特許 7136490 レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-05

(45)【発行日】2022-09-13

(54)【発明の名称】レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/28 20060101AFI20220906BHJP

   G01N 1/04 20060101ALI20220906BHJP

【ＦＩ】

G01N1/28 G

G01N1/28 J

G01N1/04 X

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020539421

(86)(22)【出願日】2019-08-23

(86)【国際出願番号】 JP2019033087

(87)【国際公開番号】W WO2020045291

(87)【国際公開日】2020-03-05

【審査請求日】2021-03-05

(31)【優先権主張番号】P 2018159784

(32)【優先日】2018-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度国立研究開発法人科学技術振興機構研究成果展開事業（先端計測分析技術・機器開発プログラム）開発課題「ＬＣ－ＭＳ対応質量分析イメージング前処理装置の開発」の委託研究の産業技術力強化法１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(74)【代理人】

【識別番号】100167689

【弁理士】

【氏名又は名称】松本 征二

(72)【発明者】

【氏名】澤田 誠

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０５３０３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１６３３８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１０－０８１８８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－１７０９３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００５／０２６８１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／０２６８１２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １／００ー １／４４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ダイセクションレーザー光を照射することで試料を採取するレーザーマイクロダイセクション装置であって、
該レーザーマイクロダイセクション装置は、
ダイセクションレーザー光を照射するためのレーザー照射部と、
前記レーザー照射部から照射されたダイセクションレーザー光を平行光にする第１レンズと、
前記平行光の周辺部分の光を遮蔽する絞り部と、
前記絞り部で絞った平行光を集光する第２レンズと
を含む、レーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項2】

光路調整部材
を更に含む、請求項１に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項3】

試料を載置することができ、前記試料を移動することができる試料移動装置と、
採取した試料を回収するための熱溶融性フィルムを含むデバイスを載置することができ、載置した前記デバイスを移動することができるデバイス移動装置と、
を更に含む、請求項１に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項4】

試料を載置することができ、前記試料を移動することができる試料移動装置と、
採取した試料を回収するための熱溶融性フィルムを含むデバイスを載置することができ、載置した前記デバイスを移動することができるデバイス移動装置と、
を更に含む、請求項２に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項5】

前記試料移動装置が水平方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向及び垂直方向に移動する、
または、
前記試料移動装置が水平方向及び垂直方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向に移動する、
請求項３に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項6】

前記試料移動装置が水平方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向及び垂直方向に移動する、
または、
前記試料移動装置が水平方向及び垂直方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向に移動する、
請求項４に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項7】

ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料を回収する箇所のデバイスの位置座標を関連付けて記憶する記憶装置と、
前記記憶装置に記憶された試料の位置座標及びデバイスの位置座標に基づき、前記試料移動装置及び前記デバイス移動装置を駆動制御する移動装置駆動制御部と、
を更に含む、請求項５に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項8】

ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料を回収する箇所のデバイスの位置座標を関連付けて記憶する記憶装置と、
前記記憶装置に記憶された試料の位置座標及びデバイスの位置座標に基づき、前記試料移動装置及び前記デバイス移動装置を駆動制御する移動装置駆動制御部と、
を更に含む、請求項６に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。

【請求項9】

請求項１～８の何れか一項に記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。

【請求項10】

レーザーマイクロダイセクション装置を用いた試料の採取方法であって、
該試料の採取方法は、
レーザー照射部からダイセクションレーザー光を照射する照射工程と、
前記照射工程で照射されたダイセクションレーザー光を平行光にするダイセクションレーザー光平行工程と、
前記ダイセクションレーザー光平行工程で平行化した平行光の周辺部分を遮蔽する絞り工程と、
前記絞り工程で絞った平行光を集光する集光工程と、
熱溶融性フィルムを含むデバイスと試料を密着した状態で、前記集光工程で集光したダイセクションレーザー光をデバイスおよび試料に照射して試料をデバイスに採取する試料採取工程と、
を含む、試料の採取方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願における開示は、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法に関する。特に、試料片から小さなサイズの試料を精度よくデバイスに採取できるレーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、生命科学の研究では、ある分子が生体試料のどの場所に存在しているのか、又、生体試料中の興味のある場所にどのような分子が存在しているのかを精度よく分析することが求められている。

