7141637 アガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属細菌、その変異株である細菌、海藻分解用細菌並びにアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-14

(45)【発行日】2022-09-26

(54)【発明の名称】アガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属細菌、その変異株である細菌、海藻分解用細菌並びにアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220915BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2018220801

(22)【出願日】2018-11-27

(65)【公開番号】P2020080741

(43)【公開日】2020-06-04

【審査請求日】2021-09-13

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02802

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000125369

【氏名又は名称】学校法人東海大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100111464

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 悦子

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 英臣

(72)【発明者】

【氏名】木原 稔

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－１９５２２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０８－２９８９３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１９２９０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】FEMS Microbiology Letters，2015年04月02日，Vol. 362，1-7，doi:10.1093/femsle/fnv054

【文献】International Journal of Systematic and Evolutionaly Microbiology，2016年，Vol. 66，p. 3119-3124，doi:10.1099/ijsem.0.001155

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその変異株であって、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する、
細菌。

【請求項2】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその変異株である細菌からなり、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する、
ことを特徴とする海藻分解用細菌。

【請求項3】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその変異株である細菌からなり、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する、
ことを特徴とするアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属細菌、その変異株である細菌、海藻分解用細菌並びにアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌に関する。

【背景技術】

【0002】

アガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属は、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ綱内のＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科に属し、主に、貝類、海藻、海水、干潟の土壌等から分離されている。

【0003】

アガリボランス属に共通している特徴の一つに、アガー分解能が挙げられる。アガーは海藻、特に紅藻に含まれる主要な多糖類の一つであることから、アガリボランス属は、海洋環境の炭素循環等において中心的な役割を果たすと考えられている。

【0004】

非特許文献１には、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ＹＫＷ－３４のアガー分解酵素を精製して性状解析したことが記載されている。

【0005】

一方で、アガーと同様に主要な海藻多糖類の一つであるアルギン酸の分解能についても、アガリボランス属において報告されている。非特許文献２には、アガリボランス属細菌であるＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ＹＫＷ－３４のアルギン酸分解酵素を精製して性状解析したことが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７８，２６５－２７３，２００８

【文献】Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４１，８２８－８３４，２００７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、アガー及びアルギン酸以外の複数の多糖類の分解活性を有するアガリボランス属細菌については、今まで報告がなされていなかった。

【0008】

本発明者らは、海洋生物において新規のアガリボランス属細菌を見出し、本発明を完成した。本発明は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有する新規のアガリボランス属細菌又はその変異株である細菌及び海藻分解用細菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の第１の観点に係る細菌は、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその変異株であって、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する。

【0012】

本発明の第２の観点に係る海藻分解用細菌は、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその
変異株である細菌からなり、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する。

【0013】

本発明の第３の観点に係るアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン
及びキシラン分解用細菌は、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその
変異株である細菌からなり、
前記変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有し、
前記変異株は、配列番号１に示される塩基配列と９９％以上の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有する新規のアガリボランス属細菌又はその変異株である細菌及び海藻分解用細菌を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】単離株のアガー分解酵素活性及びアルギン酸分解酵素活性を測定した結果を示す図である。

【図2】Ｔｏｙｏｕｒａ００１株陰性染色細胞の透過電子顕微鏡像を示す図である。

【図3】１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列から推測される、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株とその近縁種が含まれるＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌との系統発生的関係を示す系統樹の図である。Ｔｏｙｏｕｒａ００１株の配列を太字で示す。節（ｎｏｄｅ）には５０％を超えるブートストラップ値が示される。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＳＭ ５００７１Ｔ（Ｘ０６６８４）の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をアウトグループとして使用した。

【発明を実施するための形態】

【0016】

まず、本実施形態によるアガリボランス（Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ）属細菌について説明する。

【0017】

本実施形態によるアガリボランス属細菌は、アガリボランス属に属する新規の種であり、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔと系統的に近いが、これとは明確に異なる新規微生物である。該アガリボランス属細菌は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン、キシランを栄養源として増殖できる。つまり、本実施形態によるアガリボランス属細菌は、アガー、アルギン酸、ペクチン及びキシラン分解活性を有する。

【0018】

次に、本実施形態による受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌又はその変異株である細菌について説明する。

