特許 7144039 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-20

(45)【発行日】2022-09-29

(54)【発明の名称】重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20220921BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220921BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20220921BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20220921BHJP

   C07K 14/175 20060101ALN20220921BHJP

【ＦＩ】

G01N33/569 L ZNA

G01N33/53 N

G01N33/543 545D

G01N33/543 541Z

C12M1/34 F

C07K14/175

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2018149981

(22)【出願日】2018-08-09

(65)【公開番号】P2020026953

(43)【公開日】2020-02-20

【審査請求日】2021-06-08

(73)【特許権者】

【識別番号】504224153

【氏名又は名称】国立大学法人 宮崎大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100133592

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(72)【発明者】

【氏名】岡山 昭彦

(72)【発明者】

【氏名】梅北 邦彦

(72)【発明者】

【氏名】松田 基弘

(72)【発明者】

【氏名】梅木 一美

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１８１２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４０６２４４３（ＣＮ，Ａ）

【文献】Yongjun Jiao，Preparation and Evaluation of Recombinant Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Nucleocapsid Protein for Detection of Total Antibodies in Human and Animal Sera by Double-Antigen Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，J Clin Microbiol，2012年02月，50(2)，pp.372-7，doi: 10.1128/JCM.01319-11

【文献】Xianguo Wang，Development of a Colloidal Gold Kit for the Diagnosis of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus Infection，Biomed Res Int.，2014年，Volume 2014, Article ID 530621，pp.1-6，doi: 10.1155/2014/53062

【文献】Fuxun Yu，Application of recombinant severe fever with thrombocytopenia syndrome virus nucleocapsid protein for the detection of SFTSV-specific human IgG and IgM antibodies by indirect ELISA，Virol J，2015年08月04日，12:117，pp.1-7，doi: 10.1186/s12985-015-0350-0

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第１の組換え核タンパク質が固定化された担体と、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第２の組換え核タンパク質と、
を備え、
前記第１の組換え核タンパク質及び前記第２の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列である、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。

【請求項2】

前記担体は、
ＥＬＩＳＡ用プレートに設けられたウェルである、
請求項１に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。

【請求項3】

前記第２の組換え核タンパク質は、
西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている、
請求項２に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。

【請求項4】

前記担体は、
血液検体に暴露される検体反応部及び前記血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体であって、
前記検体反応部は、前記第２の組換え核タンパク質を有し、
前記捕捉部には、前記第１の組換え核タンパク質が固定化されている、
請求項１に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。

【請求項5】

前記第２の組換え核タンパク質は、
金コロイドで標識されている、
請求項４に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。

【請求項6】

担体に固定化された重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第１の組換え核タンパク質に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第２の組換え核タンパク質を介して検出し、
前記第１の組換え核タンパク質及び前記第２の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列である、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ ｆｅｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、以下「ＳＦＴＳ」ともいう）は、ブニヤウイルス科フレボウイルス属のＳＦＴＳウイルス（以下「ＳＦＴＳＶ」ともいう）によるマダニ媒介性の新興感染症である。ＳＦＴＳの感染例が中国、韓国及び日本で報告されている。日本では現在までに３００名以上の感染が確認されており、致死率は約２０％と高く、特に高齢者で致死率が高い傾向がある。

【0003】

現在、ＳＦＴＳの診断は、非特許文献１に開示されたように、ＳＦＴＳＶ遺伝子検出法及びＳＦＴＳＶ抗体検出法で主に行われる。ＳＦＴＳＶ遺伝子検出法では、本症の疑いのある患者の血液検体を対象としたＲＴ－ＰＣＲ法が用いられる。ＳＦＴＳＶ抗体検出法では、急性期及び回復期のペア血清について、ＳＦＴＳＶ感染細胞と非感染細胞とを所定の比で混合し、これを抗原とした間接蛍光抗体法により、ＳＦＴＳＶに対するＩｇＧ抗体価又はＩｇＭ抗体価が測定される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】福士秀悦、外５名、「重症熱性血小板減少症候群の検査法」、病原微生物検出情報、感染研感染症疫学センター、２０１４年２月、第３５巻、第２号（Ｎｏ．４０８）、ｐ．１０－１１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のＳＦＴＳＶ遺伝子検出法は、専用の検査設備と高度な技術を必要とし、一般的な検査室では実施できない。また、血液検体からのＲＮＡの抽出、逆転写反応及び遺伝子増幅等、結果を得るまでのステップが多くて煩わしく、時間を要する。ＳＦＴＳＶ遺伝子検出法は、保健所経由で衛生研究所に輸送された血液検体を対象に実施されるため、検体の輸送にも時間がかかり、結果が得られるまでの迅速性に欠ける。

【0006】

また、上記のＳＦＴＳＶ抗体検出法においては、ペア血清の準備及びＳＦＴＳＶ感染細胞と非感染細胞とを混合するステップを要する。さらに、ＳＦＴＳＶに対する間接蛍光抗体法に用いる試薬は市販されておらず、ＳＦＴＳＶ遺伝子検出法と同様に、血液検体の衛生研究所への輸送に時間がかかる。

【0007】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ迅速に重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体を検出できる重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１の観点に係る重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キットは、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第１の組換え核タンパク質が固定化された担体と、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第２の組換え核タンパク質と、
を備え、
前記第１の組換え核タンパク質及び前記第２の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列である。

【0010】

また、前記担体は、
ＥＬＩＳＡ用プレートに設けられたウェルである、
こととしてもよい。

【0011】

また、前記第２の組換え核タンパク質は、
西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されている、
こととしてもよい。

