼関連の病気を含む眼障害の治療における使用、ならびに、本明細書に記載の癌の治療における使用のための本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。人体に対し実施される方法の特許化が禁止されない司法管区では、組成物の「投与」は、人体に対する実施される方法および前述の動作の両方が含まれる。

【0076】

以下の実施例は例示であって、限定することを意図したものではない。

【0077】

実施例
実施例１
糖尿病性網膜症のための抗Ｓｃｇ３療法
材料および方法
抗体。組換えＨＲＰ－３を、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにして調製した。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９およびクローン７８、マウスＩｇＧ１）をヒトＳｃｇ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対し産生し、無血清ハイブリドーマ馴化培地からプロテインＧカラムを使って精製した。抗ｃ－Ｍｙｃ ｍＡｂを９Ｅ１０ハイブリドーマの馴化培地から精製し、マウス対照ＩｇＧ１として使用した。対照ウサギＩｇＧをウサギ血清から精製した。

【0078】

糖尿病マウス。ストレプトゾシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ）またはモッククエン酸緩衝液を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齡、雄；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の１型糖尿病を誘導した。手短に説明すると、マウスを４時間絶食させた後、５日の連続日の間、腹腔内注射によりＳＴＺ（４０μｇ／ｇ体重）またはクエン酸ナトリウム緩衝液（１３７ｍＭ、ｐＨ４．５）を受けた。ＳＴＺをクエン酸緩衝液（７．５ｍｇ／ｍｌ）に溶解直後に、注射した。通常ＳＴＺ処理の２週後に開始して、マウスの血糖を２週に１回モニターし、血糖≧３５０ｍｇ／ｄＬの場合は、糖尿病患者とみなした。マウスをＳＴＺ後４ヶ月間加齢させてＤＲを発症させた。

【0079】

４～６週齡までに高血糖を発症したヘテロ接合のＩｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の血糖をモニターした。雄では、糖尿病表現型および関連合併症が雌より重篤で、進行性である。Ｉｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}の雄は、６月齢で網膜血管漏出を発症し、そのため、この調査で抗Ｓｃｇ３療法に選択された。

【0080】

クローンファージ。クローンファージをＣａｂｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２００９；１４（６）：６５３－６１に記載のように構築した。手短に説明すると、停止コドン不含緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列は、ＰＣＲにより増幅し、消化して、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位でＴ７Ｂｉｏ３Ｃファージベクター（Ｃａｂｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０１０；２３（１）：７４－８３）中にクローニングし、ＧＦＰファージを生成した。人工のコドンを有する野性型ヒトＶＥＧＦ_{１－１１０}（ｈＶＥＧＦ）のコード配列を設計し、メーカー（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に委託して合成し、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ部位でＴ７Ｂｉｏ３Ｃ中にクローニングし、ｈＶＥＧＦ－ファージを生成した。両方のクローンファージを塩基配列決定により確認した。

【0081】

ＯＰＤライブラリー精製。マウス成体眼およびＥ１８胚由来のオープンリーディングフレームファージディスプレイ（ＯＰＤ）ライブラリーは以前に記載された（Ｃａｂｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２００９；１４（６）：６５３－６１；Ｃａｂｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０１０；２３（１）：７４－８３）。非選択ライブラリーの次世代ＤＮＡ塩基配列決定法（ＮＧＳ）分析は、組み合わせライブラリーは、少なくとも９，５００の異なるタンパク質からなることを示した。修正を加えた、Ｎｏｖａｇｅｎ Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、ＯＰＤライブラリーおよび対照クローンファージを増幅し、精製した。手短に説明すると、ＢＬＴ５６１５細菌をＬＢ培地中で０．５のＯＤ_６００まで培養し、イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；１ｍＭ）を用いて、３７℃で３０分間、振盪しながら誘導した。ライブラリーまたは対照クローンファージ（約４ｘ１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ））を、ＩＰＴＧ誘導されたＢＬＴ５６１５（２００ｍｌ）に加え、３７℃で振盪しながら溶菌までインキュベートした。ＤＮアーゼＩ（４０μｇ）と共に、追加の１５分のインキュベーション後、２つのライブラリーを同じファージ力価でプールし、ライブラリー表現を改善した。ｈＶＥＧＦファージおよびＧＦＰファージを同じ力価で混合し、プールライブラリー中に１：１，０００比率で希釈した。ＮａＣｌ（１０ｇ）を添加し溶解した後、組み合わせたライブラリー溶解物を１３，２００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。ポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ－８０００、４０ｇ）を上清に加え、溶解して、これを、４℃で一晩インキュベートし、同じ条件下で遠心分離した。ファージペレットをトリス－ＮａＣｌ緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、遠心分離した。上清を不連続ＣＳＣｌ勾配液（２０．８％、３１．２５％、４１．７％および６２．５％、ｗ／ｖ）上に置き、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローターで、３５，０００ｒｐｍ、２３℃で６０分間、遠心分離した。４１．７％ＣｓＣｌのすぐ上のファージバンドを集め、ＰＢＳに対し透析し、ファージプラークアッセイにより滴定した。

【0082】

インビボ結合選択。糖尿病および対照Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２３週齡またはＳＴＺの４ヶ月後）をケタミン（９０μｇ／ｇ）およびキシラジン（８μｇ／ｇ）の腹腔内注射により麻酔した。精製ライブラリーを麻酔したマウスの静脈内に注射し（３匹のマウス／群／ラウンド、１ｘ１０^１２ｐｆｕ／マウス）、２０分間循環させた。非結合ファージをＰＢＳによる心臓内灌流により除去した。網膜を単離し、１％トリトンＸ－１００含有ＰＢＳ中でホモジナイズし、内皮結合ファージを放出させた。一定分量のライセートを用いて、記載のように、プラークアッセイによりファージ力価を定量化した。ライセート中の残りのファージをＩＰＴＧ誘導されるＢＬＴ５６１５細菌中で増幅し、上記のように再精製した。精製ファージを次のインビボ選択のラウンドの入力として用いた。３ラウンドの選択後、濃縮したファージクローンのｃＤＮＡインサートを、プライマー：５’－ＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧ－３’（配列番号３６）および５’－ＣＣＧＣＴＣＣＣＡＣＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧ－３’（配列番号３７）を用いて、ＰＣＲで増幅した。４００～１，５００ｂｐのＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、ＮＧＳで特定した。

【0083】

比較リガンドミクスデータ分析。ＮＧＳデータをＮＣＢＩ ＣＣＤＳデータベースに対し整列させて、濃縮リガンドを特定した。ＮＧＳにより特定されたｃＤＮＡインサートのコピー数は、それらの同族リガンドの網膜内皮に対する相対的結合活性を表し、カイ二乗検定により定量的に比較して、ＤＲ関連リガンドを特定した。ＮＧＳデータのＣＣＤＳ ＩＤをユニプロット受入番号にバッチ変換し、ＰＡＮＴＨＥＲおよびＤＡＶＩＤにより分析した。特定されたリガンドは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ」および「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ」に基づいて分類した。

【0084】

細胞増殖アッセイ。４～８継代のＨＲＭＶＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ）をＳｃｇ３、ＶＥＧＦ１６５またはＰＢＳ対照と共に、示した濃度で、９６または４８ウェルプレート中で、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載のように、培養した。必要な場合には、親和性精製抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂまたはｍＡｂを、Ａｍｉｃｏｎ遠心力フィルターユニット（１０ｋＤａ）中でＰＢＳで３回洗浄し、濃縮して、細胞に加えた。新しい培地、成長因子および抗体を２４時間毎に加えた。各ウェル中の細胞を４８時間でトリプシン消化により集め、ＰＢＳ中に１ｍＭのトリパンブルーと共に再懸濁し、定量した。

