特許 7146397 改変γδＴ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-26

(45)【発行日】2022-10-04

(54)【発明の名称】改変γδＴ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20220927BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220927BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220927BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20220927BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220927BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220927BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20220927BHJP

   C12N 5/09 20100101ALN20220927BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

A61K35/17 Z

A61P35/00

A61P35/02

C07K14/705

C07K16/28

C12N15/00 A

C40B40/10

C12N5/09

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2017545528

(86)(22)【出願日】2015-11-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2017-11-30

(86)【国際出願番号】 US2015061189

(87)【国際公開番号】W WO2016081518

(87)【国際公開日】2016-05-26

【審査請求日】2018-11-19

【審判番号】

【審判請求日】2020-12-24

(31)【優先権主張番号】62/080,500

(32)【優先日】2014-11-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517171347

【氏名又は名称】アディセット バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ジャコボヴィッツ， アヤ

(72)【発明者】

【氏名】フォード， オリット

(72)【発明者】

【氏名】リン， アンディ アン－デ

(72)【発明者】

【氏名】サンタギダ， マリアンヌ テリーサ

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】上條 肇

【審判官】川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４年 ６月，Ｖｏｌ．２０，Ｉｓｓｕｅ２２，ｐ５７２０－５７３２

【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１３年，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３，ｐ．６３８－６４７

【文献】Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３年，Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．２，ｐ．２１１－２２０

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K 35/00 - 35/768

C12N 5/00 - 5/28

C07K 16/00 - 16/46

C40B 40/02

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

増殖したγδＴ細胞集団を含む医薬を製造するための方法であって、γδＴ細胞集団の増殖が、δ１γδＴ細胞又はδ２γδＴ細胞亜集団の選択的な増殖を刺激する作用物質によって活性化されており、
作用物質が、δ１又はδ２γδＴ細胞を増殖させ、かつそれぞれ：
ｉ．δ１ＴＣＲ鎖の特異的エピトープに結合し、δ１γδＴ細胞を選択的に増殖させ、かつ増殖したδ１γδＴ細胞集団を製造する、ＴＳ８．２又はＴＳ－１抗体、又は
ｉｉ．δ２ＴＣＲ鎖の特異的エピトープに結合し、δ２γδＴ細胞を選択的に増殖させ、かつ増殖したδ２γδＴ細胞集団を製造する、Ｂ６又は１５Ｄ抗体
から選択され、並びに：
ａ．増殖したγδＴ細胞集団が、δ１Ｔ細胞のあるパーセンテージを含み、δ１Ｔ細胞のパーセンテージが、８０％より高く、かつ増殖したγδＴ細胞集団が、少なくとも１×１０ ^７ 個のδ１γδＴ細胞を含む；又は
ｂ．増殖したγδＴ細胞集団が、δ２Ｔ細胞のあるパーセンテージを含み、δ２Ｔ細胞のパーセンテージが、８０％より高く、かつ増殖したγδＴ細胞集団が、少なくとも１×１０ ^７ 個のδ２γδＴ細胞を含む
方法。

【請求項2】

ａ．増殖したγδＴ細胞集団が、δ１Ｔ細胞のあるパーセンテージを含み、増殖したγδＴ細胞集団中のδ１Ｔ細胞のパーセンテージが、９０％より高い；
ｂ．増殖したγδＴ細胞集団が、δ２Ｔ細胞のあるパーセンテージを含み、増殖したγδＴ細胞集団中のδ２Ｔ細胞のパーセンテージが、９０％より高い；
ｃ．増殖したγδＴ細胞集団が、δ３Ｔ細胞のあるパーセンテージを含み、増殖したγδＴ細胞集団中のδ３Ｔ細胞のパーセンテージが、５％より高い；又は
ｄ．抗体は、γδＴ細胞集団の増殖を２４時間未満に１細胞分裂の平均速度で刺激する、
請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ａ．抗体が、表面上に固定され；かつ／又は
ｂ．γδＴ細胞集団のγδＴ細胞が、血液試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパ球、及び外部環境と直接接触する対象の上皮部位からなる群から選択される対象の複合試料から単離されたγδＴ細胞に由来する
請求項１に記載の方法。

【請求項4】

γδＴ細胞集団が、腫瘍認識部分を発現するように改変されたγδＴ細胞のある量をさらに含む、請求項１－３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ａ．改変されたγδＴ細胞が、ヒトＨＬＡ遺伝子座を欠いている；
ｂ．改変γδＴ細胞が、万能ドナー細胞である；
ｃ．改変γδＴ細胞が、腫瘍特異的アロジェニックγδＴ細胞である；
ｄ．改変γδＴ細胞が、２つ以上の腫瘍認識部分を発現するように改変されており、
（ｉ）２つ以上の腫瘍認識部分が、異なっており、それぞれの異なる腫瘍認識部分が、同じ抗原の異なるエピトープを認識するように改変されているか、若しくは
（ｉｉ）２つ以上の腫瘍認識部分が、異なっており、それぞれの異なる腫瘍認識部分が、異なる抗原の異なるエピトープを認識するように改変されている；
e．改変γδＴ細胞が、Ｖδ１^＋Ｔ細胞、Ｖδ２^＋Ｔ細胞、若しくはＶδ３^＋Ｔ細胞、又はそれらの混合物に由来する；
ｆ．改変γδＴ細胞が、血液試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパ球、及び外部環境と直接接触する対象の上皮部位からなる群から選択される対象の複合試料から単離されたγδＴ細胞に由来する；又は
ｇ．改変γδＴ細胞が、約２～約２０時間以内に１細胞分裂の平均速度で増殖する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

a．腫瘍認識部分が、腫瘍浸潤リンパ球に由来する；又は
ｂ．腫瘍認識部分が、Ｔ細胞からクローンされる；又は
ｃ．腫瘍認識部分が、改変Ｔ細胞受容体であり、
ｉ．改変Ｔ細胞受容体が、ヒト若しくはマウスＴ細胞受容体に由来する、
ｉｉ．改変Ｔ細胞受容体が、改変αβＴＣＲである、若しくは
ｉｉｉ．改変Ｔ細胞受容体が、改変γδＴＣＲである；
ｄ．腫瘍認識部分が、腫瘍抗原を認識する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗体、単一鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、抗体断片、Ｆａｂ、若しくはＦ（ａｂ） _２ であり、腫瘍認識部分が、ヒトＢ細胞、ラクダＢ細胞、ラマＢ細胞、ラットＢ細胞、若しくはマウスＢ細胞に由来する；
ｅ．腫瘍抗原が、ペプチド－ＭＨＣ複合体であり、かつ腫瘍認識部分が、ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する；又は
ｆ．腫瘍認識部分が、腫瘍細胞表面上に発現される外来性抗原、又はＭＨＣクラス分子との複合体として細胞表面に呈示される派生ペプチドを認識する
請求項５に記載の方法。

【請求項7】

γδＴ細胞集団が、抗原認識部分を発現するように改変されているγδＴ細胞のある量をさらに含み、抗原認識部分が、自己免疫疾患に関連する抗原又は病原性抗原を認識する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ａ．改変γδＴ細胞が、２つ以上の抗原認識部分を発現するように改変されており、それぞれの抗原認識部分が、同じ又は異なる自己免疫抗原を認識する；
ｂ．改変γδＴ細胞が、２つ以上の抗原認識部分を発現するように改変されており、それぞれの抗原認識部分が、同じ又は異なる自己免疫抗原の異なるエピトープを認識する；
ｃ．改変γδＴ細胞が、抗原認識部分を発現するように改変されており、抗原認識部分が、細菌性抗原又はウイルス性抗原である病原性抗原を認識する；
ｄ．改変γδＴ細胞が、２つ以上の抗原認識部分を発現するように改変されており、それぞれの抗原認識部分が、同じ病原性抗原の異なるエピトープを認識する；又は
e．改変γδＴ細胞が、２つ以上の抗原認識部分を発現するように改変されており、それぞれの抗原認識部分が、異なる病原性抗原を認識し、
ｉ．病原性抗原が、細菌蛋白質である；若しくは
ｉｉ．病原性抗原が、ウイルス蛋白質である
請求項７に記載の方法。

【請求項9】

δ１γδＴ細胞又はδ２γδＴ細胞亜集団の選択的なインビトロにおける増殖のための方法であって、
γδＴ細胞亜集団の選択的な増殖を刺激する活性化剤にγδＴ細胞集団を接触させることを含み、活性化剤がδ１又はδ２γδＴ細胞を選択的に増殖させる抗体であり、前記方法が、
ａ．６０パーセントより高い、増殖したγδＴ細胞集団中のδ１Ｔ細胞のパーセンテージであって、増殖したγδＴ細胞集団が、少なくとも１×１０ ^７ 個のδ１γδＴ細胞を含み、δ１γδＴ細胞を選択的に増殖させる抗体がＴＳ８．２及びＴＳ－１抗体からなる群から選択される、パーセンテージ；又は
ｂ．８０パーセントより高い、増殖したγδＴ細胞集団中のδ２Ｔ細胞のパーセンテージであって、増殖したγδＴ細胞集団が、少なくとも１×１０ ^７ 個のδ２γδＴ細胞を含み、δ２γδＴ細胞を選択的に増殖させる抗体が１５Ｄ及びＢ６抗体からなる群から選択される、パーセンテージ
を含む増殖したγδＴ細胞集団を生成することを含む、方法。

【請求項10】

抗体が、表面上に固定化されている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

γδＴ細胞が、血液試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパ球、及び外部環境と直接接触する対象の上皮部位からなる群から選択される対象の複合試料から単離されたγδＴ細胞に由来する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

γδＴ細胞集団のγδＴ細胞が、腫瘍認識部位を発現するように改変されており、
a．改変γδＴ細胞が、万能ドナー細胞である；
ｂ．改変γδＴ細胞が、腫瘍特異的アロジェニックγδＴ細胞である；
ｃ．改変γδＴ細胞が、２つ以上の腫瘍認識部分を発現するように改変されており、
i．２つ以上の腫瘍認識部分が、異なっており、それぞれの異なる腫瘍認識部分が、同じ抗原の異なるエピトープを認識するように改変されている、若しくは
ii．２つ以上の腫瘍認識部分が、異なっており、それぞれの異なる腫瘍認識部分が、異なる抗原の異なるエピトープを認識するように改変されている；
ｄ．改変γδＴ細胞が、Ｖδ１^＋Ｔ細胞、Vδ２^＋Ｔ細胞、若しくはＶδ３^＋Ｔ細胞、又はそれらの混合物に由来する；又は
e．改変γδＴ細胞が、血液試料、臍帯血試料、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検試料、組織、リンパ球、及び外部環境と直接接触する対象の上皮部位からなる群から選択される対象の複合試料から単離されたγδＴ細胞に由来する
請求項９－１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

a．腫瘍認識部分が、腫瘍浸潤リンパ球に由来する；
ｂ．腫瘍認識部分が、Ｔ細胞からクローンされる；
ｃ．腫瘍認識部分が、改変Ｔ細胞受容体であり、
ｉ．改変Ｔ細胞受容体が、ヒト若しくはマウスＴ細胞受容体に由来する、
ｉｉ．改変Ｔ細胞受容体が、改変αβＴＣＲである、若しくは
ｉｉｉ．改変Ｔ細胞受容体が、改変γδＴＣＲである；
ｄ．腫瘍認識部分が、腫瘍抗原を認識する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗体、単一鎖可変断片（ｓｃＦＶ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、抗体断片、Ｆａｂ、若しくはＦ（ａｂ） _２ であり、腫瘍認識部分が、ヒトＢ細胞、ラクダＢ細胞、ラマＢ細胞、ラットＢ細胞、若しくはマウスＢ細胞に由来する；
ｅ．腫瘍抗原が、ペプチド－ＭＨＣ複合体であり、かつ腫瘍認識部分が、ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する；又は
ｆ．腫瘍認識部分が、腫瘍細胞表面上に発現される外来性抗原、又はＭＨＣクラス分子との複合体として細胞表面に呈示される派生ペプチドを認識する
請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

抗体が、γδＴ細胞集団の増殖を２４時間未満に１細胞分裂の平均速度で刺激する、請求項９－１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

Ｔリンパ球による抗原認識は、多様性の高いヘテロ二量体受容体であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって達成され得る。血中及びリンパ器官中のヒトＴ細胞のおよそ９５％はヘテロ二量体αβＴＣＲ受容体（αβＴ細胞系統）を発現する。血中及びリンパ器官中のヒトＴ細胞のおよそ５％はヘテロ二量体γδＴＣＲ受容体（γδＴ細胞系統）を発現する。これらのＴ細胞サブセットはそれぞれ「αβ」及び「γδ」Ｔ細胞と呼ばれることもある。αβ及びγδＴ細胞は機能が異なる。αβＴ細胞はＭＨＣ拘束性養子免疫を誘導し、γδＴ細胞は先天免疫及び非ＭＨＣ拘束性養子免疫を橋渡しする。抗原提示細胞（ＡＰＣ）がクラスＩ／ＩＩ ＭＨＣとの関連で抗原を提示すると、αβＴ細胞の活性化が生じる。樹状細胞がナイーブＴ細胞の最も強力な公知のアクティベーターである。完全なαβＴ細胞活性化には２つのシグナルが必要であり、ａ）ＭＨＣ－ペプチドとＴＣＲ－ＣＤ３複合体との相互作用によって生じるシグナル；及びｂ）Ｔ細胞上のＣＤ２８とＡＰＣ上のＢ７ファミリーのメンバーとの相互作用によって生じるシグナル（共刺激シグナル）である。αβＴ細胞とは対照的に、γδＴ細胞は抗原を直接認識することができ、ＭＨＣ－ペプチドとＴＣＲ－ＣＤ３複合体との相互作用を必要としない。したがって、γδＴ細胞はＭＨＣ拘束性ではないと言われる。内因性Ｔ細胞において、共刺激シグナルの欠如はクローンアネルギーをもたらす。

【0002】

内因性γδＴ細胞の抗原を直接認識する能力がγδＴ細胞を魅力的な治療用手段としている。しかし、内因性γδＴ細胞の操作及び誘導が困難であることが、臨床における患者由来γδＴ細胞の治療上の有用性を制限している。

【発明の概要】

【0003】

いくつかの実施形態において、本開示は改変γδＴ細胞を提供し、改変γδＴ細胞は１つ、２つ、またはそれ以上の異なる腫瘍認識部分を発現するように改変されており、各腫瘍認識部分は腫瘍抗原を認識する。腫瘍認識部分は、同一腫瘍抗原の異なるエピトープ、異なる腫瘍の抗原、腫瘍抗原及び活性化もしくは不活性化共刺激／免疫調節受容体、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原、またはホーミング受容体を認識するように設計することができる。場合によっては、本開示は改変γδＴ細胞で癌を治療する方法を提供する。改変γδＴ細胞は被検者に対してアロジェニックに設計することができ、改変γδＴ細胞は腫瘍特異的アロジェニックγδＴ細胞とすることができる。場合によっては、改変γδＴ細胞はヒトＨＬＡ遺伝子座を欠く。ＨＬＡ遺伝子座はＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択することができ、改変γδＴ細胞は２つ以上のＨＬＡ遺伝子座からの発現を欠くように設計改変することができる。場合によっては、少なくとも１つの改変腫瘍認識部分は改変Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体はヒトＴ細胞受容体、マウスＴ細胞受容体、ラットＴ細胞受容体、またはキメラＴ細胞受容体とすることができる。改変Ｔ細胞受容体は改変αβＴＣＲとすることができ、２つの異なる改変αβＴＣＲが同一抗原の異なるエピトープを認識するように設計することができる。他の場合では、改変Ｔ細胞受容体は改変γδＴＣＲである。いくつかの実施形態において、固形腫瘍に浸潤するように改変γδＴ細胞を設計する。改変γδＴ細胞は、腫瘍細胞において細胞内または細胞外発現した腫瘍抗原を認識するように設計することができる。細胞外発現した腫瘍抗原の場合、改変γδＴ細胞は、ＭＨＣ分子と複合体化したペプチドである抗原を認識するように構成することができる。場合によっては、腫瘍抗原はリンパ腫抗原、白血病抗原、多発性骨髄腫抗原、乳癌抗原、前立腺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸及び直腸癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、頭頸部癌抗原、腎臓癌抗原、肺癌抗原、膵臓癌抗原、肉腫抗原、中皮腫抗原、卵巣癌抗原または黒色腫抗原である。場合によっては、改変γδＴ細胞は、Ｖδ１^＋Ｔ細胞、Ｖδ２^＋Ｔ細胞もしくはＶδ３^＋Ｔ細胞、またはＶδ１^＋、Ｖδ２^＋、もしくはＶδ３^＋Ｔ細胞の混合物に由来する。改変γδＴ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞またはＣＤ３^－Ｔ細胞に由来することができる。改変γδＴ細胞は同一抗原の異なるエピトープを認識するように設計することができる。

【0004】

場合によっては、２つ以上の異なる腫瘍認識部分は異なるポリヌクレオチド配列によってコードされ、異なるポリヌクレオチド配列それぞれが同一抗原の異なるエピトープを認識するように改変する。場合によっては、少なくとも１つの腫瘍認識部分を腫瘍細胞からクローニングする。他の場合では、少なくとも１つの腫瘍認識部分を合成的に改変する。場合によっては、少なくとも１つの腫瘍認識部分は腫瘍抗原を認識する抗体断片、またはその抗原結合断片である。腫瘍認識部分は改変免疫グロブリン軽鎖、改変免疫グロブリン重鎖、またはこれらの任意の断片とすることができる。場合によっては、改変γδＴ細胞は遊走及びホーミング受容体も発現する。ホーミング分子は改変γδＴ細胞を固形腫瘍に接着することができる。場合によっては、少なくとも１つの免疫チェックポイント遺伝子を欠くように改変γδＴ細胞をさらに改変し、免疫チェックポイント遺伝子はＣＴＬＡ－４遺伝子、ＰＤ－１遺伝子、ＬＡＧ３遺伝子、ＣＥＡＣＡＭ－１遺伝子、または別の遺伝子とすることができる。場合によっては、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、メソテリン、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、またはＣＭＶから選択される。他の場合では、少なくとも１つの腫瘍認識部分は、本明細書に記載の任意の抗原、抗原の一部または断片を認識するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。

【0005】

他の実施形態において、改変γδＴ細胞は抗原認識部分を発現するように改変されており、抗原認識部分は自己免疫疾患に関連する抗原を認識する。そのような細胞は１つ、２つ、またはそれ以上の抗原認識部分を発現するように改変され、各抗原認識部分は同一自己免疫抗原の異なるエピトープを認識し得る。場合によっては、腫瘍認識部分は異なる抗原、抗原及び活性化もしくは不活性化共刺激／免疫調節受容体、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原、または自己免疫疾患に関連するホーミング受容体を認識する。

【0006】

代替的実施形態では、改変γδＴ細胞は抗原認識部分を発現するように改変されており、抗原認識部分は病原性抗原を認識する。そのような細胞は２つ以上の抗原認識部分を発現するように改変され、各抗原認識部分は同一病原性抗原の異なるエピトープを認識し得る。場合によっては、腫瘍認識部分は異なる抗原、抗原及び活性化もしくは不活性化共刺激／免疫調節受容体、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原、または病原性抗原に関連するホーミング受容体を認識する。

【0007】

病原性抗原は細菌分子またはウイルス分子、例えば細菌タンパク質またはウイルスタンパク質などとすることができる。

【0008】

他の場合では、本開示は、２４時間未満に約１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞集団の増殖を刺激する作用物質によって、γδＴ細胞集団の増殖が活性化されるγδＴ細胞集団を提供する。場合によっては、増殖したγδＴ細胞集団はあるパーセンテージのδ１Ｔ細胞、δ２Ｔ細胞、またはδ３Ｔ細胞を含み、上述の増殖したγδＴ細胞の任意の１つのパーセンテージを５％より高くすることができる。場合によっては、γδＴ細胞集団中のδ１、δ２、またはδ３Ｔ細胞のパーセンテージは、インビトロまたはインビボで２４時間未満に約１回の細胞分裂の平均速度で拡大する。場合によっては、γδＴ細胞集団はある量の改変γδＴ細胞をさらに含み、改変γδＴ細胞は抗原認識部分を発現するように改変されている。改変γδＴ細胞はヒトＨＬＡ遺伝子座を欠くように設計することもできる。γδＴ細胞集団の増殖を刺激する作用物質は抗体とすることができ、抗体は５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、及び１１Ｆ２抗体からなる群から選択することができる。場合によっては、抗体は表面上に固定化されている。

【0009】

場合によっては、本開示はγδＴ細胞の活性化エピトープに関する。場合によっては、活性化エピトープは、２４時間未満、またはγδＴ細胞の集団の急速な増殖に堪える別の好適な時間に１回の細胞分裂の平均速度で、γδＴ細胞集団の増殖を刺激する。場合によっては、活性化エピトープはδＴＣＲ、例えばδ１、δ２、またはδ３ＴＣＲなどのアミノ酸配列である。場合によっては、活性化エピトープは５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、及び１１Ｆ２抗体からなる群から選択される抗体の任意の１種によって結合されるエピトープである。活性化エピトープはＶδ１遺伝子セグメント及びＪδ１、Ｊδ２、Ｊδ３、またはＪδ４遺伝子セグメントからのアミノ配列を含むことができる。場合によっては、活性化エピトープは立体構造エピトープであり、他の場合では、活性化エピトープは直線状エピトープである。

【0010】

場合によっては、本開示はγδＴ細胞受容体のエピトープの決定方法を提供するが、この方法は（ａ）γδＴ細胞受容体からエピトープのライブラリーを調製すること；（ｂ）エピトープのライブラリーを抗体と接触させること；及び（ｃ）エピトープのライブラリー中の、抗体が結合した少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列を同定することを含む。抗体は５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、１１Ｆ２抗体からなる群から選択することができる。場合によっては、抗体は固体支持体に付着している。Ｔ細胞受容体のエピトープはＴ細胞受容体中のアミノ酸の連続配列または不連続配列に対応することができる。エピトープのライブラリーは、約１０アミノ酸長～約３０アミノ酸長、約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長、約５アミノ酸長～約１２アミノ酸長の範囲の断片を含むことができる。場合によっては、抗体を標識する。標識は放射性分子、発光分子、蛍光分子、酵素、またはビオチンとすることができる。場合によっては、エピトープのライブラリーは合成的に設計されたｃＤＮＡから翻訳されたペプチドを含み、合成的に設計されたｃＤＮＡは複数の合成的に設計されたγＴＣＲ及び複数の合成的に設計されたδＴＣＲのセグメントを含む。他の場合では、エピトープのライブラリーは、ヒトＰＢＭＣ、またはヒト悪性もしくは正常上皮組織から単離したリンパ球起源のヒトδγＴ細胞から抽出された全ＲＮＡから増幅されたペプチドを含む。合成的に設計されたｃＤＮＡのライブラリーは、そのＪδ領域において異なっている複数のＶδ１、Ｖδ２、及びＶδ３遺伝子セグメントを含むことができ、また、このライブラリーは複数のＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、δ１、δ２、及びδ３遺伝子セグメントを含むことができる。

【0011】

いくつかの実施形態において、本開示は必要としている被検者の治療方法を提供するが、この方法は前記被検者に本明細書に記載のγδＴ細胞を投与することを含む。本開示のさらなる態様及び利点が以下の発明を実施するための形態から当業者には容易に明らかとなるが、本開示の例示的実施形態のみを提示及び記載する。理解されるように、本開示は他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細はすべて本開示から逸脱することなく変更可能である。したがって、図面及び説明は本質的に限定ではなく例示とみなされるべきである。

【0012】

参照による援用
本明細書で言及するすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個別の刊行物、特許、または特許出願をそれぞれ参照により援用すると具体的かつ個別に示した場合と同様に、参照により本明細書に援用する。

【0013】

本発明の新規な特徴は添付の特許請求の範囲に詳細に記載する。本発明の原理を利用した例示的実施形態を示す以下の発明を実施するための形態、ならびに添付図面（本明細書では「ｆｉｇｕｒｅ（図）」及び「ＦＩＧ．（図）」ともいう）を参照することによって、本発明の特徴及び利点のより深い理解が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】改変γδＴ細胞を概略的に示す。パネルＡは１つの腫瘍認識部分を発現している改変γδＴ細胞を示す。パネルＢは２つの腫瘍認識部分を発現している改変γδＴ細胞を示す。