【0012】

また、前記担体は、
血液検体に暴露される検体反応部及び前記血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体であって、
前記検体反応部は、前記第２の組換え核タンパク質を有し、
前記捕捉部には、前記第１の組換え核タンパク質が固定化されている、
こととしてもよい。

【0013】

また、前記第２の組換え核タンパク質は、
金コロイドで標識されている、
こととしてもよい。

【0014】

本発明の第２の観点に係る重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法は、
担体に固定化された重症熱性血小板減少症候群ウイルスの第１の組換え核タンパク質に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された第２の組換え核タンパク質を介して検出し、
前記第１の組換え核タンパク質及び前記第２の組換え核タンパク質のアミノ酸配列は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列である。

【発明の効果】

【0015】

本発明によれば、簡便かつ迅速に重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体を検出できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の実施の形態２に係るクロマトグラフ媒体の構成を示す図である。（Ａ）はクロマトグラフ媒体の上面図を示す。（Ｂ）はクロマトグラフ媒体の（Ａ）に示すＸ－Ｘ’破線で切断し、分解したクロマトグラフ媒体の矢視図を示す。

【図2】実施例１に係る症例Ｍ２について、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下では「ＥＬＩＳＡ」という）において固相化するｒＮＰ溶液のｒＮＰの濃度に対する吸光度を示す図である。

【図3】実施例１に係る症例Ｍ４について、ＥＬＩＳＡにおいて固相化するｒＮＰ溶液のｒＮＰの濃度に対する吸光度を示す図である。

【図4】実施例２において、健常人の血清を対象として、実施例１で構築したＥＬＩＳＡで測定した吸光度の分布を示す図である。

【図5】実施例２において、実施例１で構築したＥＬＩＳＡで測定した検体のカットオフ値に対する吸光度を示す図である。（Ａ）は症例Ｍ１の血清を含む検体に係る結果を示す図である。（Ｂ）は症例Ｍ２の血清を含む検体に係る結果を示す図である。（Ｃ）は症例Ｍ６の血清を含む検体に係る結果を示す図である。

【図6】実施例１で構築したＥＬＩＳＡによる抗ＮＰ抗体測定の特異性を示す図である。（Ａ）は症例Ｍ１に係る結果を示す図である。（Ｂ）は症例Ｍ２に係る結果を示す図である。（Ｃ）は症例Ｍ６に係る結果を示す図である。（Ｄ）はウサギ抗ＮＰ血清に係る結果を示す図である。

【図7】実施例４におけるイムノクロマトグラフィーによる抗ＮＰ抗体の検出結果を示す図である。

【図8】回復期血清を含む検体に関する実施例５に係るイムノクロマトグラフィーの結果を示す図である。

【図9】急性期血清を含む検体に関する実施例５に係るイムノクロマトグラフィーの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

【0018】

（実施の形態１）
本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、血液検体に含まれるＳＦＴＳＶの核タンパク質（以下「ＮＰ」とする）に対する抗体（以下「抗ＮＰ抗体」という）を検出するためのキットである。血液検体に抗ＮＰ抗体が検出された場合、被検者はＳＦＴＳＶに感染している又は感染していた、すなわち、ＳＦＴＳである又はＳＦＴＳであったと診断される。血液検体は、被検者の全血であってもよく、被検者の血液に含まれる血清及び血漿等の成分であってもよい。また、血液検体は、被検者の全血、血清及び血漿等の成分を緩衝液等で希釈したものであってもよい。

【0019】

ＳＦＴＳＶは、１本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＦＴＳＶのゲノムＲＮＡは、Ｌ分節、Ｍ分節及びＳ分節の３分節で構成される。ＮＰは、非構造タンパク質とともにＳ分節にコードされている。

【0020】

ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳＶの（第１の）組換えＮＰ（以下「ｒＮＰ」とする）が固定化された担体と、ＳＦＴＳＶの標識された（第２の）ｒＮＰと、を備える。ｒＮＰは、人為的に発現させたＮＰであって、ＳＦＴＳＶの種々の株におけるＮＰのアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されない。

【0021】

ｒＮＰは、公知の方法で構築される発現系で発現させることができる。発現系は、例えば、ＳＦＴＳＶのＮＰをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞である。好ましくは、発現系は大腸菌で構築される。発現系で発現されたｒＮＰは、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィー等の任意の精製方法によって精製される。好適には、Ｈｉｓ ｔａｇがＣ末端に付加されたｒＮＰがアフィニティークロマトグラフィーで精製される。

【0022】

上記の担体は、特に限定されないが、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、マイクロプレート及びクロマトグラフ媒体等の不溶性担体等である。ｒＮＰは、常法で担体に固定化される。本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＥＬＩＳＡで血液検体中の抗ＮＰ抗体を検出する。このため、担体としてＥＬＩＳＡ用プレートを用いる。

【0023】

ｒＮＰは、ＥＬＩＳＡ用プレートに設けられたウェル内に固定化される。ＥＬＩＳＡ用プレートとしては、例えば、タンパク質を吸着する表面処理がなされた市販のＥＬＩＳＡ用プレートを用いることができる。この場合、各ウェルに適量のｒＮＰ溶液を添加し、低温、例えば４℃で数時間、好ましくは１０～２０時間静置することで、ＥＬＩＳＡ用プレートに設けられたウェル内にｒＮＰを固相化できる。ｒＮＰを固定化したウェルには、適宜、非特異的な結合を低減するためのブロッキング処理が施される。

