特許 7138380 過酢酸の分解方法及びこれを用いた微生物の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-08

(45)【発行日】2022-09-16

(54)【発明の名称】過酢酸の分解方法及びこれを用いた微生物の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20220909BHJP

   C12N 1/12 20060101ALI20220909BHJP

   C12N 1/16 20060101ALI20220909BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20220909BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 J

C12N1/00 A

C12N1/12 A

C12N1/16 A

C12N1/20 A

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021538774

(86)(22)【出願日】2019-12-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-24

(86)【国際出願番号】 KR2019018348

(87)【国際公開番号】W WO2020141779

(87)【国際公開日】2020-07-09

【審査請求日】2021-06-30

(31)【優先権主張番号】10-2018-0174021

(32)【優先日】2018-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0172429

(32)【優先日】2019-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】521289227

【氏名又は名称】エヌ－セル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｎ－ＣＥＬＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】２７４， Ｓａｎｇｎｏ－ｇｉｌ， Ｗｏｎｎａｍ－ｍｙｅｏｎ Ｅｕｍｓｅｏｎｇ－ｇｕｎ Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｂｕｋ－ｄｏ ２７７２１ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】クォン ジョンヒ

(72)【発明者】

【氏名】チョ チャンホ

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００９７２９５（ＫＲ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／００４２２３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－１０７２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Bioprocess and Biosystems Engineering，Vol.41，2018年03月，pp.803-809

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

過酢酸を水と混合するステップと、
前記混合物に鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び糖を添加し且つ反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、
を含むことを特徴とする、過酢酸の分解方法。

【請求項2】

前記鉄イオンは、Ｆｅ^２＋イオンまたはＦｅ^３＋イオンであることを特徴とする、請求項１に記載の過酢酸の分解方法。

【請求項3】

前記糖は、グルコース、スクロース、または廃糖蜜であることを特徴とする、請求項１に記載の過酢酸の分解方法。

【請求項4】

前記糖の濃度は、１００ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする、請求項３に記載の過酢酸の分解方法。

【請求項5】

塩基性緩衝液をさらに添加することを特徴とする、請求項１に記載の過酢酸の分解方法。

【請求項6】

糖と窒素源とを含む培地に過酢酸を添加し、反応させて滅菌するステップと、
前記滅菌した培地に過酢酸分解促進剤として鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物及びＥＤＴＡを添加し、前記培地内において前記過酢酸と過酢酸分解促進剤を反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、
を含むことを特徴とする、培地の滅菌方法。

【請求項7】

前記鉄イオンは、Ｆｅ^２＋イオンまたはＦｅ^３＋イオンであることを特徴とする、請求項６に記載の培地の滅菌方法。

【請求項8】

前記糖は、グルコース、スクロース、または廃糖蜜であることを特徴とする、請求項６に記載の培地の滅菌方法。

【請求項9】

前記糖の濃度は、１００ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする、請求項６に記載の培地の滅菌方法。

【請求項10】

塩基性緩衝液をさらに添加することを特徴とする、請求項６に記載の培地の滅菌方法。

【請求項11】

バイオリアクターに前記請求項６の方法により滅菌された培地を添加するステップと、
前記添加された培地に微生物を接種し、純粋培養するステップと、
を含むことを特徴とする、微生物の培養方法。

【請求項12】

前記微生物は、オーランチオキトリウム属（オーランチオキトリウム ｓｐ．）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、デバルヨミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、酵母菌群（Ｙｅａｓｔｓ）、乳酸菌群（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、糸状菌群及び光合成細菌よりなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする、請求項１１に記載の微生物の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、過酢酸を水と混合するステップと、前記混合物に鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び糖を添加し且つ反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む過酢酸の分解方法及び該方法を用いた微生物の培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオ産業において様々な微生物を用いて有用な代謝産物を量産しようとする場合、培地とリアクターの滅菌がかなり肝要である。このため、従来は、微生物培養培地とリアクターを滅菌するためにオートクレーブ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）を主として用いていた。

【0003】

しかしながら、オートクレーブを用いて培地とリアクターを滅菌する場合、培地の糖成分が培地の他の成分の一つであるタンパク質（ペプトンまたは酵母抽出物）と高温で反応し、ヒドロキシメチルフルフラール（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｆｕｒｆｕｒａｌ；ＨＭＦ）などといった微生物の成長を妨げる虞がある毒性物質の発生を誘発して、微生物の生育を阻害するという問題点があり、微生物リアクターが金属やガラスなどの熱と圧力に強い材質から作製されなければならないという限界点がある。

