(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-21
(45)【発行日】2022-09-30
(54)【発明の名称】血液試料中の循環腫瘍細胞のデジタル分析
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20220922BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20220922BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220922BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12N15/10 114Z
G01N33/574 D
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2017549623
(86)(22)【出願日】2016-03-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-05-31
(86)【国際出願番号】 US2016024367
(87)【国際公開番号】W WO2016154600
(87)【国際公開日】2016-09-29
【審査請求日】2019-03-25
【審判番号】
【審判請求日】2021-01-28
(31)【優先権主張番号】62/137,891
(32)【優先日】2015-03-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/219,339
(32)【優先日】2015-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/253,619
(32)【優先日】2015-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハーバー，ダニエル・エィ
(72)【発明者】
【氏名】カプール，ラビ
(72)【発明者】
【氏名】トナー，メフメット
(72)【発明者】
【氏名】マヘスワラン，シャマラ
(72)【発明者】
【氏名】ホン，シン
(72)【発明者】
【氏名】ミヤモト，デイビッド・トモアキ
(72)【発明者】
【氏名】トドロバ，ターニャ
(72)【発明者】
【氏名】ジャベイド，サラ
【合議体】
【審判長】福井 悟
【審判官】吉森 晃
【審判官】高堀 栄二
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５３２４０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．， ２０１３， Ｖｏｌ． ５， Ｎｏ． １７９， １７９ｒａ４７
【文献】Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ２０１２， Ｖｏｌ． １８， Ｎｏ． ７， ｐｐ． ４０５－４１６
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２００５， Ｖｏｌ． ６５， Ｎｏ． １２， ｐｐ． ４９９３－４９９７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N
C12Q
G01N
ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ），ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体において極めて高い感度および特異性を有する、癌の検出方法であって、前記被験体の血液試料から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離することと、
ＣＴＣ由来のＲＮＡをｃＤＮＡに変換することと、
前記ｃＤＮＡを個々の液滴中にカプセル化することと、
ＣＴＣの供給源である特定のタイプの癌からの腫瘍系統に特異的なＲＮＡに対応するｃＤＮＡには特異的に結合するが血中の正常な細胞に由来するｃＤＮＡには結合しないように構成されたレポーター基の存在下、各液滴内で前記ｃＤＮＡ分子を増幅させることと、 レポーター基に陽性である液滴の総数を決定して、被験体における癌の存在を指し示すＣＴＣの存在を判定することと
を含み、
ここで、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることが、各液滴の中でＰＣＲを行うことを含み、
各タイプの癌について少なくとも５つのプライマーの組を液滴内で前記ｃＤＮＡ分子を増幅させるために用い、および前記少なくとも５つのプライマーの組の各プライマーの組は、選択された癌遺伝子に対応し、
前記選択された癌遺伝子は、前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌およびメラノーマのうちの１以上に対して選択的な遺伝子を含み、
前記前立腺癌選択的遺伝子は、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＤＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５、ＡＭＡＣＲ、ＡＲ変異形、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、前立腺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組の各プライマーの組は、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＯＬＨ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＨＯＸＤＢ１３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＫＬＫ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＫＬＫ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、
ＡＭＡＣＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記乳癌選択的遺伝子は、ＰＧＲ、ＰＩＰ、ＦＡＴ２、ＴＭＰＲＳＳ４、ＡＧＲ２、ＦＡＴ１、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥ、およびＳＣＧＢ２Ａ１のうちの５つ以上を含み、乳癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＧＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、
ＰＩＰ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）、
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、および
ＳＣＧＢ２Ａ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
からなる群から選択され、
前記肺癌選択的遺伝子は、ＳＦＲＰ２、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ４、ＦＯＸＦ１、ＡＲＧ２、およびＦＡＴ２のうちの５つ以上を含み、肺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＳＦＲＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＦＯＸＦ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
からなる群から選択され、
前記膵臓癌選択的遺伝子は、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤＨ１１、ＥＧＦＲ、ＦＡＴ１、ＭＥＴ、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３、Ｓ１００Ａ２、およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、膵臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＬＤＨ１Ａ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＣＤＨ１１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
ＥＧＦＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＭＥＴ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
Ｓ１００Ａ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記肝臓癌選択的遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＰＯＨ、ＦＧＢ、およびＦＧＧのうちの５つ以上を含み、肝臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＨＳＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、
ＡＬＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、
ＡＰＯＨ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、
ＦＧＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）、および
ＦＧＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）
からなる群から選択され、および
前記メラノーマ選択的遺伝子は、ＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、およびＳＯＸ１０のうちの５つ以上を含み、メラノーマ選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＭＥＬ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）、
ＭＬＡＮＡ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＭＡＧＥＡ６ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、および
ＳＯＸ１０ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）
からなる群から選択される、方法。
【請求項2】
血液試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分析する方法であって、前記血液試料から、血中に存在するＣＴＣを単離することと、
前記ＣＴＣからリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離することと、
溶液中で単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることと、
ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中にカプセル化することと、
ＣＴＣの供給源である特定のタイプの組織からの腫瘍系統に特異的なＲＮＡに対応するｃＤＮＡには特異的に結合するが血中の正常な細胞に由来するｃＤＮＡには結合しないように構成された１つ以上のレポーター基の存在下、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることと、
前記レポーター基を含有する液滴を液滴中のＣＴＣ由来の増幅ｃＤＮＡ分子の存在の指標として検出することと、および
検出された液滴中のＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子を分析することと
を含み、
ここで、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることが、各液滴の中でＰＣＲを行うことを含み、
各タイプの癌について少なくとも５つのプライマーの組を各液滴内で前記ｃＤＮＡ分子を増幅させるために用い、および前記少なくとも５つのプライマーの組の各プライマーの組は、選択された癌遺伝子に対応し、
前記選択された癌遺伝子は、前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌およびメラノーマのうちの１以上に対して選択的な遺伝子を含み、
前記前立腺癌選択的遺伝子は、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＤＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５、ＡＭＡＣＲ、ＡＲ変異形、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、前立腺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも１つのプライマーの組は、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＯＬＨ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＨＯＸＤＢ１３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＫＬＫ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＫＬＫ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、
ＡＭＡＣＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記乳癌選択的遺伝子は、ＰＧＲ、ＰＩＰ、ＦＡＴ２、ＴＭＰＲＳＳ４、ＡＧＲ２、ＦＡＴ１、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥ、およびＳＣＧＢ２Ａ１のうちの５つ以上を含み、乳癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＧＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、
ＰＩＰ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）、
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、および
ＳＣＧＢ２Ａ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
からなる群から選択され、
前記肺癌選択的遺伝子は、ＳＦＲＰ２、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ４、ＦＯＸＦ１、ＡＲＧ２、およびＦＡＴ２のうちの５つ以上を含み、肺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＳＦＲＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＦＯＸＦ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
からなる群から選択され、
前記膵臓癌選択的遺伝子は、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤＨ１１、ＥＧＦＲ、ＦＡＴ１、ＭＥＴ、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３、Ｓ１００Ａ２、およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、膵臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＬＤＨ１Ａ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＣＤＨ１１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
ＥＧＦＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＭＥＴ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
Ｓ１００Ａ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記肝臓癌選択的遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＰＯＨ、ＦＧＢ、およびＦＧＧのうちの５つ以上を含み、肝臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＨＳＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、
ＡＬＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、
ＡＰＯＨ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、
ＦＧＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）、および
ＦＧＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）
からなる群から選択され、および
前記メラノーマ選択的遺伝子は、ＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、およびＳＯＸ１０のうちの５つ以上を含み、メラノーマ選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＭＥＬ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）、
ＭＬＡＮＡ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＭＡＧＥＡ６ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、および
ＳＯＸ１０ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）
からなる群から選択される、方法。
【請求項3】
ＲＮＡを単離する前に前記血液試料の体積を減らすことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｃＤＮＡ分子をカプセル化する前にｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることが、前記単離ＲＮＡ分子の逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
個々のｃＤＮＡ分子をカプセル化することがさらに、ｃＤＮＡ分子と共にＰＣＲ試薬を個々の液滴中にカプセル化することと、非水性液体の少なくとも１０００個の液滴を形成することとを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記レポーター基が蛍光標識を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することが、固相可逆固定法（ＳＰＲＩ）の使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
前記ＳＰＲＩが、前記溶液中のｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡに特異的に結合するように構成された磁気ビーズで固定することと、
前記溶液から混入物を除去することと、
精製ｃＤＮＡを溶出させることと
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記非水性液体が、１つ以上のフッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項11】
前記選択された癌遺伝子が、異なる２つ以上、３つ以上、または４つ以上のタイプの癌に対して選択的な遺伝子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項12】
前記遺伝子が、乳癌および肺癌；乳癌、肺癌および肝臓癌；乳癌、肺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌および前立腺癌；乳癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および前立腺癌；乳癌、肺癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、前立腺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマおよび膵臓癌；または、乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌および前立腺癌に対して選択的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
検出された液滴中の前記ＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子を分析することが、既知の癌を有する患者から経時的に採取された血液試料からのＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子をモニタリングすることと、前記ＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子に対する試験、画像化、または試験と画像化との両方を行って前記患者の予後予測を提供することとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項14】