【0024】

上記担体に固定化されるｒＮＰの濃度は特に限定されず、例えば、適用する血液検体の希釈倍率に応じて適宜調製される。血液検体として適切な溶媒で１００～５００倍に希釈した被検者の血清を用いる場合、例えば、９６ウェルプレートの各ウェルには、２～５μｇ／ｍＬ、好ましくは２．２～４μｇ／ｍＬ、より好ましくは２．３～３．５μｇ／ｍＬ、特に好ましくは２．５～３μｇ／ｍＬの濃度のｒＮＰ溶液が固定化される。

【0025】

一方、血液検体として適切な溶媒で１０～５０倍に希釈した被検者の血清を用いる場合、例えば、９６ウェルプレートの各ウェルには、１～５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２～４ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５～３．５ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは３ｎｇ／ｍＬの濃度のｒＮＰ溶液が固定化される。

【0026】

担体に固定化された抗ＮＰ抗体捕捉用のｒＮＰとは別に、抗ＮＰ抗体検出用のｒＮＰとしてｒＮＰが標識される。ｒＮＰは、市販のキット等を用いて公知の方法で標識できる。ｒＮＰを標識する物質としては、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）等の酵素、放射性同位体、蛍光物質及び発光物質等を用いることができる。好ましくは、ｒＮＰはＨＲＰで標識される。以下では、担体に固定化された抗ＮＰ抗体捕捉用のｒＮＰ及び抗ＮＰ抗体検出用の標識されたｒＮＰを、それぞれ“捕捉用ｒＮＰ”及び“検出用ｒＮＰ”という。

【0027】

捕捉用ｒＮＰ及び検出用ｒＮＰのアミノ酸配列は、ＳＦＴＳＶのＮＰのアミノ酸配列であれば特に限定されない。好適には、ｒＮＰのアミノ酸配列は、国内で分離されたＳＦＴＳＶ株ＳＰＬ０３０ＡのｒＮＰのアミノ酸配列である（配列番号１）。なお、精製のためにｒＮＰにＨｉｓ ｔａｇを付加する場合、Ｈｉｓ ｔａｇはｒＮＰのアミノ酸配列に含まないものとする。また、捕捉用ｒＮＰ及び検出用ｒＮＰのアミノ酸配列は、それぞれＳＦＴＳＶの異なる株由来のアミノ酸配列であってもよいが、好ましくは同一である。

【0028】

本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、例えば、ｒＮＰを標識する酵素の基質、発色剤、色素及び緩衝液等をさらに含んでもよい。検出用ｒＮＰをＨＲＰで標識した場合、好ましくは、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットはＨＲＰの発色反応に用いる基質を含む。

【0029】

続いて、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出方法について説明する。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出方法は、担体に固定化された捕捉用ｒＮＰに捕捉された血液検体に含まれるＳＦＴＳＶのＮＰに対する抗ＮＰ抗体を、抗ＮＰ抗体に結合した、検出用ｒＮＰを介して検出する。

【0030】

より詳細には、当該ＳＦＴＳＶ抗体検出方法は、第１の反応ステップ、第２の反応ステップ及び検出ステップを含む。第１の反応ステップでは、担体に固定化された捕捉用ｒＮＰを血液検体に暴露する。第１の反応ステップの条件は、常法に従えばよいが、室温で５分間～４時間、好ましくは２時間である。これにより、血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体が抗原抗体反応によって捕捉用ｒＮＰに結合することで捕捉される。続いて、洗浄液で担体を洗浄し、未反応の物質等を除去してもよい。

【0031】

第２の反応ステップでは、捕捉用ｒＮＰに捕捉された抗ＮＰ抗体を、検出用ｒＮＰに結合させる。第２の反応ステップの条件は、常法に従えばよいが、室温で３分間～３時間、好ましくは１時間である。続いて、洗浄液で担体を洗浄し、未反応の検出用ｒＮＰ等を除去する。

【0032】

検出ステップでは、捕捉用ｒＮＰに捕捉された抗ＮＰ抗体を、当該抗ＮＰ抗体に結合した検出用ｒＮＰを介して検出する。例えば、検出用ｒＮＰをＨＲＰで標識した場合、基質とＨＲＰとを反応させ、吸光度を測定する。吸光度によって、検出用ｒＮＰ、すなわち検出用ｒＮＰに結合した抗ＮＰ抗体を検出又は定量できる。血液検体から抗ＮＰ抗体が検出されたことは、被検者からＳＦＴＳＶが検出されたことを意味する。

【0033】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、上述の急性期及び回復期のペア血清の準備及びＳＦＴＳＶ感染細胞と非感染細胞の混合が不要で、かつ二次抗体を使用せずにＳＦＴＳＶ抗体としての抗ＮＰ抗体を検出できる。よって、簡便かつ迅速に抗ＮＰ抗体を検出できる。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、下記実施例２に示すように、高い特異性及び感度で抗ＮＰ抗体を検出できる。

【0034】

さらに、当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、急性期及び回復期のいずれの血清からも抗ＮＰ抗体を検出できる。近年、ＳＦＴＳに有効なＳＦＴＳ治療薬が開発されつつある。当該ＳＦＴＳ治療薬は発症早期での投与が望ましいとされている。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳ治療薬による早期治療のためのコンパニオン診断にも有用である。

【0035】

（実施の形態２）
本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＥＬＩＳＡではなく、イムノクロマトグラフィーで血液検体中の抗ＮＰ抗体を検出する。このため、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、担体としてクロマトグラフ媒体１０を備える。

【0036】

図１（Ａ）はクロマトグラフ媒体１０の構成を示す図である。図１（Ａ）に示されたＸ－Ｘ’破線でクロマトグラフ媒体１０を切断し、分解したクロマトグラフ媒体１０を矢視したときの状態を図１（Ｂ）に示す。クロマトグラフ媒体１０は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３、吸収パッド４及びバッキングシート５を備える。