【0004】

上記のような問題点及び限界点を克服するために、ろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をする方法が用いられているが、ろ過をする場合には、培養器それ自体を別途滅菌せねばならないという不便さがあり、ろ過の過程において目詰まり現象と再汚染現象が起こる危険性が高く、フィルターのサイズが制限的である他、高いコストがかかるが故に商業的に利用可能性が低いという問題点があった。このような問題点を解決するために、大韓民国公開特許公報第１０－２０１５－００９７２９５号に開示されているように、過酢酸（ｐｅｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＰＡＡ）を用いた滅菌方法が開発された。大韓民国公開特許公報第１０－２０１５－００９７２９５号は、光を必要とする微細藻類を純粋培養するに当たって、過酢酸を用いてフォトバイオリアクターを滅菌する方法を開示している。しかしながら、前記先行文献には、ＥＤＴＡと糖（グルコース、ショ糖、廃糖蜜など）によって過酢酸の分解効率を増加させることについての開示がなく、糖と窒素源（ペプトン、酵母抽出物、乳清など）を含む培地を滅菌する方法については全く開示されていない。

【0005】

また、過酢酸を用いてフォトバイオリアクターと培地を滅菌する方法において、培地成分に糖と窒素源とが含まれている場合、完全な滅菌のためには５ｍＭ以上の高濃度の過酢酸を使用しなければならず、特に、窒素源が添加された培地を一緒に滅菌する場合、過酢酸による窒素酸化物（ＮＯ^３－）が生成され、生成された窒素酸化物が鉄イオンと結合して過酢酸の分解のための触媒反応を阻害する。このような場合、過酢酸の自然分解と鉄と４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）による触媒反応だけでは、過酢酸反応物が完全に分解されるのに一か月以上の時間が求められる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、過酢酸と水とを混合するステップと、前記混合物に鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び糖を添加し且つ反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む過酢酸の分解方法を提供することである。

【0007】

本発明の他の目的は、糖と窒素源とを含む培地に過酢酸を添加し、反応させて滅菌するステップと、前記滅菌した培地に過酢酸分解促進剤として鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物及びＥＤＴＡを添加し、前記培地内において前記過酢酸と過酢酸分解促進剤を反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む培地の滅菌方法を提供することである。

【0008】

本発明のさらに他の目的は、バイオリアクターに前記培地の滅菌方法により滅菌された培地を添加するステップと、前記添加された培地に微生物を接種し、純粋培養するステップと、を含む微生物の培養方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記目的を達成するために、本発明は、過酢酸と水とを混合するステップと、前記混合物に鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び糖を添加し且つ反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む過酢酸の分解方法を提供する。

【0010】

また、本発明は、糖と窒素源とを含む培地に過酢酸を添加し、反応させて滅菌するステップと、前記滅菌した培地に過酢酸分解促進剤として鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物及びＥＤＴＡを添加し、前記培地内において前記過酢酸と過酢酸分解促進剤を反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む培地の滅菌方法を提供する。

【0011】

さらに、本発明は、バイオリアクターに前記培地の滅菌方法により滅菌された培地を添加するステップと、前記添加された培地に微生物を接種し、純粋培養するステップと、を含む微生物の培養方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明は、過酢酸の分解方法及び該方法を用いた微生物の培養方法に関するものであり、本発明の方法を用いて微生物を培養する場合、熱を用いることなくバイオリアクターと培地を完璧に滅菌することができ、滅菌された洗浄水の使用なしに化学的な滅菌剤として用いられた培地に存在する過酢酸を分解して効果的に除去することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】過酢酸の分解においてＥＤＴＡを添加しなかった場合、鉄イオンの凝集状態を顕微鏡で観察したものを示す図である。

【図2】過酢酸の分解においてＥＤＴＡを添加した場合、鉄イオンの凝集状態を顕微鏡で観察したものを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明について実施例により詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、単に本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が実施例により限定されることはない。