【0085】

管形成アッセイ。アッセイを、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにして実施した。手短に説明すると、マトリゲルをＥＢＭ－２培地中で１：４（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に希釈し、９６ウェルプレート（５０μ／ウェル）中で播種し、３７℃で３０分間、固化させた。ＨＵＶＥＣを無血清２９３ＳＦＭ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩飢餓状態にし、採取して、マトリゲル（１５，０００細胞／ウェル）上に播種した。細胞をＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に、２９３ＳＦＭ ＩＩ培地中、３７℃で４時間インキュベートした。明視野画像を取得した。視野当たりの、合計チューブ長さ、チューブの数および分岐点の数を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて定量化した。

【0086】

創傷治癒アッセイ。ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにしてインビトロ創傷治癒アッセイにより細胞遊走を分析した。手短に説明すると、ＨＲＭＶＥＣを１２ウェルプレート中で約９０～１００％集密度まで培養し、０．２％ＦＢＳを補充した２９３ＳＦＭ ＩＩ培地中で３時間、飢餓状態にした。無菌２００μｌの先端部を用いて、各ウェル中に境界の明確な約１ｍｍ幅の引っ掻き傷を作製した。濯いだ後で、Ｓｃｇ３またはＶＥＧＦの存在下で、新しい０．２％のＦＢＳ含有２９３ＳＦＭ ＩＩ培地中で細胞を培養した。０時間および２０時間に、位相差顕微鏡により細胞遊走をモニターした。元の引っ掻き傷内の遊走細胞により覆われた露出領域のパーセンテージをＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。

【0087】

インビトロ内皮透過性アッセイ。アッセイを、Ｍａｒｔｉｎｓ－Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００８；４４３（１３７－５３）に記載のように実施した。ＨＵＶＥＣを２４ウェルプレートのトランスウェルインサート中に播種し、コンフルエンスまで培養した。ＦＩＴＣ－デキストラン（３～５ｋＤａ）（１ｍｇ／ｍｌ）をＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に、下段チャンバーに加えた。２４時間後、上段チャンバー中のＦＩＴＣ濃度を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化し、検量線に対し計算した。

【0088】

スフェロイド発芽。ＨＲＭＶＥＣと共に、アッセイをＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにして実施した。 手短に説明すると、１．２％（ｗ／ｖ）のメチルセルロースをＥＢＭ－２培地中に溶解することによりメトセル溶液を調製し、５，０００ｘｇ、４℃で２時間、遠心分離してデブリを除去した。８０％コンフルエンスで細胞を採取し、計数して、２０％のメトセルおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＥＢＭ－２培地に再懸濁し、非接着性９６ウェル丸底プレートに７５０個細胞／ウェルで播種し、２４時間培養した。スフェロイドを採取し、フィブリノーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）およびアプロチニン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）含有ＥＢＭ－２培地に再懸濁し、２４ウェルプレートに播種した（約５０スフェロイド／ｍｌ／ウェル）。トロンビン（１２単位／ｍｌ）を各ウェルに添加することにより凝血を誘導した。スフェロイド包埋フィブリンゲルを室温で５分間、その後、３７℃で２０分間凝血させた。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂを含むまたは含まない場合について、０．０５ｍｇ／ｍｌのアプロチニン含有基礎培地中で、フィブリンゲルをＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に４８時間インキュベートした。位相差顕微鏡を使って写真を取得し、平均発芽長さをＩｍａｇｅＪで定量化した。

【0089】

タンパク質プルダウン。Ｓｃｇ３（５μｇ／ｍｌ）をアフリベルセプト、ＶＥＧＦＲ－ＦｃまたはＶＥＧＦＲ２－Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）共に、０．５％トリトンＸ－１００およびＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）含有ＰＢＳ溶液中で、４℃で１時間インキュベートした。プロテインＧビーズ（２０μｌ）を加え、４℃で３０分間、転倒回転させながらインキュベートした。ビーズをＰＢＳを用いて遠心分離により３回洗浄し、低ｐＨ緩衝剤（１００ｍＭ グリシン、ｐＨ２．７）で溶出し、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂを使ってウェスタンブロットにより分析した。

【0090】

ＥＲＫ活性化。ＥＲＫ１／２活性化を、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載のように検出した。ＨＵＶＥＣを２９３ＳＦＭ ＩＩ培地中で１５分間ｘ３回、３７℃でプレインキュベーションし、他の成長因子の影響を低減した。細胞をＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に、ＥＢＭ－２培地中、３７℃で１０または３０分間インキュベートし、溶解し、リン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＫＲ１／２）、ＥＲＫ１／２またはβ－アクチンに対する抗体を使って、ウェスタンブロットにより分析した。

【0091】

Ａｋｔ活性化。Ａｋｔ活性化を、ＥＲＫ活性化と類似の方法で実施した。ＨＵＶＥＣを２９３ＳＦＭ ＩＩ培地中で１５分間ｘ４回、プレインキュベーションした。細胞をＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に、３７℃で１０分間インキュベートし、溶解し、リン酸化Ａｋｔ Ｔ３０８（ｐＡｋｔ）、総Ａｋｔまたはβ－アクチンに対する抗体を使って、ウェスタンブロットにより分析した。

【0092】

免疫組織化学。マウス網膜の免疫組織化学的分析を、親和性精製抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂを使って、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ．２０１５；２６（１２）：２３１１－２０に記載のように実施した。手短に説明すると、麻酔したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６、８週齡）を１０％ホルマリンで心臓内潅流した。眼を単離し、４℃で一晩固定した。角膜および水晶体を取りだした後、眼杯をショ糖勾配溶液と共に４℃でインキュベートし（１０％および２０％で各３時間；３０％で一晩）、続けて、３ラウンドの凍結－解凍およびＯＣＴ（最適切断温度化合物）包埋を実施した。７μｍ厚さの凍結組織切片を、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂと、続けて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体とインキュベートした。核をＤＡＰＩで可視化した。シグナルを共焦点顕微鏡により分析した。

【0093】

網膜および硝子体液中でのＳｃｇ３発現。硝子体液（２μｌ／眼）を、４ヶ月糖尿病および同年齢対照マウスから収集した。それらの網膜を単離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中でホモジナイズした。抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂまたは抗β－アクチン抗体を用いて、ウェスタンブロットにより試料を分析した。

【0094】

角膜血管新生アッセイ。アッセイを、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにして実施した。 手短に説明すると、滅菌Ｗｈａｔｍａｎ濾紙（グレード３）を小片（０．１２５ｍｍ^２／片）に切断し、Ｓｃｇ３（０．２５μｇ／μｌ）、ＶＥＧＦ（０．１μｇ／μｌ）、ＨＲＰ－３（１μｇ／μｌ）またはＰＢＳの溶液中に４℃で２時間浸漬した。浸漬した濾紙を麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齡；１濾紙／角膜；２つのポケット／マウス、１つの眼は常にＰＢＳ用）の角膜ポケット中に移植した。６日後、角膜血管新生を細隙灯顕微鏡を使って評価し、撮影した。角膜中への新規発芽血管の数、それらの分岐点および半定量的スコアを定量化し、他眼中のＰＢＳに対し正規化した。その後、マウスをＣＯ_２で安楽死させて、直ちに蛍光ＤｉＩ色素で心臓内潅流した。フラットマウント角膜を共焦点顕微鏡により分析し、ＤｉＩ標識血管を検出した。

