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▶ ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-15
(45)【発行日】2022-09-27
(54)【発明の名称】ＨＤＡＣ阻害剤またはＲＥＰタンパク質を伴う細胞培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20220916BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220916BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20220916BHJP
C12N 15/89 20060101ALI20220916BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20220916BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20220916BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20220916BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220916BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
C12N15/861
C12N15/35
C12N15/89
C12N15/88
C12N7/02
C12N15/90 Z
C12N5/10
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2019552215
(86)(22)【出願日】2018-03-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-16
(86)【国際出願番号】 US2018023841
(87)【国際公開番号】W WO2018175775
(87)【国際公開日】2018-09-27
【審査請求日】2021-03-19
(31)【優先権主張番号】62/475,112
(32)【優先日】2017-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513009107
【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ティアナン， オーブリー
(72)【発明者】
【氏名】ティッパー， クリストファー
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／２０１２５２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１６／１３４３３７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Xiang, Q. et al.，A method mediated AAVS1 recombination with Rep mRNA and homologous arm，Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2012年，Vol. 44（12），pp. 1015-1022
【文献】Howden, S. E. et al.，The transient expression of mRNA coding for Rep protein from AAV facilitates targeted plasmid integration，J. Gene Med.，2008年，Vol. 10(1)，pp. 42-50
【文献】小澤 敬也，４． ＡＡＶを利用した遺伝子治療，ウイルス，2007年，Vol. 57(1)，pp. 47-56
【文献】Li, J. et al.，Role for highly regulated rep gene expression in adeno-associated virus vector production，J. Virol.，1997年，Vol. 71(7)，pp. 5236-5243
【文献】Martin, J. et al.，Generation and Characterization of AAV Producer Cell Lines for Research and Preclinical Vector Production，Human Gene Therapy Methods，2013年，Vol. 24(4)，pp. 253-269
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター力価を増加させる方法であって、ａ）ｒＡＡＶベクターをＡＡＶ ｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；
ｂ）前記真核細胞培養物にヘルパーアデノウイルスを感染させること；および
ｃ）前記真核細胞培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増加させること
を含み、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡが、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、方法。
【請求項2】
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記共送達することがナノ粒子を伴う、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記共送達することがセルスクイージングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記共送達することが脂質への曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記共送達することがリン酸カルシウムへの曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記共送達することがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記共送達することがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記共送達することが活性化デンドリマーへの曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための細胞株を開発する方法であって、ａ）ｒＡＡＶベクターをＡＡＶ ｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；
ｂ）前記真核細胞培養物にヘルパーアデノウイルスを感染させること；
ｃ）真核細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞を同定すること；および
ｄ）前記真核細胞を含む培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増強すること
を含み、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡが、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、方法。
【請求項13】
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記共送達することがナノ粒子を伴う、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記共送達することがセルスクイージングを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記共送達することが脂質への曝露を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
前記共送達することがリン酸カルシウムへの曝露を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
前記共送達することがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項21】
前記共送達することがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項22】
前記共送達することが活性化デンドリマーへの曝露を含む、請求項１２に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年３月２２日に出願された米国出願番号第６２／４７５，１１２号に基づく利益および優先権を主張しており、この出願の全体の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
本出願は、２０１７年３月２２日に出願された米国出願番号第６２／４７５，１１２号に基づく利益および優先権を主張しており、この出願の全体の内容は、すべての目的のためにその全体が参考として本明細書によって援用される。
【0002】
発明の分野
本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質の使用を伴う細胞培養法に関する。
本発明は、ＨＤＡＣ阻害剤またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐタンパク質の使用を伴う細胞培養法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の複製欠損パルボウイルスである。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、それらを遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものとする多くの独特の特徴を有する。特に、ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。ｒＡＡＶの幅広い治療応用を考えると、多量のウイルスを費用対効果の高い様式で産生することは有用である。安定な真核細胞株は、宿主ゲノムの第１９染色体に優先的に組み込まれるｒＡＡＶベクターを用いてそれらをトランスフェクトするによって生成されうる。しかし、典型的には費用対効果の高い製造工程を開発するのに十分高いｒＡＡＶ収率を有する１つの産生細胞株を同定するために、数千の細胞クローンが複数回のトランスフェクション実行からスクリーニングされなければならない。したがって、高収率のｒＡＡＶを産生する安定細胞株を生成する方法の改善に対する必要性がある。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の複製欠損パルボウイルスである。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、それらを遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものとする多くの独特の特徴を有する。特に、ｒＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。ｒＡＡＶの幅広い治療応用を考えると、多量のウイルスを費用対効果の高い様式で産生することは有用である。安定な真核細胞株は、宿主ゲノムの第１９染色体に優先的に組み込まれるｒＡＡＶベクターを用いてそれらをトランスフェクトするによって生成されうる。しかし、典型的には費用対効果の高い製造工程を開発するのに十分高いｒＡＡＶ収率を有する１つの産生細胞株を同定するために、数千の細胞クローンが複数回のトランスフェクション実行からスクリーニングされなければならない。したがって、高収率のｒＡＡＶを産生する安定細胞株を生成する方法の改善に対する必要性がある。