検出された液滴中の前記ＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子を分析することが、患者の血液試料からの前記ＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子の試験、画像化、または試験と画像化とを行って治療介入に対する前記ＣＴＣの応答の指標を提供することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項15】
検出された液滴中の前記ＣＴＣ由来のｃＤＮＡ分子のを分析することが、患者の血液試料の単位体積当たりのＣＴＣの数または濃度を決定して、前記患者における腫瘍負荷の度合いを提供することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項16】
前記患者における腫瘍負荷の前記度合いを用いて療法を選択することをさらに含み、第２時点において前記患者における腫瘍負荷の前記度合いを決定して経時的な前記腫瘍負荷をモニタリングすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
血液試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）から得られたｃＤＮＡ分子を増幅および検出するための、癌選択的遺伝子に特異的なプローブおよびプライマーの使用であって、ここで、少なくとも５つのプローブおよびプライマーの組を前記ｃＤＮＡ分子を増幅させるために用い、および前記少なくとも５つのプライマーの組の各プライマーの組は、選択された癌遺伝子に対応し、前記選択された癌遺伝子は、前立腺癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌およびメラノーマのうちの１以上に対して選択的な遺伝子を含み、
前記前立腺癌選択的遺伝子は、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＤＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５、ＡＭＡＣＲ、ＡＲ変異形、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、前立腺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＯＬＨ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、
ＨＯＸＤＢ１３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＫＬＫ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＫＬＫ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）、
ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）、
ＡＭＡＣＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント ７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、
ＡＲ バリアント １２／ＳＥＴ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、
ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記乳癌選択的遺伝子は、ＰＧＲ、ＰＩＰ、ＦＡＴ２、ＴＭＰＲＳＳ４、ＡＧＲ２、ＦＡＴ１、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥ、およびＳＣＧＢ２Ａ１のうちの５つ以上を含み、乳癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＧＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）、
ＰＩＰ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３）、
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、
ＡＲ バリアント７／ＳＥＴ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、および
ＳＣＧＢ２Ａ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）
からなる群から選択され、
前記肺癌選択的遺伝子は、ＳＦＲＰ２、ＦＡＴ１、ＴＭＰＲＳＳ４、ＦＯＸＦ１、ＡＲＧ２、およびＦＡＴ２のうちの５つ以上を含み、肺癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＳＦＲＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＴＭＰＲＳＳ４ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２）、
ＦＯＸＦ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８）、
ＡＧＲ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および
ＦＡＴ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
からなる群から選択され、
前記膵臓癌選択的遺伝子は、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤＨ１１、ＥＧＦＲ、ＦＡＴ１、ＭＥＴ、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３、Ｓ１００Ａ２、およびＳＴＥＡＰ２のうちの５つ以上を含み、膵臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＬＤＨ１Ａ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＣＤＨ１１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
ＥＧＦＲ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）、
ＦＡＴ１ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）、
ＭＥＴ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）、
ＰＫＰ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）、
ＲＮＤ３ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、
Ｓ１００Ａ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、および
ＳＴＥＡＰ２ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４）
からなる群から選択され、
前記肝臓癌選択的遺伝子は、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＰＯＨ、ＦＧＢ、およびＦＧＧのうちの５つ以上を含み、肝臓癌選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＡＨＳＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１）、
ＡＬＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）、
ＡＰＯＨ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、
ＦＧＢ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）、および
ＦＧＧ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）
からなる群から選択され、および
前記メラノーマ選択的遺伝子は、ＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、およびＳＯＸ１０のうちの５つ以上を含み、メラノーマ選択的遺伝子に対応する前記少なくとも５つのプライマーの組は、
ＰＭＥＬ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）、
ＭＬＡＮＡ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＭＡＧＥＡ６ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、
ＰＲＡＭＥ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）、
ＴＦＡＰ２Ｃ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）、および
ＳＯＸ１０ （プライマー１ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９， プライマー２ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）
からなる群から選択される、使用。
【請求項18】
既知の癌を有する患者から経時的に得られた多数の血液試料において、増幅させたＣＴＣを分析し、前記ＣＴＣの試験、画像化、または試験と画像化との両方を行って前記患者に予後予測を提供する、請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
増幅させたＣＴＣを分析して、治療介入に対する前記ＣＴＣの応答の指標を提供する、請求項１７に記載の使用。
【請求項20】
増幅させたＣＴＣを分析して、前記血液試料の取得がなされた患者における腫瘍負荷の度合いを提供する、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液サンプリング技法に関し、より詳しくは、血液試料中の細胞の検出および分析のための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
単純な血液試験または「液体生検」を用いて希少な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の存在を検出する能力は、上皮癌のモニタリングを大いに向上させる潜在性を有し、侵襲的な腫瘍生検を必要とせずに腫瘍細胞数、遺伝子組成および薬物応答パラメータの瞬時サンプリングを提供する。したがって、早期癌検出のためのＣＴＣの検出は、癌の処置に革命を起こす潜在性を有し、治療処置を期待できる場合にはそれが転移する前の段階で浸潤癌を診断することを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかし、ＣＴＣは非常に希少であり、正常な血液成分と混ざり合ったこれらの腫瘍細胞を同定、可視化および採点することは、既知のマイクロ流体装置または同様の技術を用いて部分的に精製した後でさえ、著しい難題であり続けている。例えば、全血１ミリリットル当たり、５０億個超の赤血球（ＲＢＣ）および５００万個超の白血球（ＷＢＣ）の中にＣＴＣは１～１０個しか存在しない（Ｐｌａｋｓら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１：１１８６；２０１３）。その上、癌細胞の中での異種性が患者個人においてさえ高いことおよび、血流中を循環する多くの腫瘍細胞が物理的に弱い状態にあり、それらの多くがプログラム細胞死またはアノイキスを始めていることゆえに、腫瘍細胞の抗体染色は変動性が高い。さらに、抗体染色された腫瘍細胞の正確な採点は、抗体試薬に非特異的に結合するものがいくつかあり大量に混入している白血球と区別することを必要とする。そういったことから、抗体染色では候補となる腫瘍細胞のサブセットしか堅牢に同定することができず、試験された患者の半数もが、広く転移した癌を有するにも拘らず検出可能な細胞を有さない。
【0004】
それゆえ、ＣＴＣを画像化する現在のプロトコルは、ＣＴＣを特に他の有核血球、例えば白血球（ＷＢＣ）などから単離するときによりいっそう高いレベルの純度を必要としている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、ＣＴＣの極めて高いレベルの純度の必要性を回避しながら標準的な血液試料中の希少なＣＴＣに関する可能な最高感度のデータを得るための方法、用途およびシステムに関する。特に、当該新規方法は、混入しているＷＢＣからＣＴＣを完全に隔離する必要がなく、その代わりに、例えば多くて１０，０００個以上のＷＢＣを含有する産物中のたった１個のＣＴＣを確実に検出することができる。新規検査方法およびシステムは、血液から、（１）ＣＴＣを（質の高いリボ核酸（ＲＮＡ）を有する）無傷な全細胞として堅実に得ることのできる単離システムと、（２）健常な患者の血液中には存在しない各腫瘍タイプに特異的な癌系統のリボ核酸ＲＮＡマーカーに的を絞った、液滴に基づくデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査とを組み合わせる。
【0006】
本明細書において記載されるとおりに組み合わせた場合、これらの２つの概念は、ＣＴＣデジタル液滴ＰＣＲ検査法（「ＣＴＣ ｄｄＰＣＲ」）、または簡単に書けば「デジタルＣＴＣ」検査（「ｄ－ＣＴＣ」）を提供する。いくつかの実施形態において、単離システムは、マイクロ流体システム、例えば、負枯渇マイクロ流体システム（例えば、赤血球（ＲＢＣ）、ＷＢＣおよび血小板などの造血細胞の負枯渇を用いて血液試料中のＣＴＣなどの無標識の非造血細胞を露顕させるいわゆる「ＣＴＣチップ」）である。
【0007】
総じて本発明は、極めて高い感度および特異性で癌を早期検出する方法であって、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のマイクロ流体単離およびＣＴＣ由来ＲＮＡのデジタル検出を用いることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣ由来ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、ＣＴＣ由来のｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下で増幅させるための個々の液滴中にカプセル化することができる。レポーター基について陽性である液滴の数を数えて、疾患、例えば、様々なタイプの癌の存在を評価することができる。
【0008】
別の態様において、本発明は、血液試料中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分析する方法に関する。方法は、血液試料から、血中に存在するＣＴＣおよび他の細胞を含む産物を単離すること；産物からリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離すること；溶液中で単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させること；ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中にカプセル化すること；ＣＴＣ由来ｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞由来ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させること；液滴中のＣＴＣ由来ｃＤＮＡ分子の存在の指標としてレポーター基を含有する液滴を検出すること；および検出された液滴中のＣＴＣを分析することを含むかまたはそれらから構成される。
【0009】
本明細書に記載の方法はさらに、ＲＮＡを単離する前に産物の体積を減らすこと、および／またはｃＤＮＡ分子をカプセル化する前にｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去することを含むことができる。
【0010】
新規方法の様々な具現化において、単離ＲＮＡからｃＤＮＡ分子を生成させることは、単離ＲＮＡ分子の逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことを含むことができ、および／または各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させることは、各液滴の中でＰＣＲを行うことを含むことができる。新規方法において、個々のｃＤＮＡ分子およびＰＣＲ試薬を個々の液滴中にカプセル化することは、非水性液体、例えば１以上のフッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油、ならびに／または１以上の界面活性剤の少なくとも１０００個の液滴を形成することを含むことができる。各液滴は、ＣＴＣから得られた標的ｃＤＮＡ分子を概して１つ含有することができる。いくつかの実施形態において、レポーター基は蛍光標識であるかまたはそれを含むことができる。
【0011】
新規方法は、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）を用いることによってｃＤＮＡ含有溶液から混入物を除去すること、例えば、溶液中のｃＤＮＡを例えばｃＤＮＡに特異的に結合するように構成された磁気ビーズで固定すること；溶液から混入物を除去すること；および精製ｃＤＮＡを溶離させることを含むことができる。
【0012】
様々な具現化において、本明細書に記載の方法は、本明細書中の表１中の癌選択的遺伝子の一覧から選択される１以上の遺伝子に対応するプローブおよびプライマーを、各液滴内でｃＤＮＡ分子を増幅させる際に使用することを含む。例えば、選択された遺伝子は、前立腺癌選択的遺伝子、例えば、（表１から容易に決定できるように）ＡＧＲ２、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＤＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ４、ＳＣＨＬＡＰ１／ＳＥＴ５、ＡＭＡＣＲ、ＡＲ変異形、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ１、ＵＧＴ２Ｂ１５／ＳＥＴ５およびＳＴＥＡＰ２のうちの任意の１つ以上を含むことができる。別の例では、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＤＨ１１、ＥＧＦＲ、ＦＡＴ１、ＭＥＴ、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３、Ｓ１００Ａ２およびＳＴＥＡＰ２は膵臓癌に対して選択的である。表１に列挙するその他のタイプの癌について同様の一覧を生成することができる。
【0013】
他の例では、選択された遺伝子は、表１に列挙する乳癌選択的遺伝子のうちの任意の１つ以上を含む。他の例では、選択された遺伝子は、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌およびメラノーマ癌のうちの１以上に対して選択的な遺伝子を含む。例えば、多重検査は、特定のタイプの癌、例えば、乳癌、肺癌前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌およびメラノーマに対して選択的であるとして表１中に列挙された選択された遺伝子のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、または全てを含むことができる。典型的には、表１からの５～１２個の癌選択的遺伝子に対するプライマーおよびプローブの群を特定のタイプの癌に対して使用する。選択された遺伝子のその他の固有の組み合わせ（それらの遺伝子に対するマーカー）を以下の実施例において記載する。
【0014】
方法はまた、異なる２以上、３以上、４以上または５以上のタイプの癌に対して選択的な１以上の遺伝子を使用することを含むことができる。例えば、遺伝子は、乳癌および肺癌；乳癌、肺癌および肝臓癌；乳癌、肺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌および前立腺癌；乳癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および前立腺癌；乳癌、肺癌、肝臓癌およびメラノーマ；乳癌、肺癌、肝臓癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、前立腺癌および膵臓癌；乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマおよび膵臓癌；または、乳癌、肺癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌および前立腺癌に対して選択的であることができる。
【0015】
本明細書に記載の方法において、ＣＴＣは、転移癌または原発性／限局性の癌から生じるものであることができる。新規方法において、検出された液滴中のＣＴＣを分析するステップは、例えば既知の癌を有する患者の血液試料からのＣＴＣを例えば経時的にモニタリングすることと、ＣＴＣを（例えば標準的技法を用いて）試験および／または画像化して患者の予後予測を提供することとを含むことができる。他の実施形態では、検出された液滴中のＣＴＣを分析するステップは、患者の血液試料からのＣＴＣを（例えば標準的技法を用いて）試験および／または画像化して治療介入へのＣＴＣの応答の指標を提供することを含むことができる。
【0016】
他の実施形態において、検出液滴中のＣＴＣを分析するステップは、患者の血液試料の単位体積当たりのＣＴＣの数または濃度を決定して、患者における腫瘍負荷の度合いを提供することを含む。方法はその後にさらに、患者における腫瘍負荷の度合いを用いて療法を選択することを含むことができ、または第２時点において患者における腫瘍負荷の度合いを決定して、腫瘍負荷を経時的に、例えば治療介入に応じて、例えば腫瘍負荷の動的モニタリングのためにモニタリングすることをさらに含むことができる。
【0017】
本明細書に記載の方法および検査は、多様な診断方法、予後予測方法およびセラノスティクス方法においてＣＴＣを増幅させかつ検出するために用いることができる。
【0018】
本明細書中で使用する場合、語句「循環腫瘍細胞」（ＣＴＣ）は、患者の血流内に非常に希少な数（例えば、全血中で約１０，０００，０００個のＷＢＣの中に約１個のＣＴＣ）で存在する固形腫瘍（非血行性の癌）に由来する癌細胞を指す。ＣＴＣは、転移癌および原発性／限局性の癌のどちらから生じるものでもあることができる。
