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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-09
(45)【発行日】2022-09-20
(54)【発明の名称】Ｔ細胞レセプターとその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220912BHJP
A61K 35/26 20150101ALI20220912BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220912BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220912BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20220912BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220912BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220912BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220912BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220912BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220912BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
A61K35/26
A61P35/00
C07K14/705
C07K14/725 ZNA
C07K16/28
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12Q1/68
G01N33/53 D
G01N33/574 A
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021131926
(22)【出願日】2021-08-13
(62)【分割の表示】P 2017053317の分割
【原出願日】2017-03-17
(65)【公開番号】P2021184738
(43)【公開日】2021-12-09
【審査請求日】2021-08-17
(31)【優先権主張番号】P 2016055275
(32)【優先日】2016-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｃａ２０１６／、平成２８年９月２２日掲載 第７５回日本癌学会学術総会（日本癌学会）、上記ＷＥＢサイトで公開された要旨集
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２８年１０月６日開催、第７５回日本癌学会学術総会にて展示したポスター
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｃａ２０１５／、平成２７年９月１８日掲載 第７４回日本癌学会学術総会（日本癌学会）、上記ＷＥＢサイトで公開された電子抄録集
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２７年１０月８日開催、第７４回日本癌学会学術総会にて展示したポスター
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２７年１０月３０日発行、第４４回日本免疫学会学術集会抄録集
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｎ－ｅｋｉ．ｏｒｇ／ｍｅｎｅｋｉ＿ａｂｓｔｒａｃｔ＿ｊｉｍｕ／ａｂｓｔ＿ｓｅａｒｃｈ３．ｄｏ、平成２７年１１月１０日掲載 第４４回日本免疫学会学術集会、上記ＷＥＢサイトで公開された要旨集
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２７年１１月２０日開催、第４４回日本免疫学会学術集会にて展示したポスター
(73)【特許権者】
【識別番号】307014555
【氏名又は名称】北海道公立大学法人 札幌医科大学
(73)【特許権者】
【識別番号】390004097
【氏名又は名称】株式会社医学生物学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鳥越 俊彦
(72)【発明者】
【氏名】塚原 智英
(72)【発明者】
【氏名】廣橋 良彦
(72)【発明者】
【氏名】田路 真悟
(72)【発明者】
【氏名】中野 一絵
(72)【発明者】
【氏名】齊藤 尚吾
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１８０２１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ａ６１Ｋ ３５／２６
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ｃ０７Ｋ １４／７０５
Ｃ０７Ｋ １４／７２５
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（i) ～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプター（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる。
【請求項2】
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを認識する、請求項１に記載のＴ細胞レセプター。
【請求項3】
下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有する。
【請求項4】
下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質（i) 配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有する。
【請求項5】
請求項３及び４のうちのいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５に記載のＤＮＡを発現可能に含有するベクター。
【請求項7】
リンパ球に請求項５に記載のＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞。
【請求項8】
請求項３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入されたリンパ球であって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞。
【請求項9】
前記ＤＮＡが導入されるリンパ球が、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ／ＭＡ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＨＰＢ－ＭＬＴ、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５、又はＳｕｐ－Ｔ１である、請求項７又は８に記載の形質転換細胞。
【請求項10】
請求項７～９のうちのいずれか一項に記載の形質転換細胞を有効成分とする、ＰＢＦ陽性の癌を治療するための医薬組成物。
【請求項11】
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の分子に特異的に結合する抗体。（ａ）請求項３に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）請求項４に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）請求項１又は２に記載のＴ細胞レセプター
【請求項12】
請求項１又は２に記載のＴ細胞レセプターを結合して多量体化した分子。
【請求項13】
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、請求項１２に記載の分子を含む薬剤。
【請求項14】
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｅ）の少なくとも１つの構成要素を含むキット。（ａ）請求項１又は２に記載のＴ細胞レセプター
（ｂ）請求項３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、又は、請求項３に記載のタンパク質及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）請求項３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含有するベクター及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含有するベクター、又は、請求項３に記載のタンパク質及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に含有するベクター
（ｄ）リンパ球に、請求項３に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び請求項４に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入されてなる形質転換細胞
（ｅ）請求項１２に記載の分子
【請求項15】
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、該分子と請求項７～９のいずれかに記載の形質転換細胞との反応性を経時的に検証し、前記反応性が維持されている場合には、前記分子の品質が維持されていると評価し、一方、前記反応性が低下した場合には、当該分子の品質が劣化したと評価する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された癌抗原を認識する２種類のＴ細胞レセプター（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，以下、「ＴＣＲ」と称する）、及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された癌抗原の検出や癌治療等における当該ＴＣＲの利用に関する。
【背景技術】
【0002】
日本国内では、毎年約３６万人が癌により死亡しており、約８５万人が新規に癌と診断されている。癌治療は、手術・化学療法・放射線療法を中心とした標準治療が行われており、これらの治療後に改善が見られない場合は、癌に伴う様々な苦痛の除去を目的とした緩和医療に移る以外の選択肢はほぼ存在していない。このような日本の癌治療状況の中、患者本人あるいは患者の家族が更なる治療法を求めてさまよう姿は、「癌難民」と呼ばれて社会問題化している。
【0003】
近年、この標準治療と緩和医療の隙間を埋める位置付けで、癌ワクチン療法の研究が盛んに行われている。癌ワクチン療法は、患者自身の免疫力を活性化して癌を消滅あるいは退縮させることを目的に行われる治療であり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が２０１０年４月に承認したＰｒｏｖｅｎｇｅ（Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）も癌ワクチン療法の１つである。転移性でホルモン療法抵抗性の前立腺癌患者に対して承認されたＰｒｏｖｅｎｇｅは、前立腺癌の殆どで過剰発現しているＰＡＰ（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）タンパク質を用いて患者末梢血を刺激後、患者体内に移入する治療法である。癌ワクチン療法の成否は患者本来の免疫力に依存するため、様々な標準療法を受けて患者の症状が悪化する前に実施することができれば、より効果的に奏功すると考えられている。将来的には治療選択肢のひとつとして、また化学療法や放射線療法と併用可能な治療法として承認されることが望まれている。
【0004】
癌ワクチン療法は、抗原非特異的な治療法と抗原特異的な治療法の２つに大別される。抗原非特異的な免疫療法は、免疫賦活作用のあるビシバニルやクレスチン、結核死菌（ＢＣＧ－ＣＷＳ）等を用いて１９７０年代から始まった。１９８０年代にはＩＬ－２等のサイトカインを用いた免疫療法や、非特異的に増幅させたＴ細胞を患者体内に戻すＬＡＫ（リンフォカイン活性化キラー細胞）療法が行われてきたが、いずれも明確な臨床的効果を上げることができず、保険診療として認められることはなかった。
【0005】
１９９１年に患者から分離増幅させた細胞傷害性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、以下、「ＣＴＬ」と称する）が、癌細胞で高発現しているＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ）と呼ばれる癌抗原を特異的に認識し、癌細胞を殺傷することが報告された（非特許文献１）。また、１９９４年にはＣＴＬが、癌細胞表面上のＭＨＣ（主要組織適合性抗原、Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ、ヒトではＨＬＡと呼ばれる）に提示されたペプチド断片を認識して殺傷するメカニズムが報告された（非特許文献２）。その後、世界中の研究者によってＨＬＡに提示される様々なペプチド断片が同定された。１９９６年にはＡｌｔｍａｎらによって、特異的なＣＴＬを検出することが可能なＭＨＣテトラマー試薬が開発され（非特許文献３）、それまではクロムリリースアッセイ法により間接的にしか検証できなかったＣＴＬの検出を、ＴＣＲの立体構造より直接的に証明することが可能になった。１９９８年に報告されたメラノーマ（悪性黒色腫）を対象とする癌ペプチドワクチン療法は驚くべき臨床的成果を上げ、一気に癌免疫療法を開花させるに至った（非特許文献４）。その後、ペプチドを皮下あるいは皮内に接種する癌ペプチドワクチン療法は世界的な規模で進められている。
【0006】
２００４年に報告されたＲｏｓｅｎｂｅｒｇらの報告では、癌ワクチン療法の奏功率は期待されたよりも低く、臨床試験の対象が末期癌患者であることを考慮すべきとの報告がなされた（非特許文献５）。これは、ペプチドワクチンを接種後、患者体内で癌細胞を攻撃するＣＴＬが思惑通りに増幅されるかどうかは、患者自身の免疫力という要因に左右されるからである。したがって、化学療法や放射線療法で著しく免疫力が低下している状態では、当然奏効率も下がるであろうと考えられている。ペプチドワクチンを接種された患者では、その接種部位周辺に存在する抗原提示細胞と呼ばれる樹状細胞やマクロファージが、ペプチドを取り込んで細胞表面上のＭＨＣに提示することでＴ細胞を活性化し、さらに所属リンパ節へ抗原提示細胞がリクルートされてＴ細胞を活性化するステップが必要である。抗癌剤や放射線療法で免疫力が著しく低下した患者では、抗原提示細胞の数の減少や正常な機能の損失等も想定され、抗腫瘍効果が限定される一因と考えられている。そこで、抗原提示能が高い樹状細胞を体外で分離・誘導培養し、予め抗原を提示させた状態で患者に接種する樹状細胞療法が行われている。しかしながら、この方法を用いても、ペプチドワクチン療法と同様に、免疫力が低下した患者では体内のＴ細胞の量が不十分あるいは十分活性化されないという現象により、効果が限定される場合もあると考えられている。
【0007】
このようなペプチドワクチンや樹状細胞療法の欠点を補う目的で、体外で活性化させたＴ細胞を患者体内に戻すＣＴＬ移入療法が実施されている。この方法では血中に細胞を移入するため、専用の培養施設（ＣＰＣ、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）が必要になる。煩雑な細胞培養を繰り返すため、例えば自動培養装置等の開発も進んでいるが、体外で特異的なＣＴＬを如何に効率よく短期間で増幅させるかという非常に難易度の高い培養技術が必要である。
【0008】
Ｔ細胞はその細胞表面上に発現しているＴＣＲを介して、抗原提示細胞や癌細胞、ウィルス感染細胞等の標的細胞表面上に提示されているＭＨＣ分子と抗原ペプチドの複合体（以下、「ＭＨＣ／ペプチド複合体」と称する）を認識して結合することで作用する。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子／抗原ペプチドの複合体のみに結合し（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ拘束性）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞はＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子／抗原ペプチドの複合体のみにしか結合できない（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ拘束性）とされている。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子はほとんどの有核細胞と血小板に発現しているが、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は限られた一部の細胞しか発現していない。このためＣＤ４陽性Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現した樹状細胞やＢ細胞、活性化Ｔ細胞等とは結合できるが、これら以外の腫瘍細胞や感染細胞等には直接結合することができない。
【0009】
癌抗原特異的ＣＴＬ由来のＴＣＲ遺伝子は、末梢血リンパ球に導入することにより、特異的に癌を傷害できることが報告された（非特許文献６）。その後は特異的なＣＴＬから単離されたＴＣＲ遺伝子を末梢リンパ球に人為的に発現させ、人工的なＣＴＬを作製して患者体内に戻す、いわゆるＴＣＲ遺伝子治療が積極的に試みられている（非特許文献７）。ＣＴＬの強力な細胞傷害活性は抗腫瘍免疫において重要視されており、これを利用する方法のひとつとして、腫瘍抗原特異的なモノクローナル抗体の可変領域をＣＴＬに発現させた、可変領域キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を用いた遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）療法等が報告されている。その効果は実際にはモノクローナル抗体の性能に依存する部分が大きいが、急性リンパ性白血病等に対しては一定の効果が得られており、今後の更なる改善や生体内における安全な維持等に関して議論が行われている（非特許文献８）。
【0010】
近年のがん免疫療法に関する研究の進歩は特に目を見張るものがあり、その火付け役となったのは免疫チェックポイントを標的とした抗体医薬として知られる抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）である。抗ＰＤ－１抗体は免疫抑制すなわちブレーキの役割をするＰＤ－１を介したシグナル伝達を阻害することにより免疫抑制を解除し、癌に対する免疫応答をより効率的に誘導することが可能となる（非特許文献９、１０）。この成果は２０１３年、アメリカの科学雑誌サイエンスにおけるＢｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｒのトップを飾り、大きな注目を集めた。これまでの概念を覆し、癌の治療には免疫を無視することができないと言われるほどのインパクトを与え、国内では悪性黒色腫に関して２０１４年７月に製造販売が承認された。現在は肺癌や腎癌等に対する臨床試験が行われている。米国では同じく免疫チェックポイント阻害効果が期待される抗ＣＴＬＡ－４抗体（イピリブマブ）との併用療法にて腫瘍退縮効果が認められており、抗癌剤や放射線療法は勿論、癌ワクチン療法を含む他の免疫療法と抗ＰＤ－１抗体との併用療法にも期待が集まっている。現在は９種類のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１関連抗体医薬について臨床試験が実施されており（非特許文献１１、１２）、国内外において３０種類以上の癌に対して６０種類以上のＰＤ－１単剤あるいは他剤併用療法の臨床試験が開始されている。
【0011】
１９９１年、Ｂｏｏｎらにより悪性黒色腫抗原ＭＡＧＥタンパク質由来のペプチド断片（ＣＴＬエピトープ）が同定されて以来、癌、感染症、自己免疫疾患や移植に関連するＣＴＬエピトープが多数同定されている。同一のタンパク質由来のＣＴＬエピトープであっても、ＨＬＡ型によって提示されるペプチド断片の種類は異なり、一般にはＣＴＬエピトープのＨＬＡ拘束性と呼ばれている。近年、著しい技術の発展を見せる次世代シークエンサーを用いた解析により、腫瘍細胞に実際に起こっている変異に関しての網羅的な解析が可能となった。その結果、ＣＴＬがこの腫瘍特異的変異抗原を非常に良く認識して傷害することが報告され、変異の入りやすい癌に対しては変異抗原をターゲットとして免疫応答を活性化させることが非常に有効に働くことが示唆された。究極のオーダーメイド医療として、患者個人に特有の変異抗原由来のＣＴＬエピトープをコンピューターアルゴリズムで選択して接種する個別医療も考案され、事業化に向け既に稼働している（非特許文献１３）。しかし、変異の少ない癌においてはこの方法は対応しないため、癌の特徴に応じたＣＴＬエピトープを選択することが必要であると言える。
【0012】
このような現状より、癌ワクチン療法を行う上で、対象患者に対してどの癌抗原由来のＣＴＬエピトープを選択するかということは非常に重要なポイントである。ＣＴＬエピトープは、非常に多様性に富んだＨＬＡ型の中でも、人種間で広く保持されているＨＬＡ型の拘束を受けていることが望ましい。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２は日本人の６０～７０％が保有しており、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は欧米人の約５０％が保有し、日本人でも約２０％が保有するＨＬＡ型であるが、これは、他のＨＬＡ型頻度の多くが１０％にも満たないことを考えると非常に高頻度であることから、これらのＨＬＡ型に拘束を受けるＣＴＬエピトープの同定は非常に有意義である。
【0013】
対象患者でどの癌抗原に対するワクチン療法を実施すべきであるかという点については、ワクチン療法を開始する前に診断されることが望ましい。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性のｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドワクチン療法を行うには、まず対象患者のＨＬＡ型がＨＬＡ－Ａ＊２４：０２であることが必須条件となる。ＨＬＡ型検査は、臓器移植や骨髄移植では必須の検査であり、様々な施設で実施されている。また、標的となる癌細胞表面上にＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性のｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドが提示されていることがＣＴＬによる認識において必須であることから、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性のｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドワクチン療法を行うには、このことが証明されることが最も望ましい。しかしながら、現時点では直接的に証明する検査方法は存在せず、間接的な検査が行われている。例えばｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂの場合は、生検試料を用いて定量的ＰＣＲ法でｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ｍＲＮＡの発現量を確認する方法や、抗ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ抗体を用いて組織や細胞におけるｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂタンパク質の発現を確認する方法、抗ＨＬＡ抗体を用いてＨＬＡの発現を確認する方法が利用されている。直接的に証明するためのツールとして研究されているものには、ＭＨＣにペプチドが結合した状態を特異的に認識する抗体（以下、「抗ｐＭＨＣ抗体」と称する）や、ＴＣＲを利用したＴＣＲテトラマーや、１本鎖化したＴＣＲを利用したｓｃＴＣＲ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ＴＣＲ）マルチマー等が存在する。
【0014】
抗ｐＭＨＣ抗体に関しては、１９８９年にペプチドが提示されたＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを特異的に認識する抗体が報告され（非特許文献１４）、１９９７年にマウスのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子であるＨ－２ＫｂにＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）由来ペプチドが提示された状態を認識する抗体が報告され（非特許文献１５）、多くの研究者が同様の抗体を取得する試みを開始した。
【0015】
ＭＨＣ／ペプチド複合体を構成する分子は、分子量約４５ｋＤａのＭＨＣと、約１２ｋＤａのβ２ｍ（β２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が非共有結合した状態に、例えばＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉに提示されるペプチドであれば、８～１１個程度のアミノ酸が結合している。この提示されたペプチドの違いだけを特異的に認識する抗体をハイブリドーマ法で取得することは大変難しく、実際に、過去２０年間に数種類の抗体しか報告されていない。
【0016】
例えば、１９９６年に、免疫したマウス由来のライブラリーを使用したファージディスプレイ法によりＭＨＣ／ペプチド複合体に対する抗体を取得したという報告がある（非特許文献１６）。続けて２０００年には免疫されていないヒト由来のライブラリーからＨＬＡ－Ａ１／ＭＡＧＥ－Ａ１複合体特異的な抗体を取得したという報告がなされている（非特許文献１７）。この様にして得られた抗体は、細胞表面上で人工的にペプチドを結合させた場合は反応性を示すことができる。しかしながら、細胞表面上に自然な状態で内在性のペプチドが提示されている場合に反応性を示すことができる抗体の開発は大変難しいことが知られている。ＣＴＬは標的細胞表面上の数個から１０個程度のＭＨＣ／ペプチド複合体と結合することで十分活性化するが、それを検出するための系も同じく数個から１０個程度の分子が結合した状態を検出しなければならず、現行の技術では、その感度が十分ではない可能性が指摘されている。