【0004】
野生型ＡＡＶゲノムはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０と称される４つの制御タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ウイルス生活環の状況を調整する、部位特異的ＤＮＡ結合、ＡＴＰ依存性部位特異的エンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびＡＴＰａｓｅ活性を累積的に含む。典型的には、ｒＡＡＶベクターは、ｒｅｐタンパク質をコードするＤＮＡ配列を欠いており、１４５ヌクレオチド長ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）によって隣接された外来ＤＮＡから構成される。しばしば、ｒＡＡＶは、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスを用いて産生される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
発明の要旨
ＡＡＶ ｒｅｐ ｍＲＮＡの送達が、例えば、ｒＡＡＶ安定細胞株の生成およびこれらの細胞から収集されるｒＡＡＶベクターの力価を増強するために使用されうることが今や発見された。したがって、本発明の一態様は、ｒＡＡＶベクター力価を増加させる、または、例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、ｒＡＡＶ収率を増強する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達（ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）すること、ならびに細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
ＡＡＶ ｒｅｐ ｍＲＮＡの送達が、例えば、ｒＡＡＶ安定細胞株の生成およびこれらの細胞から収集されるｒＡＡＶベクターの力価を増強するために使用されうることが今や発見された。したがって、本発明の一態様は、ｒＡＡＶベクター力価を増加させる、または、例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、ｒＡＡＶ収率を増強する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達（ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）すること、ならびに細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
【0006】
一部の実施形態では、共送達法は、リポソームに基づくトランスフェクションを含む。一部の実施形態では、共送達法は、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストランまたは活性化デンドリマーを使用する方法などの化学物質に基づくトランスフェクション（ｃｈｅｍｉｃａｌ－ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含む。他の実施形態では、共送達法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、磁気ビーズ、ナノ粒子またはセルスクイージングを伴う。
【0007】
本発明の別の態様は、細胞株、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための安定細胞株を生成するまたは開発する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することに続いて、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること（例えば、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞コロニーを選択することによる）、ならびに必要に応じて、細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う共送達は、収集されるｒＡＡＶの力価を増強する。
【0008】
一部の実施形態では、共送達法は、リポソームに基づくトランスフェクションを含む。一部の実施形態では、共送達法は、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストランまたは活性化デンドリマーを使用する方法などの化学物質に基づくトランスフェクションを含む。他の実施形態では、共送達法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、磁気ビーズまたはナノ粒子を伴う。
【0009】
ＨＤＡＣ阻害剤が、例えば、真核細胞もしくは宿主細胞ゲノムへの組換えポリヌクレオチドの組み込みを増強するため、および／または真核細胞もしくは宿主細胞からの遺伝子産物もしくはウイルスベクターの収率を増加させるために使用されうることも発見された。したがって、本発明の一態様は、組換えポリヌクレオチドをトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）などのＨＤＡＣ阻害剤と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、真核細胞もしくは宿主細胞ゲノムへのポリヌクレオチドの組み込みは検出される、および／または安定真核細胞もしくは宿主細胞株が生成される。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物は、真核細胞または宿主細胞培養物において発現される。遺伝子産物は、組換えポリヌクレオチドによってコードされていてよい、または組換えポリヌクレオチドの存在に間接的に依存してよい。遺伝子産物は、例えば、リボ核酸、ペプチまたはタンパク質でありうる。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、これだけに限らないがｒＡＡＶベクターを含むウイルスベクターである。組換えウイルスベクターのＨＤＡＣ阻害剤を伴う共送達は、ウイルスベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを増強し、宿主細胞から収集されるウイルスベクターの収率を増加しうる。
【0010】
一部の実施形態では、共送達法は、リポソームに基づくトランスフェクションまたは、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストラン、もしくは活性化デンドリマーを利用する方法などの化学物質に基づくトランスフェクションを伴う。他の実施形態では、共送達法は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、磁気ビーズ、ナノ粒子またはセルスクイージングを伴う。
【0011】
本発明のこれらおよび他の態様および特性は、次の詳細な記載および特許請求の範囲に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【0014】
【図3】図３は、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡ：１μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ－８Ｇ３クローン、３０ｎＭ ＴＳＡ－１２Ｂ５クローンおよび０．７５μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ＋１００ｎＭ ＴＳＡ－１６Ｄ２クローンを伴うｒＡＡＶベクターの同時トランスフェクション後のＨｅＬａ細胞に由来する４つの細胞株においてｑＰＣＲによってアッセイされた増幅ｒＡＡＶゲノムコピー（ＧＣ）を示す図である。細胞株１０Ｇ８は、ｒＡＡＶベクター単独のトランスフェクション後に確立された。アデノウイルスヘルパーウイルスを用いた感染後、細胞は感染後０、１、２、３および４日目（Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）に採取され、それからゲノムＤＮＡがアッセイのために単離された。エラーバーは、三回反復のｑＰＣＲ由来の標準偏差を示している。
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
詳細な説明
本発明は、トリコスタチンＡなどのＨＤＡＣ阻害剤が、組換えポリヌクレオチドと共に真核細胞に共送達され得、それが例えば、真核細胞におけるポリヌクレオチドの組み込みおよび／または発現を促進できるという発見に部分的に基づいている。本発明は、ｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８）ならびに／またはＨＤＡＣ阻害剤が、ｒＡＡＶベクターと共に宿主細胞に共送達されてよく、例えば宿主細胞へのｒＡＡＶの送達および組み込み、宿主細胞でのｒＡＡＶの増幅ならびに／または宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶの力価を増強するという発見にも部分的に基づいている。
本発明は、トリコスタチンＡなどのＨＤＡＣ阻害剤が、組換えポリヌクレオチドと共に真核細胞に共送達され得、それが例えば、真核細胞におけるポリヌクレオチドの組み込みおよび／または発現を促進できるという発見に部分的に基づいている。本発明は、ｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８）ならびに／またはＨＤＡＣ阻害剤が、ｒＡＡＶベクターと共に宿主細胞に共送達されてよく、例えば宿主細胞へのｒＡＡＶの送達および組み込み、宿主細胞でのｒＡＡＶの増幅ならびに／または宿主細胞によって産生されるｒＡＡＶの力価を増強するという発見にも部分的に基づいている。
【0017】
本発明の種々の特性および態様は、下により詳細に論じられる。
Ｉ．ｒＡＡＶの産生の増加
Ｉ．ｒＡＡＶの産生の増加
【0018】
本発明の一つの態様は、ｒＡＡＶ力価を増加させる、または例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、ｒＡＡＶ収率を増強する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、真核細胞または宿主細胞培養物をｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で培養すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
【0019】
本発明の別の態様は、ｒＡＡＶベクター力価を増加させる、または例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、ｒＡＡＶ収率を増強する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、真核細胞または宿主細胞培養物をさらなるｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で培養すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