【0015】

実施例１：過酢酸の分解の確認
１Ｌのオーランチオキトリウム培地に１０．５２ｍＭになるように過酢酸（ドンミョンＯＮＣ社製、１６０１２６）を添加し、２時間反応させて滅菌した。前記過酢酸で滅菌した培地に９６μＭのＦｅＣｌ_３（Ｓｉｇｍａ社製、７７０５－０８－０）、５．５ｍＭのＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ社製、１３１０－７３－２）、９６μＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製、６０－００－４）、及び２０ｇ／Ｌのグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ社製、５０－９９－７）になるようにそれぞれの成分を添加し、１日間以上反応させて過酢酸とその反応物を最終的に酢酸、水、及び酸素に分解し、過酸化物テストスティックス（Ｑｕａｎｔｏｆｉｘ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ １００、マッハライ・ナーゲル社（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．，）製、ドイツ）で過酢酸の分解の有無を測定した。

【0016】

このとき、前記オーランチオキトリウム培地は、１Ｌを目安として、酵母抽出物（Ｓｉｇｍａ社製、８０１３－０１－２）２ｇ、ペプトン（Ｓｉｇｍａ社製、９１０７９－４０－２）２ｇ、Ｄ－グルコース（Ｓｉｇｍａ社製、５０－９９－７）２０ｇ、海水（ｓｅａｗａｔｅｒ）（韓国の南海）５００ｍＬ及び蒸留水５００ｍＬから構成されている（表５）。

【0017】

＜表５＞

【0018】

比較例１
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、ＥＤＴＡを添加しなかった。

【0019】

比較例２
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、グルコースを添加しなかった。

【0020】

実施例２～６：グルコース濃度の差
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、添加するグルコースの量をそれぞれ１０ｇ／Ｌ（実施例２）、３０ｇ／Ｌ（実施例３）、４０ｇ／Ｌまたは（実施例４）、５０ｇ／Ｌ（実施例５）、または６０ｇ／Ｌ（実施例６）とした。

【0021】

実施例７～１２：スクロース濃度の差
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、グルコースの代わりに、スクロースを、それぞれ１０ｇ／Ｌ（実施例７）、２０ｇ／Ｌ（実施例８）、３０ｇ／Ｌ（実施例９）、４０ｇ／Ｌ（実施例１０）、５０ｇ／Ｌ（実施例１１）、または６０ｇ／Ｌ（実施例１２）の量になるように添加した。

【0022】

比較例３～９
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、ＥＤＴＡを添加せず、ＦｅＣｌ_３の代わりにＣａＣｌ_２を添加（比較例３）し、ＥＤＴＡを添加し、ＦｅＣｌ_３の代わりにＣａＣｌ_２を添加（比較例４）し、ＥＤＴＡを添加せず、ＦｅＣｌ_３の代わりにＦｅＳＯ_４を添加（比較例５）し、ＥＤＴＡを添加せず、ＦｅＣｌ_３の代わりにＭｇＣｌ_２を添加（比較例６）し、ＥＤＴＡを添加し、ＦｅＣｌ_３の代わりにＭｇＣｌ_２を添加（比較例７）し、ＥＤＴＡを添加せず、ＦｅＣｌ_３の代わりにＺｎＣｌ_２を添加（比較例８）し、ＥＤＴＡを添加し、ＦｅＣｌ_３の代わりにＺｎＣｌ_２を添加（比較例９）した。

【0023】

実施例１３
実施例１の方法と同様にして実験を行ったが、ＦｅＣｌ_３の代わりにＦｅＳＯ_４を添加した。

【0024】

実験例１：ＥＤＴＡの効果
過酢酸の分解において、ＥＤＴＡの効果を確認するために、実施例１及び比較例１の方法と同様にして実験を行った。

【0025】

その結果、ＥＤＴＡを添加しなかった場合（比較例１、図１）には、ＥＤＴＡを添加した場合（実施例１、図２）に比べて、金属イオンである鉄イオンの溶解度が急激に低下して過酢酸の分解速度が著しく減速されることを確認することができた（表１）。

【0026】

また、ＥＤＴＡを添加した場合（実施例１、図２）に比べて、ＥＤＴＡを添加しなかった場合（比較例１）には、鉄イオンが他の高分子内において凝縮されて結合されていることを確認することができた（図１）。この結果は、ＥＤＴＡが存在する場合、鉄イオンが水溶性の状態で存在して過酢酸の分解の反応性が高くなるものの、ＥＤＴＡが存在しない場合、鉄イオンが水溶性の状態で存在しないか、あるいは、他の成分と結合して過酢酸分解の反応性が低くなることを示唆している。