【0017】
可溶性のＴＣＲを利用するＭＨＣ／ペプチド複合体の検出系は古くから考えられていたが（非特許文献１８）、ＴＣＲを構成するタンパク質α鎖、β鎖を、機能的な組み換えタンパク質複合体としてその立体構造を保持した状態で取得することの困難性、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体の結合力の弱さからその実用性は低いと思われた。しかしながらＭＨＣテトラマー試薬合成技術と同様に、ＴＣＲを４量体化することで実用的に使用できることが２００４年に報告されている（非特許文献１９）。２００６年には、α鎖とβ鎖のヘテロ２量体を形成しているＴＣＲタンパク質を、Ｖα、Ｖβ、及びＣβを連結させた一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）に改変し、これを多量体化することで、ＭＨＣ／ペプチド複合体を特異的に検出することが可能な試薬を製造することに成功している（非特許文献２０）。
【0018】
以上説明した通り、ＴＣＲは免疫療法において極めて有用であり、またそれを構成するα鎖及びβ鎖の配列を同定することは当該分野において極めて重要である。しかしながら、癌抗原として知られているｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ及びＰＢＦに関し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された当該癌抗原を認識するＴＣＲは、いまだ同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0019】
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１．２５４：１６４３－１６４７
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４；２６４：７１６－７１９
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６；２７４：９４‐９６
【文献】Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９９８；４：３２１－３２７
【文献】Ｎａｔ Ｍｅｄ，２００４；１０：９０９－９１５
【文献】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：３２８７－３２９５
【文献】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６；３１４：１２６－１２９
【文献】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６５：７２５－７３３
【文献】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１０；２８：３１６７－３１７５
【文献】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１２；３６６：２４４３－５４
【文献】Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，２０１４；８９：１４０－１６５
【文献】Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；２３： ３２－３８
【文献】Ｎａｔｕｒｅ ２０１５；５２０：６９２－６９６
【文献】Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３３８：７６５－７６８
【文献】Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７；６：７１５－７２６
【文献】ＰＮＡＳ，１９９６；９３：１８２０－１８２４
【文献】ＰＮＡＳ，２０００；９７：７９６９－７９７４
【文献】Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９４；２４２：６５５－６６９
【文献】Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４；２２：１４２９－１４３４
【文献】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１７６：３２２３－３２３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを認識することができるＴＣＲ及び該ＴＣＲをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを認識することができるＴＣＲ及び該ＴＣＲをコードするＤＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0021】
癌抗原特異的ＣＴＬの存在頻度は非常に低い。したがって、目的のＴＣＲ遺伝子を有するＣＴＬを得るには、ＣＴＬを増殖培養する等の工夫が必要である。また、ＴＣＲの遺伝子配列は極めて多様性に富んでいる。ＴＣＲは、Ｔ細胞表面に存在する膜表面タンパク質であり、α鎖／β鎖から成るヘテロ二量体と、γ鎖／δ鎖から成るヘテロ二量体の二種類が同定されている。ＴＣＲ遺伝子は免疫グロブリン遺伝子と同様に、細胞膜表面へ表出する時に切断されるシグナル配列、可変領域（Ｖ：ｖａｒｉａｂｌｅ）、多様性領域（Ｄ：ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、結合領域（Ｊ：ｊｏｉｎｉｎｇ）と呼ばれる分子の多様性を生じるＶドメインと、細胞外定常領域、膜貫通領域、細胞内領域を含む定常領域（Ｃ：ｃｏｎｓｔａｎｔ）からなるＣドメインにより構成されている。これらのアミノ酸配列はＴ細胞ごとに異なっていることから、ＴＣＲは抗原認識分子であると同時に個々のＴ細胞の目印にもなっている。このＴＣＲの多様性は後天的なＴＣＲ遺伝子の再構成によって生みだされており、ＴＣＲβとδ鎖はＶ－Ｄ－Ｊを、ＴＣＲαとγ鎖はＶ－Ｊを再構成することが知られている。ＩＭＧＴのデータベースに登録されている配列を連結させるだけでも、α鎖はＶα（１１５種類）、Ｊα（６１種類）、Ｃα（１種類）で７，０１５種類の組合せがあり、β鎖は、Ｖβ（１４６種類）、Ｄβ（３種類）、Ｊβ（１６種類）、Ｃβ（４種類）で２８，０３２種類の組合せになる。そして、α鎖とβ鎖の組合せは、２×１０８個の組合せとなる（但し、Ｔ細胞の多様性は、各領域の結合部位における塩基の挿入や欠失が多く存在するため、正確に算出することは難しく、１０１５の多様性とする報告もある）。したがって、目的とするＴＣＲ遺伝子の正しいα鎖とβ鎖の組合せを同定するためには、単一のＴＣＲを有するＣＴＬを増殖させる工夫が必要である。
【0022】
そこで、本発明者らは、先ず、限界希釈条件下でｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＰＢＦペプチドに特異的なＣＴＬを効率良く増殖し、培養する方法につき鋭意検討を行い、当該ペプチドが各々ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示された状態を認識することができるＣＴＬを取得することに成功した。また、取得した各癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬの細胞傷害活性の検証を行ったところ、対応する癌抗原ペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示されているリンパ腫の亜細胞株に対して、各々特異的な細胞傷害活性を示した。
【0023】
さらに、取得した各ＣＴＬ細胞集団のＴＣＲのレパトア解析を行ったところ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＣＴＬクローンのＶβ鎖がサブグループＶβ８に属し、またＰＢＦ特異的ＣＴＬクローンのＶβ鎖はＶβ１に属することが判明した。
【0024】
また、本発明者らは、取得した各ＣＴＬから抽出した全ＲＮＡから逆転写酵素反応にてｃＤＮＡ合成後、ＰＣＲ法等によりＴＣＲα鎖とβ鎖の全長配列を決定した。さらに、ＴＣＲα鎖とβ鎖を培養細胞に発現させ、各ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬を用いた分析を行うことにより、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示された対応する癌抗原ペプチドを特異的に認識する正しいα鎖とβ鎖の組み合わせを各々同定した。
【0025】
また、正しいα鎖とβ鎖の組み合わせを発現させた形質転換細胞株は、各ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬によって効率的に検出することができる一方、該形質転換細胞株を用いることにより、各ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬や、対応する癌抗原ペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示されている細胞を効率的に検出することができた。
【0026】
また、一般的に、癌抗原ペプチドが提示されたＨＬＡ分子とＴＣＲとの結合において、ＣＤ８分子は非常に重要な分子であることが知られている。しかしながら、本発明においては取得したこれらＴＣＲと、対応する癌抗原ペプチドが提示されたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子との結合の際にはＣＤ８の補佐を必要としないことも明らかになった。さらに、当該ＴＣＲを多量体化することで、癌抗原ペプチドが提示されたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子を検出するツールの開発に有用であることを示した。実際に、取得したＴＣＲを多量体化し、得られたＴＣＲマルチマーが対応する癌抗原ペプチドが提示されたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子を特異的に結合できることも確認した。
【0027】
したがって、本発明は、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドが拘束されているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を認識することができるＴＣＲ、ＰＢＦペプチドが拘束されているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を認識することができるＴＣＲ、及びこれらのＴＣＲを各々コードするＤＮＡ、並びにそれらの利用に関するものであり、より詳しくは以下の発明を提供するものである。
＜１＞ 下記（i) ～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプター
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる。
＜２＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを認識する、＜１＞に記載のＴ細胞レセプター。
＜３＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する。
＜４＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（i) 配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する。
＜５＞ ＜３＞及び＜４＞のうちのいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６＞ ＜５＞に記載のＤＮＡを発現可能に含有するベクター。
＜７＞ ＜５＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換細胞。
＜８＞ ＜３＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び＜４＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞であって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞。
＜９＞ リンパ球である、＜７＞又は＜８＞に記載の形質転換細胞。
＜１０＞ ＜９＞に記載の形質転換細胞を有効成分とする、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ陽性の癌を治療するための医薬組成物。
＜１１＞ 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の分子に特異的に結合する抗体。
（ａ）＜３＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜４＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプター
＜１２＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプターを結合して多量体化した分子。
＜１３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、＜１２＞に記載の分子を含む薬剤。
＜１４＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキット。
（ａ）＜３＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜４＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプター
（ｄ）＜５＞に記載のＤＮＡ
（ｅ）＜６＞に記載のベクター
（ｆ）＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の形質転換細胞
（ｇ）＜１１＞に記載の抗体
（ｈ）＜１２＞に記載の分子
＜１５＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、該分子と＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法。
＜１６＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプター
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる。
＜１７＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを認識する、＜１６＞に記載のＴ細胞レセプター。
＜１８＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有する。
＜１９＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（i) 配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有する。
＜２０＞ ＜１８＞及び＜１９＞のうちのいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２１＞ ＜２０＞に記載のＤＮＡを発現可能に含有するベクター。
＜２２＞ ＜２０＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換細胞。
＜２３＞ ＜１８＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び＜１９＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞であって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞。
＜２４＞ リンパ球である、＜２２＞又は＜２３＞に記載の形質転換細胞。
＜２５＞ ＜２４＞に記載の形質転換細胞を有効成分とする、ＰＢＦ陽性の癌を治療するための医薬組成物。
＜２６＞ 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の分子に特異的に結合する抗体。
（ａ）＜１８＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜１９＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプター
＜２７＞ ＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプターを結合して多量体化した分子。
＜２８＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、＜２７＞に記載の分子を含む薬剤。
＜２９＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキット。
（ａ）＜１８＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜１９＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプター
（ｄ）＜２０＞に記載のＤＮＡ
（ｅ）＜２１＞に記載のベクター
（ｆ）＜２２＞～＜２４＞のいずれかに記載の形質転換細胞
（ｇ）＜２６＞に記載の抗体
（ｈ）＜２７＞に記載の分子
＜３０＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、該分子と＜２２＞～＜２４＞のいずれかに記載の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法。
＜１＞ 下記（i) ～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプター
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる。
＜２＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを認識する、＜１＞に記載のＴ細胞レセプター。
＜３＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有する。
＜４＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（i) 配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する。
＜５＞ ＜３＞及び＜４＞のうちのいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜６＞ ＜５＞に記載のＤＮＡを発現可能に含有するベクター。
＜７＞ ＜５＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換細胞。
＜８＞ ＜３＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び＜４＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞であって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞。
＜９＞ リンパ球である、＜７＞又は＜８＞に記載の形質転換細胞。
＜１０＞ ＜９＞に記載の形質転換細胞を有効成分とする、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ陽性の癌を治療するための医薬組成物。
＜１１＞ 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の分子に特異的に結合する抗体。
（ａ）＜３＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜４＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプター
＜１２＞ ＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプターを結合して多量体化した分子。
＜１３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、＜１２＞に記載の分子を含む薬剤。
＜１４＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキット。
（ａ）＜３＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜４＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１＞又は＜２＞に記載のＴ細胞レセプター
（ｄ）＜５＞に記載のＤＮＡ
（ｅ）＜６＞に記載のベクター
（ｆ）＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の形質転換細胞
（ｇ）＜１１＞に記載の抗体
（ｈ）＜１２＞に記載の分子
＜１５＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、該分子と＜７＞～＜９＞のいずれかに記載の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法。
＜１６＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプター
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる。
＜１７＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを認識する、＜１６＞に記載のＴ細胞レセプター。
＜１８＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有する。
＜１９＞ 下記（i)～(iii）のいずれかの特徴を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（i) 配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有する
（ii) 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有する
（iii) 配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有する。
＜２０＞ ＜１８＞及び＜１９＞のうちのいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２１＞ ＜２０＞に記載のＤＮＡを発現可能に含有するベクター。
＜２２＞ ＜２０＞に記載のＤＮＡが導入された形質転換細胞。
＜２３＞ ＜１８＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ及び＜１９＞に記載のタンパク質をコードするＤＮＡが導入された形質転換細胞であって、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞。
＜２４＞ リンパ球である、＜２２＞又は＜２３＞に記載の形質転換細胞。
＜２５＞ ＜２４＞に記載の形質転換細胞を有効成分とする、ＰＢＦ陽性の癌を治療するための医薬組成物。
＜２６＞ 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の分子に特異的に結合する抗体。
（ａ）＜１８＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜１９＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプター
＜２７＞ ＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプターを結合して多量体化した分子。
＜２８＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、＜２７＞に記載の分子を含む薬剤。
＜２９＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキット。
（ａ）＜１８＞に記載のＴ細胞レセプターα鎖タンパク質
（ｂ）＜１９＞に記載のＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質
（ｃ）＜１６＞又は＜１７＞に記載のＴ細胞レセプター
（ｄ）＜２０＞に記載のＤＮＡ
（ｅ）＜２１＞に記載のベクター
（ｆ）＜２２＞～＜２４＞のいずれかに記載の形質転換細胞
（ｇ）＜２６＞に記載の抗体
（ｈ）＜２７＞に記載の分子
＜３０＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、該分子と＜２２＞～＜２４＞のいずれかに記載の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法。
【発明の効果】
【0028】
本発明のＴＣＲやその形質転換細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬の使用条件の設定や品質管理に有用であり、また、生体試料中にｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＰＢＦペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示されている細胞が存在するか否かを確認するためのコンパニオン診断薬として有用である。さらに、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ又はＰＢＦに関連する癌の治療薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢのＣＴＬ集団のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図1B】ＰＢＦのＣＴＬ集団のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図2A】ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢのＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図2B】ＰＢＦのＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図3A】エフェクター細胞にＩＴＧ－ＭＴ３を使用した場合の、ターゲット細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。