【0020】
本発明の別の態様は、ｒＡＡＶベクター力価を増加させる、または例えば真核細胞または宿主細胞培養物からの、ｒＡＡＶ収率を増強する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、真核細胞または宿主細胞培養物をさらなるｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で培養すること、および細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
【0021】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ科のＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属の小さな無エンベロープの正二十面体ウイルスである。これは、異なる組織向性を示す異なるＡＡＶ血清型により、数種の組織タイプの分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染することができる。ＡＡＶは、非自律的に複製し、潜伏期および感染期を有する生活環を有する。潜伏期において、細胞がＡＡＶに感染した後、ＡＡＶはプロウイルスとして宿主のゲノムに組み込まれる。ヒト細胞では、優先的組み込み部位は、第１９染色体の長腕上のおよそ２ｋｂの領域に存在する（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）。感染期は、ＡＡＶ遺伝子発現を活性化し、宿主細胞染色体からのプロウイルスＤＮＡの切り出しに続いて、ウイルスゲノムの複製およびパッケージングをもたらす、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルス）もまた細胞に感染しなければ生じない。ヘルパーウイルス誘導細胞溶解では、新たに構築されたウイルスが放出される。
【0022】
野生型ＡＡＶは、２つのウイルス遺伝子－ｒｅｐおよびｃａｐに隣接する末端に２つの１４５ヌクレオチド長の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含有する、およそ４．７ｋｂの１本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを有する。ｒｅｐ遺伝子は、２つのプロモーターおよび選択的スプライシングの使用を通じて、４つの制御タンパク質－ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２およびｒｅｐ４０をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶゲノム複製に関与している。ｃａｐ遺伝子は、選択的スプライシングおよび翻訳の開始を通じて、３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をもたらす。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを形成する。
【0023】
ＡＡＶ ＩＴＲが、ゲノムレスキュー、複製およびパッケージングに関与するすべてのシス作用性エレメントを含有しており、ＡＡＶ ＩＴＲがウイルスコード領域、すなわちｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子領域から分離されていることを考慮すると、一部またはすべてのＡＡＶ ４．３ｋｂ内部ゲノムは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生じさせるように、外来ＤＮＡ、例えば目的の外来タンパク質のための発現カセットで置換されうる。ｒＡＡＶのゲノムは、一本鎖ＤＮＡであり、４．７ｋｂである。ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂであるか、または５．２ｋｂ規模の特大ゲノムもしくは３．０ｋｂほどの小さなゲノムを含む、４．７ｋｂよりも大きいかもしくは小さい一本鎖ゲノムを有しうる。さらに、ベクターゲノムは、ウイルス内でゲノムが実質的に二本鎖であるように、実質的に自己相補性でありうる。すべてのタイプのゲノムを含有するｒＡＡＶベクターは、本発明の方法における使用に好適である。
【0024】
ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２だけでなく、非ヒト霊長類由来の１００を超える血清型を含む、多数の血清学的に識別可能なタイプを含む（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０５巻（１号）：１７～２４頁（２００８年）；およびＧａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７８巻（１２号）、６３８１～６３８８頁（２００４年）を参照されたい）。任意の血清型のＡＡＶを本発明において使用することができ、当業者はその所望のｒＡＡＶベクターの産生に好適なＡＡＶタイプを特定することができる。
【0025】
ｒＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して、ｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に細胞培養物、例えば宿主または真核細胞培養物に共送達されうる。ｒＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して、ＨＤＡＣ阻害剤と共に細胞培養物、例えば宿主または真核細胞培養物に共送達されうる。ｒＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して、ｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤と共に細胞培養物、例えば宿主または真核細胞培養物に共送達されうる。
【0026】
本明細書において使用される場合、真核細胞培養物は、ｒＡＡＶを産生できる任意の１種または複数種の細胞でありうる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞またはＶｅｒｏ細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、Ｓｆ－２１細胞、Ｔｎ－３６８細胞またはＢＴＩ－Ｔｎ－５Ｂ１－４（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｖｅ）細胞である（例えば米国特許第６，１５６，３０３号、第５，３８７，４８４号、第５，７４１，６８３号、第５，６９１，１７６号、第５，６８８，６７６号、第８，１６３，５４３号、米国公開第２００２００８１７２１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４７７５７号、第ＷＯ００／２４９１６号および第ＷＯ９６／１７９４７号を参照されたい）。他に示さない限り、用語「細胞」または「細胞株」は、示される細胞または細胞株の改変されたまたは操作されたバリアントを含むと理解される。
【0027】
Ｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生されうる（Ｈｏｗｄｅｎら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８年；１０巻：４２～５０頁）。
【0028】
本明細書において使用されるＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣの４種のクラスのいずれか１つの阻害剤でありうる。例示的ＨＤＡＣ阻害剤としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、トラポキシン（ｔｒａｐｘｉｎ）Ｂ、ベンズアミド、フェニルブチレート（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｅｔ）、バルプロ酸、ヒドロキサム酸ボリノスタット（ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔｅ）（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット、エンチノスタット、ＣＩ９９４、モセチノスタット、ニコチンアミド、ジヒドロクマリン、ナフトピラノンおよび２－ヒドロキシナフトアルデヒドが挙げられる。
【0029】
共送達の方法は、標的細胞に応じて変化する。好適な方法としては、例えば、リポソームに基づくトランスフェクション；リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストランもしくは活性化デンドリマーを利用する方法などの化学物質に基づくトランスフェクション；マイクロインジェクション；エレクトロポレーション；磁気ビーズ；ナノ粒子；またはセルスクイージングが挙げられる（例えば、Ｄｉｎｇら、（２０１７年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １巻：００３９を参照されたい）。当業者は、好適な共送達法を同定することができ、ｒＡＡＶベクターを送達しようとする細胞の種類に応じて条件を最適化することができる。
【0030】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、エレクトロポレーションを使用してＨｅｌａＳ３細胞にｒｅｐ６８ ｍＲＮＡと共に共送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、エレクトロポレーションを使用してＨｅｌａＳ３細胞にＨＤＡＣ阻害剤、例えばＴＳＡと共に共送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、エレクトロポレーションを使用してＨｅｌａＳ３細胞にｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびＴＳＡの両方と共に共送達される。
【0031】
真核細胞培養物への送達後、ｒＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の多数の方法によって細胞によって産生されうる。ｒＡＡＶの産生を可能にするために、宿主細胞は、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）（例えば、目的の異種性ヌクレオチド配列または目的の外来タンパク質をコードする発現カセットに隣接していてよい）、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能だけでなく追加的ヘルパー機能も含んで提供されなければならない。これらは、種々の適切なプラスミドまたはベクターを使用して宿主細胞に提供されうる。追加的ヘルパー機能は、例えばアデノウイルス（ＡＶ）感染によって、必要なすべてのＡＶヘルパー機能遺伝子を保有するプラスミドによって、または単純ヘルペスウイルルス（ＨＳＶ）もしくはバキュロウイルスなどの他のウイルスによって提供されうる。任意の遺伝子、遺伝子機能または宿主細胞によるｒＡＡＶ産生のために必要な他の遺伝材料は、宿主細胞内に一過的に存在しうる、または宿主細胞ゲノムに安定に挿入されうる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能およびｒＡＡＶベクターゲノムを含む産生細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、産生の時に別の組換えウイルスによってｒＡＡＶベクターゲノムが提供される、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を含むパッケージング細胞である。本発明の方法とともに使用されるのに好適なｒＡＡＶ産生方法は、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：１３２９～１３４１頁（１９９５年）、Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：２５３～２６９頁（２０１３年）、Ｔｈｏｒｎｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：７０７～７１４頁（２００９年）、Ｆｒａｓｅｒ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：６９８～７０６頁（２００９年）およびＶｉｒａｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：８０７～８１７頁（２００９年）に開示されたものを含む。
