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▶ ベイジン、ウェイランチユアン、メディカル、テクノロジー、カンパニー、リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-26
(45)【発行日】2022-10-04
(54)【発明の名称】医薬組成物の調製におけるシトクロムｂｃ１複合体阻害剤の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/505 20060101AFI20220927BHJP
A61K 31/12 20060101ALI20220927BHJP
A61K 31/4178 20060101ALI20220927BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20220927BHJP
A61K 31/539 20060101ALI20220927BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20220927BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20220927BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20220927BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220927BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20220927BHJP
A61P 25/06 20060101ALI20220927BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220927BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220927BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220927BHJP
A61P 13/04 20060101ALI20220927BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20220927BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220927BHJP
A61P 13/00 20060101ALI20220927BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20220927BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220927BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20220927BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220927BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220927BHJP
A61P 19/06 20060101ALI20220927BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220927BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220927BHJP
【ＦＩ】
A61K31/505
A61K31/12
A61K31/4178
A61K31/44
A61K31/539
A61K31/122
A61P29/00
A61P25/04
A61P21/00
A61P15/00
A61P11/00
A61P11/06
A61P9/00
A61P9/12
A61P27/16
A61P25/06
A61P1/00
A61P1/16 101
A61P1/04
A61P9/10
A61P13/04
A61P13/10
A61P13/12
A61P13/00
A61P1/12
A61P27/02
A61P27/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P19/08
A61P19/06
A61P9/10 101
A61P25/28
A61P43/00 105
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2019560444
(86)(22)【出願日】2018-01-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-03-19
(86)【国際出願番号】 CN2018073609
(87)【国際公開番号】W WO2018133862
(87)【国際公開日】2018-07-26
【審査請求日】2019-09-18
(31)【優先権主張番号】201710053062.2
(32)【優先日】2017-01-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201710060825.6
(32)【優先日】2017-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201710070661.5
(32)【優先日】2017-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】519264195
【氏名又は名称】ベイジン、ウェイランチユアン、メディカル、テクノロジー、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＷＥＩＬＡＮＺＨＩＹＵＡＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100091982
【弁理士】
【氏名又は名称】永井 浩之
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100105153
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 悟
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100143971
【氏名又は名称】藤井 宏行
(72)【発明者】
【氏名】コン、ユウェン
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０１２６９０７６（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００－４５／０８