【0003】

生体試料を分析する際には、試料を採取して単に分析するのではなく、顕微鏡により観察している試料にどの様な分子が含まれているのかを併せて表示する質量分析イメージングが要望されている。当該要望を実現する装置としては、顕微鏡で生体試料を観察し、そして、生体試料を質量分析することができる質量顕微鏡が市販されている。

【0004】

また、本発明者らは、（１）レーザーマイクロダイセクション装置に搭載したオンライン連動座標再現ステージ（測定試料の固定装置）を改良し、座標再現機能ソフトウェアを改造することで、空間分解能を向上できること、（２）座標再現機能を用いて位置決定をしているため、連続する組織切片間の位置情報を正確に再現でき、３次元での質量分析イメージングも実現できること、を見出し特許出願している（特許文献１および２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開第２０１５／０５３０３９号公報

【文献】国際公開第２０１６／１６３３８５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上記特許文献１および２に記載されている技術を用いることで、生体試料の近接した部分を連続的に分析することができる。ところで、生体試料をより詳細に分析するためには、小さなサイズの生体試料を精度よく連続的に採取できることが望ましい。現状のレーザーマイクロダイセクション装置では、生体試料に照射するダイセクションレーザー光（以下、「レーザー光」と記載することがある。）の照射条件を調整することで、採取する試料のサイズを調整している。

【0007】

しかしながら、現状のレーザーマイクロダイセクション装置では、小さな試料（数μｍレベル）を採取する場合、レーザー光の照射条件を調整しても（１）試料が採取できない、あるいは、（２）所期のサイズより大きな試料が採取されてしまう、という問題がある。

【0008】

本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたものであり、鋭意研究を行ったところ、（１）レーザー照射部から照射されたレーザー光を一度平行光にし、（２）平行光の周辺部分の光を遮蔽することで平行光を絞り、（３）絞った光を集光して試料に照射することで、従来と比較して、採取したい試料のサイズが小さくても、精度よく試料を採取できること、を新たに見出した。

【0009】

すなわち、本出願における開示の目的は、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本出願における開示は、以下に示す、レーザーマイクロダイセクション装置、レーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置、および、試料の採取方法に関する。

【0011】

（１）ダイセクションレーザー光を照射することで試料を採取するレーザーマイクロダイセクション装置であって、
該レーザーマイクロダイセクション装置は、
ダイセクションレーザー光を照射するためのレーザー照射部と、
前記レーザー照射部から照射されたダイセクションレーザー光を平行光にする第１レンズと、
前記平行光の周辺部分の光を遮蔽する絞り部と、
前記絞り部で絞った平行光を集光する第２レンズと
を含む、レーザーマイクロダイセクション装置。
（２）光路調整部材
を更に含む、上記（１）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（３）試料を載置することができ、前記試料を移動することができる試料移動装置と、
採取した試料を回収するための熱溶融性フィルムを含むデバイスを載置することができ、載置した前記デバイスを移動することができるデバイス移動装置と、
を更に含む、上記（１）または（２）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（４）前記試料移動装置が水平方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向及び垂直方向に移動する、
または、
前記試料移動装置が水平方向及び垂直方向に移動し、前記デバイス移動装置が水平方向に移動する、
上記（３）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（５）ダイセクションレーザー光を照射する箇所の試料の位置座標及び採取試料を回収する箇所のデバイスの位置座標を関連付けて記憶する記憶装置と、
前記記憶装置に記憶された試料の位置座標及びデバイスの位置座標に基づき、前記試料移動装置及び前記デバイス移動装置を駆動制御する移動装置駆動制御部と、
を更に含む、上記（４）に記載のレーザーマイクロダイセクション装置。
（６）上記（１）～（５）の何れか一つに記載のレーザーマイクロダイセクション装置を含む分析装置。
（７）レーザーマイクロダイセクション装置を用いた試料の採取方法であって、
該試料の採取方法は、
レーザー照射部からダイセクションレーザー光を照射する照射工程と、
前記照射工程で照射されたダイセクションレーザー光を平行光にするダイセクションレーザー光平行工程と、
前記ダイセクションレーザー光平行工程で平行化した平行光の周辺部分を遮蔽する絞り工程と、
前記絞り工程で絞った平行光を集光する集光工程と、
熱溶融性フィルムを含むデバイスと試料を密着した状態で、前記集光工程で集光したダイセクションレーザー光をデバイスおよび試料に照射して試料をデバイスに採取する試料採取工程と、
を含む、試料の採取方法。