【0032】
ｒＡＡＶ粒子は、細胞を溶解することにより、宿主細胞から得られうる。ＡＡＶ感染細胞の溶解は、感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）ウイルス粒子を放出するために細胞を化学的にまたは酵素的に処理する方法により達成されうる。これらの方法は、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼ、トリプシンなどのプロテアーゼ、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を含む。ホモジナイゼーションもしくは粉砕などの物理的破壊、またはマイクロフルイダイザー圧力セルによる加圧、または凍結融解サイクルも使用されうる。代替的に、細胞溶解を必要とせずに、上清がＡＡＶ感染細胞から採取されうる。
【0033】
例えば、細胞溶解の結果として生じた細胞残屑を除去するために、ｒＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子を含有する試料を精製することが必要であり得る。ヘルパーウイルス粒子およびＡＡＶ粒子の最小限の精製の方法は、当分野で公知であり、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の両方を含有する試料を準備するために、任意の適切な方法が使用されうる。２つの例示的な精製方法は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）およびイオジキサノールに基づく密度勾配精製である。両方法は、Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６巻（４号）：１４７～１５７頁（２０１５年）に記載されている。最小限の精製は、例えば、ＡＶＢセファロース親和性樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することもできる。ＡＶＢセファロース親和性樹脂を使用するＡＡＶ精製の方法は、例えば、Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、２巻：１５０４０頁（２０１５年）に記載されている。
【0034】
熱によってヘルパーウイルスを不活性化することが必要であり得る。熱不活性化技術は、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の異なる熱安定性に基づく。例えば、ＡＡＶ粒子は、５６℃もの高い温度まで加熱されうるが、依然としてインタクトなままであり、一方、ＡＶ粒子は不活性にされる。Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６巻、９８６～９９３頁、１９９９年は、ＡＡＶを含有する試料中のＨＳＶの示差熱不活性化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を記載している。熱不活性化は、任意の公知の方法論により達成されうる。以下に記載の例において、熱不活性化は、３００μＬまたはそれ未満の試料容積を急速に加熱および冷却するために、サーモサイクラーを使用して達成された。このシステムは、主に伝導性の熱伝達に依拠するという理由で選択され、連続フローシステムおよび能動的混合を採用するより大きなバッチシステムの両方のための実行可能なモデルとなっている。連続フローシステムの例としては、Ｂｉｏ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇのためのＤＨＸ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ Ｈｅａｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｅｒｓｂｅｒｇ、ＰＡ）などの、連続フロー熱交換器を通る試料の通過が挙げられる。そのようなシステムは、熱交換器を通る試料の流速を制御し、その結果として加熱プロセスの持続時間および熱交換器の温度を制御し、その結果として熱不活性化の温度を制御することにより、オペレーターが熱不活性化プロセスを制御することを可能にする。
【0035】
代替的に、熱不活性化は、様々なサイズのバッチシステムを使用して達成されうる。例えば、熱不活性化は、ＡＡＶを含有する試料を１ＬのＰＥＴＧボトル中に置き、そのボトルを所望の不活性化温度に設定した水浴中に所望の期間、混合しながら置くことにより１Ｌスケールで達成可能であり、例えば、試料は、４７℃に２０分間加熱されうる。より大きなスケールでは、熱不活性化は、５Ｌのバイオプロセシングバッグ中のｒＡＡＶを含有する試料を、所望の不活性化温度に設定した温度制御ロッキングプラットフォーム上に所望の期間置くことにより達成されうる。例えば、ロッキングプラットフォームは、１２°の混合角度、３０ＲＰＭのロッキングスピード、４９℃で４０分間に設定されうる。
【0036】
熱不活性化は、ｒＡＡＶ粒子とヘルパーウイルス粒子の間で安定性が十分に異なるために、ヘルパーウイルス粒子が実質的に不活性化される一方、活性なｒＡＡＶ粒子が残存する、任意の温度で行いうる。当業者は、より大きなレベルのＡＶ低減を達成するためにはより高い温度が必要とされうることを理解する。
【0037】
熱不活性化が達成されると、不活性化の効率を決定することが必要または望ましい場合がある。不活性化プロトコールの効力は、プラークアッセイなどの複製可能なヘルパーウイルスの存在を検出するアッセイにより決定される。ＡＶ、ＨＳＶ、バキュロウイルスなどのためのプラークアッセイを含む、ヘルパーウイルスのためのプラークアッセイは、当業者に周知である。アデノウイルスのプラークアッセイは、任意の適切な細胞タイプ、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を使用して実行されうる。標準的なプラークアッセイプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００３年に記載されている。アデノウイルス力価を測定するための代替アッセイは、免疫細胞化学染色を使用してヘキソンタンパク質などのウイルスタンパク質を検出することによる、培養物中の感染細胞の同定を可能とするものを含む。そのようなアッセイは、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。一般に、不活性化の効率は、ウイルスの対数減少（ＬＲＶ）として報告される。
【0038】
ｒＡＡＶ粒子の定量は、ＡＡＶ感染がｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞変性効果をもたらさず、したがって、感染力価を決定するためにプラークアッセイが使用できないという事実により、複雑である。しかしながら、ＡＡＶ粒子は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０巻、１０３１～１０３９頁（１９９９年））もしくはドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻、３８２２～３８２８頁（１９８９年））を含むいくつかの方法を使用して、または高度に精製されたベクター調製物の光学密度により（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、７巻、１２２～１２８頁（２００３年））定量可能である。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）は、サーモサイクラー（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ９６ウエルブロックフォーマットサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））におけるリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）により、定量可能である。ＡＡＶ粒子を含有する試料が、ＤＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートされ、続いて、５０℃で６０分間のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）消化（１０Ｕ／ｍｌ）、次いで、９５℃で３０分間、変性させる。使用されるプライマープローブセットは、ＡＡＶベクターゲノムの非天然部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的であるべきである。ＰＣＲ産物は、プライマー、プローブおよび増幅された配列の長さおよび組成に基づく、任意の適切なサイクリングパラメータのセットを使用して増幅されうる。代替プロトコールは、例えば、Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５巻（２号）：１１５～１２５頁（２０１４年）に開示されている。
【0039】
ｒＡＡＶ粒子の感染力は、例えば、Ｚｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１５巻：７０９～７１５頁（２００４年）に記載のＴＣＩＤ５０（５０％の組織培養感染量）アッセイを使用して決定されうる。このアッセイでは、ＡＡＶベクター粒子が連続的に希釈され、９６ウエルプレート中でＡＶ粒子とともにｒｅｐ／ｃａｐ発現細胞株に共感染するために使用される。感染後４８時間で、感染させたウエルおよび対照ウエルからの全細胞内ＤＮＡが抽出される。次いで、導入遺伝子特異的プローブおよびプライマーとともにｑＰＣＲを使用して、ＡＡＶベクターの複製が測定される。１ミリリットルあたりのＴＣＩＤ５０感染力（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、１０倍の連続希釈でのＡＡＶ陽性のウエルの比を使用して、Ｋａｅｒｂｅｒ方程式により計算される。
ＩＩ．安定細胞株の生成
ＩＩ．安定細胞株の生成
【0040】