【0019】
本明細書中で使用する場合、「産物」は、例えば本明細書に記載のシステムを使用して本明細書に記載の方法で処理することから生じる、例えば何らかの液体、例えば緩衝液、例えばプルロニック緩衝液の中の単離された希少細胞およびその他の混入している血球、例えば赤血球、白血球〔例えば白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）〕の群を意味する。典型的な産物は、５００～２，５００個以上のＷＢＣと混ざり合ったほんの約１～１０個のＣＴＣ、例えば、１０００～２０００個のＷＢＣと混ざり合った１～１０個のＣＴＣを含有し得る。しかしながら、本発明の方法の検出限界は、１０，０００個のＷＢＣ中で約１個のＣＴＣであることができる。このように、本発明の方法は５００個のＷＢＣ中で約１個のＣＴＣの純度のレベルを達成することができる一方で、本発明の方法は、いくつかの既知のＣＴＣ分析方法で必要とされるような高度に精製されたＣＴＣを必要としない。
【0020】
本明細書において用いる場合、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）による浄化は、産物の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲから作り出されたｃＤＮＡに対して、被覆磁気ビーズを使用して大きさの選択を実施する技法である。本明細書に記載の新規検査方法において、これは、（ａ）正しい大きさのｃＤＮＡのみを選択することと、（ｂ）液滴の安定性に適合しない強すぎる溶解洗剤を除去することとの二重の目的を達成する。
【0021】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、小さいオリゴヌクレオチドプライマーの連続アニーリングおよび再アニーリングによって既知のＤＮＡ断片を増幅させて結果として検出可能な分子信号を得るプロセスである。
【0022】
逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲは、逆転写を用いて相補的ｃ－ＤＮＡ分子をＲＮＡ鋳型から精製し、それによってＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応がＲＮＡに対して作用するのを可能にすることを指す。本明細書中に開示される新規方法の重要な態様は、ＲＮＡを破壊または分解しかねないような方法で溶解または処理されていない全細胞ＣＴＣからの質の高いＲＮＡの入手可能性である。
【0023】
本明細書中で使用する場合、「陽性液滴」は、タグ付きプライマーを使用して行われるＰＣＲ反応によってＰＣＲ増幅産物の可視化が可能になる脂質カプセル化分子である。したがって、特定の標識遺伝子の一本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を含有していた液滴は、蛍光顕微鏡法を用いて可視化可能になることができ、他方、「空」または「陰性」の液滴は、非標識ｃＤＮＡを含有する液滴である。
【0024】
新規方法およびシステムは、数多くの利点および利益を提供する。例えば、現在の方法およびシステムは、単独で用いられるいずれかの従来の既知のシステムに比べてはるかにより正確かつ堅牢な結果を提供する。単一のＣＴＣからの信号を明るい蛍光を放つ数百個または数千個の液滴（各々は単一のｃＤＮＡ分子に由来する）に作り替えることにより、新規デジタルＣＴＣ検査は劇的な信号増幅を可能にする。本明細書に記載のバイオマーカー遺伝子を選択および最適化する厳密な判断基準を考慮すれば、正常な血球からのバックグラウンド信号はｄ－ＣＴＣでは無視できる。したがって、ｄ－ＣＴＣは、進行癌を有する患者（前立腺癌、肺癌、乳癌および肝臓癌を有する患者のうちのほぼ１００％）からの信号を著しく増幅させることを可能にする。陽性点数を有する患者の割合が著しく増すだけでなく、高レベルの信号は、癌治療に続いて腫瘍負荷が低下するときの動的測定を可能にする。さらに、信号増幅は、非常に低い腫瘍負荷を有する患者においてさえ、ＣＴＣ由来の識別特徴の検出（ＣＴＣ細胞画像化では容易に達成されないもの）を可能にし、それゆえ著しく早い時期での癌の検出を可能にする。
【0025】
要約すれば、この新規マイクロ流体学方策は、患者の血液試料中のＣＴＣを濃縮、検出および分析する、能率的で処理能が極めて高く、高速で（例えば１試行当たり３時間）、感度の極めて高い方法を提供する。当該方策は、豊富で臨床上実用的な情報を提供し、さらなる最適化によって癌の早期検出を可能にし得る。
【0026】
別段の定義がなされない限り、本明細書において使用するあらゆる科学技術用語は、本発明が属する技術分野において当業者にとって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されているのと同様または等価な方法および材料を本発明の実施または試験で用いることはできるが、適する方法および材料を以下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書において言及されるその他の参考文献は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。係争の場合には、定義を含めた本明細書によって立証されることになる。さらに、材料、方法および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。
【0027】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】図１Ａは、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の全ＲＮＡから調製され、白血球と混合され、２つの異なる前立腺プライマー組を使用して液滴ＰＣＲによって分析された、ｃＤＮＡの希釈液を示すグラフである。結果はいくつかの純度を表し、この範囲に亘って陽性液滴数の良好な応答を示す。
【図1B】図１Ｂは、健常提供者（ＨＤ）の血液試料の中へスパイクされ、ＣＴＣ－ｉチップの中に流され、液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ＫＬＫ３プライマー組）に供された、手作業で単離されたＬＮＣａＰ細胞のグラフである。結果は、少数の標的細胞にまで至る優れた感度を示す。
【図1C】図１Ｃは、ＣＴＣ－ｉチップの中を通って処理され、３つの前立腺特異的なバイオマーカーおよび１つの上皮特異的なバイオマーカー（ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１、ＥｐＣＡＭ）を使用するＲＴ－ＰＣＲおよび液滴分析に供された、健常対照、限局性の（切除可能な）前立腺癌および転移性の前立腺癌を有する患者からの血液試料の分析を示すグラフである。４つマーカー全てを合わせたときの液滴の総数／ｍｌの結果を示す。
【図4】図４は、本明細書に記載の新規ＣＴＣデジタル液滴ＰＣＲ検査法（「ＣＴＣ ｄｄＰＣＲ」検査または単に「ｄ－ＣＴＣ」検査）を用いて、健常提供者では４つの異なる癌特異的マーカーに陽性な液滴が存在していないことを示す、信号強度プロットである。
【図7B】図７Ｂは、１反応当たり４つの異なる前立腺癌特異的転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。２つのそのような反応つまり反応１および２について示される理論モデル（図６Ａおよび７Ａ）および癌細胞株データ（図６Ｂおよび７Ｂ）は両方とも、理論モデルから実験データが正確に予測されることを実証している。
【図13B】図１３Ｂは、１反応当たり４つの異なる乳癌特異的および肺癌特異的な転写物について多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す信号強度プロットである。６つのそのような反応、反応１～６について示される理論モデル（図８Ａ、９Ａ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ａおよび１３Ａ）および癌細胞株データ（図８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂおよび１３Ｂ）は、マーカーの種々の組み合わせの各々に関して、理論モデルから実験データが正確に予測されることを実証している。
【図14】図１４は、１ｎｇの非増幅細胞株ｃＤＮＡ、ならびに１０、１４および１８サイクルの特異的標的増幅（ＳＴＡ）前増幅の後での１μｌの前増幅産物から得られた、７つの異なるバイオマーカー（ＰＩＰ、ＰＲＡＭＥ、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＦＡＴ１、Ｓ１００Ａ２およびＡＧＲ２）についての液滴ＰＣＲ信号を示す棒グラフであり、ＳＴＡ前増幅により液滴ＰＣＲ信号が著しく増強されることを実証している。
【図16】図１６は、図中に列挙する９つのバイオマーカー（ＡＧＲ２、Ｄｕａｌ、ＦＡＴ１、ＦＯＬＨ１、ＨＯＸＢ１３、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＳＴＥＡＰ２およびＴＭＰＲＳＳ２）について本明細書に記載の多重化ｄ－ＣＴＣ検査法を用いて試験した患者の前立腺癌のデータの結果を示す横棒グラフである。９１パーセントの癌患者（１１人中１０人の患者）が、検出可能なＣＴＣを有しており、２８個のうち２４個（８６％）の試料が、検出可能なＣＴＣを含有しており、１２個のうち０個（０％）の健常提供者（ＨＤ）の血液試料がＣＴＣを含有していた。
【図17】図１７は、転移性前立腺癌患者（上行）、限局性前立腺癌患者（中央行）および健常提供者の対照試料（下列）から得た血液試料について２つの異なる反応（反応１（ＴＭＰＲＳＳ２、ＦＡＴ１、ＫＬＫ２およびＳＴＥＡＰ２）、左列）および反応２（ＫＬＫ３、ＨＯＸＢ１３、ＡＧＲ２およびＦＯＬＨ１）、右列）を多重化したｄ－ＣＴＣ検査を示す一連の信号強度プロットである。各場合において、健常提供者（ＨＤ）の試料中にはＣＴＣは存在しなかったが、癌の試料中にはＣＴＣの明確な証拠が存在していた。
【図18】図１８は、アビラテロン（登録商標）で処置した前立腺癌患者における薬物応答の読み出しを提供する経時的に測定されたＣＴＣでの、アンドロゲン受容体シグナル伝達遺伝子の相対的割合を示す多重棒グラフである。
【図19A】図１９Ａは、非増幅対１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を示すグラフである。図１９Ａは、３回の反復（ＷＴＡ１、ＷＴＡ２、ＷＴＡ３）において一致した、種々の標的領域のアンプリコン増幅効率のレベルを示す棒グラフである。
【図19B】図１９Ｂは、非増幅対１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を示すグラフである。図１９Ｂは、１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を用いることによって信号が非前増幅試料に比べておおよそ４桁（１０８対１０４）増大することを示す。
【図21B】図２１Ｂは、１４個のマーカーを多重化した肺癌検査の結果を示すグラフである。図２１Ｂは、癌患者の血液１ｍｌ当たりの液滴計数が全て（８人中８人）、全ての健常提供者よりも高くなり、この検査での検出率が１００％となったことを示す。
【図22】図２２は、９人の転移性乳癌患者、５人の限局性乳癌患者、および１５人の健常提供者の範囲で用いた１１個のマーカーの多重検査のための乳癌検査の結果を示すグラフである。結果は、検査が９人中７人の転移性乳癌患者、５人中２人の限局性乳癌患者、および０人の健常提供者試料において癌を検出することを示す。
【図23A】図２３Ａは、転移性乳癌患者におけるＡＲｖ７検出の結果を示すグラフである。図２３Ａは、１０人の転移性乳癌患者および７人の健常提供者から得た試料を本明細書に記載のＣＴＣチップによって処理した結果を示す棒グラフである。
【図23B】図２３Ｂは、転移性乳癌患者におけるＡＲｖ７検出の結果を示すグラフである。図２３Ｂは、１０個のうち５個の癌患者試料が健常提供者のバックグラウンドレベルを超え、１０中５、すなわち５０％の検出率が得られたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本開示は、血液試料中の希少な癌細胞から情報を得る方法およびシステムに関する。これらの方法およびシステムは、血液試料中の非標識ＣＴＣを単離するための単離技法、例えば、超高処理能マイクロ流体技法、例えば、負枯渇技法、例えば、造血細胞の負枯渇を用いるものの力と、固有癌系統のリボ核酸（ＲＮＡ）マーカーに的を絞った分析技法、例えば、液滴に基づくデジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検査とを組み合わせる。この方略は、細胞の精製（例えば、濾過、陽性腫瘍細胞選択）を部分的に提供するその他のＣＴＣ単離技術に適用することもできるが、ＲＮＡの質、したがって検査の感度はマイクロ流体技術には劣るであろう。同様に、ＲＮＡに適用されるその他のデジタルＰＣＲ技術は、系統に固有のプライマーを検出することができるが、液滴に基づく検査の感度が最も高い可能性がある。
【0030】
本明細書に記載の新規方法は、血中のＣＴＣの存在に基づく癌の早期検出のためだけでなく腫瘍負荷定量のためにも用いることができ、また、特定の腫瘍からのＣＴＣを経時的にモニタリングして例えば臨床試行または特定の療法との関連において例えばＣＴＣの中に存在する固有の腫瘍マーカー遺伝子のあらゆる潜在的変化および特異的療法の結果としての腫瘍における変化を測定するために用いることができる。
【0031】
検査方法の一般概念
単離技法は、例えば国際ＰＣＴ出願第２０１５／０５８２０６号パンフレットおよびＯｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５：１７９ｒａ４７（２０１３）の中で記載されているいわゆる「ＣＴＣ－ｉチップ」などの超高処理能マイクロ流体学を用いて血液試料からＣＴＣを濃縮するために用いられる。ＣＴＣ－ｉチップは、血液試料中のＷＢＣを磁気ビーズで標識してその後に試料を２つの濃縮段階を通じて処理するというＣＴＣ抗原非依存的な手法を用いる。第１段階では、決定論的横置換法を用いて小さく柔軟な細胞（粒子）（ＲＢＣ、血小板、未結合磁気ビーズおよび血漿）を除去し、その一方でより大きい細胞（ＣＴＣおよびＷＢＣ）が保持される。第２段階では、慣性集束を用いて全ての細胞を狭い流体流の中で移動させ、その後、磁場を用いてビーズ標識されたＷＢＣを集束流から引き出し、高度に濃縮されたＣＴＣが残る。１０ｍｌの全血からのＣＴＣ－ｉチップ産物は、通常は＜５００，０００個のＲＢＣ、＜５，０００個のＷＢＣおよび変動する数のＣＴＣを含有する。
単離技法は、例えば国際ＰＣＴ出願第２０１５／０５８２０６号パンフレットおよびＯｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５：１７９ｒａ４７（２０１３）の中で記載されているいわゆる「ＣＴＣ－ｉチップ」などの超高処理能マイクロ流体学を用いて血液試料からＣＴＣを濃縮するために用いられる。ＣＴＣ－ｉチップは、血液試料中のＷＢＣを磁気ビーズで標識してその後に試料を２つの濃縮段階を通じて処理するというＣＴＣ抗原非依存的な手法を用いる。第１段階では、決定論的横置換法を用いて小さく柔軟な細胞（粒子）（ＲＢＣ、血小板、未結合磁気ビーズおよび血漿）を除去し、その一方でより大きい細胞（ＣＴＣおよびＷＢＣ）が保持される。第２段階では、慣性集束を用いて全ての細胞を狭い流体流の中で移動させ、その後、磁場を用いてビーズ標識されたＷＢＣを集束流から引き出し、高度に濃縮されたＣＴＣが残る。１０ｍｌの全血からのＣＴＣ－ｉチップ産物は、通常は＜５００，０００個のＲＢＣ、＜５，０００個のＷＢＣおよび変動する数のＣＴＣを含有する。
【0032】
いくつかの分析技法は、例えば液滴マイクロ流体学を用いて、例えばＣＴＣ－ｉチップから得られた単離ＣＴＣをさらに濃縮および分析する。液滴マイクロ流体学についてのいくつかの基礎的な情報は、Ｊｅｒｅｍｙら、「Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｐ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｆｏｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１０７：４００４（２０１０）に全体的に記載されている。
【0033】
本明細書において用いる場合、液滴マイクロ流体技法は、特定の具現化において、典型的には非水溶性液体（例えば、フッ化炭素、フッ化炭化水素、鉱油、シリコーンオイルおよび炭化水素油；また、非水性液体中に界面活性剤、例えば、Ｓｐａｎ８０、モノオレイン／オレイン酸、Ｔｗｅｅｎ２０／８０、ＳＤＳ、ｎ－ブタノール、ＡＢＩＬ ＥＭ９０およびリン脂質を含むこともできる）であり体積での大きさが例えば約０．５ｐＬ～１５ｎＬ、直径が例えば１０～３００μｍ、例えば２０～１００μｍ、例えば３０～５０μｍ、例えば３５μｍである液滴の中に単一の細胞、ＲＴ－ＰＣＲ試薬、および溶解用緩衝剤をカプセル化することを含むことができる。本開示において記載の新規方法において使用する場合、これらの技法はさらに、癌特異的転写物を液滴内で増幅させて蛍光信号を生成すること、および増幅陽性液滴を選別することを含む。この手法によって、診断および個人別薬物療法を目的とした配列決定および分析を行うことのできる純粋なＣＴＣが単離される。ＣＴＣの異種性が高いため、多重化した増幅を用いて可能な限り多くのＣＴＣを検出することが有用である。したがって、１対のプライマーをＰＣＲ混合物中で使用する代わりに、腫瘍特異的なプライマーの組み合わせを用いてＣＴＣの検出および選別の可能性を高めることができる。癌細胞を選別するためにＰＣＲを使用する際のさらなる情報については、例えば、Ｅａｓｔｂｕｒｎら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＰＣＲ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４、第４２巻、Ｎｏ．１６ｅ１２８を参照されたい。
【0034】
新規検査方法では、ＣＴＣを溶解して、癌細胞で発現される遺伝子を代表するものであるＲＮＡ分子を放出する。大半のものが、癌特異的というよりはむしろ「系統」特異的であり、例えばいかなる前立腺細胞も（癌性であろうとなかろうと）これらのマーカーを発現する。しかし正常な血液細胞はその発現がなく、信号が、血流中を循環する細胞に由来する、という事実はそれを異常な信号として決定する。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換することによって、今やこの系統信号をＰＣＲ増幅させることができる。本発明者らは、極めて高感度である液滴デジタルＰＣＲを用いて、単一の癌細胞からの信号（例えば、画像化検査での１つの信号）を何千もの陽性免疫蛍光液滴に変換することを可能にする。多重に高度に集団化した転写物のこれらの組み合わせは、癌に対する高い感度および特異性を保証し、（前立腺癌および乳癌におけるホルモン応答性経路の状態などでの）機能的洞察をも可能にする。
【0035】
記している通り、新規検査方法は、ＤＮＡではなく質の高いＲＮＡの検出および分析に的を絞る。これらは、血漿およびＣＴＣでのＤＮＡ突然変異に対してかなりの作業となってきたが、本発明の方法は、以下の理由からＲＮＡマーカーに依拠している：
１．ＤＮＡ突然変異は腫瘍特異的ではなく、また、健常個体がいくつかの未確認の癌細胞を血中に有するという発見は、臨床上非常に困難な状況である。これとは対照的に、腫瘍特異的なＲＮＡ（例えば、肺に対して前立腺）を選択することによって、新規方法は血中の癌細胞の根源を特定することができる。
１．ＤＮＡ突然変異は腫瘍特異的ではなく、また、健常個体がいくつかの未確認の癌細胞を血中に有するという発見は、臨床上非常に困難な状況である。これとは対照的に、腫瘍特異的なＲＮＡ（例えば、肺に対して前立腺）を選択することによって、新規方法は血中の癌細胞の根源を特定することができる。
【0036】
２．ＤＮＡ突然変異は、非常に異種性が高く、そのうえ、多くの癌が共有する再発性突然変異は少なく、大半の血液に基づく突然変異の検出には、一次腫瘍の中に存在する突然変異についての既存の知識が必要である（すなわち、未知の癌のスクリーニングには適さない）。これとは対照的に、特異的な器官に由来する全ての腫瘍細胞は、共通する系統のマーカーをＲＮＡレベルで発現する。それゆえ、新規方法では、個々の癌タイプのそれぞれに対して単一のマーカー混合物を使用する。
【0037】
３．転移が確立される前に浸潤癌は低レベルのＣＴＣを流す（つまりそれは、血液に基づく検出には遅すぎではない）が、血中での腫瘍細胞の存在は血管浸潤を暗に意味する（つまり、緩慢性ではなく侵襲性の癌）。それは、一次腫瘍の中の死滅しかけている細胞から漏れるものである血漿ＤＮＡまたは血漿タンパク質マーカーの場合には当てはまらず、必ずしも血管浸潤を指し示している必要はない。例えば、血中の血清ＰＳＡタンパク質は、良性の前立腺細胞からも一次前立腺癌からも流れる。他方、ＰＳＡを発現しているＣＴＣは、浸潤性の前立腺癌のみから流れる。
【0038】
４．本明細書に記載の新規デジタル採点技術を用いるＲＮＡの分析は、極めて高感度である。しかしながら、遊離ＲＮＡは血流中で分解されるものであり、本明細書に記載の単離システム、例えばマイクロ流体負枯渇システム（例えばＣＴＣチップシステム）の使用は、非標識の腫瘍細胞が抽出可能な質の高いＲＮＡを有するという点で独特である。
【0039】
ＤＮＡよりもｃＤＮＡを標的分子として選択することは、各腫瘍細胞を起源とする信号を増大させるためだけでなく、白血球（ＷＢＣ）転写物の排除に向けて腫瘍細胞転写物のみを特異的に標的化するためにも行われた。信号の増大は重要な利点である、というのも、それによって、ＣＴＣを非常に高いレベルの純度で単離する必要がなくなるからである。つまりそれは、同じ産物中で混入している何百または何千ものＷＢＣ、例えば白血球によって未だに取り囲まれた１つ以上の「単離」ＣＴＣを含有する産物に関して、堅牢で反復可能な結果を可能にする。それにも拘らず、新規方法において使用されるようなＲＮＡから作られたｃＤＮＡを標的とする方略は、従来の手法に比べて最低レベルのＣＴＣ純度で最大限の特異性を精巧にあつらえることを可能にする。
【0040】