【図3B】エフェクター細胞にＦＫＳ－Ｄ１１Ｐを使用した場合の、ターゲット細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。
【図4A】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３を染色分析した結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図4B】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１Ｐを染色分析した結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図5A】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅産物を、各々アガロースゲル電気泳動で展開した結果を示す写真である。
【図5B】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲα鎖遺伝子及びＴＣＲβ鎖遺伝子のＰＣＲ増幅産物を、各々アガロースゲル電気泳動で展開した結果を示す写真である。
【図6】ＩＴＧ－ＭＴ３由来の２種類のＴＣＲα鎖（Ａ４とＡ１３－２）と１種類のβ鎖（Ｂ１２－４）との正しい組み合わせについて解析した結果、及びＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ由来のＴＣＲα鎖（Ａ１－２）とＴＣＲβ鎖（Ｂ９）の組合せが正しい事を示す、ドット－プロット展開図である。
【図7A】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲα鎖及びβ鎖の構成を示す概略図である。
【図7B】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲα鎖及びβ鎖の構成を示す概略図である。
【図8A】ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＳＭＴ３ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図8B】ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＰＤ１１ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図9A】ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＳＭＴ３Ｓを用いたＭＨＣテトラマー試薬の評価（添加回収試験）結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図9B】ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＰＤ１１Ｓを用いたＭＨＣテトラマー試薬の評価（添加回収試験）結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図10A】ＳＭＴ３Ｓを用いたＭＨＣテトラマー試薬の評価（濃度依存的染色性の検証と保存安定性の確認）結果を示す図である。
【図10B】ＰＤ１１Ｓを用いたＭＨＣテトラマー試薬の評価（濃度依存的染色性の検証と保存安定性の確認）結果を示す図である。
【図11A】ＴＣＲ遺伝子（ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４）を導入したＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５細胞株のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図11B】ＴＣＲ遺伝子（ＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９）を導入したＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５細胞株のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図11C】ＣＤ８抗体クローン（Ｔ８又はＲＦＴ－８）存在下における、ＳＭＴ３Ｓ及びＰＤ１１Ｓの、各々に対応するＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示す、ドット－プロット展開図である。
【図12A】ＳＭＴ３ＪのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図12B】ＰＤ１１ＪのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を示す、ドット－プロット展開図である。
【図13A】ＳＭＴ３ＪにおけるＴＣＲシグナル伝達を、ルシフェラーゼの活性を指標として解析した結果を示すグラフである。
【図13B】ＰＤ１１ＪにおけるＴＣＲシグナル伝達を、ルシフェラーゼの活性を指標として解析した結果を示すグラフである。
【図14A】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲα鎖のアミノ酸配列（配列番号：２２に記載のアミノ酸配列）を示す図である。
【図14B】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲα鎖のアミノ酸配列（配列番号：２６に記載のアミノ酸配列）を示す図である。
【図15A】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列（配列番号：２４に記載のアミノ酸配列）を示す図である。
【図15B】ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列（配列番号：２８に記載のアミノ酸配列）を示す図である。
【図16】ＴＣＲマルチマーを作製するためのコンストラクトを示す概略図である。
【図17A】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞への反応性を示す、ヒストグラム図である。
【図17B】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞への反応性を示す、グラフである。
【図18A】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞への濃度依存的な反応性を示す、ヒストグラム図である。
【図18B】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞への濃度依存的な反応性を示す、グラフである。
【図19A】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＰＢＦペプチドをパルスした細胞に対するパルスしたペプチド濃度依存的な反応性を示す、ヒストグラム図である。
【図19B】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＰＢＦペプチドをパルスした細胞へのＴＣＲマルチマー濃度依存的な反応性を示す、ヒストグラム図である。
【図20】抗ＨＬＡ―Ａ２４抗体を用いてブロッキングアッセイを行った結果、ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ及びＰＢＦペプチドをパルスした細胞への反応性が阻害されることを示す、ヒストグラム図である。
【図21A】ＴＣＲマルチマーのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＰＢＦペプチドをパルスした細胞への反応性を示す、顕微鏡写真である。
【図21B】ＴＣＲマルチマーの、ＰＢＦをナチュラルに発現したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性骨肉腫由来細胞株ＫＩＫＵへの反応性を示す、顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
＜ＴＣＲ、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖＞
本発明は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、並びにそれを構成するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質（ＴＣＲα鎖）及びＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質（ＴＣＲβ鎖）を提供する。
本発明は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、並びにそれを構成するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質（ＴＣＲα鎖）及びＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質（ＴＣＲβ鎖）を提供する。
【0031】
本発明のＴＣＲの一態様として、より具体的には、
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる、又は
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなるＴ細胞レセプターであり、当該ＴＣＲの典型的な特徴は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドに対する認識である。
（i) 配列番号：１～３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：６～８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる、又は
（iii) 配列番号：５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなるＴ細胞レセプターであり、当該ＴＣＲの典型的な特徴は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドに対する認識である。
【0032】
また、本発明のＴＣＲの一態様として、より具体的には、
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる、又は
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなるＴ細胞レセプターであり、当該ＴＣＲの典型的な特徴は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドに対する認識である。
（i) 配列番号：１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる
（ii) 配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：１９に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなる、又は
（iii) 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターα鎖タンパク質と配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を有するＴ細胞レセプターβ鎖タンパク質とからなるＴ細胞レセプターであり、当該ＴＣＲの典型的な特徴は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドに対する認識である。
【0033】
また、一般的に、癌抗原ペプチドが提示されたＨＬＡ分子とＴＣＲとの結合において、ＣＤ８分子は非常に重要な分子であることが知られている。しかしながら、上記本発明のＴＣＲに関しては、後述の実施例１０に示す通り、ＣＤ８の非存在下においても、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された対応する抗原ペプチドを認識し得るという優れた特徴を有する。
【0034】
本発明における「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２」は、ヒト組織適合性白血球抗原（ＨＬＡ）のクラスＩ分子のＡ座にコードされており、血清学的ＨＬＡ型ではＡ２４に分類され、アミノ酸変異を伴うサブタイプに分類され、日本人では保有頻度が最も高い型である（ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２のアミノ酸配列を配列番号：３２に示す）。
【0035】
「ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ（サバイビン－２Ｂ）」は、アポトーシスを抑制するＩＡＰファミリーに属するタンパク質であって、ヒト由来のものであれば典型的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＡＡ９３６７６．１にて特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、「ＰＢＦ」は、骨肉腫特異抗原 パピローマウィルス結合因子（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、ＺＮＦ３９５と称されるタンパク質であって、ヒト由来のものであれば典型的には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＡＨ０１２３７．１にて特定されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。なお、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ及びＰＢＦのいずれにおいても、このような典型的なアミノ酸配列を有するもの以外に、天然においてアミノ酸が変異したものも存在しうることも理解されたい。
【0036】
また、本発明における「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチド」とは、これらペプチドが細胞表面上に存在する場合、及び単離若しくは精製された分子として存在する場合（例えば、多量体化されたＴＣＲにこれらペプチドが拘束された分子）の双方を含む意である。
【0037】
本発明において「ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド」とは、「ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ」（配列番号：２９）を意味し、「ＰＢＦペプチド」とは、「ＡＹＲＰＶＳＲＮＩ」（配列番号：３０）を意味する。なお、これらのペプチド断片によって誘導されたＣＴＬが、癌細胞に対して高い細胞傷害活性を有することは明らかになっている（特開２００２－２８４７９７号公報、国際公開第２００４／０２９２４８号）。
【0038】
本発明は、また、上記ＴＣＲを構成するＴＣＲα鎖タンパク質及びＴＣＲβ鎖タンパク質を提供する。本発明者らにより同定されたＴＣＲを構成するＴＣＲα鎖タンパク質は、可変領域上の相補性決定領域として、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。また、本発明者らにより同定された他のＴＣＲを構成するＴＣＲα鎖タンパク質は、可変領域上の相補性決定領域として、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。したがって、本発明は、配列番号：１～３又は１１～１３に記載のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖タンパク質を提供する。
【0039】
なお、本発明におけるＣＤＲは、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８ Ｊｕｌｙ １；３６（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５０３－Ｗ５０８）に記載の方法及びＩＭＧＴ提供のソフトウェアによる解析で特定することができる。
【0040】
これら相補性決定領域を含む可変領域は、当該相補性決定領域以外の領域におけるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸（例えば、数個以内のアミノ酸、３個以内のアミノ酸、２個以内のアミノ酸）が置換、欠失、付加等していてもよいが、好ましくは配列番号：４又は１４に記載のアミノ酸配列からなる可変領域である。また、本発明のＴＣＲα鎖タンパク質は、好ましくは配列番号：５又は１５に記載のアミノ酸配列を有する。なお、配列番号：５及び１５に記載のアミノ酸配列は、前記可変領域に定常領域が付加された態様であり、より具体的には、図１４Ａ及び１４Ｂに記載の各々のＴＣＲα鎖タンパク質からリーダー配列及びＴＭ（膜貫通領域）を除いたアミノ酸配列である。
【0041】
一方、本発明者らにより同定されたＴＣＲを構成するＴＣＲβ鎖タンパク質は、可変領域上の相補性決定領域として、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。また、本発明者らにより同定された他のＴＣＲを構成するＴＣＲβ鎖タンパク質は、可変領域上の相補性決定領域として、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する。したがって、本発明は、配列番号：６～８又は１６～１８に記載のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖タンパク質を提供する。
【0042】
これら相補性決定領域を含む可変領域は、当該相補性決定領域以外の領域におけるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸（例えば、数個以内のアミノ酸、３個以内のアミノ酸、２個以内のアミノ酸）が置換、欠失、付加等していてもよいが、好ましくは配列番号：９又は１９に記載のアミノ酸配列からなる可変領域である。また、本発明のＴＣＲα鎖タンパク質は、好ましくは配列番号：１０又は２０に記載のアミノ酸配列を有する。なお、配列番号：１０及び２０に記載のアミノ酸配列は、前記可変領域に定常領域が付加された態様であり、より具体的には、図１５Ａ及び１５Ｂに記載の各々のＴＣＲα鎖タンパク質からリーダー配列及びＴＭを除いたアミノ酸配列である。
【0043】
＜遺伝子、ベクター、形質転換細胞＞
本発明は、また、上記ＴＣＲα鎖タンパク質をコードするＤＮＡ、及び上記ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。これらＤＮＡを発現ベクターに組み込んで細胞に導入することにより、上記ＴＣＲα鎖タンパク質、上記ＴＣＲβ鎖タンパク質、またはこれらタンパク質からなるＴＣＲ複合体を、細胞において発現させることができる。これらタンパク質を細胞に発現させるためのベクターとしては、本実施例に示したベクターを用いることができるが、それに制限されない。例えば、２種類の遺伝子をＩＲＥＳを介して単一ｍＲＮＡから翻訳可能なベクターｐＩＲＥＳ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）やＭａｍｍａｌｉａｎ ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡）のベクター等を利用することもできる。ベクターは、上記ＴＣＲα鎖タンパク質をコードするＤＮＡと上記ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするＤＮＡのいずれかを発現可能に含有するベクターであってもよく、両者を発現可能に含有するベクターであってもよい。上記ベクターを導入する細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の細胞を用いることができる。細胞への遺伝子導入は、エレクトロポレーション法等当業者に公知の方法で行うことができる。
本発明は、また、上記ＴＣＲα鎖タンパク質をコードするＤＮＡ、及び上記ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。これらＤＮＡを発現ベクターに組み込んで細胞に導入することにより、上記ＴＣＲα鎖タンパク質、上記ＴＣＲβ鎖タンパク質、またはこれらタンパク質からなるＴＣＲ複合体を、細胞において発現させることができる。これらタンパク質を細胞に発現させるためのベクターとしては、本実施例に示したベクターを用いることができるが、それに制限されない。例えば、２種類の遺伝子をＩＲＥＳを介して単一ｍＲＮＡから翻訳可能なベクターｐＩＲＥＳ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）やＭａｍｍａｌｉａｎ ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（東洋紡）のベクター等を利用することもできる。ベクターは、上記ＴＣＲα鎖タンパク質をコードするＤＮＡと上記ＴＣＲβ鎖タンパク質をコードするＤＮＡのいずれかを発現可能に含有するベクターであってもよく、両者を発現可能に含有するベクターであってもよい。上記ベクターを導入する細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の細胞を用いることができる。細胞への遺伝子導入は、エレクトロポレーション法等当業者に公知の方法で行うことができる。
【0044】
こうして調製された形質転換細胞は、例えば、ペプチドワクチン療法を行う際のコンパニオン診断薬として利用することが可能である。ペプチドワクチン療法を行う場合には、どのペプチドをワクチンとして使用すべきかは重要な診断情報となるが、当該形質転換細胞を用いれば、対象細胞の膜表面中にＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＰＢＦペプチド（以下、「癌抗原ペプチド」とも総称する）が提示されているか否かを評価することができる。
【0045】
このような目的においては、形質転換細胞の調製に用いる細胞として、ＴＣＲシグナル伝達の活性化に応じてレポータータンパク質が発現するように改変された細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞亜株であるＪｕｒｋａｔ／ＭＡ細胞）を用いることができる（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００２；９９（１）：７－１３）。また、同目的においては、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＰＢ－ＡＬＬやＨＰＢ－ＭＬＴ等、刺激に応答してサイトカインを産生する細胞も、前記形質転換細胞の調製に用いる細胞として用いることができる。これにより形質転換細胞におけるサイトカインの産生を指標として、対象細胞の膜表面におけるＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された癌抗原ペプチドの存在を検出することが可能である（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８４；１３３：１１２３－１１２８ 参照のこと）。
【0046】
また、患者から分離した樹状細胞にペプチドを結合させ患者に接種する樹状細胞ワクチン療法が行われているが、実際に樹状細胞上の特定のＨＬＡにペプチドが提示されていることを確認する試薬としても利用することが可能である。
【0047】
本発明の形質転換細胞の他の好ましい態様は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された癌抗原ペプチドを結合して多量体化した分子によって検出することができる形質転換細胞である。
【0048】
本発明のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束された癌抗原ペプチドを結合して多量体化した分子、すなわち「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子」あるいは「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子」は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６；２７４：９４‐９６、米国特許５，６３５，３６３号、日本特許第３５０６３８４号に記された方法により調製することができる。具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とβ２ｍの組換えタンパク質と化学合成したｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＰＢＦペプチドをフォールディング溶液中で撹拌することで会合させ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とβ２ｍとペプチドの複合体（以下「モノマー」と称する）を形成させる。つづいて、モノマーを構成するＨＬＡ－Ａ＊２４：０２のＣ末端側の１箇所のアミノ酸に酵素反応によりビオチンを結合させる。ビオチン化されたモノマーをカラムクロマトグラフィー法で精製し、これをアビジンと反応させることで多量体化した分子を合成できる。アビジンを予めＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）あるいはＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）等の蛍光物質で標識することで、フローサイトメーターや蛍光顕微鏡を用いて、抗原特異的Ｔ細胞の検出が可能である。
【0049】