【0095】

エバンスブルーアッセイ。網膜血管漏出をＳｃｈｅｐｐｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８；１１８（６）：２３３７－４６に記載のように、エバンスブルー（ＥＢ）アッセイにより定量した。手短に説明すると、親和性精製抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、無関係の抗原（Ｐｌｅｋｈａ１）に対する親和性精製ｐＡｂ（モック対照）、ウサギ対照ＩｇＧ、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂおよびマウス対照ＩｇＧ１を、Ａｍｉｃｏｎ遠心力フィルターユニット（１０ｋＤａ）中でＰＢＳで３回洗浄し、濃縮した。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ、モック親和性精製ｐＡｂ、ウサギ対照ＩｇＧ、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ、マウス対照ＩｇＧ１（０．３６μｇ／１μｌ／眼）またはアフリベルセプト（２μｇ／１μｌ／眼）を糖尿病マウスの片方の眼の硝子体内に注射し、反対側の眼にＰＢＳを注射した。硝子体内注射の１．５時間後に、ＥＢ（０．１５ｍｇ／ｇ体重）を静脈内に注射した。ＥＢ注射の２．５時間後に、予め温めた（３７℃）クエン酸ナトリウム溶液（１００ｍＭ、ｐＨ４．５）を用いて、麻酔したマウスを心臓内潅流した。網膜を単離し、フォルムアミド（５０μｌ／網膜）と共に７０℃で一晩インキュベートしてＥＢを抽出した。溶液を１８０，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離した。上清中のＥＢを６２０ｎｍおよび７４０ｎｍ（バックグラウンド）で定量化し、検量線と比較した。ＥＢ注射マウスから血液試料を集めた後、心臓内灌流し、３，５５０ｘｇ、２５℃で１５分間遠心分離後、希釈して、同じ波長で定量化した。ＥＢ漏出を次式で計算した：［漏出ＥＢ濃度（ｍｇ／ｍｌ）／網膜重量（ｍｇ）］／［血中ＥＢ濃度（ｍｇ／ｍｌ）ｘ循環時間（時間）］。データは、反対側の眼中のＰＢＳに正規化し、漏出の減少のパーセンテージとして表した。

【0096】

酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）。ＯＩＲを、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２０１６；２２Ｌ３７４－８６；Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１１）：１５６５－７３に記載されているように実施した。手短に説明すると、生後の７日目（Ｐ７）のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を制御チャンバー中で７５％酸素に曝露した。Ｐ１２で、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、対照ＩｇＧ、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（０．３６μｇ／１μｌ／眼）、アフリベルセプト（２μｇ／１μｌ／眼）またはＰＢＳを麻酔したマウスの硝子体内に注射し、注射後にマウスを室内気に戻した。Ｐ１７で、ＣＯ_２吸入によりマウスを安楽死させた。単離網膜をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８－イソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして、共焦点顕微鏡により分析した。血管新生を、Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１１）：１５６５－７３に記載のように定量化した。さらに、網膜全体にわたり新生血管タフトの数を定量化した。一定の領域中の分岐点の数を、各網膜の同じ領域中で定量化した。全てのデータを非注射眼に対し正規化した。

【0097】

統計。データを平均±ＳＥＭとして表した。群間差異を１元配置分散分析検定またはスチューデントのｔ検定により解析した。ＮＧＳデータセットをカイ二乗検定により比較した。

【0098】

結果
定量的リガンドミクスプロファイリング。血管新生因子などの細胞リガンドを技術的に難易度の高い、低スループットの手法の従来方式で特定した。病原性リガンドを治療可能性の観点で詳細に記述することはなおさら困難である。この課題に取り組むために、オープンリーディングフレームファージディスプレイ（ＯＰＤ）を細胞リガンドの偏りのない特定を目的として、受容体情報のない状況下で開発した。リガンドミクスの第１のパラダイムとして、ＯＰＤを次世代塩基配列決定法（ＮＧＳ）とさらに組み合わせて、細胞全体に及ぶ内皮リガンドを全体的にマッピングした。この実施例では、比較リガンドミクスを糖尿病および対照マウスに適用し、ＤＲ関連内皮リガンドを系統的に特定し、それらの病理学的役割および治療可能性を調査した。

【0099】

マウスのＤＲを確立するために、β膵島細胞を破壊するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で１型糖尿病を誘導し、高血糖マウスを４ヶ月間加齢させてＤＲを発症させた。予想通り、糖尿病マウスにおける網膜血管漏出の３．４倍増加が観察された。リガンドミクス分析のために、３ラウンドのインビボ結合選択で糖尿病マウスおよびモック処理対照マウスにＯＰＤライブラリーを静脈内注射し、網膜内皮リガンドを濃縮した（Ｆｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３；２７８（３０）：２７３９０－８）。濃縮クローンの全てのｃＤＮＡインサートをＮＧＳで分析した。合計で４８９，１２６個および４７３，９６５個の有効な配列リードを特定し、ＮＣＢＩ ＣＣＤＳデータベース中の１，５４８個（糖尿病網膜）および８４４個（健康な網膜）のタンパク質と整列させた。特定したリガンドは、多様な細胞プロセスに関与しており、その内の約１１．５％が、血管新生、アポトーシス、細胞遊走および接着に関連する。

【0100】

ＮＧＳにより特定されたｃＤＮＡインサートのコピー数は、それらの同族リガンドの内皮結合活性と相関している。この相関を確認するために、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ－ファージ、陽性対照）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ－ファージ、陰性対照）を発現する２つのクローンファージを構築した。ｈＶＥＧＦ－ファージは、野性型ヒトＶＥＧＦタンパク質を提示するが、最大限度のサイレント変異のための人工的改変コドンを有し、内在性ＶＥＧＦとはＮＧＳにより区別できる。同じ力価の非マウスコドンを有するｈＶＥＧＦ－ファージおよびＧＦＰ－ファージをマウスＯＰＤライブラリー中に希釈（１：１，０００）した後、インビボ選択を実施し、濃縮ライブラリークローン中でＮＧＳにより同時に特定した。３ラウンドの選択後の、ＮＧＳ（ＧＦＰ－ファージ対ＶＥＧＦ－ファージ）におけるＧＦＰ－ファージの枯渇およびｈＶＥＧＦ－ファージの相対的濃縮により、コピー数がそれらのインビボ結合活性の差異を反映していることが確認された。さらに、この結果により、ＧＦＰ－ファージを非特異的結合のベースラインとして確定した。４１７／８４４および８１７／１，５４８の単離リガンドが、このベースラインを上回って、それぞれ、健康な網膜および糖尿病の網膜に特異的に結合することが明らかになった。

【0101】

比較リガンドミクスによるＤＲ高発現リガンドとしてのＳｃｇ３の特定。糖尿病のおよび健康な網膜の全リガンドームプロファイルのための全体的結合活性パターンは、比較的類似していた。しかし、より詳細な比較により、個別リガンドのわずかな差異が明らかになった。Ｓｃｇ３は、糖尿病網膜中で１，７３１コピーが検出されたが、健康な網膜中ではコピーは検出されず、その受容体は、糖尿病の内皮上で発現上昇され得ることを意味している。対照的に、ヘパトーマ由来成長因子関連タンパク質３（Ｈｄｇｆｒｐ３、ＨＲＰ－３）の糖尿病網膜に対する内皮の結合活性は、２２７倍低減され、糖尿病ではその受容体の発現が低減され得ることを意味している。ＶＥＧＦ結合活性は５．９倍のみ低減し、ＶＥＧＦ受容体の網膜内皮発現が、４ヶ月糖尿病マウスで、わずかに変化したことを示唆している。

【0102】

比較リガンドミクスの概念実証として、カイ二乗（χ^２）検定により糖尿病と対照網膜とを対比した全リガンドームプロファイルの定量的比較を実施した。合計１，７７２個の非冗長性リガンドの内から特定された、１，１１４個のＤＲ関連内皮リガンド（ｐ＜０．０５）が存在し、これらは、それらの上昇したまたは低減した糖尿病網膜内皮に対する結合に基づいて、「ＤＲ高発現」および「ＤＲ低発現」リガンドとして特徴付けられた。しかし、糖尿病：対照のカイ二乗値対結合活性比率のプロットは、最小限であるが、統計的に有意な、２つの状態間の結合活性の変化を有する多くのリガンドを明らかにした。疾患関連リガンドの特定の信頼性を改善するために、ＤＲ高発現またはＤＲ低発現リガンドを、次のより厳密な、恣意的判定基準：ｐ＜０．００１；糖尿病：対照結合活性≧１０または≦０．１；ＤＲまたは対照中のコピー数≧３０；によりに定義した。これらの基準を用いて、３５３個のＤＲ高発現リガンドおよび１０５個のＤＲ低発現リガンドを得た（表２）。Ｓｃｇ３およびＨＲＰ－３は、それぞれ、ＤＲ高発現リガンドおよびＤＲ低発現リガンドとして特定された。Ｓｃｇ２はまた、糖尿病網膜血管に対する増大した結合を有することが見出された（表３）が、その比較的低い結合活性に起因して、ＤＲ高発現リガンドとしては認定されなかった。全ての特定されたリガンドに対する活性プロットを用いた全体的結合活性パターンの変化を分析した。結果は、全体リガンドームの内皮結合活性は、糖尿病マウスで大きく変化した（ピアソン相関係数：１，７７２リガンドに対しｒ＝０．４９８）。