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｐ １５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を含んでなる、平滑筋攣縮関連疾患の処置のための医薬組成物であって、前記シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤が、フルアクリピリム（ＦＡＰＭ）、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチル、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、ジモキシストロビン、フルオキサストロビン、アトバコン、パルバクオン、ブパルバクオン、およびその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択され、
前記平滑筋攣縮関連疾患が、月経困難症；気道攣縮関連疾患、例えば、気管支喘息、喘息性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患または気道過敏；血管攣縮関連疾患、例えば、脳血管攣縮、肺高血圧、血管性難聴、片頭痛または群発頭痛；消化管攣縮関連疾患、例えば、胆嚢炎、胆管炎、胆石、急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性腸炎、慢性腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎または腸結核；高血圧；冠動脈攣縮関連疾患、例えば、異型狭心症；膀胱炎；尿管結石；腎疝痛；緑内障；術後腸閉塞；頻尿；線維筋痛；性交疼痛；過敏性腸症候群；頸筋および眼瞼の攣縮；過活動膀胱；術後眼炎症および呼吸窮迫症候群からなる群から選択される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品の分野、特に、医薬におけるシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の使用に関する。特に、本発明は、平滑筋攣縮(spasm)関連疾患の処置、炎症性疾患の処置および疼痛の緩和のためのシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
シトクロムｃレダクターゼ、またはミトコンドリア呼吸鎖複合体ＩＩＩとしても知られるミトコンドリアシトクロムｂｃ１複合体は、ミトコンドリアおよびほとんどの細菌の呼吸電子伝達鎖の重要な成分であり、ユビキノンからシトクロムｃ（細菌においてはシトクロムｃ２）への電子の伝達を触媒する。シトクロムｂｃ１複合体は、２つの機能的キノン結合部位を有する。一方は、ヘムｂＬに近い、膜間腔の片側に位置する酸化部位ＱＯであり、他方は、ヘムｂＨに近い、マトリックスの片側に位置する還元部位Ｑｉである。従って、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、２つのカテゴリーに分けることができる。一方は、ミトコンドリア内膜の内壁に位置するＱｉ部位に結合するものであり、この種の阻害剤はＱｉ部位阻害剤と呼ばれ、アンチマイシンおよびシアゾファミドなどが挙げられる。他方は、ミトコンドリア内膜の外壁に位置するＱｏ部位に結合するものであり、この種の阻害剤はＱｏ部位阻害剤と呼ばれ、メトキシアクリレート系殺菌剤、およびイミダゾリノンなどが挙げられる。
【0003】
シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤に関する既存の研究は、それらの殺菌および殺虫効果に主に焦点を当てており、これらの阻害剤を用いたヒト疾患の処置に関する報告はほとんどない。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤により平滑筋攣縮関連疾患を処置し、炎症性疾患を処置し、かつ／または疼痛を緩和する方法、平滑筋攣縮関連疾患の処置、炎症性疾患の処置および／または疼痛の緩和のための薬剤の調製におけるシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の使用、ならびにシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を含んでなる医薬組成物を提供する。
【0005】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏ部位阻害剤である。
【0006】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｉ部位阻害剤である。
【0007】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのストロビルリン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのストロビルリン類似体は、フルアクリピリム（ＦＡＰＭ）、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチル、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、ジモキシストロビン、フルオキサストロビン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0008】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのピリドン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのピリドン類似体は、クロピドール、ＧＷ８４４５２０、ＧＳＫ９３２１２１、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0009】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのヒドロキシナフトキノン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのヒドロキシナフトキノン類似体は、アトバコン、パルバクオン、ブパルバクオン、Ｓ－１０５７６、ＮＱ３（２－ＯＨ－３－（２－メチル－トリフルオロオクチル）－８－メチル－ナフトキノン）、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0010】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのキノロン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのキノロン類似体は、ＲＣＱ０６、エンドキン、ならびにＥＬＱ－１１８、ＥＬＱ－１２０、ＥＬＱ－１２１、ＥＬＱ－１３６、ＥＬＱ－２３３、ＥＬＱ－２４５、ＥＬＱ－２６０、ＥＬＱ－２７１、ＥＬＱ－２７４、ＥＬＱ－３００、ＥＬＱ－３１４、ＥＬＱ－３１６、ＥＬＱ－３１７、ＥＬＱ－３１９、ＥＬＱ－３３７、ＥＬＱ－３３８、ＥＬＱ－３５１、ＥＬＱ－３７０、ＥＬＱ－３７２、ＥＬＱ－３８０、ＥＬＱ－３８４、ＥＬＱ－３８５、ＥＬＱ－３８８、ＥＬＱ－３９０、ＥＬＱ－４００、ＥＬＱ－４０４、ＥＬＱ－４２８、Ｐ４Ｑ－９５およびＰ４Ｑ－３９１などのエンドキン様キノロン（ＥＬＱ）、ならびにプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0011】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのアクリジンジオン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのアクリジンジオン類似体は、フロキサクリン、ＷＲ２４９６８５、ＷＲ２４３２４６、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0012】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのスタチン類似体である。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのスタチン類似体は、シンバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0013】
いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、アンチマイシンＡ、ランソプラゾール、ランソプラゾールスルフィド、オメプラゾール、ペンタミジン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される。
【0014】
いくつかの実施形態では、平滑筋攣縮関連疾患は、月経困難症；気道攣縮関連疾患、例えば、気管支喘息、喘息性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患または気道過敏；血管攣縮関連疾患、例えば、脳血管攣縮、片頭痛または群発頭痛；消化管攣縮関連疾患、例えば、急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性腸炎、慢性腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎または腸結核；高血圧；冠動脈攣縮関連疾患、例えば、異型狭心症；緑内障；術後腸閉塞；頻尿；線維筋痛；性交疼痛；過敏性腸症候群；頸筋および眼瞼の攣縮；過活動膀胱；術後眼炎症および呼吸窮迫症候群からなる群から選択される。
【0015】
いくつかの特定の実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ、変形性関節症、骨溶解、腱炎、滑膜炎、および炎症性呼吸器疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、線維症、気腫または急性呼吸窮迫症候群からなる群から選択される。
【0016】
いくつかの特定の実施形態では、疼痛は炎症性疼痛である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【0018】
発明の詳細な説明
異なる器官において生じる明らかに病因が異なる多くの疾患が、平滑筋細胞の生化学的機能不全に起因することが知られている。平滑筋細胞が適切に機能することが、平滑筋細胞が重要な役割を果たす総ての器官における健康問題を避けるために重要である。
異なる器官において生じる明らかに病因が異なる多くの疾患が、平滑筋細胞の生化学的機能不全に起因することが知られている。平滑筋細胞が適切に機能することが、平滑筋細胞が重要な役割を果たす総ての器官における健康問題を避けるために重要である。
【0019】
本発明者らは、意外にも、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて平滑筋収縮を阻害でき、よって、平滑筋攣縮関連疾患の処置に使用できることを見出した。
【0020】
従って、第１の側面において、本発明は、治療上有効な量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を被験体に投与することを含んでなる、被験体における平滑筋攣縮関連疾患を処置する方法を提供する。
【0021】
いずれの理論にも拘束されることなく、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ＭＬＣ２０のリン酸化を防ぐことにより、平滑筋収縮を阻害し得る。ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）は、ミオシンＩＩのミオシン軽鎖（ＭＬＣ２０）を特異的にリン酸化するカルシウムイオンおよびカルモジュリン依存タンパク質キナーゼである。ＭＬＣ２０のリン酸化は、ミオシン厚フィラメントとアクチン細フィラメントとの間の相互作用を促進する。ＭＬＣ２０のＭＬＣＫ媒介リン酸化は、平滑筋収縮を開始するのに必要である。本発明者らは、意外にも、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ＭＬＣ２０のリン酸化を防ぐことができ、それによって、平滑筋収縮を阻害することにより平滑筋攣縮関連疾患を処置できることを見出した。
【0022】
本明細書で使用する場合、「平滑筋」は、限定されるものではないが、子宮平滑筋、膀胱平滑筋、虹彩筋、生殖管平滑筋、輸卵管平滑筋、気管支平滑筋、血管平滑筋および消化管平滑筋が挙げられる。
【0023】
本明細書で使用する場合、「平滑筋攣縮関連疾患」は、限定されるものではないが、以下の（１）～（８）から選択される疾患が挙げられる：
【0024】
（１）婦人科疾患（子宮平滑筋）：月経困難症；早産；および早期前期破水；
（２）泌尿器系疾患（尿道平滑筋、膀胱平滑筋）：良性前立腺過形成；尿路結石、例えば、腎結石および尿管結石；過活動膀胱；頻尿；および勃起不全；
（３）消化器系疾患（食道平滑筋、括約筋、消化管平滑筋）：食道および噴門アカラシア；過敏性腸症候群；オッディ括約筋機能不全；消化管痙攣性腹痛、例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ならびに急性および慢性虫垂炎；胆石症；急性および慢性胆嚢炎；急性および慢性膵炎；急性および慢性腹膜炎；ならびに腸閉塞。
（４）呼吸器系疾患（気管および気管支平滑筋）：喘息、例えば、慢性気管支喘息、アレルギー性喘息、薬剤誘発性喘息、老人性喘息、咳喘息、慢性喘息、運動誘発性喘息および小児喘息；気管炎；急性および慢性気管支炎；慢性閉塞性肺疾患；ならびに呼吸窮迫症候群；
（５）心血管疾患（血管平滑筋）：高血圧；門脈圧亢進；アテローム性動脈硬化；狭心症、例えば、異型狭心症、不安定狭心症、および安定狭心症；心筋梗塞；ならびに肥大型心筋症；
（６）脳血管攣縮関連疾患：虚血性脳血管疾患、例えば、脳梗塞、一過性脳虚血発作、および脳血栓症；血管性認知症；脳動脈硬化症；非回転性めまい；頭痛；ならびに難治性吃逆；
（７）末梢血管攣縮関連疾患：片頭痛；間欠性跛行；レイノー症候群；緑内障；突発性難聴；耳鳴；回転性めまい；および動揺病；ならびに
（８）その他：眼瞼痙攣。
（２）泌尿器系疾患（尿道平滑筋、膀胱平滑筋）：良性前立腺過形成；尿路結石、例えば、腎結石および尿管結石；過活動膀胱；頻尿；および勃起不全；
（３）消化器系疾患（食道平滑筋、括約筋、消化管平滑筋）：食道および噴門アカラシア；過敏性腸症候群；オッディ括約筋機能不全；消化管痙攣性腹痛、例えば、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、ならびに急性および慢性虫垂炎；胆石症；急性および慢性胆嚢炎；急性および慢性膵炎；急性および慢性腹膜炎；ならびに腸閉塞。