【図2】被検者の治療方法を概略的に示す。

【図3】改変γδＴ細胞の集団を被検者に投与する方法を概略的に示す。

【図4】肝臓転移結腸腺癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）から単離した、ＣＣＲ４及びＣＣＲ７を発現することがわかっているγδ１及びγδ２リンパ球の成長を図示するグラフを示す。

【図5】血清含有培地及び無血清培地でのγδＴ細胞成長を図示するグラフを示す。

【図6】５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ－１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２での抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を図示するグラフを示す。

【図7】５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ－１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２での抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を図示するグラフを示す。

【図8】抗ＴＣＲ Ｖδ１ ＴＳ－１抗体での競合実験を示す。

【図9】抗ＴＣＲ Ｖδ１ ＴＳ８－２抗体での競合実験を示す。

【図10】ＰＢＭＣ由来のδ１Ｔ細胞の活性化及び増殖を図示するグラフを示す。

【図11】ＰＢＭＣ由来のδ２Ｔ細胞の活性化及び増殖を図示するグラフを示す。

【図12】ＰＢＭＣ由来のδ１Ｔ細胞の増殖倍率を図示するグラフを示す。

【図13】ＰＢＭＣ由来のδ２Ｔ細胞の増殖倍率を図示するグラフを示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の様々な実施形態を本明細書に提示及び記載したが、そのような実施形態は例示のみを目的として提供されていることが当業者には明らかであろう。当業者は本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換を容易に考え出し得る。本明細書に記載の発明の実施形態に対する様々な代替が採用され得ると理解すべきである。

【0016】

概要
ヒトにおいて、γδＴ細胞（複数可）は先天免疫応答と適応免疫応答との間を結びつけるＴ細胞のサブセットである。これらの細胞はＶ－（Ｄ）－Ｊセグメント再構成を経て抗原特異的γδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）を生成し、γδＴ細胞（複数可）は、γδＴ細胞エフェクタ－機能を活性化するように独立してまたは一緒に作用するγδＴＣＲまたは他の非ＴＣＲタンパク質のいずれかによる抗原の認識を介して、直接活性化され得る。哺乳類においてγδＴ細胞はＴ細胞集団全体の小部分を占め、末梢血及びリンパ器官中のＴ細胞のおよそ１～５％であり、主に皮膚、肝臓、消化路、気道、及び生殖道のような上皮細胞リッチ区画に存在すると思われる。主要組織適合抗原複合体分子（ＭＨＣ）に結合した抗原を認識するαβＴＣＲとは異なり、γδＴＣＲは、インタクトタンパク質または非ペプチド化合物の形態の細菌抗原、ウイルス抗原、疾患細胞によって発現されているストレス抗原、及び腫瘍抗原を直接認識することができる。

【0017】

γδＴ細胞の広域スペクトルの抗原を認識する能力はγδＴ細胞の遺伝子改変によって強化することができる。γδＴ細胞（複数可）を改変することにより、インビボで選択された抗原を認識する万能アロジェニック治療が可能となる。膜貫通ドメイン及び／または細胞内Ｔ細胞活性化ドメインに結合した少なくとも１つの腫瘍認識部分、例えばαβＴＣＲまたはγδＴＣＲなどを含む発現カセットを発現するように改変されたγδＴ細胞（複数可）を本明細書に記載する。活性化ドメインはＴ細胞のαβＴＣＲまたはγδＴＣＲ装置に由来することができる。例えば、活性化ドメインはＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＡＬ、ＰＤ－１、４１－ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＶＥＭ、またはＣＤ４６分子に由来することができる。γδＴ細胞は、同一抗原の異なるエピトープを認識する２つ以上の異なるＴＣＲ、異なる抗体、または抗原結合断片を発現するように改変することができる。被検者に投与した場合、改変αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、抗体、またはキメラ抗原受容体ＣＡＲの抗原との結合により、インビボでγδＴ細胞に著しい細胞傷害性が効果的に付与される。ＴＣＲはヒトＴ細胞、マウスＴ細胞、ラットＴ細胞、ヒト化マウス、ヒト化ラット、免疫化哺乳類、またはファージもしくは酵母ライブラリーに由来することができる。抗体、ＣＡＲ、または任意の抗原結合断片はヒトＢ細胞、マウスＢ細胞、ラットＢ細胞、ラクダＢ細胞、ラマＢ細胞、免疫化哺乳類、またはファージもしくは酵母ライブラリーに由来することができる。改変γδＴ細胞によって発現される腫瘍認識部分は、疾患細胞によって細胞内または細胞外発現される抗原を認識することができる。例えば、細胞は発癌性ウイルス、例えばヒト乳頭腫ウイルスなどに感染する場合があり、疾患細胞は１種以上のＨＰＶ抗原を細胞内発現し得る。疾患細胞は細胞内発現したＨＰＶ抗原を小さな断片にプロセシングし、抗原性ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子との結合及び細胞表面への輸送を可能とし得る。改変γδＴ細胞の腫瘍認識部分は、疾患細胞によって細胞内発現されてＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子と複合体化して細胞表面上に提示される様々な抗原断片、またはエピトープを認識するように設計することができる。あるいは、改変γδＴ細胞の腫瘍認識部分は、腫瘍細胞表面上に発現される外因性抗原またはＭＨＣクラス分子と複合体化して細胞表面上に掲示された誘導ペプチドを認識するように設計することができる。

【0018】

改変γδＴ細胞（複数可）ならびに疾患細胞上の選択された抗原を標的化する効力及び選択能力を有する治療用製品としてのその使用方法を本明細書で提供する。標準的な技術により腫瘍抗原（複数可）、細菌抗原（複数可）、ウイルス抗原（複数可）、またはストレス抗原（複数可）と結合した１つまたは複数のαβまたはγδＴ細胞（複数可）からαβまたはγδＴＣＲのポリヌクレオチドまたはタンパク質配列をクローニングすることができる。あるいは、αβまたはγδＴＣＲのポリヌクレオチド配列はコンピュータプログラム製品上でインシリコ設計することができる。改変γδＴＣＲを含む発現カセットを例えばオリゴヌクレオチド合成法によって合成することができる。ハイスループットスクリーニング技術を用いて改変ＴＣＲの腫瘍抗原への結合特性を評価することができる。αβまたはγδＴＣＲ、膜貫通ドメイン及び活性化ドメインを含む発現カセットの改変がγδＴ細胞の活性及び細胞傷害性を増加させ、それによって改変γδＴ細胞に強力な細胞傷害性が付与される。

【0019】

改変γδＴ細胞は、血液、臍帯血、幹細胞、腫瘍、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から単離した非改変Ｔ細胞に由来し得る。単離されたＴ細胞は哺乳類、例えばヒトに由来し得る。単離されたＴ細胞集団中の１つ以上の細胞は、例えばＴ細胞活性化または不活性化ドメインと結合した腫瘍認識部分を含む発現カセットのポリヌクレオチド（複数可）を発現するように改変され得る。腫瘍認識部分は、標的腫瘍抗原、腫瘍細胞不活性化またはＴ細胞不活性化ドメインを認識するように設計する。腫瘍認識部分は、標的腫瘍抗原、活性化もしくは不活性化共刺激／免疫調節受容体、またはホーミング受容体を認識するように設計する。腫瘍抗原は、例えば、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）と複合体化して細胞表面上に発現された細胞内または細胞外タンパク質に由来するペプチドとすることができる。場合によっては、腫瘍認識部分はαβＴＣＲであり、抗原は腫瘍細胞によって提示されたＭＨＣと複合体化したペプチドである。抗原は、危険な状態の細胞、例えば癌細胞などに、または細胞内で複製する病原体、例えばウイルスもしくは細胞内細菌などに、もしくは細胞が細胞外液からエンドサイトーシスによって内在化した病原体もしくはその産物に由来する分子とすることができる。場合によっては、改変γδＴ細胞が２つ以上の異なる腫瘍認識部分を発現するように設計し、各腫瘍認識部分が同一抗原の異なるエピトープを認識するように設計する。万能改変γδＴ細胞は、異なるＭＨＣハプロタイプを伴う抗原を認識することができる腫瘍認識部分を発現することができる。腫瘍認識部分はＴＣＲ（αβもしくはγδＴＣＲ）またはペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する抗体のいずれかを含むことができる。例えば、所与の抗原に対して、ＴＣＲまたは抗体のいずれかである異なる腫瘍認識部分は、異なるＨＬＡハプロタイプと複合体化した同一のまたは異なる抗原由来ペプチドを認識することができる。

【0020】

改変γδＴ細胞は被検者に投与された場合、標的抗原を発現する細胞を弱体化または死滅させる。改変γδＴ細胞（複数可）は疾患の治療を必要とするヒトに導入され得る。好ましい実施形態において、癌を有する人間にこの細胞を投与するが、そのような場合、この細胞は腫瘍抗原または他の疾患関連抗原を認識するように改変されている。図１はγδＴ細胞を概略的に示す。パネルＡは１つの腫瘍認識部分を発現している改変γδＴ細胞を示す。パネルＢは２つの腫瘍認識部分を発現している改変γδＴ細胞を示す。

【0021】

発現カセットによってコードされる認識部分、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などは、細胞表面腫瘍抗原、ＭＨＣとの複合体（ペプチド－ＭＨＣ複合体）として細胞表面上に発現される腫瘍抗原に由来するペプチドに結合する完全な抗体、抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｃ、抗体上の軽鎖もしくは重鎖、抗体の可変領域もしくは定常領域、もしくはこれらの任意の組合せ、または２つの異なる抗原、同一抗原の異なるエピトープ、もしくは腫瘍抗原及び共刺激／活性化分子、免疫調節分子（複数可）、もしくはホーミング受容体（複数可）を対象とする２つの異なる抗体を含む二重特異性構築体とすることができる。抗体は例えば、ヒトＢ細胞、マウスＢ細胞、ラットＢ細胞、またはハイブリドーマ細胞株に由来することができる。マウスハイブリドーマ細胞株は、免疫化野生型もしくはヒト化マウス、ラットＢ細胞、免疫化野生型もしくはヒト化ラットから単離されたラットハイブリドーマ細胞、またはヒト、マウス、ラット、ラクダ、もしくはラマに由来する抗体ライブラリーに由来することができる。改変腫瘍認識部分は、細胞表面抗原またはペプチドＭＨＣ－抗原複合体を認識するＣＡＲとすることができる。改変腫瘍認識部分は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩと複合体化した腫瘍特異的抗原を認識する改変αβＴＣＲとすることができる。認識部分は、非ＭＨＣ拘束的に腫瘍特異的抗原を認識するγδＴＣＲとすることもできる。腫瘍認識部分は、細胞表面抗原、ペプチド－ＭＨＣ複合体、炭水化物、または脂質を認識する改変ＴＣＲまたはＣＡＲとすることができる。

【0022】

１つ、２つ、またはそれ以上の腫瘍認識部分が同一のまたは異なる抗原を認識するように設計することができる。１つ、２つ、またはそれ以上の腫瘍認識部分が同一のまたは異なる抗原の異なるエピトープを認識するように設計することができる。場合によっては、腫瘍認識部分はγδＴ細胞のゲノム中に設計された発現カセットによって発現されるαβＴＣＲ受容体である。場合によっては、腫瘍細胞または別の疾患細胞によって細胞内もしくは細胞外または細胞表面上に発現される抗原に由来するペプチド、またはペプチドマー（例えば９マーなど）を認識するように、改変γδＴ細胞によって発現される改変αβＴＣＲを設計する。細胞内抗原は、例えば感染細胞内で複製するウイルス及び細菌、または被検者自身のタンパク質によって産生され得る。被検者の細胞は抗原をペプチドにプロセシングし、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子と複合体化させてペプチドを提示し得る。本開示の改変γδＴ細胞（複数可）は、様々な異なる細胞内抗原の様々な異なるエピトープを認識するように設計することができる。細胞外もしくは外因性抗原、例えば細菌、寄生体、ウイルスなど、または癌細胞までもが抗原提示細胞によって貪食され、小さい断片にプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体化して提示され得る。本開示の改変γδＴ細胞（複数可）は、様々な異なる細胞外抗原の様々な異なるエピトープを認識するように設計することができる。場合によっては、腫瘍認識部分は細胞に新たな抗原認識をもたらすγδＴＣＲ受容体である。発現カセットは、例えば抗体またはリガンドを発現するＣＡＲを含み得るが、これをγδＴ細胞のゲノムに組み込み、γδＴ細胞によって発現させる。場合によっては、腫瘍認識部分は、例えば本明細書に記載の抗体、ＴＣＲ、抗原結合断片、またはこれらの任意の組合せを含む二重特異性構築体であり得る。γδＴ細胞は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から改変することができる、及び／または発現カセットによってコードされる腫瘍認識部分はＴＩＬから単離することができる。ＴＩＬから改変されたγδＴ細胞は、効果的に遊走、ホーミングし、腫瘍微小環境と相互作用する腫瘍特異的アロジェニック細胞とすることができる。改変γδＴ細胞は、特定の腫瘍、例えば乳癌、前立腺癌、膀胱癌、結腸及び直腸癌、脳癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、肉腫、中皮腫、卵巣癌抗原または黒色腫などから単離したＴＩＬから改変することができる。腫瘍認識部分は合成ライブラリーに由来することができる、または腫瘍認識部分は、例えばリンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、結腸及び直腸癌、脳癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、肉腫、中皮腫、卵巣癌抗原もしくは黒色腫から単離されたＢ細胞、Ｔ細胞に由来することができる。場合によっては、腫瘍認識部分は癌から単離された腫瘍浸潤リンパ球に由来する。

【0023】

改変γδＴ細胞はＴ細胞共刺激／活性化ドメインをさらに含み得る。Ｔ細胞活性化ドメインはαβＴ細胞及び／またはγδＴ細胞に由来することができる。例えば、γδ共刺激／活性化ドメインまたはαβ共刺激／活性化ドメインのいずれかと連結するように改変αβＴＣＲを設計することができる。αβ共刺激／活性化ドメインの非限定例としては、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭが挙げられる。γδ共刺激／活性化ドメインの非限定例としては、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＡＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４６が挙げられる。腫瘍認識部分をＴ細胞活性化ドメインまたは任意の他の好適なドメインに連結することができる。Ｔ細胞活性化ドメインはＣＤ３ζドメイン、ＣＤ２８ドメイン、またはＣＤ２、ＩＣＯＳ、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４６、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２、ＰＤ－１、ＪＡＭＡＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１４、及び／またはＦｃｅＲＩｇをはじめとする別の好適な活性化ドメインであり得る。膜貫通ドメインとしては、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３ｅ、ＣＤ１６及び免疫グロブリンの関連ドメインを挙げることができる。

【0024】

本明細書に開示の発明は好ましくは、認識分子をコードする発現カセットを発現する改変γδＴ細胞を提供する。場合によっては、発現カセットに対応する核酸配列をクローニングして改変γδＴ細胞のゲノムに安定導入する。腫瘍認識部分及び関連する活性化ドメインを含むことができる発現カセットを含む核酸配列は、合成的に改変して改変γδＴ細胞のゲノムに安定導入してもよい。２つ以上の異なる腫瘍認識部分は同一のまたは異なる発現カセットから発現され得る。

【0025】

こうした細胞を改変するために様々な技術が用いられ得る。例えば、改変ヌクレアーゼ、例えばａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系；ｂ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；ｃ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；ｄ）及び改変メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどでのゲノム編集法によって、クローニングまたは合成的に改変したＤＮＡを挿入、置換、または除去して改変γδＴ細胞を生成することができる。スリーピングビューティートランスポゾンシステムを用いて腫瘍認識部分のコードを含む核酸を転移させ、改変γδＴ細胞を生成することができる。当該技術分野において公知の様々な他のポリヌクレオチド送達方法がγδＴ細胞の改変に好適であり得るが、例えば形質移入、エレクトロポレーション、形質導入、リポフェクション、ナノ加工物質、例えばオルモシルなど、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスを含むウイルス送達方法、または別の好適な方法などである。

【0026】

場合によっては、認識部分は単一または複数の種に由来し、例えば、認識部分のポリヌクレオチド配列は、例えばヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（例えばＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（例えばＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓもしくはＲａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ラクダ（例えばＣａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓもしくはＣａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、もしくはラマ（Ｌａｍａ ｖｉｃｕｇｎａ）に由来することができるか、または認識部分のポリヌクレオチド配列は両方のキメラ結合体とすることができる。腫瘍認識部分はヒトに由来することが好ましいが、場合によっては、マウスまたは他の種、好ましくは哺乳類に由来してもよい。場合によっては、腫瘍認識部分はキメラＴＣＲ受容体またはキメラＣＡＲである。場合によっては、ヒト種由来のポリヌクレオチド配列に対する類似性を増加させ、それによって腫瘍認識部分を「ヒト化」するように非ヒト種に由来する腫瘍認識部分のポリヌクレオチド配列を改変する。場合によっては、マウス及びラットなどの種を「ヒト化」させて、例えばヒト化抗体及びＴＣＲを得る。

【0027】

腫瘍認識部分は改変γδＴ細胞中の発現カセットから恒常的発現されることが好ましい。場合によっては、腫瘍認識部分は誘導発現系、例えばテトラサイクリン調節性Ｔ－ＲＥｘ（商標）哺乳類発現系、好適なＴｅｔ－ｏｎ／Ｔｅｔ－ｏｆｆ発現系、または別の好適な系などの発現下にある。ある特定の場合において、改変γδＴ細胞は、ヒトＶδ１^＋Ｔ細胞、ヒトＶδ２^＋Ｔ細胞、ヒトＶδ３^＋Ｔ細胞、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞、またはヒトＣＤ３^－Ｔ細胞に由来する。

【0028】

本開示は、被検者の体内で特定の抗原を感知及び標的化することができる発現カセットからの腫瘍認識部分を発現する方法及び改変γδＴ細胞（複数可）を提供する。被検者は、特定の抗原を発現する細胞（複数可）を有効かつ選択的に認識して死滅または弱体化させることのできる治療薬による治療を必要とする被検者とすることができる。好ましい場合において、抗原は癌に関連する。抗原は系列特異的腫瘍抗原とすることができる。一実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、メソテリン、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、またはＣＭＶなどの腫瘍抗原である。

【0029】

本開示の改変γδＴ細胞は、被検者のＭＨＣ遺伝子座に対してオートロガスまたはアロジェニックとすることができる。例えば、オートロガス及びアロジェニック骨髄移植（ＢＭＴ）がいくつかの病態、特に血液悪性腫瘍に対する治療として用いられている。しかし、アロジェニックＢＭＴについては急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）が依然として最も重要なＢＭＴ合併症である。

【0030】

ドナーＴ細胞及び宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＧＶＨＤの誘発に決定的である。γδＴ細胞は宿主由来のＭＨＣ分子を認識しないので、本発明の改変γδＴ細胞による抗原認識はＧＶＨＤを誘発し得ない。本開示の改変γδＴ細胞は、移植片対宿主病を誘発することなく非オートロガス被検者に投与されるように設計することができる。さらに、改変γδＴ細胞は１つ以上のＭＨＣ遺伝子座からの遺伝子発現を欠くように設計することができる。あるいは、１つ以上のＭＨＣ遺伝子座（複数可）を欠くようにγδＴ細胞を改変することができる。改変γδＴ細胞中のＭＨＣ遺伝子座の欠失、または遺伝子発現の破壊は、遺伝子編集技術、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ、及び改変メガヌクレアーゼなどによって、またはβ２ｍ欠失によって実現することができる。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は、複数のＭＨＣ遺伝子座の遺伝子発現を欠くまたは破壊するように改変される。他の場合では、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ遺伝子座、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座、または両方において遺伝子発現を欠くまたは破壊するように改変γδＴ細胞を改変する。１つ以上のＭＨＣ遺伝子座の欠失により、宿主対移植片病を誘発することなく任意のＭＨＣハプロタイプを有する任意の被検者に対して万能ドナーである改変γδＴ細胞が得られ、それゆえに宿主の免疫系の標的とされることなく宿主内で成長、生存、増殖、及び機能することのできる改変γδＴ細胞が得られ得る。

【0031】

本明細書に記載の教示及び組成物は様々な用途に用いられ得る。好ましい実施形態において、腫瘍抗原は乳癌抗原、前立腺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸及び直腸癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、頭頸部癌抗原、腎臓癌抗原、肺癌抗原、膵臓癌抗原、肉腫抗原、中皮腫抗原、卵巣癌抗原または黒色腫抗原である。そのような場合において、腫瘍認識部分は改変αβＴＣＲ、またはクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣと複合体化して腫瘍細胞表面上に提示される細胞内または細胞外腫瘍抗原に由来するエピトープを認識するように設計された抗体であり得る。改変αβＴＣＲは、例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ複合体との関連で、またはＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、もしくは他のＨＬＡ分子との関連で腫瘍またはＡＰＣによって提示された細胞内腫瘍抗原を認識することができる。

【0032】

場合によっては、抗原は自己抗原である。自己抗原は、例えば免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、細胞内腫瘍抗原、細胞外腫瘍抗原、ＭＨＣ分子、または病態に関連する細胞外部分であり得る。例えば、ヒトＨＬＡ ＤＲ２の細胞発現は全身性ループス及び多発性硬化症に関連し、ヒトＨＬＡ ＤＲ４の細胞発現は関節リウマチ及び真性糖尿病に関連する。

【0033】

他の場合では、抗原は外来抗原である。外来抗原は、例えばウイルス、細菌、原生動物、またはアレルゲン、例えば花粉もしくは食物などであり得る。外来抗原は、例えば感染症、自己免疫障害、または組織傷害に関連し得る。

【0034】

本開示の改変γδＴ細胞は被検者の体内の特定の身体的部位にホーミングするように設計することができ、したがって、特定の組織、器官または身体部位における抗原を標的化することができる。内因性Ｔ細胞は、その遊走パターンに影響を与える異なるレパートリーの輸送リガンド及び受容体を有する。本開示の改変γδＴ細胞は、腫瘍認識部分を含む発現カセットから、または別個の発現カセットから、特定の組織、器官、または身体部位への改変γδＴ細胞の遊走を誘導する１つ以上の輸送リガンド（複数可）、または受容体（複数可）を発現するように設計することができる。

【0035】

本開示の改変γδＴ細胞は腫瘍特異的アロジェニック細胞とすることができる。例えば、改変γδＴ細胞は腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である非改変γδＴ細胞に由来し得る。異なる腫瘍タイプから異なるＴＩＬを単離することができる。腫瘍認識部分、及び活性化ドメイン、または別の改変特徴をコードする発現カセットを様々な腫瘍から単離したＴＩＬのゲノムに挿入することができる。そのようなγδＴ細胞は、固形腫瘍に浸潤し、１つ以上の標的抗原を発現している腫瘍細胞を弱体化及び死滅させることができ、悪性腫瘍に対して効果的な治療をもたらすことができる。腫瘍特異的アロジェニックγδＴ細胞は、選択されたエピトープを認識する少なくとも１つの腫瘍認識部分を発現するように改変することができる。場合によっては、腫瘍特異的アロジェニックγδＴ細胞が少なくとも２つの異なる腫瘍認識部分を発現するように設計し、異なる腫瘍認識部分それぞれが同一抗原の異なるエピトープ、異なる抗原、抗原及び活性化もしくは不活性化共刺激／免疫調節受容体（複数可）、ＭＨＣ分子と複合体化した抗原、またはホーミング受容体を認識するように設計する。