【0019】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌は、本明細書において「Ｔｏｙｏｕｒａ００１」とも称される。受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２として寄託されたアガリボランス属細菌（Ｔｏｙｏｕｒａ００１）は、配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する。

【0020】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１は、平成３０年１１月７日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２にて寄託された。

【0021】

本明細書においてＴｏｙｏｕｒａ００１の変異株とは、例えば、配列番号１に示される塩基配列と９５％以上、好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは１００％の相同性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を有する菌株をいう。また、Ｔｏｙｏｕｒａ００１の変異株は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有する。

【0022】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１の変異株は、例えば、Ｔｏｙｏｕｒａ００１から当業者に公知の変異処理により誘導され得る。該変異処理として、例えば、紫外線、γ線といった放射線等の照射、メチルニトロソウレア等の変異原性化学物質の接触、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理等が挙げられる。

【0023】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１は、例えば、日本近海で捕獲したアワビを解剖して腸内容物を採取し、マリンブロス寒天培地に塗布して培養し、アガー及びアルギン酸分解活性を有する株を単離することで得ることができる。

【0024】

次に、本実施形態による海藻分解用細菌について説明する。

【0025】

本実施形態による海藻分解用細菌は、前述のアガリボランス属細菌又はＴｏｙｏｕｒａ００１若しくはその変異株からなる。本実施形態による海藻分解用細菌は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有するため、海藻成分の多糖類（例えば、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン）を効率良く分解し、海藻を分解することができる。本明細書において、「海藻」とは、海産種群の藻類の総称であり、褐藻類、紅藻類及び緑藻類が包含され、例えば、褐藻類として、アラメ、ガゴメコンブなど、紅藻類として、キリンサイ、クロバラノリ（スサビノリ）、トサカノリ、オゴノリなど、緑藻類として、ヒトエグサ（アオサ）などが挙げられる。本明細書において、「海藻分解」とは、海藻成分の多糖類（例えば、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン）を分解することで、海藻が軟化すること、海藻が物理的に分解すること等をいう。

【0026】

次に、本実施形態によるアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌について説明する。

【0027】

本実施形態によるアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌は、前述のアガリボランス属細菌又はＴｏｙｏｕｒａ００１若しくはその変異株からなる。本実施形態によるアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解用細菌は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有する。つまり、該細菌は、アガー分解活性、アルギン酸分解活性、フコイダン分解活性、カラギーナン分解活性、ペクチン分解活性及びキシラン分解活性の６つの分解活性を併せ持つ。アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシランの分解活性は、例えば、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシランをそれぞれ唯一の炭素源とした培地（例えば、Ｅｎｓｏｒ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔｏｓｚ，Ｓ．Ｋ．，＆ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ｍ．（１９９９）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ２－４０．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（２），１２３－１２６．に準拠）において該細菌を培養し、培養前後の培養液の濁度を比較することで測定することができる。また、アガー分解酵素活性については、例えば、該細菌をＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ液体培地に懸濁して振とう培養し、遠心分離後の上澄み液をフィルター滅菌して菌体外酵素（酵素液）を得て、該酵素液とリン酸緩衝液とを混合した後、基質溶液（アガーを含むリン酸緩衝液）を添加混合して反応させ、遠心分離後の反応液上清にジニトロサリチル酸試薬を加えて加熱し、氷冷後、吸光度を５４５ｎｍで測定し、アガロース分解の生成物であるガラクトースを用いて検量線を作成し、ガラクトース生成量を酵素活性とすることで測定することができる。また、アルギン酸分解酵素活性については、例えば、該細菌をＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ液体培地に懸濁して振とう培養し、遠心分離後の上澄み液をフィルター滅菌して菌体外酵素（酵素液）を得て、酵素液とＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液とを混合した後、アルギン酸ナトリウム含有Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加混合して反応させ、遠心分離後の反応液上清の吸光度を２３５ｎｍで測定し、吸光度を１分間あたり０．０１増加させる酵素活性を１Ｕとして測定することができる。

【0028】

以上説明したように、本実施形態によるアガリボランス属細菌又はＴｏｙｏｕｒａ００１若しくはその変異体は、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有する新規なＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓ属細菌である。これまでのアガリボランス属では報告のない多糖類分解能を利用した、高効率な海藻分解技術への活用を可能とする。本実施形態によるアガリボランス属細菌又はＴｏｙｏｕｒａ００１若しくはその変異体を活用することで、例えば、海藻廃棄物の減量、易消化型海藻飼料の開発等が期待される。