また、本発明において、多量体化した分子を形成するモノマーの数としては特に制限はないが、通常２～１０であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは４又は５であり、特に好ましくは４である。
【0050】
「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子」の製品としては、例えば、Ｔ－Ｓｅｌｅｃｔ ＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ（ＭＢＬ社製、ＰＥ標識物の製品コード：ＴＳ－Ｍ０２５－１、ＡＰＣ標識物の製品コード：ＴＳ－Ｍ０２５－２）が挙げられ、「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子」の製品としては、例えば、Ｔ－Ｓｅｌｅｃｔ ＭＨＣ Ｔｅｔｒａｍｅｒ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ Ａ２４．２ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＹＲＰＶＳＲＮＩ（ＭＢＬ社製、ＰＥ標識物の製品コード：ＴＳ－Ｍ１３６－１、ＡＰＣ標識物の製品コード：ＴＳ－Ｍ１３６－２）が挙げられる。
【0051】
このような形質転換細胞の調製に用いる細胞としては、例えば、ヒト白血病由来であるＪｕｒｋａｔの変異株で、ＴＣＲβ鎖を欠損しているＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５や、ＴＣＲα鎖を欠損しているＳｕｐ－Ｔ１が挙げられる。これらの細胞を用いて調製した形質転換細胞株ＳＭＴ３Ｓ及びＰＤ１１Ｓ（実施例７参照のこと）は、無限の増殖性を持つ細胞株であり、感染性の心配もない。また、煩雑で特殊な培養方法により、増殖させる必要もないことから、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬の陽性コントロール細胞として各々頒布することも可能である。ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓを陽性コントロール細胞として利用することで、実験者が前記テトラマー試薬の反応性を随時確認できるため、臨床検体で得られたデータの正確性と信頼性は非常に高くなると思われる。また、当該細胞株はフローサイトメトリーの取り込み条件の設定にも有効である。ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓを頒布する場合には、通常の液体窒素やドライアイスを利用した保存や輸送も可能であるし、フローサイトメトリー用のヒト全血コントロール細胞であるＩｍｍｕｎｏ－ＴＲＯＬ（登録商標） Ｃｅｌｌｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）のように適切な溶液中に希釈することで冷蔵条件下での保存や輸送も可能になる。さらに凍結乾燥することで利便性を高めることも可能である（米国特許第第５，８６１，３１１号）。
【0052】
本発明の形質転換細胞の他の好ましい態様は、リンパ球を利用して調製した形質転換細胞である。例えば、ヒトから末梢血リンパ球を採取し、これに遺伝子導入して、生体内に戻すことにより、癌の治療を行うことが可能である。したがって、本発明は、本発明の形質転換細胞を有効成分とする、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ陽性の癌又はＰＢＦ陽性の癌を治療するための医薬組成物をも提供する。
【0053】
治療の対象となるｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ陽性の癌としては、例えば、肺癌、胃癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺癌、乳癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、頭頚部癌、脳腫瘍等の上皮癌、悪性リンパ腫、骨肉腫、滑膜肉腫等の非上皮癌が挙げられるが、これらに制限されない。また、ＰＢＦ陽性の癌としては、主に骨原発肉腫、軟部肉腫が挙げられるが、肺癌、胃癌、乳癌、肝臓癌等でもＰＢＦの高発現が認められており、ＰＢＦはこの様な上皮系の癌においても有望な免疫療法の標的になり得る。
【0054】
なお、調製した細胞の細胞傷害活性は、例えば、ＣＦＳＥ（同仁化学社）で標的細胞を標識するＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＢＬ社）や、標的細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）を測定するＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）等を利用して測定することも可能である。また、放射性同位元素である５１Ｃｒで標的細胞を標識して利用するクロムリリースアッセイにより測定することが可能である。
【0055】
＜抗体＞
また、本発明は、上記ＴＣＲα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体、上記ＴＣＲβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体、及びこれらタンパク質からなるＴＣＲに特異的に結合する抗体を提供する。
また、本発明は、上記ＴＣＲα鎖タンパク質に特異的に結合する抗体、上記ＴＣＲβ鎖タンパク質に特異的に結合する抗体、及びこれらタンパク質からなるＴＣＲに特異的に結合する抗体を提供する。
【0056】
これらの抗体を用いることで細胞表面上に発現された本発明のＴＣＲを特異的に検出することが可能である。本発明の抗体は、例えば、上記本発明の形質転換細胞や医薬品組成物の検定に使用することができる。また、本発明の形質転換細胞や医薬品組成物を製造する過程で、これらの純度を上げるための単離において使用することもできる。また医薬品組成物として投与された後、投与された患者の末梢血中における有効成分の定量に使用することもできる。
【0057】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を生産する方法としては、代表的には、コーラー及びミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原であるＴＣＲα鎖タンパク質又はＴＣＲβ鎖タンパク質で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等である。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球等に対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。抗原に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【0058】
上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等）に導入することにより、抗体を組換え抗体として産生させることもできる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５（１９９０））。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【0059】
本発明の抗体は、ＴＣＲの検出のために、標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素、補酵素等を用いることが可能である。また、ＴＣＲの単離のために、タグが付加されていてもよい。タグとしては、例えば、磁性ビーズ、ビオチン、アビジン等を用いることが可能である。
【0060】
＜ＴＣＲマルチマー＞
本発明は、また、上記ＴＣＲを結合して多量体化した分子を提供する。当該分子の調製は、例えば、次の通り、行うことができる。ＴＣＲの細胞外領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、人工的にＴＣＲα鎖及びβ鎖の組み換えタンパク質を作製し、ＴＣＲα鎖あるいはβ鎖のＣ末端を酵素反応を利用してビオチン化する。ビオチン化されたＴＣＲをカラムクロマトグラフィー法で精製し、これをアビジンと反応させることで多量体化した分子を調製できる。さらに、後述の実施例１２に示す通り、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のヘテロ二量体化を促進するため、これらタンパク質に多量体形成能を有するモチーフ（ロイシンジッパー領域等）を融合させてもよい。また、アビジンを予めＦＩＴＣ、ＰＥあるいはＡＰＣ等の蛍光物質で標識することでフローサイトメーターや蛍光顕微鏡を用いて、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体を発現する細胞の検出が可能である。
本発明は、また、上記ＴＣＲを結合して多量体化した分子を提供する。当該分子の調製は、例えば、次の通り、行うことができる。ＴＣＲの細胞外領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、人工的にＴＣＲα鎖及びβ鎖の組み換えタンパク質を作製し、ＴＣＲα鎖あるいはβ鎖のＣ末端を酵素反応を利用してビオチン化する。ビオチン化されたＴＣＲをカラムクロマトグラフィー法で精製し、これをアビジンと反応させることで多量体化した分子を調製できる。さらに、後述の実施例１２に示す通り、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のヘテロ二量体化を促進するため、これらタンパク質に多量体形成能を有するモチーフ（ロイシンジッパー領域等）を融合させてもよい。また、アビジンを予めＦＩＴＣ、ＰＥあるいはＡＰＣ等の蛍光物質で標識することでフローサイトメーターや蛍光顕微鏡を用いて、特異的なＭＨＣ／ペプチド複合体を発現する細胞の検出が可能である。
【0061】
また、別の調製方法としては、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の細胞外領域を短鎖ペプチドリンカーを利用して連結させ一本のタンパク質（ｓｃＴＣＲ）として発現させることができる。そして、前記同様にＣ末端側をビオチン化することにより多量体化することも可能であり、また、ＩｇＧの可変領域に組み込んで多量体化することも可能である。
【0062】
また、本発明において、多量体化した分子を形成するＴＣＲの数としては特に制限はないが、通常２～１０であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは４又は５であり、特に好ましくは４である。
【0063】
こうして調製された分子は、上記本発明の形質転換細胞と同様に、ペプチドワクチン療法を行う際のコンパニオン診断薬として、あるいは樹状細胞ワクチン療法を行う際に、樹状細胞上の特定のＨＬＡにペプチドが提示されていることを確認するための試薬として利用することが可能である。さらには、癌治療目的で放射性同位元素や抗癌剤と結合し、薬物送達システム（ＤＤＳ）のツールとして利用することも可能である。したがって、本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出又は捕捉するための薬剤であって、上記本発明の分子を含む薬剤をも提供する。
【0064】
＜検出キット＞
本発明は、また、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキットを提供する。
（ａ）本発明のＴＣＲα鎖タンパク質
（ｂ）本発明のＴＣＲβ鎖タンパク質
（ｃ）本発明のＴＣＲ複合体
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡが導入された形質転換細胞
（ｇ）（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）の複合体に特異的に結合する抗体
（ｈ）（ｃ）の複合体を結合して多量体化した分子
ここで「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチド」とは、上記の通り、これらペプチドが細胞表面上に存在する場合、及び単離若しくは精製された分子（例えば、多量体化されたＴＣＲにこれらペプチドが拘束された分子）として存在する場合の双方を含む意である。本発明のキットにおいては、さらに、当該キットの使用説明書が含まれていてもよい。
本発明は、また、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを検出するためのキットであって、以下の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つの構成要素を含むキットを提供する。
（ａ）本発明のＴＣＲα鎖タンパク質
（ｂ）本発明のＴＣＲβ鎖タンパク質
（ｃ）本発明のＴＣＲ複合体
（ｄ）（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）（ｄ）のＤＮＡを発現可能に保持するベクター
（ｆ）（ｄ）のＤＮＡが導入された形質転換細胞
（ｇ）（ａ）若しくは（ｂ）のタンパク質又は（ｃ）の複合体に特異的に結合する抗体
（ｈ）（ｃ）の複合体を結合して多量体化した分子
ここで「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド」及び「ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチド」とは、上記の通り、これらペプチドが細胞表面上に存在する場合、及び単離若しくは精製された分子（例えば、多量体化されたＴＣＲにこれらペプチドが拘束された分子）として存在する場合の双方を含む意である。本発明のキットにおいては、さらに、当該キットの使用説明書が含まれていてもよい。
【0065】
＜ＭＨＣテトラマー試薬の品質管理＞
本発明は、また、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、当該分子と上記本発明の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法を提供する。本発明の品質管理方法における反応性の確認は、例えば、本実施例８～１１に記載の方法で実施することができる。その結果、反応性が維持されている場合には、当該分子の品質が維持されていると評価することができ、一方、反応性が低下した場合には、当該分子の品質が劣化したと評価することができる。なお、反応性の維持は、例えば、陽性率の維持及び／又はＳ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）の維持を指標に判定することができる。Ｓ／Ｎ比は陽性細胞集団のＭＦＩ（平均蛍光強度、ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を陰性細胞集団のＭＦＩで割った値から算出される。また、いずれかの指標の低下で、その品質の欠陥点を推認し、改善策を立てることができる。
本発明は、また、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドを結合して多量体化した分子又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に拘束されたＰＢＦペプチドを結合して多量体化した分子の品質管理方法であって、当該分子と上記本発明の形質転換細胞との反応性を確認する工程を含む方法を提供する。本発明の品質管理方法における反応性の確認は、例えば、本実施例８～１１に記載の方法で実施することができる。その結果、反応性が維持されている場合には、当該分子の品質が維持されていると評価することができ、一方、反応性が低下した場合には、当該分子の品質が劣化したと評価することができる。なお、反応性の維持は、例えば、陽性率の維持及び／又はＳ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）の維持を指標に判定することができる。Ｓ／Ｎ比は陽性細胞集団のＭＦＩ（平均蛍光強度、ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を陰性細胞集団のＭＦＩで割った値から算出される。また、いずれかの指標の低下で、その品質の欠陥点を推認し、改善策を立てることができる。
【実施例】
【0066】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0067】
（実施例１） ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅ及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅの誘導と増幅培養
本発明者らは、先ず、２００３年に報告されたＫａｒａｎｉｋｓらの論文（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４８９８－４９０４）を参考に検証と改良を繰り返し、限界希釈条件下で効率よく癌抗原特異的ＣＴＬを増殖培養するＭＬＰＣ法（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を確立した。ＭＬＰＣ法はＰＢＭＣに抗原ペプチドを直接添加して培養する方法であり、血液提供者の体内に存在するメモリーＴ細胞、あるいはメモリー／エフェクターＴ細胞を刺激して増殖させていると考えられる。したがって試験管内で調製した抗原提示細胞を利用した場合に心配されるような、ナイーブＴ細胞を人為的なプライミングにより刺激増殖してしまうリスクは低いと考えられる。本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅ及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅの誘導を、次の通り、本発明者らが実際に患者検体を用いて免疫モニタリングを実施する際に使用している方法にて行った。
本発明者らは、先ず、２００３年に報告されたＫａｒａｎｉｋｓらの論文（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７１：４８９８－４９０４）を参考に検証と改良を繰り返し、限界希釈条件下で効率よく癌抗原特異的ＣＴＬを増殖培養するＭＬＰＣ法（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を確立した。ＭＬＰＣ法はＰＢＭＣに抗原ペプチドを直接添加して培養する方法であり、血液提供者の体内に存在するメモリーＴ細胞、あるいはメモリー／エフェクターＴ細胞を刺激して増殖させていると考えられる。したがって試験管内で調製した抗原提示細胞を利用した場合に心配されるような、ナイーブＴ細胞を人為的なプライミングにより刺激増殖してしまうリスクは低いと考えられる。本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅ及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的ＣＴＬ ｌｉｎｅの誘導を、次の通り、本発明者らが実際に患者検体を用いて免疫モニタリングを実施する際に使用している方法にて行った。
【0068】
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を保持することが予め分かっているインフォームドコンセント実施済の癌患者ＰＢＭＣを１～５×１０６個／ｍＬの密度になるようにＣＴＬ培地（１０％ ｈｕｍａｎ ＡＢ ｓｅｒｕｍ／１００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／１×ＧｌｕｔａＭＡＸ／５５μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＡＩＭ－Ｖ）で調整し、最終濃度が４０μｇ／ｍＬになるようにＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ，ＭＢＬ社）又はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ Ａ２４．２ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＹＲＰＶＳＲＮＩ，ＭＢＬ社）を添加し、よく攪拌後、２４－ウェルプレートの１個のウェル当たり１ｍＬずつ分注した。その後、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で４８時間培養した。４８時間後に、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（塩野義製薬）を含むＣＴＬ培地を１ｍＬ添加して培養を続けた。ＣＴＬ培地の交換は、培養の状態を観察しつつ、約半量の培地を吸引除去し、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２添加ＣＴＬ培地を加えて実施した。最初の１週間は１回程度、１週間経過後は、２～３日に一度交換を行った。
【0069】
培養開始から１０～１４日後に、各ウェルから７０μＬの細胞浮遊液を回収し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー－ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ－ＰＥ（以下ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬と略す、ＭＢＬ社）またはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ Ａ２４．２ テトラマー－ＡＹＲＰＶＳＲＮＩ－ＰＥ（以下ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬と略す、ＭＢＬ社）で染色した。染色手順は次の通りである。
【0070】
回収した細胞浮遊液にＦＣＭバッファー［２％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）／０．０５％ ＮａＮ３／ＰＢＳ］を加え、４００×ｇで５分間遠心した。上清を吸引除去後、再度ＦＣＭバッファーを適量加え４００×ｇで５分間遠心後、上清を吸引除去した。２０μＬのＦＣＭバッファーと１０μＬのＣｌｅａｒ Ｂａｃｋ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＢＬ社）を加え良く攪拌後、室温にて５分間静置した。１０μＬのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬あるいはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬を加え穏やかに攪拌後、２～８℃の冷蔵室で３０分間反応させた。１０μＬのＣＤ８（ｃｌｏｎｅ Ｔ８）－ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加え、冷蔵室で２０分間反応させた。適量のＦＣＭバッファーを加え４００×ｇで５分間遠心した。上清を注意深く捨て、死細胞染色試薬 ７－ＡＡＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を１％添加した４００μＬのＦＣＭバッファーを加えて細胞を懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞を取込み分析した。分析データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）あるいはＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を用いて解析した。ＭＨＣテトラマー試薬のコントロールとしてＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖ テトラマー－ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ－ＰＥ（ＭＢＬ社、配列番号：３１）を用いて染色を行い、非特異的な染色では無いことを確認した。この試薬は、ＭＨＣにＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を、抗原ペプチドにＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）ｅｎｖｅｌｏｐｅ由来のペプチドを用いて合成しており、これに特異的なＣＴＬ集団を検出定量することが可能である。日本国内ではＨＩＶ罹患率が低いことから、ＭＨＣテトラマー試薬のネガティブコントロールとしてしばしば利用されている。ＣＴＬの存在頻度は基本的に低いためＭＨＣ－テトラマー試薬陽性細胞の有無を判定する場合、このようなネガティブコントロールＭＨＣテトラマー試薬をコントロールに用いることは非常に重要である。この染色試験の結果、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬に反応を示す細胞集団及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬に反応を示す細胞集団が得られた。
【0071】
図１Ａにｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢのＣＴＬ集団のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示した。Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示したドットプロット展開図である。各ドットプロット上部に使用したＭＨＣテトラマー試薬の種類を示した。各ドットプロットを四分割した右上に抗ＣＤ８抗体陽性かつＭＨＣテトラマー試薬陽性ＣＴＬの生細胞中での存在率（％）を示した。
【0072】
抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬特異的なＣＴＬが細胞集団中に占める割合は３．９３％であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー試薬での陽性率が０．０４％であることから、抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬陽性細胞集団は、そのほとんどが特異的なＣＴＬ集団と考えられた。
【0073】