【0037】

サンプルパッド１は、血液検体が滴下される部材である。サンプルパッド１は、サンプルパッド１に滴下された血液検体が浸透する媒体であれば、任意の媒体で形成される。サンプルパッド１は、コンジュゲートパッド２に接している。

【0038】

検体反応部としてのコンジュゲートパッド２は、検出用ｒＮＰを有する。当該検出用ｒＮＰは、公知の方法によって、例えば金コロイドで標識されている。コンジュゲートパッド２は、サンプルパッド１と接する面の反対側の面でメンブレン３と接している。

【0039】

メンブレン３は、例えば、ニトロセルロースシート等のイムノクロマトグラフ用濾紙である。メンブレン３は、捕捉用ｒＮＰが固定化された捕捉部３１を有する。捕捉用ｒＮＰは、メンブレン３の表面に直線状に塗布することでメンブレン３に固定化される。捕捉部３１は、血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体を捕捉する。

【0040】

メンブレン３に固定化されるｒＮＰの濃度は特に限定されず、例えば、適用する血液検体の希釈倍率に応じて適宜調製される。血液検体として適切な溶媒で１０～５０倍に希釈した被検者の血清を用いる場合、例えば、捕捉部３１に直線状に塗布されるｒＮＰ溶液の濃度は、０．１～１０μｇ／ｃｍ、好ましくは０．５～５μｇ／ｃｍ、より好ましくは１～３μｇ／ｃｍ又は１～１．５μｇ／ｃｍ、特に好ましくは１．２５μｇ／ｃｍである。

【0041】

また、メンブレン３は、検出用ｒＮＰに対する抗体を表面に直線状に塗布し固定したコントロールライン３２を有する。コントロールライン３２に固定化された抗体は、例えば、抗ＮＰウサギＩｇＧ抗体、抗ＮＰヤギＩｇＧ抗体、抗ＮＰウサギＩｇＭ抗体及び抗ＮＰニワトリＩｇＭ抗体等である。当該抗体は、動物に抗原としてのｒＮＰを免疫し、公知の方法で作製できる。

【0042】

メンブレン３に固定化される抗体の濃度は特に限定されず、例えば、適用する血液検体の希釈倍率に応じて適宜調製される。血液検体として１０～５０倍に適切な溶媒で希釈した被検者の血清を用いる場合、例えば、コントロールライン３２に直線状に塗布される抗体の濃度は、０．１～１０μｇ／ｃｍ、好ましくは０．３～５μｇ／ｃｍ、より好ましくは０．５～３μｇ／ｃｍ、特に好ましくは１μｇ／ｃｍである。

【0043】

メンブレン３は、コンジュゲートパッド２と接する面と同じ面で吸収パッド４と接している。吸収パッド４は、サンプルパッド１に滴下された血液検体を吸い上げる。吸収パッド４は、液体を速やかに吸収保持できるものであればよく、例えば、濾紙、綿布、ポリエチレン又はポリプロピレン等からなる不織布等を吸収パッド４に用いることができる。

【0044】

メンブレン３は、コンジュゲートパッド２と接する面の反対側の面でバッキングシート５に貼り付けられている。バッキングシート５は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３、及び吸収パッド４を固定する台紙である。サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３及び吸収パッド４は、上から図１（Ｂ）に示す順番でバッキングシート５の表面に固定される。

【0045】

続いて、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出方法について説明する。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出方法は、第１の反応ステップ、第２の反応ステップ及び検出ステップを含む。第１の反応ステップでは、コンジュゲートパッド２に保持された検出用ｒＮＰを血液検体に暴露する。より詳細には、サンプルパッド１に反応用緩衝液に混合された血液検体が滴下されると、血液検体は毛細管現象によってコンジュゲートパッド２へ浸透する。そして、コンジュゲートパッド２に保持された検出用ｒＮＰと血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体とが抗原抗体反応によって結合して、検出用ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体（検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体複合体）が形成される。検出用ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体は、毛細管現象でメンブレン３を移動する。

【0046】

第２の反応ステップでは、検出用ｒＮＰに結合した抗ＮＰ抗体を、メンブレン３に固定化された捕捉用ｒＮＰに捕捉させる。これにより、検出用ｒＮＰと抗ＮＰ抗体と捕捉用ｒＮＰとの複合体（検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体－捕捉用ｒＮＰ複合体）が形成される。検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体－捕捉用ｒＮＰ複合体は、捕捉部３１のメンブレン３上に直線状に固定された捕捉用ｒＮＰに堰き止められる。第１の反応ステップにおいて、抗ＮＰ抗体と複合体を形成しなかった検出用ｒＮＰは、捕捉部３１で捕捉されずに、コントロールライン３２に達する。コントロールライン３２において、抗ＮＰ抗体と複合体を形成しなかった検出用ｒＮＰは検出用ｒＮＰに対する抗体によって捕捉される。

【0047】

検出ステップでは、捕捉用ｒＮＰに捕捉された血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体を、該抗ＮＰ抗体に結合した検出用ｒＮＰを介して検出する。捕捉部３１には、検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体－捕捉用ｒＮＰ複合体の検出用ｒＮＰが有する金コロイドが濃縮されるため、捕捉部３１が直線状に呈色する。目視で呈色を判定することで、抗ＮＰ抗体を検出できる。

【0048】

以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、イムノクロマトグラフィーを用いることで、さらに簡便かつ迅速に抗ＮＰ抗体を検出できる。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、下記実施例５に示すように、急性期及び回復期のいずれの血清からも高い特異性及び感度で抗ＮＰ抗体を検出できる。