【実施例】

【0029】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0030】

（実施例１）
アワビの腸内容物から、新規のアガリボランス属細菌株（Ｔｏｙｏｕｒａ００１）を単離し、多糖類分解活性を調べた。

【0031】

北海道虻田郡豊浦町の海岸で野生アワビＨａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ｈａｎｎａｉを捕獲した。捕獲した翌日、アワビを解剖して腸内容物を採取し、フィルター滅菌した人工海水（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ、Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）に懸濁させた。得られた懸濁液をマリンブロス（Ｄｉｆｃｏ社）の１．５％寒天プレート上に塗布して、１５℃で１０日間培養した。培養後、寒天上に複数のコロニーが形成されたが、寒天を凹ませながら生育するコロニーが観察された。形成されたコロニーのうち、寒天を凹ませるもの４個（株名：２０３株、２０６株、２１９株、２２５株）、寒天を凹ませないもの４個（株名：２０１株、２０４株、２２０株、２２２株）について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を解読して簡易同定したところ、寒天を凹ませるものはすべてアガリボランス属細菌であり、凹ませないものはＡｌｌｉｖｉｂｒｉｏ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ属細菌の近縁種であると推定された。

【0032】

上記８株（２０１、２０３、２０４、２０６、２１９、２２０、２２２、２２５株）について、アガー分解活性及びアルギン酸分解活性を測定した。なお、２０１、２０３、２０４、２０６、２１９、２２０の６株と、２２２、２２５の２株と、は、それぞれ別個体のアワビから単離されたものであった。

【0033】

アガー分解酵素活性及びアルギン酸分解酵素活性の測定方法について説明する。
（１）酵素溶液の調製
単離した細菌をＭａｒｉｎｅ Ｂｒｏｔｈ液体培地に懸濁して振とう培養（１５℃、２４ｈ）し、遠心分離（２，８００ｒｐｍ、２０分間、４℃）後の上澄み液をフィルター滅菌（ＤＩＳＭＩＣ－２５、０．４５μｍ）して菌体外酵素を得た。

【0034】

（２）アガー分解酵素活性
アガー分解酵素活性の基質溶液には、０．２５％のアガー（試薬特級、富士フイルム和光純薬）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を使用した。酵素液とリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）とを混合した後、基質溶液を添加混合して、３０℃で３０分間反応させた。遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後の反応液上清にジニトロサリチル酸試薬を加え、１００℃で５分間加熱した。氷冷後、吸光度を５４５ｎｍで測定した。アガロース分解の生成物であるガラクトースを用いて検量線を作成し、ガラクトース生成量を酵素活性とした。

【0035】

（３）アルギン酸分解酵素活性
酵素液と０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）とを混合した後、１％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウム含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加混合して、３０℃で３０分間反応させた。遠心分離（８，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）後の反応液上清の吸光度を２３５ｎｍで測定した。酵素活性は、吸光度を１分間あたり０．０１増加させる酵素活性を１Ｕと定義した。アルギン酸分解酵素活性測定については、Ｉｎｏｕｅ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｌｙａｓｅ，ＦｌＡｌｙＡ，ｆｒｏｍ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＵＭＩ－０１ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍａｒｉｎｅ Ｄｒｕｇｓ，１２，４６９３－４７１２．を参考にした。

【0036】

結果を図１に示す。８株のうち、２０３、２０６、２１９、２２５株については、アガー分解酵素活性及びアルギン酸分解酵素活性の両方を有することが確認され、特に「２０６株」においてアガー分解酵素活性及びアルギン酸分解酵素活性が高いことが示された。そこで、この「２０６株」を「Ｔｏｙｏｕｒａ００１株」（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８０２）と命名した。

【0037】

（実施例２）
実施例１で得られた「Ｔｏｙｏｕｒａ００１株」について、形態、生理学的性状、化学的性状、遺伝子型特性等について調べた。

【0038】

前述のマリンブロスの１．５％寒天プレート上で生育したＴｏｙｏｕｒａ００１株を単離し、ＭＢ培地に移し、１５℃で２４時間振とうしながらインキュベートし、次いで、以下の実験に使用するまで培養液に２０％グリセロールを補充して－８０℃で保存した。比較対象のＡｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔは、ＮＩＴＥ生物資源センター（ＮＢＲＣ）から入手した。