ＣＴＣ－ｉチップ技術は、抗体でタグ付けされた白血球のマイクロ流体枯渇によって、非造血性細胞を単離する効率が高い。ＣＴＣ－ｉチップのこの特徴は、無傷な腫瘍由来ＲＮＡを（その他の技術を用いて得られるレベルよりもはるかに高いレベルで）提供し、またそれは、（個人の癌の中で癌同士および上皮細胞対間葉系細胞サブタイプ同士で異形成が高い）腫瘍細胞表面エピトープとは無関係である。さらに、画像化分析のための抗体染色および選択が最適未満であるアポトーシス前の癌細胞さえも、本明細書に記載の方法を用いて採点されることのできる腫瘍特異的ＲＮＡの供給源を提供することができる。これら全ての理由から、希少なＣＴＣと共に試料中に見受けられるＷＢＣを少なくともいくらか低減しつつ、質の高いＲＮＡを無傷のＣＴＣから提供する単離技術またはシステム、例えばマイクロ流体負枯渇システム、例えばＣＴＣ－ｉチップは、腫瘍特異的なデジタル読み出しを産物に適用する前の重要な第１ステップの単離である。
【0041】
異種混交の混合物中での極めて希少な分子の液滴に基づくデジタル検出は元々、異種混交の混合物中に存在する場合には検出レベル未満であるがＰＣＲに供される前に液滴中に隔離されている場合には容易に識別される、個々のＤＮＡ分子をＰＣＲ増幅させるために開発された。液滴に基づくデジタルＰＣＲ（「液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）」）の基本的技術は、ＲａｉｎＤａｎｃｅおよびＢｉｏ―Ｒａｄにより市販されており、それによって、標的分子の脂質カプセル化およびそれに続くＰＣＲ分析のための装備が提供される。これを可能にした重要な科学的進歩には、ハーバードのＤａｖｉｄ Ｗｅｉｔｚおよびジョンズ・ホプキンズのＢｅｒｔ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの研究所での研究が含まれる。例えば、米国特許第６，７６７，５１２号；第７，０７４，３６７号；第８，５３５，８８９号；第８，８４１，０７１号；第９，０７４，２４２号；および米国特許第２０１４／０３０３００５号公報を参照されたい。また、米国特許第９，０６８，１８１号も参照されたい。
【0042】
しかしながら、液滴デジタルＰＣＲ自体は、本明細書に記載の新規方法の肝要部分である生物起源の材料と結合されない限り、生物学的に重要ではない。例えば、系統特異的なＲＮＡの検出（本発明の検出方略の中心的焦点）は、正常な前立腺上皮細胞と癌性の前立腺細胞とを区別しない。そういったことから、前立腺由来の転写物の血中での検出は意味深いものではない：それらは、正常な前立腺細胞またはエキソソームからの破片の中に存在する。完全ＣＴＣ（すなわち、血中の無傷のＣＴＣ）の単離と結合させたときに初めて、ｄｄＰＣＲ検査は極めて高い感度と特異性との両方を達成する。それゆえ、これらの２つの技術は理想的には互いに適合したものである、というのも、新規方法において、単離システムは質の高いＲＮＡを提供し、液滴に基づくデジタルＰＣＲ検査はＲＮＡマーカーに的を絞っているからである。
【0043】
１つの付加的な態様は、新規検査方法の全体的な成功にとって重要である。記されているように、本明細書に記載の新規検査方法は、完全ＲＮＡから作られたｃＤＮＡを使用するが、この使用にとって肝要なのは、各癌タイプについて主要系統に特異的であり、しかも正常な血球の中には（ｄｄＰＣＲ感度によってさえ）全く存在しない程に非常に独特である、適切なバイオマーカーを特定することである。本明細書において記載される、各癌タイプについての多数の標的ＲＮＡバイオマーカーの選択、試験および検証は、新規検査方法の成功を可能にする。
【0044】
検査方法のステップ
新規検査方法は、液滴デジタルＰＣＲ機器からのデータの解析に至るまで、またはそれを含めて、単離システム、例えばマイクロ流体負枯渇システムを用いて部分的に純粋なＣＴＣを単離することから始まる。主に８つの検査ステップがあり、そのいくつかは、任意で選択されるが概してより良好な結果を与えるものである。
新規検査方法は、液滴デジタルＰＣＲ機器からのデータの解析に至るまで、またはそれを含めて、単離システム、例えばマイクロ流体負枯渇システムを用いて部分的に純粋なＣＴＣを単離することから始まる。主に８つの検査ステップがあり、そのいくつかは、任意で選択されるが概してより良好な結果を与えるものである。
【0045】
１．血液試料から；例えば患者または被験体から、血中に存在するＣＴＣおよびその他の細胞を含む産物を単離すること；
２．希少細胞含有産物の体積を減らすこと（任意）；
３．例えば細胞溶解によって、産物からリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離し、単離ＲＮＡから；例えば産物中に含まれている細胞から放出したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを生成させること；
４．ＲＴ－ＰＣＲステップ中に合成されたｃＤＮＡの浄化（任意）；
５．遺伝子特異的な標的化前増幅プローブを使用して、例えばＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法、または非特異的完全トランスクリプトーム増幅を用いて、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）を使用して、ｃＤＮＡを前増幅すること（任意）；
６．ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中に、例えばＰＣＲ試薬と共に、カプセル化すること；
７．ＣＴＣ由来ｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞由来ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下、各液滴内で、例えばＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡ分子を増幅させること；
８．レポーター基を含有する液滴（例えば「陽性」液滴）を液滴中のＣＴＣ由来ｃＤＮＡ分子の存在の指標として検出すること；ならびに
９．検出された液滴中のＣＴＣを分析して、例えば、患者または被験体における特定疾患の存在を判定すること。
２．希少細胞含有産物の体積を減らすこと（任意）；
３．例えば細胞溶解によって、産物からリボ核酸（ＲＮＡ）分子を単離し、単離ＲＮＡから；例えば産物中に含まれている細胞から放出したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを生成させること；
４．ＲＴ－ＰＣＲステップ中に合成されたｃＤＮＡの浄化（任意）；
５．遺伝子特異的な標的化前増幅プローブを使用して、例えばＦｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法、または非特異的完全トランスクリプトーム増幅を用いて、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）を使用して、ｃＤＮＡを前増幅すること（任意）；
６．ｃＤＮＡ分子を個々の液滴中に、例えばＰＣＲ試薬と共に、カプセル化すること；
７．ＣＴＣ由来ｃＤＮＡには特異的に結合するが他の細胞由来ｃＤＮＡには結合しない構成のレポーター基の存在下、各液滴内で、例えばＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡ分子を増幅させること；
８．レポーター基を含有する液滴（例えば「陽性」液滴）を液滴中のＣＴＣ由来ｃＤＮＡ分子の存在の指標として検出すること；ならびに
９．検出された液滴中のＣＴＣを分析して、例えば、患者または被験体における特定疾患の存在を判定すること。
【0046】
以下にさらに詳しく記載しているように、新規ｄ－ＣＴＣ検査法の重要な特徴の１つは、優れた感度を送達する数々の標的バイオマーカー（および対応するプライマー）が慎重に選択される一方で同時にほぼ完璧な特異性が維持されることである。本明細書に記載の独特の標的遺伝子バイオマーカーの一覧（表１、下記）は、公的に入手可能なデータベースと専売のＲＮＡｓｅｑ ＣＴＣデータとのバイオインフォマティクス解析を用いて決定した。白血球のいかなる亜集団でも発現されないがＣＴＣでは十分に高い頻度および強度で発現されるマーカーを十分に慎重に選択して、種々様々な患者の合理的な広さのアレイにおいて信頼性のある信号を提供した。各癌タイプ（例えば特に、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、肺癌、膵臓癌）について特異的な組のマーカーを選択した。
【0047】
これより、検査方法の個別のステップについてより詳しく記載することにする。
１．ＣＴＣの単離
患者の血液をＣＴＣ－ｉチップ、例えば、バージョン１．３Ｍまたは１．４．５Ｔの中に流し、試料を氷上の１５ｍＬ円錐形チューブ内に回収した。ＣＴＣ－ｉチップは、以前に記載されているとおりに設計および作製された（Ｏｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（１７９）：１７９ｒａ４７（ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５６１６）（２０１３））。
１．ＣＴＣの単離
患者の血液をＣＴＣ－ｉチップ、例えば、バージョン１．３Ｍまたは１．４．５Ｔの中に流し、試料を氷上の１５ｍＬ円錐形チューブ内に回収した。ＣＴＣ－ｉチップは、以前に記載されているとおりに設計および作製された（Ｏｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（１７９）：１７９ｒａ４７（ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５６１６）（２０１３））。
【0048】
血液試料（癌患者１人当たり約２０ｍｌ）を、認可済のプロトコルを用いてＥＤＴＡチューブ内に採取する。その後にこれらの試料をＣＤ４５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＣＤ６６ｂ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、自社でビオチン化した）に対するビオチン化抗体と共に保温し、続いてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（登録商標）ストレプトアビジンＴ１（インビトロジェン）と共に保温して、白血球の磁気標識化を達成する（Ｏｚｋｕｍｕｒら、２０１３）。
【0049】
その後に試料をＣＴＣ－ｉチップの中に通して処理し、それによって血液成分（赤血球および白血球および血小板）および未結合ビーズをＣＴＣから分離する。ＣＴＣを溶液中に回収する一方で、赤血球、血小板、未結合ビーズおよびタグ付き白血球を廃液チャンバ内に回収する。プロセスは自動化されており、１０ｍｌの血液が１時間で処理される。
【0050】
２．希少細胞含有産物の体積低減および貯蔵
産物中に単離された全ての細胞を完全に溶解させるためには、典型的な出発点である数ミリリットから最終体積の約１００μｌに産物体積を低減することが好ましい。これは、例えば、産物を遠心分離し、細胞溶解およびｃＤＮＡの生成に備えてプルロニック緩衝液中に再懸濁させることによって、成し遂げることができる。この時点で、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の添加およびそれに続く液体窒素中での瞬間凍結および－８０℃での保存により、試料を長期保存のために処理することができる。
産物中に単離された全ての細胞を完全に溶解させるためには、典型的な出発点である数ミリリットから最終体積の約１００μｌに産物体積を低減することが好ましい。これは、例えば、産物を遠心分離し、細胞溶解およびｃＤＮＡの生成に備えてプルロニック緩衝液中に再懸濁させることによって、成し遂げることができる。この時点で、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の添加およびそれに続く液体窒素中での瞬間凍結および－８０℃での保存により、試料を長期保存のために処理することができる。
【0051】
３．産物中の細胞からのＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの生成
ＲＮＡ単離ステップは、ＲＴ－ＰＣＲに備えて細胞から全てのＲＮＡ分子を完全に放出させるためにプロセスにとって重要である。ワンステップでのチューブ内反応を用いて、標準的な移送ステップの間に招く可能性のある細胞およびＲＮＡの損失の危険性を最小限に抑えることができる。例えば、ペレット状産物にＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを直接添加し、ピペット操作で完全に溶解させ、１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標とするキットプロトコルに従って反応を実施することにより、ｑＲＴ－ＰＣＲキット用のインビトロジェンＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（登録商標）第一鎖合成Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）を使用することができる。一旦ｃＤＮＡが合成されたならばＲＮアーゼＨを反応に適用して、残存しているあらゆるＲＮＡを除去する。あるいは、後のステップにおいて試料の完全トランスクリプトーム前増幅を実施したいのであれば、専売オリゴヌクレオチドおよび逆転写酵素を使用するものであるＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルを使用して、ｃＤＮＡを合成することができる。
ＲＮＡ単離ステップは、ＲＴ－ＰＣＲに備えて細胞から全てのＲＮＡ分子を完全に放出させるためにプロセスにとって重要である。ワンステップでのチューブ内反応を用いて、標準的な移送ステップの間に招く可能性のある細胞およびＲＮＡの損失の危険性を最小限に抑えることができる。例えば、ペレット状産物にＲＴ－ＰＣＲマスターミックスを直接添加し、ピペット操作で完全に溶解させ、１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標とするキットプロトコルに従って反応を実施することにより、ｑＲＴ－ＰＣＲキット用のインビトロジェンＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（登録商標）第一鎖合成Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（登録商標）を使用することができる。一旦ｃＤＮＡが合成されたならばＲＮアーゼＨを反応に適用して、残存しているあらゆるＲＮＡを除去する。あるいは、後のステップにおいて試料の完全トランスクリプトーム前増幅を実施したいのであれば、専売オリゴヌクレオチドおよび逆転写酵素を使用するものであるＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルを使用して、ｃＤＮＡを合成することができる。
【0052】
４．ＲＴ－ＰＣＲ中に合成されたｃＤＮＡの浄化
プロセスの別の有用なステップは、任意ステップではあるが、溶解試薬をｃＤＮＡ含有溶液から除去することを含む。強すぎる洗剤の存在は、ｃＤＮＡ含有溶液がｄｄＰＣＲ機器へ移されるとすぐに、ｄｄＰＣＲ法で使用する液滴の不安定化を招く可能性がある。洗剤の除去は、例えば、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）を用いることによって成し遂げることができる。この技法では、被覆磁気ビーズを使用して最初に特定の大きさ範囲のｃＤＮＡを結合させ、その後に洗剤含有上清を除去し、最後に純粋なｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ機器への投入のために溶離させる。ＲＴ－ＰＣＲの浄化に加えて、ＳＰＲＩプロセスもまた、ｃＤＮＡの大きさの選択を達成し、それは、プロセスのｄｄＰＣＲ段階に入る非標的ｃＤＮＡ分子の数を低減し、次いでそれはバックグラウンドおよびノイズを低減する。
プロセスの別の有用なステップは、任意ステップではあるが、溶解試薬をｃＤＮＡ含有溶液から除去することを含む。強すぎる洗剤の存在は、ｃＤＮＡ含有溶液がｄｄＰＣＲ機器へ移されるとすぐに、ｄｄＰＣＲ法で使用する液滴の不安定化を招く可能性がある。洗剤の除去は、例えば、固相可逆固定（ＳＰＲＩ）を用いることによって成し遂げることができる。この技法では、被覆磁気ビーズを使用して最初に特定の大きさ範囲のｃＤＮＡを結合させ、その後に洗剤含有上清を除去し、最後に純粋なｃＤＮＡをｄｄＰＣＲ機器への投入のために溶離させる。ＲＴ－ＰＣＲの浄化に加えて、ＳＰＲＩプロセスもまた、ｃＤＮＡの大きさの選択を達成し、それは、プロセスのｄｄＰＣＲ段階に入る非標的ｃＤＮＡ分子の数を低減し、次いでそれはバックグラウンドおよびノイズを低減する。
【0053】
５．前増幅
ｃＤＮＡの前増幅は、液滴ＰＣＲステップで検出できる鋳型分子の数を増加させる、したがってシグナル対ノイズ比を向上させ陽性読み値の信頼性を高める、任意ステップである。それは、ＣＴＣにおいて低レベルで発現されるマーカーの検出のためおよび、例えば転移前の疾患の早期検出との関連において、アポトーシス性である可能性のある非常に少ない数のＣＴＣを含有する試料を分析するための、非常に強力な手法である。これらの２つの手法は、ｄ－ＣＴＣ検査の作業流れにおいて適用されるために改変されている。特異的標的増幅（ＳＴＡ）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲプロトコルに基づいて、液滴ＰＣＲステップで使用されるプローブによって標的化される領域を増幅するように特異的に設計されたプライマーを使用することに依拠している（表２参照）。これらのプライマーは、健常対照におけるノイズの増加なしに効率的で特異的な増幅を確保するために、それらの各々の蛍光プローブと組み合わせて慎重に設計および試験された。その代わりに、完全トランスクリプトーム増幅は、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルに基づき、ＷＢＣにおいて見受けられる転写物とＣＴＣにおいて見受けられる転写物との両方を含めた産物中の全ての転写物の増幅に依拠している。
ｃＤＮＡの前増幅は、液滴ＰＣＲステップで検出できる鋳型分子の数を増加させる、したがってシグナル対ノイズ比を向上させ陽性読み値の信頼性を高める、任意ステップである。それは、ＣＴＣにおいて低レベルで発現されるマーカーの検出のためおよび、例えば転移前の疾患の早期検出との関連において、アポトーシス性である可能性のある非常に少ない数のＣＴＣを含有する試料を分析するための、非常に強力な手法である。これらの２つの手法は、ｄ－ＣＴＣ検査の作業流れにおいて適用されるために改変されている。特異的標的増幅（ＳＴＡ）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲプロトコルに基づいて、液滴ＰＣＲステップで使用されるプローブによって標的化される領域を増幅するように特異的に設計されたプライマーを使用することに依拠している（表２参照）。これらのプライマーは、健常対照におけるノイズの増加なしに効率的で特異的な増幅を確保するために、それらの各々の蛍光プローブと組み合わせて慎重に設計および試験された。その代わりに、完全トランスクリプトーム増幅は、ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキットプロトコルに基づき、ＷＢＣにおいて見受けられる転写物とＣＴＣにおいて見受けられる転写物との両方を含めた産物中の全ての転写物の増幅に依拠している。
【0054】
６．液滴中でのｃＤＮＡおよびＰＣＲ試薬のカプセル化
一旦ｃＤＮＡが合成され、混入している洗剤を除去して精製されたならば、溶液中のｃＤＮＡ分子の全ての凝集物とｑＰＣＲ試薬とを、例えば液滴製造機器、例えば液滴生成器、例えば１試料あたり２０，０００個の液滴を精製するＢｉｏｒａｄ自動液滴生成器によって、多くの小区画化された反応に分割する。各反応は、非水性液体、例えば油（ＰＣＲ適合性、例えば販売者からの専売製剤）の極めて小さい液滴から構成され、それは、Ｔａｑｍａｎ型ＰＣＲ試薬を遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに少量の試料を含有している。液滴生成が完了した時点で、試料は、多大な数の個々のＰＣＲ対応型反応を含有しているエマルジョンから構成される。
一旦ｃＤＮＡが合成され、混入している洗剤を除去して精製されたならば、溶液中のｃＤＮＡ分子の全ての凝集物とｑＰＣＲ試薬とを、例えば液滴製造機器、例えば液滴生成器、例えば１試料あたり２０，０００個の液滴を精製するＢｉｏｒａｄ自動液滴生成器によって、多くの小区画化された反応に分割する。各反応は、非水性液体、例えば油（ＰＣＲ適合性、例えば販売者からの専売製剤）の極めて小さい液滴から構成され、それは、Ｔａｑｍａｎ型ＰＣＲ試薬を遺伝子特異的プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに少量の試料を含有している。液滴生成が完了した時点で、試料は、多大な数の個々のＰＣＲ対応型反応を含有しているエマルジョンから構成される。
【0055】
このステップでは、１つ、または多数の反応において腫瘍負荷の総合的な判定のため、例えば、主要の進展または療法への応答を判定するために、以下の表１に挙げる１つ以上の異なる標的遺伝子に対するＰＣＲプローブおよび関連するプライマーを使用することができる。このように、いくつかの事例では表１の特定の遺伝子に対する単一の組のＰＣＲプライマーおよびプローブを各液滴中に含むことができるが、ＣＴＣにおける遺伝子発現の異種性を考慮すれば、腫瘍細胞の検出を最大限に高めるために、それぞれのプライマー／プローブの組について種々の蛍光プローブを使用して各液滴中に２つ以上の異なる遺伝子に対してＰＣＲプライマーおよびプローブを多重化することも可能である。また、各液滴中で様々な癌タイプを標的とする多数の遺伝子のためにＰＣＲプライマーおよびプローブを多重化して、それゆえに単回の検査において多数の腫瘍タイプの広範でしかも特異的な検出を可能にすることも、可能である。
【0056】
７．液滴にカプセル化されたｃＤＮＡ分子のＰＣＲ
ｑＰＣＲサイクル条件を用いて、エマルジョン試料全体に対して標準的なＰＣＲサイクルを実施する。反応は、個々の液滴ＰＣＲ体積の大部分が終点へともたらされることを確かにするために、４５サイクルまで行う。このことは重要であるが、反応はＴａｑｍａｎ型ｑＰＣＲ試薬を使用して実施され、ｑＰＣＲ条件下で繰り返されるが、試料の蛍光強度はＰＣＲサイクル中には測定されずに次のステップで測定されることになるからである。
ｑＰＣＲサイクル条件を用いて、エマルジョン試料全体に対して標準的なＰＣＲサイクルを実施する。反応は、個々の液滴ＰＣＲ体積の大部分が終点へともたらされることを確かにするために、４５サイクルまで行う。このことは重要であるが、反応はＴａｑｍａｎ型ｑＰＣＲ試薬を使用して実施され、ｑＰＣＲ条件下で繰り返されるが、試料の蛍光強度はＰＣＲサイクル中には測定されずに次のステップで測定されることになるからである。