【0036】

場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞はＴＣＲδ及びＴＣＲγ受容体鎖の特定の対立遺伝子を発現するように設計される。改変γδＴ細胞のＴＣＲδ及びＴＣＲγ受容体鎖の特定の対立遺伝子は、被検者の体内の１つ以上の身体的部位への改変γδＴ細胞の遊走またはホーミングを誘導し得る。例えば、ヒトにおいて、Ｖδ１^＋ＴＣＲを発現するγδＴ細胞は、主に皮膚の上皮組織または上皮関連／粘膜組織、気道、消化管及び尿生殖器管ならびにいくつかの内臓に限局してホーミングする。Ｖδ３^＋ＴＣＲを発現するヒトγδＴ細胞は肝臓で豊富である。本開示の改変γδＴ細胞は恒常的に活性化している場合もある。野生型Ｔ細胞では、ＴＣＲは複数のタンパク質の複合体として存在し、これにはＣＤ３タンパク質、例えばＣＤ３εγ、ＣＤ３εδ、及びζ鎖（ＣＤ３ζホモ二量体）が挙げられる。ζ鎖上の複数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）がリン酸化されてＴリンパ球に活性化シグナルを発生させることができる。それぞれＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合した特定の抗原を認識した際に活性化するα／βＴＣＲ ＣＤ８及びＣＤ４細胞とは異なり、γδＴ細胞は非ＭＨＣ拘束的に抗原を直接認識することによって活性化する。そのような抗原には、腫瘍細胞によって発現される抗原、例えばＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ及びＢ（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＣＤ１、ＮＫＧ２Ａ、ＵＬＢＰ１－３、脂質、ならびにリン酸化抗原などが含まれる。本開示の改変γδＴ細胞は恒常的に活性化するように改変され得る。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は腫瘍認識部分及び活性化部分を含むように改変される。活性化部分はＴＣＲ－ＣＤ３複合体中のタンパク質であり得る。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は遺伝子組換えＣＤ３ζ遺伝子を恒常的発現するが、この場合、ＣＤ３ζ遺伝子の免疫受容体チロシン活性化モチーフはＹｘｘＬ／Ｉモチーフ中のチロシンのリン酸化模倣体を含むように改変されている。様々なＴ細胞活性化ドメイン及び膜貫通ドメイン、例えばＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＦｃｅＲＩｇ、ＣＤ４、ＣＤ３ｅ、ＪＡＭＡＬ、ＮＫＧ２Ｄ、またはＣＤ１６などは、例えばリン酸化模倣体または別の核酸変異を含むように改変され得る。

【0037】

本開示の改変γδＴ細胞のインビトロ（エクスビボ）増殖方法をさらに本明細書で開示する。場合によっては、抗原提示細胞またはアミノホスフェート（複数可）による刺激なしで改変γδＴ細胞をエクスビボ増殖させることができる。本開示の抗原反応性改変Ｔ細胞はエクスビボ及びインビボで増殖させられ得る。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞の活性集団は、抗原提示細胞、抗原性ペプチド、非ペプチド分子、または低分子化合物、例えばアミノホスフェート（複数可）などによる抗原刺激なしで、しかし、特定の抗体、サイトカイン、分裂促進因子、または融合タンパク質、例えばＩＬ－１７ Ｆｃ融合、ＭＩＣＡ Ｆｃ融合、及びＣＤ７０ Ｆｃ融合などを用いてエクスビボ増殖させられ得る。γδＴ細胞集団の増殖に用いることのできる抗体の例としては、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０、抗ＮＫＧ２Ｄ、または抗ＣＤ２抗体が挙げられ、サイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、またはＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－９、ＩＬ－７、ＩＬ－３３が挙げられ、また、分裂促進因子の例としては、ヒトＣＤ２７のリガンドであるＣＤ７０、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）、ポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）、大豆アグルチニン（ＳＢＡ）、ｌｅｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡ）、ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）またはＴ細胞増殖を刺激可能な別の好適な分裂促進因子が挙げられる。場合によっては、改変γδＴ細胞の集団は、６０日未満、４８日未満、３６日、２４日未満、１２日未満、または６日未満で増殖させることができる。

【0038】

様々な病態を本開示の改変γδＴ細胞（複数可）で治療する方法をさらに本明細書で開示する。本開示の改変γδＴ細胞は病態の治療を必要とする被検者を治療するために用いられ得る。病態は癌、例えば膀胱癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、肝臓癌、皮膚癌、結腸及び直腸癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌、肉腫、頭頸部癌、中皮腫、脳癌、肉腫または別の癌などであり得る。病態は感染症、自己免疫障害、移植、または敗血症であり得る。改変γδＴ細胞を被検者に与える方法も本明細書に開示する。場合によっては、改変γδＴ細胞は病態にかかっている被検者に投与され得る。場合によっては、改変γδＴ細胞は手術、例えば骨髄移植などの間に被検者に投与され得る。本開示は、調節性サイトカイン、例えばＩＬ－２などの共投与なしで改変γδＴ細胞を被検者に投与する方法をさらに提供する。場合によっては、エクスビボ増殖してインビボ投与した場合に増殖、生存、及び機能を向上させることのできる１種以上のサイトカインまたはホルモン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－９などを発現するようにγδＴ細胞を改変する。γδＴ細胞は、認識部分を含む同一のまたは異なる発現カセットから１種以上のサイトカインまたはホルモンを発現するように改変することができる。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、及び腫瘍壊死因子が含まれる。サイトカインの非限定例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－９、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びインターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリーのメンバーが挙げられる。

【0039】

場合によっては、改変γδＴ細胞は併用療法として被検者に投与され得る。場合によっては、併用療法は、ａ）本開示の改変γδＴ細胞；及びｂ）免疫チェックポイント療法を含む。

【0040】

改変γδＴ細胞
改変γδＴ細胞は当該技術分野において公知の様々な方法で生成され得る。改変γδＴ細胞は特定の腫瘍認識部分を安定発現するように設計され得る。トランスポゾン／トランスポザーゼシステム、もしくはウイルスベースの遺伝子移入システム、例えばレンチウイルスもしくはレトロウイルスシステムなど、または別の好適な方法、例えば形質移入、エレクトロポレーション、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）、ナノ加工物質、例えばオルモシルなど、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスを含むウイルス送達方法、もしくは別の好適な方法などによって、腫瘍認識または別のタイプの認識部分を含む発現カセットをコードするポリヌクレオチドをγδＴ細胞に安定導入することができる。抗原特異的ＴＣＲ、αβまたはγδのいずれかは、抗原特異的ＴＣＲの遺伝子コードを含むポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノム中に安定挿入することによって、改変γδＴ細胞に導入することができる。腫瘍認識部分とともにＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドをγδＴ細胞のゲノム中に安定挿入することによって改変γδＴ細胞に導入され得る。場合によっては、改変腫瘍認識部分は改変Ｔ細胞受容体であり、改変γδＴ細胞のゲノムに組み込まれる発現カセットは、改変ＴＣＲα（ＴＣＲアルファ）遺伝子、改変ＴＣＲβ（ＴＣＲベータ）遺伝子、ＴＣＲδ（ＴＣＲデルタ）遺伝子、または改変ＴＣＲγ（ＴＣＲガンマ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によっては、改変γδＴ細胞のゲノムに組み込まれる発現カセットは、抗体断片またはその抗原結合部分をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によっては、抗体断片またはその抗原結合断片は、完全な抗体、抗体断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｃ、抗体上の軽鎖もしくは重鎖、抗体の可変領域もしくは定常領域、またはこれらの任意の組合せでＣＡＲ及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、もしくは異なる抗原を対象とする抗体を有する複数のＣＡＲを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築体、もしくは二重特異性構築体の一部として細胞表面腫瘍抗原に結合するものをコードするポリヌクレオチドである。場合によっては、ポリヌクレオチドはヒトまたは別の種に由来する。非ヒト種に由来する抗体断片またはその抗原結合断片ポリヌクレオチドは、ヒトにおいて天然産生される抗体バリアントに対する類似性を増加させるように改変することができ、抗体断片または抗原結合断片は部分的にまたは完全にヒト化することができる。抗体断片またはその抗原結合断片ポリヌクレオチドはキメラ、例えばマウス－ヒト抗体キメラとすることもできる。ＣＡＲを発現する改変γδＴ細胞は、腫瘍認識部分によって認識される抗原に対するリガンドを発現するように改変することもできる。

【0041】

腫瘍認識部分の遺伝子コードを含むクローニングまたは合成的に改変した核酸を改変γδＴ細胞のゲノム中の特定の位置に導入するために、当該技術分野において公知の様々な技術を用いることができる。ＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２、及びＷＯ２０１１０９０８０４（それぞれの全内容を参照により本明細書に援用する）にそれぞれ記載されている微生物クラスター化等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）系由来のＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ技術を用いることにより、γδＴ細胞におけるゲノム改変を効率的に行うことができる。本明細書に記載の技術を用いて、ある遺伝子のノックアウト及び別の遺伝子のノックインを同時にもたらすゲノム位置に発現カセットを挿入することもできる。例えば、ＭＨＣ遺伝子をコードするゲノム領域に本開示の発現カセットを含むポリヌクレオチドを挿入することができる。そのような改変は、１つ以上の遺伝子、例えば発現カセットに含まれる遺伝子のノックイン、及び別の遺伝子、例えばＭＨＣ遺伝子座のノックアウトを同時にもたらす。

【0042】

ある場合において、腫瘍認識部分をコードする核酸を含むスリーピングビューティートランスポゾンを改変しているγδＴ細胞に導入する。野生型スリーピングビューティーと比較して向上した組込みをもたらす変異型スリーピングビューティートランスポザーゼ、例えばＵＳ７，９８５，７３９（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているトランスポザーゼなどを用いてポリヌクレオチドが改変γδＴ細胞に導入され得る。

【0043】

場合によっては、ウイルス法を用いて腫瘍認識部分を含むポリヌクレオチドを改変γδＴ細胞のゲノム中に導入する。複数のウイルス法がヒト遺伝子治療に用いられており、例えばＷＯ１９９３０２０２２１に記載されている方法などであり、その全体を本明細書に援用する。γδＴ細胞を改変するために用いることのできるウイルス法の非限定例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、またはアデノウイルス随伴ウイルス法が挙げられる。

【0044】

腫瘍認識部分の遺伝子コードを含むポリヌクレオチドは、改変γδＴ細胞、または腫瘍細胞に特異的な抗原、例えば精巣特異的癌抗原などの成長、増殖、活性化状態に影響を及ぼす変異または他の導入遺伝子を含み得る。本開示のγδＴ細胞は、抗原認識部分に連結した活性化ドメイン、例えばＴＣＲ－ＣＤ３複合体中の分子または共刺激因子などを含むポリヌクレオチドを発現するように改変され得る。改変γδＴ細胞はＴリンパ球活性化ドメインである細胞内シグナル伝達ドメインを発現することができる。γδＴ細胞は、細胞内活性化ドメイン遺伝子または細胞内シグナル伝達ドメインを発現するように改変され得る。細胞内シグナル伝達ドメイン遺伝子は例えばＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＡＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ４、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ－２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ７０、サイトカイン受容体、ＣＤ４０、またはこれらの任意の組合せであり得る。場合によっては、改変γδＴ細胞がサイトカイン、抗原、細胞受容体、または他の免疫調節分子を発現するようにも改変する。

【0045】

改変γδＴ細胞によって発現させる適切な腫瘍認識部分は、治療しようとする疾患に基づいて選択することができる。例えば、場合によっては、腫瘍認識部分はＴＣＲである。場合によっては、腫瘍認識部分は癌細胞上で発現されるリガンドに対する受容体である。好適な受容体の非限定例としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０が挙げられる。場合によっては、腫瘍認識部分は腫瘍抗原に対するリガンド、例えばＩＬ－１３リガンド、またはリガンド模倣体、例えばＩＬ１３Ｒに対するＩＬ－１３模倣体などを含むことができる。

【0046】

γδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０に由来するリガンド結合ドメイン、または抗腫瘍抗体、例えば抗Ｈｅｒ２ｎｅｕまたは抗ＥＧＦＲなど、及びＣＤ３－ζ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４ ＩＢＢ、及びＣＤ４０Ｌから得られるシグナル伝達ドメインを含むキメラ腫瘍認識部分を発現するように改変され得る。いくつかの例では、キメラ受容体はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＲＯＮ、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、ＣＭＶに結合する。

【0047】

γδＴ細胞において、改変γδＴ細胞から安定発現される遺伝的に異なる、実質的に異なる、もしくは実質的に同一のαβＴＣＲポリヌクレオチドから、または改変γδＴ細胞に安定導入された遺伝的に異なるαβＴＣＲポリヌクレオチドから２つ以上の腫瘍認識部分が発現され得る。遺伝的に異なるαβＴＣＲ（複数可）の場合、同一の病態に関連する異なる抗原を認識するαβＴＣＲ（複数可）が利用され得る。好ましい一実施形態において、１つ以上の発現カセットから、異なるＭＨＣハプロタイプとの関連で同一抗原を認識するヒトまたはマウス起源由来の異なるＴＣＲを発現するようにγδＴ細胞を改変する。別の好ましい実施形態では、１つのＴＣＲ及び異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化した所与の抗原由来の同一のまたは異なるペプチドを対象とする２つ以上の抗体を発現するようにγδＴ細胞を改変する。場合によっては、改変γδＴ細胞による単一のＴＣＲの発現が適切なＴＣＲ対合を容易とする。異なるＴＣＲを発現する改変γδＴ細胞により、万能アロジェニック改変γδＴ細胞を得ることができる。第２の好ましい実施形態において、ペプチド－ＭＨＣ複合体を対象とする１つ以上の異なる抗体を発現するようにγδＴ細胞を改変するが、それぞれの抗体は同一のまたは異なるＭＨＣハプロタイプと複合体化した同一のまたは異なるペプチドを対象とする。場合によっては、腫瘍認識部分はペプチド－ＭＨＣ複合体に結合する抗体とすることができる。

【0048】

γδＴ細胞は、１つ以上の発現カセットから、異なるＭＨＣハプロタイプとの関連で同一抗原を認識するＴＣＲを発現するように改変することができる。場合によっては、改変細胞内で単一のＴＣＲを発現するように、またはＴＣＲ誤対合の可能性を最小限にするためのＣＡＲとともにＴＣＲを発現するように改変γδＴ細胞を設計する。２つ以上の発現カセットから発現される腫瘍認識部分は、異なるポリヌクレオチド配列を有し、同一標的の異なるエピトープを認識する腫瘍認識部分をコードすることが好ましい。そのような異なるＴＣＲまたはＣＡＲを発現する改変γδＴ細胞により、万能アロジェニック改変γδＴ細胞を得ることができる。

【0049】

場合によっては、１つ以上の腫瘍認識部分を発現するようにγδＴ細胞を改変する。２つ以上の腫瘍認識部分は、γδＴ細胞内に改変された遺伝的に同一、または実質的に同一の抗原特異的キメラ（ＣＡＲ）ポリヌクレオチドから発現され得る。２つ以上の腫瘍認識部分は、γδＴ細胞内に改変された遺伝的に異なるＣＡＲポリヌクレオチドから発現され得る。遺伝的に異なるＣＡＲ（複数可）は同一病態に関連する異なる抗原を認識するように設計され得る。

【0050】

γδＴ細胞は代替として二重特異性としてもよい。二重特異性改変γδＴ細胞は２つ以上の腫瘍認識部分を発現することができる。二重特異性改変γδＴ細胞はＴＣＲ及びＣＡＲ腫瘍認識部分の両方を発現することができる。二重特異性改変γδＴ細胞は同一病態に関連する異なる抗原を認識するように設計することができる。改変γδＴ細胞は、同一または実質的に同一の抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性ポリヌクレオチドを発現することができる。改変γδＴ細胞は、異なる抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ／ＴＣＲ（複数可）二重特異性構築体を発現することができる。場合によっては、本開示の二重特異性構築体は標的細胞の活性化及び不活性化ドメインに結合し、その結果、標的特異性が増加する。γδＴ細胞は、少なくとも１種の腫瘍認識部分、少なくとも２種の腫瘍認識部分、少なくとも３種の腫瘍認識部分、少なくとも４種の腫瘍認識部分、少なくとも５種の腫瘍認識部分、少なくとも６種の腫瘍認識部分、少なくとも７種の腫瘍認識部分、少なくとも８種の腫瘍認識部分、少なくとも９種の腫瘍認識部分、少なくとも１０種の腫瘍認識部分、少なくとも１１種の腫瘍認識部分、少なくとも１２種の腫瘍認識部分、または別の好適な数の腫瘍認識部分を発現するように改変され得る。

【0051】

適切なＴＣＲ機能はＩＴＡＭモチーフを含む２つの機能性ζ（ゼータ）タンパク質によって強化され得る。適切なＴＣＲ機能はαβまたはγδ活性化ドメイン、例えばＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＪＡＭＡＬ、ＰＤ－１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４１－ＢＢ、ＯＸ４０、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＶＥＭ、またはＣＤ４６などの発現によっても強化され得る。発現されるポリヌクレオチドは腫瘍認識部分の遺伝子コード、リンカー部分、及び活性化ドメインを含み得る。改変γδＴ細胞によるポリヌクレオチドの翻訳でタンパク質リンカーによって連結された腫瘍認識部分及び活性化ドメインが得られ得る。多くの場合、リンカーは腫瘍認識部分及び活性化ドメインのフォールディングを妨害しないアミノ酸を含む。リンカー分子は少なくとも約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、約１０アミノ酸、約１１アミノ酸、約１２アミノ酸、約１３アミノ酸、約１４アミノ酸、約１５アミノ酸、約１６アミノ酸、約１７アミノ酸、約１８アミノ酸、約１９アミノ酸、または約２０アミノ酸の長さとすることができる。場合によっては、リンカー中のアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％はセリンまたはグリシンである。

【0052】

場合によっては、活性化ドメインは１つ以上の変異を含むことができる。好適な変異は例えば、活性化ドメインを恒常的活性型とする変異であり得る。１つ以上の核酸の同一性の改変により翻訳されるアミノ酸のアミノ酸配列が変化する。コードされるアミノ酸が極性、非極性、塩基性または酸性アミノ酸に改質されるように核酸を変異させることができる。腫瘍認識部分が腫瘍由来のエピトープ認識に最適化されるように核酸を変異させることができる。γδＴ細胞の改変腫瘍認識部分、改変活性化ドメイン、または別の改変コンポーネントは、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、７アミノ酸変異、８アミノ酸変異、９アミノ酸変異、１０アミノ酸変異、１１アミノ酸変異、１２アミノ酸変異、１３アミノ酸変異、１４アミノ酸変異、１５アミノ酸変異、１６アミノ酸変異、１７アミノ酸変異、１８アミノ酸変異、１９アミノ酸変異、２０アミノ酸変異、２１アミノ酸変異、２２アミノ酸変異、２３アミノ酸変異、２４アミノ酸変異、２５アミノ酸変異、２６アミノ酸変異、２７アミノ酸変異、２８アミノ酸変異、２９アミノ酸変異、３０アミノ酸変異、３１アミノ酸変異、３２アミノ酸変異、３３アミノ酸変異、３４アミノ酸変異、３５アミノ酸変異、３６アミノ酸変異、３７アミノ酸変異、３８アミノ酸変異、３９アミノ酸変異、４０アミノ酸変異、４１アミノ酸変異、４２アミノ酸変異、４３アミノ酸変異、４４アミノ酸変異、４５アミノ酸変異、４６アミノ酸変異、４７アミノ酸変異、４８アミノ酸変異、４９アミノ酸変異、または５０アミノ酸変異より多くのアミノ酸変異を含み得る。

【0053】

場合によっては、本開示のγδＴ細胞は１つ以上のＭＨＣ分子を発現しない。改変γδＴ細胞における１つ以上のＭＨＣ遺伝子座の欠失により、改変γδＴ細胞が宿主免疫系によって認識される可能性を減少させることができる。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系として知られているヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）遺伝子座は、γδＴ細胞を含めた抗原提示細胞中で発現される大きな遺伝子ファミリーを含む。ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ分子は細胞内ペプチドを抗原として抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ ＤＲ分子は細胞外ペプチドを抗原として抗原提示細胞に提示するように機能する。ＨＬＡ遺伝子のいくつかの対立遺伝子がＧＶＨＤ、自己免疫障害、及び癌に関連付けられている。本明細書に記載の改変γδＴ細胞は、１つ以上のＨＬＡ遺伝子の遺伝子発現を欠くように、または破壊するようにさらに改変することができる。本明細書に記載の改変γδＴ細胞は、ＭＨＣ複合体の１つ以上のコンポーネントの遺伝子発現を欠くように、または破壊するようにさらに改変することができ、例えばＭＨＣ遺伝子の１つ以上の完全欠失、特定のエキソンの欠失、またはβ_２ミクログロブリン（Ｂ２ｍ）の欠失などである。少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子の遺伝子除去または遺伝子破壊により、宿主対移植片病を引き起こすことなく任意のＨＬＡハプロタイプの被検者に投与することができる臨床治療用γδＴ細胞を得ることができる。本明細書に記載の改変γδＴ細胞は任意のＨＬＡハプロタイプのヒト被検者に対する万能ドナーとすることができる。

【0054】

１つのまたは様々なＨＬＡ遺伝子座（複数可）を欠くようにγδＴ細胞を改変することができる。改変γδＴ細胞はＨＬＡ－Ａ対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、ＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子、またはＨＬＡ－ＤＰ対立遺伝子を欠くように改変することができる。場合によっては、ＨＬＡ対立遺伝子はヒトの病態、例えば自己免疫病などに関連する。例えば、ＨＬＡ－Ｂ２７対立遺伝子は関節炎及びぶどう膜炎に関連付けられ、ＨＬＡ－ＤＲ２対立遺伝子は全身性エリテマトーデスに関連付けられ、ＨＬＡ－ＤＲ３対立遺伝子は２１ヒドロキシラーゼ欠損症に関連付けられ、ＨＬＡ－ＤＲ４は関節リウマチ及び１型糖尿病に関連付けられている。例えばＨＬＡ－Ｂ２７対立遺伝子を欠く改変γδＴ細胞は、被検者の免疫系に容易に認識されることなく関節炎を患っている被検者に投与することができる。場合によっては、１つ以上のＨＬＡ遺伝子座の欠失により、任意のＨＬＡハプロタイプを有する任意の被検者に対して万能ドナーである改変γδＴ細胞が得られる。

【0055】

場合によっては、γδＴ細胞の改変はγδＴ細胞ゲノムの一部の欠失を必要とする。場合によっては、ゲノムの欠失させる部分はＭＨＣ遺伝子座（複数可）の一部を含む。場合によっては、改変γδＴ細胞は野生型ヒトγδＴ細胞に由来し、ＭＨＣ遺伝子座はＨＬＡ遺伝子座である。場合によっては、ゲノムの欠失させる部分はＭＨＣ複合体中の一部に対応する遺伝子の一部を含む。場合によっては、ゲノムの欠失させる部分はβ２ミクログロブリン遺伝子を含む。場合によっては、ゲノムの欠失させる部分は免疫チェックポイント遺伝子、例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、及びＣＥＣＡＭ－１などを含む。場合によっては、改変γδＴ細胞はＴ細胞活性化及び細胞傷害性を強化する活性化ドメインを発現するように設計することができる。改変γδＴ細胞によって発現させることのできる活性化ドメインの非限定例としては、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃｅＲＩｇが挙げられる。

【0056】

改変γδＴ細胞のゲノムの任意の部分を欠失させて内因性γδＴ細胞遺伝子の発現を破壊することができる。γδＴ細胞のゲノムにおいて欠失または破壊することができるゲノム領域の非限定例としては、プロモーター、アクティベーター、エンハンサー、エキソン、イントロン、ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）、ＳＮＰパターン、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピートまたは単純反復配列が挙げられる。場合によっては、ゲノムの欠失部分は１核酸～約１０核酸、１核酸～約１００核酸、１核酸～約１，０００核酸、１核酸～約１０，０００核酸、１核酸～約１００，０００核酸、１核酸～約１，０００，０００核酸の範囲、または他の好適な範囲である。

【0057】

改変γδＴ細胞におけるＨＬＡ遺伝子発現は、当該技術分野において公知の様々な技術によって破壊することもできる。場合によっては、大きな遺伝子座の遺伝子編集技術を用いて改変γδＴ細胞ゲノムから遺伝子を除去する、または改変γδＴ細胞における少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子座の遺伝子発現を破壊する。改変γδＴ細胞のゲノム上の所望の遺伝子座を編集するために用いることのできる遺伝子編集技術の非限定例としては、クラスター化等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びメガヌクレアーゼ技術が挙げられるが、これらはＷＯ２０１４０９３７０、ＷＯ２００３０８７３４１、ＷＯ２０１４１３４４１２、及びＷＯ２０１１０９０８０４にそれぞれ記載されており、それぞれの全内容を参照により本明細書に援用する。

【0058】

改変γδＴ細胞は、腫瘍認識部分をすでに発現している単離した非改変γδＴ細胞から改変され得る。改変γδＴ細胞には、単離した野生型γδＴ細胞によって内因的に発現される腫瘍細胞認識部分を残すことができる。場合によっては、改変γδＴ細胞腫瘍細胞認識部分で野生型γδＴＣＲを置換する。