【0039】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株をＭＢ寒天プレート上で、２５℃で２４時間培養した後、コロニー形態及びグラム染色を観察した。ＭＢ培地で２５℃、２４時間培養した細胞の形態を陰性染色して透過型電子顕微鏡で観察し、光学顕微鏡下、ハンギングドロップ法で運動性を評価した。ＭＢ寒天上で２４時間培養し、４～４０℃（４、１０、１５、２０、２５、３０、３５及び４０℃）で増殖の温度範囲及び最適条件を決定した。ｐＨ範囲及び最適増殖条件を、２０ｍＭの濃度で緩衝液（ＭＥＳ（ｐＨ５．０～６．０）、ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５～７．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５～８．０）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．５）及びＣＨＥＳ（ｐＨ９．０～１０．０））を用いて２５℃で２４時間、ＭＢ培地中で試験した。０～８．０％ＮａＣｌ（０、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０）を補充したＲ２Ａ（Ｄｉｆｃｏ社）培地中で、２５℃で４８時間、ＮａＣｌ濃度及び最適増殖条件を調べた。嫌気的条件下での増殖を、ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｇａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて２５℃で２週間、ＭＢ寒天培地上でのインキュベーションによって試験した。カタラーゼ活性の測定については、Ｋｉｍ，Ｓ．Ｇ．，Ｐｈｅｎｇ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｊ．，Ｅｏｍ，Ｍ．Ｋ．，＆ Ｓｈｉｎ，Ｄ．Ｈ．（２０１６）．Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｅｓｔｕａｒｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｇａｒ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｔｉｄａｌ ｆｌａｔ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６（８），３１１９－３１２４．を参照した。炭水化物からの酸生成についてはＡＰＩ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）、種々の酵素活性についてはＡＰＩＺＹＭ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）、ＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）及びＡＰＩ２０Ｅ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を用いて試験した。単糖類、二糖類及び有機酸の資化性については、それぞれを唯一の炭素源とした最少培地（人工海水（Ｐａｒｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ｌｉｔｏｒｅｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｎｏｖｅｌ ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅａｗａｔｅｒ ａｎｄ ｅｍｅｎｄｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，１０６（５），１０４１－１０４７．）に、塩化アンモニウム、微量金属溶液（表１）及びビタミン溶液（表２）を添加したもの）を用いて試験した。２５℃で２４時間培養し、培養前後の培養液の濁度を比較し、資化性を判別した。すべてのＡＰＩ試験は、細胞懸濁液を３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液で調製したことを除いて、製品説明書に従って２５℃で行った。抗生物質に対する感受性を、各抗生物質（最終濃度；μｇ／ｍｌ）（アンピシリン（１０）、カルベニシリン（１００）、クロラムフェニコール（３０）、エリスロマイシン（１５）、ゲンタマイシン（１０）、カナマイシン（３０）、ナリジクス酸（３０）、ネオマイシン（３０）、ペニシリンＧ（１０）、ストレプトマイシン（１０）、テトラサイクリン（１０）及びバンコマイシン（３０））を補充したＭＢ培地で試験した。培養物を２５℃で２４時間インキュベートした。

【0040】

【表1】

【0041】

【表2】

【0042】

２５℃で２４時間、ＭＢ培地で培養した細胞１００ｍｇからＳａｓｓｅｒの方法（Ｓａｓｓｅｒ，Ｍ．（１９９０）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ，ＭＩＤＩ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ １０１．Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ：ＭＩＤＩ Ｉｎｃ．）を参照して細胞性脂肪酸メチルエステルを抽出し、Ｓｈｅｒｌｏｃｋ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（ＭＩＤＩ Ｉｎｃ．）によって分析した。また、２５℃で２４時間、ＭＢ培地で培養した細胞１００ｍｇからメタノール／クロロホルム／ＭｉｌｌｉＱ水（１０：５：４）及びクロロホルム／ＭｉｌｌｉＱ水（１：１）を用いてイソプレノイドキノンを精製した。得られた精製キノンをＨＰＬＣ（Ｔａｍａｏｋａ，Ｊ．，Ｋａｔａｙａｍａ－Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｙ．，＆ Ｋｕｒａｉｓｈｉ，Ｈ．（１９８３）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，５４（１），３１－３６．）により同定した。極性脂質をメタノール／０．３％ ＮａＣｌ（１０：１、ｖ／ｖ）及び石油エーテルで抽出し、Ｍｉｎｎｉｋｉｎらの方法（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ ＤＥ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＭＤ，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｍ．Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ，Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｘａ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９７９；４７：８７-９５．；Ｃｏｌｌｉｎｓ ＭＤ，Ｊｏｎｅｓ Ｄ．Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ２，４－ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ．Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９８０；４８：４５９-４７０．）を用いて分析した。