【表2】

【表3-1】

【表3-2】

【0103】

比較リガンドミクスの妥当性は、いくつかの既知のおよび推定糖尿病関連内皮リガンドの特定により裏付けられた（表２および３）。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来のアミロイドβは、既知の内皮リガンドであり、ＲＡＧＥ（高度糖化最終生成物に対する受容体）に結合し、これは、糖尿病性内皮上に発現上昇している（Ｃａｂｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．２０１０；２９（２３）：３８９８－９１０）。Ｃ１ｑｂは、Ｃ１ｑ補体因子のサブユニットで、少なくとも２種の内皮受容体、ｃＣ１ｑＲおよびｇＣ１ｑＲ／ｐ３３と相互作用し、炎症促進性のサイトカインを産生する（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９４；５４（３）：２９９－３０８）。Ｃ１ｑは、動脈硬化病変の部位にかなりの量で存在し（Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４１（８）：７５９－６６）、これは、最もよくある糖尿病性血管合併症の１つである。ヘパトーマ由来成長因子（ＨＤＧＦ）は、既知の分裂促進的内皮リガンドである（Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０２（６）：１２０８－１９）。ＨＲＰ－３は、ＨＤＧＦと同じタンパク質ファミリーであり（Ｉｚｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９７；２３８（１）：２６－３２）、この実施例で、独立にＤＲ低発現血管新生因子として実証されたので、ＨＤＧＦも同様にＤＲ低発現リガンドである可能性を示唆する。最後に、フィブロネクチン１（Ｆｎ１）、コラーゲンＩＶ型α３（Ｃｏｌ４ａ３）およびカドヘリン１（Ｃｄｈ１）などの接着性分子の糖尿病網膜内皮上での受容体発現上昇は、ＤＲにおける白血球粘着に寄与し得る（ａｓｋ－Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１３；１７（１）：２０－３３；Ｆｏｒｂｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１３；９３（１）：１３７－８８）。

【0104】

新規血管新生因子としてのＳｃｇ３の独立検証。比較リガンドミクスの妥当性を実証するために、ＤＲ高発現Ｓｃｇ３およびＤＲ低発現ＨＲＰ－３を、それらの明確に異なる疾患関連パターンの独立検証のために選択した。これらの２つの非常にまれなリガンドを選択した。理由は、糖尿病網膜内皮への結合活性におけるそれらの高倍率変化のためである。さらに、ＨＲＰ－３をリガンドミクスにより健康な網膜中の血管新生因子として最近特定した（ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４）。Ｓｃｇ３も同様に血管新生因子であるかを判定するために、いくつかのインビトロ機能的分析を実施した。Ｓｃｇ３はヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）の増殖を有意に促進する（図１Ａおよび１Ｂ）。追加の分析は、Ｓｃｇ３がＥＣの管形成を刺激することを示した。顕微鏡分析での、チューブ長さ、分岐点の数およびチューブの数の定量化により、Ｓｃｇ３が管形成を誘導することを確認した（図１Ｃ～Ｅ）。さらに、この結果は、Ｓｃｇ３がＨＲＭＶＥＣのスフェロイド発芽を有意に促進することを明らかにした（図１Ｆ）。創傷治癒アッセイは、Ｓｃｇ３がＨＲＭＶＥＣの移動を容易にすることを示し（図１Ｇ）、インビトロ透過性アッセイは、Ｓｃｇ３が内皮透過性を誘導することを示した（図１Ｈ）。全てのこれらのアッセイでは、ＶＥＧＦは、陽性対照として機能し、内皮の増殖、管形成、移動および透過性を有意に刺激した。

【0105】

糖尿病および対照マウスの網膜および硝子体液中でのＳｃｇ３発現を特徴付けた。免疫組織化学は、Ｓｃｇ３が網膜神経節細胞、内網状層および外網状層、光受容体内節および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞中で発現したことを明らかにした。内および外顆粒層ならびに視細胞外節中では、わずかなＳｃｇ３シグナルしか検出されなかった。この発現パターンは、分泌顆粒中における神経伝達物質の貯蔵および輸送を調節するその役割と一致した。結果は、Ｓｃｇ３が、糖尿病および対照網膜のホモジネート中で類似のレベルで発現することをさらに明らかにした。Ｓｃｇ３分泌は、ウェスタンブロットによる、マウスの眼の無細胞の硝子体液中のその存在により実証された。興味深いことに、Ｓｃｇ３は、健康なマウスに比べて、４ヶ月糖尿病マウスの硝子体液中で有意に発現上昇しており、Ｓｃｇ３分泌が、調節されたＣＴＬＡ－４の分泌と類似して、調節されたプロセスであり得ることを意味している（Ｖａｌｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２９（６）：２７２－９）。

【0106】

疾患高発現および疾患低発現血管新生因子の検証。ＤＲ高発現Ｓｃｇ３およびＤＲ低発現ＨＲＰ－３を疾患関連血管新生因子として検証するために、糖尿病および対照マウスで、角膜ポケットアッセイを実施した。Ｓｃｇ３は糖尿病マウス中で、健康なマウスに比べて、選択的に血管新生を誘導した。対照的に、ＨＲＰ－３は、健康なマウス中で血管新生を選択的に刺激したが、糖尿病マウス中では刺激しなかった。予想通り、ＶＥＧＦを用いて対照アッセイは、健康なおよび糖尿病マウスの両方で血管新生を促進した。これらの調査結果は、細隙灯検査により観察されただけでなく、親油性の蛍光ＤｉＩ色素での角膜血管の染色によっても実証された。角膜血管、分岐点および包括的スコアの定量化は、Ｓｃｇ３およびＨＲＰ－３の逆の血管新生パターンを裏付けた（図２Ａ～２Ｃ）。定量化はまた、包括的スコアが、対照マウスにおけるよりも、糖尿病マウス中のＶＥＧＦに対して、より高い血管新生活性を示したことを除いて、ＶＥＧＦは健康なおよび糖尿病マウス中で類似の活性を有することを実証した（図２Ｃ）。データは、Ｓｃｇ３およびＨＲＰ－３は、それぞれ、本物の糖尿病高発現および糖尿病低発現血管新生因子であり、これは、さらには、定量的および比較リガンドミクスの妥当性を裏付けていることを示した。

【0107】

Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦの別の受容体シグナル伝達経路。糖尿病および対照マウスの角膜血管新生活性の別々のパターンは、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦが異なる受容体およびシグナル伝達経路を有し得ることを示唆している。実際に、Ｓｃｇ３は、ヒトＩｇＧ Ｆｃに融合したＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の第２の結合ドメインおよびＶＥＧＦＲ２の第３のドメインからなる遺伝子改変キメラ受容体であるアフリベルセプトと相互作用できなかった。この知見は、ＶＥＧＦＲ１－ＦｃおよびＶＥＧＦＲ２－Ｆｃを用いたタンパク質プルダウンアッセイにより、独立に実証された。Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦの両方がＥＲＫ１／２を活性化したが、ＶＥＧＦのみが、Ａｋｔのリン酸化を刺激し、Ｓｃｇ３は刺激しなかった。これらのデータは、別々の受容体を有するＳｃｇ３およびＶＥＧＦが、別々に血管新生を調節するようにそれらの細胞内シグナル伝達を部分的に収束させ得ることを示した。