【0059】

γδＴ細胞は、１つ以上のホーミング分子、例えばリンパ球ホーミング分子などを発現するように改変することができる。ホーミング分子は例えばリンパ球ホーミング受容体または細胞接着分子とすることができる。ホーミング分子は、改変γδＴ細胞を被検者に投与した際に、改変γδＴ細胞が標的固形腫瘍をはじめとする固形腫瘍に遊走して浸潤するのを助けることができる。ホーミング受容体の非限定例としては、ＣＣＲファミリーのメンバー、例えばＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＬＡ、ＣＤ４４、ＣＤ１０３、ＣＤ６２Ｌ、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、インテグリン、例えばＶＬＡ－４及びＬＦＡ－１などが挙げられる。細胞接着分子の非限定例としては、ＩＣＡＭ、Ｎ－ＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＥ－ＣＡＭＬ１－ＣＡＭ、ネクチン（ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ２、ＰＶＲＬ３）、ＬＦＡ－１、インテグリンαＸβ２、αＶβ７、マクロファージ１抗原、ＣＬＡ－４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａが挙げられる。細胞接着分子の別の例としては、カルシウム依存性分子、例えばＴ－カドヘリンなど、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えばＭＭＰ９またはＭＭＰ２などに対する抗体が挙げられる。

【0060】

Ｔ細胞の成熟、活性化、増殖、及び機能に関与するステップは免疫チェックポイントタンパク質による共刺激及び阻害シグナルを介して調節され得る。免疫チェックポイントは免疫系に本来備わっている共刺激及び阻害要素である。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、生理的免疫応答の持続時間及び強度を調節して、免疫系が病状、例えば細胞悪性転換または感染などに反応する際に組織に対する傷害を防止するのに役立つ。γδ及びαβＴ細胞のいずれかからの免疫応答を制御するのに用いられる共刺激シグナルと阻害シグナルとの間の平衡は、免疫チェックポイントタンパク質によって調節され得る。免疫チェックポイントタンパク質、例えばＰＤ１及びＣＴＬＡ４などはＴ細胞の表面上に存在し、免疫応答の「オン」または「オフ」を切り替えるために用いられ得る。腫瘍は、特に腫瘍抗原に特異的であるＴ細胞に対する免疫耐性機構としてチェックポイントタンパク質機能を調節不全とし得る。本開示の改変γδＴ細胞は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子座（複数可）、例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲ、ＣＥＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、及びＢ７－Ｈ４などを欠くようにさらに改変することができる。あるいは、本開示の改変γδＴ細胞における内因性免疫チェックポイントの発現を遺伝子編集技術によって破壊することができる。

【0061】

免疫チェックポイントは、本開示の改変γδＴ細胞において阻害シグナル伝達経路を調節する分子（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＬＡＧ３によって例示される）または刺激シグナル伝達経路を調節する分子（ＩＣＯＳによって例示される）であり得る。広範な免疫グロブリンスーパーファミリーのいくつかのタンパク質を免疫チェックポイントに対するリガンドとすることができる。免疫チェックポイントリガンドタンパク質の非限定例としては、Ｂ７－Ｈ４、ＩＣＯＳＬ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＭｅｇａＣＤ４０Ｌ、ＭｅｇａＯＸ４０Ｌ、及びＣＤ１３７Ｌが挙げられる。場合によっては、免疫チェックポイントリガンドタンパク質は腫瘍によって発現される抗原である。場合によっては、免疫チェックポイント遺伝子はＣＴＬＡ－４遺伝子である。場合によっては、免疫チェックポイント遺伝子はＰＤ－１遺伝子である。

【0062】

ＰＤ１はＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーに属する阻害受容体であり、活性化Ｔリンパ球、Ｂ細胞、単球、ＤＣ、及びＴ－ｒｅｇ上で発現される。ＰＤ１に対してＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２という２つのリガンドが公知であり、Ｔ細胞、ＡＰＣ、及び悪性細胞上で発現され、自己反応性リンパ球を抑制し、ＴＡＡ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のエフェクタ－機能を阻害するように機能する。したがって、ＰＤ１を欠く改変γδＴ細胞は、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の発現にかかわらず、細胞傷害活性を保持することができる。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞はＰＤ－１遺伝子の遺伝子座を欠く。場合によっては、改変γδＴ細胞におけるＰＤ－１遺伝子の発現を遺伝子編集技術によって破壊する。

【0063】

ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）はＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られている。ＣＴＬＡ４は共刺激分子ＣＤ２８と配列相同性及びリガンド（ＣＤ８０／Ｂ７－１及びＣＤ８６／Ｂ７－２）を共有するが、ＣＴＬＡ４を受容体として発現しているＴ細胞に阻害シグナルを送達することで異なる。ＣＴＬＡ４の方が両方のリガンドに対する全体的な親和性がはるかに高く、リガンド密度が限られている場合の結合についてはＣＤ２８に勝る。ＣＴＬＡ４は多くの場合、ＣＤ８^＋エフェクタ－Ｔ細胞の表面上に発現され、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の初期活性化段階において機能的な役割を果たす。Ｔ細胞活性化の初期段階において、ＣＴＬＡ４はＣＤ８０及びＣＤ８６に対する高い親和性によりＣＤ２８の活性を打ち消す。ＣＴＬＡ４の主な機能としては、ヘルパーＴ細胞の下方調節及び調節性Ｔ細胞免疫抑制活性の強化が挙げられる。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞はＣＴＬＡ４遺伝子を欠く。場合によっては、改変γδＴ細胞におけるＣＴＬＡ４遺伝子の発現を遺伝子編集技術によって破壊する。

【0064】

ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）は活性化した抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞上で発現され、調節性Ｔ細胞の機能を強化し、独立してＣＤ８^＋エフェクタ－Ｔ細胞活性を阻害することができる。ＬＡＧ３はＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合する親和性が高いＣＤ－４様ネガティブ調節性タンパク質であり、いくつかの上皮癌において上方制御されており、Ｔ細胞増殖及びホメオスタシスの寛容につながる。ＬＡＧ－３－ＩＧ融合タンパク質を用いたＬＡＧ－３／クラスＩＩ相互作用の低下により抗腫瘍免疫応答が強化され得る。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞はＬＡＧ３遺伝子の遺伝子座を欠く。場合によっては、改変γδＴ細胞におけるＬＡＧ３遺伝子の発現を遺伝子編集技術によって破壊する。

【0065】

改変γδＴ細胞の表現型
改変γδＴ細胞は被検者の体内の特定の身体的部位にホーミングし得る。改変γδＴ細胞の遊走及びホーミングは、特定のケモカイン及び／または接着分子の発現及び作用の組合せに依存し得る。改変γδＴ細胞のホーミングはケモカインとその受容体との間の相互作用によって制御することができる。例えば、限定はしないがＣＸＣＲ３（そのリガンドはＩＰ－１０／ＣＸＣＬ１０及び６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ／ＣＣＬ２１に代表される） ＣＣＲ４＋ ＣＸＣＲ５＋（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１βに対する受容体） ＣＣＲ６＋及びＣＣＲ７をはじめとするサイトカインは、改変γδＴ細胞のホーミングに影響を及ぼし得る。場合によっては、改変γδＴ細胞は炎症及び傷害の部位、ならびに疾患細胞にホーミングして機能の修復を行い得る。場合によっては、改変γδＴ細胞は癌にホーミングすることができる。場合によっては、改変γδＴ細胞は胸腺、骨髄、皮膚、喉頭、気管、胸膜、肺、食道、腹部、胃、小腸、大腸、肝臓、膵臓、腎臓、尿道、膀胱、精巣、前立腺、精管、卵巣、子宮、乳腺、副甲状腺、脾臓または被検者の体内の別の部位にホーミングし得る。改変γδＴ細胞は１つ以上のホーミング部分、例えば特定のＴＣＲ対立遺伝子及び／またはリンパ球ホーミング分子などを発現することができる。

【0066】

改変γδＴ細胞は特定の表現型を有する場合があり、表現型は細胞表面マーカー発現の観点から記述することができる。様々な種類のγδＴ細胞を本明細書に記載のように改変することができる。好ましい実施形態において、改変γδＴ細胞はヒトに由来するが、改変γδＴ細胞は異なる起源、例えば哺乳類または合成細胞などに由来してもよい。

【0067】

抗原
本明細書に開示の本発明は、疾患特異的エピトープを認識する抗原認識部分を発現する改変γδＴ細胞を提供する。抗原は免疫応答を誘発する分子であり得る。この免疫応答は抗体産生、特定の免疫担当細胞の活性化のいずれか、または両方を伴い得る。抗原は例えばペプチド、タンパク質、ハプテン、脂質、炭水化物、細菌、病原体、またはウイルスであり得る。抗原は腫瘍抗原であり得る。腫瘍エピトープはＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ複合体によって腫瘍細胞の表面上に提示され得る。エピトープは細胞表面上に発現されて腫瘍認識部分によって認識される抗原の一部とすることができる。

【0068】

改変γδＴ細胞によって認識される抗原の非限定例としては、ＣＤ－１９、ＣＤ－３０、ＣＤ－２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ－３３、ＣＤ－１３８、ＣＤ－１２３、ＣＤ－７９ｂ、ＣＤ－７０、ＣＤ－７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、メソテリン、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原、ＭＡＧＥＡ、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、または病態に関連する別の抗原が挙げられる。改訂リストのＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＲＯＮ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、メソテリン、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、ＣＭＶを参照。

【0069】

抗原は細胞の細胞内または細胞外区画で発現される場合があり、改変γδＴ細胞は細胞内または細胞外腫瘍抗原を認識することができる。場合によっては、改変γδＴ細胞におけるαβＴＣＲは細胞内または細胞外腫瘍抗原のいずれかに由来するペプチドを認識する。例えば、抗原はウイルスに感染した細胞によって細胞内または細胞外で産生されるタンパク質、例えばＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、またはＨＰＶタンパク質などであり得る。抗原は癌細胞によって細胞内または細胞外で発現されるタンパク質であってもよい。

【0070】

抗原認識部分は危険な状態の細胞由来の抗原、例えば癌細胞またはウイルスに感染した細胞などを認識し得る。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）は染色体６のＨＬＡクラスＩ領域内に位置する。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢタンパク質はヒト上皮における「ストレス」のマーカーであると考えられており、一般的なナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ）を発現している細胞に対するリガンドとして機能する。ストレスマーカーとして、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは癌細胞から高度に発現され得る。改変γδＴ細胞はＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ腫瘍エピトープを認識することができる。

【0071】

腫瘍認識部分はある一定のアビディティーで抗原を認識するように改変され得る。例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ構築体によってコードされる腫瘍認識部分は、少なくとも１０ｆＭ、少なくとも１００ｆＭ、少なくとも１ピコモーラー（ｐＭ）、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも２０ｐＭ、少なくとも３０ｐＭ、少なくとも４０ｐＭ、少なくとも５０ｐＭ、少なくとも６０ｐＭ、少なくとも７ｐＭ、少なくとも８０ｐＭ、少なくとも９０ｐＭ、少なくとも１００ｐＭ、少なくとも２００ｐＭ、少なくとも３００ｐＭ、少なくとも４００ｐＭ、少なくとも５００ｐＭ、少なくとも６００ｐＭ、少なくとも７００ｐＭ、少なくとも８００ｐＭ、少なくとも９００ｐＭ、少なくとも１ナノモーラー（ｎＭ）、少なくとも２ｎＭ、少なくとも３ｎＭ、少なくとも４ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも６ｎＭ、少なくとも７ｎＭ、少なくとも８ｎＭ、少なくとも９ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２０ｎＭ、少なくとも３０ｎＭ、少なくとも４０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも６０ｎＭ、少なくとも７０ｎＭ、少なくとも８０ｎＭ、少なくとも９０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも３００ｎＭ、少なくとも４００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも６００ｎＭ、少なくとも７００ｎＭ、少なくとも８００ｎＭ、少なくとも９００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも３μＭ、少なくとも４μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも６μＭ、少なくとも７μＭ、少なくとも８μＭ、少なくとも９μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも３０μＭ、少なくとも４０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも６０μＭ、少なくとも７０μＭ、少なくとも８０μＭ、少なくとも９０μＭ、または少なくとも１００μＭの解離定数で抗原を認識し得る。

【0072】

場合によっては、腫瘍認識部分は、多くとも１０ｆＭ、多くとも１００ｆＭ、多くとも１ピコモーラー（ｐＭ）、多くとも１０ｐＭ、多くとも２０ｐＭ、多くとも３０ｐＭ、多くとも４０ｐＭ、多くとも５０ｐＭ、多くとも６０ｐＭ、多くとも７ｐＭ、多くとも８０ｐＭ、多くとも９０ｐＭ、多くとも１００ｐＭ、多くとも２００ｐＭ、多くとも３００ｐＭ、多くとも４００ｐＭ、多くとも５００ｐＭ、多くとも６００ｐＭ、多くとも７００ｐＭ、多くとも８００ｐＭ、多くとも９００ｐＭ、多くとも１ナノモーラー（ｎＭ）、多くとも２ｎＭ、多くとも３ｎＭ、多くとも４ｎＭ、多くとも５ｎＭ、多くとも６ｎＭ、多くとも７ｎＭ、多くとも８ｎＭ、多くとも９ｎＭ、多くとも１０ｎＭ、多くとも２０ｎＭ、多くとも３０ｎＭ、多くとも４０ｎＭ、多くとも５０ｎＭ、多くとも６０ｎＭ、多くとも７０ｎＭ、多くとも８０ｎＭ、多くとも９０ｎＭ、多くとも１００ｎＭ、多くとも２００ｎＭ、多くとも３００ｎＭ、多くとも４００ｎＭ、多くとも５００ｎＭ、多くとも６００ｎＭ、多くとも７００ｎＭ、多くとも８００ｎＭ、多くとも９００ｎＭ、多くとも１μＭ、多くとも２μＭ、多くとも３μＭ、多くとも４μＭ、多くとも５μＭ、多くとも６μＭ、多くとも７μＭ、多くとも８μＭ、多くとも９μＭ、多くとも１０μＭ、多くとも２０μＭ、多くとも３０μＭ、多くとも４０μＭ、多くとも５０μＭ、多くとも６０μ、Ｍ、多くとも７０μＭ、多くとも８０μＭ、多くとも９０μＭ、または多くとも１００μＭの解離定数で抗原を認識するように改変され得る。

【0073】

γδＴ細胞の単離
いくつかの態様において、本開示は、被検者から単離したγδＴ細胞の遺伝子改変のための方法を提供する。γδＴ細胞は被検者の複合サンプルから単離することができる。複合サンプルは、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検、組織、リンパであってもよく、もしくは外部環境に直接接している被検者の上皮部位由来でもよく、または幹前駆細胞に由来してもよい。γδＴ細胞は、例えば１つ以上の細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞（複数可）をフローサイトメトリー法でソーティングすることによって、被検者の複合サンプルから直接単離され得る。野生型γδＴ細胞は、γδＴ細胞（複数可）に関連し得る多数の抗原認識、抗原提示、共刺激、及び接着分子を呈する。１つ以上の細胞表面マーカー、例えば特定のγδＴＣＲ、抗原認識、抗原提示、リガンド、接着分子、または共刺激分子などが、複合サンプルから野生型γδＴ細胞を単離するために用いられ得る。γδＴ細胞に関連する、またはγδＴ細胞によって発現される様々な分子が、複合サンプルからγδＴ細胞を単離するために用いられ得る。場合によっては、本開示は、Ｖδ１^＋、Ｖδ２^＋、Ｖδ３^＋細胞の混合集団またはこれらの任意の組合せの単離のための方法を提供する。

【0074】

末梢血単核細胞は、例えばＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムをはじめとするアフェレーシス機器、または別の好適なデバイス／システムで被検者から収集することができる。γδＴ細胞（複数可）、またはγδＴ細胞（複数可）の所望の亜集団は、収集したサンプルから例えばフローサイトメトリー法で精製することができる。被検者の出産中に臍帯血から臍帯血細胞を得ることもできる。

【0075】

収集したγδＴ細胞（複数可）上で発現される細胞表面マーカーのポジティブ及び／またはネガティブセレクションを用いて、被検者の末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、腫瘍生検、組織、リンパ、または上皮サンプルからγδＴ細胞、または類似の細胞表面マーカーを発現しているγδＴ細胞（複数可）の集団を直接単離することができる。例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４６）、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＣＲ７、及び他の好適な細胞表面マーカーのポジティブまたはネガティブ発現に基づいてγδＴ細胞を複合サンプルから単離することができる。

【0076】

γδＴ細胞はインビトロで培養した複合サンプルから単離され得る。いくつかの実施形態において、全ＰＢＭＣ集団を、特定の細胞集団、例えば単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞などの前除去なしで活性化及び増殖させることができる。他の実施形態では、富化γδＴ細胞集団をその特異的な活性化及び増殖の前に生成することができる。いくつかの態様において、γδＴ細胞の活性化及び増殖を天然または改変ＡＰＣの非存在下で行う。いくつかの態様において、腫瘍試料からのγδＴ細胞の単離及び増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体を含めた固定化γδＴ細胞分裂促進因子、及びレクチンをはじめとする他のγδＴＣＲ活性化剤を用いて行うことができる。

【0077】

いくつかの実施形態において、γδＴ細胞（複数可）は１つ以上の抗原との接触に反応して急速に増殖することができる。いくつかのγδＴ細胞（複数可）、例えばＶγ９Ｖδ２^＋γδＴ細胞（複数可）などは、組織培養中にプレニルピロリン酸、アルキルアミン、及び代謝産物または微生物抽出物のようないくつかの抗原との接触に反応してインビトロで急速に増殖する。さらに、いくつかの野生型γδＴ細胞（複数可）、例えばＶγ２Ｖδ２^＋γδＴ細胞（複数可）などは、特定の種類のワクチン接種（複数可）に反応してヒト生体内で急速に増殖する。刺激されたγδＴ細胞は、複合サンプルからのγδＴ細胞（複数可）の単離を容易にすることができる多数の抗原提示、共刺激、及び接着分子を呈することができる。複合サンプル中のγδＴ細胞（複数可）は、少なくとも１種の抗原によりインビトロで１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、または別の好適な期間刺激することができる。好適な抗原でのγδＴ細胞の刺激により、γδＴ細胞集団をインビトロで増殖させることができる。

【0078】

インビトロで複合サンプルからのγδＴ細胞（複数可）の増殖を刺激するために用いられ得る抗原の非限定例としては、プレニルピロリン酸、例えばイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）など、アルキルアミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、共生細菌の代謝産物、メチル－３－ブテニル－１－ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢ－ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸（ＤＭＡＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、エチルアデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル－アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３－ホルミル－１－ブチル－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３－ホルミル－１－ブチル－ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３－ホルミル－１－ブチル－デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイル（ｃｒｏｔｏｙｌ）ピロリン酸、ジメチルアリル－γ－ウリジン三リン酸、クロトイル（ｃｒｏｔｏｙｌ）－γ－ウリジン三リン酸、アリル－γ－ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、イソアミルアミン及び窒素含有ビスホスホネートが挙げられる。

【0079】

γδＴ細胞の活性化及び増殖は、特定のγδＴ細胞増殖及びパーシスタンス集団を誘発する本明細書に記載の活性化及び共刺激剤を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、異なる培養からのγδＴ細胞の活性化及び増殖により、異なるクローンまたは混合多クローン集団サブセットを得ることができる。いくつかの実施形態において、異なるアゴニスト剤を用いて特定のγδ活性化シグナルをもたらす作用物質を同定することができる。一態様において、特定のγδ活性化シグナルをもたらす作用物質は、γδＴＣＲを対象とする異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）とすることができる。一態様において、ＭＡｂはγＴＣＲ及び／またはδＴＣＲの定常または可変領域上の異なるエピトープに結合することができる。一態様において、ＭＡｂは汎γδＴＣＲ ＭＡｂを含むことができる。一態様において、汎γδＴＣＲ ＭＡｂは、δ１及びδ２細胞集団を含む両方における異なるγ及びδＴＣＲによって共有されるドメインを認識し得る。一態様において、抗体は５Ａ６．Ｅ９（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｂ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＭＭＵ５１０及び／または１１Ｆ１２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）であり得る。一態様において、ＭＡｂは、γ鎖の可変領域に特有の特異的ドメイン（Ｖγ９ ＴＣＲなどを対象とする７Ａ５ Ｍａｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＴＣＲ１７２０））、またはＶδ１可変領域上のドメイン（Ｍａｂ ＴＳ８．２（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＴＣＲ１７３０；ＭＡｂ ＴＣ１、ＭＡｂ Ｒ９．１２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ））、またはＶδ２鎖（ＭＡｂ １５Ｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＴＣＲ１７３２））を対象とすることができる。これらのＭＡｂが単一集団Ｖδ１またはＶδ２細胞サブセットを特異的に活性化及び増殖させる能力を試験した（図４）。図４は、血清含有培地（Ｒ２：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）及び無血清培地（ＡＩＭＶ＋ウシアルブミン；ＣＴＳ無血清サプリメントを含むＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ無血清培地）中でのδ２Ｔ細胞成長を示す。すべての培地は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、２ｍＭのグルタミン及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する。０日目に１、５及び２０μＭのゾレドロン酸で細胞を刺激した。ゾレドロン酸のさらなる添加はなしで２～３日ごとに培地を補充した。１３日後の１０^６ＰＢＭＣから増殖した全δ２Ｔ細胞及び増殖倍率を各条件について示す。いくつかの実施形態において、γδＴＣＲの異なるドメインに対する抗体（汎抗体及びサブセット集団上の特定の可変領域エピトープを認識する抗体）を組み合わせて、それらのγδＴ細胞の活性化を強化する能力を評価することができる。いくつかの実施形態において、γδＴ細胞アクティベーターとしては、γδＴＣＲ結合剤、例えばＭＩＣＡなど、ＮＫＧ２Ｄに対するアゴニスト抗体、ＭＩＣＡの（Ｆｃタグ）融合タンパク質、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）ＵＬＢＰ２、またはＵＬＢＰ６（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｅｉｊｉｎｇ， 中国）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、細胞アネルギー及びアポトーシスを引き起こすことなく特異的γδＴ細胞増殖の誘発を補助する併用共刺激剤を同定することができる。こうした共刺激剤としては、γδ細胞上で発現される受容体、例えばＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１）ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、及びＣＤ２８－などに対するリガンドを挙げることができる。いくつかの態様において、共刺激剤はＣＤ２及びＣＤ３分子上の特有のエピトープに特異的な抗体とすることができる。ＣＤ２及びＣＤ３はαβまたはγδＴ細胞（複数可）上で発現された際に異なる配座構造を有することができ、場合によっては、ＣＤ３及びＣＤ２に対する特異的抗体はγδＴ細胞の異なる活性化をもたらすことができる。

【0080】

γδＴ細胞（複数可）の改変前にγδＴ細胞（複数可）の集団をエクスビボ増殖させる場合がある。インビトロでのγδＴ細胞集団の増殖を促進するために用いることのできる試薬の非限定例としては、抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－３３、ＩＬ－１８、もしくはＩＬ－２１、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）、ポークウィード（ＰＷＭ）、タンパク質ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）、大豆アグルチニン（ＳＢＡ）、Ｌｅｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡ）、Ｐｉｓｕｍ Ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、またはＴ細胞増殖を刺激可能な別の好適な分裂促進因子が挙げられる。γδＴ細胞（複数可）の遺伝子改変は、腫瘍認識部分、例えばαβＴＣＲ、γδＴＣＲ、抗体、その抗原結合断片、またはリンパ球活性化ドメインをコードするＣＡＲなど、エクスビボ及びインビボでのＴ細胞増殖、生存、及び機能を向上させるサイトカイン（ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３３、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－２３、ＩＬ１β）を発現する構築体を単離したγδＴ細胞（複数可）のゲノム中に安定的に組み込むことを含み得る。単離したγδＴ細胞の遺伝子改変は、単離したγδＴ細胞のゲノム中の１つ以上の内因性遺伝子、例えばＭＨＣ遺伝子座（複数可）などからの遺伝子発現を除去または破壊することをさらに含み得る。

【0081】

改変γδＴ細胞のエクスビボ増殖
他の態様では、本開示は、養子移入療法のための改変γδＴ細胞集団のエクスビボ増殖方法を提供する。本開示の改変γδＴ細胞はエクスビボ増殖させられ得る。本開示の改変γδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化なしで、またはＡＰＣ及びアミノホスフェートとの共培養なしでインビトロ増殖させることができる。