【発明の効果】

【0012】

本出願で開示するレーザーマイクロダイセクション装置は、従来と比較して、採取したい試料が小さい場合でも、所期のサイズの試料を精度よく採取できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａの概略を示す図である。

【図2】図２は、試料の採取原理を説明するための図である。

【図3】図３は、第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａが、従来と比較して、小さなサイズの試料を精度よく採取できる原理を説明するための図である。

【図4】図４は、第２の実施形態に係るＬＭＤ１ｂの概略を示す図である。

【図5】図５は、試料の採取方法の第１の実施形態のフローチャートである。

【図6】図６は、第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃの概略を示す図である。

【図7】図７は、記憶装置と移動装置駆動制御部の概略について説明するための図である。

【図8】図８は、図面代用写真で、レーザー光照射後のホットメルトフィルムスライドの位相差写真である。円がレーザー光により溶融した箇所である。

【図9】図９Ａ～９Ｄは、図面代用写真で、実施例１において、図９Ａは試料の写真、図９Ｂは図９Ａの拡大写真で矢印部分が切り出す試料部分（ミトコンドリア）、図９Ｃは設定した照射条件でホットメルトフィルムスライドにレーザー光を照射した時の位相差写真、図９Ｄは試料をホットメルトフィルムスライドに採取した時の写真である。

【図10】図１０は、図面代用写真で、比較例１において、試料を採取した後の写真である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、図面を参照しつつ、レーザーマイクロダイセクション装置（以下、「ＬＭＤ」と記載することがある。）、ＬＭＤを含む分析装置、および、試料の採取方法の各実施形態について、詳しく説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。

【0015】

（ＬＭＤの第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａの概略を示す図である。ＬＭＤ１ａは、レーザー光Ｌを照射するためのレーザー照射部２と、レーザー照射部２から照射されたレーザー光Ｌを平行光にする第１レンズ３と、平行光Ｌの周辺部分の光を遮蔽する絞り部４と、絞り部４で絞った平行光Ｌを集光する第２レンズ５と、を少なくとも含んでいる。

【0016】

レーザー照射部２は、試料Ｓと後述するデバイスにレーザー光を照射し、試料Ｓをデバイスに採取できれば特に制限はない。例えば、半導体レーザー（ＧａＡｓ）等の赤外線レーザー、Ｎ₂レーザー等の紫外線レーザーが挙げられる。

【0017】

第１レンズ３は、レーザー照射部２から照射されたレーザー光Ｌを平行光にすることができれば特に制限はなく、コリメーターレンズ等が挙げられる。

【0018】

絞り部４は、平行光Ｌの周辺部分を遮蔽することができれば特に制限はない。例えば、平行光Ｌの断面が略円形状の場合、平行光Ｌの断面の直径より小さな直径を有する板部材が挙げられ、具体的には、カメラ等の光学機器に用いられている絞りを用いればよい。なお、絞り部４は、絞り機能があれば他の機能を併せ持つ部材を用いてもよい。例えば、絞り機能とレーザー光Ｌの光束を拡張する機能を有するビームエクスパンダー等を用いることもできる。

【0019】

第２レンズ５は、絞り部４で絞った平行光Ｌを集光することができれば特に制限はなく、例えば、対物レンズが挙げられる。

【0020】

次に、図１乃至図３を参照して、第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａが、従来のＬＭＤと比較して、小さなサイズの試料を精度よく採取できる原理を説明する。先ず、図２を参照して、試料の採取原理を説明する。第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａは、熱溶融性フィルムを含むデバイス７と試料Ｓを密着させ、両者が密着した状態でレーザー光Ｌを照射することで、デバイス７の熱溶融性フィルムが溶融し、溶融したフィルム部分が試料を剥ぎ取ることで、所期の部分の試料をデバイス７に採取できる。ところで、図３Ａに示すように、レーザー照射部２から照射されるレーザー光は、レーザー光の中心の強度が大きく、中心から離れるほど強度が小さくなり、且つ、レーザー光の周辺部分の強度の減少具合は緩やかになる。そのため、レーザー照射部２から照射されたレーザー光を単に対物レンズ等で集光した場合は、図３Ａに示す強度分布のレーザー光をそのまま集光することになる。したがって、デバイス７および試料Ｓに照射するレーザー光の強度は位置によるばらつきが大きくなる。