【0057】
８．陽性液滴の検出
個々に区画されたＰＣＲの各々は、いかなる蛍光測定も実施する前に完全に終点へともたらされるため、個々の液滴はそれぞれ、十分に蛍光を発する液滴となるか、または蛍光を実質的に全く含まないことになる。これにより、陽性（蛍光を発する）および陰性（蛍光を発しない）の液滴を簡単に数え上げることが可能になる。
個々に区画されたＰＣＲの各々は、いかなる蛍光測定も実施する前に完全に終点へともたらされるため、個々の液滴はそれぞれ、十分に蛍光を発する液滴となるか、または蛍光を実質的に全く含まないことになる。これにより、陽性（蛍光を発する）および陰性（蛍光を発しない）の液滴を簡単に数え上げることが可能になる。
【0058】
９．分析
上流でのＲＴ－ＰＣＲは１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標としたため、各陽性液滴は、生じる単一のＲＮＡ転写物を表すはずである。この解釈は、標的ｃＤＮＡ分子の数をはるかに上回る個々の液滴の数に依拠している。新規プロセスでは、一極において本発明者らは、単一のＣＴＣを単離および溶解させて、数個のＲＮＡ転写物を遊離させ、次いでそれを１：１でｃＤＮＡへと逆転写し、分画し、ＰＣＲ増幅させ、数え上げる、ということの可能性を検討する。
上流でのＲＴ－ＰＣＲは１：１のＲＮＡ：ｃＤＮＡ比を目標としたため、各陽性液滴は、生じる単一のＲＮＡ転写物を表すはずである。この解釈は、標的ｃＤＮＡ分子の数をはるかに上回る個々の液滴の数に依拠している。新規プロセスでは、一極において本発明者らは、単一のＣＴＣを単離および溶解させて、数個のＲＮＡ転写物を遊離させ、次いでそれを１：１でｃＤＮＡへと逆転写し、分画し、ＰＣＲ増幅させ、数え上げる、ということの可能性を検討する。
【0059】
本発明者らは、適度に発現された遺伝子、例えば前立腺癌細胞中のＫＬＫ３遺伝子の場合、各細胞がおおよそ８０～１２０個のＫＬＫ３ ｍＲＮＡの複製物を含有している、と推定する。Ｂｉｏｒａｄ ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムは、２０，０００個の液滴を生成し、それは、少数の単離ＣＴＣおよび適度に発現された標的遺伝子について液滴１個当たり２つ以上の標的ｃＤＮＡ分子が決して存在しないことを確かなものにする。他方、ＣＴＣの数が数ダースまたは数百に達する場合、適度に発現する遺伝子について液滴１個当たり多数の標的ｃＤＮＡ複製物が存在する可能性がある。そのような場合、生じる転写物のおおよその数はポアソン統計学を用いて推定することができる。
【0060】
ＣＴＣの系統特異的同定を可能にする新規遺伝子パネル
上に述べたように、周囲を取り巻く正常な血球との関連において癌細胞に対して高度に特異的である遺伝子転写物の同定は、新規方法の中心部分である。癌細胞においてより高度に発現される遺伝子は多く知られているが、これらの遺伝子の大多数もまた、血液を含めた正常な組織において通常は少なくとも限られた発現を有する。この検査に必要とされる並外れた感度を考慮すれば、正常な血球における信号の欠如は、血流中の腫瘍細胞の信頼性の高い同定にとって必須である。
上に述べたように、周囲を取り巻く正常な血球との関連において癌細胞に対して高度に特異的である遺伝子転写物の同定は、新規方法の中心部分である。癌細胞においてより高度に発現される遺伝子は多く知られているが、これらの遺伝子の大多数もまた、血液を含めた正常な組織において通常は少なくとも限られた発現を有する。この検査に必要とされる並外れた感度を考慮すれば、正常な血球における信号の欠如は、血流中の腫瘍細胞の信頼性の高い同定にとって必須である。
【0061】
血中のＣＴＣを検出するために使用される候補の腫瘍特異的転写物は、最初に、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および肝臓癌ならびにメラノーマに由来する、公的に入手可能な遺伝子発現データセットならびに、本発明者らの研究所で生成させた、乳癌、前立腺癌および膵臓癌の患者およびこれらの癌のマウスモデルから単離されたＣＴＣからの単一細胞ＲＮＡＳｅｑデータを解析することによって選択される。発現が腫瘍に制限されており血液成分中には存在しないかまたは検出不可能である転写物は、さらに下流での分析のために選択される。正常な血球における発現の完全な欠如を（最も高いレベルの感度で、つまりデジタルＰＣＲ検査によって）実証および検証することは重要である。全体として本発明者らは、コンピュータモデルまたはＲＮＡ Ｓｅｑデータに基づいて予言された候補遺伝子のうちのたった約１０％のみがヒト血液試料において真に陰性であることを見出した。
【0062】
特に、ＣＴＣを検出するための候補の腫瘍特異的ｍＲＮＡ転写物は最初に、ヒトの乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、肝細胞癌およびメラノーマ癌について以前に導き出された遺伝子発現データセット（マイクロアレイおよびＲＮＡ－Ｓｅｑ）の解析によって特定した。この解析に用いる公的に入手可能なデータセットの具体的な例としては、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）（癌ゲノムアトラス、ｔｃｇａ－ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｂ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＨｏｍｅ２．ｊｓｐにてオンライン利用可能）および癌細胞株百科辞典（ＣＣＬＥ）（ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ／ｈｏｍｅにてオンライン利用可能；また、Ｂａｒｒｅｔｉｎａら、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ ４８３：６０３－６０７（２０１２）も参照されたい）が挙げられる。加えて、乳癌、前立腺癌および膵臓癌を有するヒト患者から単離されたＣＴＣからの単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ遺伝子発現データを解析した（ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ５１８２７、ＧＳＥ６０４０７およびＧＳＥ６７９８０）（Ａｃｅｔｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｒｅ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ、Ｃｅｌｌ、１５８：１１１０－１１２２（２０１４）；Ｔｉｎｇら、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ、８：１９０５－１９１８（２０１４）；およびＭｉｙａｍｏｔｏら、ＲＮＡ－Ｓｅｑ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ＣＴＣｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４９：１３５１－１３５６（２０１５）。次に、これらのデータベースによって特定された腫瘍特異的転写物をヒト白血球ＲＮＡ－Ｓｅｑ遺伝子発現データ（ＧＥＯ受託番号ＧＳＥ３０８１１、ＧＳＥ２４７５９、ＧＳＥ５１８０８、ＧＳＥ４８０６０、ＧＳＥ５４５１４およびＧＳＥ６７９８０）と比較した。次に、さらに下流での分析のために、腫瘍における発現が高く白血球における発現が低いかまたは検出不可能である、差異の著しい発現を呈した転写物を選択した。さらに、文献検索を実施して追加候補の腫瘍特異的転写物を選択した。ヒトの各タイプの癌について５０～１００個の候補遺伝子が選択された。
【0063】
各特異的癌タイプにおける各候補遺伝子について、標的転写物の領域にまたがる２～４組のＰＣＲプライマーを設計した。プライマーはＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成し、プローブをＦＡＭまたはＨＥＸ、ＺＥＮおよびＩＡＢｋＦＱで標識して、アンプリコンの中間部を標的とするプローブを作出する。ヒトＣＴＣにおいてデジタル式のＰＣＲに基づくｍＲＮＡ転写検出を好結果に適用するために必要とされる本発明者らのＰＣＲプライマー設計方式の独特の特徴としては、例えば下記が挙げられる：１）細胞ｍＲＮＡ転写物は、固定されていない脆弱な細胞、例えばＣＴＣにおいて特に、５’末端から分解する傾向にある、ということを考慮した、各ｍＲＮＡ転写物の３’末端の特異的標的化；２）例えば富化ＣＴＣ混合物中に過剰に混入している白血球に由来する、混入しているゲノムＤＮＡの意図しない増幅を排除するための、イントロンにまたがるアンプリコンを生成させるプライマーの設計；および３）特異的スプライス変異形の臨床的妥当性に関するいくつかの事例における不確定性を考慮した、所与の遺伝子の多数のスプライス変異形を包括的に増幅させるプライマーの設計。
【0064】
癌細胞株（乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および肝臓癌ならびにメラノーマを代表する）に由来するｃＤＮＡを使用してプライマーの特異性を最初にｑＲＴ－ＰＣＲによって試験した。ヒトの各タイプの癌について、２～５個の立証された癌細胞株を培養し、初期試験に使用してＰＣＲプライマー性能を見積もり、指定された癌における標的転写物の発現を評価した。特異性の初期試験を提供するために同じプライマーを使用して、癌の診断を有さない健常個体の白血球における標的転写物の発現を見積もった。最低５人の異なる健常個体の白血球をこの段階の試験において試験した（男性個体および女性個体の混合－これは、癌のタイプに依存する；つまり、候補の前立腺癌遺伝子および乳癌遺伝子はそれぞれ、男性提供者のみ、または女性提供者のみを用いる必要があった）。
【0065】
ヘパリンナトリウムを含む細胞調製チューブ（ＣＰＴ）（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー、ニュージャージー州）を製品に折り込まれた説明書に従って使用して全血から健常個体の白血球を単離した。ＲＮＡ抽出および第一鎖ｃＤＮＡ合成を癌細胞株に対して実施し、標準的方法を用いて白血球を単離した。（各遺伝子に対して別個の２～４組のプライマーを使用して）各遺伝子の発現の特異性を、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて（細胞株ｃＤＮＡを陽性対照とし、健常提供者からの白血球ｃＤＮＡを陰性対照とし、水を追加の陰性対照として）試験した。その後、ｑＲＴ－ＰＣＲ試験に基づいて癌細胞株の中には存在するが白血球の中には存在しない転写物を、液滴デジタルＰＣＲによるさらなる検証のために選択した。この段階の試験を通過する選択基準は非常に厳密であり、ｑＲＴ－ＰＣＲ信号が少なくとも１つの癌細胞株の中に存在し、かつ試験された健常提供者のいずれの白血球試料の中にも存在しない、ということを要求した。
【0066】
ｑＲＴ－ＰＣＲ段階の試験を通過した標的転写物および特異的プライマー対を、液滴デジタルＰＣＲを用いてさらに検証した。この段階の試験では、ＣＴＣ－ｉチップ（例えば、Ｏｚｋｕｍｕｒら、「Ｉｎｅｒｔｉａｌ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｒａｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、５、１７９ｒａ１４７（２０１３）を参照されたい）を使用して、健常個体から提供された全血試料を処理した。ＣＴＣ－ｉチップは全血からの赤血球、血小板および白血球の負枯渇を実施するものであり、（健常個体に存在するはずのない）ＣＴＣを含めた、白血球マーカーを発現しない血中の細胞が富化された試料産物を生成する。各血液試料について、ＣＴＣ－ｉチップからの産物にＲＮＡ安定化溶液（ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給し、標準的方法を用いるＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成のための処理を行った。その後、液滴デジタルＰＣＲ（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州）を用いて、試験されている特異的プライマー対に基づいて各試料中に存在する転写物の数を定量した。この段階中に液滴デジタルＰＣＲによって評価した試料は、癌細胞株からのｃＤＮＡ、ＣＴＣ－ｉチップを通じて処理された健常提供者からの白血球ｃＤＮＡ（試験されているプライマー対１つ当たり少なくとも４人の健常個体）、および陰性対照としての水を含んでいた。
【0067】
液滴デジタルＰＣＲ試験を通過するための基準は厳密であり、下記：１）癌細胞株における転写信号の存在（＞１０個の陽性液滴を有する少なくとも１つの細胞株）；２）陽性液滴と陰性（空の）液滴との間での信号の隔たりによって表される優れたシグナル対ノイズ比；３）健常提供者（健常提供者１人当たり＜３個の液滴）において液滴信号が最小限であるかまたは欠如していること；ならびに４）水における液滴信号の欠如（０個の陽性液体）を含んでいた。
【0068】
上記の液滴デジタルＰＣＲ試験において、転写物を細胞株では特異的に増幅させたが白血球では増幅させなかったプライマーをその後にシグナルの感度についての詳細な試験に供した。単一細胞の顕微操作を用いて正確な数（１個、５個、１０個、２５個および５０個の細胞）の癌細胞を、健常個体から提供された全血の中にスパイクし、その後、ＣＴＣ－ｉチップに通して処理した。その後、各試料を、液滴デジタルＰＣＲを用いる試験のために上記のとおりに処理し、信号が所望の臨床用途のために十分となることを確かにする感度を見積もった。
【0069】
ｑＲＴ－ＰＣＲおよび液滴デジタルＰＣＲを用いて候補の遺伝子およびプライマーを見積もる上記の厳密な手順によって、各タイプの癌について５０～１００個の候補遺伝子の初期一覧（合計でおおよそ４００個の初期候補遺伝子）のうちのおおよそ１０％から構成される最終プライマー一覧が得られた。次いで、ＭＧＨ癌センターで癌処置を受けている癌患者から提供された、ＩＲＢ承認済の臨床プロトコルの下で採集した血液試料を使用して、患者のＣＴＣにおける信号についてこれらのプライマーをさらに見積もった。この部分の見積もりにおいて肝要となるのは、癌の診断を有さない健常個体から採取した血液との比較である。以下の表１は、液滴デジタルＰＣＲを用いる前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、膵臓癌、肺癌およびメラノーマ癌を有する患者からのＣＴＣの特異的検出のためのこれらの方法を用いてこれまで開発されたプライマーおよびプローブを一覧で示す。
【0070】
各癌タイプに対して単一遺伝子を使用することはできるが、各パネルにおける多数の遺伝子の存在は、感度（ＣＴＣは、発現様式において患者個人の中でさえ異種性を有する）と特異性（多数の遺伝子信号を検出は、これが真の癌細胞識別特徴を表すということのさらなる信頼性を付与する）との両方のために有用である。
【0071】
以下の表１中に提供される遺伝子一覧は、特定タイプの癌に独特である転写物（例えば、前立腺癌または乳癌または肝臓癌の特異性の高いマーカー）および、いくつかの癌タイプ、例えば全ての上皮癌タイプによって共有される（したがって全癌マーカーとして役立ち得る）遺伝子、および特定条件（例えば、前立腺癌における活発なアンドロゲンシグナル伝達または乳癌における活発なエストロゲンシグナル伝達）の下で誘導される遺伝子を含む。このように、各タイプの癌に対して、最適な感度、特異性、および所与の癌タイプについての臨床上実用的な情報のために設計された遺伝子の特異的パネルが割当てられる。
【0072】
さらに、表２に記載されているプライマーは、それらの特異性を維持しながら表１に列挙する遺伝子のうちのいくつかを前増幅するように設計される。ＳＴＡを方法に選択する場合、これらの入れ子型プライマーは各癌パネルの追加成分となる。
【0073】
様々なタイプの癌についての遺伝子一覧
以下の表１は、（（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ）および配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）による）遺伝子の名前の一覧を、それらの選択対象である癌タイプ（Ｂｒ：乳房、Ｌｕ：肺、Ｌｉ：肝、Ｐｒ：前立腺、Ｐａｎｃ：膵臓、Ｍｅｌ：メラノーマ）と共に提供する。加えて、各遺伝子について最適化されたプライマーの組（プライマー１および２）を、デジタルＰＣＲ産物を最適に可視化するための蛍光プライマープローブの構成（例えば、タグ付きプローブ用の６－ＦＡＭ（商標）（青色蛍光標識）またはＨＥＸ（商標）（緑色蛍光標識）、およびＺＥＮ－３１ＡＢｋＦＱ消光剤）と共に列挙する。
以下の表１は、（（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ）および配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）による）遺伝子の名前の一覧を、それらの選択対象である癌タイプ（Ｂｒ：乳房、Ｌｕ：肺、Ｌｉ：肝、Ｐｒ：前立腺、Ｐａｎｃ：膵臓、Ｍｅｌ：メラノーマ）と共に提供する。加えて、各遺伝子について最適化されたプライマーの組（プライマー１および２）を、デジタルＰＣＲ産物を最適に可視化するための蛍光プライマープローブの構成（例えば、タグ付きプローブ用の６－ＦＡＭ（商標）（青色蛍光標識）またはＨＥＸ（商標）（緑色蛍光標識）、およびＺＥＮ－３１ＡＢｋＦＱ消光剤）と共に列挙する。
【0074】
【表1-1】
【0075】
【表1-2】
【0076】
【表1-3】
【0077】
【表1-4】
【0078】
【表1-5】
【0079】
【表1-6】
【0080】
ＰＲＡＭＥはＭＡＰＥ（腫瘍に好発現するメラノーマ抗原）、ＯＩＰ４（Ｏｐａ相互作用タンパク質ＯＩＰ４）、およびＣＴ１３０（癌／精巣抗原１３０）とも呼ばれることに留意されたい。
【0081】
以下の表２は、表１に列挙するプライマーによって標的化される領域を特異的に前増幅させるように設計された入れ子型プライマーを一覧にしたものである。
【0082】
【表2-1】
【0083】
【表2-2】
【0084】
【表2-3】
【0085】
ＣＴＣチップ産物からの遺伝子転写物の多重デジタル分析
ＣＴＣに由来する最小量のＲＮＡからの腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を向上させるために、本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物からの多様な遺伝子転写産物を試験することのできる多重検査を確立した。これは、独立した多数の遺伝子を使用することのより高い感度／特異性を、投入される鋳型の量が限られている（したがって多数の反応へと希釈されるべきでない）という事実と組み合わせるものである。本発明者らの検査は、１反応当たり４つの遺伝子を含み、各遺伝子は、様々な比率で蛍光結合プライマーを選択することによって独特に二次元空間に分解される。それゆえ、鋳型を希釈する必要なく、１回の反応で４つの遺伝子転写物を独立に測定することができる。種々の癌について本発明者らは最大で４つもの異なる反応（つまり、最大２０個の異なる遺伝子転写物）を行っており、入れ子式ＲＴ－ＰＣＲデジタル検査を適用すれば、実施できる反応の数に制限はない。
ＣＴＣに由来する最小量のＲＮＡからの腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を向上させるために、本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物からの多様な遺伝子転写産物を試験することのできる多重検査を確立した。これは、独立した多数の遺伝子を使用することのより高い感度／特異性を、投入される鋳型の量が限られている（したがって多数の反応へと希釈されるべきでない）という事実と組み合わせるものである。本発明者らの検査は、１反応当たり４つの遺伝子を含み、各遺伝子は、様々な比率で蛍光結合プライマーを選択することによって独特に二次元空間に分解される。それゆえ、鋳型を希釈する必要なく、１回の反応で４つの遺伝子転写物を独立に測定することができる。種々の癌について本発明者らは最大で４つもの異なる反応（つまり、最大２０個の異なる遺伝子転写物）を行っており、入れ子式ＲＴ－ＰＣＲデジタル検査を適用すれば、実施できる反応の数に制限はない。
【0086】
この多重式の方略は、多数の転写物の分析同士での理想的な均衡を達成する（したがって、癌細胞発現様式の異種変動から守る）ものであるが、独立した多数のＰＣＲ反応の実施によって投入材料が希釈されない。腫瘍タイプおよび、最適な信号に必要な遺伝子の数に応じて、本発明者らは、２～４重反応に及ぶ検査（４つの遺伝子に対して各々の多重反応）を開発した。それゆえ、投入される鋳型の不適切な希釈を行うことなく単一のＣＴＣの産物を、８～１６個のうちの任意個数の異なる遺伝子の発現について調べることができる。これらの遺伝子全てからの信号（すなわち累加信号）を加えることができる一方で、個々の遺伝子の結果を有する（そして、個々の遺伝子レベルでシグナル／ノイズを最適化し、また各遺伝子によって引き出される特異的なシグナル伝達経路からの情報（例えば、前立腺ＣＴＣでのアンドロゲンシグナル伝達）を集める）ことができることは、検査にとって重要なことである。
【0087】
多重反応の結果を単一の図で提示する（それゆえ各遺伝子の増幅を分離して区別する）ために、本発明者らは、２つの蛍光プローブ（ＦＡＭ（青色）およびＨＥＸ（緑色））の濃度を変化させた。こうすることによって、個々の遺伝子増幅反応のそれぞれが、遺伝子特異的プライマーの組成を反映する、したがって遺伝し特異的ＰＣＲ産物を識別する、ＦＡＭ／ＨＥＸ識別特徴の独特の組み合わせを有する。二次元空間に、単一の多重反応から生じた４つの異なる遺伝子増幅産物の信号位置を示すことができる。各ＰＣＲ反応をカプセル化する液滴を使用するデジタルＰＣＲに適用されるように、この方法は、定量的に示されるものである陽性液滴の二元信号振幅を改変することによって、標的を個々の集合体に分離する。予測されるとおり、この方法は、多数の遺伝子（例えば、合計４つの反応において１６個のマーカー）についての全信号の累加的採点だけでなく、個々の遺伝子標的のそれぞれからの信号を定量する能力の維持も可能にする。
【0088】
試験の具体的な結果は以下の実施例で詳述する。
ｄ－ＣＴＣ検査法の応用