【0027】

【表1】

【0028】

前記表中の数字は、存在する過酢酸の濃度を意味し、例えば、＞２００は、２００ｍｇ／Ｌ以上の過酢酸が残っていることを意味する。

【0029】

実験例２：グルコースの効果
過酢酸の分解において、グルコースの効果を確認するために、実施例１～６及び比較例２の方法と同様にして実験を行った。

【0030】

その結果、グルコースを添加しなかった場合、過酢酸がほとんど分解されなかったものの、添加するグルコースの量が増加するにつれて、過酢酸の分解速度が次第に速くなることを確認することができた（表２）。

【0031】

【表2】

【0032】

前記表中の数字は、存在する過酢酸の濃度を意味し、例えば、＞２００は、２００ｍｇ／Ｌ以上の過酢酸が残っていることを意味する。

【0033】

実験例３：スクロースの効果
過酢酸の分解において、スクロースの効果を確認するために、実施例７～１２及び比較例２の方法と同様にして実験を行った。

【0034】

その結果、糖を添加しなかった場合、過酢酸がほとんど分解されなかったものの、添加するスクロースの量が増加するにつれて、過酢酸の分解速度が次第に速くなることを確認することができた（表３）。

【0035】

【表3】

【0036】

前記表中の数字は、存在する過酢酸の濃度を意味し、例えば、＞２００は、２００ｍｇ／Ｌ以上の過酢酸が残っていることを意味する。

【0037】

実験例４：金属の効果
過酢酸の分解において、金属の効果を確認するために、実施例１、実施例１３及び比較例１、比較例３～９の方法と同様にして実験を行った。

【0038】

その結果、ＦｅＣｌ_３＋ＥＤＴＡまたはＦｅＳＯ_４＋ＥＤＴＡを添加した場合には過酢酸が十分に分解されたものの、ＣａＣｌ_２＋ＥＤＴＡ、ＭｇＣｌ_２＋ＥＤＴＡまたはＺｎＣｌ_２＋ＥＤＴＡを添加した場合には過酢酸がほとんど分解されず、ＦｅＣｌ_３、ＦｅＳＯ_４、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、またはＺｎＣｌ_２金属のみを添加し、かつ、ＥＤＴＡを添加しなかった場合には過酢酸がほとんど分解されないことを確認することができた（表４）。

【0039】

【表4】

【0040】

前記表中の数字は、存在する過酢酸の濃度を意味し、例えば、＞２００は、２００ｍｇ／Ｌ以上の過酢酸が残っていることを意味する。

【0041】

以下、本発明について詳しく説明する。

【0042】

本発明は、過酢酸と水とを混合するステップと、前記混合物に鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）及び糖を添加し且つ反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む過酢酸の分解方法を提供する。

【0043】

本発明において用いられた用語「滅菌（ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、微生物の栄養細胞及び胞子を死滅させることを意味する。

【0044】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、前記鉄イオンは、Ｆｅ^２＋イオンまたはＦｅ^３＋イオンであってもよく、前記鉄イオンは、ＦｅＣｌ_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４などのＦｅを含有する塩に由来したものであってもよい。

【0045】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、アルカリ金属の水酸化物は、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨまたはＫＯＨであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0046】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、前記アルカリ金属の水酸化物、例えば、ＮａＯＨを用いて過酢酸（ＰＡＡ）の分解に適したｐＨ値を容易に実現することができ、これにより、過酢酸の分解が早く起こることができる。

【0047】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）は、鉄イオンの溶解度を増加させ、鉄と他の物質との結合を防いで過酢酸の分解を促すことができる。

【0048】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、添加する鉄イオンのモル濃度がＥＤＴＡのモル濃度よりもわずかに高いかあるいは低い場合よりも、添加する鉄イオンとＥＤＴＡのモル濃度が互いに近似しているほど、過酢酸の分解速度がさらに速くなり、添加する鉄イオンとＥＤＴＡのモル濃度が同じである場合の方が、過酢酸の分解速度が最も速い。例えば、鉄イオンとＥＤＴＡのモル濃度比が１０：１、９：１、８：１．７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１であってもよく、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０であってもよい。反応の際に存在するＥＤＴＡの量が鉄イオンの量よりも多い場合、鉄イオンによるフェントン反応を妨げて鉄による過酢酸の分解機作を妨げる虞がある。