【0108】

抗Ｓｃｇ３療法は糖尿病網膜血管漏出を軽減する。ＤＲにおける血管新生因子の病原性の役割を考慮して、ＤＲ高発現Ｓｃｇ３を、糖尿病網膜血管漏出を軽減する抗血管新生療法の標的として評価した。親和性精製抗Ｓｃｇ３ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、Ｓｃｇ３誘導ＨＲＭＶＥＣ増殖を阻止できた（図１Ｂ）が、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ単独では、内皮増殖に対し効果はなかった。ｐＡｂの中和活性を、スフェロイド発芽アッセイにより独立に確認した（図１Ｆ）。重要なのは、抗Ｓｃｇ３療法剤の硝子体内注射が、アフリベルセプトと類似の治療効力で、ＳＴＺ誘導糖尿病マウス中の網膜血管漏出を有意に低減したことである（図３Ａ）。対照として、無関係の抗原に対するモック親和性精製ｐＡｂは、糖尿病網膜血管漏出に対する抑制はなかった。

【0109】

抗Ｓｃｇ３療法の独立検証。しかし、親和性精製および種々の対照にもかかわらず、ｐＡｂは、オフターゲット効果により、他のタンパク質を非特異的に認識し得る。ｐＡｂとは異なり、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、他のタンパク質と最小限の交差反応しかせず、標的検証ならびに治療のための選択的試薬として十分に評価できる。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９およびクローン７８）を開発し、これらは、ヒトおよびマウスＳｃｇ３を認識した。Ｓｃｇ３中和ｍＡｂ クローン４９またはクローン７８の硝子体内注射は、ＳＴＺ誘導糖尿病マウスの網膜血管漏出を軽減し（図３Ａおよび３Ｄ）、ＨＲＭＶＥＣのＳｃｇ３誘導増殖を中和し（図３Ｂ）、Ｓｃｇ３が、ＤＲの抗血管新生療法のための本物の標的であることを示している。

【0110】

インスリン２遺伝子中に変異を有するＩｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}マウスは、自然に１型糖尿病を発症する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９；１０３（１）：２７－３７）。これを用いて、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂの治療効力を独立に検証した。マウスは、６月齢で網膜血管漏出を発症する。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂの硝子体内注射は、アフリベルセプトと類似の効力で、Ｉｎｓ２^{Ａｋｉｔａ}マウスの網膜漏出を有意に抑制し（図３Ｃ）、ＤＲ療法の標的として、Ｓｃｇ３をさらに裏付けた。

【0111】

クローン４９および表１に記載の他の抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂに対し、Ｓｃｇ３への競合的結合を評価した。抗Ｓｃｇ３ ｓｃＦｖ クローン４９（図３Ｄ）およびクローン７８（図３Ｅ）を発現させ、精製した。ＥＬＩＳＡプレート上に予め固定したＳｃｇ３に対するそれらの結合活性を、ｓｃＦｖ結合を阻止するための過剰の抗Ｓｃｇ３ クローン７、クローン１６、クローン４９、クローン７８、クローン１５３、クローン１６２、およびクローン１９０ ｍＡｂの存在下、または非存在下で、定量化した。結合ｓｃＦｖをＥＬＩＳＡアッセイにより検出した。結合アッセイはまた、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、Ｅｓｔｅｐ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１３；５：２７０－２７８に記載のように、実施した。両タイプの結合アッセイは、クローン４８およびクローン７８がＳｃｇ３に結合したが、相互に阻止をしないことを示し、それらがＳｃｇ３上の異なるエピトープに結合することを示す。両方の結合アッセイはまた、クローン１５３、クローン１６２、およびクローン１９０が、Ｓｃｇ３の結合に関し、クローン７８と競合したことを実証し、これらのｍＡｂの間で共通のエピトープを示す。

【0112】

網膜血管新生の抗Ｓｃｇ３療法。疾患発症の１０～２０年後にＰＤＲを発症し得る糖尿病患者とは対照的に、糖尿病げっ歯類は、おそらく、それらの比較的短い寿命に起因して、ＰＤＲに進行しない。酸素誘導網膜症（ＯＩＲ）は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）の動物モデルであり、網膜血管新生を有する増殖網膜症の代用モデルとして広く使用されてきた（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０；５１（６）：２８１３－２６；Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１１）：１５６５－７３）。抗Ｓｃｇ３療法のＯＩＲにより誘導された網膜血管新生を防ぐ能力を評価した。Ｓｃｇ３中和ｐＡｂの硝子体内注射は、新生血管タフトおよび蛇行血管を特徴とするＯＩＲ誘導病理学的血管新生を改善した。血管密度、新生血管タフトおよび血管分岐点の定量化は、抗Ｓｃｇ３が、ＯＩＲ誘導血管新生を有意に抑制したことを示した（図４Ａ～４Ｄ）。類似の治療効果は、アフリベルセプトの場合も観察された。これらのデータは、ＰＤＲ患者ならびにＲＯＰ患者に対する抗Ｓｃｇ３の治療可能性を示している。

【0113】

考察
比較リガンドミクス。リガンド結合活性を全体的に定量化する定量的リガンドミクスの信頼性は、米国特許出願第１４／７０８，０７３号でさらに考察されている。この特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。比較リガンドミクスを、病気状態で改変結合を有する疾患関連リガンドの系統的記述に適用した。ＤＲに対する抗Ｓｃｇ３療法の実証の成功は、この手法の有用性を裏付けた。まとめると、これらの知見は、比較リガンドミクスによる内在性リガンドの結合活性のプロファイリングは、疾患関連リガンドを系統的に特定するための強力な手法であり、疾患関連リガンドの病原性寄与および治療可能性を規定するように拡張でき、状況に依存して疾患発病を加速または遅延させ得ることを示した。

【0114】

比較リガンドミクスの大きな利点を、ＤＲ高発現Ｓｃｇ３により実証した。健康な細胞における比較的低結合活性を有する疾患高発現リガンドは、従来のリガンドスクリーニング手法では、見落とす可能性が高い。その結果、Ｓｃｇ３は、血管新生因子としては報告されてこなかった。比較リガンドミクス分析は、疾患高発現リガンドを効率的に選別し、続けて、健康なおよび疾患細胞または状態における追加の機能的分析を行うことができる。

【0115】

Ｓｃｇ３は、リガンドミクスにより、糖尿病および健康な網膜中にそれぞれ、１，７３１コピーおよび０コピーを含む、ＤＲ高発現リガンドとして特定された（表２）。これらの数は、ＮＧＳにより分析された配列合計数に基づいて、同時に、増加または低下する。したがって、健康な網膜内皮に対する低減したＳｃｇ３結合は、Ｓｃｇ３受容体の絶対的非存在を示すものではなく、むしろ、その比較的低い発現を示唆するものと思われる。実際に、統計的に有意ではないにしても、弱いＳｃｇ３血管新生活性が、健康な角膜中でインビボ血管新生アッセイで検出された（Ｓｃｇ３対ＰＢＳ）。さらに、Ｓｃｇ３は、比較的高用量で、ＨＵＶＥＣを刺激でき、非糖尿病ＥＣのＳｃｇ３による調節が、その他の機能アッセイにより検出できることを示唆している。

【0116】

ＤＲ関連血管新生リガンドとしてのＳｃｇ３。Ｓｃｇ３の機能的役割は、明確になっておらず、内分泌および神経内分泌細胞中の分泌顆粒生合成およびホルモンペプチド分泌の制御因子として、大きく特徴付けられてきた（Ｈｏｓａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｊｏｕｒｎａｌ．２０１０；５７（４）：２７５－８６）。しかし、分泌されたＳｃｇ３は、何らかの細胞を外因的に調節するためのリガンドとして記載されて来なかった。本実施例は、Ｓｃｇ３がＤＲ関連血管新生因子であることを発見した。糖尿病網膜漏出およびＯＩＲ誘導網膜血管新生の抗Ｓｃｇ３治療は、Ｓｃｇ３がこれらの２つの疾患モデルにおける病原性リガンドであり、ＤＭＥおよびＰＤＲの抗血管新生療法のための有望な標的であることを示した。限られた治療選択肢のために、１つの抗ＶＥＧＦ薬物への反応が不十分なＤＭＥ患者は、作用機序が類似であるにもかかわらず、別のＶＥＧＦ阻害剤に切り替えられることが多い。異なるシグナル伝達経路を標的とする抗血管新生療法の開発は、抗ＶＥＧＦ耐性ＤＲの代替または併用療法を容易にするであろう。