【0043】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の全配列（１，５３９ｂｐ）（配列番号１）を、ドラフトゲノム配列上のｒＲＮＡオペロン（１６Ｓ－２３Ｓ－５Ｓ）から読み出した。分離株の近接系統を同定するために、ＢＬＡＳＴ検索を行った。ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ Ｖｅｒ．１９（Ｇｅｎｅｔｙｘ）を用いて、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株と標準株との間の配列類似性を計算した。系統解析のために、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースから、アガリボランス属の４種の標準菌株とアルテロモナス科の菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を検索した。ＭＡＦＦＴプログラム（Ｋａｔｏｈ，Ｋ．，＆ Ｔｏｈ，Ｈ．（２００８）．Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＭＡＦＦＴ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，９（４），２８６－２９８．）を用いて、ヌクレオチド配列の複数のアラインメントを生成した。ＭＥＧＡ ｖｅｒ．７．０．２１ソフトウェア（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｇ．，＆ Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．（２０１６）．ＭＥＧＡ７： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０ ｆｏｒ ｂｉｇｇｅｒ ｄａｔａｓｅｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，３３（７），１８７０－１８７４．）を用いて、近隣結合法及びＴａｍｕｒａ－Ｎｅｉ置換モデル（Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．，＆ Ｎｅｉ，Ｍ．（１９９３）．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，１０（３），５１２－５２６．）に基づいて系統樹を作成した。Ｔｏｙｏｕｒａ００１株とＡ．ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔ（Ｙａｓｕｉｋｅ，Ｍ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｋａｉ，Ｗ．，Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ａ．，Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．，Ｓａｔｏｍｉ，Ｍ．，＆ Ｓａｎｏ，Ｍ．（２０１３）．Ｄｒａｆｔ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＫＴ １０６Ｔ，ａｎ ａｇａｒｏｌｙｔｉｃ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓ，１（４），ｅ００３６７－１３．）との間のドラフトゲノムの平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）及びＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含量を、ＥＺ ＢｉｏＣｌｏｕｄのＡＮＩ計算機及びＪＧＩ微生物種同定機（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｗｏｎ，Ｓ．，Ｌｉｍ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｓｅｏ，Ｈ．，＆ Ｃｈｕｎ，Ｊ．（２０１７）．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ：ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｕｎｉｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ６７（５），１６１３－１６１７．；Ｖａｒｇｈｅｓｅ，Ｎ．Ｊ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．，Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｍａｖｒｏｍｍａｔｉｓ，Ｋ．，Ｋｙｒｐｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，＆ Ｐａｔｉ，Ａ．（２０１５）．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（１４），６７６１－６７７１．）を用いて検証した。