本発明の別の態様は、細胞株、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための安定細胞株を生成するまたは開発する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することに続いて、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること（例えば、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞コロニーを選択することによって）および、必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、ｒＡＡＶベクターを真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込むことを可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞培養物を培養すること、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること、さらなるｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞を培養すること、および必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う共送達は、ｒＡＡＶベクターの真核細胞または宿主細胞ゲノムへの組み込みを増強する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う共送達は、収集されるｒＡＡＶの力価を増強する。
【0041】
本発明の別の態様は、細胞株、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための安定細胞株を生成するまたは開発する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することに続いて、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること（例えば、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞コロニーを選択することによって）および、必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、ｒＡＡＶベクターを真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込むことを可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞培養物を培養すること、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること、さらなるｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞を培養すること、および必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）を伴う共送達は、ｒＡＡＶベクターの真核細胞または宿主細胞ゲノムへの組み込みを増強する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）を伴う共送達は、収集されるｒＡＡＶの力価を増強する。
【0042】
本発明の別の態様は、細胞株、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための安定細胞株を生成するまたは開発する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することに続いて、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること（例えば、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞コロニーを選択することによって）および、必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達すること、ｒＡＡＶベクターを真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込むことを可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞培養物を培養すること、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること、さらなるｒＡＡＶの生成を可能にする条件下で真核細胞または宿主細胞を培養すること、および必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）を伴う共送達は、ｒＡＡＶベクターの真核細胞または宿主細胞ゲノムへの組み込みを増強する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶのｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）およびＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）を伴う共送達は、収集されるｒＡＡＶの力価を増強する。
【0043】
本発明の別の態様は、細胞株、例えば組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための安定細胞株を生成するまたは開発する方法を提供する。方法は、ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡ（例えば、ｒｅｐ６８および／またはｒｅｐ７８ ｍＲＮＡ）ならびにＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ＴＳＡ）と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することに続いて、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞または宿主細胞を同定すること（例えば、真核細胞または宿主細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞コロニーを選択することによって）および、必要に応じて細胞培養物からｒＡＡＶを収集することを含む。
【0044】
トランスフェクション後、ｒＡＡＶの宿主ゲノムへの組み込みは、Ｎａｋａｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００３年）３４巻、２９７～３０２頁、Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２年）７６巻（１１号）：５４１１～５４２１頁およびＨｏｗｄｅｎら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８年；１０巻：４２～５０頁によって記載されるとおり、抗生物質選択、蛍光標識細胞分取、サザンブロット、ＰＣＲに基づく検出、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの種々の方法によってアッセイされうる。さらに、安定細胞株は、Ｃｌａｒｋ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、６１巻（２００２年）：Ｓ９～Ｓ１５頁およびＹｕａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１年５月；２２巻（５号）：６１３～２４頁に記載のものなどの当技術分野において周知のプロトコールに従って確立されうる。
ＩＩＩ．組換えポリヌクレオチドのＨＤＡＣ阻害剤を伴う共送達
ＩＩＩ．組換えポリヌクレオチドのＨＤＡＣ阻害剤を伴う共送達
【0045】
本発明の別の態様は、組換えポリヌクレオチドをトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）などのＨＤＡＣ阻害剤と共に真核細胞または宿主細胞培養物に共送達することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、組換えポリヌクレオチドをＨＤＡＣ阻害剤と共に真核細胞もしくは宿主細胞培養物に共送達すること、ポリヌクレオチドの真核細胞もしくは宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にする条件下で真核細胞もしくは宿主細胞培養物を培養すること、ポリヌクレオチドの真核細胞もしくは宿主細胞ゲノムへの組み込みを検出すること、および／または安定な真核細胞もしくは宿主細胞株を生成すること、を含む。
【0046】
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物は、真核細胞または宿主細胞培養物において発現される。遺伝子産物は、組換えポリヌクレオチドによってコードされていてよい、または組換えポリヌクレオチドの存在に間接的に依存してよい。遺伝子産物は、例えば、リボ核酸、ペプチドまたはタンパク質でありうる。
【0047】
一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶベクターである。組換えウイルスベクターのＨＤＡＣ阻害剤を伴う共送達は、ウイルスベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを増強し、宿主細胞から収集されるウイルスの収率を増加させうる。
【0048】
本明細書において使用される組換えポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッドおよびこれらのキメラでありうる。それらは、１本鎖または２本鎖でありうる。一部の実施形態では、それらは、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列がシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に組み込まれ、シグナルペプチドのヌクレオチド配列の下流のタンパク質の高レベルでの発現を可能にする、発現ベクターでありうる。本発明は、一般に使用されるプラスミドおよびウイルスなどの任意のベクターに好適である。そのようなベクターの例として、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８およびアデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスに基づくベクターを含みうる。本発明の組換えポリヌクレオチドは、プロモーター、ターミネーター、コザック配列、マルチクローニング部位、薬剤耐性遺伝子および他のヌクレオチド配列などの発現ベクターにおいて一般に使用される他のヌクレオチド配列をさらに組み入れることができる。
【0049】
本明細書において使用されるＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣの４種のクラスのいずれか１つに作用する阻害剤でありうる。例としては、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、ベンズアミド、フェニルブチレート、バルプロ酸、ヒドロキサム酸ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、エンチノスタット（ＭＳ－２７５）、ＣＩ９９４、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、ニコチンアミド、ジヒドロクマリン、ナフトピラノンおよび２－ヒドロキシナフトアルデヒドが挙げられる。
【0050】