【0117】

別々の血管新生活性パターンに基づいて、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦは、異なる受容体シグナル伝達経路を有することが示された。ＶＥＧＦは３つの受容体、ＶＥＧＦＲ１、２および３を有する。最初の２つの受容体は、眼の血管新生の発病で重要な役割を果たし（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００１；１１４（Ｐｔ ５）：８５３－６５）、一方、ＶＥＧＦＲ３は、リンパ脈管新生に関与する（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９５；９２（８）：３５６６－７０）。実験は、Ｓｃｇ３がＶＥＧＦＲ１および２に結合しないことをタンパク質プルダウンおよびＥＬＩＳＡにより独立に確認した。いくつかの血管新生因子はＶＥＧＦ発現を誘導し得るので（Ｍａｔｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７；６（１２）：１９５１－９）、Ｓｃｇ３がＶＥＧＦ発現を発現上昇させないこと、または逆も同じであることをさらに確認した。これらのデータは、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦは、異なる血管新生活性領域を有することを示し、それらの阻害剤によりＤＲに対する代替または併用療法を支持した。

【0118】

抗Ｓｃｇ３療法のその他の潜在的利点は、最小限の副作用および柔軟な投与経路である。単一ＶＥＧＦアレルの欠失を有するマウスの胎仔致死性（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８０（６５７３）：４３９－４２）と対照的に、Ｓｃｇ３遺伝子（すなわち、１Ｂ１０７５遺伝子、Ｓｃｇ３ブロッカーに１００％等価）のホモ接合欠失を有するマウスは正常な表現型を示し（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９（２）：３９５－９）、抗Ｓｃｇ３療法は、最小限の副作用を有し得ることを示唆する。抗血管新生療法の可能な臨床適用は、疾患発症の前のＤＭＥ／ＰＤＲの予防である（Ｊｅｇａｎａｔｈａｎ ＶＳ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１；１２（３）：３６９－７２）。しかし、硝子体内注射関連および無関係の有害作用により、抗ＶＥＧＦ療法は、ＤＭＥ／ＰＤＲの予防に対し、限られたベネフィット・リスク比を有する。最小限の副作用を有する全身性抗Ｓｃｇ３療法は、ベネフィット・リスク比を改善し、ＰＤＲ／ＤＭＥの予防のための可能性を開くことができる。ルセンティスと同様に、Ｓｃｇ３中和ｍＡｂは、抗Ｓｃｇ３療法の基礎から臨床への移行のためにヒト化できる。

【0119】

ＶＥＧＦは、胎児および新生児段階での血管および網膜発生にとって非常に重要である。ＶＥＧＦ受容体１または２のホモ接合欠失を有するマウスは、子宮中で死亡する（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９５；３７６：６６－７０；Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９５；３７６：６２－６６）。同様に、単一ＶＥＧＦアレルの欠失を有するマウスは、胎児期致死性である（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８０；４３９－４４２）。全てのＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲノックアウトマウスでは、早死には、脈管形成の重度障害に起因し、これは、次に、胚形成に影響を与える。未熟児におけるＲＯＰの抗ＶＥＧＦ療法は、有害副作用と関連付けられてきた（Ｂｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０１６；４０：１８９－２０２；Ｌｅｐｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．２０１４；１２１：２２１２－２２１９）。効力および安全性の不確定性に起因して（Ｓａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ．Ｒｅｖ．２０１６；２：ＣＤ００９７３４）、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＲＯＰ治療用としては承認されなかった。本実施例は、抗Ｓｃｇ３療法がＯＩＲに対し高い効力を有することを確立した。Ｓｃｇ３の高い疾患選択性は、抗Ｓｃｇ３療法が正常な血管に対し最小限の副作用を有し得ることを示す。この考えは、Ｓｃｇ３遺伝子（すなわち、１Ｂ１０７５遺伝子、Ｓｃｇ３ブロッカーに１００％等価）のホモ接合欠失を有するマウスの報告された正常表現型により裏付けられ（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：３９５－３９９）、脈管形成および胚形成に対する最小限の有害作用を示唆する。図４の結果は、抗Ｓｃｇ３抗体が、高い効力と安全性を有する、ＲＯＰのための有望な薬物療法剤であることを示す。

【0120】

まとめると、比較リガンドミクスによる高スループットスクリーニングを実施し、疾患関連リガンドを系統的に特定した。Ｓｃｇ３は、糖尿病の血管系で選択的に血管新生を誘導するが健康な血管系では誘導しない、特有の血管新生因子として、およびＤＭＥ、ＰＤＲ、およびＲＯＰの抗血管新生療法の有望な標的として特徴付けられた。抗Ｓｃｇ３抗体は、ＯＩＲ誘導される病理学的網膜血管新生を顕著に軽減し、抗Ｓｃｇ３療法がＤＭＥおよびＰＤＲを治療し、加えて、ＲＯＰに対する高い効力と安全性を有する最初の薬物療法になり得ることを示す。

【0121】

実施例２
ＣＮＶのための抗Ｓｃｇ３療法
材料および方法
抗体。親和性精製抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂをＰｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）から入手した。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ（クローン４９およびクローン７８、マウスＩｇＧ１）を生成し、無血清ハイブリドーマ馴化培地からプロテインＧカラムを使って精製した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１３８（１）：６０－６）。全ての抗体をＡｍｉｃｏｎ遠心力フィルターユニット（１０ｋＤａカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）中でリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。

【0122】

細胞培養。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は以前に記載されている（ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４）。ヒト網膜毛細血管内皮細胞（ＨＲＭＶＥＣ）ならびに血清含有完全クラシック培地キットおよびＣｕｌｔｕｒｅＢｏｏｓｔをＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）から入手した（ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２０１６；２２：３７４－８６）。ヒトＶＥＧＦ１６５および抗ＶＥＧＦ抗体をＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。アフリベルセプトは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で製造された。４～８継代のＨＲＭＶＥＣを、Ｓｃｇ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）または培地対照と共に、９６ウェルプレート中で抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂの存在下または非存在下で、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載のように、培養した。各ウェル中の細胞を４８時間でトリプシン消化により集め、定量した。

【0123】

スフェロイド発芽アッセイ。ＨＵＶＥＣを用い、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載されているようにしてアッセイを実施した。 手短に説明すると、１．２％（ｗ／ｖ）のメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＥＢＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）中に溶解することによりメトセル溶液を調製し、５，０００ｘｇ、４℃で２時間遠心分離してデブリを除去した。８０％コンフルエンスで細胞を採取し、計数して、２０％のメトセルおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ＥＢＭ－２培地に再懸濁し、非接着性９６ウェル丸底プレートに７５０個細胞／ウェルで播種し、２４時間培養した。スフェロイドを採取し、フィブリノーゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ）およびアプロチニン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）含有ＥＢＭ－２培地に再懸濁し、２４ウェルプレートに播種した（約５０スフェロイド／ｍｌ／ウェル）。トロンビン（１２単位／ｍｌ）を各ウェルに添加することにより凝血を誘導した。スフェロイド包埋フィブリンゲルを室温で５分間、その後、３７℃で２０分間凝血させた。０．０５ｍｇ／ｍｌのアプロチニン含有基礎培地中で、フィブリンゲルをＳｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に４８時間インキュベートした。位相差顕微鏡を使って写真を取得し、平均発芽長さをＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）で定量化した。