また、図１ＢにＰＢＦのＣＴＬ集団のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を図１Ａと同様に示した。抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬特異的なＣＴＬが細胞集団中に占める割合は５．２５％であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー試薬での陽性率が０．１０％であることから、抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬陽性細胞集団は、そのほとんどが特異的なＣＴＬ集団と考えられた。
【0074】
（実施例２） ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的ＣＴＬクローン及びＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦペプチド特異的ＣＴＬクローンの樹立と増幅培養
これらの細胞集団は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてシングルセルソーティングを行い、マイトジェンとしてよく使用されるＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）にて刺激して約１ヶ月間培養を続けた。更に、Ｘ線照射したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２保持健常人由来ＰＢＭＣにペプチドをパルスした細胞を添加混合培養する事で増殖刺激し２週間培養を続けた。
これらの細胞集団は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてシングルセルソーティングを行い、マイトジェンとしてよく使用されるＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）にて刺激して約１ヶ月間培養を続けた。更に、Ｘ線照射したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２保持健常人由来ＰＢＭＣにペプチドをパルスした細胞を添加混合培養する事で増殖刺激し２週間培養を続けた。
【0075】
なお、その他の刺激増殖方法としては、抗原提示細胞にヒトＢ細胞をＥＢウィルスで不死化させたリンパ芽球様細胞株（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＬＣＬ）を用いたり、抗ＣＤ３抗体やＰＨＡやＩＬ－２等のＴ細胞刺激薬剤で活性化させた活性化Ｔ細胞を利用することもできる。これらの抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を細胞表面上に発現していることが重要であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２が発現しているかどうかの確認は、例えば抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体（ＭＢＬ社）等を用いてフローサイトメトリー法で確認できる。あるいは、抗原提示細胞を用いずに抗ＣＤ１３７抗体によるＣＴＬの増殖作用を利用して直接的にＣＴＬに増殖刺激を加える方法等を用いることもできる（特許５４３３８２５号公報、ＷＯ２００８／０２３７８６）。
【0076】
次に、ペプチドパルス処理は以下のように行った。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性の抗原提示細胞を２％ ＦＢＳ／ＰＢＳで一回洗浄後、１ｍＬのペプチドパルス用培地［０．１％ ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）／５５μＭ ２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／ＲＰＭＩ １６４０］若しくはＡＩＭ－Ｖ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に懸濁し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドを添加し、良く攪拌後、およそ１５分間隔で穏やかに混合させながら室温にて１時間インキュベーションした。この操作を行うことで、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子にペプチドが結合すると考えられる。続けて適量のペプチドパルス用培地を添加し、良く攪拌後、４００×ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を注意深く廃棄した。過剰量のペプチドを完全に除去する目的でこの洗浄処理をさらに２回実施後、適量のＣＴＬ培地に再懸濁し細胞数を数えた。これらの抗原提示細胞はＸ線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させておくことが重要であり、Ｘ線照射はペプチドと抗原提示細胞を混合後１時間室温でインキュベーションする時に同時に行うことも可能である。マイトマイシン処理は、ペプチドパルス処理を行う前に実施することが望ましい。ペプチドパルス処理した抗原提示細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬あるいはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬に反応性を示す細胞集団の細胞数に対して１／１０倍量～等量を添加した。
【0077】
図２Ａにｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢのＣＴＬクローン ＩＴＧ－ＭＴ３のＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を示した。Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示したドットプロット展開図である。各ドットプロット上部に使用したＭＨＣテトラマー試薬の種類を示した。各ドットプロットを四分割した右上に抗ＣＤ８抗体陽性かつＭＨＣテトラマー試薬陽性ＣＴＬの生細胞中での存在率（％）を示した。
【0078】
抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬特異的なＣＴＬが細胞集団中に占める割合は８７．７％であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー試薬での陽性率が０．７５％であることから、抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ テトラマー試薬陽性細胞集団について、クローン化が完了したと考えられた。
【0079】
また、図２ＢにＰＢＦのＣＴＬクローン ＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を図２Ａ同様に示した。
抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬特異的なＣＴＬが細胞集団中に占める割合は９８．８％であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー試薬での陽性率が０．００％であることから、抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬陽性細胞について、クローン化が完了したと考えられた。
抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦ テトラマー試薬特異的なＣＴＬが細胞集団中に占める割合は９８．８％であり、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー試薬での陽性率が０．００％であることから、抗ＣＤ８抗体陽性かつＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬陽性細胞について、クローン化が完了したと考えられた。
【0080】
（実施例３） ＩＴＧ－ＭＴ３及びＦＫＳ－Ｄ１１Ｐにおける細胞傷害活性の確認
図２Ａに示した通り、ＩＴＧ－ＭＴ３にはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬と反応するＴＣＲを有する細胞が８７．７％の比率で存在することが明らかとなった。また、図２Ｂに示した通り、ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐについては、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬と反応するＴＣＲを有する細胞が９８．８％の比率で存在することが明らかとなった。
図２Ａに示した通り、ＩＴＧ－ＭＴ３にはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬と反応するＴＣＲを有する細胞が８７．７％の比率で存在することが明らかとなった。また、図２Ｂに示した通り、ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐについては、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬と反応するＴＣＲを有する細胞が９８．８％の比率で存在することが明らかとなった。
【0081】
しかしながら、かかるＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬は人工的に合成されたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とβ２ｍとエピトープペプチドとの３者複合体で構成されているため、実際の細胞表面上に発現している３者複合体を上記ＴＣＲが各々認識できるか確認する必要がある。さらに、これらＴＣＲを各々有するＣＴＬが、ＴＣＲと３者複合体との結合により活性化され、３者複合体を発現している細胞に対して細胞傷害活性を発揮できるかどうかは、各ＣＴＬクローン由来のＴＣＲのα鎖とβ鎖を人為的に導入発現させたリンパ球が生体内で機能するかを推測する上で重要である。そこで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬陽性細胞集団として検出可能なＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ペプチド特異的なＣＴＬ細胞集団（ＩＴＧ－ＭＴ３又はＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ）の細胞傷害活性を測定した。
【0082】
なお、細胞傷害活性の確認は、ＩＴＧ－ＭＴ３あるいはＦＫＳ－Ｄ１１Ｐをエフェクター細胞とし、培養細胞Ｃ１Ｒ－Ａ２４とＨＬＡ発現欠損細胞株Ｋ５６２とをターゲット細胞に用いて定法に従って実施した。また、Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するリンパ腫細胞株である（Ｏｉｓｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８１：３８７－３９４，１９９９ 参照のこと）。
【0083】
以下に具体的な実験方法を示す。ターゲット細胞であるＣ１Ｒ－Ａ２４及びＫ５６２をそれぞれ１ｍＬのペプチドパルス用培地に懸濁し、最終濃度が２０μｇ／ｍＬになるようにｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド、ＰＢＦペプチド又はＨＩＶペプチドを添加し、良く攪拌後、室温で１時間インキュベーションした。過剰量のペプチドパルス用培地を添加し、良く攪拌後、４００×ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を注意深く廃棄した。過剰量のペプチドを除去する目的でこの洗浄処理をさらに２回実施後、ＣＦＳＥにて染色を行った。適量のＣＴＬ培地に再懸濁し、細胞数を数えた。９６－ウェルＵ底プレートの１個のウェル当たり、５，０００個の標的細胞を添加し、エフェクター細胞の量を５００～１５０，０００個になるように添加し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で５時間培養した。培養後、塩化カルシウム溶液を１ｍＭの濃度で添加し、蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎ Ｖにて染色し、フローサイトメトリーにてＣＦＳＥでラベルされたターゲット細胞の死細胞率を測定した。
【0084】
細胞傷害活性（％）は次の計算式で算出した。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝［（Ｅ－Ｔ０）／（１００－Ｔ０）］×１００
Ｅはターゲット細胞とエフェクター細胞を共培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ Ｖ陽性細胞率を示し、Ｔ０はターゲット細胞のみを培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ Ｖ陽性細胞率を示す。
Ｅはターゲット細胞とエフェクター細胞を共培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ Ｖ陽性細胞率を示し、Ｔ０はターゲット細胞のみを培養した時のＣＦＳＥ陽性細胞集団中のＡｎｎｅｘｘｉｎ Ｖ陽性細胞率を示す。
【0085】
結果を図３Ａ及びＢに示した。これらの図面において、Ｘ軸にエフェクター細胞の細胞数と標的細胞の細胞数の比（Ｅ／Ｔ ｒａｔｉｏ）を、Ｙ軸に細胞傷害活性（％）を示した。図３Ａはエフェクター細胞にＩＴＧ－ＭＴ３を使用した場合の結果であり、図３Ｂはエフェクター細胞にＦＫＳ－Ｄ１１Ｐを使用した場合の結果である。ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４ではＥ／Ｔ比＝１０において９７％の細胞傷害活性が認められ、ＰＢＦペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４の場合ではＥ／Ｔ比＝１において７３．４％の細胞傷害活性が認められた。一方、ＨＩＶペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４の場合及びＫ５６２の場合は、細胞傷害活性はほとんど検出されなかった。以上より、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬ細胞集団（ＩＴＧ－ＭＴ３）とＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬ細胞集団（ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ）は、標的細胞の膜表面に発現しているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドをそれぞれ認識し、殺傷する事が可能な細胞集団であることが明らかになった。すなわち、このＣＴＬ膜表面上に発現しているＴＣＲは標的細胞の膜表面に発現しているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドをそれぞれ認識し、標的細胞を殺傷するシグナルを細胞内に伝達する機能を有するＴＣＲであることが示された。
【0086】
（実施例４） ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３及びＰＢＦ特異的ＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲ β鎖レパトア解析
本発明者らは、遺伝子を取得する過程でＰＣＲを繰り返し行うことによる予測不可能な変異の挿入を避けるために、遺伝子情報を抽出する前に取得可能な情報を得ておくべきと考えた。この目的のため、ＴＣＲβ鎖のＶβ領域を特異的に認識することが可能な抗体を用いたフローサイトメトリーにより２４種類のＶβ領域をレパトア分析することが可能なキット（ＩＯＴｅｓｔ ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖβ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｋｉｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を利用した。このキットに含まれているＴＣＲＶβ領域に特異的な抗体は、Ｖβ１、Ｖβ２、Ｖβ３、Ｖβ４、Ｖβ５．１、Ｖβ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ７．１、Ｖβ７．２、Ｖβ８、Ｖβ９、Ｖβ１１、Ｖβ１２、Ｖβ１３．１、Ｖβ１３．２、Ｖβ１３．６、Ｖβ１４、Ｖβ１６、Ｖβ１７、Ｖβ１８、Ｖβ２０、Ｖβ２１．３、Ｖβ２２、Ｖβ２３の２４種類である。このキットはＴＣＲβ鎖のＶβ領域の約７０％を検出可能であり、ＴＣＲβ鎖のＶβ領域のみの情報が判別できる。
本発明者らは、遺伝子を取得する過程でＰＣＲを繰り返し行うことによる予測不可能な変異の挿入を避けるために、遺伝子情報を抽出する前に取得可能な情報を得ておくべきと考えた。この目的のため、ＴＣＲβ鎖のＶβ領域を特異的に認識することが可能な抗体を用いたフローサイトメトリーにより２４種類のＶβ領域をレパトア分析することが可能なキット（ＩＯＴｅｓｔ ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖβ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｋｉｔ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を利用した。このキットに含まれているＴＣＲＶβ領域に特異的な抗体は、Ｖβ１、Ｖβ２、Ｖβ３、Ｖβ４、Ｖβ５．１、Ｖβ５．２、Ｖβ５．３、Ｖβ７．１、Ｖβ７．２、Ｖβ８、Ｖβ９、Ｖβ１１、Ｖβ１２、Ｖβ１３．１、Ｖβ１３．２、Ｖβ１３．６、Ｖβ１４、Ｖβ１６、Ｖβ１７、Ｖβ１８、Ｖβ２０、Ｖβ２１．３、Ｖβ２２、Ｖβ２３の２４種類である。このキットはＴＣＲβ鎖のＶβ領域の約７０％を検出可能であり、ＴＣＲβ鎖のＶβ領域のみの情報が判別できる。
【0087】
データーシートの操作手順に従い、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド特異的なＣＴＬクローン ＩＴＧ－ＭＴ３を染色分析した結果を図４Ａに、ＰＢＦペプチド特異的なＣＴＬクローン ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐを染色分析した結果を図４Ｂに示した。このキットには８本の染色試薬が入っており、ＣＴＬクローンを８本の試薬で染色することで２４種類のＶβ領域の分析が可能である。１本の試薬には、ＦＴＩＣ標識抗Ｖβ抗体、ＰＥ標識抗Ｖβ抗体、ＰＥとＦＩＴＣの両方で標識された抗Ｖβ抗体が含まれている。図４Ａ及びＢに示すドットプロット展開図は、Ｘ軸がＦＴＩＣ標識抗Ｖβ抗体の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識抗Ｖβ抗体の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を示す。四分割されたドットプロット展開図の左下領域はいずれの抗体でも染色されなかった細胞集団を示し、左上領域はＰＥ標識抗Ｖβ抗体で染色された細胞集団を示し、右上領域はＰＥとＦＩＴＣの両方で標識された抗Ｖβ抗体で染色された細胞集団を示し、右下領域は、ＦＴＩＣ標識抗Ｖβ抗体で染色された細胞集団を示す。各抗Ｖβ抗体が特異的に染色するＶβ領域のサブグループ名を図中に表記した。この結果、ＩＴＧ－ＭＴ３含まれる殆ど全ての細胞はＶβ８であり、ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐに含まれる殆ど全ての細胞はＶβ１であることが明らかになった。
【0088】
（実施例５） ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＣＴＬクローンＩＴＧ－ＭＴ３及びＰＢＦ特異的ＣＴＬクローンＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ由来ＴＣＲ遺伝子クローニング
－ＴＣＲ遺伝子のクローニング－
本発明者らは、ＩＭＧＴに登録されているＴＣＲの遺伝子情報を網羅的に分析し、全てのＴＣＲのα鎖とβ鎖の全長をクローニングできるように多数のプライマーを設計した。この方法の優位点は１回のＰＣＲで全長配列が取得できることである。この方法では、ＰＣＲ産物を基に得られたＤＮＡ配列情報に従ってプライマーを設計する必要が無いため、変異が含まれる可能性は最小限にとどめられている。しかしながら、プライマーの組合せが膨大になり、少ないｃＤＮＡを用いて検証できるＰＣＲの回数は限られている。そこで、ＰＣＲ反応をお互いに阻害しないことを確認したプライマーを１０～１１種類混合させたプライマーミックスを用いてＰＣＲを実施し、遺伝子産物が得られたプライマーミックスの全ての組合せでＰＣＲを実施して、全長配列が得られるように工夫した。プライマーミックスの組合せとＰＣＲの反応温度条件の設定は、既にＴＣＲのレパトアが報告されているＪｕｒｋａｔ細胞、未処理のヒトＰＢＭＣ、及び特定のＶβ鎖を発現するＴ細胞のそれぞれから調製したｃＤＮＡを用いて行った。特定のＶβ鎖を発現するＴ細胞は、ヒトＰＢＭＣよりＶβ鎖抗体を用いて自動磁気分離装置で分離濃縮して調製した。
－ＴＣＲ遺伝子のクローニング－
本発明者らは、ＩＭＧＴに登録されているＴＣＲの遺伝子情報を網羅的に分析し、全てのＴＣＲのα鎖とβ鎖の全長をクローニングできるように多数のプライマーを設計した。この方法の優位点は１回のＰＣＲで全長配列が取得できることである。この方法では、ＰＣＲ産物を基に得られたＤＮＡ配列情報に従ってプライマーを設計する必要が無いため、変異が含まれる可能性は最小限にとどめられている。しかしながら、プライマーの組合せが膨大になり、少ないｃＤＮＡを用いて検証できるＰＣＲの回数は限られている。そこで、ＰＣＲ反応をお互いに阻害しないことを確認したプライマーを１０～１１種類混合させたプライマーミックスを用いてＰＣＲを実施し、遺伝子産物が得られたプライマーミックスの全ての組合せでＰＣＲを実施して、全長配列が得られるように工夫した。プライマーミックスの組合せとＰＣＲの反応温度条件の設定は、既にＴＣＲのレパトアが報告されているＪｕｒｋａｔ細胞、未処理のヒトＰＢＭＣ、及び特定のＶβ鎖を発現するＴ細胞のそれぞれから調製したｃＤＮＡを用いて行った。特定のＶβ鎖を発現するＴ細胞は、ヒトＰＢＭＣよりＶβ鎖抗体を用いて自動磁気分離装置で分離濃縮して調製した。
【0089】
前述のＩＴＧ－ＭＴ３及びＦＫＳ－Ｄ１１Ｐから、ＲＮｅａｓｙ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを回収した。続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のマニュアルに従ってＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを用いて、ｃＤＮＡを調製した。ＴＣＲα鎖の全長配列を得るために、網羅的に設計した各ＴＣＲα鎖特異的なフォワードプライマーを１０－１１種類ずつ混合した、４種のプライマーミックスとＴＣＲα鎖のＣα領域に設計した１種類のリバースプライマーを用いて得られたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを実施した。その結果、ＩＴＧ－ＭＴ３由来のｃＤＮＡからは３種類のプライマーミックスでＰＣＲ産物が得られ、ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ由来のｃＤＮＡからは１種類のプライマーミックスでＰＣＲ産物が得られた。それぞれのプライマーミックスに含まれる個々のフォワードプライマーとＣα領域に設計した１種類のリバースプライマーを用いて、得られたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で展開した結果を図５Ａ及びＢに示した。
【0090】
ＩＴＧ－ＭＴ３のα鎖は合計３２組のプライマーでＰＣＲを行った結果、図５Ａに示す通り、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１３－２のプライマーでＰＣＲ産物の増幅が確認された。また、図５Ｂに示す通り、ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐのα鎖は合計１２組のプライマーでＰＣＲを行った結果、ＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ８－２のプライマーでＰＣＲ産物の増幅が確認された。
【0091】
次に、これらのＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯに遺伝子断片を挿入した後、定法に従ってＤＮＡ配列を解析した。判読した配列情報はＩＭＧＴのデータベースを用いてレパトア解析を行った。
【0092】
その結果、ＩＴＧ－ＭＴ３由来のＴＣＲα鎖は、２種類同定され、Ｖα－Ｊαの構成は、ＴＲＡＶ４／ＴＲＡＪ２７／ＴＲＡＣ（以下、「Ａ４」と記す）及びＴＲＡＶ１３－２／ＴＲＡＪ２４／ＴＲＡＣ（以下、「Ａ１３－２」と記す）であった（「Ａ４」については、図１４Ａ参照のこと）。ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ由来のＴＣＲα鎖は、ＴＲＡＶ１－１とＴＲＡＶ１－２のＰＣＲ産物が同一のＤＮＡ配列であり、Ｖα－Ｊαの構成は、ＴＲＡＶ１－２／ＴＲＡＪ４２／ＴＲＡＣ（以下、「Ａ１－２」と記す）であった（図１４Ｂ参照のこと）。なお、ＴＲＡＶ８－２のＰＣＲ産物の配列は、アミノ酸置換した場合に途中でストップコドンが入っていたため、シュードジーンであると考えられる。
【0093】
次に、ＩＴＧ－ＭＴ３及びＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲβ鎖の解析を行った。ＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲβ鎖については、図４Ａの結果よりＶβ８であった事からＴＣＲβ鎖の全長配列は、ＴＲＢＶ１２－３又はＴＲＢＶ１２－４に該当する。このＩＭＧＴに登録されているＴＲＢＶ１２－３及びＴＲＢＶ１２－４のシグナル配列特異的なフォワードプライマーを設計した。
【0094】
ＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲβ鎖については、図４Ｂの結果よりＶβ１であった事からＴＣＲβ鎖の全長配列は、ＴＲＢＶ９に該当する。したがって、ＩＭＧＴに登録されているＴＲＢＶ９のシグナル配列特異的なフォワードプライマーを設計した。これらフォワードプライマーと２種類のＴＣＲ Ｃβ領域に特異的なリバースプライマー（ＢＣ１とＢＣ２）を用いて得られたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動で展開した結果を図５Ａ及びＢに示した。
【0095】
図５Ａに示す通り、ＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲβ鎖では、ＢＣ１とＢＣ２の両方でＰＣＲ産物が得られた。また、図５Ｂに示す通り、ＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲβ鎖では、ＢＣ１でＰＣＲ産物が得られた。ＰＣＲ産物はいずれもアガロースゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯに遺伝子断片を挿入した後、定法に従ってＤＮＡ配列を解析した。その結果、ＩＴＧ－ＭＴ３のＴＣＲβ鎖では、ＴＲＢＶ１２－３／ＢＣ１、ＴＲＢＶ１２－３／ＢＣ２、ＴＲＢＶ１２－４／ＢＣ１、ＴＲＢＶ１２－４／ＢＣ２の４種のＰＣＲ産物がいずれも同一のＤＮＡ配列であった。ＩＭＧＴのデータベースを用いてレパトア解析を行った結果、ＩＴＧ－ＭＴ３由来のＴＣＲβ鎖は１種類同定され、Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ／Ｃβの構成は、ＴＲＢＶ１２－４／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－１／ＴＲＢＣ２（以下、「Ｂ１２－４」と記す）であった（図１５Ａ参照のこと）。また、ＦＫＳ－Ｄ１１ＰのＴＣＲβ鎖は、１種類同定され、Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ／Ｃβの構成は、ＴＲＢＶ９／ＴＲＢＤ１／ＴＲＢＪ１－１／ＴＲＢＣ１（以下、「Ｂ９」と記す）であった（図１５Ｂ参照のこと）。
【0096】
（実施例６） 培養細胞での発現とＴＣＲα鎖とβ鎖の組合せ確認
ＩＴＧ－ＭＴ３由来の２種類のＴＣＲα鎖（Ａ４とＡ１３－２）と１種類のβ鎖（Ｂ１２－４）の正しい組合せを解明する為に、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にｃＤＮＡをサブクローニングした。コントロールとして、本発明者らが過去に同定したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＷＴ１特異的ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のｃＤＮＡを用い、同様に発現ベクターを構築した（特開２０１４－１４３９８２，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ． ２０１３；３４：４１－５０）。
ＩＴＧ－ＭＴ３由来の２種類のＴＣＲα鎖（Ａ４とＡ１３－２）と１種類のβ鎖（Ｂ１２－４）の正しい組合せを解明する為に、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にｃＤＮＡをサブクローニングした。コントロールとして、本発明者らが過去に同定したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＷＴ１特異的ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のｃＤＮＡを用い、同様に発現ベクターを構築した（特開２０１４－１４３９８２，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ． ２０１３；３４：４１－５０）。
【0097】
遺伝子導入に使用した培養細胞株は、ヒト白血病由来であるＪｕｒｋａｔの変異株で、ＴＣＲβ鎖を欠損しているＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５やＪｕｒｋａｔ／ＭＡ、ＴＣＲα鎖を欠損しているＳｕｐ－Ｔ１を使用した。これら３種の細胞株がＴＣＲを発現していないことは、抗ＴＣＲ ｐａｎ α／β抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いたフローサイトメトリーで確認した。遺伝子導入は、Ｎｅｏｎ(登録商標） Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてエレクトロポレーション法で実施した。３日間静置培養後、細胞集団の一部を分取し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬若しくはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬にて染色し、フローサイトメーターにて分析した。
【0098】
その結果を図６に示した。Ｘ軸はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸はＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示す。ｐｃＤＮＡ３．１とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓを遺伝子導入した細胞集団（ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌｓ）と、ｐｃＤＮＡ３．１－Ａ１３－２とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ－Ｂ１２－４を遺伝子導入した細胞集団ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ１３－２／Ｂ１２－４では、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬陽性の細胞集団は確認できなかった。一方、ｐｃＤＮＡ３．１－Ａ４とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ－Ｂ１２－４を遺伝子導入した細胞集団ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬で２４．０％の陽性細胞が確認された。ｐｃＤＮＡ３．１－Ａ１－２とｐＥＦ６／Ｍｙｃ－Ｈｉｓ－Ｂ９を遺伝子導入した細胞集団ＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬で１６．４％の陽性細胞が確認された。
【0099】
以上より、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬と特異的に結合するＴＣＲは、ＴＣＲα鎖がＴＲＡＶ４／ＴＲＡＪ２７／ＴＲＡＣであり、ＴＣＲβ鎖がＴＲＢＶ１２－４／ＴＲＢＤ２／ＴＲＢＪ２－１／ＴＲＢＣ２であることが明らかとなった。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬と特異的に結合するＴＣＲは、ＴＣＲα鎖がＴＲＡＶ１－２／ＴＲＡＪ４２／ＴＲＡＣであり、ＴＣＲβ鎖がＴＲＢＶ９／ＴＲＢＤ１／ＴＲＢＪ１－１／ＴＲＢＣ１であることが明らかとなった。同定したＴＣＲの略図を図７Ａ及びＢに示した。
【0100】
（実施例７） ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞（ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓ）の樹立
陽性像が得られた細胞集団ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４及びＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９に、各ベクターの耐性薬剤であるＧ４１８（Ｒｏｃｈｅ社）と、Ｂｌａｓｔｉｓｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、薬剤耐性のＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓをそれぞれ樹立した。ＳＭＴ３ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を図８Ａに示した。ＰＤ１１ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を図８Ｂに示した。これらの図面において、Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示した。各ドットプロット上部に使用したＭＨＣテトラマー試薬の種類を示した。各ドットプロットを四分割した右上に存在する抗ＣＤ８抗体陽性かつＭＨＣテトラマー試薬陽性細胞の生細胞中での存在率（％）を示した。
陽性像が得られた細胞集団ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４及びＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９に、各ベクターの耐性薬剤であるＧ４１８（Ｒｏｃｈｅ社）と、Ｂｌａｓｔｉｓｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、薬剤耐性のＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓをそれぞれ樹立した。ＳＭＴ３ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を図８Ａに示した。ＰＤ１１ＳのＭＨＣテトラマー試薬に対する反応性を検証した結果を図８Ｂに示した。これらの図面において、Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示した。各ドットプロット上部に使用したＭＨＣテトラマー試薬の種類を示した。各ドットプロットを四分割した右上に存在する抗ＣＤ８抗体陽性かつＭＨＣテトラマー試薬陽性細胞の生細胞中での存在率（％）を示した。
【0101】
ＳＭＴ３ＳはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬に対して８９．６％の細胞集団が反応し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は７２０、変動係数（ＣＶ値）は６１．２であった。ＰＤ１１ＳはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬に対して９５．８％の細胞集団が反応し、ＭＦＩは３７９、ＣＶ値は４２．８であった。一方、ＭＨＣテトラマー試薬のコントロールとして用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー－ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ－ＰＥでは特異的な染色は認められなかった。
【0102】
以上より、ＳＭＴ３ＳとＰＤ１１Ｓに遺伝子導入されているＴＣＲ遺伝子は、それぞれテトラマー試薬と結合する能力を有するＴＣＲタンパク質として翻訳され、それぞれの細胞膜表面上に機能的に発現している事が明らかとなった。
【0103】
（実施例８） ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓを用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ テトラマー試薬の評価（添加回収試験）
ＳＭＴ３Ｓ細胞を用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬の評価の正確性及びＰＤ１１Ｓ細胞を用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬の評価の正確性を確認する目的で添加回収試験を行った。実験方法は、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓと、ＴＣＲ遺伝子を導入していない親株細胞とを混合し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬で染色後、その陽性率と混合率から期待される陽性率とを比較した。培養中のＳＭＴ３Ｓ、ＰＤ１１Ｓ及びこれら形質転換細胞の親細胞株から各々２０μＬの細胞浮遊液を分取し、２０μＬのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ ０．４％（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え血球計算盤にて生細胞数をカウントした。次いで、測定した生細胞数に基づき、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓと親細胞株とを各々混合し、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓの存在比率が１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．３％、３．１％、１．６％、０．８％、０．４％、０％の細胞集団を調整した。各細胞集団から５×１０５個細胞をエッペンドルフチューブに分取し、４００×ｇで５分間遠心処理後、上清を注意深く廃棄した。１ｍＬのＦＣＭバッファーを添加し、再懸濁後、４００×ｇで５分間遠心し、上清を注意深く廃棄した。２０μＬのＦＣＭバッファーと１０μＬのＣｌｅａｒ Ｂａｃｋ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを加え良く攪拌後、室温にて５分間反応させた。１０μＬのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬あるいはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬を加え穏やかに攪拌後、４℃で３０分間反応させた。１０μＬのＣＤ８（ｃｌｏｎｅ Ｔ８）－ＦＩＴＣを加え、４℃で２０分間反応させた。適量のＦＣＭバッファーを加え４００×ｇで５分間遠心した。上清を注意深く捨て、７－ＡＡＤを１％添加したＦＣＭバッファーを４００μＬ加えて細胞を懸濁し、フローサイトメーターで細胞を取込み分析した。なお、解析はＦＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ｈドットプロット展開図中で選択した領域をＲ１とし、ＦＳＣ－Ｈ／７－ＡＡＤドットプロット展開図での生細胞領域（すなわち、７－ＡＡＤ陰性細胞集団）をＲ２として、「Ｒ１かつＲ２」の細胞集団において行った。得られた結果を図９Ａ及びＢに示した。これらの図面において、Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示した。図９ＡはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬を用いて染色した結果である。ＳＭＴ３Ｓの各混合率のドットプロット展開図を四分割した右上に陽性率を示した。ＳＭＴ３Ｓが１００％の時の陽性率が９１．０％であったことから、混合率から期待される陽性率を、ドットプロット展開図を四分割した右上のカッコ内に示した。図９ＢはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬を用いて染色した結果である。ＰＤ１１Ｓが１００％の時の陽性率が９２．８％であったことから、混合率から期待される陽性率を、ドットプロット展開図を四分割した右上のカッコ内に示した。これらの添加回収試験の結果より、ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓの混合率はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬によって正確に陽性率として検出されることが明らかとなった。
ＳＭＴ３Ｓ細胞を用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬の評価の正確性及びＰＤ１１Ｓ細胞を用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬の評価の正確性を確認する目的で添加回収試験を行った。実験方法は、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓと、ＴＣＲ遺伝子を導入していない親株細胞とを混合し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬で染色後、その陽性率と混合率から期待される陽性率とを比較した。培養中のＳＭＴ３Ｓ、ＰＤ１１Ｓ及びこれら形質転換細胞の親細胞株から各々２０μＬの細胞浮遊液を分取し、２０μＬのＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ ０．４％（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え血球計算盤にて生細胞数をカウントした。次いで、測定した生細胞数に基づき、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓと親細胞株とを各々混合し、ＳＭＴ３Ｓ又はＰＤ１１Ｓの存在比率が１００％、５０％、２５％、１２．５％、６．３％、３．１％、１．６％、０．８％、０．４％、０％の細胞集団を調整した。各細胞集団から５×１０５個細胞をエッペンドルフチューブに分取し、４００×ｇで５分間遠心処理後、上清を注意深く廃棄した。１ｍＬのＦＣＭバッファーを添加し、再懸濁後、４００×ｇで５分間遠心し、上清を注意深く廃棄した。２０μＬのＦＣＭバッファーと１０μＬのＣｌｅａｒ Ｂａｃｋ Ｈｕｍａｎ ＦｃＲ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを加え良く攪拌後、室温にて５分間反応させた。１０μＬのＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬あるいはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬を加え穏やかに攪拌後、４℃で３０分間反応させた。１０μＬのＣＤ８（ｃｌｏｎｅ Ｔ８）－ＦＩＴＣを加え、４℃で２０分間反応させた。適量のＦＣＭバッファーを加え４００×ｇで５分間遠心した。上清を注意深く捨て、７－ＡＡＤを１％添加したＦＣＭバッファーを４００μＬ加えて細胞を懸濁し、フローサイトメーターで細胞を取込み分析した。なお、解析はＦＳＣ－Ｈ／ＳＳＣ－Ｈドットプロット展開図中で選択した領域をＲ１とし、ＦＳＣ－Ｈ／７－ＡＡＤドットプロット展開図での生細胞領域（すなわち、７－ＡＡＤ陰性細胞集団）をＲ２として、「Ｒ１かつＲ２」の細胞集団において行った。得られた結果を図９Ａ及びＢに示した。これらの図面において、Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示した。図９ＡはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬を用いて染色した結果である。ＳＭＴ３Ｓの各混合率のドットプロット展開図を四分割した右上に陽性率を示した。ＳＭＴ３Ｓが１００％の時の陽性率が９１．０％であったことから、混合率から期待される陽性率を、ドットプロット展開図を四分割した右上のカッコ内に示した。図９ＢはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬を用いて染色した結果である。ＰＤ１１Ｓが１００％の時の陽性率が９２．８％であったことから、混合率から期待される陽性率を、ドットプロット展開図を四分割した右上のカッコ内に示した。これらの添加回収試験の結果より、ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓの混合率はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬によって正確に陽性率として検出されることが明らかとなった。
【0104】
（実施例９） ＳＭＴ３Ｓ，ＰＤ１１Ｓを用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２テトラマー試薬の評価（濃度依存的染色性の検証と保存安定性の確認）
フローサイトメーターで使用するＭＨＣテトラマー試薬の保存安定性を確認するためには、ポジティブコントロール細胞が必須である。ポジティブコントロール細胞は、常に試薬に対して同一の反応性を示すことが重要である。ＳＭＴ３ＳやＰＤ１１Ｓのようにテトラマー試薬が特異的に結合するＴＣＲ遺伝子が導入された安定的形質転換細胞は理想的なポジティブコントロール細胞といえる。そこで、本発明者らはＳＭＴ３ＳとＰＤ１１Ｓを利用して、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬及びＰＢＦテトラマー試薬の保存安定性試験の実施方法を検証した。ＭＨＣテトラマー試薬の保存安定性は、フローサイトメトリーで期待される陽性率が保たれる期間として評価できる。ＳＭＴ３ＳとＰＤ１１Ｓの陽性率をそれぞれ５～１５％に調整し、定期的に試薬の希釈系列により反応性を確認し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ テトラマー試薬陽性率、ＭＦＩ、ＣＶ値を分析することで保存安定性の検証を行った。
フローサイトメーターで使用するＭＨＣテトラマー試薬の保存安定性を確認するためには、ポジティブコントロール細胞が必須である。ポジティブコントロール細胞は、常に試薬に対して同一の反応性を示すことが重要である。ＳＭＴ３ＳやＰＤ１１Ｓのようにテトラマー試薬が特異的に結合するＴＣＲ遺伝子が導入された安定的形質転換細胞は理想的なポジティブコントロール細胞といえる。そこで、本発明者らはＳＭＴ３ＳとＰＤ１１Ｓを利用して、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬及びＰＢＦテトラマー試薬の保存安定性試験の実施方法を検証した。ＭＨＣテトラマー試薬の保存安定性は、フローサイトメトリーで期待される陽性率が保たれる期間として評価できる。ＳＭＴ３ＳとＰＤ１１Ｓの陽性率をそれぞれ５～１５％に調整し、定期的に試薬の希釈系列により反応性を確認し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ テトラマー試薬陽性率、ＭＦＩ、ＣＶ値を分析することで保存安定性の検証を行った。
【0105】
図１０Ａに、保存安定性試験の一つの例として、ＳＭＴ３Ｓ細胞の存在比率を約１０％に調整した細胞集団を用いてＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬の試験データを示した。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬は、精製ビオチン化モノマー濃度換算で反応溶液中の濃度が、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０μｇ／ｍＬとなるように調整した。図１０Ａ（ａ）は、Ｘ軸がＦＩＴＣ標識ＣＤ８抗体の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸がＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を示す。各ドットプロット展開図の四分割右上にＭＨＣテトラマー試薬陽性かつＣＤ８陽性の細胞集団の陽性率とＭＦＩを示した。図１０Ａ（ｂ）にはＭＦＩと試薬濃度の関係を示すグラフを、図１０Ａ（ｃ）には、ＣＶ値と試薬濃度の関係を示すグラフを示した。この結果より、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬は０．６２５μｇ／ｍＬの濃度でも陽性細胞の検出が可能だが、検出感度としては２．５μｇ／ｍＬの濃度以下でＭＦＩが徐々に低下し、ＣＶ値が上昇することから、２．５μｇ／ｍＬを検出感度の許容範囲のボーダーラインに設定できることが示唆された。
【0106】
図１０Ｂに、保存安定性試験の一つの例として、ＰＤ１１Ｓ細胞の存在比率を約１４％に調整した細胞集団を用いてＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬の試験データを示した。ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬は、精製ビオチン化モノマー濃度換算で反応溶液中の濃度が、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０μｇ／ｍＬとなるように調整した。図１０Ｂ（ａ）は、Ｘ軸がＦＩＴＣ標識ＣＤ８抗体の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸がＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬の蛍光強度（ｌｏｇスケール）を示す。各ドットプロット展開図の四分割右上にＭＨＣテトラマー試薬陽性かつＣＤ８陽性の細胞集団の陽性率とＭＦＩを示した。図１０Ｂ（ｂ）にはＭＦＩと試薬濃度の関係を示すグラフを、図１０Ｂ（ｃ）には、ＣＶ値と試薬濃度の関係を示すグラフを示した。この結果より、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬は０．６２５μｇ／ｍＬの濃度でも陽性細胞の検出が可能だが、検出感度としては１．２５μｇ／ｍＬの濃度以下でＭＦＩが低下し、ＣＶ値も徐々に上昇することから、１．２５μｇ／ｍＬを検出感度の許容範囲のボーダーラインに設定できることが示唆された。
【0107】
以上より、ＳＭＴ３ＳやＰＤ１１Ｓのように、テトラマー試薬が特異的に結合するＴＣＲ遺伝子が導入された安定的形質転換細胞を用いて経時的に反応性の検証を行う事で、ＭＨＣテトラマー試薬の保存安定性試験を実施する事が可能であることが示された。
【0108】
（実施例１０） ＴＣＲ遺伝子（ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４、ＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９）の発現とテトラマー試薬のＣＤ８依存性に関する検討