ＨＤＡＣ阻害剤および組換えポリヌクレオチドは、哺乳動物由来、昆虫由来もしくは酵母由来の細胞株；初代細胞または培養物中で増殖できる幹細胞を含む任意の真核細胞培養物に同時投与されうる。ポリヌクレオチドおよびＨＤＡＣ阻害剤の共送達法は、標的細胞型およびポリヌクレオチドに大きく依存する。それらとしては、リポソームに基づくトランスフェクション；リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストランもしくは活性化デンドリマーを利用する方法などの化学物質に基づくトランスフェクション；マイクロインジェクション；エレクトロポレーション；磁気ビーズ；ナノ粒子；またはセルスクイージングが挙げられる。当業者は、ポリヌクレオチドを送達しようとする細胞の種類に応じて好適な共送達法を同定することができるであろう。
【0051】
ポリヌクレオチドをＨＤＡＣ阻害剤と共に真核細胞培養物に共送達した後に、ポリヌクレオチドの宿主ゲノムへの組み込みは、Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４年）１１巻、７１１～７２１頁、Ｐｈｉｌｐｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２年）７６巻（１１号）：５４１１～５４２１頁、Ｈｏｗｄｅｎら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８年；１０巻：４２～５０頁によって記載されるとおり、抗生物質選択、蛍光標識細胞分取、ＰＣＲに基づく方法、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの当技術分野において周知の種々の方法によってアッセイされうる。付加的に、安定細胞株は、Ｌｏｎｇｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２０１３年；５２９巻：２０９～２２６頁およびＹｕａｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１年５月；２２巻（５号）：６１３～２４頁に記載のプロトコールに従って確立されうる。一部の実施形態では、宿主細胞中の１つまたは複数の遺伝子産物は、発現される。遺伝子産物は、組換えポリヌクレオチドによってコードされていてよい、または宿主細胞に導入された組換えポリヌクレオチドの存在に間接的に依存してよい。リボ核酸、ペプチドからタンパク質に変化した遺伝子産物は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、サザンブロット、免疫蛍光およびＥＬＩＳＡなどの当技術分野において十分確立された方法によって検出されうる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターであり、それらの産生、単離および定量は、当技術分野において公知である。
【0052】
記載全体を通じて、組成物が特定の構成成分を有している、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、または工程および方法が特定のステップを有している、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として記載される場合、追加的に、列挙された構成成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物があり、列挙された処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明による工程および方法があることが企図される。
【0053】
本出願において、エレメントまたは構成成分が、列挙されたエレメントまたは構成成分のリストに含まれるおよび／またはそれから選択されると述べられている場合、エレメントもしくは構成成分は、列挙されたエレメントもしくは構成成分の任意の１つでありうる、またはエレメントもしくは構成成分は、列挙されたエレメントもしくは構成成分の２つもしくはそれより多くからなる群から選択されうることは理解されるべきである。
【0054】
さらに、本明細書に記載される組成物または方法のエレメントおよび／または特性が、本明細書において明確であるかまたは暗示的であるかどうかに関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされうることは理解されるべきである。例えば、具体的な化合物に言及する場合、その化合物は、内容からそうでないと理解されない限り、本発明の組成物の種々の実施形態および／または本発明の方法において使用されうる。言い換えると、本出願内で、実施形態は、明確で簡潔な応用が記載され、描かれることを可能にする方法で記載され、描かれているが、実施形態が本教示および発明（単数または複数）から離れることなく、種々に組み合わされる、または分けられうることは意図され、理解されるであろう。例えば、本明細書に記載および描かれるすべての特性は、本明細書に記載され、描かれる本発明のすべての態様（単数または複数）に適用可能であることは理解されるであろう。
【0055】
表現「少なくとも１つの」は、内容および使用から他に理解される場合を除いて、表現の後に列挙された対象のそれぞれを個別に、および列挙された対象の２つまたはそれよりも多くの種々の組合せを含むことは理解されるべきである。３つまたはそれよりも多い列挙された対象と関連する表現「および／または」は、内容から他に理解される場合を除いて、同じ意味を有すると理解されるべきである。
【0056】
その文法的同等語を含む、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、他に具体的に述べられているまたは内容から理解されない限り、一般に制約なくかつ非限定的であるとして、例えば、追加的な列挙されていないエレメントまたはステップを排除しないとして理解されるべきである。
【0057】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」の使用が定量的な値の前である場合、本発明は、他に具体的に述べられない限り、具体的な定量値それ自体も含む。本明細書において使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、他に示されるまたは推測されない限り、名目値からの±１０％変動を指す。
【0058】
ステップの順序またはある特定の作用を実施する順序は、本発明が作動可能なままである限り重要でないことは理解されるべきである。さらに、２つまたはそれよりも多いステップまたは作用は、同時に実施されうる。
【0059】
本明細書におけるありとあらゆる例、または例示的語の使用、例えば「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本発明をよりよく例示する目的のためだけであり、特許請求しない限り本発明の範囲に制限を提示しない。本明細書における語は、特許請求されていない任意のエレメントが本発明の実施に不可欠であるとことを示すとして解釈されるべきでない。
【0060】
本発明の実施は、例示的目的のためだけに本明細書において提示され、いかなる方法においても本発明を限定すると解釈されるべきでない、前述の例からさらに十分に理解される。
【実施例】
【0061】
コロニー形成
懸濁液で培養したＨｅＬａ Ｓ３細胞を、それらを接着培養条件に適合させるためにトランスフェクションの前日に蒔いた。トランスフェクション当日に、１５μｇのｒＡＡＶベクターを０、０．７５または１μｇのｒｅｐ６８ ｍＲＮＡと０、３０ｎＭまたは１００ｎＭトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）と組み合わせて混合し、次に０．２ｃｍギャップキュベット（ｇａｐ ｃｕｖｅｔｔｅ）中１００Ｖ、３０ｍｓでのエレクトロポレーションによって細胞１０６個にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、細胞を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を含む９６ウエルプレートに蒔く前に室温で、５分間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、４００ｎｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する培地を、それらのゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞を選択するために使用した。トランスフェクション後１０日目に増殖したコロニーの数を各プレートで計数した。図１は、ｒＡＡＶベクターの、種々の量のｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡを伴う共送達後の細胞コロニーの定量を示している。結果は、９６ウエルプレートに蒔き、抗生物質選択した後に増殖したコロニーの数を表している。ＴＳＡを含まない１μｇのｒｅｐ６８のトランスフェクション条件下のコロニーの数は、１０枚の９６ウエルプレートからの平均であった（＋／－標準偏差）。結果は、ｒＡＡＶベクターのｒｅｐ６８ ｍＲＮＡを伴う同時トランスフェクションがコロニー形成を顕著に増強し、ＴＳＡもコロニー形成を中程度に増加させることを示している。
ｒＡＡＶ産生
懸濁液で培養したＨｅＬａ Ｓ３細胞を、それらを接着培養条件に適合させるためにトランスフェクションの前日に蒔いた。トランスフェクション当日に、１５μｇのｒＡＡＶベクターを０、０．７５または１μｇのｒｅｐ６８ ｍＲＮＡと０、３０ｎＭまたは１００ｎＭトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）と組み合わせて混合し、次に０．２ｃｍギャップキュベット（ｇａｐ ｃｕｖｅｔｔｅ）中１００Ｖ、３０ｍｓでのエレクトロポレーションによって細胞１０６個にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの後、細胞を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を含む９６ウエルプレートに蒔く前に室温で、５分間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、４００ｎｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する培地を、それらのゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクターを有する細胞を選択するために使用した。トランスフェクション後１０日目に増殖したコロニーの数を各プレートで計数した。図１は、ｒＡＡＶベクターの、種々の量のｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡを伴う共送達後の細胞コロニーの定量を示している。結果は、９６ウエルプレートに蒔き、抗生物質選択した後に増殖したコロニーの数を表している。ＴＳＡを含まない１μｇのｒｅｐ６８のトランスフェクション条件下のコロニーの数は、１０枚の９６ウエルプレートからの平均であった（＋／－標準偏差）。結果は、ｒＡＡＶベクターのｒｅｐ６８ ｍＲＮＡを伴う同時トランスフェクションがコロニー形成を顕著に増強し、ＴＳＡもコロニー形成を中程度に増加させることを示している。
ｒＡＡＶ産生
【0062】