【0049】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、前記糖は、微生物の炭素源であって、グルコース、スクロース、または廃糖蜜（糖蜜）などであってもよいが、これに制限されるものではない。

【0050】

また、前記糖の濃度は、１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは、５～５０ｇ／Ｌであってもよい。

【0051】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、アルカリ金属の水酸化物の代わりに塩基性緩衝液を用いてもよく、あるいは、塩基性緩衝液をさらに添加してもよく、前記塩基性緩衝液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）であってもよい。

【0052】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、前記過酢酸は、水と反応して次のように反応して酢酸と過酸化水素を形成する。

【0053】

ｉ）ＣＨ_３ＣＯ_３Ｈ＋Ｈ_２Ｏ→Ｈ_２Ｏ_２＋ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ

【0054】

一方、過酢酸と水とが反応して生成された過酸化水素は、鉄イオンによりフェントン反応（Ｆｅｎｔｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）をして最終的に下記の反応式のように酢酸、水及び酸素に分解される。

【0055】

ｉｉ）２ＣＨ_３ＣＯ_３Ｈ→２ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ＋Ｏ_２

【0056】

ｉｉｉ）２Ｈ_２Ｏ２→２Ｈ_２Ｏ＋Ｏ_２

【0057】

本発明は、糖と窒素源とを含む培地に過酢酸を添加し、反応させて滅菌するステップと、前記過酢酸で滅菌した培地に過酢酸分解促進剤として鉄イオン、アルカリ金属の水酸化物、及びＥＤＴＡを添加し、前記培地内において前記過酢酸と過酢酸分解促進剤を反応させて過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解するステップと、を含む培地の滅菌方法を提供する。

【0058】

本発明の前記培地の滅菌方法において、滅菌した培地に存在する過酢酸及び過酢酸反応物を最終的に酢酸、水及び酸素に分解して滅菌に用いられた培地に存在する過酢酸と過酢酸反応物を除去することができ、これを通して製造された培地を微生物の培養に用いることができる。

【0059】

本発明の前記培地の滅菌方法において、前記培地は、酵母やオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）などを培養する場合のように、糖（グルコース、ショ糖、廃糖蜜など）と窒素源（ペプトン、酵母抽出物、乳清など）を必要とする培地であってもよい。

【0060】

本発明の前記培地の滅菌方法において、前記培地は、海水種、淡水種などの微細藻類を培養する場合のように、光（ｌｉｇｈｔ）を必要とする培地であってもよい。

【0061】

本発明の前記培地の滅菌方法において、前記鉄イオンは、Ｆｅ^２＋イオンまたはＦｅ^３＋イオンであってもよく、前記鉄イオンは、ＦｅＣｌ_３、ＦｅＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４などのＦｅを含有する塩に由来するものであってもよい。

【0062】

本発明の前記培地の滅菌方法において、アルカリ金属の水酸化物は、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨまたはＫＯＨであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0063】

本発明の前記過酢酸の分解方法において、前記アルカリ金属の水酸化物、例えば、ＮａＯＨを用いて過酢酸（ＰＡＡ）の分解に適したｐＨ値を容易に実現することができ、これにより、過酢酸の分解が早く起こることができる。

【0064】

本発明の前記培地の滅菌方法において、ＥＤＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）は、鉄イオンの溶解度を増加させ、他の構成成分との結合を防いで過酢酸の分解を促すことができる。

【0065】

本発明の前記培地の滅菌方法において、添加する鉄イオンのモル濃度がＥＤＴＡのモル濃度よりもわずかに高いかあるいは低い場合よりも、添加する鉄イオンとＥＤＴＡのモル濃度が互いに近似しているほど、過酢酸の分解速度がさらに速くなり、添加する鉄イオンとＥＤＴＡのモル濃度が同じである場合の方が、過酢酸の分解速度が最も速い。

【0066】

本発明の前記培地の滅菌方法において、前記糖は、グルコース、スクロース、または廃糖蜜（糖蜜）であってもよいが、これに制限されるものではない。

【0067】

また、前記糖の濃度は、１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは、５～５０ｇ／Ｌであってもよい。