【0049】

なお、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、サンプルパッド１を備えることとしたが、サンプルパッド１を省いた構成でもよい。この場合、コンジュゲートパッド２に血液検体を滴下すればよい。

【0050】

また、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、コンジュゲートパッド２を備えない構成、すなわちハーフストリップの構成をとることもできる。ハーフストリップの構成とする場合、例えば、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、サンプルパッド１、メンブレン３、及び吸収パッド４を備えるクロマトグラフ媒体１０と、試薬として検出用ｒＮＰとを備える。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットを用いたＳＦＴＳＶ抗体検出方法では、まず、検出用ｒＮＰが血液検体に加えられて検体が調製される。当該検体中では、血液検体に含まれていた抗ＮＰ抗体が検出用ｒＮＰと反応し、検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体複合体が形成される。

【0051】

続いて、当該検体がサンプルパッド１に滴下されると、検出用ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体は、毛細管現象でメンブレン３を移動する。そして、検出用ｒＮＰに結合した抗ＮＰ抗体を、メンブレン３に固定化された捕捉用ｒＮＰに捕捉させる。これにより、検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体－捕捉用ｒＮＰ複合体が形成される。検出用ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体－捕捉用ｒＮＰ複合体は、捕捉部３１で上記のように捕捉される。

【0052】

なお、サンプルパッド１から捕捉部３１までの長さは、滴下する血液検体の量及び濃度等によって適宜設定される。また、本実施の形態では、サンプルパッド１に血液検体が滴下されることとしたが、サンプルパッド１を血液検体に浸してもよい。

【0053】

本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、簡便に使用するために、上記ＳＦＴＳＶ抗体検出キットの構成が一体となったカセット型又はカートリッジ型の検出キットであることが好ましい。

【0054】

なお、血液検体から抗ＮＰ抗体が検出されることは被検者のＳＦＴＳＶへの感染あるいは既往を示すため、上記実施の形態１及び実施の形態２に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳＶ検出キットとして使用されてもよい。また、上記実施の形態１及び実施の形態２に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳ診断キットとして使用されてもよい。また、当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、感染急性期におけるベッドサイドでの迅速診断を実現し、発症早期の投与が望ましいとされる上記ＳＦＴＳ治療薬のコンパニオン診断としても有用である。

【実施例】

【0055】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。実施例において臨床検体として、同意の得られた患者４名の血清を用いた。健常人血清にはＮｏｒｍａｌ ｓｅｒｕｍ ６０検体（Ｎｏｅｔｏｎ社製）を用いた。

【0056】

実施例１：抗ＮＰ抗体測定用のＥＬＩＳＡの検討
（ＳＦＴＳＶのＮＰをコードする遺伝子の増幅及び発現ベクターへの組み込み）
ＳＦＴＳＶ株ＳＰＬ０３０Ａの全ｃＤＮＡ（国立感染症研究所より取得、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ８１８０００）を鋳型に用い、ＮＰ遺伝子を増幅した。ＮＰ遺伝子増幅用のプライマー対には、ＮｃｏＩサイトを付加したＮＰ－Ｆ１（配列番号２）及びＥｃｏＲＩサイトを付加したＮＰ－Ｒ１（配列番号３）を用いた。増幅酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標） ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、９８℃で２０秒間変性させた後、９８℃で１０秒間、６０℃で１０秒間及び７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクルの増幅を行った。０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動で、増幅産物がＮＰ遺伝子であることを確認した。

【0057】

得られた増幅産物を制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化した。大腸菌発現ベクターｐＥＴ ６ｘＨＮ－Ｃ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）のマルチクローニングサイトをＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、当該サイトにＮＰ遺伝子をライゲートした。この発現ベクターによって、インサートのＣ末端にＨｉｓ ｔａｇが付加される。

【0058】

（大腸菌への発現プラスミドの導入）
上記のプラスミドＤＮＡを、タンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入した。形質転換した大腸菌にＳＯＣ溶液３５０μＬを添加し、３７℃で３０分間振とう培養した後、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢプレートに播種し、３７℃で一昼夜培養した。得られたコロニーの一部を２５ｍＭ ＮａＯＨ ２０μＬで溶菌し、９８℃で５分間加温後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．０）２０μＬを添加した。ボルテックスで混和後、遠心して得た上清を鋳型として、インサートＤＮＡを増幅するプライマーｐＥＴ－Ｆ１（配列番号４）及びｐＥＴ－Ｒ１（配列番号５）を用いてＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ社製）でインサートＤＮＡを増幅した。インサートＤＮＡの塩基配列はＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてダイレクトシーケンス法で確認した。

【0059】

（組換えタンパク質の発現と精製）
ＮＰ発現ベクターを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地において、３７℃で１６時間、振とう培養した。その培養液３．２ｍＬを新しいアンピシリン添加ＬＢ培地１６０ｍＬに添加し、３７℃で振とう培養した。６００ｎｍの吸光度が０．４～０．５に達した時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに４時間培養して組換えタンパク質の発現を誘導した。培養液を３５００ｒｐｍで２０分間、遠心し、その菌体にＨｉＴＡＬＯＮＴＭ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）のＴｒａｃｔｏｒ Ｂｕｆｆｅｒ １６ｍＬを添加し超音波処理で可溶化を行った。

【0060】

この溶液を４℃で１００００×ｇで２０分間、遠心し、上清を回収した。得られた上清をＨｉｓＴＡＬＯＮＴＭ Ｃｏｌｕｍｎ（タカラバイオ社製）５ｍＬにアプライし、Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液、５ｍＭイミダゾール）２００ｍＬで洗浄後、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ３０ｍＬで溶出し、ｒＮＰを回収した。溶出した組換えＮＰタンパク質（ｒＮＰ）溶液は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ １０Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮した後、ＰＤ－１０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてバッファーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換し、最終的に１ｍｇ／ｍＬのｒＮＰ溶液に調製した。