上に記載の同時トランスフェクション後１５日目に、９６ウエルプレート上に形成されたコロニーをウイルス粒子の形成を可能にする３０の感染多重度（ＭＯＩ）でアデノウイルス５（Ａｄ５）を用いて感染させた。１８日目に、感染細胞を２時間、３７℃で、デオキシコール酸ナトリウムおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含有する溶解緩衝液で溶解させた。試料からの上清をｒＡＡＶゲノムＤＮＡを遊離するためにＤＮａｓｅ Ｉおよび次にプロテイナーゼＫを用いて連続的に消化した。ｒＡＡＶベクターのＢＧＨ－ＰｏｌｙＡコード領域を増幅するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを次に各試料のＣｔ値を決定するために使用した。図２は、各同時トランスフェクション条件下でのコロニーのＣｔ値および平均Ｃｔ値の分布を示している。ｒＡＡＶの１μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ＋３０ｎＭ ＴＳＡ、または０．７５μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ＋１００ｎＭ ＴＳＡを伴う共送達は、Ｃｔ値の減少をもたらし、これらのトランスフェクション条件下での宿主細胞からのｒＡＡＶ産生の増強を示している。
安定細胞株の生成
安定細胞株の生成
【0063】
安定細胞株を上に記載のさまざまなｒＡＡＶ同時トランスフェクション条件：１μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ（８Ｇ３クローン）、３０ｎＭ ＴＳＡ（１２Ｂ５クローン）、または０．７５μｇ ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡ＋１００ｎＭ ＴＳＡ（１６Ｄ２クローン）から、ｒｅｐ ｍＲＮＡもＴＳＡも伴わないｒＡＡＶベクターのトランスフェクション（１０Ｇ８クローン）によって生成された対照細胞株と一緒に生成した。Ａｄ５を用いたＭＯＩ、５０での感染後、細胞を感染後０、１、２、３および４日目（Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）に採取し、それからゲノムＤＮＡを単離した。ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲをｒＡＡＶゲノムだけでなく内在性遺伝子－ＲＮａｓｅ Ｐも増幅するために使用した。細胞あたりのｒＡＡＶゲノムコピー数（ＧＣ／細胞）の定量を、各ＨｅＬａ細胞におよそ３コピーで存在するＲＮａｓｅ Ｐ遺伝子を用いた正規化によって達成した。図３は、ｒＡＡＶベクターならびにｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡの同時トランスフェクションによって得られる安定細胞株中のｒＡＡＶゲノムコピーの増加を、ｒＡＡＶ単独でトランスフェクトした細胞株と比較して示し、ｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡがｒＡＡＶゲノムの宿主細胞への組み込みおよび安定宿主細胞株生成を改善したことを示している。
安定細胞株からのｒＡＡＶ収率
安定細胞株からのｒＡＡＶ収率
【0064】
ｒＡＡＶ収率を対照および上に記載の３つの安定細胞株からアッセイした。細胞を２回反復で１００ｍＬの産生培地（９０ｍＬ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ＤＭＥＭ＋１０ｍＬ ＥＸ－ＣＥＬＬ）中、細胞１．５×１０６個／ｍＬでフラスコに播種し、Ａｄ５を用いてＭＯＩ、５０で感染させた。感染の４日後、細胞を２時間、３７℃で、デオキシコール酸ナトリウムおよびＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含有する溶解緩衝液で溶解させた。試料からの上清をｒＡＡＶゲノムＤＮＡを遊離するためにＤＮａｓｅ Ｉおよび次にプロテイナーゼＫを用いて連続的に消化した。ｒＡＡＶゲノムのＢＧＨ－ＰｏｌｙＡコード領域を増幅するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを次にｒＡＡＶプラスミド標準曲線に基づいてｒＡＡＶゲノムコピー数（ＧＣ）を決定するために使用した。図４は、ｒＡＡＶベクターならびにｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡの共送達によって確立した安定細胞株からのｒＡＡＶの産生の増強を示し、ｒＡＡＶベクターのｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよび／またはＴＳＡを伴う宿主細胞への共送達が宿主細胞からのｒＡＡＶ産生を改善したことを示唆している。
番号付き実施形態
番号付き実施形態
【0065】
１．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター力価を増加させる方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；および
ｂ）前記真核細胞培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増加させること
を含む方法。
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；および
ｂ）前記真核細胞培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増加させること
を含む方法。
【0066】
２．前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【0067】
３．前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、実施形態１に記載の方法。
【0068】
４．前記共送達することが磁気ビーズを伴う、実施形態１に記載の方法。
【0069】
５．前記共送達することがナノ粒子を伴う、実施形態１に記載の方法。
【0070】
６．前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、実施形態１に記載の方法。
【0071】
７．前記共送達することがセルスクイージングを含む、実施形態１に記載の方法。
【0072】
８．前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、実施形態１に記載の方法。
【0073】
９．前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、実施形態８に記載の方法。
【0074】
１０．前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、実施形態８に記載の方法。
【0075】
１１．前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、実施形態８に記載の方法。
【0076】
１２．前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、実施形態８に記載の方法。
【0077】
１３．前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、実施形態８に記載の方法。
【0078】
１４．組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための細胞株を開発する方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞に共送達すること；
ｂ）真核細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞を同定すること；および
ｃ）必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増強すること
を含む方法。
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞に共送達すること；
ｂ）真核細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞を同定すること；および
ｃ）必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増強すること
を含む方法。
【0079】
１５．前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１４に記載の方法。
【0080】
１６．前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、実施形態１４に記載の方法。
【0081】
１７．前記共送達することが磁気ビーズを伴う、実施形態１４に記載の方法。
【0082】
１８．前記共送達することがナノ粒子を伴う、実施形態１４に記載の方法。
【0083】
１９．前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、実施形態１４に記載の方法。
【0084】
２０．前記共送達することがセルスクイージングを含む、実施形態１４に記載の方法。
【0085】
２１．前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、実施形態１４に記載の方法。
【0086】
２２．前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、実施形態２１に記載の方法。
【0087】
２３．前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、実施形態２１に記載の方法。
【0088】
２４．前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、実施形態２１に記載の方法。
【0089】
２５．前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、実施形態２１に記載の方法。
【0090】
２６．前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、実施形態２１に記載の方法。
【0091】
２７．ＨＤＡＣ阻害剤および組換えポリヌクレオチドを真核細胞に共送達することを含む方法。
【0092】
２８．前記真核細胞の１つの染色体内での前記組換えポリヌクレオチドの組み込みを検出するステップをさらに含む、実施形態２７に記載の方法。
【0093】
２９．前記真核細胞ゲノムに組み込まれた前記組換えポリヌクレオチドを含む安定細胞株を確立するステップをさらに含む、実施形態２７または２８に記載の方法。
【0094】
３０．前記真核細胞内の前記組換えポリヌクレオチドの存在に依存して遺伝子産物を発現するステップをさらに含む、実施形態２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【0095】
３１．前記遺伝子産物がリボ核酸である、実施形態３０に記載の方法。
【0096】
３２．前記遺伝子産物がポリペプチドである、実施形態３０に記載の方法。
【0097】
３３．前記ポリヌクレオチドが前記遺伝子産物をコードする、実施形態３０に記載の方法。
【0098】
３４．前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスベクターを含む、実施形態３０に記載の方法。
【0099】
３５．前記組換えウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）である、実施形態３４に記載の方法。
【0100】
３６．前記真核細胞の培養物から組換えウイルスを収集するステップをさらに含む、実施形態３４に記載の方法。
【0101】
３７．前記真核細胞の培養物から組換えＡＡＶを収集するステップをさらに含む、実施形態３５に記載の方法。
【0102】
３８．前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、実施形態２７に記載の方法。
【0103】
３９．前記共送達することが磁気ビーズを伴う、実施形態２７に記載の方法。