【0021】

一方、第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａは、レーザー照射部２から照射されたレーザー光Ｌを第１レンズ３で一度平行光にする。次に、絞り部４で平行光の周辺部分を遮蔽することで、図３Ｂに示すように、強度の減少具合が緩やかになる周辺部分の光が絞られたシャープな強度分布を有するレーザー光が得られる。そして、絞ったレーザー光を第２レンズ５で集光することで、従来と比較して、強度のばらつきが少なく、且つ、照射領域とそれ以外の領域で強度が明確に異なるレーザー光Ｌを、デバイス７および試料Ｓに照射できる。したがって、設定した採取試料のサイズと実際に採取した試料のサイズの解離を小さくできる。

【0022】

絞り部４で絞るレーザー光の量は、レーザー照射部２から照射される光の質（強度分布）に応じて適宜決めればよい。また、絞り部４で絞った光の量が多い場合、換言すると、第２レンズ５で集光するレーザー光の量が少ない場合は、必要に応じてレーザー照射部２の出力を調整すればよい。

【0023】

（ＬＭＤの第２の実施形態）
図４を参照して、第２の実施形態に係るＬＭＤ１ｂの概略を説明する。第２の実施形態に係るＬＭＤ１ｂは、光路調整部材６を備える点で第１の実施形態に係るＬＭＤ１ａと異なり、その他の点では、第１の実施形態と同様である。なお、本明細書において「光路調整部材」とは、レーザー照射部２から照射されたレーザー光の進行方向を変更できる部材、及び／又は、レーザー光の進行をガイドする部材を意味する。光路調整部材６は、レーザー光の進行方向を変更及び／又はガイドできるものであれば特に制限はなく、例えば、光ファイバー、ミラー、或いは、ミラーを組合わせたミラー系等が挙げられる。図４に示す例では、絞り部４と第２レンズ５との間に光ファイバー６が配置されているが、光源２と第１レンズ３の間に配置してもよい。また、図示は省略するが、ミラー、ミラー系を配置してもよい。第２の実施形態に係るＬＭＤ１ｂは、光路調整部材６を備えるため、ＬＤＭ１ｂを構成する部材の配置の自由度が向上する。

【0024】

（試料の採取方法の第１の実施形態）
図５を参照して、ＬＭＤ１ａおよびＬＭＤ１ｂを用いた試料の採取方法の第１の実施形態について説明する。図５は試料の採取方法の第１の実施形態のフローチャートである。

【0025】

図５に示すように、試料の採取方法の第１の実施形態は、照射工程（ＳＴ１）と、ダイセクションレーザー光平行工程（ＳＴ２）と、絞り工程（ＳＴ３）と、集光工程（ＳＴ４）と、試料採取工程（ＳＴ５）と、を含む。照射工程（ＳＴ１）では、レーザー照射部２からダイセクションレーザー光を照射する。ダイセクションレーザー光平行工程（ＳＴ２）では、照射工程（ＳＴ１）で照射されたダイセクションレーザー光を平行光にする。絞り工程（ＳＴ３）では、ダイセクションレーザー光平行工程（ＳＴ２）で平行化した平行光の周辺部分の光を遮蔽する。集光工程（ＳＴ４）では、絞り工程（ＳＴ３）で絞った平行光を集光する。そして、試料採取工程（ＳＴ５）では、デバイス７と試料Ｓが密着した状態で、集光工程（ＳＴ４）で集光したダイセクションレーザー光Ｌを照射することでデバイス７を溶融し、その後、デバイス７と試料Ｓを分離する際に溶融したデバイスが試料Ｓを剥ぎ取ることで、試料Ｓをデバイス７に採取できる。