【0061】

（組換えＮＰタンパク質のペルオキシダーゼ標識）
ｒＮＰのＨＲＰによる標識は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所製）を用いて以下のように行った。３００μｇのｒＮＰにＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、分画分子量１万の限界濾過膜スピンカラム ＮＡＮＯＳＥＰ １０Ｋ ＯＭＥＧＡ（Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）にアプライし８０００×ｇで１０分間遠心し、再度Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、バッファーを交換した。Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬで溶解したＮＨ_２－Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｅｒｘｉｄａｓｅをメンブレン上のｒＮＰに添加し、３７℃で２時間反応させ、ｒＮＰにペルオキシダーゼを結合させた。メンブレンにＷａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ添加し、８０００×ｇで１０分間遠心し、最終的に２００μＬのＳｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒでペルオキシダーゼ標識ｒＮＰを溶出して回収し、４℃で保存した。

【0062】

（ＥＬＩＳＡによる抗ＮＰ抗体の測定）
ＰＢＳでｒＮＰを希釈し、ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートであるＦ９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＮＵＮＣ－ＩＭＭＵＮＯＰＬＡＴＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の１ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１６時間静置し、ｒＮＰを固相化した。固相化後、ＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ブロッキングとして５％スキムミルクを含むＴＢＳＴを２００μＬ添加し、室温（２４～２６℃）で２時間静置した。

【0063】

静置後、ＴＢＳＴでウェルを洗浄後、０．５％スキムミルクを含むＴＢＳＴ（０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴ）で２５倍希釈した血清検体を１００μＬずつウェルに分注し、室温で２時間反応させた。反応後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで２０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ｒＮＰ（ＮＰ－ＨＲＰ）を１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。反応後ＴＢＳＴで３回洗浄し、酵素基質溶液１ Ｓｔｅｐ（商標） ＡＢＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１００μＬ加え、室温で３０分間反応させた。吸光度はＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＦＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、４０５ｎｍ及び４９５ｎｍの２波長で測定し、吸光度の差（４０５ｎｍ－４９５ｎｍ）を求めた。以下では、当該吸光度の差を吸光度とする。

【0064】

ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化するｒＮＰ溶液のｒＮＰの至適濃度を検討した。凍結保存したＳＦＴＳ患者２症例の血清（症例Ｍ２の発症後６３日、及び症例Ｍ４の発症後３５０日）を、０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで１００倍又は５００倍に希釈し、１０ｎｇ／ｍＬから段階希釈したｒＮＰ溶液を固相化した上記ＥＬＩＳＡで抗ＮＰ抗体を測定した。コントロールとして１０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。

【0065】

（結果）
図２及び図３は、それぞれ症例Ｍ２及び症例Ｍ４について、ｒＮＰ溶液の濃度に対する吸光度を示す。血清の希釈倍率に関わらず、ｒＮＰの濃度が２．５μｇ／ｍＬまで、ｒＮＰの濃度依存的な吸光度の増大が確認された。

【0066】

実施例２：ＥＬＩＳＡによる抗ＮＰ抗体の測定
（カットオフ指標の設定）
健常人血清６０検体を０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで２５倍希釈し、上記ＥＬＩＳＡで抗ＮＰ抗体を測定した。得られた吸光度の平均＋６×標準偏差をカットオフ値とした。なお、固相化したｒＮＰ溶液におけるｒＮＰの濃度は３ｎｇ／ｍＬとした。

【0067】

（患者血清の抗ＮＰ抗体測定）
凍結保存したＳＦＴＳ患者３症例の血清（症例Ｍ１の発症後４、６、８、１０、３７５日、症例Ｍ２の発症後６、９、１１、１８、３２、６３、６２２日、症例Ｍ６の発症後７、１１、１３、２３、５７、１２６日）を０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで２５倍希釈し、上記ＥＬＩＳＡで抗ＮＰ抗体を測定した。なお、固相化したｒＮＰ溶液のｒＮＰの濃度は３ｎｇ／ｍＬとした。

【0068】

（結果）
健常人６０名の血清の吸光度の分布を図４に示す。カットオフ値は０．０４１と算出された（０．００５＋６×０．００５＝０．０４１）。

【0069】

図５（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ症例Ｍ１、症例Ｍ２及び症例Ｍ６のＳＦＴＳ患者の血清から得られた、カットオフ値に対する吸光度の比（Ｃｕｔ ｏｆｆ ｉｎｄｅｘ；ＣＯＩ）を示す。図５において、カットオフ値が矢印で示されている。症例Ｍ１、Ｍ２及びＭ６について、それぞれ発症後４日、６日及び７日目の血清における抗ＮＰ抗体を検出できることが示された。

【0070】

実施例３：ＥＬＩＳＡによる抗ＮＰ抗体測定の特異性確認
０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで２５倍希釈した症例Ｍ１（発症後４日）、症例Ｍ２（発症後６日）、症例Ｍ６（発症後７日）の血清にｒＮＰを０、１、３、１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し室温（２５℃）で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡの検体として測定した。また、２５倍希釈した患者血清にＭｏｃｋ細胞ライセート又はＳＦＴＳＶ感染細胞ライセートをそれぞれ１／３０量加えて室温（２５℃）で１時間反応させた検体もＥＬＩＳＡで測定した。