【0104】
４０．前記共送達することがナノ粒子を伴う、実施形態２７に記載の方法。
【0105】
４１．前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、実施形態２７に記載の方法。
【0106】
４２．前記共送達することがセルスクイージングを含む、実施形態２７に記載の方法。
【0107】
４３．前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、実施形態２７に記載の方法。
【0108】
４４．前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、実施形態４３に記載の方法。
【0109】
４５．前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、実施形態４３に記載の方法。
【0110】
４６．前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、実施形態４３に記載の方法。
【0111】
４７．前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、実施形態４３に記載の方法。
【0112】
４８．前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、実施形態４３に記載の方法。
【0113】
４９．前記ＨＤＡＣ阻害剤がトリコスタチンＡである、実施形態２７から４８のいずれか一項に記載の方法。
参照による組み込み
参照による組み込み
【0114】
本明細書において参照される特許および科学文書のそれぞれの開示全体は、すべての目的について参照により組み込まれる。
均等物
均等物
【0115】
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態において具体化されうる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明への制限よりむしろ、あらゆる点で例示的であると見なされるべきである。本発明の範囲は、したがって前述の記載によってよりむしろ添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に生じるすべての変化は、それに含まれることが意図される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター力価を増加させる方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；および
ｂ）前記真核細胞培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増加させること
を含む方法。
（項目２）
前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１４）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための細胞株を開発する方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞に共送達すること；
ｂ）真核細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞を同定すること；および
ｃ）必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増強すること
を含む方法。
（項目１５）
前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
ＨＤＡＣ阻害剤および組換えポリヌクレオチドを真核細胞に共送達することを含む方法。
（項目２８）
前記真核細胞の１つのゲノムへの前記組換えポリヌクレオチドの組み込みを検出するステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記真核細胞ゲノムに組み込まれた前記組換えポリヌクレオチドを含む安定細胞株を確立するステップをさらに含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記真核細胞内の前記組換えポリヌクレオチドの存在に依存して遺伝子産物を発現するステップをさらに含む、項目２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記遺伝子産物がリボ核酸である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子産物がポリペプチドである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ポリヌクレオチドが前記遺伝子産物をコードする、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスベクターを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記組換えウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記真核細胞の培養物から組換えウイルスを収集するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記真核細胞の培養物から組換えＡＡＶを収集するステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３９）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目２７に記載の方法。
（項目４０）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目２７に記載の方法。
（項目４１）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４２）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４３）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４４）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記ＨＤＡＣ阻害剤がトリコスタチンＡである、項目２７から４８のいずれか一項に記載の方法。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター力価を増加させる方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞培養物に共送達すること；および
ｂ）前記真核細胞培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増加させること
を含む方法。
（項目２）
前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目８に記載の方法。
（項目１４）
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するための細胞株を開発する方法であって、
ａ）ｒＡＡＶベクターをｒｅｐ ｍＲＮＡと共に真核細胞に共送達すること；
ｂ）真核細胞ゲノムに組み込まれたｒＡＡＶベクター配列を含有する真核細胞を同定すること；および
ｃ）必要に応じて、前記真核細胞を含む培養物からｒＡＡＶを収集することであって、前記ｒｅｐ ｍＲＮＡを伴う前記共送達が前記収集されるｒＡＡＶの力価を増強すること
を含む方法。
（項目１５）
前記ｒｅｐ ｍＲＮＡがｒｅｐ６８ ｍＲＮＡおよびｒｅｐ７８ ｍＲＮＡからなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
ＨＤＡＣ阻害剤および組換えポリヌクレオチドを真核細胞に共送達することを含む方法。
（項目２８）
前記真核細胞の１つのゲノムへの前記組換えポリヌクレオチドの組み込みを検出するステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記真核細胞ゲノムに組み込まれた前記組換えポリヌクレオチドを含む安定細胞株を確立するステップをさらに含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記真核細胞内の前記組換えポリヌクレオチドの存在に依存して遺伝子産物を発現するステップをさらに含む、項目２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記遺伝子産物がリボ核酸である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記遺伝子産物がポリペプチドである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ポリヌクレオチドが前記遺伝子産物をコードする、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスベクターを含む、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記組換えウイルスベクターが組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記真核細胞の培養物から組換えウイルスを収集するステップをさらに含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記真核細胞の培養物から組換えＡＡＶを収集するステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記共送達することがエレクトロポレーションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３９）
前記共送達することが磁気ビーズを伴う、項目２７に記載の方法。
（項目４０）
前記共送達することがナノ粒子を伴う、項目２７に記載の方法。
（項目４１）
前記共送達することがマイクロインジェクションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４２）
前記共送達することがセルスクイージングを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４３）
前記共送達することが化学物質に基づくトランスフェクションを含む、項目２７に記載の方法。
（項目４４）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが脂質への曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがリン酸カルシウムへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがカチオン性ポリマーへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記化学物質に基づくトランスフェクションがＤＥＡＥデキストランへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記化学物質に基づくトランスフェクションが活性化デンドリマーへの曝露を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記ＨＤＡＣ阻害剤がトリコスタチンＡである、項目２７から４８のいずれか一項に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