【0124】

Ｓｒｃ活性化。Ｓｒｃ活性化を、ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（５）：ｅ０１２７９０４に記載のように検出した。ＨＲＭＶＥＣを、０．２％ＦＢＳ補充ＥＢＭ－２培地中で一晩インキュベートして、他の成長因子の影響を減らした。細胞をＳｃｇ３またはＰＢＳと共に、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ含有または非含有ＥＢＭ－２培地中、３７℃で１０分間インキュベートし、溶解し、リン酸化Ｓｒｃ（Ｐ－Ｓｒｃ）、Ｓｒｃまたはβ－アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）に対する抗体を使って、ウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロットシグナルをデジタル化した。

【0125】

Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦ発現。ＨＲＭＶＥＣを６ウェルプレートに播種し、Ｓｃｇ３、ＶＥＧＦまたはＰＢＳと共に、２％ＦＢＳ補充ＥＢＭ－２培地中で４８時間インキュベートした。洗浄後、細胞を収集し、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂおよび抗ＶＥＧＦ抗体を用いて、ウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロットシグナルをデジタル化した。

【0126】

レーザー誘導ＣＮＶの治療。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齡、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、以前に記載のようにレーザー光凝固に供し（アルゴンレーザー、５３２ｎｍ、１００ｍＷ、１００ｍｓ、１００μｍ、４スポット／網膜）、ＣＮＶを０日目に誘導した（ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２０１６；２２：３７４－８６）。脈絡膜出血を有する病変および線状病変または融合病変を、Ｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１４；５５（１０）：６５２５－３４に記載のように、除外した。３日目に、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、対照ＩｇＧ、抗Ｓｃｇ３ クローン４９ ｍＡｂ（０．３６μｇ／１μｌ／眼）、アフリベルセプト（２μｇ／１μｌ／眼）またはＰＢＳを硝子体内に注射した。マウス中の２μｇ／眼のアフリベルセプトは、それらの相対的硝子体体積を基準にして、ｎＡＭＤ療法の場合のヒトの２ｍｇ／眼と同等である。７日目に、フルオレセインナトリウム（０．１ｍｌ、２．５％）の腹腔内注射を受けたマウスの、注射の６分後のフルオレセイン血管造影法により、ＣＮＶ漏出を分析した。レーザースポットの強度をＩｍａｇｅＪを使って定量化した。８日目に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）－脈絡膜層－強膜複合体の眼杯を単離し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８－イソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして、共焦点顕微鏡により分析した（ＬｅＢｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｖｉｓ．２０１６；２２（３７４－８６）；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（３）：ｅ０１２０５８７）。 ＣＮＶ ３Ｄ体積をｚ－スタック画像からデコンボリューションし、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェアを用いて定量化した。各病変の最大ＣＮＶ ｚ－スタック画像の領域サイズおよびその蛍光強度を定量化し、ＩｍａｇｅＪを使って、ＣＮＶサイズおよび血管密度を決定した。データをＰＢＳ対照に対し正規化した。

【0127】

マトリゲル誘導ＣＮＶの治療。成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）をＰＢＳで１：４に希釈し、０日目に、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０；５１（１１）：６００９－１７に記載のように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齡、０．８ｌ／網膜）の網膜下腔に注射した。０、２および４日目に、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、ウサギ対照ＩｇＧ、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂ、マウス対照ＩｇＧ１（抗ｃ－Ｍｙｃ、クローン９Ｅ１０）（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ，ＩＡ）、アフリベルセプトまたはＰＢＳを皮下に注射した。人的バイアスを避けるために、試薬を盲検法試験として符号化した。７日目に、フルオレセイン血管造影法を実施し、上記のようにＣＮＶ漏出を分析した。

【0128】

統計分析。データを平均±ＳＥＭとして表し、１元配置分散分析検定により分析した。Ｐ＜０．０５の差異を有意と見なした。

【0129】

結果
新規血管新生因子としてのＳｃｇ３のインビトロ特性評価。３Ｄ内皮のスフェロイド発芽アッセイを実施して、Ｓｃｇ３のインビトロ血管新生活性を特徴付けた。結果は、Ｓｃｇ３がＨＵＶＥＣの新芽形成を有意に刺激することを示した（Ｐ＜０．００１、図１Ｉ）。陽性対照として、ＶＥＧＦは、類似の内皮新芽形成を誘導し（Ｐ＜０．０１）、Ｓｃｇ３が血管新生因子であることをさらに裏付けた。

【0130】

中和ｐＡｂを用いたレーザー誘導ＣＮＶの抗Ｓｃｇ３療法。ＣＮＶ発病に対するＳｃｇ３の可能な寄与を調査するために、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂによるマウスのＣＮＶを軽減する能力を分析した。マウスのＣＮＶをレーザー光凝固により誘導した。抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、対照ＩｇＧ（０．３６μｇ／眼）またはアフリベルセプト（２μｇ／眼）を光凝固の３日後に硝子体内に注射した。７日目のフルオレセイン血管造影は、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂがアフリベルセプトと類似の効力でＣＮＶ血管漏出を有意に低減することを示した（Ｐ＜０．０５、図５Ａおよび５Ｂ）。眼杯中のＣＮＶ血管をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８－イソレクチンＢ４で標識し、共焦点顕微鏡により分析した。抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂは、ＣＮＶのサイズを顕著に縮小した。ＣＮＶ ３Ｄ体積、病変面積および血管密度の定量化により、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂがアフリベルセプトと類似の効力でＣＮＶを有意に抑制することが明らかになった（図５Ｄ～５Ｅ）。

【0131】

中和ｍＡｂを用いたレーザー誘導ＣＮＶの抗Ｓｃｇ３療法。親和性精製にもかかわらず、複数のエピトープを認識する抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂは、オフターゲット効果により、他のタンパク質に非特異的に結合し得る。モノクローナル抗体は、他のタンパク質と最小限の交差反応しかせず、したがって、標的検証ならびに治療のための選択的試薬として十分に評価できる。抗Ｓｃｇ３クローン４９ ｍＡｂの中和活性を特徴付けるために、Ｓｃｇ３がＨＲＭＶＥＣの増殖を有意に誘導すること（Ｐ＜０．０５）およびそのｍＡｂがＳｃｇ３誘導される増殖を抑制すること（Ｐ＜０．０５、図６Ａ）が実証された。これらの結果は、Ｓｃｇ３が、内皮細胞の増殖を促進する血管新生因子であること、およびクローン４９ ｍＡｂがＳｃｇ３中和抗体であることを確信させた。さらに、シグナル伝達調査は、Ｓｃｇ３がＨＲＭＶＥＣ中のＳｒｃキナーゼのリン酸化を有意に刺激すること（Ｐ＜０．０５）、およびクローン４９ ｍＡｂがＳｃｇ３誘導Ｓｒｃ活性化を阻止すること（Ｐ＜０．０５、図６Ｂおよび６Ｃ）を明らかにした。クローン４９ ｍＡｂを用いたデータは、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂの治療活性は、Ｓｃｇ３がＣＮＶ発病における重要な役割を果たすことを実証し、ＣＮＶの抗血管新生療法のための有望な標的であることを確信させた。

【0132】

マトリゲル誘導ＣＮＶの抗Ｓｃｇ３療法。Ｓｃｇ３の病原性の役割を検証するために、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１０；５１（１１）：６００９－１７に記載のように、マトリゲル（０．８μｌ／網膜）を網膜下腔に注射してＣＮＶを誘導することにより、別のＣＮＶのマウスモデルを生成した。硝子体内注射の副作用を回避するために、このＣＮＶモデルで全身性抗Ｓｃｇ３療法の概念実証について調べた。０、２および４日目に、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂ、クローン４９またはクローン７８ ｍＡｂ、対照ウサギＩｇＧ、マウスＩｇＧ１マウスＩｇＧ１（２５μｇ／ｋｇ体重）、アフリベルセプト（２５０μｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを皮下に注射した。フルオレセイン血管造影は、抗Ｓｃｇ３ ｐＡｂがマトリゲル誘導ＣＮＶを有意に防止した（Ｐ＜０．０１、ウサギ対照ＩｇＧに対して）ことを示した（図７Ａおよび７Ｂ）。結果は、クローン４９ ｍＡｂ（Ｐ＜０．０１、対照マウスＩｇＧ１に対して）（図７Ａおよび７Ｂ）およびクローン７８ ｍＡｂ（Ｐ＜０．０５、対照ＩｇＧに対して）（図７Ｃおよび７Ｄ）で独立に立証された。陽性対照として、アフリベルセプトもまた、マトリゲル誘導ＣＮＶを有意に抑制した（図７Ｂ）。