【0044】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、２５℃で２４時間培養した後、ＭＢ寒天培地に白いコロニーを形成させた。そのまま培養を続けると、細菌は完全に寒天を溶かした。細胞はグラム染色で陰性であり、厳密に好気性であり、運動性が高く、桿状（幅０．９～１．２μｍ、長さ２．３～３．７μｍ）の単一極鞭毛を形成した（図２）。コロニーは、円形で、わずかに凸状で、色は白色で、ＭＢ寒天プレート上では周囲にクレーターを形成した。Ｔｏｙｏｕｒａ００１株の増殖は、１．０～８．０％ＮａＣｌ（至適濃度５．０％）の存在下で、ｐＨ５．５～１０．０（至適ｐＨ ７．５）及び１０℃～３０℃（至適温度２５℃）で起こることが判明した。なお、同条件で調べたところ、Ａ．ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔの至適ＮａＣｌ濃度は４．０％であり、他のアガリボランス属の標準株も、いずれも２．０～３．０％ＮａＣｌ中で最適に増殖することが知られている（Ｄｕ，Ｚ．Ｊ．，Ｌｖ，Ｇ．Ｑ．，Ｒｏｏｎｅｙ，Ａ．Ｐ．，Ｍｉａｏ，Ｔ．Ｔ．，Ｘｕ，Ｑ．Ｑ．，＆ Ｃｈｅｎ，Ｇ．Ｊ．（２０１１）．Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ｇｉｌｖｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅａｗｅｅｄ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６１（３），４９３－４９６．；Ｐａｒｋ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｊｕｎｇ，Ｙ．Ｔ．，＆ Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｈ．（２０１４）．Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ｌｉｔｏｒｅｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ ｎｏｖｅｌ ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｅａｗａｔｅｒ ａｎｄ ｅｍｅｎｄｅｄ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，１０６（５），１０４１－１０４７．；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｇ．，Ｐｈｅｎｇ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｙ．Ｊ．，Ｅｏｍ，Ｍ．Ｋ．，＆ Ｓｈｉｎ，Ｄ．Ｈ．（２０１６）．Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｅｓｔｕａｒｉｉ ｓｐ．ｎｏｖ．，ａｎ ａｇａｒ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｔｉｄａｌ ｆｌａｔ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６６（８），３１１９－３１２４．）。したがって、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、５．０％ＮａＣｌ中での最適増殖によって、他のアガリボランスの標準株と区別することができた。

【0045】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、アルカリホスファターゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、酸性ホスファターゼ、ナフトール－ＡＳ－ＢＩ－ホスホリラーゼ及びβ－ガラクトシダーゼの酵素活性、並びにグリセロール、Ｄ－キシロース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－グルコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－マンニトール、Ｎ－アセチルグルコサミン、エスクリン、クエン酸鉄、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マルトース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－メリビオース、デンプン及びグリコーゲンからの酸生成を示した。さらに、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、フマル酸、リンゴ酸、グルコース、ガラクトース、マルトース及びマンノースを資化したが、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、グルコン酸、アラビノース及びスクロースは資化しなかった。また、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、アンピシリン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ペニシリンＧ、テトラサイクリンに感受性を示した。

【0046】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、カタラーゼには陽性であった。アルギニンヒドロラーゼ、リシンデカルボキシラーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、クエン酸の利用、Ｈ_２Ｓの生成、ウレアーゼ、トリプトファンの脱アミノ化、インドール及びアセトインの生成、プロテアーゼは陰性であった。エスクリン及びパラ／オルト－ニトロフェニル－β－ガラクトピラノシドの加水分解に対するβ－ガラクトシダーゼ活性はすべて陽性であった。硝酸塩を亜硝酸塩に還元するが、Ｎ_２には還元しなかった。エステラーゼ（Ｃ４）、エステラーゼ／リパーゼ（Ｃ８）、リパーゼ（Ｃ１４）、バリンアリールアミダーゼ、シスチンアリールアミダーゼ、トリプシン、α－キモトリプシン、α－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、Ｎ－アセチル－β－グルコシダーゼ、α－マンノシダーゼ、α－フコシダーゼは陰性であった。エリストール、Ｄ－アラビノース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－アドニトール、メチルβ－Ｄ－キシロピラノシド、Ｄ－マンノース、Ｌ－ソルボース、Ｌ－ラムノース、ズルシトール、イノシトール、Ｄ－ソルビトール、メチルα－Ｄ－マンノピラノシド、メチルα－グルコピラノシド、アミグダリン、アルブチン、サリシン、Ｄ－スクロース、Ｄ－トレハロース、イヌリン、Ｄ－メレジトース、Ｄ－ラフィノース、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ－ツラノース、Ｄ－リキトース、Ｄ－タガトース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－アラビトール、Ｌ－アラビトール、グルコン酸、２－ケトグルコン酸及び５－ケトグルコン酸からは酸産生は示されなかった。

【0047】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株の主な脂肪酸は、Ｃ_１６：０（１９．９％）、Ｃ_１６：１ω７ｃ／Ｃ_１６：１ω６ｃ（３９．４％）及びＣ_１８：１ω７ｃ／Ｃ_１８：１ω６ｃ（１６．６％）、Ｃ_１２：０（６．０％）であった。キノン分析については、ユビキノン８（Ｑ－８）がＴｏｙｏｕｒａ００１株の主要なイソプレノイドキノンであることが示された。