外科的に切除または根絶することのできる時点での上皮癌の早期検出は、治癒の絶好の機会を提供し、最小限の癌播種の開始時における補助化学療法の投与は、確立された転移性疾患の処置に比べて治癒を得るのにはるかにより効果的である。しかしながら、早期癌検出の現在の取り組みは、特異性の欠如に悩まされている。例えば、血清ＰＳＡ測定を使用した男性の前立腺癌についての広範なスクリーニングは初期癌を発見するのに有効ではあるが、それは、はるかに数多くの非悪性前立腺症状（例えば、腺の良性の肥大）、さらには浸潤性になることが決してない緩慢性の癌さえも識別する。こういった事情から、広範なＰＳＡスクリーニングは公的医療機関によって推奨されていない、というのも、過剰診断による（死を含めた）合併症は早期癌検出の計算上の利点と競合的であるかまたはそれを上回るからである。
ｄ－ＣＴＣ検査法の応用
外科的に切除または根絶することのできる時点での上皮癌の早期検出は、治癒の絶好の機会を提供し、最小限の癌播種の開始時における補助化学療法の投与は、確立された転移性疾患の処置に比べて治癒を得るのにはるかにより効果的である。しかしながら、早期癌検出の現在の取り組みは、特異性の欠如に悩まされている。例えば、血清ＰＳＡ測定を使用した男性の前立腺癌についての広範なスクリーニングは初期癌を発見するのに有効ではあるが、それは、はるかに数多くの非悪性前立腺症状（例えば、腺の良性の肥大）、さらには浸潤性になることが決してない緩慢性の癌さえも識別する。こういった事情から、広範なＰＳＡスクリーニングは公的医療機関によって推奨されていない、というのも、過剰診断による（死を含めた）合併症は早期癌検出の計算上の利点と競合的であるかまたはそれを上回るからである。
【0089】
その他の癌、例えば乳癌の場合、マンモグラフィーが有効であると考えられているが、その場合でさえ、各々の真の悪性度を診断するために乳房生検が多数実施される。肺癌の場合、近年推奨されている、重度の喫煙履歴を有する個体の低線量ＣＴスキャンもまた、各々の真の悪性度について数百もの無害の放射線画像異常を検出する可能性がある。
【0090】
この文脈上、癌細胞由来の識別特徴の存在に関して血液に基づく極めて高感度な読み出しを追加することは、所要の特異性を提供することになるであろう。本明細書に記載のｄ－ＣＴＣ検査は、初期スクリーニングのためだけでなく、早期スクリーニングの事後確認としても用いることができる。例えば、ある場合には、高感度であるが非特異的なスクリーニング試験（例えば前立腺癌におけるＰＳＡ）を検証する第二次試験として検査を用いることができる。癌が非常に致命的であるがスクリーニング手法が現在存在していないその他の状況（例えば膵臓癌）では、本明細書に記載の検査を用いる慣例的な周期的血液スクリーニングは、患者の経時的な状態または容態をモニタリングする規範となり得る。
【0091】
新規ｄ－ＣＴＣ読み出しはまた、患者、例えば、特定タイプの癌の家族履歴および／または遺伝子マーカーを有する健常であると思われる患者の連続モニタリングにとって大いに妥当である。ＣＴＣの画像化は、必要な全てのマーカーについて適切に染色する無傷の細胞が単一の信号を生成するという点で、高い費用が掛かり、比較的感度が低い。（どれほど無傷であるかまたはアポトーシス前であるかに拘らず）各ＣＴＣが何百もの分子信号を生じることができる、本明細書に記載の新規ｄ－ＣＴＣ検査を用いることにより、既知の癌を有する患者のＣＴＣを検出およびモニタリングする能力および、治療介入に対するそれらの応答を定量的にモニタリングおよび分析する能力を劇的に向上させる。分子マーカーによる細胞数の採点の他に、かなりの感度で突然変異または癌関連の再編成（例えば、肺癌でのＥＭＬ４－ＡＬＫ）の特異的調査を達成することができる。
【0092】
血液試料中に存在するＣＴＣのデジタル式（定量的）手段を提供することに加えて、新規ｄ－ＣＴＣ検査は、血中の腫瘍細胞に独特である特異的シグナル伝達経路の分析も可能にする。例えば、前立腺系統特異的遺伝子のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＡ）が動因となるが、別のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＭＡ）によって抑制される。これらの遺伝子を一緒に分析することにより、ＣＴＣ内でのアンドロゲンシグナル伝達の状態を確認することができる。同様に、乳癌では、エストロゲン応答性遺伝子（例えばプロゲステロン受容体）の発現は、ＣＴＣ内でのエストロゲン応答経路の状態についての度合いを提供する。これらの測定は、前立腺癌および乳癌での治療介入がいずれもそれぞれアンドロゲン受容体およびエストロゲン受容体を標的とするために引き出されるものであるという点において、特に重要である。このように、臨床的経路の標的化および遮断における治療剤の有効性についての情報を同時に用いて血中のＣＴＣ信号の総数を定義することは治療モニタリングのために重要である。
【0093】
以下の実施例で述べるように、癌の進行を抑制するために抗アンドロゲン剤であるアビラトロン（例えば、ザイティガ（登録商標））が有効である前立腺癌、特に、アンドロゲン経路に未だ依存性である腫瘍において、本明細書に記載の新規方法を示す。
【実施例】
【0094】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、それは請求項の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【0095】
実施例１－デジタルＣＴＣ検査の予備的試験および検証
ＣＴＣチップ－液滴検査の実行可能性を試験するために、本発明者らはまず、前立腺腫瘍細胞では特異的に発現されるが混入している白血球には存在しないいくつかの転写物を選択した。これらは、前立腺系統特異的マーカーであるＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ；または前立腺特異的抗原すなわちＰＳＭＡ）、ＦＯＬＨ１（葉酸加水分解酵素；または前立腺特異的膜抗原すなわちＰＳＭＡ）およびＡＭＡＣＲ（アルファメチルアシルＣｏＡラセミ化酵素）ならびにＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）であった。ＰＣＲ条件は、イントロンにまたがるプライマーとＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルヴィル、アイオワ州）のＺＥＮ二重消光ＦＡＭ標識プローブとを使用して標準的なｑＰＣＲプロトコルに従って最適化した。系の動的範囲を調査するために、これらの条件をまず、癌細胞と白血球との混合物からカプセル化されたｃＤＮＡを使用して試験した。次に、個々の細胞を選択する手作業での単離技法を用いて、０個、３個、６個、１２個、２５個および１２５個の前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、ＨＤ血液の個々の５ｍｌ分取の中にスパイクし、続いてＣＴＣ－ｉチップ処理、ＲＴ－ＰＣＲおよび、ＲａｉｎＤｒｏｐシステムを使用した液滴カプセル化を行った。本発明者らは、ＫＬＫ３をこの実験の標的転写物として選択した、というのもそれは程よく豊富に存在することが予測されるからである。５，０００の強度閾値を用いて、本発明者らは、おおよそ２５０個の液滴でたった３個の細胞に値するＫＬＫ３転写物が容易に検出されることを見出した。
ＣＴＣチップ－液滴検査の実行可能性を試験するために、本発明者らはまず、前立腺腫瘍細胞では特異的に発現されるが混入している白血球には存在しないいくつかの転写物を選択した。これらは、前立腺系統特異的マーカーであるＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ；または前立腺特異的抗原すなわちＰＳＭＡ）、ＦＯＬＨ１（葉酸加水分解酵素；または前立腺特異的膜抗原すなわちＰＳＭＡ）およびＡＭＡＣＲ（アルファメチルアシルＣｏＡラセミ化酵素）ならびにＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）であった。ＰＣＲ条件は、イントロンにまたがるプライマーとＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（コーラルヴィル、アイオワ州）のＺＥＮ二重消光ＦＡＭ標識プローブとを使用して標準的なｑＰＣＲプロトコルに従って最適化した。系の動的範囲を調査するために、これらの条件をまず、癌細胞と白血球との混合物からカプセル化されたｃＤＮＡを使用して試験した。次に、個々の細胞を選択する手作業での単離技法を用いて、０個、３個、６個、１２個、２５個および１２５個の前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、ＨＤ血液の個々の５ｍｌ分取の中にスパイクし、続いてＣＴＣ－ｉチップ処理、ＲＴ－ＰＣＲおよび、ＲａｉｎＤｒｏｐシステムを使用した液滴カプセル化を行った。本発明者らは、ＫＬＫ３をこの実験の標的転写物として選択した、というのもそれは程よく豊富に存在することが予測されるからである。５，０００の強度閾値を用いて、本発明者らは、おおよそ２５０個の液滴でたった３個の細胞に値するＫＬＫ３転写物が容易に検出されることを見出した。
【0096】
これらの予備データに基づき、本発明者らは、転移性および限局性の前立腺癌を有する患者において健常対照と比較してＣＴＣチップ液滴検査を試験した。各試料をｉチップの中に流し、その後、上記４つの前立腺マーカー：ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１およびＥｐＣＡＭを使用してＣＴＣ含有産物を液滴ＲＴ－ＰＣＲの中に流した。局所性または転移性のいずれかの前立腺癌を有する患者は、ＨＤ対照と比較してより著しく高い陽性液滴計数を生じた。
【0097】
図１Ａは、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の全ＲＮＡから調製され、白血球と混和され、２つの異なる前立腺プライマー組を使用して液滴ＰＣＲによって分析された、ｃＤＮＡの希釈液を示す。結果はいくつかの純度を表し、この範囲に亘って陽性液滴数の良好な応答を示す。
【0098】
図１Ｂは、ＨＤ血液試料の中へスパイクされ、ＣＴＣｉチップの中に流され、液滴ＲＴ－ＰＣＲ（ＫＬＫ３プライマー組）に供された、手作業で単離されたＬＮＣａＰ細胞を示す。結果は、少数の標的細胞にまで至る優れた感度を示す。
【0099】
図１Ｃは、ＣＴＣ－ｉチップの中を通って処理され、３つの前立腺特異的なバイオマーカーおよび１つの上皮特異的なバイオマーカー（ＫＬＫ３、ＡＭＡＣＲ、ＦＯＬＨ１、ＥｐＣＡＭ）を使用するＲＴ－ＰＣＲおよび液滴分析に供された、健常対照、限局性の（切除可能な）前立腺癌および転移性の前立腺癌を有する患者からの血液試料の分析を示す。４つマーカー全てを合わせたときの液滴の総数／ｍｌの結果を示す。
【0100】
これらの結果は、ＣＴＣ－ｉチップに液滴に基づくＰＣＲ読み出しを適用することによって、生物学的検体中に存在する実質的に全てのＣＴＣを検出するその感度が著しく向上することを示唆している。まとめると、ＣＴＣ－ｉチップおよび液滴ＰＣＲは、互いに適合性が高く直列で一体化させて新規かつ高感度で正確な生体検査を作り出すことができる、２つの強力なマイクロ流体技術を表す。
【0101】
実施例２－デジタルＣＴＣ検査プロトコル
この実施例は、本明細書に記載の方法に使用できる一般的デジタルＣＴＣ検査プロトコルを提供する。本明細書中に記載されるいくつかの実施例では、この一般的プロトコルの様々な態様を用いた。例えば、以下に記載する（ＲＮＡ精製からｃＤＮＡ合成までに関する）プロトコルのステップ３の手法１を用いて、図１５Ａ～１５Ｃのデータが生成された。ステップ３の手法２を用いて図１９Ａ～２４Ｂのデータが生成された。
この実施例は、本明細書に記載の方法に使用できる一般的デジタルＣＴＣ検査プロトコルを提供する。本明細書中に記載されるいくつかの実施例では、この一般的プロトコルの様々な態様を用いた。例えば、以下に記載する（ＲＮＡ精製からｃＤＮＡ合成までに関する）プロトコルのステップ３の手法１を用いて、図１５Ａ～１５Ｃのデータが生成された。ステップ３の手法２を用いて図１９Ａ～２４Ｂのデータが生成された。
【0102】
１．患者の血液をＩ－チップ、バージョン１．３Ｍまたは１．４．５Ｔの中に流す。試料を氷上の１５ｍＬ円錐形チューブ内に回収する。
【0103】
２．４Ｃで試料の遠心沈殿を行う。上清を静かに移し、ペレットにＳＵＰＥＲａｓｅ（商標）Ｉｎ（ＤＴＴ非依存性ＲＮアーゼ阻害剤）＋ＲＮＡＬａｔｅｒ（登録商標）安定化溶液（ＲＮアーゼを阻害することによってＲＮＡ分解を防止するもの）を添加する。試料を瞬間凍結させ、さらなる処理を行うまで－８０のところに置く。試料は－８０で安定である。
【0104】
３．ＲＮＡ精製からｃＤＮＡ合成までは、以下に記載の実施例で用いた２つの異なる処理プロトコルが存在する。
【0105】
手法１
ａ．試料を氷上で解凍した。
ａ．試料を氷上で解凍した。
【0106】
ｂ．洗剤（ＮＰ４０、Ｔｗｅｅｎ２０）を使用した試料の直接溶解。
ｃ．溶解した試料をそのままｃＤＮＡ合成（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ）に使用した。
ｃ．溶解した試料をそのままｃＤＮＡ合成（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ）に使用した。
【0107】
ｄ．ｃＤＮＡ合成試料をＳＰＲＩ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズ）による浄化によって精製して洗剤およびあらゆる＜１００ｂｐのヌクレオチドを除去した。
【0108】
手法２
ａ．試料を氷上で解凍した。
ａ．試料を氷上で解凍した。
【0109】
ｂ．試料をＲＮｅａｓｙＱｉａｇｅｎＭｉｃｒｏＫｉｔで処理した。プロトコルは、従前のＱｉａｇｅｎの推奨と比較してわずかな変化を有する。より多い体積の緩衝剤ＲＬＴ（溶解用緩衝剤）を使用すると同時に、より高いＥＴＯＨ濃度を用いた。これらの改変は、試料にＲＮＡＬａｔｅｒ（登録商標）を添加するがゆえに行った。
【0110】
ｃ．ｃＤＮＡ合成後－試料をＳＰＲＩ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ）による浄化によって精製して洗剤およびあらゆる＜１００ｂｐのヌクレオチドを除去した。
【0111】
４．ｃＤＮＡ（アプローチ１または２により合成）は、２つの異なる方法で処理することができる：
ａ．ｃＤＮＡを直接、ｄｄＰＣＲに使用した；または
ｂ．Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法を用いてｃＤＮＡを増幅させた（入れ子式ＰＣＲに使用した遺伝子からのプライマーは事前に検証した）。増幅させたｃＤＮＡを希釈した。
ａ．ｃＤＮＡを直接、ｄｄＰＣＲに使用した；または
ｂ．Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＢｉｏＭａｒｋ（商標）入れ子式ＰＣＲ手法を用いてｃＤＮＡを増幅させた（入れ子式ＰＣＲに使用した遺伝子からのプライマーは事前に検証した）。増幅させたｃＤＮＡを希釈した。
【0112】
５．ｃＤＮＡ（ステップ４ａまたは４ｂから）、プローブとしてのＢｉｏｒａｄ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（商標）、（対象遺伝子のための）１つ以上のプライマー（４つ以下の異なるプライマー（ＦＡＭおよびＨＥＸ）を多重化することができる）を合計２２μｌの体積に添加した。
【0113】
６．液滴を生成させた（１ウェルあたり約１５，０００～１８，０００個の液滴）。
７．液滴試料をＰＣＲ機の中に入れた。ＰＣＲ条件はＢｉｏｒａｄの推奨とは異なっていた。本発明者らは、全ての液滴を確実に同じ温度にするために、緩やかな傾斜ではなく段階的降下を用いた。これは、ＲａｉｎＤａｎｃｅが用いるものともＢｉｏｒａｄが用いるものとも異なっている。勾配ではなく段階的降下を用いることによって、よりよい結果（すなわち、より大きな信号および、陽性液滴と陰性液滴との間でのより大きな分離）を得ることができる。
７．液滴試料をＰＣＲ機の中に入れた。ＰＣＲ条件はＢｉｏｒａｄの推奨とは異なっていた。本発明者らは、全ての液滴を確実に同じ温度にするために、緩やかな傾斜ではなく段階的降下を用いた。これは、ＲａｉｎＤａｎｃｅが用いるものともＢｉｏｒａｄが用いるものとも異なっている。勾配ではなく段階的降下を用いることによって、よりよい結果（すなわち、より大きな信号および、陽性液滴と陰性液滴との間でのより大きな分離）を得ることができる。
【0114】
８．ＰＣＲの後、陽性液体の数をｄｄＰＣＲ機で数えた。
９．データを収集し、ＴＩＢＣＯ（登録商標）Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）解析ソフトウェアを使用して解析した。
９．データを収集し、ＴＩＢＣＯ（登録商標）Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）解析ソフトウェアを使用して解析した。
【0115】
試薬、試薬濃度および反応体積を以下に示す：
試薬：
・プローブとしてのＢｉｏｒａｄ ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし）
・ＩＤＴプライマー／プローブ（２０倍濃縮または４０倍濃縮）
・ｃＤＮＡ（細胞株で１ｎｇ／ｕｌ）
・ヌクレアーゼ不含水
・エッペンドルフ セミスカート９６ウェルプレート（これらのプレートのみが機械で正常に機能する）
試験関連の細胞株
単一反応当たり：
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー（２０倍濃縮） １．１０μｌ
ｃＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ） １．１０μｌ
水 ８．８０μｌ
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ｃＤＮＡおよび水を含有するマスターミックスをウェル内へ分取し、各々１．１μｌのプライマーを各ウェルに加え、十分に混合した。
試薬：
・プローブとしてのＢｉｏｒａｄ ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし）
・ＩＤＴプライマー／プローブ（２０倍濃縮または４０倍濃縮）
・ｃＤＮＡ（細胞株で１ｎｇ／ｕｌ）
・ヌクレアーゼ不含水
・エッペンドルフ セミスカート９６ウェルプレート（これらのプレートのみが機械で正常に機能する）
試験関連の細胞株
単一反応当たり：
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー（２０倍濃縮） １．１０μｌ
ｃＤＮＡ（１ｎｇ／μｌ） １．１０μｌ
水 ８．８０μｌ
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ、ｃＤＮＡおよび水を含有するマスターミックスをウェル内へ分取し、各々１．１μｌのプライマーを各ウェルに加え、十分に混合した。
【0116】
患者試料
個々の遺伝子について単一反応当たり
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー（２０倍濃縮） １．１μｌ
ｃＤＮＡ（患者） ９．９μｌまで（満たない場合は水で釣り合わせる）
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
多数の遺伝子についての単一多重化反応当たり
ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １１．０μｌ
プライマー１（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー２（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー３（４０倍濃縮） ．５５μｌ
プライマー４（４０倍濃縮） ．５５μｌ
ｃＤＮＡ（患者） ８．８μｌ
合計 １ウェル当たり２２．０μｌ
遺伝子特異的プライマーに対して多数の患者を試験する場合、または多数の遺伝子に対して多重化するプライマーを試験する場合、ｄｄＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘとプライマーとを含むものであるマスターミックスをウェル内へ分取し、続いて各ウェルに患者ｃＤＮＡを加え、十分に混合した。
【0117】
実施例３－遺伝子検証のためのプロトコル
表１に列挙する特異的マーカー遺伝子を選択するために下記のプロトコルを用いた。
表１に列挙する特異的マーカー遺伝子を選択するために下記のプロトコルを用いた。
【0118】
１．ＣＴＣに対しては独特であるが白血球（ＷＢＣ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）などをバイオインフォマティクス的に徹底調査した。一次腫瘍およびＣＴＣの遺伝子発現データをＷＢＣ遺伝子発現データセットと比較して、一次腫瘍および／またはＣＴＣにのみ存在する転写物を探し出した。
【0119】
２．閾値カットオフを通過した転写物をｑＰＣＲによって検証した。
３．プライマーをＩＤＴによって合成した。プローブをＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱで標識した。
３．プライマーをＩＤＴによって合成した。プローブをＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱで標識した。
【0120】
４．ｑＰＣＲ検証には、２つの異なる細胞株、（ＣＰＴカラムにより単離された）５つの健常提供者ＷＢＣ、および陰性対照としての水に対して各転写物を少なくとも２つの独立したプライマー組によって検証することを要した。５０サイクルのｑＰＣＲを用いて、転写物の発現が細胞株にのみ存在し健常提供者に存在しないことを確認した。
【0121】
５．ｑＰＣＲ検証を通過した転写物を、ＣＴＣ－ｉチップを通過させる細胞株および健常提供者を用いたｄｄＰＣＲで（細胞のスパイクの有り無しで）検証した。
【0122】
６．対照の疾患に応じて転写物のパネルを（１反応当たり４つまでの遺伝子）多重化した。
【0123】
この方略の効力はスパイク細胞実験で以下に示されるが、スパイク細胞実験は、慎重に数を測定した（ＬＮＣＡＰ前立腺癌細胞株からの）腫瘍細胞を個々に顕微操作し、対照血液検体を添加し、ＣＴＣ－ｉチップに通してその後に上記のｄ－ＣＴＣ検査で分析するものであった。スパイクする細胞の数が増えると、図２に示すようにデジタル信号の数が増加を示し、それはこのプロトコルの能力を例証している。図２は、プローブとしての単一の遺伝子転写物（前立腺癌のＰＳＡとしても知られるＫＬＫ３）の使用を実証する（検査において本発明者らは８～２４個の遺伝子転写物を使用し、それによって感度をさらに向上させている）。ここで、本発明者らは、計算した数の癌細胞をスパイクする（各セルを顕微操作して選び、１０ｍｌの対照血液検体中に導入する）。その後、血液をＣＴＣチップに通して処理し、上記のデジタル読み出しに供する。単一の癌細胞でスパイクされた場合に血中に観察される信号は全くない。２細胞／血液１０ｍｌの投入は明確な信号（６５個の陽性液滴）を生成する。この場合、１０個のＣＴＣ産物を４つに分割して４重に流したため、６４個の液滴は実際には腫瘍細胞の１／４に由来するデジタル信号を表す。