【0026】

（ＬＭＤの第３の実施形態）
図６を参照して、第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃの概略を説明する。第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃは、デバイス移動装置２０、試料移動装置２１、を更に含む点で、第１および第２の実施形態に係るＬＭＤ１ａ、１ｂと異なり、その他の点では同様である。

【0027】

図６は、第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃ（図６中の点線で囲った部分）の概略を示す図である。図６に示す例では、デバイス移動装置２０、試料移動装置２１に加え、試料を観察するための光を照射する光源２２、画像を取得するためのＣＣＤ等の撮像装置２３を含んでいる。なお、第１レンズと絞り部は、レーザー照射部２と第２レンズ５の間に設けられている。図６に示す例では、ダイセクションレーザー光をデバイスの下方から照射するため、レーザー照射部２は、デバイス移動装置２０より下方に配置されている。また、図示は省略するが、第３の実施形態では、記憶装置及び移動手段駆動制御部を含んでいてもよい。

【0028】

第３の実施形態では、熱溶融性フィルムを含むデバイス７と試料Ｓを密着する動作を自動化している。デバイス移動装置２０は、デバイスを載置することができ、載置したデバイス７を移動できれば特に制限はない。例えば、図示は省略するが、デバイス移動装置２０は、デバイス７を載置することができるデバイス載置台と、デバイス載置台を水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に移動するための駆動原及び該駆動原の駆動力をデバイス載置台に伝達する駆動力伝達機構を含んでいる。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、顕微鏡等に使われているデバイス（チップ）載置台を水平方向に駆動するための駆動力伝達機構等、公知のものを用いればよい。

【0029】

試料移動装置２１は、試料Ｓが載置したスライドを載置することができ、載置した試料Ｓを移動できれば特に制限はない。例えば、図示は省略するが、試料Ｓを載置したスライドを一端に載置することができ他端はアーム支柱に取り付けることができるアーム、該アームを水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）に回転及び垂直方向（Ｚ軸方向）に移動することができるアーム支柱で構成すればよい。アームを水平方向に回転及び垂直方向に移動するためには、駆動原及び該駆動原の駆動力を伝達してアームを回転及び垂直方向に移動するための駆動力伝達機構を設ければよい。駆動原としては、パルスモーター、超音波モーター等を用いればよい。また、駆動力伝達機構は、例えば、自動分析装置のサンプル移動用のアーム機構等、水平方向に回転及び垂直方向に移動することができる公知のアーム機構を用いればよい。

【0030】

なお、図６に示す例では、デバイス移動装置２０の上方に試料移動装置２１が設けられているが、ＬＭＤ１ｃの構成要素の配置は、適宜変更してもよい。例えば、試料移動装置２１の上方にデバイス移動装置２０を設けてもよい。その場合は、例えば、試料移動装置２１が水平方向に移動し、デバイス移動装置２０が水平方向及び垂直方向に移動するように構成してもよい。また、レーザー照射部２をＬＭＤ１ｃの上方に設け、試料Ｓおよびデバイス７の上方からレーザー光Ｌを照射してもよい。或いは、光ファイバー等の光学系を用いることで、レーザー照射部２を配置した位置とは反対方向からレーザー光Ｌを照射できるようにしてもよい。

【0031】

デバイス７は、レーザー光Ｌを照射することで、照射した部分に密着している試料Ｓを採取試料として回収できるものであれば特に制限はないが、試料Ｓの加熱変性を防止するとの観点から、融点が約５０－７０℃程度の熱溶融性フィルムを含むことが好ましい。熱溶融性フィルムとしては、例えば、エチルビニルアセテート（ＥＶＡ）、ポリオレフィン、ポリアミド、アクリル、ポリウレタン等が挙げられる。デバイス７は、熱溶融性フィルムのみで形成してもよいし、熱溶融性フィルムを加工したものでもよい。例えば、熱溶融性フィルム表面に撥水性インキを印刷することで、熱溶融性フィルム表面に親水領域と疎水領域を形成してもよく、熱溶融性フィルムを基板上に塗布することで、デバイス７を形成してもよい。また、必要に応じて、熱溶融性フィルムには、レーザー光源の波長域のスペクトルを選択的に吸収するため、ナフタレンシアニン染料等の有機染料等、用いるレーザー照射部２の波長域に応じて好適な有機染料を添加してもよい。