【0048】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１を１００ｍＬのマリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ社）中、８０ｒｐｍで振とうしながら２５℃で２０時間培養した。培養細胞由来のゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳによる消化、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出、イソプロパノール及びエタノール沈殿、ＲＮａｓｅ処理（Ｄａｓ Ｓ，Ｄａｓｈ ＨＲ．２０１４．Ｂａｓｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｐ１－３４．Ｉｎ Ｄａｓ Ｓ，Ｄａｓｈ ＨＲ（ｅｄ），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｄｉａ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－８１－３２２－２０９５－４．のプロトコルを参照）によって調製した。調製したＤＮＡの純度及び濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）及びＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ｄｓＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて測定した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ Ｉｎｃ．）による精製ＤＮＡの５００ｂｐ断片化後、５００ｎｇの断片化ＤＮＡ用いて、ＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＤＮＡライブラリーを調製した。調製したライブラリーの完全性は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で確認した。調製したライブラリーのペアエンドシーケンス（２×１５１ｂｐ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｓｅＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で行った。低品質（Ｑスコア＜２０）及び短長（＜１２８塩基）の配列をＳｉｃｋｌｅ ｖｅｒ．１．３３（Ｊｏｓｈｉ ＮＡ，Ｆａｓｓ ＪＮ．２０１１． Ｓｉｃｋｌｅ：ａ ｓｌｉｄｉｎｇ－ｗｉｎｄｏｗ，ａｄａｐｔｉｖｅ，ｑｕａｌｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｔｒｉｍｍｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＦａｓｔＱ ｆｉｌｅｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）．ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｎａｊｏｓｈｉ／ｓｉｃｋｌｅ．）を使用してトリム及び破棄した。残りの配列を、ＳＰＡｄｅｓ ｖｅｒ．３．１０．１（Ｂａｎｋｅｖｉｃｈ Ａ，Ｎｕｒｋ Ｓ，Ａｎｔｉｐｏｖ Ｄ，Ｇｕｒｅｖｉｃｈ ＡＡ，Ｄｖｏｒｋｉｎ Ｍ，Ｋｕｌｉｋｏｖ ＡＳ，Ｌｅｓｉｎ ＶＭ，Ｎｉｋｏｌｅｎｋｏ ＳＩ，Ｐｈａｍ Ｓ，Ｐｒｊｉｂｅｌｓｋｉ ＡＤ，Ｐｙｓｈｋｉｎ ＡＶ，Ｓｉｒｏｔｋｉｎ ＡＶ，Ｖｙａｈｈｉ Ｎ，Ｔｅｓｌｅｒ Ｇ，Ａｌｅｋｓｅｙｅｖ ＭＡ，Ｐｅｖｚｎｅｒ ＰＡ．２０１２．ＳＰＡｄｅｓ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １９：４５５-４７７．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｍｂ．２０１２．００２１．）を用いて新たに組み立てた。得られたＴｏｙｏｕｒａ００１のゲノムを、Ｐｒｏｋｋａ ｖｅｒ．１．１１（Ｓｅｅｍａｎｎ Ｔ．２０１４．Ｐｒｏｋｋａ：ｒａｐｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０：２０６８-２０６９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１５３．）を使用してアノテーションした。

【0049】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１の組み立てられたゲノムは、２４３個のコンティグ（最長：７０６，３４５ｂｐ、Ｎ_５０：１８６，０３５ｂｐ）からなり、４，７３１，７５３ｂｐを含みＧ＋Ｃ含量４４．４％を有していた。Ｐｒｏｋｋａによるアノテーションは、４，２９５個のタンパク質コード配列、１個のｒＲＮＡオペロン（１６Ｓ－２３Ｓ－５Ｓ）及び６２個のｔＲＮＡについての遺伝子を予測した。ドラフトゲノムは、アガラーゼ及びアルギナーゼを各々コードする５遺伝子及び７遺伝子を含み、それはＡ．ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔのものと相同性を有していた（相同性は各々それぞれ７７．９－９３．３％及び５９．３－９４．８％）。