（４）呼吸器系疾患（気管および気管支平滑筋）：喘息、例えば、慢性気管支喘息、アレルギー性喘息、薬剤誘発性喘息、老人性喘息、咳喘息、慢性喘息、運動誘発性喘息および小児喘息；気管炎；急性および慢性気管支炎；慢性閉塞性肺疾患；ならびに呼吸窮迫症候群；
（５）心血管疾患（血管平滑筋）：高血圧；門脈圧亢進；アテローム性動脈硬化；狭心症、例えば、異型狭心症、不安定狭心症、および安定狭心症；心筋梗塞；ならびに肥大型心筋症；
（６）脳血管攣縮関連疾患：虚血性脳血管疾患、例えば、脳梗塞、一過性脳虚血発作、および脳血栓症；血管性認知症；脳動脈硬化症；非回転性めまい；頭痛；ならびに難治性吃逆；
（７）末梢血管攣縮関連疾患：片頭痛；間欠性跛行；レイノー症候群；緑内障；突発性難聴；耳鳴；回転性めまい；および動揺病；ならびに
（８）その他：眼瞼痙攣。
【0025】
例えば、「平滑筋攣縮関連疾患」は、月経困難症；気道攣縮関連疾患、例えば、気管支喘息、喘息性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患または気道過敏；血管攣縮関連疾患、例えば、脳血管攣縮、肺高血圧、血管性難聴、片頭痛または群発頭痛；消化管攣縮関連疾患、例えば、胆嚢炎、胆管炎、胆石、急性胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、急性腸炎、慢性腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎または腸結核；高血圧；冠動脈攣縮関連疾患、例えば、異型狭心症；膀胱炎；尿管結石；腎疝痛および緑内障からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、「平滑筋攣縮関連疾患」は、例えば、術後腸閉塞、頻尿、線維筋痛、性交疼痛、過敏性腸症候群、頸筋および眼瞼の攣縮、過活動膀胱、術後眼炎症および呼吸窮迫症候群も含み得る。
【0026】
例えば、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤による処置は、少なくともいくつかの平滑筋細胞の有意な弛緩をもたらし得、その結果、主要動脈（例えば、大動脈）および中動脈の動脈径が増加し、血圧が低下し、かつ、中動脈（例えば、冠動脈）の動脈径が増加し、狭心症が軽減し；肺細気管支平滑筋細胞の弛緩をもたらし得、気道径が増加し、その結果、喘息症状が緩和され；眼のカテーテル系の弛緩をもたらし得、その結果、例えば、涙管径が増加し、眼内圧が低下し、それにより、緑内障および失明のリスクが減少し；輸卵管および子宮の平滑筋細胞の弛緩をもたらし得、筋組織の弛緩が生じ、その結果、受胎能が改善し、かつ／または月経困難症症状が緩和され；胆管、尿管および尿道の平滑筋細胞の弛緩をもたらし得、カテーテル径が増加し、その結果、胆汁結石または腎結石に起因する攣縮のリスクが減少し；かつ、消化管平滑筋の弛緩をもたらし得、例えば、痙攣性疝痛が緩和される。
【0027】
好ましい実施形態では、平滑筋攣縮関連疾患は、月経困難症である。さらに好ましい実施形態では、平滑筋攣縮関連疾患は、原発性月経困難症である。
【0028】
さらに、本発明者らは、意外にも、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて炎症症状を有意に阻害できることを見出した。例えば、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、マウスにおけるキシレン誘発性耳介腫脹およびラットにおけるカラゲナン誘発性足底腫脹を阻害できることが、例５において示されている。
【0029】
従って、第２の側面において、本発明は、治療上有効な量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を被験体に投与することを含んでなる、被験体における炎症性疾患を処置する方法を提供する。
【0030】
いずれの理論にも縛られることなく、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、一酸化窒素（ＮＯ）の産生を阻害することにより、炎症を阻害し得る。ＮＯは、生命活動を調節する重要な小分子物質であり、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を介してＬ－アルギニンにより合成される。ＮＯＳアイソエンザイムには３つのサブタイプ、すなわち、通常条件下で発現する神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）および内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）と、傷害後に誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）がある。マクロファージは、宿主防御系に加え、免疫および炎症性応答に重要な役割を果たす。病的条件下では、マクロファージにおけるｉＮＯＳの発現は有意に増加し、大量の合成されたＮＯが、身体の種々の急性および慢性炎症性応答に関与する。本発明者らは、意外にも、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、マクロファージによる一酸化窒素の産生を阻害でき、よって、炎症性疾患の処置に使用できることを見出した。例えば、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、マウスにおける単核マクロファージによるＮＯ産生を阻害できることが、例３において実証されている。
【0031】
本発明の方法により処置することができる炎症性疾患の例としては、関節リウマチ、変形性関節症、骨溶解、腱炎、滑膜炎、痛風、アルツハイマー病、糸球体腎炎、腎盂腎炎、アテローム硬化性疾患、血管炎、ならびに炎症性呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、線維症、気腫、および急性呼吸窮迫症候群）が挙げられる。好ましくは、炎症性疾患は、非感染性炎症性疾患である。
【0032】
本発明者らはまた、意外にも、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて鎮痛効果を有することを見出した。例えば、本出願の例４において、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の投与は、酢酸、ジエチルスチルベストロールおよびＰＧＦ２αにより引き起こされたマウスのライジング（身もだえ）（writhing）回数を有意に阻害し得る。
【0033】
従って、第３の側面において、本発明は、治療上有効な量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を被験体に投与することを含んでなる、被験体における疼痛を緩和する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疼痛は炎症性疼痛、例えば、身体において炎症が生じる炎症部位から放出された炎症性メディエーターを介して、一連のシグナル伝達経路が活性化された時に、痛覚受容体が活性化または感作された後に生じた疼痛である。