【0032】

また、図示は省略するが、第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃは、デバイス７の熱溶融性フィルムと試料を密着するための押圧デバイスを設けてもよい。押圧デバイスの詳細は、国際公開公報第２０１６／１６３３８５号公報を参照することができる。

【0033】

図７を参照して、記憶装置と移動装置駆動制御部の概略について説明する。記憶装置は、レーザー光を照射する箇所の試料Ｓの位置座標及び採取試料を回収する箇所のデバイス７の位置座標を関連付けて記憶する。また、移動装置駆動制御部は、記憶装置に記憶された試料Ｓの位置座標及びデバイス７の位置座標に基づき、試料移動装置及びデバイス移動装置を駆動制御する。例えば、図７Ａの試料Ｓから、ａ、ｂ、ｃのように試料を連続的に切り出す場合、（ｉ）デバイス移動装置２０により、デバイス７をレーザー光が照射される位置に移動する。（ｉｉ）次に、試料移動装置２１により、試料Ｓのａに示す位置の試料が図７Ｂに示すデバイス７の採取試料ａを回収する箇所ａ’に重なる位置に移動する。（ｉｉｉ）次に、試料移動装置２１を垂直方向に移動することで試料Ｓとデバイス７を密着させる。なお、デバイス移動装置２０と試料移動装置２１の配置関係によっては、デバイス移動装置２０を垂直方向に移動してもよい。（ｉＶ）レーザー光Ｌを照射することで、試料Ｓのａの箇所から採取した試料をデバイス７のａ’の位置に回収し、次いで、試料移動装置２１（デバイス移動装置２０）を垂直方向に移動することで試料Ｓをデバイス７から離し、デバイス７の予め決められた箇所に、採取試料ａを回収する。採取試料ｂ、ｃについても、上記（ｉ）～（ｉＶ）の手順を繰り返せばよい。図７に示す方法により、採取する前の個々の試料の間隔（Ａμｍ）より、デバイス７に回収する試料の間隔（Ｂμｍ）を大きくした場合、分析の空間分解能を向上することができる。第３の実施形態に係るＬＭＤ１ｃを用いた試料の採取方法は、図５に示す試料採取工程（ＳＴ５）において、デバイス移動装置２０および試料移動装置２１を用いて試料Ｓとデバイス７を密着する以外は、試料の採取方法の第１の実施形態と同様である。

【0034】

ＬＭＤ１を含む分析装置（分析方法）としては、切り出した試料を分析できれば特に制限はない。例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＨＰＬＣ－蛍光分光機、ＨＰＬＣ－電気化学的検出器等のクロマトグラフィーを含む分析装置；電子線マイクロアナライザ；Ｘ線光電子分光装置等の元素分析装置；ＰＣＲまたはＬＣＲで遺伝子を増幅しシークエンサーを用いて試料に含まれるＤＮＡ配列の解析を行う核酸配列分析装置；試料に含まれる核酸を鋳型にＤＮＡをハイブリダイズするＤＮＡチップ、タンパク質に抗体を反応させる抗体チップ等のマイクロチップ分析装置；等が挙げられる。分析装置は、図１に示すように、ＬＭＤ１で採取した試料を分析できるように、ＬＭＤ１と一体化すればよい。

【0035】

第１～第３の実施形態に示すＬＭＤ１は、上記のとおり、比較的均一なレーザー光を照射できる。したがって、試料の採取以外にも、レーザーアブレーションによる治療装置、加工装置等にも用いることができる。

【0036】

以下に実施例を掲げ、実施形態を具体的に説明するが、本願で開示する発明の範囲を限定、あるいは制限することを表すものではない。

【実施例】

【0037】

＜実施例１＞
〔ＬＭＤの作製〕
以下の部材を用いて、ＬＭＤを作製した。なお、各部材は、（１）～（６）の順にレーザー光が進むように配置した。
（１）レーザー照射部２：半導体レーザードライバー（Ｌｕｍｉｘ社製、ＤＳ１１－ＬＡ０４Ｖ０６）
（２）光路調整部材６：光ファイバー（ソーラボ社製、ＰＡＦ－Ｘ－７－Ｂ）
（３）第１レンズ３：調整可能型ＦＣコリメータ（ソーラボ社製、ＣＦＣ－２Ｘ－Ｂ）
（４）光路調整部材６：高安定型キネマティックミラーホルダー（オプトシグマ社製、ＭＨＧ－ＨＳ３０－ＮＬ）
（５）絞り部４：５～１０倍可変ガリレイビームエキスパンダ（ソーラボ社製、ＢＥ０２－０５－Ｂ）
（６）第２レンズ５：対物レンズ１０，２０，５０，１００倍（オリンパス社製、ＬＭＰｌａｎＦＬ）