【0082】

本発明の方法は、様々なγδＴ細胞（複数可）集団、例えばＶγ１^＋、Ｖγ２^＋、Ｖγ３^＋γδＴ細胞集団などを増殖させることができる。場合によっては、３６日未満、３５日未満、３４日未満、３３日未満、３２日未満、３１日未満、３０日未満、２９日未満、２８日未満、２７日未満、２６日未満、２５日未満、２４日未満、２３日未満、２２日未満、２１日未満、２０日未満、１９日未満、１８日未満、１７日未満、１６日未満、１５日未満、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満でγδＴ細胞集団をインビトロ増殖させることができる。

【0083】

いくつかの態様において、γδＴ細胞を活性化剤と接触させることによって、改変及び非改変γδＴ細胞を含めた様々なγδＴ細胞を増殖させるための方法を提供する。場合によっては、活性化剤はγδＴ細胞の細胞表面受容体上の特定のエピトープに結合する。活性化剤は抗体、例えばモノクローナル抗体などとすることができる。活性化剤は１種以上のγδＴ細胞、例えばδ１、δ２、またはδ３細胞集団などの成長を特異的に活性化することができる。いくつかの実施形態において、活性化剤はδ１細胞集団の成長を特異的に活性化する。他の場合では、活性化剤はδ２細胞集団の成長を特異的に活性化する。

【0084】

活性化剤は速い成長速度で改変及び非改変γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。例えば、３０時間未満に１回の細胞分裂、２９時間未満に１回の細胞分裂、２８時間未満に１回の細胞分裂、２７時間未満に１回の細胞分裂、２６時間未満に１回の細胞分裂、２５時間未満に１回の細胞分裂、２４時間未満に１回の細胞分裂、２３時間未満に１回の細胞分裂、２２時間未満に１回の細胞分裂、２１時間未満に１回の細胞分裂、２０時間未満に１回の細胞分裂、１９時間未満に１回の細胞分裂、１８時間未満に１回の細胞分裂、１７時間未満に１回の細胞分裂、１６時間未満に１回の細胞分裂、１５時間未満に１回の細胞分裂、１４時間未満に１回の細胞分裂、１３時間未満に１回の細胞分裂、１２時間未満に１回の細胞分裂、１１時間未満に１回の細胞分裂、１０時間未満に１回の細胞分裂、９時間未満に１回の細胞分裂、８時間未満に１回の細胞分裂、７時間未満に１回の細胞分裂、６時間未満に１回の細胞分裂、５時間未満に１回の細胞分裂、４時間未満に１回の細胞分裂、３時間未満に１回の細胞分裂、２時間未満に１回の細胞分裂の平均速度でγδＴ細胞集団の増殖を刺激する作用物質。

【0085】

場合によっては、活性化剤は、約４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約８時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約９時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１２時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１３時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１８時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約１９時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２２時間ごとに約１回の分裂の速度、約２３時間ごとに約１回の分裂の速度、約２４時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２５時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２６時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２７時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約２８時間ごとに約１回の分裂の速度、約２９時間ごとに約１回の分裂の速度、約３０時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３１時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３２時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３３時間ごとに約１回の分裂の平均速度、約３４時間ごとに約１回の分裂の速度、約３５時間ごとに約１回の分裂の速度、約３６時間ごとに約１回の分裂の平均速度で改変及び非改変γδＴ細胞の増殖を刺激し得る。

【0086】

活性化剤は異なる成長速度で改変及び非改変γδＴ細胞の亜集団の増殖を刺激し得る。例えば、作用物質は、１日～９０日の培養期間にかけて、別のγδＴ細胞集団、例えばδ２もしくはδ３集団または別のγδ亜集団などよりも１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１，０００，０００倍を超える増殖となるような速い速度でδ１細胞集団の成長を刺激し得る。他の場合では、作用物質は、１日～９０日の培養期間にかけて、δ１Ｔ細胞集団または別のγδＴ細胞亜集団などよりも１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１，０００，０００倍を超える増殖となるような速い速度でδ２またはδ３集団の成長を刺激し得る。他の場合では、作用物質は、１日～９０日の培養期間にかけて、δ１Ｔ細胞集団、δ３Ｔ細胞集団または別のγδＴ細胞亜集団などよりも１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍または１，０００，０００倍を超える増殖となるような速い速度でδ２集団の成長を刺激し得る。

【0087】

いくつかの態様において、本開示は、急速な速度で、例えば１時間ごとに約１回の細胞分裂の速度またはそれより速い速度などでγδＴ細胞集団の増殖を刺激する作用物質によって、γδＴ細胞集団の増殖が活性化されるγδＴ細胞集団を提供する。場合によっては、作用物質はδ１、δ２、またはδ３Ｔ細胞のいずれかの増殖を選択的に刺激する。γδＴ細胞集団はある量の非改変γδＴ細胞及びある量の改変γδＴ細胞を含むことができる。場合によっては、γδＴ細胞集団は異なるパーセンテージのδ１、δ２、及びδ３Ｔ細胞を含む。改変または非改変γδＴ細胞集団は、例えば９０％未満のδ１Ｔ細胞、８０％未満のδ１Ｔ細胞、７０％未満のδ１Ｔ細胞、６０％未満のδ１Ｔ細胞、５０％未満のδ１Ｔ細胞、４０％未満のδ１Ｔ細胞、３０％未満のδ１Ｔ細胞、２０％未満のδ１Ｔ細胞、１０％未満のδ１Ｔ細胞、または５％未満のδ１Ｔ細胞を含むことができる。あるいは、改変または非改変γδＴ細胞集団は、５％超のδ１Ｔ細胞、１０％超のδ１Ｔ細胞、２０％超のδ１Ｔ細胞、３０％超のδ１Ｔ細胞、４０％超のδ１Ｔ細胞、５０％超のδ１Ｔ細胞、６０％超のδ１Ｔ細胞、７０％超のδ１Ｔ細胞、８０％超のδ１Ｔ細胞、または９０％超のδ１Ｔ細胞を含むことができる。

【0088】

改変または非改変γδＴ細胞集団は、例えば９０％未満のδ２Ｔ細胞、８０％未満のδ２Ｔ細胞、７０％未満のδ２Ｔ細胞、６０％未満のδ２Ｔ細胞、５０％未満のδ２Ｔ細胞、４０％未満のδ２Ｔ細胞、３０％未満のδ２Ｔ細胞、２０％未満のδ２Ｔ細胞、１０％未満のδ２Ｔ細胞、または５％未満のδ２Ｔ細胞を含むことができる。あるいは、改変または非改変γδＴ細胞集団は、５％超のδ２Ｔ細胞、１０％超のδ２Ｔ細胞、２０％超のδ２Ｔ細胞、３０％超のδ２Ｔ細胞、４０％超のδ２Ｔ細胞、５０％超のδ２Ｔ細胞、６０％超のδ２Ｔ細胞、７０％超のδ２Ｔ細胞、８０％超のδ２Ｔ細胞、または９０％超のδ２Ｔ細胞を含むことができる。

【0089】

改変または非改変γδＴ細胞集団は、例えば９０％未満のδ３Ｔ細胞、８０％未満のδ３Ｔ細胞、７０％未満のδ３Ｔ細胞、６０％未満のδ３Ｔ細胞、５０％未満のδ３Ｔ細胞、４０％未満のδ３Ｔ細胞、３０％未満のδ３Ｔ細胞、２０％未満のδ３Ｔ細胞、１０％未満のδ３Ｔ細胞、または５％未満のδ３Ｔ細胞を含むことができる。あるいは、改変または非改変γδＴ細胞集団は、５％超のδ３Ｔ細胞、１０％超のδ３Ｔ細胞、２０％超のδ３Ｔ細胞、３０％超のδ３Ｔ細胞、４０％超のδ３Ｔ細胞、５０％超のδ３Ｔ細胞、６０％超のδ３Ｔ細胞、７０％超のδ３Ｔ細胞、８０％超のδ３Ｔ細胞、または９０％超のδ３Ｔ細胞を含むことができる。

【0090】

１種以上の活性化剤をγδＴ細胞と接触させることができ、その後、共刺激分子をγδＴ細胞と接触させてさらなる刺激を与え、γδＴ細胞を増殖させることができる。いくつかの実施形態において、活性化剤及び／または共刺激剤は、植物及び非植物起源のレクチン、γδＴ細胞を活性化するモノクローナル抗体、及び非レクチン／非抗体作用物質とすることができる。他の場合では、植物レクチンはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）とすることができるが、他の植物レクチン、例えばフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）などを用いてもよい。レクチンの他の例としては、タンパク質ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）、大豆アグルチニン（ＳＢＡ）、ｌｅｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡ）、ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）が挙げられる。

【0091】

活性化剤及び共刺激分子の非限定例としては、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、γ３．２０、７Ａ５、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、１１Ｆ２などの抗体、またはこれらの組合せが挙げられる。活性化剤及び共刺激分子の他の例としては、ゾレドロネート、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＴＰＡ）、メゼレイン、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、連鎖球菌プロテインＡ、またはこれらの組合せが挙げられる。

【0092】

他の場合では、活性化剤及び／または共刺激剤は、αＴＣＲ、βＴＣＲ、γＴＣＲ、δＴＣＲ、ＣＤ２７７、ＣＤ２８、ＣＤ４６、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＤ３０、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＨＶＥＭ、４－１ ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＦｃｅＲＩｇ、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＣＤ１６１、ＤＮＡＸ、アクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１）、ＳＬＡＭ、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体に対する抗体もしくはリガンドまたはこれらの組合せとすることができる。

【0093】

エピトープ同定
一態様において、本開示は速い成長速度で改変及び非改変γδＴ細胞の増殖を刺激する作用物質のエピトープを同定するための方法を提供する。エピトープは固有の空間的構造をした少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸を含むことができる。エピトープは隣接アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並んだ非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは一般に変性溶媒にさらされても維持され得る一方で、三次フォールディングによって形成されるエピトープは一般に変性溶媒で処理すると失われ得る。

【0094】

エピトープマッピングを行い、対象とする活性化剤、例えば５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、３．２０、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２、１１Ｆ２及び７Ａ５などによって認識される直線または非直線不連続アミノ酸配列（複数可）、すなわちエピトープを同定することができる。エピトープマッピングのための一般的アプローチは、一般に異種発現系における、対象とする抗体またはリガンドによって認識される全長ポリペプチド配列、及び様々な断片、すなわちポリペプチド配列の切断型の発現を必要とし得る。次に、こうした様々な組換えポリペプチド配列またはその断片（例えばＮ末端タンパク質（例えばＧＦＰ）との融合）を用いて、対象とする抗体またはリガンドがポリペプチド配列の切断型の１つ以上に結合可能であるかどうかを判定することができる。繰り返し切断を用いて部分的に一致するアミノ酸領域を有する組換えポリペプチド配列を生成することにより、対象とする抗体によって認識されるポリペプチド配列の領域を特定することが可能である（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６６， Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ， Ｅｄ （１９９６）を参照）。この方法は作用物質、例えば対象とする抗体などの、エピトープライブラリー、例えば膜支持体上の合成ペプチドアレイ、コンビナトリアル・ファージディスプレイペプチドライブラリーに由来するエピトープライブラリーなどから再現された配列に結合する能力に依存する。そして、エピトープライブラリーは抗体に対してスクリーニングされる可能性の範囲を提供する。加えて、エピトープの１つ以上の残基を標的とする部位特異的変異導入、またはランダムＡｌａスキャンを行い、エピトープの同一性を確認することができる。

【0095】

エピトープのライブラリーは、様々な可能なγδＴ細胞受容体（γδＴＣＲ）の組換えをｃＤＮＡ構築体として合成的に設計し、好適な系で発現させることによって作製することができる。例えば、そのＪδ領域において異なっている複数のＶδ１遺伝子セグメントを合成的に設計することができ、これにはＪδ１、Ｊδ２及びＪδ３遺伝子セグメントが挙げられる。あるいは、Ｖδ２Ｊδ１及びＶδ３Ｊδ１鎖を合成遺伝子として取り寄せ、好適なベクターにクローニングすることもできる。複数の合成的にクローニングしたδＴＣＲ鎖、例えばＶδ１Ｊδ１、Ｖδ１Ｊδ２、Ｖδ１Ｊδ３、Ｖδ１Ｊδ４、Ｖδ２及びＶδ３鎖などを、合成的にクローニングしたγＴＣＲ鎖、例えばＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９及びＶγ１０合成設計遺伝子セグメントなどとともに宿主系に共形質移入することができる。他の場合では、δＴＣＲ鎖、例えばＶδ１Ｊδ１、Ｖδ１Ｊδ２、Ｖδ１Ｊδ３、Ｖδ１Ｊδ４、Ｖδ２及びＶδ３鎖などは、ヒトＰＢＭＣまたはヒト正常及び悪性組織から単離したγδＴ細胞から抽出した全ＲＮＡから増幅することができる。

【0096】

宿主系は任意の好適な発現系、例えば２９３細胞、昆虫細胞など、または好適なインビトロ翻訳系とすることができる。宿主系に形質移入される合成設計γδＴ細胞セグメントの複数の様々な可能な組換えにより、例えば２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０を超える可能なペアの組合せのγδＴＣＲを得ることができる。前述のライブラリー中のエピトープのうちの１つに対する作用物質の結合は、標識化抗体、例えばＴＳ－１、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、γ３．２０、Ｒ９．１２、７Ａ５などをライブラリーのエピトープと接触させ、標識からのシグナルを検出することによって検出することができる。

【0097】

エピトープマッピングについて、計算アルゴリズムも開発されており、立体構造的不連続エピトープをマッピングすることが示されている。立体構造的エピトープは、例えばＸ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴を含めた方法でアミノ酸の空間的構造を決定することによって同定することができる。いくつかのエピトープマッピング方法、例えば抗原：抗体複合体の結晶のＸ線解析などにより、エピトープの原子分解能を得ることができる。他の場合では、エピトープマッピングのための計算的コンビナトリアル方法を用いて、抗体、例えばＴＳ－１抗体またはＴＳ８．２抗体などの配列に基づいて可能性のあるエピトープをモデリングすることができる。そのような場合において、抗体の抗原結合部分を配列決定し、計算モデルを用いて抗体の可能性のある結合部位を再構築及び予測する。

【0098】

場合によっては、本開示はγδＴ細胞受容体のエピトープの決定方法を提供するが、この方法は（ａ）γδＴ細胞受容体からエピトープのライブラリーを調製すること；（ｂ）エピトープのライブラリーを抗体と接触させること；及び（ｂ）エピトープのライブラリー中の、抗体が結合した少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列を同定することを含む。場合によっては、抗体は、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、Ｒ９．１２、１１Ｆ２及び７Ａ５抗体からなる群から選択される。ある場合において、抗体は固体支持体に付着している。エピトープのライブラリーは、Ｔ細胞受容体、例えばγＴＣＲまたはδＴＣＲなどの連続及び不連続エピトープに対応する配列を含むことができる。場合によっては、エピトープのライブラリーは、約１０アミノ酸長～約３０アミノ酸長、約１０アミノ酸長～約２０アミノ酸長、または約５アミノ酸長～約１２アミノ酸長の範囲のγδＴ細胞受容体からの断片を含む。場合によっては、抗体を標識化し、標識は放射性分子、発光分子、蛍光分子、酵素、またはビオチンである。

【0099】

治療方法
本明細書に記載の改変γδＴ細胞を含有する医薬組成物は、予防的及び／または治療的処置のために投与され得る。治療用途において、すでに疾患または病態を患っている被検者に、疾患または病態の症状を治療する、または少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で組成物を投与することができる。改変γδＴ細胞は、病態の発症、罹患、または悪化の可能性を低下させるために投与することもできる。治療用途に有効な改変γδＴ細胞集団の量は、疾患もしくは病態の重症度及び経過、それまでの治療法、被検者の健康状態、体重、及び／または薬剤への反応、及び／または治療する医師の判断に応じて変化し得る。

【0100】

本開示の改変γδＴ細胞は病態の治療を必要とする被検者を治療するために用いることができる。病態の例としては、癌、感染症、自己免疫障害及び敗血症が挙げられる。被検者は、ヒト、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、及び他の類人猿ならびにサル種など；家畜、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなど；家庭動物、例えばウサギ、イヌ及びネコなど；げっ歯類、例えばラット、マウス及びモルモットなどをはじめとする実験動物などとすることができる。被検者はあらゆる年齢とすることができる。被検者は、例えば、高齢者、成人、青年、少年少女、小児、幼児、乳児とすることができる。

【0101】

γδＴ細胞で被検者の病態（例えば病気）を治療する方法は、被検者に治療有効量の改変γδＴ細胞を投与することを含み得る。本開示のγδＴ細胞は、様々なレジメン（例えば時期、濃度、投与量、治療の間隔、及び／または製剤形態）で投与され得る。本開示の改変γδＴ細胞を与える前に、例えば化学療法、放射線、または両方の組合せによって被検者を前処置することもできる。治療の一部として、第１レジメンで改変γδＴ細胞が被検者に投与され、被検者は、第１レジメンでの治療が所与のレベルの治療有効性を満たすかどうか判定するために監視され得る。場合によっては、同じ改変γδＴ細胞または別の改変γδＴ細胞が第２レジメンで被検者に投与され得る。図２は被検者の治療方法を概略的に示す。第１処理２０１において、所与の病態（例えば癌）を有する、または有すると疑われる被検者に少なくとも１種の改変γδＴ細胞を投与する。改変γδＴ細胞は第１レジメンで被検者に投与され得る。第２処理２０２において、被検者は例えば医療提供者（例えば治療する医師または看護師）によって監視され得る。いくつかの例では、被検者の病態の治療における改変γδＴ細胞の有効性を判定または測定するために被検者を監視する。場合によっては、被検者におけるγδＴ細胞集団のインビボ増殖を判定するために被検者を監視してもよい。次に、第３処理２０３において、第２レジメンで被検者に少なくとも１種の他の改変γδＴ細胞を投与する。第２レジメンは第１レジメンと同じであってもよく、第１レジメンと異なっていてもよい。場合によっては、例えば、第１処理２０１における改変γδＴ細胞の投与が有効である（例えば一巡の投与が病態を治療するのに十分であり得る）と判明した場合、第３処理２０３は行わない。そのアロジェニック及び万能ドナー特性のために、改変γδＴ細胞の集団はＭＨＣハプロタイプが異なる様々な被検者に投与され得る。改変γδＴ細胞は被検者に投与される前に凍結またはクライオ保存され得る。

【0102】

改変γδＴ細胞の集団も被検者に投与される前に凍結またはクライオ保存され得る。改変γδＴ細胞の集団は、同一の腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同一及び異なる腫瘍認識部分の組合せを発現する２種以上の細胞を含むことができる。例えば、改変γδＴ細胞の集団は、異なる抗原、または同一抗原の異なるエピトープを認識するように設計された複数の異なる改変γδＴ細胞を含むことができる。例えば、黒色腫を患っているヒト細胞はＮＹ－ＥＳＯ－１癌遺伝子を発現することができる。ヒト体内の感染細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１癌タンパク質を小さな断片にプロセシングし、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質の様々な部分を抗原認識のために提示することができる。改変γδＴ細胞の集団は、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質の異なる部分を認識するように設計された異なる腫瘍認識部分を発現する様々な改変γδＴ細胞を含むことができる。図３は、黒色腫抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１の異なるエピトープを認識する改変γδＴ細胞の集団で被検者を治療するための方法を概略的に示す。第１処理３０１において、同一抗原の異なるエピトープを認識する改変γδＴ細胞の集団を選択する。例えば、改変γδＴ細胞の集団は、ＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質の異なる部分を認識する異なる腫瘍認識部分を発現する２種以上の細胞を含み得る。第２処理３０２において、改変γδＴ細胞の集団が第１レジメンで被検者に投与され得る。第２処理３０３において、被検者は例えば医療提供者（例えば治療する医師または看護師）によって監視され得る。

【0103】

本開示のγδＴ細胞は様々な病態を治療するために用いられ得る。場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含む癌を治療するために用いられ得る。癌の非限定例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、神経芽細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、例えば小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部神経膠腫など、乳癌、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮体癌、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍、神経膠腫、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、例えば非小細胞及び小細胞肺癌など、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口咽頭癌、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、皮膚メルケル細胞癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉癌、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍（妊娠性）、原発部位不明癌、尿道癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。

【0104】

場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は感染症を治療するために用いられ得る。感染症は例えば病原性細菌またはウイルスによって引き起こされ得る。様々な病原性タンパク質、核酸、脂質、またはこれらの断片が疾患細胞によって発現され得る。抗原提示細胞は、例えば、食作用または受容体媒介エンドサイトーシスによってそのような病原性分子を内在化することができ、適切なＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を提示する。例えば、病原性タンパク質の様々な９マー断片がＡＰＣによって提示され得る。本開示の改変γδＴ細胞は、病原性細菌またはウイルスの様々な抗原及び抗原断片を認識するように設計され得る。病原性細菌の非限定例は、ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、例えばＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ種など；ｂ）Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、例えばＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ種など；ｃ）Ｂｒｕｃｅｌｉａ属、例えばＢｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌａ ｍｅｌｉｔｅｒｉｓｉｓ、及び／またはＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ種など；ｄ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ種など；ｅ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ及びＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ属、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及び／またはＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ種など；ｆ）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、例えばＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ種など；ｇ）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ種など；ｈ）Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、及び／またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ種など；ｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種など；ｊ）Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、例えばＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ種など；ｋ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ種など；ｌ）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、例えばＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ種など；ｍ）Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、例えばＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ種など；ｎ）Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、例えばＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ種など；ｏ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種など；ｐ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及び／またはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ種など；ｑ）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、例えばＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ種など；ｒ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉａ種など；ｓ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ種など；ｔ）Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、例えばＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ種など；ｕ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ及び／またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ種など；ｖ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、例えばＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ種など；ｗ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、及び／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ種など；ｘ）Ｓｔｒｅｐｔｐｃｏｃｃｕｓ属、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及び／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ種など；ｙ）Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、例えばＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ種など；ｚ）Ｖｉｂｒｉｏ属、例えばＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａなど；及び／またはａａ）Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、例えばＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ種などに見出すことができる。

【0105】

場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は感染症を治療するために用いられ、感染症はウイルスによって引き起こされ得る。ウイルスの非限定例は、以下のウイルスの科に見出すことができ、代表的な種を例示する：ａ）Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばアデノウイルス種など；ｂ）Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、例えば単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型種など；ｃ）Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒト乳頭腫ウイルス種など；ｄ）Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＢＫウイルス、ＪＣウイルス種など；ｅ）Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科、例えば天然痘種など；ｆ）Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＢ型肝炎ウイルス種など；ｇ）Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒトボカウイルス、パルボウイルスＢ１９種など；ｈ）Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒトアストロウイルス種など；ｉ）Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えばノーウォークウイルス種など；ｊ）Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス種など；ｋ）Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば風疹ウイルス種など；ｌ）Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ科、例えばＥ型肝炎ウイルス種など；ｍ）Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）種など；ｎ）Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｗ科、例えばインフルエンザウイルス種など；ｏ）Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばグアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、及び／またはサビアウイルス種など；ｐ）Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、例えばクリミア・コンゴ出血熱ウイルス種など；ｑ）Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばエボラウイルス及び／またはマールブルグウイルス種など；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ヘンドラウイルス及び／またはニパウイルス種など；ｒ）Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ属、例えば狂犬病ウイルス種など；ｓ）Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えばロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス及び／またはバンナウイルス種など。いくつかの例では、ウイルス科に属していないウイルスもあり、例えばＤ型肝炎などである。

【0106】

場合によっては、本開示の改変γδＴ細胞は免疫疾患、例えば自己免疫疾患などを治療するために用いられ得る。自己免疫疾患は、炎症性疾患を含め、Ｂ細胞障害に関連する疾患の分類でもある。本明細書に開示の改変γδＴ細胞で治療することができる自己免疫病態をはじめとする免疫疾患または病態の例としては、関節リウマチ、リウマチ熱、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、乾癬、ぶどう膜炎、真性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、湿疹、強皮症、多発性筋炎／強皮症、多発性筋炎／皮膚筋炎、潰瘍性直腸炎、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、季節性アレルギー、通年性アレルギー、食物アレルギー、アナフィラキシー、肥満細胞症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、脾機能亢進症、白血球接着不全症、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、選択的免疫グロブリンＡ欠損症、高ＩｇＭ症候群、ＨＩＶ、自己免疫性リンパ増殖症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫症、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）、高免疫グロブリンＥ症候群、橋本甲状腺炎、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、多形性紅斑、ｇＡ腎症、高安動脈炎、アジソン病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、慢性活動性肝炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発筋痛症、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、線維化肺胞炎、及び癌が挙げられる。