【0068】

本発明の前記培地の滅菌方法において、アルカリ金属の水酸化物の代わりに塩基性緩衝液を用いてもよく、あるいは、塩基性緩衝液をさらに添加してもよく、前記塩基性緩衝液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）であってもよい。

【0069】

本発明の前記方法のようにして培地を滅菌すれば、中和するまでオートクレーブで滅菌しなくても、かつ、開放された容器においても汚れず、長期間にわたって保管することができるというメリットがある。

【0070】

本発明は、滅菌されたバイオリアクターまたはバイオリアクターに前記培地の滅菌方法により滅菌された培地を添加するステップと、前記添加された培地に微生物を接種し、純粋培養するステップと、を含む微生物の培養方法を提供する。

【0071】

本発明の前記微生物の培養方法において、前記微生物の例としては、オーランチオキトリウム属（オーランチオキトリウム ｓｐ．）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、デバルヨミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、酵母菌群（Ｙｅａｓｔｓ）、乳酸菌群（Ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａ）、放線菌群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、モルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）糸状菌群及び光合成細菌よりなる群から選ばれる一種以上が挙げられるが、これに限定されることはない。

【0072】

また、本発明は、バイオリアクターに糖と窒素源とを含む培地を入れ、過酢酸を添加し、反応させてバイオリアクターと培地を同時に滅菌する方法を提供する。

【0073】

本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地にＦｅＣｌ_３、ＮａＯＨ、ＥＤＴＡ、及びグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を添加し、１日間以上反応させた場合、過酢酸が最終的に酢酸、水、及び酸素に著しく速い速度で分解されることを確認した（実験例１）。

【0074】

但し、本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地にＥＤＴＡを除いてＦｅＣｌ_３、ＮａＯＨ、及びグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を添加し、１日間以上反応させた場合、過酢酸の分解速度が著しく減速されることを確認した（実験例１）。

【0075】

本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地にＦｅＣｌ_３、ＮａＯＨ、及びＥＤＴＡを添加し、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）の量を次第に増やして添加し、１日間以上反応させた場合、添加するグルコースの量が次第に増加するにつれて、過酢酸が最終的に酢酸、水、及び酸素に分解される速度が次第に増加することを確認することができた（実験例２）。

【0076】

但し、本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地にグルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）を除いてＦｅＣｌ_３、ＮａＯＨ、及びＥＤＴＡを添加し、１日間以上反応させた場合、過酢酸の分解速度が著しく減速されることを確認した（実験例２）。グルコースのような還元性糖が添加される場合、過酢酸により酸化された鉄を再び還元させることにより、鉄によるフェントン反応を活性化させて鉄による過酢酸の分解に一助となることができる。

【0077】

本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地にＦｅＣｌ_３、ＮａＯＨ、及びＥＤＴＡを添加し、グルコースの代わりにスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）の量を次第に増やして添加し、１日間以上反応させた場合、添加するスクロースの量が次第に増加するにつれて、過酢酸が最終的に酢酸、水、及び酸素に分解される速度が次第に増加することを確認した（実験例３）。

【0078】

本発明の一実施形態によれば、オーランチオキトリウム培地に過酢酸を添加し、２時間反応させて滅菌した培地に金属、ＮａＯＨ、グルコース及びＥＤＴＡを添加し、１日間以上反応させた場合、ＦｅＣｌ_３＋ＥＤＴＡまたはＦｅＳＯ_４＋ＥＤＴＡを添加した場合には過酢酸が十分に分解されたものの、ＣａＣｌ_２＋ＥＤＴＡ、ＭｇＣｌ_２＋ＥＤＴＡまたはＺｎＣｌ_２＋ＥＤＴＡを添加した場合には過酢酸がほとんど分解されず、ＦｅＣｌ_３、ＦｅＳＯ_４、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、及びＺｎＣｌ_２金属のみを添加し、かつ、ＥＤＴＡを添加しなかった場合には過酢酸がほとんど分解されないことを確認した（実験例４）。

【産業上の利用可能性】

【0079】

本発明の過酢酸の分解方法及び該方法を用いた微生物の培養方法を用いて微生物を培養する場合、熱を用いることなくバイオリアクターと培地を完璧に滅菌することができて、産業的に有用である。

【図1】

【図2】