【0124】
この検査は高感度だけでなく再現性も有する。図３に示すように、これらのスパイク細胞実験でのデジタル信号は、高い再現性を示し（ここでは２つの独立な反復を示している）、細胞を（血液でなく）緩衝液の中にスパイクして直接（ＣＴＣチップ処理なしで）分析した場合に同じ量の信号が見られる。したがって、腫瘍細胞を数十億個もの正常血液細胞の中に希釈し、その後にデジタル読み出しに先立ってＣＴＣチップを使用して「再単離」した場合、信号の損失は実質的に存在しない。
【0125】
実施例４－ＣＴＣチップ産物からの遺伝子転写物の多重デジタル分析
本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物から多くの異なる遺伝子転写物を試験することのできる多重検査を確立した。
本発明者らは、微少量のＣＴＣチップ産物から多くの異なる遺伝子転写物を試験することのできる多重検査を確立した。
【0126】
これは、独立した多数の遺伝子を使用することのより高い感度および特異性を、投入される鋳型の量が限られている（したがって多数の反応へと希釈されるべきでない）という事実と組み合わせたものである。
【0127】
新規検査は、１反応当たり多数の遺伝子、例えば、２個、３個、４個、６個、８個、１０個またはそれより多い遺伝子を含み、各遺伝子は、様々な比率で蛍光結合プライマーを選択することによって独特に二次元空間に分解される。それゆえ、鋳型を希釈する必要なく、１回の反応で２つ、３つ、４つまたはそれより多い遺伝子転写物を独立に測定することができる。種々の癌について、多数の異なる反応（例えば、４回の反応において最大２０個の異なる遺伝子転写物）を実行および分析することができ、入れ子式ＲＴ－ＰＣＲデジタル検査を適用すれば、実施できる反応の数に制限はない。
【0128】
多重反応の結果を１つの図で提示する（それゆえ各遺伝子の増幅を分離して区別する）ために、本発明者らは、２つの蛍光プローブ（ＦＡＭおよびＨＥＸ）の濃度を変化させた。こうすることによって、個々の遺伝子増幅反応のそれぞれが、遺伝子特異的プライマーの組成を反映する、したがって遺伝し特異的ＰＣＲ産物を識別する、ＦＡＭ／ＨＥＸ識別特徴の独特の組み合わせを有する。二次元空間に、単一の多重反応から生じた４つの異なる遺伝子増幅産物の信号位置を示すことができる。各ＰＣＲ反応をカプセル化する液滴を使用するデジタルＰＣＲに適用されるように、この方法は、定量的に示されるものである陽性液滴の二元信号振幅を改変することによって、標的を個々の集合体に分離する。予測されるとおり、この方法は、多数の遺伝子（例えば、合計４つの反応において１６個のマーカー）についての全信号の累加的採点だけでなく、個々の遺伝子標的のそれぞれからの信号を定量する能力の維持も可能にする。
【0129】
プローブ１：１００％ ＦＡＭ
プローブ２：１００％ ＨＥＸ
プローブ３：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
プローブ４：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
表３～７に示すように、多重反応において下記のプローブ混合物を使用した：
プローブ２：１００％ ＨＥＸ
プローブ３：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
プローブ４：ＦＡＭとＨＥＸとの混合物－合計１００％
表３～７に示すように、多重反応において下記のプローブ混合物を使用した：
【0130】
【表3】
【0131】
【表4】
【0132】
【表5】
【0133】
【表6】
【0134】
【表7】
【0135】
検証および試験
この多重方略の有効性を検証および実証するために、本発明者らは、（スパイク細胞実験を用いた）概念と患者由来の試料とを示した。図４は、健常提供者（ＨＤ）からの正常な対照血液試料をＣＴＣチップによって処理して４つの異なる遺伝子転写物（その全てが陰性（すなわちブランク液滴）である）についてｄーＣＴＣ検査に供した結果を示す。
この多重方略の有効性を検証および実証するために、本発明者らは、（スパイク細胞実験を用いた）概念と患者由来の試料とを示した。図４は、健常提供者（ＨＤ）からの正常な対照血液試料をＣＴＣチップによって処理して４つの異なる遺伝子転写物（その全てが陰性（すなわちブランク液滴）である）についてｄーＣＴＣ検査に供した結果を示す。
【0136】
他方、図５は、スパイク細胞実験から得たデータを表すものであり、当該実験では、前立腺癌細胞株を血中に導入してＣＴＣチップにより処理し、続いてデジタル検査を行い、４系統の転写物の各々について陽性信号（蛍光液滴）が示された。これらは、二次元プロットの中で、（写真では色付けされている）２つのプローブの蛍光の区別に基づいて別個の場所に現れた。試料は使用細胞が過剰に投入されているため、いくつかの液滴は１つ以上の遺伝子転写物からの信号を含んでいた（液滴１個あたり多数個ある遺伝子は灰色で示されている）。
【0137】
各反応において４つの異なる遺伝子を表す方略は、各腫瘍タイプの代わりに特異的系統マーカーを使用して多様な癌に適用可能であった。例えば、前立腺癌では、本発明者らは、２つの反応のそれぞれについて４つの四つ組（１つの四つ組当たり１つの遺伝子）を使用する多重反応の予測（理論モデル）をした（合計８つの遺伝子マーカー）。スパイク細胞実験（対照血液中に導入されＣＴＣ－ｉチップにより処理される前立腺癌細胞）は、予測された結果を正確に再現した。
【0138】
さらに、図６Ａ～６Ｂおよび図７Ａ～７Ｂは、まとめ合わせると、本発明の解析プログラムが全ての陽性信号をまさにモデリングから予測されるとおりに四半部内に統合し、特異的遺伝子信号の採点方法を本発明者らが開発するのを可能にした、ということを示している。信号の多次元空間解析は、高い精度レベルでの自動化された分析および採点を可能にした。図６Ａおよび６Ｂはそれぞれ反応１の前立腺癌細胞株についての理論モデルおよび実際の結果を示し、図７Ａおよび７Ｂはそれぞれ、反応２の同じ前立腺癌細胞株についての理論モデルおよび実際の結果を示す。
【0139】
図８Ａ～８Ｂ（乳癌および肺癌の理論および実際の結果、反応１）および図９Ａ～９Ｂ（乳癌および肺癌の理論および実際の結果、反応２）、図１０Ａ～１０Ｂ（同じ、反応３）、図１１Ａ～１１Ｂ（同じ、反応４）、図１２Ａ～１２Ｂ（同じ、反応５）、図１３Ａ～１３Ｂ（同じ、反応６）は、乳癌および肺癌に関して同じ手法を用いた場合の結果を示す。本発明者らは、以下（乳癌細胞と肺癌細胞との両方に関するスパイク細胞実験を用いる理論対検証）に示すように、殆どの腺癌で共有されている（つまり、乳癌と肺癌とをまとめ合わせる）マーカーを識別するのに有効な多重癌パネルを６つの反応（合計２４個のマーカーでは各反応に４つの遺伝子マーカー）として確立することができる。
【0140】
これらの図は、多数の遺伝子転写物を多重様式（１反応当たり４つの遺伝子）で試験する同じ手法を乳癌に適応した場合の結果を示す。（合計２４個の遺伝子転写物を独立に試験することを可能にする）６つの異なる反応を同じＣＴＣチップ産物に実施し、その各々を指定の（上のパネルで予測された）信号位置を有し、スパイク細胞検証実験で観察された（下のパネルで観察された）。
【0141】
実施例５－腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を改善する標的特異的な前増幅
腫瘍特異的ＲＮＡの検出を改善するために、遺伝子特異的増幅の各々について入れ子式ＰＣＲ方略を最適化した。これを成し遂げるために、ＣＴＣに由来するｃＤＮＡをまず、ｄ－ＣＴＣ検査に使用する遺伝子特異的プライマーの数塩基対外側に配置される遺伝子特異的プライマーで増幅した。各遺伝子について、２～３個のプライマー組を試験し、遺伝子特異的ｄ－ＣＴＣ検査プライマーに適合しておりかつＨＤ血液において試験結果が陰性であるプライマー組を患者試料の分析のために選択した。
腫瘍特異的ＲＮＡの検出を改善するために、遺伝子特異的増幅の各々について入れ子式ＰＣＲ方略を最適化した。これを成し遂げるために、ＣＴＣに由来するｃＤＮＡをまず、ｄ－ＣＴＣ検査に使用する遺伝子特異的プライマーの数塩基対外側に配置される遺伝子特異的プライマーで増幅した。各遺伝子について、２～３個のプライマー組を試験し、遺伝子特異的ｄ－ＣＴＣ検査プライマーに適合しておりかつＨＤ血液において試験結果が陰性であるプライマー組を患者試料の分析のために選択した。
【0142】
上記のとおり、標的特異的増幅プロトコルをまず、種々の癌に由来する細胞株で試験した。その後、血液と混ぜてＣＴＣ－ｉチップによって濃縮した癌細胞株の混合物を使用して腫瘍細胞に特異的な（かつ白血球には存在しない）プライマーの組み合わせを試験した。ＣＴＣ－ｉチップによって処理したＨＤ血液を対照として使用した。この方略にとって肝要なのは、正常血液細胞からのベースライン信号を増加させることなく微少量のＣＴＣ由来ｃＤＮＡからの信号を増強する入れ子式ＰＣＲ条件の考案である。この感度は、ＰＣＲプライマー配列および検査条件を慎重に最適化することならびに外部ＰＣＲと内部ＰＣＲとでサイクル数の釣り合いをとることによって達成された。全ての条件は、最初に生成核酸を使用して検証し、次に、対照血液試料中へスパイクされかつＣＴＣ－ｉチップによって処理された個々の腫瘍細胞を使用して検証し、次に、種々の健常血液提供者の広い（＞１０）パネルを使用して検証し、最終的に、転移性または限局性のいずれかである前立腺、乳房、メラノーマ、肝臓、肺または膵臓の癌を有する患者からの患者由来血液試料を使用して検証する。
【0143】
試薬
・ＤＮＡ懸濁用緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮＴ０２２１）
・０．５ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（インビトロジェン、ＰＮ Ａｍ９２６０Ｇ）
・ＴａｑＭａｎ前増幅マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３９１１２８）
・ヌクレアーゼ不含水（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮ Ｗ３３０）
１０倍濃縮の特異的標的増幅（ＳＴＡ）プライマー混合物の調製
１．）ＤＮＡ非存在フード内で、０．５μＬの２００μＭのプライマーの対の各々（０．５μＬの順方向プライマーおよび０．５μＬの逆方向プライマー）を混合した。
・ＤＮＡ懸濁用緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮＴ０２２１）
・０．５ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（インビトロジェン、ＰＮ Ａｍ９２６０Ｇ）
・ＴａｑＭａｎ前増幅マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ４３９１１２８）
・ヌクレアーゼ不含水（ＴＥＫｎｏｖａ、ＰＮ Ｗ３３０）
１０倍濃縮の特異的標的増幅（ＳＴＡ）プライマー混合物の調製
１．）ＤＮＡ非存在フード内で、０．５μＬの２００μＭのプライマーの対の各々（０．５μＬの順方向プライマーおよび０．５μＬの逆方向プライマー）を混合した。
【0144】
２．）各プライマーを１倍濃度のＤＮＡ懸濁用緩衝液中に希釈して終濃度を５００ｎＭとした。（例：プールされたプライマーの体積が８ｍＬに等しい場合には１９２ｍＬのＤＮＡ懸濁用緩衝液を添加する）
３．）混合物の渦流撹拌を２０秒間行い、遠心沈殿を３０秒間行った。
３．）混合物の渦流撹拌を２０秒間行い、遠心沈殿を３０秒間行った。
【0145】
４．）１０倍濃縮のＳＴＡプライマー混合物は繰り返し使用するために４℃で６ヶ月まで貯蔵することができ、または長期使用のために－２０℃で凍結貯蔵することができる。
【0146】
ＳＴＡ反応混合物の調製
１．）９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに下記の混合物を調製する。
１．）９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに下記の混合物を調製する。
【0147】
【表8】
【0148】
２．）６μＬのｃＤＮＡを９μＬのＳＴＡ反応混合物に添加する
３．）２０サイクルではなく１８サイクルの変性およびアニーリング／伸長ステップを用いて下記に一覧で示す熱サイクル条件を用いた（注：１８サイクルは、ＴＳＡ前増幅プロトコルを全トランスクリプトーム増幅と比較するために用いた）。
３．）２０サイクルではなく１８サイクルの変性およびアニーリング／伸長ステップを用いて下記に一覧で示す熱サイクル条件を用いた（注：１８サイクルは、ＴＳＡ前増幅プロトコルを全トランスクリプトーム増幅と比較するために用いた）。
【0149】
【表9】
【0150】
各液滴ＰＣＲ反応に１μｌの前増幅産物を投入する。
図１４は、１ｎｇの非増幅細胞株ｃＤＮＡならびに、１０、１４および１８サイクルの前増幅後の１μｌの前増幅産物から得られた、７つのマーカー（ＰＩＰ、ＰＲＡＭＥ、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＦＡＴ１、Ｓ１００Ａ２およびＡＧＲ２）の液滴ＰＣＲ信号を示す。さらなるサイクルの前増幅は信号の増加をもたらす。注目すべきことに、この細胞株において非常に低レベルで発現されるマーカーであるＰＲＡＭＥは、１８サイクルの前増幅の後にのみ検出され、当該技法の有用性を実証している。
図１４は、１ｎｇの非増幅細胞株ｃＤＮＡならびに、１０、１４および１８サイクルの前増幅後の１μｌの前増幅産物から得られた、７つのマーカー（ＰＩＰ、ＰＲＡＭＥ、ＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＦＡＴ１、Ｓ１００Ａ２およびＡＧＲ２）の液滴ＰＣＲ信号を示す。さらなるサイクルの前増幅は信号の増加をもたらす。注目すべきことに、この細胞株において非常に低レベルで発現されるマーカーであるＰＲＡＭＥは、１８サイクルの前増幅の後にのみ検出され、当該技法の有用性を実証している。
【0151】
実施例６－臨床データおよび検査検証
臨床研究からの実際の患者試料を使用して本明細書に記載の検査を検証した。これらは、転移癌（肺、乳房、前立腺およびメラノーマ）を有する患者および限局癌（前立腺）を有する患者を含む。検査は実施例２～５に記載されているとおりに行った。
臨床研究からの実際の患者試料を使用して本明細書に記載の検査を検証した。これらは、転移癌（肺、乳房、前立腺およびメラノーマ）を有する患者および限局癌（前立腺）を有する患者を含む。検査は実施例２～５に記載されているとおりに行った。
【0152】
図１５Ａ、ＢおよびＣは、肺（６人の患者；図１５Ａ）、乳房（６人の患者；図１５Ｂ）および前立腺（１０人の患者；図１５Ｃ）の転移癌を有する患者からの臨床検査の概要により、実質的に全ての患者は陽性信号を有するがその一方で健常対照はそれを全く有しないことが示されたことを示す。この検査では、全ての陽性点数を足し合わせた（累加点数）。しかしながら、以下に記載するように、点数を個々の遺伝子によって図１６に示すように分解することもできる。
【0153】
図１６は、多数のプローブからのデータの累加的な解析を例示するものであり、１０／１１の転移性前立腺癌患者（患者１人当たりの基準では９１％）および０／１２（０％）の健常対照での陽性信号を示す。試料１つ当たりの基準では２８個のうち２４個の試料が陽性信号を有し、８６％の検出率を示していた。さらに、いくつかの個々のマーカーはかなり効果的であり、例えば、ＡＧＲ２（転移癌については９／１０の検出、および限局癌については０／３の検出）、ＴＭＰＲＳＳ２（５／１０および１／３）、ＫＬＫ２（６／１０および０／３）、ＳＴＥＡＰ２（１／１０および１／３）、ＦＡＴ１（２／１０および１／３）およびＦＯＬＨ１（３／１０および１／３）となった。
【0154】
上に示したように、上記の多重蛍光色体系を用いて、独立した検証および定量のために個々の遺伝子マーカーを分解することもできる。以下のこの実施例では、転移性前立腺癌を有する患者は多数の陽性マーカーを有し、限局性前立腺癌を有する患者はより少ないマーカーのより少ない数の陽性点数を有し、健常対照は全てのマーカーについて陰性である。
【0155】
図１７は、３つの代表的な患者試料からの臨床データを示す。各々４つの遺伝子転写物（合計８つのプローブ）を使用する２つの個別の反応において転移性前立腺癌を有する患者の血液試料は、多数の信号を示した（全てのプローブは様々な程度で陽性である）。対照的に、限局性（治癒可能な）前立腺癌を有する患者の血液試料はより弱い（しかし明確に検出できる）信号を示した。プローブ１（ＴＭＰＲＳＳ２）、５（ＫＬＫ３）、６（ＨＯＸＢ１３）、７（ＡＧＲ２）は、転移癌患者において最も強い信号を有しており、プローブ２（ＦＡＴ１）および４（ＳＴＥＡＰ２）は、限局癌患者において最も陽性であった。この結果は、血中の癌細胞における信号の異種性、および検査の中で差異のある信号を詳細に分析することの重要性を明確に例証している。（癌患者試料と等しく処理された）ＨＤ対照からの血液は、信号が全く存在していなかった。
【0156】
実施例７－ＣＴＣ内でのシグナル伝達経路の測定
血液試料中に存在するＣＴＣのデジタル式（定量的）手段を提供することに加えて、本発明者らのｄ－ＣＴＣ検査は、血中の腫瘍細胞に独特である特異的シグナル伝達経路の分析も可能にする。例えば、前立腺系統特異的遺伝子のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＡ）が動因となったが、別のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＭＡ）によって抑制された。これらの遺伝子を一緒に分析することにより、ＣＴＣ内でのアンドロゲンシグナル伝達の状態を確認することができる。必須経路の標的化および遮断における治療剤の有効性についての情報を同時に用いて血中のＣＴＣ信号の総数を定義することは治療モニタリングのために重要である。
血液試料中に存在するＣＴＣのデジタル式（定量的）手段を提供することに加えて、本発明者らのｄ－ＣＴＣ検査は、血中の腫瘍細胞に独特である特異的シグナル伝達経路の分析も可能にする。例えば、前立腺系統特異的遺伝子のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＡ）が動因となったが、別のサブセットはアンドロゲンシグナル伝達（例えばＰＳＭＡ）によって抑制された。これらの遺伝子を一緒に分析することにより、ＣＴＣ内でのアンドロゲンシグナル伝達の状態を確認することができる。必須経路の標的化および遮断における治療剤の有効性についての情報を同時に用いて血中のＣＴＣ信号の総数を定義することは治療モニタリングのために重要である。
【0157】
本発明者らはこの概念を、抗アンドロゲン剤であるアビラトロンが癌進行の抑制に有効である前立腺癌、特に、アンドロゲン経路に未だ依存性である腫瘍において例証してきた。以下に、第一線のリュープロリドに対してもはや応答性でない「去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）」を有しアビラテロンで処置された患者の結果を示した。アンドロゲン応答マーカー（緑色）は、初期の有効性を示す療法によって最初に抑制されたが、後に腫瘍が抵抗性になるにつれて回復し、患者はこの薬剤で疾患が進行する。
【0158】
図１８は、転移性前立腺癌を有する患者の臨床研究の結果を提供する。「アンドロゲン受容体に起因する遺伝子（ＡＲオン）」からの信号のサブセットはこの棒グラフのバーの上部に緑色で示され、その一方で「アンドロゲンで抑制される遺伝子（ＡＲオフ）」は各バーの下部に赤色で示される。患者はアンドロゲン経路阻害剤であるアビラトロン（例えばザイティガ（登録商標）（酢酸アビラテロン）で処置されているため、ＡＲオン信号は大きく低減され、血中の癌細胞内でアンドロゲン経路が効果的に抑制されることを示している。しかし、薬物処置の第４サイクルまでにアンドロゲン経路は癌細胞において再活性化されると見受けられ（増加している緑色信号）、薬物抵抗性を指し示している。これらの時点において行われた血清ＰＳＡ測定結果は、薬物処置の失敗と一致する。
【0159】
実施例８－腫瘍特異的ｍＲＮＡの検出を改善する非特異的前増幅
実施例５と同様に、非特異的全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を用いてＣＴＣ特異的転写物の検出率を向上させることができる。この方法は、対象標的だけでなく産物中に見つかるあらゆる伝達を増幅させるランダムなプライマーの使用に依拠する。この実施例では、下記のとおりＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＲＮＡキットプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
実施例５と同様に、非特異的全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を用いてＣＴＣ特異的転写物の検出率を向上させることができる。この方法は、対象標的だけでなく産物中に見つかるあらゆる伝達を増幅させるランダムなプライマーの使用に依拠する。この実施例では、下記のとおりＳＭＡＲＴｅｒ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＲＮＡキットプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。
【0160】
ＲＮＡをＰＣＲ用のチューブまたはプレートに移す
１）１：５０，０００に希釈された１ｕＬのＥＲＣＣ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ Ｍｉｘ １を各試料に添加する
２）各試料の体積を１０ｕＬに増やす
３）１ｕＬの３’ＳＭＡＲＴ ＣＤＳプライマーＩＩＡを各試料に添加する
４）熱サイクル機の「７２Ｃ」プログラムを実行する：
７２℃ ３分
４°Ｃ 永遠
第一鎖ｃＤＮＡマスターミックス（ＦＳＭ）：
１倍濃度で４ｕＬ ５倍濃縮の第一鎖用緩衝液
０．５ｕＬ ＤＴＴ
１ｕＬ ｄＮＴＰ混合物
１ｕＬ ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩＡオリゴヌクレオチド
０．５ｕＬ ＲＮアーゼ阻害剤
２ｕＬ ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ
１試料当たり９ｕＬ
５）試料個数分のＦＳＭを１０％過剰に調製し、次いで９ｕＬのＦＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
６）熱サイクル機の「ｃＤＮＡ」プログラムを実行する：
４２℃ ９０分
７０℃ １０分
４°Ｃ 永遠
第二鎖合成および増幅（ＳＳＭ）：
１倍濃度で２５ｕＬ ２倍濃縮のＳｅｑＡｍｐ ＰＣＲ用緩衝液
１μＬ プライマーＩＩＡ－ｖ３
１μＬ ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ
３ｕＬ ヌクレアーゼ不含水 １試料当たり３０ｕＬ
７）試料個数分のＳＳＭを１０％過剰に調製し、次いで３０ｕＬのＳＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
８）熱サイクル機の「ＰＣＲ」プログラムを実行する：
９５℃ １分
Ｘサイクル
９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
６８℃ ３分
７２℃ １０分
４℃ 永遠
サイクルの回数はＲＮＡ投入量に応じて調節することができる（例えば、単一の細胞には１８サイクル、または１０ｎｇのＲＮＡ投入量では９サイクル）。加えて、４℃の停止点は一晩である。
１）１：５０，０００に希釈された１ｕＬのＥＲＣＣ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ Ｍｉｘ １を各試料に添加する
２）各試料の体積を１０ｕＬに増やす
３）１ｕＬの３’ＳＭＡＲＴ ＣＤＳプライマーＩＩＡを各試料に添加する
４）熱サイクル機の「７２Ｃ」プログラムを実行する：
７２℃ ３分
４°Ｃ 永遠
第一鎖ｃＤＮＡマスターミックス（ＦＳＭ）：
１倍濃度で４ｕＬ ５倍濃縮の第一鎖用緩衝液
０．５ｕＬ ＤＴＴ
１ｕＬ ｄＮＴＰ混合物
１ｕＬ ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩＡオリゴヌクレオチド
０．５ｕＬ ＲＮアーゼ阻害剤
２ｕＬ ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴ
１試料当たり９ｕＬ
５）試料個数分のＦＳＭを１０％過剰に調製し、次いで９ｕＬのＦＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
６）熱サイクル機の「ｃＤＮＡ」プログラムを実行する：
４２℃ ９０分
７０℃ １０分
４°Ｃ 永遠
第二鎖合成および増幅（ＳＳＭ）：
１倍濃度で２５ｕＬ ２倍濃縮のＳｅｑＡｍｐ ＰＣＲ用緩衝液
１μＬ プライマーＩＩＡ－ｖ３
１μＬ ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ
３ｕＬ ヌクレアーゼ不含水 １試料当たり３０ｕＬ
７）試料個数分のＳＳＭを１０％過剰に調製し、次いで３０ｕＬのＳＳＭを各試料に添加し、ピペット操作で混合する
８）熱サイクル機の「ＰＣＲ」プログラムを実行する：
９５℃ １分
Ｘサイクル
９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
６８℃ ３分
７２℃ １０分
４℃ 永遠
サイクルの回数はＲＮＡ投入量に応じて調節することができる（例えば、単一の細胞には１８サイクル、または１０ｎｇのＲＮＡ投入量では９サイクル）。加えて、４℃の停止点は一晩である。
【0161】
固相可逆固定（ＳＰＲＩ）による精製：
ＰＣＲ産物をｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフに移し、第２組のチューブに試料ＩＤのラベルを付け；最終的に溶離させるときまで室温でＳＰＲＩプロトコルを行う
９）ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰビーズ［４度］を室温で少なくとも３０分間保温する
１０）十分な量の溶離用緩衝液が解凍されて室温であることを確認する
１１）８０％エタノールを作る（１試料当たり少なくとも４００ｕＬ）
１２）５０ｕＬのビーズを各試料に添加する前に、十分に混合すべくピペット操作を上下に５～１０回行ってビーズの十分な渦流撹拌を行う。注：ビーズをピペットで採取するときには、体積のよりよい制御および先端でのより少ないビーズの付着のためにＲＰＴ先端具を使用することが賢明である
１３）試料を室温で５分間保温する
１４）試料を磁石の上に置き、５分間静置する
１５）ビーズを乱さずに上清（約９５ｕＬ）をピペットで吸い出す（ピペット先端が褐色になっているか確認し、相当な量のビーズの損失があればチューブに戻す）
１６）２００ｕＬの８０％エタノールで２回洗浄する－ビーズペレットを混合または撹乱しないこと。
ＰＣＲ産物をｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフに移し、第２組のチューブに試料ＩＤのラベルを付け；最終的に溶離させるときまで室温でＳＰＲＩプロトコルを行う
９）ＡＭＰｕｒｅ（商標）ＸＰビーズ［４度］を室温で少なくとも３０分間保温する
１０）十分な量の溶離用緩衝液が解凍されて室温であることを確認する
１１）８０％エタノールを作る（１試料当たり少なくとも４００ｕＬ）
１２）５０ｕＬのビーズを各試料に添加する前に、十分に混合すべくピペット操作を上下に５～１０回行ってビーズの十分な渦流撹拌を行う。注：ビーズをピペットで採取するときには、体積のよりよい制御および先端でのより少ないビーズの付着のためにＲＰＴ先端具を使用することが賢明である
１３）試料を室温で５分間保温する
１４）試料を磁石の上に置き、５分間静置する
１５）ビーズを乱さずに上清（約９５ｕＬ）をピペットで吸い出す（ピペット先端が褐色になっているか確認し、相当な量のビーズの損失があればチューブに戻す）
１６）２００ｕＬの８０％エタノールで２回洗浄する－ビーズペレットを混合または撹乱しないこと。
【0162】
単純にビーズペレットをエタノールに３０秒間浸し、その後にエタノールを除去する。エタノール洗浄の合間にビーズペレットが乾燥しないようにすること。
【0163】
１７）ビーズペレットの光沢がもはやなくなるまで（但しそれらが割れる前に）磁気ラック上で試料を風乾する。乾燥中、底に溜まる残留エタノールをピペットで取り除く（注：乾燥時間は増幅後のＤＮＡ濃度に大いに依存する可能性がある）。単一細胞レベルのＲＮＡ投入量では乾燥に通常３～５分間掛かる一方、その他のＩＦＤ産物試料は１時間まで掛かった。
【0164】
１８）ペレットを、それらが割れ始める時に１７ｕＬの溶離用緩衝液中で溶離させる。試料を磁石から取り外し、全てのビーズが溶液中に入るまでペレットの上に緩衝液をピペットで加え；その後、ピペット操作で混合してビーズを完全に再懸濁させる（これは効果の程度が各試料で異なるであろう）。激しく混合し過ぎないようにすること、というのも、これは、達成可能な溶離体積を低下させる傾向にある気泡を多く作り出すからである。
【0165】
１９）再懸濁させた試料を室温で少なくとも２分間保温し、その後、全ての試料を高速旋回させる。
【0166】
２０）試料を磁気ラック上に戻して５分間置く。
２１）約１５ｕＬの溶離した増幅ｃＤＮＡをピペットで吸い取り、ピペット先端にビーズがあるか確認する。ビーズが存在しているならば、ピペットで溶液をビーズペレットの上に戻し、溶離をもう１回試みる前に約１分間静置する。そうでなければ、新しいｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフ、ＰＣＲチューブまたは９６ウェルＰＣＲプレートの中に保存する。注：溶離産物中に繰り返しビーズが入るようであれば、吸入体積を１４ｕＬ以下にすることが唯一の解決策となり得る。
２１）約１５ｕＬの溶離した増幅ｃＤＮＡをピペットで吸い取り、ピペット先端にビーズがあるか確認する。ビーズが存在しているならば、ピペットで溶液をビーズペレットの上に戻し、溶離をもう１回試みる前に約１分間静置する。そうでなければ、新しいｌｏ－ｂｉｎｄ１．５ｍＬエッペンドルフ、ＰＣＲチューブまたは９６ウェルＰＣＲプレートの中に保存する。注：溶離産物中に繰り返しビーズが入るようであれば、吸入体積を１４ｕＬ以下にすることが唯一の解決策となり得る。
【0167】
この全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）手法は最初に、種々の癌に由来する細胞株で試験した。図１９Ａおよび１９Ｂは、３回の異なる反復のＳＭＡＲＴｅｒで前増幅した、肝臓癌細胞株（ＨＥＰＧ２）由来のｃＤＮＡ（１８サイクル）を、肝臓癌パネルからの１２個のプローブで分析したものを示す。図１９Ａに示すように、各標的領域の増幅効率は異なるがそれは３回の反復（ＷＴＡ１、ＷＴＡ２、ＷＴＡ３）の間で一致しており、この手法の再現性を実証している。図１９Ｂに示すように、１８サイクルのＳＭＡＲＴｅｒ前増幅を用いるこれらの方法は、おおよそ４桁（１０８対１０４）の信号の増大をもたらし、検出の著しい強化をもたらす。
【0168】
実施例９－肝臓癌の多重対個別マーカー検査
各試料のために各患者から１０～２０ｍＬの血液を採取した。血液を到着から３時間以内に、負枯渇モードで流しているＣＴＣ－ｉチップで処理した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ｐｌｕｓマイクロキットを使用して産物からＲＮＡを抽出し、取得可能な１７ｕＬのうちの５ｕＬを、ＣｌｏｎＴｅｃｈのｖ３ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）方略を用いて増幅させた。その後、ＷＴＡ産物の１％をデジタルＰＣＲプレートの各ウェルの中に投入し、５００ｎＭのＴａｑｍａｎ（商標）プライマー／プローブ合剤を使用して対象の各遺伝子について転写物濃度を決定した。転写物計数を血液体積に規格化してＨＣＣ、ＨＤおよびＣＬＤの患者同士で比較した。ＨＣＣ患者は、生検確認済の未切除肝細胞癌腫として定義され、ＣＬＤ患者は、超音波／ＭＲＩが陰性である、様々な病因（アルコール媒介性、ＨＢＶ、ＨＣＶ）の肝臓疾患を有する患者である。ＨＤは、１０～２０ｍＬの血液を提供する、研究所外の健常提供者である。
各試料のために各患者から１０～２０ｍＬの血液を採取した。血液を到着から３時間以内に、負枯渇モードで流しているＣＴＣ－ｉチップで処理した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（商標）ｐｌｕｓマイクロキットを使用して産物からＲＮＡを抽出し、取得可能な１７ｕＬのうちの５ｕＬを、ＣｌｏｎＴｅｃｈのｖ３ ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）方略を用いて増幅させた。その後、ＷＴＡ産物の１％をデジタルＰＣＲプレートの各ウェルの中に投入し、５００ｎＭのＴａｑｍａｎ（商標）プライマー／プローブ合剤を使用して対象の各遺伝子について転写物濃度を決定した。転写物計数を血液体積に規格化してＨＣＣ、ＨＤおよびＣＬＤの患者同士で比較した。ＨＣＣ患者は、生検確認済の未切除肝細胞癌腫として定義され、ＣＬＤ患者は、超音波／ＭＲＩが陰性である、様々な病因（アルコール媒介性、ＨＢＶ、ＨＣＶ）の肝臓疾患を有する患者である。ＨＤは、１０～２０ｍＬの血液を提供する、研究所外の健常提供者である。
【0169】
図２０Ａ～２０Ｃは、２１人の肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者（図２０Ａ）、１３人の慢性肝臓疾患（ＣＬＤ）患者（図２０Ｂ）および１５人の健常提供者（ＨＤ）（図２０Ｃ）における液滴総数を示す。ＨＣＣ患者はＣＬＤおよびＨＤのどちらと比べてもより多い数の液滴を示し、パネルから高リスクＣＬＤ群がかなり取り除かれていることおよび、パネルを用いてそれらの患者を肝臓癌の発症に関してスクリーニングできることを示唆している。これは、現在診療所で利用可能な肝臓癌のためのスクリーニング方法ｃの特異性が低いことを考慮すれば重要な結果である。ＣＬＤ患者についてアメリカ肝臓病協会は、６ヶ月毎の超音波（ＵＳ）（詳細なアルゴリズムは、検出される肝臓病巣の大きさに依存する）を推奨している。中国において、ＡＦＰ遺伝子マーカーと超音波スクリーニングとの有望な組み合わせは、スクリーニングされた母集団がたった６０％の遵守率を維持した場合でさえ、スクリーニングされた人が、スクリーニングされなかった人に比べて死亡率の３７％の得をする、ということを実証した。
【0170】
各検査の感度および特異性は、「罹患」対「非罹患」を定義するために選択される閾値に依存するが、２０ｕｇ／Ｌを用いて、ＡＦＰ遺伝子マーカーは５０～８０％の感度および８０～９０％の特異性を有する。２０ｎｇ／ｍｌをカットオフ点として用いる研究では、感度は７８．９％に上昇するが、特異性は７８．１％に落ち込む（Ｔａｋｅｔａ、Ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８９；３３：１３８０）。他方、本発明の検査は、患者の臨床履歴を考慮に入れ、かつ根治的切除または肝臓移植を受けた者について補正した場合、全体的な検出率が７６％であり、特異性が１００％であった。
【0171】
さらに、本明細書において用いられる肝臓癌検査の１１個のマーカーは全て、７６％の感度に寄与したが、上位５つのマーカー（ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＰＯＨ、ＦＧＢおよびＦＧＧ）はそれら自体で７０％の感度を有し、その一方で上位３つのマーカーのみ（ＡＬＢ、ＦＧＢ、ＦＧＧ）では６７％の感度を生じる。ＡＬＢ単独では症例の５６％を検出した。
【0172】
実施例１０－肺癌についての多重対個別マーカー検査
８人の転移性肺患者および８人の健常提供者の血液試料を、先に記載したようにＣＴＣチップに通して処理した。試料に遠心沈殿を行い、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。ＲＮＡを精製し、記載したようにｃＤＮＡを合成した。６μｌのｃＤＮＡおよび図中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマーを使用して各試料に対してＳＴＡを実施した。各液滴ＰＣＲ反応につき１μｌのＳＴＡ産物を投入した。
８人の転移性肺患者および８人の健常提供者の血液試料を、先に記載したようにＣＴＣチップに通して処理した。試料に遠心沈殿を行い、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。ＲＮＡを精製し、記載したようにｃＤＮＡを合成した。６μｌのｃＤＮＡおよび図中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマーを使用して各試料に対してＳＴＡを実施した。各液滴ＰＣＲ反応につき１μｌのＳＴＡ産物を投入した。
【0173】
液滴数を血液体積に正規化した。図２１Ａおよび２１Ｂに示すように、多重化した肺遺伝子マーカーのパネルは、８人の健常提供者のバックグラウンドを上回る転移性肺癌患者試料を１００％（８／８）検出することができた。肺パネルの各マーカーの感度もまた決定したところ、結果は、ＳＦＲＰの検出率が８／８であり、ＦＡＴ１プローブ２の検出率が７／８であり、ＴＭＰＲＳＳ４の検出率が６／８であり、ＦＯＸＦ１およびＡＲＧ２、プローブ２の検出率が５／８であり、ＦＡＴ１の検出率が４／８であり、ＦＡＴ２およびＡＧＲ２の検出率が３／８であり、ＦＡＴ２、プローブ２の検出率が２／８であったことを示している。
【0174】
ＳＥＲＰＩＮＡ３およびＳＦＲＰ２の検査は、ＳＦＲＰ２が肺癌および乳癌のどちらの検出にも有効であることを指し示したが、他方で前者は、乳癌検出に対してより特異的であるがいくつかの肺癌試料も検出すると見受けられる。
【0175】
実施例１１－乳癌についての多重対個別マーカー検査
９人の転移性乳癌患者、５人の限局性乳癌患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。図２２中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマー（ＦＡＴ２、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＰＧＲ、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｓ１００Ａ２、ＦＡＴ１、ＡＧＲ２、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３およびＰＩＰ）を使用して各試料から６μｌのｃＤＮＡをＳＴＡ増幅した。液滴数を血液体積に正規化し、各マーカーについて、最も高い健常提供者の値を患者試料の値から差し引いた。
９人の転移性乳癌患者、５人の限局性乳癌患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。図２２中に列挙されるプローブに対応する入れ子型プライマー（ＦＡＴ２、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＰＧＲ、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２Ｃ、Ｓ１００Ａ２、ＦＡＴ１、ＡＧＲ２、ＰＫＰ３、ＲＮＤ３およびＰＩＰ）を使用して各試料から６μｌのｃＤＮＡをＳＴＡ増幅した。液滴数を血液体積に正規化し、各マーカーについて、最も高い健常提供者の値を患者試料の値から差し引いた。
【0176】
図２２は、各患者についてのバックグラウンドより上の信号を示す。これらの方法は、７／９（７８％）の転移性試料および２／５（４０％）の限局性試料を検出した。各マーカー単独での感度は１／１４～６／１４で変動し、最も関連のある２つのマーカーはＡＧＲ２（６／１４）およびＦＡＴ１（５／１４）であり、その次に最も関連のある４つのマーカーはＲＮＤ３、ＰＫＰ３、ＰＲＡＭＥおよびＳＣＧＢ２Ａ１（それぞれ３／１４）であった。
【0177】
実施例１２－転移性乳癌におけるＡＶＲ７検出
１０人の転移性乳癌患者、７人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。６μｌの未増幅ｃＤＮＡを各液滴ＰＣＲ反応に投入した。試料は、アンドロゲン受容体のｖ７アイソフォーム（ＡＲｖ７、配列は表１中）に対するプローブを使用して分析した。液滴数を血液体積に正規化した。
１０人の転移性乳癌患者、７人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで保存した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。６μｌの未増幅ｃＤＮＡを各液滴ＰＣＲ反応に投入した。試料は、アンドロゲン受容体のｖ７アイソフォーム（ＡＲｖ７、配列は表１中）に対するプローブを使用して分析した。液滴数を血液体積に正規化した。
【0178】
図２３Ａに示すように、ＡＲｖ７は５／１０の患者（５０％）においてバックグラウンド（ＨＤ）レベルを超えて検出され、検査が好結果にＡＲｖ７を液体生検から検出することを実証した。患者のうちの１人は三重陰性乳癌を有しており、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）との関連（例えば、３つの最も一般的な乳癌マーカーであるエストロゲン受容体（ＥＲ）マーカー、ＨＥＲ２／ｎｅｕマーカーおよびプロゲステロン受容体（ＰＲ）マーカーのいずれかの遺伝子を発現しない患者）においてさえＡＲｖ７がマーカーとして有用であることが示唆された。
【0179】
実施例１３－メラノーマについての多重対個別マーカー検査
（各々多数の描点（合計描点：１８２）を有する）３４人の転移性または切除不可能なメラノーマ患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで瞬間凍結した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。図２４Ａ中のグラフの下部に沿って列挙されているプローブに対応する入れ子型プライマー（個々のマーカーはＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２ＣおよびＳＯＸ１０））を使用して、各試料から１２μｌのｃＤＮＡを特異的標的増幅（１０サイクル）によって増幅させた。液滴数を血液体積に正規化した。図２４Ｂは、健常提供者と比較した場合のメラノーマ患者において検出された液滴信号のドットプロット分布図を示す。全患者の描点について検出感度は８１％であった（患者の描点は、６つのマーカーのうち任意の１つが、その特定マーカーについてのＨＤでの最も高いバックグラウンド信号を上回る液滴信号を示す場合に、陽性に採点される）。個々のマーカーのうち、ＰＭＥＬおよびＭＬＡＮＡは最も高い検出率を示した。
（各々多数の描点（合計描点：１８２）を有する）３４人の転移性または切除不可能なメラノーマ患者および１５人の健常提供者からの血液試料をＣＴＣチップに通して処理した。産物をペレット化し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）で処理し、－８０Ｃで瞬間凍結した。先に記載したように各試料からＲＮＡおよびｃＤＮＡを調製した。図２４Ａ中のグラフの下部に沿って列挙されているプローブに対応する入れ子型プライマー（個々のマーカーはＰＭＥＬ、ＭＬＡＮＡ、ＭＡＧＥＡ６、ＰＲＡＭＥ、ＴＦＡＰ２ＣおよびＳＯＸ１０））を使用して、各試料から１２μｌのｃＤＮＡを特異的標的増幅（１０サイクル）によって増幅させた。液滴数を血液体積に正規化した。図２４Ｂは、健常提供者と比較した場合のメラノーマ患者において検出された液滴信号のドットプロット分布図を示す。全患者の描点について検出感度は８１％であった（患者の描点は、６つのマーカーのうち任意の１つが、その特定マーカーについてのＨＤでの最も高いバックグラウンド信号を上回る液滴信号を示す場合に、陽性に採点される）。個々のマーカーのうち、ＰＭＥＬおよびＭＬＡＮＡは最も高い検出率を示した。
【0180】
その他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の記載が例示を意図したものであり、別記の特許請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない、ということは理解されるべきである。その他の態様、利点および変化形態は添付の特許請求の範囲に含まれる。
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の記載が例示を意図したものであり、別記の特許請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない、ということは理解されるべきである。その他の態様、利点および変化形態は添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【配列表】