実施例６で使用した細胞株のうち、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５はＭＨＣとＴＣＲの結合を補佐するＣＤ８分子を発現していない細胞株である。この細胞株にＴＣＲを遺伝子導入し、テトラマー試薬で反応性が確認できた場合、そのＴＣＲにおいてはＭＨＣ分子との結合の際にＣＤ８分子の補佐を必須としないことが証明できる。ＭＨＣ分子との結合の際にＣＤ８分子の影響が低いＴＣＲを取得することは、ＴＣＲテトラマーやＴＣＲマルチマー等、取得したＴＣＲ遺伝子をツール化する上で非常に重要である。ＴＣＲ遺伝子配列ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４とＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９に関して、いかにその後の開発に有用な配列であるかを確認するため、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５にこれらのＴＣＲ遺伝子を遺伝子導入し、発現確認を行った。その結果、図１１Ａ及びＢに示す通り、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４とＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９のいずれにおいても各テトラマー試薬との反応が確認された。
実施例６で使用した細胞株のうち、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５はＭＨＣとＴＣＲの結合を補佐するＣＤ８分子を発現していない細胞株である。この細胞株にＴＣＲを遺伝子導入し、テトラマー試薬で反応性が確認できた場合、そのＴＣＲにおいてはＭＨＣ分子との結合の際にＣＤ８分子の補佐を必須としないことが証明できる。ＭＨＣ分子との結合の際にＣＤ８分子の影響が低いＴＣＲを取得することは、ＴＣＲテトラマーやＴＣＲマルチマー等、取得したＴＣＲ遺伝子をツール化する上で非常に重要である。ＴＣＲ遺伝子配列ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４とＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９に関して、いかにその後の開発に有用な配列であるかを確認するため、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５にこれらのＴＣＲ遺伝子を遺伝子導入し、発現確認を行った。その結果、図１１Ａ及びＢに示す通り、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４とＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９のいずれにおいても各テトラマー試薬との反応が確認された。
【0109】
テトラマー試薬とＴＣＲの相互作用において、ＣＤ８分子は上記の通り非常に重要な分子であり、テトラマー試薬の反応性がＣＤ８抗体の由来となるクローンの種類に影響されることは周知の事実である（Ｍａｔｈｅｗ Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊｕｌ ２０１１；１８７：６５４－６６３ 参照のこと）。また、取得したＴＣＲがＣＤ８非依存的に機能するか否かを事前に予期することも困難である（ＴＶ Ｍｏｏｒｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，Ｍａｙ ２００９；５８（５）：７１９－２８ 参照のこと）。そこで、テトラマー試薬とＴＣＲの結合を阻害しないことが知られているＣＤ８抗体クローンＴ８（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と、阻害的に働くことが知られているＣＤ８抗体クローンＲＦＴ－８（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）の２種類のクローンを用いて、今回取得したＴＣＲのテトラマー染色性に差が見られるかを確認した。その結果を図１１Ｃに示す。なお、染色には今回樹立したＳＭＴ３Ｓ、ＰＤ１１Ｓの存在比率を約１０％に調製した細胞集団をそれぞれ使用した。
Ｃｏｕｌｔｅｒ社）と、阻害的に働くことが知られているＣＤ８抗体クローンＲＦＴ－８（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）の２種類のクローンを用いて、今回取得したＴＣＲのテトラマー染色性に差が見られるかを確認した。その結果を図１１Ｃに示す。なお、染色には今回樹立したＳＭＴ３Ｓ、ＰＤ１１Ｓの存在比率を約１０％に調製した細胞集団をそれぞれ使用した。
【0110】
また、比較対照として、ＷＴ１ ＴＣＲ遺伝子発現形質転換細胞株ＳＫ３７を使用した（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ．３４（１）：４１－５０，２０１３ 参照のこと）。この細胞株に発現しているＷＴ１ ＴＣＲは、対応するテトラマー試薬との反応において、ＣＤ８分子の補佐が必要であることが明らかになっている。また、図１１Ｄには、クローンＴ８使用時のテトラマー陽性率を１００％とした時の、クローンＲＦＴ－８使用時のテトラマー陽性率の割合を示した。
【0111】
図１１Ｃに示した通り、ＳＭＴ３Ｓ及びＰＤ１１Ｓにおいては、クローンＴ８及びクローンＲＦＴ－８のいずれのクローンを用いた場合でも、各テトラマー試薬との反応が確認された。ＳＫ３７においては、クローンＴ８使用時にはテトラマー試薬との反応性が確認されたが、クローンＲＦＴ－８使用時にはテトラマー試薬との反応性が見られなかった。
【0112】
また、図１１Ｄに示した結果から明らかなように、ＳＭＴ３Ｓ及びＰＤ１１Ｓにおいては、ＲＦＴ－８使用時でもそれぞれ９２．３％、９０．８％と、Ｔ８使用時の９割以上のテトラマー陽性細胞が検出できたが、ＳＫ３７においては５．１％しか検出されなかった。
【0113】
これらのことより、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ Ａ４／Ｂ１２－４とＰＢＦ ＴＣＲ Ａ１－２／Ｂ９は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２分子との結合の際にＣＤ８分子の補佐を必須としないことが明らかとなり、マルチマー化されたこれらＴＣＲは、ＭＨＣ／ｐｅｐｔｉｄｅ複合体の検出において有用なツールとして機能することも証明された。
【0114】
（実施例１１） ＴＣＲのα鎖とβ鎖を利用した癌細胞あるいは抗原提示細胞の検出１
ＨＬＡに目的とするペプチド断片が提示されているかどうかの判定は非常に難しく、抗ＨＬＡ／ぺプチド複合体抗体やＴＣＲマルチマー等の研究が盛んに行われている。現在世界中で２００種類以上のがんペプチドワクチン療法の臨床試験が進められているが、接種するペプチドの選択は、患者癌検体を用いたＰＣＲ法によるｍＲＮＡレベルの判定、又は癌抗原タンパク質そのものに対する抗体を用いた組織染色による癌抗原タンパク質の検出が主たる解析方法として用いられている。しかしながら、癌を特異的に認識するＣＴＬは癌抗原タンパク質そのものを認識して癌細胞を殺傷するのではなく、癌抗原タンパク質が癌細胞内で分解され、そのペプチド断片がＨＬＡに結合して細胞膜表面上に提示されている場合に癌細胞を認識して殺傷する。すなわち、癌細胞膜表面上でＨＬＡとペプチドが複合体を形成している状態を認識している。ＨＬＡとペプチドが複合体を形成している状態を検出可能な試薬は、がん免疫療法を実施する上で、適切な癌抗原を選択する為に必須の分析ツールとなり得る。発明者らは本発明により同定したＴＣＲ遺伝子を用いてこの様な分析ツールとして利用できないかについて、検討を実施した。
ＨＬＡに目的とするペプチド断片が提示されているかどうかの判定は非常に難しく、抗ＨＬＡ／ぺプチド複合体抗体やＴＣＲマルチマー等の研究が盛んに行われている。現在世界中で２００種類以上のがんペプチドワクチン療法の臨床試験が進められているが、接種するペプチドの選択は、患者癌検体を用いたＰＣＲ法によるｍＲＮＡレベルの判定、又は癌抗原タンパク質そのものに対する抗体を用いた組織染色による癌抗原タンパク質の検出が主たる解析方法として用いられている。しかしながら、癌を特異的に認識するＣＴＬは癌抗原タンパク質そのものを認識して癌細胞を殺傷するのではなく、癌抗原タンパク質が癌細胞内で分解され、そのペプチド断片がＨＬＡに結合して細胞膜表面上に提示されている場合に癌細胞を認識して殺傷する。すなわち、癌細胞膜表面上でＨＬＡとペプチドが複合体を形成している状態を認識している。ＨＬＡとペプチドが複合体を形成している状態を検出可能な試薬は、がん免疫療法を実施する上で、適切な癌抗原を選択する為に必須の分析ツールとなり得る。発明者らは本発明により同定したＴＣＲ遺伝子を用いてこの様な分析ツールとして利用できないかについて、検討を実施した。
【0115】
Ｊｕｒｋａｔ細胞亜株であるＪｕｒｋａｔ／ＭＡ細胞には、ＴＣＲのシグナルにより活性化する転写因子ＮＦ－ＡＴの下流にレポータージーンを組み込んだベクターが遺伝子導入されている。（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００２；９９（１）：７－１３）。本実施例では、Ｊｕｒｋａｔ／ＭＡに実施例６で示した特異的なＴＣＲを安定的に発現させた遺伝子導入細胞株を樹立し、該細胞に予め導入されたレポータージーンによるルシフェラーゼ活性を指標に、細胞表面のＨＬＡに目的ペプチドが提示されていることを検出可能かについて検証した。
【0116】
先ず、Ｊｕｒｋａｔ／ＭＡ細胞に実施例７と同様の方法でｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲ遺伝子（Ａ４／Ｂ１２－４）あるいはＰＢＦ ＴＣＲ遺伝子（Ａ１－２／Ｂ９）を遺伝子導入した安定的形質転換細胞、ＳＭＴ３ＪとＰＤ１１Ｊをそれぞれ樹立した。樹立した細胞株の特異性を確認した結果を図１２Ａ及びＢに示した。これら図面において、Ｘ軸にＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体の染色強度（ｌｏｇスケール）を、Ｙ軸にＰＥ標識ＭＨＣテトラマー試薬の染色強度（ｌｏｇスケール）を示した。各ドットプロット上部に使用したＭＨＣテトラマー試薬の種類を示した。各ドットプロットを四分割した右上に、存在する抗ＣＤ８抗体陽性かつＭＨＣテトラマー試薬陽性細胞の生細胞中での存在率（％）を示した。
【0117】
ＳＭＴ３ＪはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂテトラマー試薬に対して８９．２％の細胞集団が反応し、ＭＦＩは２６６、ＣＶ値は６５．１であった。ＰＤ１１ＳはＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＰＢＦテトラマー試薬に対して９３．２％の細胞集団が反応し、ＭＦＩは７５６、ＣＶ値は３７．２であった。一方、ＭＨＣテトラマー試薬のコントロールとして用いたＨＬＡ－Ａ＊２４：０２ ＨＩＶ ｅｎｖテトラマー－ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ－ＰＥでは特異的な染色はいずれも認められなかった。この結果はＳＭＴ３Ｊが人工的に作製したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド（ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ）とβ２ｍの複合体に結合し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とＨＩＶ ｅｎｖペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ）とβ２ｍの複合体には結合しない事を示している。同様にＰＤ１１Ｊが人工的に作製したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とＰＢＦペプチド（ＡＹＲＰＶＳＲＮＩ）とβ２ｍの複合体に結合し、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とＨＩＶ ｅｎｖペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ）とβ２ｍの複合体には結合しない事を示している。
【0118】
次に、実際の細胞膜表面上に発現しているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とβ２ｍとｓｕｒｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドの複合体にも反応するかどうかを検証した。すなわち、上記の通りに樹立したＳＭＴ３Ｊ及びＰＤ１１Ｊを用いて、ＴＣＲから下流に存在するＮＦ－ＡＴを介したシグナル伝達を、上記ルシフェラーゼの活性を指標として検出した。実験は以下のように実施した。ターゲット細胞として、各種ペプチドをパルスしたＫ５６２又はＣ１Ｒ－Ａ２４を用いた。Ｋ５６２にはｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドを１０μｇ／ｍＬの濃度でパルスし、ＨＩＶペプチドは１０μｇ／ｍＬの濃度でＣ１Ｒ－Ａ２４にパルスして使用した。Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞にはｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドは、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬの濃度でパルスした。１×１０５個のターゲット細胞と、同量のＳＭＴ３Ｊ細胞あるいはＰＤ１１Ｊ細胞を、２００μＬの培地中でＵ底の９６－ウェルプレートで混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。培養後、Ｕ底の９６－ウェルプレートを４００×ｇで５分間遠心し、上清を捨てて２００μＬのＰＢＳで２回洗浄してＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で懸濁し、一回の凍結融解を行った。遠心して上清を回収し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図１３Ａ及びＢに示した。これら図面において、Ｘ軸にターゲット細胞の種類とパルスしたペプチドの濃度を、Ｙ軸にルシフェラーゼ活性を示した。
【0119】
図１３Ａに示した通り、ＳＭＴ３Ｊ細胞は、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４細胞を認識し、ペプチド濃度依存的に活性が上昇することが明らかになった。また、図１３Ｂに示した通り、ＰＤ１１Ｊ細胞は、ＰＢＦペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４細胞を認識し、ペプチド濃度依存的に活性が上昇することが明らかになった。
【0120】
以上の結果は、本発明において同定されたＴＣＲを用い、患者由来の生検試料を対象として同様の解析を行っても当該試料に含まれる細胞集団のＨＬＡ－Ａ＊２４：０２において、エピトープが提示されているかどうかを判別できることを意味している。
【0121】
（実施例１２） ＴＣＲマルチマーの作製及びＴＣＲのα鎖とβ鎖を利用した癌細胞あるいは抗原提示細胞の検出２
癌抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を発現させた安定形質転換細胞株を利用して、目的とするＨＬＡとペプチドの複合体を発現している抗原提示細胞、あるいは癌細胞を検出する方法を実施例１１に示した。しかしながら、特異的なＴＣＲ遺伝子を発現させた安定形質転換細胞株を利用する方法では、常に安定形質転換細胞株を良好な条件下で培養維持する必要がある。加えて安定形質転換細胞株では継代を重ねることで遺伝子の脱落など予測不可能な現象が生じる可能性があり、必ずしも安定した実験系が複数の施設で実施できるかについては保証できない。そのため、特異的なＴＣＲと反応するＭＨＣテトラマー試薬のように、人工的に合成した試薬で代用できることが望ましい。
癌抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を発現させた安定形質転換細胞株を利用して、目的とするＨＬＡとペプチドの複合体を発現している抗原提示細胞、あるいは癌細胞を検出する方法を実施例１１に示した。しかしながら、特異的なＴＣＲ遺伝子を発現させた安定形質転換細胞株を利用する方法では、常に安定形質転換細胞株を良好な条件下で培養維持する必要がある。加えて安定形質転換細胞株では継代を重ねることで遺伝子の脱落など予測不可能な現象が生じる可能性があり、必ずしも安定した実験系が複数の施設で実施できるかについては保証できない。そのため、特異的なＴＣＲと反応するＭＨＣテトラマー試薬のように、人工的に合成した試薬で代用できることが望ましい。
【0122】
ＭＨＣテトラマー試薬は多量体化する事でＴＣＲとの結合を検出する事が可能になった。また、ＴＣＲも単量体ではＭＨＣ（ＨＬＡ）とペプチドの複合体に結合する能力が低いと考えられる。そこで、本発明者らは、ＭＨＣテトラマー試薬の製造と同様に、ＴＣＲ遺伝子を用いて人工的にＴＣＲタンパク質を製造し、これを用いてＴＣＲマルチマーの試薬化を検討した。すなわち、本実施例の目的は、上述の通りにして得られたＴＣＲの配列に基づき、可溶性ＴＣＲの多量体（ＴＣＲマルチマー）を作製し、ＴＣＲマルチマーによって、細胞表面上に提示されたＨＬＡとペプチドの複合体を検出可能であるかを検証する事にある。
【0123】
（１）可溶性ＴＣＲをコードする発現コンストラクトの調製
図１６に示す通り、先ず、ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖又はＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖の細胞外領域のＣ末端側にリンカーを介してＦｏｓのロイシンジッパー領域及び６×Ｈｉｓ－ｔａｇが付加されてなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を設計した。またＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖又はＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖の細胞外領域のＣ末端側にリンカーを介してＪｕｎのロイシンジッパー領域及びビオチン結合部位（ＢｉｒＡ認識サイト）が付加されてなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も設計した。
図１６に示す通り、先ず、ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖又はＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖の細胞外領域のＣ末端側にリンカーを介してＦｏｓのロイシンジッパー領域及び６×Ｈｉｓ－ｔａｇが付加されてなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を設計した。またＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖又はＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖の細胞外領域のＣ末端側にリンカーを介してＪｕｎのロイシンジッパー領域及びビオチン結合部位（ＢｉｒＡ認識サイト）が付加されてなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も設計した。
【0124】
なお、化学と生物 Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．８「ロイシンジッパー 転写制御因子に固有な新しい構造」においても示されているように、Ｆｏｓ及びＪｕｎのロイシンジッパー領域がお互いに結合する事を利用し、これらタグが各々付加されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖を培養細胞にて発現させることにより、これらを二量体化させて可溶性ＴＣＲを作出することが可能となる。
【0125】
次に、上記にて設計したヌクレオチド配列に基づき、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社にてｃＤＮＡを化学合成した。次いで、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＸＣ１７．４及びｐＸＣ１８．４（Ｌｏｎｚａ社）に前記ｃＤＮＡを各々サブクローニングし、ｐＸＣ１７．４－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲα及びｐＸＣ１８．４－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲβを得た。続いてｐＸＣ１８．４－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲβを制限酵素Ｎｏｔ ＩとＳａｌ Ｉで切断して得られたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲβ遺伝子断片を、同じ制限酵素で切断したｐＸＣ１７．４－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲαに組み込むことで、ｐＸＣ－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ ＴＣＲαβのダブルジーンベクターを作製した。同様にしてｐＸＣ－ＰＢＦ ＴＣＲαβのダブルジーンベクターを作製した。
【0126】
（２）ＴＣＲマルチマーの作製
次に、上記の通りにして設計した可溶性ＴＣＲを発現させるべく、前記発現ベクターを培養細胞株に導入した。遺伝子導入に使用した培養細胞株は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ ＧＳＫＯ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。なお、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ ＧＳＫＯはＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞のグルタミン合成酵素（ＧＳ）の欠失変異株で、ＧＳをコードする上記発現ベクター（ｐＸＣ１７．４）と組み合わせて用いることにより、当該合成酵素系を指標としてクローンの選択を行うこと（ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））が可能である。また、遺伝子導入は、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてエレクトロポレーション法で実施した。このようにして遺伝子導入を行った後、限界希釈法により可溶性ＴＣＲを発現する細胞を単クローン化し、可溶性ＴＣＲを高発現する安定形質転換細胞株を取得した。なお、可溶性ＴＣＲの発現確認は、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で行った。
次に、上記の通りにして設計した可溶性ＴＣＲを発現させるべく、前記発現ベクターを培養細胞株に導入した。遺伝子導入に使用した培養細胞株は、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ ＧＳＫＯ（Ｌｏｎｚａ社）を用いた。なお、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ ＧＳＫＯはＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞のグルタミン合成酵素（ＧＳ）の欠失変異株で、ＧＳをコードする上記発現ベクター（ｐＸＣ１７．４）と組み合わせて用いることにより、当該合成酵素系を指標としてクローンの選択を行うこと（ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））が可能である。また、遺伝子導入は、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてエレクトロポレーション法で実施した。このようにして遺伝子導入を行った後、限界希釈法により可溶性ＴＣＲを発現する細胞を単クローン化し、可溶性ＴＣＲを高発現する安定形質転換細胞株を取得した。なお、可溶性ＴＣＲの発現確認は、抗Ｈｉｓ－ｔａｇ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で行った。
【0127】
培養細胞から培養上清に分泌されたＴＣＲは、可溶性ＴＣＲのα鎖に付加されている６×Ｈｉｓ－ｔａｇを利用してＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製した。次いで、可溶性ＴＣＲのβ鎖のＣ末端側に付加したビオチン結合部位にＢｉｒＡ酵素を用いてビオチンを付加した。ビオチン化された可溶性ＴＣＲをカラムクロマトグラフィー法で精製し、色素標識されたストレプトアビジンと、ビオチン化可溶性ＴＣＲとをモル比１：４で混合し、ＴＣＲマルチマーを得た。
【0128】
（実施例１３） ＴＣＲマルチマーの評価
上記の通りにして得られたＴＣＲマルチマーの染色性評価のため、先ずＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とsｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドとの複合体を形成する細胞の調製を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現する上述のＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度１０μｇ／ｍＬのｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドと混合し、またはネガティブコントロールとして同濃度のＨＩＶペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。