【0133】

Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦ発現の交差調節。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）などの多くの血管新生因子が、ＶＥＧＦ発現を上方制御できる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９９；５９（７）：１４６４－７２；Ｓｅｇｈｅｚｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８；１４１（７）：１６５９－７３；Ｍａｉｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００；６０（２０）：５８７９－８６）。したがって、それらは、ＶＥＧＦを介して血管新生を間接的に促進し得る。この可能性を調査するために、ＨＲＭＶＥＣ中のＶＥＧＦ発現に対するＳｃｇ３の効果を分析した。結果は、Ｓｃｇ３はＶＥＧＦ発現を上方制御しない、または逆もまた同じであることを示した（図８Ａ～８Ｃ）。陽性対照として、ＶＥＧＦは、以前にＫｗｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１１；２８６（５０）：４２８６３－７２で報告されているように、自身の発現を有意に促進した（Ｐ＜０．００５）。これらの結果は、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦが相互の発現を調節できないことを示した。

【0134】

考察
この調査は、Ｓｃｇ３をＣＮＶにおける血管新生因子として、および有望なｎＡＭＤ療法の標的として特徴付けた。他の血管新生因子と比較して、Ｓｃｇ３はその疾患関連性の理由で、独特である。Ｓｃｇ３は正常な血管に結合しない、またはその血管新生を誘導しない。したがって、抗Ｓｃｇ３療法は、ＣＮＶ血管に対して比較的高い選択性を有するはずである。さらに、Ｓｃｇ３（すなわち、１Ｂ１０７５遺伝子、Ｓｃｇ３阻害に１００％等価）遺伝子を除去したマウスは、正常な表現型を有し（３７）、抗Ｓｃｇ３が正常血管および他の細胞に対し最小限の副作用を有し得ることを示唆している。実際に、過剰の高用量でのＳｃｇ３中和ｍＡｂの硝子体内注射は網膜毒性がないこと、および高濃度のクローン４９ ｍＡｂは、ＦＩＴＣアネキシンＶ標識を用いて検出可能なＨＲＭＶＥＣのアポトーシスを誘導しないことが明らかになった。これらの知見は、ＣＮＶの全身性抗Ｓｃｇ３療法に可能性を開くものである。図７の結果は、高効力を有する、マトリゲル誘導ＣＮＶの全身性抗Ｓｃｇ３療法を実証している。柔軟な投与経路を有する抗Ｓｃｇ３は、眼の硝子体内注射関連有害作用を回避するであろう。この実施例は、皮下注射によるＣＮＶの全身性抗Ｓｃｇ３療法を概念実証として示したが、全身療法に対する効力を最大化するために、異なる選択肢、例えば、異なる注射部位、持続放出製剤およびペグ化抗体による半減期の延長などが探索されるであろう。

【0135】

抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂおよびアフリベルセプトの両方は、レーザーまたはマトリゲル誘導ＣＮＶを顕著に回復させ、５０％を超える抑制がなされた。さらに、機構的調査は、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦの両方がＥＲＫ１／２キナーゼを活性化することを示した。重要な問題点は、Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦが、ＣＮＶの堅牢な抑制およびＥＲＫ１／２の活性化のために、同じ受容体経路を共有するかどうかということであった。Ｓｃｇ３はＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合しないということがわかった。さらに、ＶＥＧＦは、Ａｋｔキナーゼおよびシグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）を活性化するが、Ｓｃｇ３はそれらを活性化しなかった。この調査は、Ｓｃｇ３はＶＥＧＦ発現を上方制御し得ない、または逆もまた同じであることをさらに明らかにした（図８Ａ）。まとめるとこれらの結果は、Ｓｃｇ３がＶＥＧＦとは独立したシグナル伝達機序を有する血管新生因子であることを示し、代替療法またはそれらの阻害剤とのｎＡＭＤの併用療法のための分子的機序を提供した。Ｓｃｇ３およびＶＥＧＦは、別々の細胞内のシグナル伝達経路を活性化する異なる受容体を有し得、これは、最終的に、いくつかの共通のシグナル伝達分子（例えば、ＥＫＲ１／２）に収束して、血管新生を調節する。したがって、Ｓｃｇ３の阻害剤との併用療法は、ＣＮＶ療法の効力を相乗的にまたは付加的に改善する可能性を有し得る。

【0136】

まだ探求されていない領域は、ｎＡＭＤの予防療法である。例えば、片側の眼に、ＡＭＤになりやすい遺伝子、喫煙歴、ドルーゼンまたはＣＮＶを有する患者は、ｎＡＭＤを発症する高いリスクがある。注射関連有害作用のために、硝子体内の抗ＶＥＧＦ療法は、ＣＮＶ発症前のｎＡＭＤ予防に対して、比較的低いベネフィット・リスク比を有する。最小限の副作用を有する全身性抗Ｓｃｇ３療法であれば、この比を改善し、それにより、高リスク群の患者のｎＡＭＤを予防する可能性を開くであろう。したがって、Ｓｃｇ３は、ｎＡＭＤの治療および予防のための有望な標的である。

【0137】

実施例３
癌のための抗Ｓｃｇ３療法
比較リガンドミクス分析は、Ｓｃｇ３が、マウスの網膜芽細胞腫に１９８コピーが結合し、正常な網膜にはゼロコピーが結合することが明らかになった（図９Ａ）。ヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞（２ｘ１０^６細胞／マウス）を免疫不全ＮＳＧマウスの側面乳房体中に移植した。約１６０ｍｍ^３のサイズに腫瘍成長後、マウスを抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂクローン４９または対照マウスＩｇＧ１（５ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内の注射により処理した。腫瘍サイズを定量後、合計４種の処理による次の処理を実施した。

【0138】

抗Ｓｃｇ３抗体で処理した動物は、対照マウスＩｇＧで処理したマウスに比べて、有意により小さい腫瘍体積を示した（図９Ｂ）。対照ＩｇＧで処理した腫瘍と比較すると、腫瘍増殖は抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂによる最初の処理後、有意に低下した。追加の抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂによる処理は、測定した全ての時点で、腫瘍増殖を有意に抑制した。体重減少、食欲減退、被毛の逆立ちまたは呼吸困難などの副作用の臨床徴候は観察されず、抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂは最小限の副作用であることが実証された。

【0139】

前述の実施例は、Ｓｃｇ３は、正常な血管では最小限の結合活性および血管新生活性を有するが、複数の血管疾患の場合には、その結合活性および血管新生活性を顕著に上方制御することを示す。血管発生および網膜発生とって不可欠であるＶＥＧＦとは対照的に、Ｓｃｇ３は、正常な血管および網膜形態形成では、最小限の役割しか果たさない。Ｓｃｇ３遺伝子のホモ接合欠失を有するマウスは、正常な表現型を有すると報告されたが（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９（２）：３９５－９）、一方で、単一ＶＥＧＦアレルの欠失を有するマウスは、胎児期致死性である（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９６；３８０（６５７３）；４３９－４４２）。抗Ｓｃｇ３ ｍＡｂを含む抗Ｓｃｇ３療法は、ＤＲ、ＣＮＶ／ＰＣＶを有するｎＡＭＤ、ＲＯＰ、および癌に関連する症状を治療するのに効果的であり、現在の抗ＶＥＧＦ療法選択肢に対する有望な代替療法を提供する。

【0140】

本明細書で引用された全ての出版物および特許出願は、あたかもそれぞれの出版物または特許出願が具体的かつ個々に、参照により組み込まれると示されるように参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にする目的で図および例を用いて詳細に記載されているが、本開示の教示に照らして、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正を行ってもよいことは、当業者に容易に明らかとなろう。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【配列表】

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