【0034】
本発明の種々の側面のいくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｏ部位阻害剤である。本発明の種々の側面のいくつかの他の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体のＱｉ部位阻害剤である。
【0035】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのストロビルリン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのストロビルリン類似体の例としては、限定されるものではないが、フルアクリピリム（ＦＡＰＭ）、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチル、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、ジモキシストロビン、フルオキサストロビン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0036】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのピリドン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのピリドン類似体の例としては、限定されるものではないが、クロピドール、ＧＷ８４４５２０、ＧＳＫ９３２１２１、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0037】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのヒドロキシナフトキノン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのヒドロキシナフトキノン類似体の例としては、限定されるものではないが、アトバコン、パルバクオン、ブパルバクオン、Ｓ－１０５７６、ＮＱ３、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0038】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのキノロン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのキノロン類似体の例としては、限定されるものではないが、ＲＣＱ０６、エンドキン、ならびにＥＬＱ－１１８、ＥＬＱ－１２０、ＥＬＱ－１２１、ＥＬＱ－１３６、ＥＬＱ－２３３、ＥＬＱ－２４５、ＥＬＱ－２６０、ＥＬＱ－２７１、ＥＬＱ－２７４、ＥＬＱ－３００、ＥＬＱ－３１４、ＥＬＱ－３１６、ＥＬＱ－３１７、ＥＬＱ－３１９、ＥＬＱ－３３７、ＥＬＱ－３３８、ＥＬＱ－３５１、ＥＬＱ－３７０、ＥＬＱ－３７２、ＥＬＱ－３８０、ＥＬＱ－３８４、ＥＬＱ－３８５、ＥＬＱ－３８８、ＥＬＱ－３９０、ＥＬＱ－４００、ＥＬＱ－４０４、ＥＬＱ－４２８、Ｐ４Ｑ－９５およびＰ４Ｑ－３９１などのエンドキン様キノロン（ＥＬＱ）、ならびにプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0039】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのアクリジンジオン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのアクリジンジオン類似体の例としては、限定されるものではないが、フロキサクリン、ＷＲ２４９６８５、ＷＲ２４３２４６、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0040】
いくつかの実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのスタチン類似体である。シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのスタチン類似体の例としては、限定されるものではないが、シンバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩が挙げられる。
【0041】
いくつかの他の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、アンチマイシンＡ、ランソプラゾール、ランソプラゾールスルフィド、オメプラゾール、ペンタミジン、およびプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩から選択され得る。
【0042】
上記の特定のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤およびその他の利用可能な本発明のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、例えば、Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Jan 20, 112(3): 755-60; Antimicrob Agents Chemother. 2016 Jul 22, 60(8): 4972-82；Am J Trop Med Hyg. 2015 Jun, 92(6): 1195-201；PLoS One. 2013 Aug 12, 8(8): e71726; Nat Commun. 2015 Jul 9, 6: 7659; Cell Metabolism 22, 399-407, September 1, 2015; Nat Chem Biol. 2015 Nov, 11(11): 834-6; J. Med. Chem. 2015, 58, 9371-9381; ACS Med. Chem. Lett., 2012, 3 (12), pp 951-951; J. Agric. Food Chem. 2015, 63, 3377-3386; J. Phys. Chem. B 2016, 120, 2701-2708; Mol Biochem Parasitol. 2011 May, 177(1): 12-9; US2015/0203445 A1;およびWO2012070015 A1に見出すことができる。
【0043】
本発明はまた、シトクロムｂｃ１複合体に対する阻害機能を有する上記の化合物の誘導体を網羅する。
【0044】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」は、哺乳類、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトを意味する。
【0045】
第４の側面において、本発明は、平滑筋攣縮関連疾患の処置、炎症性疾患の処置および／または疼痛の緩和のための薬剤の調製におけるシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の使用をさらに提供する。