【0071】

上記のＳＦＴＳＶ感染細胞ライセートは次のように調製した。Ｈｕｈ７細胞（８×１０^６個）にＳＦＴＳＶ（ＭＯＩ＝０．０５）を感染させ３日培養後、ＰＢＳで３回洗浄した。当該細胞に１ｍＬの１％ＮＰ４０／ＰＢＳを加え室温で１５分静置し、細胞溶液を回収した。その溶液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を分離した。得られた上清にトランスイルミネータで紫外線を１５分間照射しウイルスを不活化し、ＳＦＴＳＶ感染細胞ライセートとして用いた。また、ＳＦＴＳＶを感染させずに同様の操作を行った細胞上清をＭｏｃｋ細胞ライセートとして用いた。

【0072】

ウサギ（２羽）を次のように免疫してウサギ抗ＮＰ血清を得た。ウサギ１羽当たり初回が０．４ｍｇ、２～５回目は０．２ｍｇのｒＮＰをアジュバント・コンプリート（Ｄｉｆｃｏ社製）と等量混合して２週間の間隔でウサギに感作した。最終免疫の２週間後に採血し、ウサギ抗ＮＰ血清を得た。

【0073】

０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで５０００倍希釈したウサギ抗ＮＰ血清に、１０μｇ／ｍＬの濃度でｒＮＰ、Ｍｏｃｋ細胞ライセートを１／３０量及びＳＦＴＳＶ感染細胞ライセートを１／３０量それぞれ添加した検体を得た。これら検体に加え、無添加のウサギ抗ＮＰ血清を検体としてＥＬＩＳＡで測定した。陰性コントロール（ＮＣ）には免疫前のウサギ血清を０．５％ＳＭ／ＴＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を検体として用いた。

【0074】

（結果）
図６（Ａ）～（Ｃ）は、それぞれ症例Ｍ１、症例Ｍ２及び症例Ｍ６の血清に関する結果を示す。いずれもｒＮＰの濃度依存的に吸光度が減少し、終濃度１０μｇ／ｍＬ ｒＮＰで吸光度がほぼ０となった。また、ＳＦＴＳＶ感染細胞ライセート（感染細胞）でも吸光度が低下し、非感染細胞のＭｏｃｋ細胞ライセートではｒＮＰを添加しなかった検体と比較して吸光度が低下しなかったことから、上記ＥＬＩＳＡは特異的に抗ＮＰ抗体を測定していることが示された。図６（Ｄ）に示すように、コントロールとしてｒＮＰを免疫源として感作して得られたウサギ抗ＮＰ血清でも同様の結果が得られた。

【0075】

実施例４：イムノクロマトグラフィーの作製及び測定
（ＮＰ抗原感作金コロイドの作製）
上記のｒＮＰ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、１００μｇ／ｍＬに調製した。１０ｍＬ梨型沈殿管に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加した。当該沈殿管に金コロイド（４０ｎｍ、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製、ＥＭＧＣ４０）液を９００μＬ添加し、軽く撹拌した。当該沈殿管に１００μｇ／ｍＬに調製したｒＮＰ溶液を撹拌しながら添加し、室温で１０分静置した。当該沈殿管に１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、和光工業社製、１６９－２１１０５）を５５μＬ添加し、軽く撹拌した。さらに、当該沈殿管に１０％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製、ＡＡ３０５０－５０Ｇ）を１１０μＬ添加し、軽く撹拌した。

【0076】

上清を１００μＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を、超音波洗浄機を用いて分散させた。当該沈殿管に金コロイド保存バッファー（１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム、０．０５％ＰＥＧ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．２）を２ｍＬ添加した。８０００×ｇ、４℃で１５分間、遠心し、上清を１００μＬ程度残して取り除き、超音波洗浄機を用いて残した上清に沈殿を分散させた。上記の金コロイド保存バッファーの添加から沈殿の分散までを再度繰り返した。分散させた感作金コロイド液を１６μＬ分取し、金コロイド保存バッファーを３８４μＬ加え、Ｏ．Ｄ５２０を測定した。測定値から換算し、金コロイド保存バッファーでＯ．Ｄ５２０＝６．０に調整し、そのまま冷蔵で保存した。

【0077】

（抗体及び抗原を固相化したメンブレンの作製）
上記のウサギ抗ＮＰ血清１０ｍＬにＰＢＳ１０ｍＬを加え、硫酸ナトリウム３．６ｇを添加し４℃で１時間静置した後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心した。沈殿を１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で溶解し、同じリン酸緩衝液で平衡化したＰＤ１０（ＧＥヘルスケア社製）カラムに添加し、同じリン酸緩衝液３．５ｍＬで溶出しバッファーを交換した。この溶液を１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で平衡化したＤＥ－５２（ワットマン社製）カラムに添加し、同じ緩衝液で溶出した。２８０ｎｍに吸収が認められた溶出分画をＩｇＧ分画として得た。さらに、このＩｇＧ分画をＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）にｒＮＰ１．４ｍｇを結合させて作成した抗原カラムにアプライし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出した。２８０ｎｍで吸収の認められた溶出分画をプールし、ＰＢＳで平衡化したＰＤ－１０カラムでバッファーを交換し、アフィニティ精製ウサギ抗ＮＰ ＩｇＧとして用いた。