【0038】

〔試料の調整〕
以下の手順により、レーザーマイクロダイセクション用の試料を調整した。
（１）試料として、ＯＳ３グリア前駆細胞株（理研細胞バンク ＲＣＢ１５９３）を使用した。
（２）Ｐ１ ｄｉｓｈに、十分に洗浄し乾熱滅菌処理したカバースリップ３枚を入れた。
（３）１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／Ｐ１の濃度で、ＯＳ３細胞を播きこんだ。
（４）Ｍｉ ｍｅｄｉｕｍ中で４日間培養した。（Ｍｉ ｍｅｄｉｕｍ：ＭＥＭ ｍｅｄｉｕｍ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ １０％ＦＢＳ、０．２％ ｇｌｕｃｏｓｅ、５ｍｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ）
（５）Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｏｒａｎｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｍ７５１１）２５０ｎＭを添加し、１時間インキュベーションした。
（６）ミトコンドリアが標識されたことを顕微鏡下で確認した。
（７）レーザーマイクロダイセクション用として、カバースリップに付着したＯＳ３細胞を以下のようにサンプリングした。
（８）培養液を捨て、カバースリップをＰＢＳで１回洗浄した。
（９）カバースリップを、７０％エタノールに室温で１０ｍｉｎ浸漬することで、カバースリップ上の細胞を固定した。
（１０）固定した細胞を、１００％エタノールで１ｍｉｎ処理を２回実施し、脱水処理を行った。
（１１）キシレンで２ｍｉｎ処理を２回実施し、脱水処理を行った。

【0039】

〔試料の採取〕
（１）レーザー光の照射条件の調整
試料を採取するデバイスには、スライドガラス上に熱溶融性樹脂がコーティングされたホットメルトフィルムスライド（東洋ケム社製、ＳＧ－１００スライド、（ＮＵ－０７９））を用いた。
作製したＬＭＤの対物レンズを１００倍に設定した。次に、実際に試料を採取する前に、ＬＭＤのレーザー照射部２のパワーを調整しながらホットメルトフィルムスライドに集光したレーザー光を照射した。図８は、レーザー光照射後のホットメルトフィルムスライドの位相差写真で、円がレーザー光の照射により溶融した箇所である。レーザー照射部２のパワーを調整することで、ホットメルトフィルムスライドの溶融する大きさが変化することを確認した。
実施例１において、採取試料であるミトコンドリアの大きさは、約１．２μｍである。したがって、ホットメルトフィルムスライドが溶融する大きさが約１．２μｍとなるレーザー光の照射条件を、試料を約１．２μｍの大きさで採取する照射条件とした。具体的には、レーザーパワー２０％（１．５６Ｖ、１３８ｍＡ）、レーザー照射時間１５ｍｓｅｃ／１回、照射回数１回を、実施例１のレーザー光の照射条件とした。
（２）試料（ミトコンドリア）の採取
上記〔試料の調整〕で作製した試料とホットメルトフィルムスライドを密着し、上記（１）で設定した照射条件で、レーザー光をフィルム側から照射した。図９Ａは試料の写真、図９Ｂは図９Ａの拡大写真で矢印部分が切り出す試料部分（ミトコンドリア）、図９Ｃは設定した照射条件でホットメルトフィルムスライドにレーザー光を照射した時の位相差写真、図９Ｄは試料をホットメルトフィルムスライドに採取した時の写真である。図９Ｃおよび図９Ｄに示すように、実施例１のＬＭＤを用いて試料を採取すると、設定した大きさとほぼ同じ大きさの試料を、ホットメルトフィルムスライドに採取できることを確認した。