【0107】

本開示のγδＴ細胞での治療は、病態の臨床的発症の前、その間、及びその後に被検者に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症の後、１日、１週、６か月、１２か月、または２年後に被検者に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症の後、１日、１週、１か月、６か月、１２か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはこれよりも長い間、被検者に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症の後、１日、１週、１か月、６か月、１２か月、または２年未満の間、被検者に提供され得る。治療は臨床試験でヒトを治療することも含み得る。治療は被検者に本開示の改変γδＴ細胞を含む医薬組成物を投与することを含むことができる。

【0108】

場合によっては、被検者への本開示の改変γδＴ細胞の投与は被検者の体内の内因性リンパ球の活性を調節する。場合によっては、被検者への改変γδＴ細胞（複数可）の投与は内因性Ｔ細胞に抗原を与え、免疫応答を増強し得る。場合によっては、メモリーＴ細胞はＣＤ４^＋Ｔ細胞である。場合によっては、メモリーＴ細胞はＣＤ８^＋Ｔ細胞である。場合によっては、被検者への改変γδＴ細胞（複数可）の投与は別の免疫細胞の細胞傷害性を活性化する。場合によっては、この別の免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。場合によっては、この別の免疫細胞はナチュラルキラーＴ細胞である。場合によっては、被検者への改変γδＴ細胞（複数可）の投与は調節性Ｔ細胞を抑制する。場合によっては、調節性Ｔ細胞はＦｏｘ３＋Ｔｒｅｇ細胞である。場合によっては、調節性Ｔ細胞はＦｏｘ３－Ｔｒｅｇ細胞である。本開示の改変γδＴ細胞によってその活性を調節することのできる細胞の非限定例としては、造血幹細胞；Ｂ細胞；ＣＤ４；ＣＤ８；赤血球；白血球；樹状抗原提示細胞を含む樹状細胞；白血球；マクロファージ；メモリーＢ細胞；メモリーＴ細胞；単球；ナチュラルキラー細胞；好中球、ヘルパーＴ細胞；及びキラーＴ細胞が挙げられる。

【0109】

ほとんどの骨髄移植において、被検者の免疫系による移植組織中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶反応を防止するために、シクロホスファミドと全身放射線照射との組合せが従来用いられている。場合によっては、ドナー骨髄中のキラーリンパ球の生成を亢進するために、エクスビボでのインターロイキン２（ＩＬ－２）によるドナー骨髄のインキュベーションが行われる。インターロイキン２（ＩＬ－２）は野生型リンパ球の成長、増殖、及び分化に必要なサイトカインである。ヒトへのγδＴ細胞の養子移入の現在の研究では、γδＴ細胞及びインターロイキン２の共投与を必要としている場合がある。しかし、ＩＬ－２の低投与量及び高投与量の両方とも毒性が高い副作用を有する恐れがある。ＩＬ－２毒性は複数の器官／系で現れ得るが、心臓、肺、腎臓、及び中枢神経系で最も著しい。場合によっては、本開示は、サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１などの共投与なしで改変γδＴ細胞を被検者に投与する方法を提供する。場合によっては、ＩＬ－２との共投与なしで改変γδＴ細胞を被検者に投与することができる。場合によっては、ＩＬ－２との共投与なしで、手術、例えば骨髄移植などの間に改変γδＴ細胞を被検者に投与する。

【0110】

投与方法
１種または複数の改変γδＴ細胞（複数可）を任意の順序でまたは同時に被検者に投与することができる。同時の場合、複数の改変γδＴ細胞（複数可）は、単一の一体化された形態、例えば静脈内注射など、または複数の形態、例えば複数の静脈内注入、ｓ．ｃ、注射または丸薬として提供することができる。改変γδＴ細胞（複数可）は、単一パッケージまたは複数のパッケージに一緒にまたは別々に充填することができる。１種またはすべての改変γδＴ細胞（複数可）は複数回投与で与えることができる。同時ではない場合、複数回投与の間のタイミングは様々であり、約１週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、または約１年にもなり得る。場合によっては、改変γδＴ細胞（複数可）は、被検者への投与後に被検者の体内でインビボ増殖することができる。改変γδＴ細胞（複数可）は、複数回治療用の細胞に同一の細胞調製を行うために凍結することができる。本開示の改変γδＴ細胞（複数可）、及びこれを含む医薬組成物はキットとしてパッケージ化することができる。キットは改変γδＴ細胞（複数可）及びこれを含む組成物の使用についての指示（例えば説明書）を含み得る。

【0111】

場合によっては、癌の治療方法は、治療有効量の改変γδＴ細胞（複数可）を被検者に投与することを含み、投与により癌が治療される。いくつかの実施形態において、治療有効量の改変γδＴ細胞（複数可）を少なくとも約１０秒、３０秒、１分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、または１年間投与する。いくつかの実施形態において、治療有効量の改変γδＴ細胞（複数可）を少なくとも１週間投与する。いくつかの実施形態において、治療有効量の改変γδＴ細胞（複数可）を少なくとも２週間投与する。

【0112】

本明細書に記載の改変γδＴ細胞（複数可）は、疾患または病態の発症前、その間、またはその後に投与することができ、改変γδＴ細胞を含有する医薬組成物を投与するタイミングは様々であり得る。例えば、改変γδＴ細胞を予防薬として用いることができ、病態または疾患にかかる傾向のある被検者に、疾患または病態の発症の可能性を低下させるために継続的に投与することができる改変γδＴ細胞（複数可）は症状の発症の間またはその後で可能な限り早く被検者に投与することができる。改変γδＴ細胞（複数可）の投与は、症状の発症中すぐに、症状発症の最初の３時間以内、症状発症の最初の６時間以内、症状発症の最初の２４時間以内、症状発症の４８時間以内、または症状発症から任意の時間以内に開始することができる。最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤形態を用いて任意の実用的な経路を介して、例えば本明細書に記載の任意の経路などによって行うことができる。いくつかの例では、本開示の改変γδＴ細胞の投与は静脈内投与である。１つまたは複数の投与量の改変γδＴ細胞は、癌、感染症、免疫疾患、敗血症の発症後、または骨髄移植において実施可能な限り早く、かつ、免疫疾患の治療に必要な期間、例えば約２４時間～約４８時間、約４８時間～約１週間、約１週間～約２週間、約２週間～約１か月、約１か月～約３か月などの間投与することができる。癌の治療については、１つまたは複数の投与量の改変γδＴ細胞は、癌の発症の数年後で他の治療の前または後に投与することができる。いくつかの例では、少なくとも約１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、または少なくとも５年の間、改変γδＴ細胞（複数可）を投与することができる。治療の長さは被検者それぞれに対して異なり得る。

【0113】

投与量
本明細書に開示の改変γδＴ細胞（複数可）は正確な投与量の単回投与に適した単位剤形に製剤化され得る。場合によっては、単位剤形は別のリンパ球を含む。単位剤形では、１種以上の化合物の適切な量を含有する単位投与量に製剤を分割する。単位投与量は製剤の個々の量を含有するパッケージの形態とすることができる。非限定例は包装された錠剤またはカプセル、及びバイアルまたはアンプル中の粉末である。水性懸濁液組成物は単回投与量の再封不可能な容器に入れることができる。複数回投与量の再封可能な容器を、例えば保存剤とともに、または保存剤なしで用いることができる。いくつかの例では、医薬組成物は保存剤を含まない。腸管外注入用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプルで、または保存剤を含む複数回投与量の容器で提供することができる。

【0114】

本明細書に記載の改変γδＴ細胞は、少なくとも５細胞、少なくとも１０細胞、少なくとも２０細胞、少なくとも３０細胞、少なくとも４０細胞、少なくとも５０細胞、少なくとも６０細胞、少なくとも７０細胞、少なくとも８０細胞、少なくとも９０細胞、少なくとも１００細胞、少なくとも２００細胞、少なくとも３００細胞、少なくとも４００細胞、少なくとも５００細胞、少なくとも６００細胞、少なくとも７００細胞、少なくとも８００細胞、少なくとも９００細胞、少なくとも１×１０^３細胞、少なくとも２×１０^３細胞、少なくとも３×１０^３細胞、少なくとも４×１０^３細胞、少なくとも５×１０^３細胞、少なくとも６×１０^３細胞、少なくとも７×１０^３細胞、少なくとも８×１０^３細胞、少なくとも９×１０^３細胞、少なくとも１×１０^４細胞、少なくとも２×１０^４細胞、少なくとも３×１０^４細胞、少なくとも４×１０^４細胞、少なくとも５×１０^４細胞、少なくとも６×１０^４細胞、少なくとも７×１０^４細胞、少なくとも８×１０^４細胞、少なくとも９×１０^４細胞、少なくとも１×１０^５細胞、少なくとも２×１０^５細胞、少なくとも３×１０^５細胞、少なくとも４×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも６×１０^５細胞、少なくとも７×１０^５細胞、少なくとも８×１０^５細胞、少なくとも９×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも２×１０^６細胞、少なくとも３×１０^６細胞、少なくとも４×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも６×１０^６細胞、少なくとも７×１０^６細胞、少なくとも８×１０^６細胞、少なくとも９×１０^６細胞、少なくとも１×１０^７細胞、少なくとも２×１０^７細胞、少なくとも３×１０^７細胞、少なくとも４×１０^７細胞、少なくとも５×１０^７細胞、少なくとも６×１０^７細胞、少なくとも７×１０^７細胞、少なくとも８×１０^７細胞、少なくとも９×１０^７細胞、少なくとも１×１０^８細胞、少なくとも２×１０^８細胞、少なくとも３×１０^８細胞、少なくとも４×１０^８細胞、少なくとも５×１０^８細胞、少なくとも６×１０^８細胞、少なくとも７×１０^８細胞、少なくとも８×１０^８細胞、少なくとも９×１０^８細胞、少なくとも１×１０^９細胞、またはこれより多い量で組成物中に存在し得る。

【0115】

本発明の改変γδＴ細胞の治療有効量は、約１細胞～約１０細胞、約１細胞～約１００細胞、約１細胞～約１０細胞、約１細胞～約２０細胞、約１細胞～約３０細胞、約１細胞～約４０細胞、約１細胞～約５０細胞、約１細胞～約６０細胞、約１細胞～約７０細胞、約１細胞～約８０細胞、約１細胞～約９０細胞、約１細胞～約１００細胞、約１細胞～約１×１０^３細胞、約１細胞～約２×１０^３細胞、約１細胞～約３×１０^３細胞、約１細胞～約４×１０^３細胞、約１細胞～約５×１０^３細胞、約１細胞～約６×１０^３細胞、約１細胞～約７×１０^３細胞、約１細胞～約８×１０^３細胞、約１細胞～約９×１０^３細胞、約１細胞～約１×１０^４細胞、約１細胞～約２×１０^４細胞、約１細胞～約３×１０^４細胞、約１細胞～約４×１０^４細胞、約１細胞～約５×１０^４細胞、約１細胞～約６×１０^４細胞、約１細胞～約７×１０^４細胞、約１細胞～約８×１０^４細胞、約１細胞～約９×１０^４細胞、約１細胞～約１×１０^５細胞、約１細胞～約２×１０^５細胞、約１細胞～約３×１０^５細胞、約１細胞～約４×１０^５細胞、約１細胞～約５×１０^５細胞、約１細胞～約６×１０^５細胞、約１細胞～約７×１０^５細胞、約１細胞～約８×１０^５細胞、約１細胞～約９×１０^５細胞、約１細胞～約１×１０^６細胞、約１細胞～約２×１０^６細胞、約１細胞～約３×１０^６細胞、約１細胞～約４×１０^６細胞、約１細胞～約５×１０^６細胞、約１細胞～約６×１０^６細胞、約１細胞～約７×１０^６細胞、約１細胞～約８×１０^６細胞、約１細胞～約９×１０^６細胞、約１細胞～約１×１０^７細胞、約１細胞～約２×１０^７細胞、約１細胞～約３×１０^７細胞、約１細胞～約４×１０^７細胞、約１細胞～約５×１０^７細胞、約１細胞～約６×１０^７細胞、約１細胞～約７×１０^７細胞、約１細胞～約８×１０^７細胞、約１細胞～約９×１０^７細胞、約１細胞～約１×１０^８細胞、約１細胞～約２×１０^８細胞、約１細胞～約３×１０^８細胞、約１細胞～約４×１０^８細胞、約１細胞～約５×１０^８細胞、約１細胞～約６×１０^８細胞、約１細胞～約７×１０^８細胞、約１細胞～約８×１０^８細胞、約１細胞～約９×１０^８細胞、または約１細胞～約１×１０^９細胞とすることができる。

【0116】

場合によっては、本発明の改変γδＴ細胞の治療有効量は、約１×１０^３細胞～約１細胞～約２×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^３細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^４細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^５細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^６細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^７細胞、約１×１０^３細胞～約１×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約２×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約３×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約４×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約５×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約６×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約７×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約８×１０^８細胞、約１×１０^３細胞～約９×１０^８細胞、または約１×１０^３細胞～約１×１０^９細胞とすることができる。

【0117】

保存
いくつかの実施形態において、γδＴ細胞は凍結培地中で製剤化され、少なくとも約１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、３年、または少なくとも５年の長期保存のために低温保存装置、例えば液体窒素冷凍装置（－１９５℃）または超低温冷凍装置（－６５℃、－８０℃または－１２０℃）などに入れられ得る。凍結培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及び／またはデキストロース、及び／または硫酸デキストラン及び／またはヒドロイエチルデンプン（ｈｙｄｒｏｙｅｔｈｙｌ ｓｔａｒｃｈ）（ＨＥＳ）を、約６．０～約６．５、約６．５～約７．０、約７．０～約７．５、約７．５～約８．０または約６．５～約７．５のｐＨを維持するための生理的ｐＨ緩衝剤とともに含有することができる。凍結保存γδＴ細胞は、解凍して本明細書に記載の抗体、タンパク質、ペプチド、及び／またはサイトカインでの刺激によってさらに処理することができる。凍結保存γδＴ細胞は、解凍して本明細書に記載のウイルスベクター（レトロウイルス及びレンチウイルスベクターを含む）または非ウイルス手段（ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質を含む）で遺伝子組換えすることができる。改変γδＴ細胞をさらに凍結保存して、凍結培地中１ｍＬ当たり少なくとも約１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または少なくとも約１０^１０細胞で少なくとも約１，５，１０、１００、１５０、２００、５００バイアルの量の細胞バンクを作製することができる。凍結保存細胞バンクはその機能を保持し得、解凍してさらに刺激及び増殖させることができる。いくつかの態様において、解凍した細胞を好適な密閉容器内、例えば細胞培養バッグ及び／またはバイオリアクターなどで刺激及び増殖させて、アロジェニック細胞製品としての細胞の量を生成することができる。凍結保存γδＴ細胞は、低温保存条件下で少なくとも約６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１５か月、１８か月、２０か月、２４か月、３０か月、３６か月、４０か月、５０か月、または少なくとも約６０か月間その生物学的機能を維持することができる。いくつかの態様において、製剤に保存剤を用いない。凍結保存γδＴ細胞は、アロジェニック汎用細胞製品として解凍して複数の患者に注入することができる。

【0118】

本発明は以下の実施例を参照することによってより深く理解され得るが、実施例により特許請求の範囲を限定する意図はない。

【実施例】

【0119】

実施例１．一次細胞単離
アフェレーシス機器を用いて一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康なドナーから収集する。ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）システムまたは類似のシステムで精製する。その後、細胞を適切な成長培地に再懸濁する。

【0120】

あるいは、末梢血、臍帯血、骨髄、健康組織、または疾患を患っている組織、例えば癌組織などから一次ヒト細胞を収集する。

【0121】

実施例２．健康なドナー由来の組織
健康なドナー由来の新鮮組織をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手し、ＲＰＭＩ－１６４０培地に入れ実験室に輸送する。組織をメスで１～３ｍｍ^３断片に切断する。ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ヒトＡＢ血清ならびに１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を追加した２ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０中の２～５断片／ウェルを２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に入れるか、または後述のように消化する。プレートを３７℃、空気中５％ＣＯ_２で加湿インキュベーター内でインキュベートする。１日おきに培養物を検査してリンパ球の増殖を監視する。培養開始後７日ごとにすべてのウェルで培地の半分を交換する。密集したリンパ球のカーペットが断片の周りを覆うか、または後述のように消化した組織に由来するリンパ球集団が適切な濃度に達したら、リンパ球を収集する。

【0122】

実施例３．組織の酵素消化
健康なドナー由来の新鮮組織サンプルをＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手し、ＲＰＭＩ－１６４０培地に入れ実験室に輸送した。Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＤＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、またはＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＭ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の２つの酵素ブレンドを用いて、リンパ球を酵素消化によって単離した。組織を２～３ｍｍ^３の断片に切断し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間消化した。消化した細胞懸濁液を４０μｍフィルターに通し、スピンダウンしてＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した。細胞を計数し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を追加したＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に再懸濁した。収集した細胞集団を２４ウェル組織培養プレートに０．５～１×１０^６細胞／ｍｌで接種した。細胞が１．５×１０^６細胞／ｍｌの濃度を超えた場合、細胞をＲＰＭＩ－ＩＬ２含有培地に分割した。

【0123】

実施例４．腫瘍検体の培養
結腸、乳房、腎臓、頭頚部、口腔、膵臓及び肝臓のものを含む原発性及び転移性癌の患者由来の新鮮腫瘍検体をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手し、ＲＰＭＩ培地に入れ実験室に輸送した。腫瘍検体をメスで１～３ｍｍ^３断片に切断した。ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン及び１０％ヒトＡＢ血清ならびに１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を追加した２ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０中の２～５断片／ウェルを２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に入れた。プレートを３７℃、空気中５％ＣＯ_２で加湿インキュベーター内でインキュベートした。１日おきに培養物を検査してリンパ球の増殖を監視した。培養開始後７日ごとにすべてのウェルで培地の半分を交換した。密集したリンパ球のカーペットが断片の周りを覆ったら、リンパ球を収集した。

【0124】

実施例５．新鮮腫瘍検体の酵素消化
結腸、乳房、腎臓、頭頚部、口腔、膵臓及び肝臓のものを含む原発性及び転移性癌の患者由来の新鮮腫瘍検体をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手し、ＲＰＭＩ培地に入れ実験室に輸送した。Ｌｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＤＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、またはＬｉｂｅｒａｓｅ（商標）ＴＭ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の２つの酵素ブレンドを用いて、リンパ球を酵素消化によって単離した。組織を２～３ｍｍ^３の断片に切断し、３７℃、空気中５％ＣＯ_２で１時間消化した。消化した細胞懸濁液を４０μｍフィルターに通し、スピンダウンしてＲＰＭＩ－１６４０培地で洗浄した。細胞を計数し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び１００ＩＵ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を追加したＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）に再懸濁した。収集した細胞集団を２４ウェル組織培養プレートに０．５～１×１０^６細胞／ｍｌで接種した。細胞が１．５×１０^６細胞／ｍｌの濃度を超えた場合、細胞をＲＰＭＩ－ＩＬ２含有培地に分割した。

【0125】

実施例６．例示的な血清添加培地での一次細胞の培養
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＡ， 米国）を用いて健康なドナーに由来するバフィーコートから分離することによってＰＢＭＣ集団を得た。２４ウェル組織培養プレートにおいて、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ ストレプトマイシン、及び１００ｒｈＩＬ－２／ｍｌを追加したＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣｅｌｌＧｒｏ）中で、１×１０^６細胞／ｍＬでＰＢＭＣを培養した。

【0126】

末梢血、臍帯血、骨髄、健康組織、または疾患を患っている組織、例えば前述の癌組織などから収集した一次細胞を成長させるために、類似の培養条件を用いることができる。

【0127】

実施例７．例示的な無血清培地での一次細胞の培養
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＰＡ， 米国）を用いて健康なドナーに由来するバフィーコートから分離することによってＰＢＭＣ集団を得た。２４ウェル組織培養プレートにおいて、ＣＴＳ－ＯｐＴｍｉｚｅｒサプリメントを含むＣＴＳ無血清培地中で、１×１０^６細胞／ｍＬでＰＢＭＣを培養した。

【0128】

末梢血、臍帯血、骨髄、健康組織、または疾患を患っている組織、例えば前述の癌組織などから収集した一次細胞を成長させるために、類似の培養条件を用いることができる。

【0129】

実施例８：接着性単球及びマクロファージの除去
ＰＭＢＣを前述のアフェレーシス法で収集し、低張処理またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いた密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣをラージスケール組織培養容器中、例えば１０スタックまたは４０スタックＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などでインキュベートする。マクロファージ及び単球を含む接着性集団は一般に細胞培養容器の表面に付着したままとなる。懸濁集団中で成長した細胞集団はγδＴ細胞が豊富である。およそ１０^８、１０^９または１０^１０ＰＢＭＣをＣＤ４及びＣＤ８でコーティングされた鉄含有マイクロビーズ（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈマイクロビーズ）でインキュベートする。インキュベートした細胞集団を磁場中に流し通すと、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞がそこに留まる。「フロースルー」細胞集団はγδＴ細胞が豊富である。

【0130】

実施例９：単球及びマクロファージの除去
ＰＭＢＣを前述のアフェレーシス法で収集し、低張処理またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いた密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣをラージスケール組織培養容器中、例えば１０スタックまたは４０スタックＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などでインキュベートする。赤血球除去ＰＢＭＣをグラスウール充填カラムに流すことによって単球及びマクロファージを除去する。「フロースルー」細胞集団はさらなる処理のためのγδＴ細胞が豊富である。

【0131】

実施例１０：γδＴ細胞の富化
ＰＭＢＣを前述のアフェレーシス法で収集し、低張処理またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を用いた密度分離によって赤血球を除去する。赤血球不含ＰＢＭＣをラージスケール組織培養容器中、例えば１０スタックまたは４０スタックＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ）、ローラーボトル（Ｎｕｎｃ）などでインキュベートする。実施例８または実施例９に記載した方法のいずれかによって単球及びマクロファージを除去する。およそ１０^８、１０^９または１０^１０ＰＢＭＣをＣＤ４及びＣＤ８でコーティングされた鉄含有マイクロビーズ（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈマイクロビーズ）でインキュベートする。インキュベートした細胞集団を磁場中に流し通すと、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞がそこに留まる。「フロースルー」細胞集団はγδＴ細胞が豊富である。不要な細胞、例えばＮＫ、γδＴ細胞、Ｂ細胞、単球及びマクロファージなどは、不要な細胞型を対象とする抗体のカクテルを用いた免疫磁気ビーズ分離（例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｕｔｏＭＡＣＳシステム）によって除去する。

【0132】

あるいは、ＮＫ、ａｂＴ細胞、Ｂ細胞、単球及びマクロファージ上の表面受容体を対象とする四量体抗体複合体または二重特異性抗体を用いることによって、不要な細胞型を除去する。

【0133】

実施例１１．抗体による一次細胞からのγδＴ細胞の単離
一実施例では、細胞表面マーカーのポジティブ（すなわちγδＴＣＲ）またはネガティブ（すなわちαβＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６）発現に基づいて、フローサイトメトリーソーティングで一次培養物から天然γδＴ細胞を単離する。

【0134】

実施例１２．原発性腫瘍からのγδＴ細胞の単離
新たに採取された腫瘍検体をＮＣＩ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手した。肝臓転移結腸腺癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）がＲＰＭＩ－１６４０培地に入れて輸送された。平刃を用いて腫瘍組織を２ｍｍ^３の大きさの小片に細断し、その後、ＲＰＭＩ及び３０００ユニットのＤＮａｓｅ中２ｍＬのＬｉｂｅｒａｓｅ酵素カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で記載したように消化した。消化後に腫瘍を滅菌ガーゼ４０μｍナイロンメッシュに通して濾過し、ＲＰＭＩ－１６４０で２回洗浄した。細胞を計数し、Ｌ－グルタミン、及び１００Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を追加した１０％ヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０中１×１０^６／ｍｌとして２４ウェルプレートで培養した。培養６日後に腫瘍浸潤リンパ球を収集した。フローサイトメトリー抗δ１ＴＣＲ（ＦＩＴＣ結合抗Ｖδ１ＴＳ８．２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び抗Ｖδ２ Ｂ６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によってγδＴリンパ球の存在を分析した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。