【0050】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔ、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ｌｉｔｏｒｅｕｓ ＧＪＳＷ－６Ｔ、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ａｅｓｔｕａｒｉｉ ｈｙｄＤ６２２Ｔ、Ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ ｇｉｌｖｕｓ ＷＨ０８０１Ｔとそれぞれ９８．１、９７．４、９７．３及び９６．４％の類似性を有し、これは種分離基準の９８．６５％を下回っていた（Ｋｉｍ Ｍ，Ｏｈ ＨＳ，Ｐａｒｋ ＳＣ，Ｃｈｕｎ Ｊ．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｖｅｒａｇｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４；６４：３４６－３５１．）。Ｔｏｙｏｕｒａ００１株とアガリボランス系統株との系統学的関係は、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株がＡ．ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔ、Ａ．ｌｉｔｏｒｅｕｓ ＧＪＳＷ－６Ｔ、Ａ．ａｅｓｔｕａｒｉｉ ｈｙｄＤ６２２及びＡ．ｇｉｌｖｕｓ ＷＨ０８０１から独立した枝を形成することを示した（図３）。最も近い系統発生系統であるＡ．ａｌｂｕｓ ＭＫＴ１０６Ｔに対するＴｏｙｏｕｒａ００１株のゲノム塩基配列に基づくＡＮＩ値は、７８．５％（ＯｒｔｈｏＡＮＩ）及び７９．１％（ｇＡＮＩ）（Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｈａ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｗｏｎ，Ｓ．，Ｌｉｍ，Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｙ．，Ｓｅｏ，Ｈ．，＆ Ｃｈｕｎ，Ｊ．（２０１７）．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ：ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ ｕｎｉｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７（５），１６１３－１６１７．；Ｖａｒｇｈｅｓｅ，Ｎ．Ｊ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．，Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ，Ｋ．Ｔ．，Ｍａｖｒｏｍｍａｔｉｓ，Ｋ．，Ｋｙｒｐｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．，＆ Ｐａｔｉ，Ａ．（２０１５）． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（１４），６７６１－６７７１．を参照）であり、これらの値は種の分化に一般的に使用される９４～９５％の閾値より低かった（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｍ．，＆ Ｒｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ，Ｒ．（２００９）．Ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０６（４５），１９１２６－１９１３１．）。Ｔｏｙｏｕｒａ００１株のドラフトゲノムのＤＮＡ Ｇ＋Ｃ含有量は、４４．４モル％であり、他のアガリボランス属の標準株と同等であった。

【0051】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株の多糖類の資化性について下記の表にまとめる。２５℃で２４時間、０．０１％アガー及び０．０２％アルギン酸を含むＭＢ培地で培養したＴｏｙｏｕｒａ００１株を、アガー、アガロース、アルギン酸、フコイダン、ｋ－カラギーナン、λ－カラギーナン、ラミナラン、デンプン、ペクチン、キシラン、ＣＭセルロース、イヌリン、プルラン及びゲランガムをそれぞれ唯一の炭素源とする培地（Ｅｎｓｏｒ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔｏｓｚ，Ｓ．Ｋ．，＆ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ｍ．（１９９９）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ２－４０．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（２），１２３－１２６．に準拠）に接種して、２５℃で４８時間培養して濁度を比較した。なおアガロース及びｋ－カラギーナンについては、培地がゲル化したため濁りを目視で確認した。その結果、アガー、アガロース、アルギン酸、フコイダン、ｋ－カラギーナン、λ－カラギーナン、デンプン、ペクチン、キシラン、プルラン、ゲランガムにおいて菌の増殖が確認された。また、アガロース及びｋ－カラギーナンについては、ゲル化した培地の液状化も確認された。このことから、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株がアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン、キシラン分解活性を有することが示された。

【0052】

【表3】

【0053】

Ｔｏｙｏｕｒａ００１株は、ゲノム配列の相同性解析、ゲノム情報から得られた１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の系統解析、形態観察、生理学的性状等から、アガリボランス属の新規の種であることが証明された。また、アガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン、キシランをそれぞれ唯一の炭素源とする培地でＴｏｙｏｕｒａ００１株を培養したところ生育可能であることが確認され、Ｔｏｙｏｕｒａ００１株がアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン及びキシラン分解活性を有することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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