上記の通りにして得られたＴＣＲマルチマーの染色性評価のため、先ずＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とsｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドとの複合体を形成する細胞の調製を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現する上述のＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度１０μｇ／ｍＬのｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドと混合し、またはネガティブコントロールとして同濃度のＨＩＶペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。
【0129】
ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、上記の通りにして調製したＴＣＲマルチマーは、可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した後、２μＬのＨＬＡ－Ａ２４－ＦＩＴＣ抗体（ＭＢＬ社）を加え、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＦＣＭバッファーに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターで解析した。結果を図１７Ａ及びＢに示す。
【0130】
なお、図１７Ａは、Ｘ軸にＴＣＲマルチマーに対する蛍光をｌｏｇスケールで示し、Ｙ軸に細胞数を示したヒストグラム図で表されており、白色のヒストグラムはペプチドの溶媒であるＤＭＳＯのみを処理した細胞、灰色のヒストグラムはＨＩＶペプチドをパルスした細胞、黒色のヒストグラムはｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞を示した。図１７Ｂは、各細胞集団のＭＦＩを示す棒グラフであり、ＤＭＳＯのみを処理した細胞、ＨＩＶペプチドをパルスした細胞及びｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞におけるＭＦＩは、それぞれ０．７６、０．６８及び２．０２であった。
【0131】
また、図１８Ａ及びＢにおいて、前記同様の方法にて、ＴＣＲマルチマーの濃度依存性について解析した結果を示す。ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、添加したＴＣＲマルチマーは、可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算しての終濃度は、０．３μｇ／ｍＬ、１．２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬとして、これら５条件について検討した。図１８Ａは、Ｘ軸にＴＣＲマルチマーに対する蛍光をｌｏｇスケールで示し、Ｙ軸に細胞数を示したヒストグラム図で表されており、灰色のヒストグラムはＨＩＶペプチドをパルスした細胞、黒色のヒストグラムはｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞を表している。また、各細胞集団のＭＦＩを算出し、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした細胞集団におけるそれをシグナルとし、ＨＩＶペプチドをパルスした細胞集団におけるそれをノイズとし、ＴＣＲマルチマーの可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算した各終濃度におけるシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した。得られた結果を図１８Ｂに示す。なお、図１８Ｂには、Ｘ軸にＴＣＲマルチマーの終濃度（可溶性ＴＣＲモノマー換算濃度）を、Ｙ軸にＳ／Ｎ比を表している。ＴＣＲマルチマーの終濃度：０．３μｇ／ｍＬ、１．２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ及び８０μｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比はそれぞれ、１．０４２、１．４６４、２．２６７、３．５３３及び５．５４９であった。
【0132】
図１７Ａ、１７Ｂ、１８Ａ及び１８Ｂにおいて示す通り、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドをパルスした場合のみＭＦＩの増加が観察され（特に図１７Ｂ参照のこと）、ＴＣＲマルチマーの終濃度依存的にＳ／Ｎ比が増大していることが認められた（特に図１８Ｂ参照のこと）。したがって、実施例１２において製造したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＴＣＲマルチマーは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とそれによって提示されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチドとの複合体に対して特異的に反応していることが明らかになった。
【0133】
（実施例１４） ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーの評価
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーの反応性を評価するため、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とＰＢＦペプチドとの複合体を形成する細胞の調製を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのＰＢＦペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。
ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーの反応性を評価するため、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とＰＢＦペプチドとの複合体を形成する細胞の調製を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのＰＢＦペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。
【0134】
ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、ＴＣＲマルチマーを可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＦＣＭバッファーに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターで解析した。得られた結果を図１９Ａに示す。なお、図１９Ａは、Ｘ軸にＴＣＲマルチマーに対する蛍光をｌｏｇスケールで示し、Ｙ軸に細胞数を示したヒストグラム図で表されており、図中の数値はＭＦＩを示す。 また、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーの濃度依存性について解析すべく、最終濃度１０μｇ／ｍＬにてペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、ＴＣＲマルチマーを可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＦＣＭバッファーに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターで解析した。得られた結果を図１９Ｂに示す。なお、図１９Ｂは、Ｘ軸にＴＣＲマルチマーに対する蛍光をｌｏｇスケールで示し、Ｙ軸に細胞数を示したヒストグラム図で表されており、図中の数値はＭＦＩを示す。
【0135】
図１９Ａ、１９Ｂにおいて示す通り、ＰＢＦペプチドをパルスした場合のみＭＦＩの増加が観察され、かつパルスしたＰＢＦペプチドの濃度依存的にＭＦＩが増大し（特に図１９Ａ参照のこと）、ＴＣＲマルチマーの終濃度依存的にＭＦＩが増大していることが認められた（特に図１９Ｂ参照のこと）。したがって、実施例１２において製造したＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とそれによって提示されたＰＢＦペプチドとの複合体に対して特異的に反応していることが確認された。
【0136】
（実施例１５） 抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体によるブロッキングアッセイ
Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するリンパ腫細胞株であるが、他にもＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１を有する。そこで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に対する特異性を確認する目的で、抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体をＨＬＡ－Ａ２４とエピトープペプチドとの複合体に結合させた場合に、ＴＣＲマルチマーの反応性に変化が生じることを確認した。
Ｃ１Ｒ－Ａ２４細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するリンパ腫細胞株であるが、他にもＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１を有する。そこで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に対する特異性を確認する目的で、抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体をＨＬＡ－Ａ２４とエピトープペプチドとの複合体に結合させた場合に、ＴＣＲマルチマーの反応性に変化が生じることを確認した。
【0137】
抗原提示細胞として、Ｃ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞を最終濃度１０μｇ／ｍＬのｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド又はＰＢＦペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、ＨＬＡ－Ａ２４とＴＣＲの結合を阻害することが知られている抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体クローンＣ７７０９Ａ２（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７；６（２）：１９９－２０８ 参照のこと）又はネガティブコントロールとしてアイソタイプコントロール抗体を、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加して穏やかに混合し、４℃で１時間ブロッキング処理した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を５０μＬのＦＣＭバッファーに再懸濁し、ＴＣＲマルチマーをそれぞれ添加して４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞を４００μＬのＦＣＭバッファーに再懸濁し、２４時間以内にフローサイトメーターで解析した。得られた結果を図２０に示す。なお、図２０において、白色のヒストグラムはアイソタイプコントロール抗体にてブロッキング処理した細胞を、灰色のヒストグラムは抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体にてブロッキング処理した細胞を示す。
【0138】
図２０に示した通り、アイソタイプコントロール抗体にてブロッキング処理した場合と抗ＨＬＡ－Ａ２４抗体にてブロッキング処理した場合のＭＦＩを比較したところ、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂ特異的ＴＣＲマルチマーのＭＦＩは２４．６から８．８へ減少しており、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーのＭＦＩは９８２から１１．３に減少した。したがって、実施例１２において製造したＴＣＲマルチマーは、いずれもＨＬＡ－Ａ＊２４：０２とそれによって提示されたｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドあるいはＰＢＦペプチドとの複合体に対して特異的に反応していることが確認された。
【0139】
（実施例１６） 蛍光顕微鏡による観察
上記にて製造したＴＣＲマルチマーのうち、反応性の高かったＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーに関して、蛍光顕微鏡による観察を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのＰＢＦペプチド又は１０μｇ／ｍＬのＨＩＶペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、ＴＣＲマルチマーを可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞をＦＣＭバッファーに再懸濁し、うち１００μＬを３ｃｍのＧＬＡＳＳ ＢＡＳＥ ＤＩＳＨ（ＩＷＡＫＩ社）に分取した。これらの細胞をＨＳオールインワンＢＺ９０００蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社）にて観察した。得られた結果を図２１Ａに示す。なお、図２１Ａにおいて、「ＴＣＲ－ｍｕｌｔｉｍｅｒ」は、ＴＣＲマルチマーの標識色素に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示す（図２１Ｂにおいても同じ）。
上記にて製造したＴＣＲマルチマーのうち、反応性の高かったＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーに関して、蛍光顕微鏡による観察を行った。抗原提示細胞として、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２を発現するＣ１Ｒ－Ａ２４を用い、当該細胞に最終濃度０μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのＰＢＦペプチド又は１０μｇ／ｍＬのＨＩＶペプチドと混合し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータで２４時間培養することで、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２へペプチドをパルスした。ペプチドパルスを行ったＣ１Ｒ－Ａ２４細胞の適量に対して、ＴＣＲマルチマーを可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞をＦＣＭバッファーに再懸濁し、うち１００μＬを３ｃｍのＧＬＡＳＳ ＢＡＳＥ ＤＩＳＨ（ＩＷＡＫＩ社）に分取した。これらの細胞をＨＳオールインワンＢＺ９０００蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社）にて観察した。得られた結果を図２１Ａに示す。なお、図２１Ａにおいて、「ＴＣＲ－ｍｕｌｔｉｍｅｒ」は、ＴＣＲマルチマーの標識色素に由来する蛍光シグナルを検出した結果を示す（図２１Ｂにおいても同じ）。
【0140】
図２１Ａに示した通り、０．１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのＰＢＦペプチドをパルスした細胞において、細胞表面に特異的なシグナルが観察された。１０μｇ／ｍＬのＨＩＶペプチドをパルスした細胞においては、特異的なシグナルは観察されなかった。
【0141】
次に、ＰＢＦを発現していることが分かっているＨＬＡ－Ａ＊２４：０２陽性の骨肉腫由来細胞株ＫＩＫＵ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. １９８８；４８（８）：２２７３－２２７９ 参照のこと）について、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーによる染色を行った。ＫＩＫＵの適量に対して、ＴＣＲマルチマーを可溶性ＴＣＲモノマー濃度で換算して終濃度２０μｇ／ｍＬになるように添加して穏やかに混合し、４℃で３０分静置した。１．５ｍＬのＦＣＭバッファーを加え撹拌後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引廃棄後、細胞をＦＣＭバッファーに再懸濁し、うち１００μＬを３ｃｍのＧＬＡＳＳ ＢＡＳＥ ＤＩＳＨ（ＩＷＡＫＩ社）に分取した。これらの細胞をＨＳオールインワンＢＺ９０００蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社）にて観察した。得られた結果を図２１Ｂに示す。
【0142】
図２１Ｂに示した通り、ＫＩＫＵに関して、細胞表面に特異的なシグナルが観察された。ＰＢＦペプチドをパルスしなくてもＫＩＫＵがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２－ＰＢＦ特異的ＴＣＲマルチマーによって染色された事から、ＫＩＫＵで発現しているＰＢＦが、プロテアソームにより分解されＰＢＦペプチドとしてＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に結合し、ＫＩＫＵ細胞表面に提示されている事が確認された。
【産業上の利用可能性】
【0143】
以上説明したように、本発明によれば、ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２ＢペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示された状態及びＰＢＦペプチドがＨＬＡ－Ａ＊２４：０２に提示された状態を認識することができる。本発明のＴＣＲを発現させた細胞や本発明のＴＣＲを多量体化した分子は、ペプチドワクチン療法を行う場合のコンパニオン診断薬として、また、樹状細胞ワクチン療法を行う場合に樹状細胞のＨＬＡに目的のペプチドが提示されているか否かを確認するための試薬として利用しうる。また、癌細胞へ薬物を送達するためのツールとしても利用しうる。さらには、ＭＨＣテトラマー試薬の品質管理にも利用しうる。したがって、本発明は、主として医療分野及び関連する研究分野に大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【0144】
配列番号：１
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１
配列番号：２
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２
配列番号：３
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３
配列番号：４
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖の可変領域
配列番号：５
＜２２３＞ 可溶性ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖
配列番号：６
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１
配列番号：７
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２
配列番号：８
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３
配列番号：９
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖の可変領域
配列番号：１０
＜２２３＞ 可溶性ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖
配列番号：１１
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１
配列番号：１２
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２
配列番号：１３
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３
配列番号：１４
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖の可変領域
配列番号：１５
＜２２３＞ 可溶性ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖
配列番号：１６
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１
配列番号：１７
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２
配列番号：１８
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３
配列番号：１９
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖の可変領域
配列番号：２０
＜２２３＞ 可溶性ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２１
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖
配列番号：２３
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２５
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖
配列番号：２７
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２９
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド
配列番号：３０
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＰＢＦペプチド
配列番号：３１
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＨＩＶ ｅｎｖペプチド
配列番号：３２
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１
配列番号：２
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２
配列番号：３
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３
配列番号：４
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖の可変領域
配列番号：５
＜２２３＞ 可溶性ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖
配列番号：６
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１
配列番号：７
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２
配列番号：８
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３
配列番号：９
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖の可変領域
配列番号：１０
＜２２３＞ 可溶性ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖
配列番号：１１
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ１
配列番号：１２
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ２
配列番号：１３
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖のＣＤＲ３
配列番号：１４
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖の可変領域
配列番号：１５
＜２２３＞ 可溶性ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖
配列番号：１６
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ１
配列番号：１７
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ２
配列番号：１８
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３
配列番号：１９
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖の可変領域
配列番号：２０
＜２２３＞ 可溶性ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２１
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲα鎖
配列番号：２３
＜２２３＞ ＩＴＧ－ＭＴ３ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２５
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲα鎖
配列番号：２７
＜２２３＞ ＦＫＳ－Ｄ１１Ｐ ＴＣＲβ鎖
配列番号：２９
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ｓｕｒｖｉｖｉｎ－２Ｂペプチド
配列番号：３０
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＰＢＦペプチド
配列番号：３１
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２拘束性ＨＩＶ ｅｎｖペプチド
配列番号：３２
＜２２３＞ ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【配列表】