【0135】

図４は、肝臓転移結腸腺癌（ＴＩＬ１）及び腎腫瘍（ＴＩＬ２）から単離したγδ１及びγδ２リンパ球の成長を図示するグラフを示す。これらのリンパ球はＣＣＲ４及びＣＣＲ７を発現することがわかっている。図４に示すように、Ｖδ１サブセットが両タイプの腫瘍から単離された主な集団であった。

【0136】

実施例１３．γδＴ細胞の刺激及び増殖
サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３またはＩＬ－３３）、成長因子（インスリン及びトランスフェリン、インスリン様成長因子）、アルブミン、脂質（コレステロール、脂質溶液、脂質前駆体）、ビタミン、銅、鉄、セレン、タンパク質加水分解物、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、及び剪断保護剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）を含有する無血清培地、例えばＥｘ－Ｖｉｖｏ１０、Ｅｘ－Ｖｉｖｏ１５、Ｅｘ－Ｖｉｖｏ２０、ＡＩＭＶ培地、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＴＳなどの中でγδＴ細胞を刺激して増殖させる。

【0137】

γδＴ細胞の生物学的機能を維持すると同時に、懸濁培養（例えばＷＡＶＥバイオリアクター）において１０^５～２×１０^７細胞／ｍＬの高い細胞密度のγδＴ細胞の成長を補助するために、この実施例に記載の無血清培地に添加剤を追加することができる。

【0138】

実施例１４．無血清培地中でのロバストなγδＴ細胞成長をもたらす添加剤
ロバストなγδＴ細胞成長をもたらす追加の添加剤には、塩化カルシウム、無水物、硝酸カルシウム、硫酸第二銅、五水和物、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、及び／またはプトレシンが含まれていた。

【0139】

血清の代わりとなる低濃度の元素成分を供給するために無血清培地に微量金属を添加したが、これにはパラモリブデン酸アンモニウム、バナジウム、マンガン、ニッケル、亜セレン酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、九水和物、塩化第一スズ、塩化アルミニウム、酢酸バリウム、塩化カドミウム、塩化第二クロム、コバルト、二酸化ゲルマニウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ルビジウム、硝酸銀、フッ化ナトリウム、及び／または塩化ジルコニルが含まれる。

【0140】

細胞培養培地に添加される他の成分でγδＴ細胞のロバストな成長を補助するものは、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、ベタインタウリン、フォリン酸、エタノールアミン、リノール酸、オレイン酸ヒドロコルチゾン、ピルビン酸、植物加水分解物、酵母加水分解物、及び／またはベータ－メルカプトエタノールである。

【0141】

ロバストなγδＴ細胞成長を促進するために添加されるビタミンとしては、ビオチン（Ｂ７）、Ｄ－パントテン酸カルシウム（Ｂ５）、塩化コリン、シアノコバラミン（Ｂ１２）、葉酸（Ｂ９）、ｉ－イノシトール（ミオイノシトール）、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキサール、一塩酸塩、ピリドキシン、一塩酸塩（Ｂ６）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン、及び／または一塩酸塩（Ｂ１）が挙げられる。

【0142】

実施例１５：増殖したγδＴ細胞の同定：免疫表現型
異なる集団を区別する細胞表面マーカーに対するＦＡＣＳ染色によって増殖したＴ細胞集団を同定する。２％ウシ胎児血清を含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）中で細胞を１回洗浄し、４℃で３０分間適量のＭＡｂとともにインキュベートしてＨＢＳＳで再び洗浄した。簡潔に述べると、ＣＤ２、ＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ３）、ＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ４）、ＣＤ７、ＣＤ８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡＴ８）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ９５、ＣＤ１０７、ＩＣＡＭ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＫＧ２Ｄ ＤＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５ ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、Ｋｉ６７、Ｌ－セレクチン、ＶＬＡ－４、ＪＡＭＬ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ－４、Ｏｘ４０、ＴＣＲ Ｖδ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、クローンＴＳ８．２）、またはＴＣＲ Ｖδ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローンＢ６）を対象とするフルオロイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）結合ＭＡｂを含有する１００ｕｌの量のＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％ウシ胎児血清を含有するＨＢＳＳ）中で１×１０^６細胞を染色する。

【0143】

表面マーカーに加えて、サイトカイン分泌、細胞内サイトカイン及び／または膜結合型サイトカインを同定し、これらにはＴＮＦ－α ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、またはＩＬ－２１が含まれる。

【0144】

ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）アミン染色色素の不在または少ない取り込みによって生細胞を判定した。各抗原の表面表現のポジティブ及びネガティブのゲート境界線を定めるために蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照を用いる。Ｓｏｎｙ ＳＨ８００サイトメーターで染色細胞を収集し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１を用いてデータを分析する。フローサイトメトリーデータをドットプロットとして可視化する。

【0145】

実施例１６．血清含有培地及び無血清培地でのδ２Ｔ細胞増殖
血清含有培地（Ｒ２：ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）及び無血清培地（ＡＩＭＶ＋ウシアルブミン；ＣＴＳ無血清サプリメント）において、異なるδ２Ｔ細胞の成長及び増殖速度を評価した。図５はδ２Ｔ細胞の成長を図示するグラフを示す。本実験に用いたすべての培地は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、２ｍＭのグルタミン及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有していた。さらに、０日目に１、５及び２０μＭのゾレドロン酸で細胞を刺激した。ゾレドロン酸のさらなる添加はなしで２～３日ごとに培地を補充した。１３日の期間の後の各処理の１０^６ＰＢＭＣから増殖したδ２Ｔ細胞の総数及び増殖倍率を図５に示す。

【0146】

実施例１７．抗γδＴＣＲ抗体の遮断及び競合アッセイ
図６及び図７は抗γδＴＣＲ抗体遮断実験を図示するグラフを示し、図８及び図９は抗体競合アッセイを示す。図６及び図７は遮断実験の結果を示すが、この実験ではＰＢＭＣを様々な抗体、すなわち５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ３、Ｂ６、ＴＳ－１、γ３．２０、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２でプレインキュベートした。その後、細胞を洗浄して二次ＴＳ８．２－ＦＩＴＣ（δ１特異的）またはＢ６－ＰＥ（δ２特異的）抗体で染色した。フローサイトメトリーによってＰＢＭＣサンプルを分析した。幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）の低下を用いて遮断の程度を評価した。ＴＳ８．２－ＦＩＴＣ（図６）及びＢ６－ＰＥ（図７）に対して阻害のレベルを示す。

【0147】

１、２または１０μｇの非標識競合抗体（ＩｇＧ１、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、ＴＳ－１、Ｒ９．１２、ＩＭＭＵ５１０、または１１Ｆ２）及び０．２μｇのＦＩＴＣ結合抗Ｖδ１ＴＣＲクローンＴＳ８．２（図８）または抗Ｖδ１ＴＣＲクローンＴＳ－１（図９）で同時に、氷上で３０分間１×１０^５細胞をインキュベートすることによって、γδ１ＴＣＲ発現細胞株ＢＥ１３上への結合に対するＭＡｂ ＴＳ－１及びＴＳ８．２と抗体５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＩＭＭＵ５１０、Ｒ９．１２－２、または１１Ｆ２との間の競合調査を行った。幾何平均蛍光の最大変化で割った幾何平均蛍光の変化によって競合率（％）を計算した。図９に示すように、ＴＳ－１抗体はＴＳ８．２抗体自身と同じくらい効果的にＴＳ８．２の細胞への結合と競合した。他の抗体はどれもＴＳ８．２結合と競合することができなかった。ＴＳ８．２抗体はＴＳ－１の細胞への結合と競合したが、ＴＳ－１抗体自身ほど効果的ではなかった。ある程度のＴＳ－１結合との競合が１１Ｆ２抗体についても観察された。これらの結果は、ＴＳ－１及びＴＳ８．２抗体は両方ともγδ１と結合するが、おそらく同一エピトープではないことを示す。

【0148】

実施例１８．腫瘍検体の酵素消化及び特異的γδエピトープに対する抗体でのγδＴ細胞増殖
２４ウェルプレートを０．５～１μｇの抗γδＴＣＲ抗体でコーティングした。消化した腫瘍組織から実施例１０に記載したように単離した細胞を計数し、１０％ヒトＡＢ血清及びｒｈＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地中０．５～１×１０^６細胞／ｍｌで抗体でコーティングしたウェルに接種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ_２で７４～２１日間インキュベートした。

【0149】

実施例１９．腫瘍検体の酵素消化及び特異的γδエピトープに対する抗体でのγδＴ細胞増殖
実施例５に記載したように消化した腫瘍組織から単離した細胞を計数し、１０％ヒトＡＢ血清及びｒｈＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地中０．５～１×１０^６細胞／ｍｌで、三次元細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）超低接着マルチウェルプレート）の抗体でコーティングしたウェルに接種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ_２で７４～２１日間インキュベートした。

【0150】

実施例２０．ＰＢＭＣ由来のγδＴ細胞の活性化及び増殖
活性化剤は、可溶性作用物質、または培養ウェルに固定化した作用物質のいずれかとして試験した。１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度で２４ウェルプレート中で培養したヒトＰＢＭＣに、可溶性抗原及び抗体を０．１～５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。あるいは、２４ウェル培養プレートのウェルをコーティングすることによって、抗γδＴＣＲ抗体を固定化した。抗γδＴＣＲ抗体は０．１～１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。ＰＢＳでウェルを２回洗浄し、その後、ＰＢＭＣをプレートに移して、上記のようにＲＰＭＩ－１６４０、ＡＩＭ－ＶまたはＣＴＳ－ＯｐＴｍｉｚｅｒ培地のいずれかで培養した。培養培地には１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を追加した。

【0151】

実施例２１．ＰＢＭＣ由来のγδＴ細胞の活性化及び増殖
ドナーＢ３由来の１００万ＰＢＭＣを、２４ウェルプレートに１ウェル当たり０．５、１、及び２μｇで固定化した様々な抗体で０日目に刺激した。試験した抗体は、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照クローンＭＧ１－４５（Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ）、ＵＣＨＴ－１、５Ａ６．Ｅ９、Ｂ１、ＴＳ８．２、１５Ｄ、Ｂ６、Ｂ３、ＴＳ－１、γ３．２０、７Ａ５、及びゾレドロネートであった。図１０及び図１１は、それぞれＰＢＭＣ由来のδ１及びδ２Ｔ細胞の活性化及び増殖を図示するグラフを示す。細胞は、１０％ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２、グルタミン及び１×ペニシリン ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩを含有する培地中で活性化及び増殖させた。最初の刺激後７日目に、細胞を新鮮な培地に継代し、同一濃度の同一抗体で新たにコーティングした２４ウェルプレートに入れた。再刺激した培養物の培地は１３日目まで２～３日ごとに補充し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0152】

図１２は成長及び増殖の１３日後のδ１Ｔ細胞の総数を示し、図１３は成長及び増殖の１３日後のδ２Ｔ細胞の総数を示す。γδＴ細胞の総数は、δ１及びδ２Ｔ細胞のパーセンテージ（それぞれＴＳ８．２－ＦＩＴＣ及びＢ６－ＰＥを用いたフローサイトメトリーによって求めた）に全生細胞数を掛け、非特異的マウスＩｇＧ ＭＧ１－４５によって活性化したδ１及びδ２Ｔ細胞からの陰性対照の値を引くことによって計算した。

【0153】

抗体を培養プレートに固定化した場合のみ細胞増殖のための活性化が得られ、これらの抗体を可溶性形態で培養物に加えた場合には、全ＰＢＭＣ細胞集団における場合を含め、増殖は検出されなかった（データは図示せず）。汎γδＴＣＲ ＭＡｂ ５Ａ６．Ｅ９及びＢ１はδ１及びδ２細胞集団両方の成長を活性化した。ＭＡｂ １５Ｄ及びＢ６はδ２細胞集団の選択的成長を誘発した。ＭＡｂ ＴＳ８．２及びＴＳ－１はδ１細胞集団の選択的成長を誘発した。興味深いことに、ＭＡｂ ＴＳ－１及びＴＳ８．２は細胞表面ＴＣＲへの結合において互いに競合するにもかかわらず、ＴＳ－１誘発増殖は３倍高かった。同様に、異なる程度のδ２細胞集団増殖誘発が抗体Ｂ１、５Ａ６．Ｅ９、１５Ｄ、Ｂ６、及びＢ３の間で検出された。このデータは、γδ細胞集団の特異的かつロバストな増殖を誘発するためには独特のエピトープが必要であることを示す。

【0154】

実施例２２．活性化γδＴＣＲ ＭＡｂのエピトープマッピング

【0155】

γδＴＣＲ上の特異的活性化エピトープを以下に記載するようにＴＳ－１ ＭＡｂについて同定する。同様のステップを行い、本明細書に記載の他のγδ活性化抗体の活性化エピトープを同定する。

【0156】

まず、ＴＳ－１によって認識される特異的γδ組換えを同定する。ヒトＴ細胞急性リンパ芽球性白血病γδ細胞株ＭＯＬＴ－１３（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ００５２６０２２３Ａ）でのマウスの免疫化によってＴＳ－１抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を生成した。本発明者らはＭＯＬＴ－１３ γδＴＣＲ鎖を配列決定し、Ｖδ１Ｄδ３Ｊδ１遺伝子セグメントからなる特異的δ鎖再構成を同定した。ＴＳ－１結合特異性がＶδ１の可変領域に対するものであるか、または結合部位がＶδ１－Ｊδ１接合部を含むＴＣＲ ＣＤＲ３領域に及ぶのか判定するために、及びエピトープ認識におけるγ鎖の役割を評価するために、γ及びδ鎖の広範囲に及ぶセットをｐＣＩ発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングする。異なる設計のγ及びδＴＣＲ鎖をＩＤＴから合成ｇＢｌｏｃｋｓとして取り寄せた。ＮｈｅＩ－ＮｏｔＩで消化した合成遺伝子をｐＣＩ－ｎｅｏベクター中にクローニングする。個々の細菌コロニー由来のプラスミドＤＮＡの配列をシーケンシングによって確認する。

【0157】

Ｊδ領域において異なっている３つのＶδ１遺伝子セグメントを設計する（Ｊδ１、Ｊδ２及びＪδ３）。さらに、Ｖδ２Ｊδ１及びＶδ３Ｊδ１鎖を合成遺伝子として取り寄せ、同様にクローニングした。Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９及びＶγ１０遺伝子セグメントを用いてγＴＣＲ鎖と共形質移入する５つのδＴＣＲ鎖（Ｖδ１Ｊδ１、Ｖδ１Ｊδ２、Ｖδ１Ｊδ３、Ｖδ２及びＶδ３）。３５組の可能なペアの組合せのγδＴＣＲを形質移入して２９３形質移入細胞の表面上に発現させる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、γδ鎖をコードするｐＣＩベクターでの２９３細胞の一過性形質移入を行う。様々な特異性の抗γδＴＣＲ抗体のセットを用いたフローサイトメトリーによって、形質移入２９３細胞をγδＴＣＲ発現について同定する。ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳ分析を行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて分析する。ＴＳ－１ ｍＡｂによって認識される特異的γδＴＣＲ鎖ペアを同定したら、特異的結合エピトープが直線状であるか、または立体構造エピトープであるか特徴を明らかにする。

【0158】

変性または天然ＴＣＲに結合する抗体の能力をウェスタンブロット解析によって確認する。プロテアーゼインヒビターのカクテルを含む氷冷改質ＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ）中でのホモジナイゼーションによって、ＴＣＲを発現している細胞の細胞ライセートを調製する。ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ、マイクロプレート標準アッセイ）によってタンパク質濃度を測定する。５％ｂ－メルカプトエタノールを含有する１×ＳＤＳローディングバッファー（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ６．８、１２．５％グリセロール、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０１％ブロモフェノールブルー）中で細胞ライセートを５分間煮沸し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行う。電気泳動後、分離された分子をＰＶＤＦ膜上に転写する。次に、膜をブロッキングして抗体とともにインキュベートする。蛍光イメージングシステムによる検出のために二次蛍光標識抗体を用いる。

【0159】

δ鎖への結合がウェスタンブロット解析によって検出された場合、反応鎖のポリペプチド配列に由来する合成による膜に結合した部分的に一致する一連のペプチドを用いる。（ＪＰＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ ドイツ）。ペプチドアレイは、１残基ずつずれてＶδ１配列全体をカバーする部分的に一致する１２マーペプチドからなる。スポットスキャン分析を以下のように行う。ＴＢＳで膜を３回洗浄し、ブロッキングバッファー（ＴＢＳＴ（ＴＢＳ中０．０５％Ｔｅｅｗｎ２０）中５％低脂肪乳）で一晩ブロッキングする。ＴＢＳで膜を洗浄し、ブロッキングバッファーで１μｇ／ｍｌに希釈したＴＣＳ－１ ＭＡｂとともに室温で３時間インキュベートする。

【0160】

ＴＢＳで膜を３回洗浄した後、ブロッキングバッファーで希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎＲｅａｓｅｒｃｈ）で結合したＭＡｂを室温で２時間検出する。最後にＴＢＳで膜を３回洗浄し、シグナル発生溶液でインキュベートする。室温で１０～４０分間呈色反応を生じさせる。結合部位は陽性ペプチドスポットの配列で表される。

【0161】

実施例２３．立体構造エピトープのエピトープマッピング
抗体の結合エピトープの適切なフォールディング／組立てにジスルフィド結合の形成を必要とするエピトープは、立体構造エピトープとして知られている。重要な結合残基の特定は、反応性Ｖデルタ鎖の部位特異的変異誘発によって行うことができる。変異鎖を特異的抗体に対する反応性の喪失について試験する。結合部位に包含される残基は、さもなければ非反応性である鎖における重要な残基の変異誘発によってＴＳ－１抗体の結合が復元されることとなる場合に特定することができる。

【0162】

反応性ＴＣＲ鎖のランダムＡｌａスキャンを用いて、ＴＳ－１ ｍＡｂによる結合親和性の変化、認識の喪失、または親和性の増加を評価することができる。

【0163】

実施例２４．γδＴ細胞活性化及び増殖の新規調節因子のエピトープマッピング
ＣＤ２エピトープ：

【0164】

ＣＤ２分子は２つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインのＩｇ様Ｖ型ドメイン及びＩｇ様Ｃ型ドメインからなるが、これについて３つの主要な免疫原性領域が記載されている（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １９９６； １７： １７７－１８７）。領域１及び２は第１ドメインに位置し、領域３は第２ドメインに位置している。領域１を認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は休止及び活性化Ｔ細胞の両方に結合し、ＣＤ５８のＣＤ２への結合を強く阻害することができる。領域２を認識するモノクローナル抗体は同様の結合特性を有するが、ＣＤ５８結合の遮断には効果的ではない。領域３を認識するモノクローナル抗体は活性化Ｔ細胞上のＣＤ２のみを認識し、ＣＤ５８結合を遮断しない。

【0165】

ＣＤ２の天然リガンドであるＣＤ５８に対する競合アッセイ及び活性化アッセイによって、ＣＤ２アゴニストＭＡｂの結合エピトープのマッピングを行う。さらに、ＣＤ５８の結合の喪失につながる重要なＣＤ２結合残基の部位特異的変異誘発を、ＭＡｂ結合について試験する。変異の例としては、ＣＤ２配列の６７位（ＫからＲ）、７０位（ＱからＫ）、１１０位（ＹからＤ）及び１１１位（ＤからＨ）における変異誘発が挙げられる。結合エピトープのマッピングのための構築体を設計するために、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いたヒト及びマウスＣＤ２の配列アラインメントを行う。アラインメントによりヒトとマウスとの間で５０％の配列相同性が示される。ヒトＣＤ２の細胞外ドメインに結合するＭＡｂはマウスＣＤ２と交差反応しないと予想される。結合エピトープを同定するために、本発明者らはマウス／ヒトキメラＣＤ２構築体のドメインスワッピングを生じさせる。そのような構築体において、ＣＤ２の細胞外ドメインを発現する発現ベクター中で、ヒトＮ末端Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（残基２５～１２８）をマウス残基（２３～１２１）で置換する。キメラｃＤＮＡ種をＣＨＯまたは２９３細胞に一過性形質移入する。ヒト野生型ＣＤ２及びヒトマウスキメラ構築体をＣＨＯ細胞の表面上に発現させる。キメラＣＤ２細胞表面発現をＦＡＣＳｃａｎｔｏによって分析する。キメラ分子への結合または結合の喪失をフローサイトメトリーによって検出し、活性化アッセイによって確認する。

【0166】

ＮＫＧ２Ｄエピトープ：

【0167】

ＮＫＧ２Ｄに対する活性化ＭＡｂのエピトープマッピングを、そのリガンド（ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ）の１つ以上とのＮＫＧ２Ｄ相互作用を減少もしくは遮断する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の能力によって、またはｈＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用を遮断することが知られている抗体との競合によって試験する。ＮＫまたはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介活性化を減少させる能力によってアゴニストＭＡｂを同定する。これは、典型的な細胞傷害性アッセイ、リガンド遮断抗体の添加、またはＭＩＣＡ発現腫瘍細胞のγδＴ細胞媒介死滅の投与量依存的な遮断によって評価することができる。

【0168】

ＣＤ２７エピトープ：

【0169】

ＣＤ２７に対するアゴニスト抗体のエピトープマッピングを、機能アッセイ及びヒトＣＤ２７とその天然リガンドのヒトＣＤ７０との間の相互作用を遮断する能力によって行う。ＣＤ２７発現細胞を５μｇのＭＡｂとともに４℃で３０分間インキュベートし、その後、１μｇのビオチン化ＣＤ７０をチューブに添加する。混合物を４℃でさらに１５分間インキュベートした後洗浄する。次に、ストレプトアビジン－ＰＥの混合物（ＣＤ７０リガンド結合の検出のため）とともに細胞を３０分間インキュベートし、その後、複数の洗浄ステップ及びＦＡＣＳを用いた分析を行う。ＣＤ７０結合の遮断は、ＭＡｂ及びＣＤ７０が同一エピトープを共有することを示す。

【0170】

実施例２５：増殖したγδＴ細胞集団のＴＣＲ Ｖδレパートリーの同定
個々のドナー由来の増殖したγδＴ細胞のクローン多様性をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で評価する。健康なドナー由来の新たに単離したＰＢＭＣのクローン多様性を、抗ＴＣＲ特異的抗体、リガンド、及びレクチンを含む本明細書に記載の異なる活性化剤で７及び１３日間刺激した培養物のクローン多様性と比較する。

【0171】

上述のγδＴ細胞由来のＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、Ｖδ１、Ｖδ２、及びＶδ３特異的プライマーペアを用いてＰＣＲによって増幅する。Ｖδ１フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＴＡＴＴＴ３’；配列番号１）、Ｖδ２フォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴ３’；配列番号２）及びＶδ３フォワードプライマー（５’ＡＴＧＡＴＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＴＴＧ３’；配列番号３）をＣδリバースプライマー（５’ＣＴＴＧＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣ３’；配列番号４）と併せて用いて５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。

【0172】

γ鎖は、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、及びＶγ５（５’ＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣ３’）、Ｖγ８（５’ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＣＴＡ３’）及びＶγ９（５’ＡＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＡＡＣＧ３’）を増幅するためのＶγ特異的プライマーを用いて分離ＲＴ－ＰＣＲ反応で増幅した。ＶγプライマーはＣγリバースプライマー（５’ＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＧＡＡ３’）とペアにする。γリバースプライマーはＣγ１及びＣγ２のコンセンサス配列を基にした。ＰＣＲ断片をクローニングし、８０種の独立したＶγインサートのヌクレオチド配列を得る。Ｖδ、Ｄδ及びＪδ接合配列をＣＤＲ３配列アラインメントとともに解析する。

【0173】

実施例２６：γδＴ細胞の改変のためのＭＡｂ及び関連するターゲティング構築体
ヒトＣＤ２０遺伝子をｃＤＮＡクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， ６ Ｔａｆｔ Ｃｏｕｒｔ， Ｓｕｉｔｅ １００， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍｄ． ２０８５０）から得る。フォワードプライマー（５’ＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧ３’）及びリバースプライマー（５’ＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＧＴＧ３’）を用いてＣＤ２０遺伝子を増幅する。増幅したＣＤ２０ｃＤＮＡを哺乳類細胞用の高発現ベクターとしてのｐＣＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に組み込み、宿主細胞としてのＣＨＯ細胞に形質移入する。細胞表面上に高いレベルでＣＤ２０分子を発現する組換えＣＨＯ細胞（ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞）をＦＡＣＳ分析によって同定する。