【0040】

＜比較例１＞
〔ＬＭＤの作製〕
実施例１の第１レンズ３、絞り部４を使用しなかった点、及び第２レンズ５（対物レンズ）の倍率以外は、実施例１と同様の手順でＬＭＤを作製した。

【0041】

〔試料の採取〕
（１）レーザー光の照射条件の調整
実施例１と同様の手順で、ホットメルトフィルムスライドが溶融する大きさが約１．２μｍとなるレーザー光の照射条件及び対物レンズを調整した。具体的には、対物レンズ１０倍、レーザーパワー３０％（０．１４Ｖ、１４５ｍＡ）、レーザー照射時間３ｍｓｅｃ／１回、照射回数１回を、比較例１の照射条件とした。
（２）試料（ミトコンドリア）の採取
実施例１と同様の手順で試料の採取を行った。図１０は比較例１で採取した試料の写真である。図１０から明らかなように、実施例１と同様に位相差写真でホットメルトフィルムが約１．２μｍ溶融した照射条件でレーザー光を照射しても、比較例1の場合は、採取した試料の大きさは約８．５μｍで、実施例１と比較して大きくなった。

【0042】

＜比較例２＞
〔試料の採取〕
（１）レーザー光の照射条件の調整
図８に示すように、位相差写真では、ホットメルトフィルムが溶融した周囲にはハローと呼ばれる、熱が伝わった部分も観察されている。したがって、比較例２では、ハロー部分も含めた直径が約１．２μｍとなるレーザー光の照射条件を調整した。具体的には、対物レンズ１００倍、レーザーパワー３０％（０．１４Ｖ、１４５ｍＡ）、レーザー照射時間３ｍｓｅｃ／１回、照射回数１回を、比較例２のレーザー光の照射条件とした。

【0043】

（２）試料（ミトコンドリア）の採取
比較例１と同様の手順で試料の採取を行った。しかしながら、比較例２では、試料を採取できなかった。

【0044】

以上のとおり、実施例１のＬＭＤを用いて試料を採取した時は、所期のサイズの試料を採取できた。これは、図２Ｂに示すように、周辺部分を遮蔽した後で集光したレーザー光をデバイスおよび試料に照射したことから、レーザー光の照射領域内の強度は比較的均一で、且つ、レーザー光の照射領域とそれ以外では強度が明確に異なるため、所期の範囲のデバイスが溶融し、溶融した部分の試料を剥ぎ取ったためと考えられる。

【0045】

一方、比較例１では、所期のサイズより大きい試料が採取された。これは、図２Ａに示すように、比較例１のレーザー光は中心から周辺部分に向けて、強度が緩やかに弱くなるため、図２Ｂに示すように、レーザー光の照射領域とそれ以外の領域で強度を明確に区別することができない。そのため、図８の位相差写真に示す熱溶融性フィルムが溶解した範囲の外側にも、実際には中心部より弱いレーザー光が照射されている。そして、本来であれば、試料を剥ぎ取る程に溶融しない部分に、中心部に照射されたレーザー光による発熱の余熱が加わったため、所期の範囲より広範囲で試料を剥ぎ取る接着性が生じ、その結果、所期の大きさ以上の範囲の試料が採取されてしまったと考えられる。

【0046】

また、比較例２では、試料を採取できなかった。これは、ハローを含めたため、デバイスを溶融するのに必要なレーザー光のパワーが不足したためと考えられる。換言すると、従来のＬＭＤでは、単に対物レンズを用いてデバイスおよび試料に照射するレーザー光を小さくした場合、試料を採取できないことが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0047】

本出願で開示するＬＭＤは、サイズの小さな試料を精度よく採取できる。したがって、医療機関や大学医学部などの研究機関、一般病院等において、組織分析のための装置として利用が可能である。

【符号の説明】

【0048】

１、１ａ、１ｂ、１ｃ…レーザーマイクロダイセクション装置、２…レーザー照射部、３…第１レンズ、４…絞り部、５…第２レンズ、６…光路調整部材、７…デバイス、２０…デバイス移動装置、２１…試料移動装置、２２…光源、２３…撮像装置、Ｌ…ダイセクションレーザー光、Ｓ…試料

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】