【0078】

コントロールライン用として、アフィニティ精製ウサギ抗ＮＰ ＩｇＧ（ウサギ抗ＮＰ抗体）を最終液量が４０μＬになるようＵｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＵＦＣ５１００９６）を使用し、５ｍＭリン酸緩衝液に置換し、１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。９６ウェル等にウサギ抗ＮＰ抗体溶液を１５μＬ、テストライン用のｒＮＰ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１８．７μＬそれぞれ入れ、ウサギ抗ＮＰ抗体溶液に筆を浸し、全量をメンブレン（ニトロセルロースメンブレン、ｍｄｉ社製、９０ＣＮＰＨ－Ｎ－ＳＳ４０、２５ｍｍ×１５０ｍｍ）の下端から１３ｍｍに水平方向に直線状に塗布した（１μＬ／ｃｍ）。ｒＮＰ溶液に筆を浸し、全量をメンブレンの下端から８ｍｍに水平方向に直線状に塗布した（１．２５μＬ／ｃｍ）。メンブレンを３７℃で１時間乾燥させた。

【0079】

メンブレンの下端をブロッキング液（０．２５％ＢＳＡ及び２５ｍＭホウ酸、ｐＨ７．５）に浸し、ブロッキング液が上端まで吸いあげられた後、メンブレン全体をブロッキング液中に浸し、室温で３０分間静置した。液切りした後、メンブレンを洗浄・安定化液（０．５％スクロース、０．０５％コール酸ナトリウム及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）に移し、室温３０分間、軽く振とうした。液切りした後、ペーパータオル上に置き、デシケータで一昼夜以上乾燥させた。乾燥剤を入れた袋で、メンブレンを冷蔵保存した。

【0080】

（イムノクロマトストリップの組み立て）
上記の抗体及び抗原を固相化したメンブレン（固相化メンブレン）を、コントロールライン側が上、テストラインが下になるようにバッキングシート（ニップエンジニアリング社製、３４０４２／９１０７）の下端から２０ｍｍの位置に貼り付けた。サンプル吸収パッド（２０ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＣＦＳＰ２２３０００）を、固相化メンブレンとサンプル吸収パッドが５ｍｍ重なるようにして、バッキングシートの上端に合わせて貼り付けた。サンプルパッド（２１．５ｍｍ×１５０ｍｍ、ＡＢＳＯＲＢＥＮＴ ＴＹＰＥ １１１、ポール社製、ＢＳＰ１１１ＰＫ）を、固相化メンブレンとサンプルパッドが２ｍｍ重なるようにして、バッキングシートの下端に合わせて貼り付けた。乾燥剤を入れた袋で、冷蔵保存した。使用時に５ｍｍ幅にカットし、イムノクロマトストリップとした。

【0081】

（健常人血清を用いたウサギ抗ＮＰ抗体検出試験）
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００及びＢＳＡを混合し、反応用緩衝液を調製した。ウサギ抗ＮＰ抗体溶液を、健常人血清を用いて２０００、１０００、５００、２５０、１００、５０及び１０ｎｇ／ｍＬに調整し、試料とした。試料と反応用緩衝液とを９：１（試料：反応用緩衝液）で混合し、検体とした。また、ＮＣとして健常人血清と反応用緩衝液とを混合した検体も調製した。

【0082】

各試料９３μＬと、超音波洗浄機を用いて分散させたＮＰ抗原感作金コロイド溶液７μＬをウェル内で混合した。試料の入ったウェルにストリップを挿入した。１５分後、ラインの有無を確認した。

【0083】

（結果）
図７に示すように、イムノクロマトグラフィーによって、ウサギ抗ＮＰ抗体の濃度として５０ｎｇ／ｍＬまで検出できた。また、ウサギ抗ＮＰ抗体を含まない健常人血清で非特異反応が出ないことを確認した。

【0084】

実施例５：イムノクロマトグラフィーによる抗ＮＰ抗体の検出
上記実施例４で作製したイムノクロマトストリップを用いて、ＳＦＴＳ患者の血清検体に関する抗ＮＰ抗体の検出を以下のように検討した。凍結保存したＳＦＴＳ患者５症例の血清（症例Ｍ１の発症後４日及び３７５日、症例Ｍ２の発症後６３日、症例Ｍ３の発症後４３０日、症例Ｍ４の発症後７日及び３５０日、症例Ｍ６の発症後７日及び５７日）４μＬに反応用緩衝液８９μＬ及びＮＰ抗原感作金コロイド溶液７μＬを加えた。

【0085】

なお、ＮＣとして健常人血清と反応用緩衝液とを混合した検体を調製した。陽性コントロール（ＰＣ）として、ウサギ抗ＮＰ抗体溶液（終濃度１μｇ／ｍＬ）を調製した。

【0086】

得られた反応溶液全量をマイクロタイタープレートのウェルに移し、イムノクロマトストリップのサンプルパッドを反応溶液のウェルに挿入し室温で１５分間反応させた。判定はコントールラインに金コロイドのバンドが形成されたのを確認して、テストラインに金コロイドのラインが形成されたものを陽性と判定した。

【0087】

（結果）
図８に回復期血清（症例Ｍ１の発症後３７５日、症例Ｍ２の発症後６３日、症例Ｍ３の発症後４３０日、症例Ｍ４の発症後３５０日、症例Ｍ６の発症後５７日）に関する結果を示す。いずれの検体についてもテストラインに金コロイドのラインが確認され、陽性と判定された。

【0088】

図９に急性期血清（症例Ｍ１の発症後４日、症例Ｍ６の発症後７日）に関する結果を示す。回復期血清と同様に、いずれの検体についてもテストラインに金コロイドのラインが確認され、陽性と判定された。

【0089】

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【産業上の利用可能性】

【0090】

本発明は、ＳＦＴＳＶ抗体の検出及びＳＦＴＳの診断に好適である。

【符号の説明】

【0091】

１ サンプルパッド
２ コンジュゲートパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ バッキングシート
１０ クロマトグラフ媒体
３１ 捕捉部
３２ コントロールライン

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

0007144039000001.app