【0174】

ＣＤ２０／ＣＨＯ細胞を用いて、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ及びＢｏｒｎｓｔｅｉｎ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９５ ６：５６１－６； Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ． ２０１０ ２８：５６１－７４．）に記載の完全ヒト抗体を産生するように改変されたＢＡＬＢ／Ｃマウスまたは遺伝子導入マウスを免疫化する。ヒトＣＤ２０への高い親和性及び特異性を有する抗体をＦＡＣＳアッセイによってスクリーニングする。マウス抗体はＣＤＲ移植によってヒト化する（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｈｏｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１２；９０７：２３７－４５）。ヒト重鎖シングルドメイン抗体を産生するように改変したマウスまたはラットからヒトシングルドメインＣＤ２０抗体も生成する（Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ２００６ ｖｏｌ． １０３：１５１３０）。

【0175】

上記の高親和性／特異性ＣＤ２０抗体をコードする遺伝子を、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクターバックボーンまたはｐＣＡＧレンチウイルスベクターにクローニングする。選択したＭＡｂを発現するマウスハイブリドーマまたはヒト化抗体鎖のいずれかからＶＨ及びＶＬドメインをクローニングする。ここに記載のＣＤ２０ ＭＡｂでγδＴ細胞を改変する。

【0176】

実施例２７：γδＴ細胞の改変のためのＴＣＲ構築体
ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＭＨＣ特異的ペプチド複合体を発現するＴリンパ球から、高反応性αβＴＣＲ鎖の配列を含むＴＣＲを発現する構築体を単離する。ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＭＨＣ特異的ペプチド複合体は、様々なＮＹＥＳＯ－１発現腫瘍に対する強力なインビトロ及びインビボ抗腫瘍活性を誘発する。

【0177】

高反応性αβＴＣＲ鎖は、黒色腫、肉腫患者、またはヒト黒色腫もしくは肉腫から得た患者由来異種移植片を有するマウスから単離する。あるいは、ＴＣＲは、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドまたはＮＹＥＳＯ－１ペプチド複合体を発現するヒト化免疫系を有するように改変したマウスから得る（Ｇｏｎｚａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１３ ５７： ３２６－３３４； Ｂｏｕｃｈｅｒｍａ ｅｔａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ． ２０１３． １９１； ５８３－５９３； Ｌｉａｎｇ－ＰｉｎｇＬ． Ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２０１０， １６：１０２９－１０３５を参照）。優性クラスＩ対立遺伝子ＨＬＡ－Ａ＊０２（例えばペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ残基１５７～１６７）及び優性ＨＬＡ－Ａ＊０１関連ペプチドとの関連でＮＹ－ＥＳＯ－１のエピトープを認識するＴ細胞を同定する。

【0178】

１ステップＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｈｉｌｄｅｎ ドイツ）を製造業者の推奨に従って用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって、ＴＣＲα及びＴＣＲβ転写物の配列を生成する。第１鎖ｃＤＮＡを反応性Ｔ細胞から単離したＲＮＡから生成する。ＣＴＬクローンからＴＲＩｚｏｌ全ＲＮＡ単離試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で全ＲＮＡを抽出する。３４及び３５アミノ酸位（カバットナンバリング）のトリプトファン－チロシン残基を中心とするＴＣＲα及びβ鎖Ｖ領域の高度保存領域に結合することができ、α及びβ定常領域リバースプライマー（Ｍｏｏｎｋａ ａｎｄ Ｌｏｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９ （１９９４） ４１－５１）と併せて用いる一連の縮重プライマーによってＴＣＲα及びβ鎖の増幅を行う。増幅したＰＣＲ断片をゲル精製して直接配列決定する。配列情報を用いて個々の全長ｃＤＮＡのクローニングに適したＰＣＲプライマーを設計する。

【0179】

ＴＣＲ遺伝子をクローニングしてＭＳＧＶベースのレトロウイルスベクターに挿入し、選択したＴ細胞から全長ｃＤＮＡを増幅する。ＭＳＧＶ１バックボーンを用いて野生型ＮＹ－ＥＳＯ－１反応性ヒトＴＣＲのα及びβ鎖両方をコードするレトロウイルスベクターを構築する。１つの構築体において内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を介して、または切断可能なピコロウイルス（ｐｉｃｏｒｏｖｉｒｕｓ）ペプチド配列を用いた分離によってＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖の連結を行う。

【0180】

前述のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、またはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いたエレクトロポレーションによって、ＭＭＬＶ ｇａｇ及びｐｏｌタンパク質を安定発現した２９３細胞に、各ＭＳＧＶ１ ＴＣＲベクター及び内因性ウイルスレトロウイルスエンベロープタンパク質をコードするベクターを共形質移入することによってレトロウイルス上清を生成する。形質移入後２日目及び３日目に上清を収集し、１０％ＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭで１：１に希釈した。さらなる操作を一切行うことなく、改変γδＴ細胞はＴＣＲα及びβ鎖をコードする遺伝子を発現することができる。

【0181】

実施例２８．αβＴＣＲ構築体を有するγδＴ細胞の改変
標準的な技術を用いて所望の抗原に対して特異的であるものを選択したＴ細胞から、αβＴＣＲ（腫瘍認識部分）を含むポリヌクレオチドをクローニングする。腫瘍認識部分をコードする発現カセットを含むレトロウイルスまたはレンチウイルスによる感染前に、単離した内因性野生型γδＴ細胞を前述の実施例に記載の方法で少なくとも６×１０^６細胞に成長させる。ウイルス感染の標準的手順を用いてベクター系を野生型γδＴ細胞に導入することができる。選択マーカーの発現を用いて形質移入に成功した細胞を選択する。

【0182】

改変αβＴＣＲの発現は、フローサイトメトリー及び／または定量的ＱＲＴ－ＰＣＲ、ならびに標的細胞での細胞傷害性及びサイトカイン分泌についての機能アッセイによって評価することができる。改変活性化ドメインの発現もフローサイトメトリー及び／または定量的ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価することができる。目的の細胞表面マーカーを発現する改変γδＴ細胞の数をフローサイトメトリーによって測定する。本明細書に記載の好適な方法、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ｔａｌｅｎ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー、またはスリーピングビューティートランスポゾン技術などで改変γδＴ細胞をさらに改変して、ＨＬＡ遺伝子またはβ２Ｍ遺伝子に関連するエキソンを欠失させる。

【0183】

実施例２９：ＣＡＲ及びＴＣＲ構築体を有するγδＴ細胞の改変
腫瘍細胞を特異的に認識し、活性化してこれを死滅させるように改変γδＴ細胞を誘導することができる標的化部分を発現するレトロまたはレンチウイルスベースのベクターを、γδＴ細胞に形質導入する。形質導入される標的化部分は、腫瘍特異的表面タンパク質または腫瘍特異的細胞内ペプチドを対象とするＭＡｂを含む。γδＴ細胞は、ペプチド－ＭＨＣ複合体を対象とする高親和性ＴＣＲによっても改変する。

【0184】

あるいは、非ウイルスベクターでの形質導入によって細胞を改変することができる。

【0185】

実施例３０：標的化部分を有する単離γδＴ細胞の改変
ＣＡＲ構築体設計は異なる主な機能ドメインを含み、腫瘍細胞に掲示された目的のタンパク質またはＭＨＣ結合ペプチドを認識する標的部分、細胞外受容体標的化要素を膜貫通ドメインに連結する短いスペーサーがあり、膜貫通ドメインは細胞膜を横断し、細胞内活性化シグナル伝達ドメインに連結する。

【0186】

γδＴ細胞の表面上に発現される標的部分受容体は、癌細胞上で発現される標的タンパク質に特異的に結合するように設計される。腫瘍認識部分は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、糖脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、メソテリン、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、クリプト、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、及びＳＬＴＲＫ６を含む白血病標的に対して設計される。

【0187】

標的部分受容体は、腫瘍細胞の表面上に発現される腫瘍糖タンパク質に特異的な抗体の一部に由来することができるか、または代替として、改変受容体は、公知の特異性を有するＴＣＲ受容体、もしくはｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（例えばＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、もしくはＣＭＶを含めた、ＭＨＣ複合体と共同して表面上に提示される細胞内腫瘍特異的抗原に由来する特異的ペプチド配列を認識する抗体に由来することができる。腫瘍認識部分のようなこうした高親和性Ｔ細胞受容体は高度な特異性でペプチド－ＭＨＣ複合体を認識することになる。

【0188】

実施例３１：スペーサー及び膜貫通ドメインを有する標的化部分構築体
癌細胞に対する改変Ｔ細胞の効力を最適化するために、様々なスペーサーが腫瘍認識部分構築体中に改変されるであろう。各スペーサーのサイズは、標的タンパク質のサイズ、受容体によって認識されるエピトープ、改変腫瘍認識部分のサイズ及び受容体の親和性に応じて異なることになる。立体構造変化に適応することのできるスペーサーは、ヒトＩｇＧ、ＣＤ８ａ及びＣＤ４ヒンジ領域の配列を含む。

【0189】

試験するスペーサーは、キメラ受容体に結合親和性の向上をもたらすために異なる長さ（１９～９残基）で用いるＧｌｙ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒアミノ酸からなる。各構築体のヒンジ及び膜貫通部分は、ＣＤ８ａ配列（ヒトＣＤ８ａの残基１１７～１７８）、または代替として、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（残基１５３～１７９）を有するヒトＩｇＧ１ヒンジ－Ｆｃ ｃＤＮＡに由来する。

【0190】

実施例３２：共刺激ドメインを有する標的化部分構築体
様々な共刺激ドメインが腫瘍認識部分を含む構築体中に改変されることになる。ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ３０、ＪＡＭＬ、ＣＤ２４４を含む共刺激ドメインまたはＣＤ１００共刺激シグナル伝達ドメインをγδＴ細胞中に改変して、キメラ受容体を介した活性化を増幅する「二次シグナル」を模倣するが、これによってよりロバストなシグナルがもたらされ、増殖して癌細胞を死滅させる。

【0191】

細胞質領域は、ＣＤ２８（残基１８０～２２０）、ＣＤ１３７（残基２１４～２２５）、ＩＣＯＳ（残基１６５～１９９）、ＣＤ２７（残基２１３～２６０）、ＮＫＧ２Ｄ（残基１～５１）、ＪＡＭＬ（残基２９７～３９４）、ＣＤ２（残基２３６～３５１）、ＣＤ３０（残基４０８～５９５）、ＯＸ４０（残基１～２３）、ＨＶＥＭ（残基２２４～２８３）、またはＣＤ４６分子を含むαβ及び／またはγδＴ細胞共刺激分子のエンドドメインから誘導する。細胞傷害性の誘発における改変γδＴ細胞集団の活性化の程度、ならびにインビトロ及びインビボでのサイトカイン分泌の程度に基づいて最適な構築体を選択する。

【0192】

実施例３３：ＣＤ３ζ活性化ドメインを含む標的化部分
３つのＩＴＡＭドメイン（ＩＴＡＭ１：ＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲ、（配列番号５）；ＩＴＡＭ２：ＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭ、（配列番号６）；及びＩＴＡＭ３：ＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱ、（配列番号７））を含む細胞内ＣＤ３ζ（残基５２～１６４）をクローニングした。

【0193】

プライマー５’ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡ－３’（配列番号８）及びリバースプライマー５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡ－３’（配列番号９）を用いて、ＴＣＲζの細胞内ドメインを増幅した。

【0194】

ＣＡＲ構築体をマルチステップオーバーラップ伸長ＰＣＲによって生成する。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応プロトコールを用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ高忠実性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を結合させたプライマーによって誘発される別のＰＣＲ反応で生成物を融合した。全長構築体をコードするＤＮＡをＭＳＧＶ１レトロウイルスベクター中に連結した。この構築体によりＣＤ３ζ活性化ドメインを含むＣＡＲ標的化部分が得られる。

【0195】

実施例３４：２つ以上の認識部分を有するγδＴ細胞の改変
同一の細胞内腫瘍特異的タンパク質を対象とするＴＣＲ及びＭＡｂを含めた腫瘍認識部分を含む２つ以上の構築体をγδＴ細胞に形質導入する。異なるＭＨＣハプロタイプ、例えばＡ２及びＡ１などとの関連で特異的ペプチドを認識するように各構築体を選択し、同一腫瘍細胞上に発現される異なる標的を対象とする抗体または同一標的上の異なるエピトープを対象とする抗体である。

【0196】

実施例３５．改変γδＴ細胞のインビトロ増殖
適切な組織培養培地、例えば前述の実施例に記載の組織培養培地などで改変γδＴ細胞を成長及び増殖させる。外部抗原による刺激有りまたは無しで、かつＡＰＣまたはアミノホスフェートとの共培養なしで、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で約１×１０^６まで指数関数的に改変γδＴ細胞を成長させる。

【0197】

実施例３６：活性化した改変γδＴ細胞及び非改変γδＴ細胞によって放出されるサイトカインの機能特性評価
ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ＩＬ－１２（Ｄｉａｃｌｏｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、及びＩＬ－１８の発現は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて測定される。酵素結合免疫吸着アッセイは製造者の指示に従って実施される。サイトカインの量は、０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムバッファー中１μｇ／ｍｌの濃度で一晩４℃で、ヒトサイトカインに対するモノクローナルマウスＩｇＧ１でコーティングしたポリスチレン９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）中で、異なる時点（２４～７２時間）において測定される。Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、プレートをＰＢＳＴ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、重量／体積、Ｓｉｇｍａ）で１時間３７℃でブロッキングする。標準試料（Ｒ＆Ｄから入手できる組換えヒトサイトカイン）及びγδ培養物サンプルからの上清を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートする。組換えヒトサイトカイン標準試料に対して対応する抗体ペアで検出。

【0198】

実施例３７．共刺激剤の同定
全ＰＢＭＣまたは富化改変及び非改変γδＴ細胞集団に共刺激剤を添加することによって、改変及び非改変γδＴ細胞の活性化、増殖及び生存力を補助する様々な共刺激剤の能力を試験する。抗γδＴＣＲ特異的ＭＡｂを含む様々な活性化剤に共刺激剤を可溶性または固定化形態で添加する。前述の実施例に記載の健康なドナーのバフィーコートから精製されたヒトＰＢＭＣまたは組織から単離されたリンパ球を、２４ウェルフラットボトム組織中で１００ＩＵ／ｍＬ ｒｈＩｌ－２を追加した１ｍＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中に２×１０^６で、２～１０μｇの抗γδＴＣＲ抗体とともに、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６１、ＣＤ１２２、ＣＤ２４４、及びＮＫＧ２Ｄに対する可溶性もしくは固定化アゴニスト抗体、またはＣＤ７０－ＦＣ（ＣＤ２７に対するリガンド）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ及びＵＬＢＰ（ＮＫＧ２Ｄに対するリガンド）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７に対するリガンド）、ならびにＰｉｌａｒ９（ＣＤ１６１に対するリガンド）を含む刺激リガンドの存在下または非存在下で培養する。

【0199】

実施例３８．サイトカイン補助活性化
全ＰＢＭＣまたは富化改変及び非改変γδＴ細胞集団にサイトカインを添加することによって、改変及び非改変γδＴ細胞の活性化、増殖及び生存力を補助する様々なサイトカインの能力を試験する。サイトカイン活性化補助を試験するために、様々なサイトカインを３日ごとに１００ＩＵ／ｍＬで別々の細胞培養物に個別に添加する。試験するサイトカインにはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－３３、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－２３、及びＩＬ１βが含まれる。選択した期間の終了後、細胞のサンプルを採取し、細胞集団の組成、すなわちγδＴ細胞、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定する。

【0200】

細胞の培養を継続し、１４日目及び２１日目に選択した集団の増殖を調べる。

【0201】

実施例３９：インビトロでの改変及び非改変γδＴ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイ
改変または非改変γδ－Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性アッセイは、４つの異なる細胞傷害性アッセイ：１）腫瘍細胞溶解；２）活性化Ｔ細胞によるサイトカイン放出；３）ＬＤＨアッセイ；及び４）ＣＤ１０７ａ発現の活性化によって測定される。限定はしないが結腸、乳房、卵巣、腎臓、頭頚部、口腔、膵臓及び肝臓癌に由来する様々なヒト腫瘍細胞株またはヒト腫瘍由来細胞（患者由来異種移植片腫瘍株）を標的細胞として用いる。正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を陰性対照として用いる。簡潔に述べると、増殖させる標的細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０^４細胞で接種する。２４時間後、培地を除去し、活性化Ｔ細胞をＲＰＭＩ培地（Ｃｏｒｎｉｎｇから入手できるＲＰＭＩ－１６４０、１０％Ｈｙｃｌｏｎｅウシ胎児血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン）中に、２０：１または４０：１のエフェクタ－対標的比で添加して、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で５時間インキュベートする。改変及び非改変γδ－Ｔ細胞によって放出されるサイトカインは、このインキュベーションの後、共培養上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いてＩＦＮ－γ、ＩＬ２、ＴＮＦα、ＩＬ－６及びＩＬ１βを含むサイトカインの分泌を定量化することによって測定する。ＬＤＨ細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者の指示に従って用いてＬＤＨアッセイを実施する。最後に、標的細胞へのγδ－Ｔ細胞の添加後、Ｃｙ７ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に結合したＣＤ１０７ａ抗体５ｕｌを添加することによってＣＤ１０７ａ発現を測定する。プレートを短時間遠心分離し、５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃で１時間インキュベートし、その後、１：５０希釈のＧｏｌｇｉ ｓｔｏｐ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ）８．５μＬを添加する。５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃でさらに２時間細胞をインキュベートする。このインキュベーションの後、細胞を氷上で収集し、冷ＨＢＳＳで１回洗浄し、１ｕｌのｚｏｍｂｉｅ ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）アミン染色色素で染色して１００ｕｌのＨＢＳＳ中の生細胞集団を測定する。細胞をＦＡＣＳ染色培地（ＦＳＭ；２％ウシ胎児血清を含有するＨＢＳＳ）で洗浄し、ＦＩＴＣに結合したＶδ１抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手できるクローンＴＳ８．２）及びＰＥに結合したＶδ２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手できるクローンＢ６）を含めた、飽和量の抗体を含有する１００ｕｌのＦＳＭに再懸濁する。抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートし、その後、過剰量のＨＢＳＳで洗浄する。染色された集団をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで収集し、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．１ソフトウェアを用いて解析する。

【0202】

実施例４０：インビトロでの増殖したγδＴ細胞の抗腫瘍活性
様々な腫瘍細胞株及び原発性腫瘍細胞に対する細胞傷害性活性を１：１～４０：１のエフェクタ－対標的比で試験する。細胞内酵素である乳酸脱水素酵素の放出を検出することによって、腫瘍細胞株及び原発性腫瘍細胞の溶解を測定する。培養物中の改変腫瘍認識部分を発現しているγδＴ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ及び／またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定する。

【0203】

実施例４１：インビボ抗腫瘍活性
ヒト腫瘍異種移植片を移植した免疫不全マウス、もしくはｈｕＰＢＭＣ－ＮＯＧ（Ｔａｃｏｎｉｃ）マウス、または前述のヒト化免疫系を有するマウスのコホートに、結腸、乳房、腎臓、頭頚部、前立腺、膀胱、口腔、膵臓及び肝臓の癌を含む患者由来腫瘍または腫瘍細胞株に由来する細胞を皮下または同所注入して、１００ｍｍ^３の平均サイズに到達させる。富化または単離したナイーブまたは改変いずれかのγδ－Ｔ細胞をある範囲の投与量でマウスに静脈内注入するか、または腫瘍に直接注入する。腫瘍退縮は、未治療及び特定の適応症に対する標準治療と比較したγδ－Ｔ細胞投与後の腫瘍体積の減少と定義される。いくつかの実験において、ナイーブまたは改変γδＴ細胞をＧＦＰまたはルシフェラーゼで標識し、腫瘍保有マウスに注入してそのパーシスタンス及びホーミングを追跡する。研究の最後に、腫瘍を採取してフローサイトメトリー及び免疫組織化学によってＧＦＰ陽性細胞を分析した。

【0204】

実施例４２．さらなる処理用の細胞バンクを作製するための凍結培地中でのγδＴ細胞の凍結保存
非改変γδＴ細胞を長期保存のために凍結培地中で製剤化し、低温保存装置、例えば液体窒素冷凍装置（－１９５℃）または超低温冷凍装置（－６５℃、－８０℃または－１２０℃）などに入れる。凍結培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、デキストロース、硫酸デキストランまたはヒドロイエチルデンプン（ｈｙｄｒｏｙｅｔｈｙｌ ｓｔａｒｃｈ）（ＨＥＳ）を６．５～７．５の範囲の生理的ｐＨ緩衝剤とともに含有することになるであろう。

【0205】

凍結保存γδＴ細胞は解凍されて抗体、タンパク質、ペプチド、及びサイトカインでの刺激によってさらに処理される。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、本出願において前述したように遺伝子組換えされる。改変γδＴ細胞はさらに凍結保存され、凍結培地中１ｍＬ当たり１０^６～１０^８細胞で１０、１００、２００バイアルの量の細胞バンクが作製される。

【0206】

実施例４３．さらなる処理用の細胞バンクを作製するための凍結培地中でのγδＴ細胞の代替的凍結保存
他の凍結保護物質を前述の実施例に記載の凍結保存担体に加え、栄養維持ならびに凍結及び解凍プロセス中の溶解に対する生物物理的細胞保護をもたらす。これらとしては、Ｄ－グルコース、マンニトール、スクロース、アデニン、グアノシン、組換えヒトアルブミン、シトレート、抗凝固剤、ベンゾナーゼ、ＤＮａｓｅ、プロピレングリコール、エチレングリコール、２－メチル－２，４－ペンタンジオールが挙げられる。高細胞密度凍結製品に緩衝能を付与するように意図された追加の添加剤としては、無機リン酸塩、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳが挙げられる。

【0207】

実施例４４．さらなる処理用の細胞バンクを作製するための凍結培地中でのγδＴ細胞の凍結保存
速度制御冷凍装置（例えばＣｒｙｏＭｅｄコントロールレートフリーザー）、または所望の凍結速度をもたらす適切に断熱されたラッキングシステムを備える機械式－７０℃冷凍装置を用いて、１分当たり－０．１℃～－０．５℃の凍結速度を達成するように意図した温度制御傾斜でγδＴ細胞の最初の凍結を行う。最大３０～６０日の短期保存のために凍結細胞を－７０℃冷凍装置に入れる。前述の節に記載の方法によって測定した場合に劣化を示すことなく、γδＴ細胞数及び細胞機能を維持したまま最大１２、２４、３６及び４８か月で長期保存するためには、液体Ｎ_２貯蔵タンクに凍結細胞を入れる。

【0208】

この実施例に記載の凍結保存細胞を解凍し、好適な密閉容器中、例えば細胞培養バッグ及び／またはバイオリアクターなどでさらに刺激及び増殖させて、被検者への投与に適した量の改変γδＴ細胞を生成する。

【0209】

実施例４５．患者への直接注入用のγδＴ細胞の製剤
遠心分離及び／または膜透析濾過によって、凍結保護添加剤を含有する生理緩衝液中５×１０^６細胞／ｍＬ～１０^８細胞／ｍＬまで改変γδＴ細胞を濃縮し、長期保存のために低温保存装置、例えば液体窒素、または超低温冷凍装置などに入れる。

【0210】

実施例４６．癌を患っているヒト被検者の治療
新鮮なまたは凍結した改変γδＴ細胞をベッドサイドで解凍し、ヒト被検者に静脈内注入する。約１細胞／ｋｇ～約１×１０^１０細胞／ｋｇの改変γδＴ細胞を３０～６０分間かけてヒト被検者に注入する。改変γδＴ細胞は、共刺激サイトカインＩＬ－２または他のサイトカインの補助有りまたは無しで投与する。任意により、処置を繰り返す。被検者におけるγδＴ細胞のインビボ増殖をフローサイトメトリーによって測定する。

【0211】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に提示及び記載したが、そのような実施形態は例示のみを目的として提供されていることが当業者には明らかであろう。当業者は今や本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換を容易に考え付くであろう。本明細書に記載の発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明を実施するにあたって採用され得ると理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を規定し、それによってこれらの請求項の範囲内の方法及び構成ならびにそれらの均等物が網羅されることを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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