【0046】
第５の側面において、本発明はまた、有効成分としてのシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤と薬学的に許容可能な担体とを含んでなる、平滑筋攣縮関連疾患の処置、炎症性疾患の処置および／または疼痛の緩和のための医薬組成物を提供する。
【0047】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体に溶解または分散された有効量の１以上のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を含んでなる。句「薬学的に許容可能な」は、所望により動物（例えば、ヒト）に投与された場合に、有害反応、アレルギー反応または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を意味する。少なくとも１つのシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を含んでなる医薬組成物の調製は、本開示に従って当業者に既知であり、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」第21版, 2005に例示されており、これは、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。さらに、ヒトへの投与に関しては、医薬品承認当局により要求される無菌性、発熱性、全体的な安全性および純度に関する基準も満たす必要があることが理解されるべきである。
【0048】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者により理解されるように、あらゆる溶媒、分散媒、抗酸化剤、塩、コーティング剤、界面活性剤、保存剤（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピル、ソルビン酸、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、溶液遮断薬（例えば、パラフィン）、吸着剤（例えば、カオリン、ベントナイト）、薬剤安定剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、ゲル、結合剤（例えば、シロップ、アラビアガム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントガム、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩）、賦形剤（例えば、ラクトース、ポリエチレングリコール）、崩壊剤（例えば、寒天、デンプン、ラクトース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アルギン酸、ソルビトール、グリシン）、湿潤剤（例えば、ヘキサデカノール、モノステアリン酸グリセリン）、滑沢剤、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム塩）、食用油（例えば、扁桃油、ヤシ油、油性エステルまたはプロピレングリコール）、甘味剤、香味剤、着色剤、増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸）、錠剤化滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、グルコース、ラクトース、白亜）、吸入担体（例えば、炭化水素噴射剤）、緩衝剤などおよびその組合せを含む（例えば、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」第21版, 2005参照)。また、治療用組成物または医薬組成物の有効成分と適合しないもの以外のいずれかの従来の担体を使用することも企図される。
【0049】
いずれにせよ、前記組成物は、１以上の成分の酸化を遅延させるために、複数の抗酸化剤を含有してもよい。抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、レシチン、没食子酸プロピル、およびトコフェロールが挙げられる。さらに、微生物作用の予防は、限定されるものではないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはその組合せを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤などの保存剤を用いることにより、達成することができる。
【0050】
薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質成分の遊離アミノ基とともに形成される塩または無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸もしくはリン酸）もしくは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、安息香酸、乳酸、ホスホン酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、ナフタレンスルホン酸、クラブラン酸、ステアリン酸もしくはアーモンド酸）とともに形成される塩を含む。遊離カルボキシル基とともに形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムもしくは水酸化鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン）にも由来し得る。
【0051】
組成物が液体形態であるいくつかの実施形態では、担体は、限定されるものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、液体（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）、およびその組合せを含む、溶媒または分散媒であり得る。例えば、コーティング剤（例えば、レシチン）を用いることにより；担体（例えば、液体ポリオールもしくは脂質）に分散させることで所望の粒子径を維持することにより；界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）を用いることにより；またはこれらの方法の組合せにより、適当な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウム、またはその組合せ）を含むことが好ましい。
【0052】
本発明は、当業者に既知のいずれかの好適な方法により投与することができる(例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」第21版, 2005参照)。医薬組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所または吸入経路を介して投与することができる。
【0053】
経口投与される場合、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、バイアル、散剤、顆粒剤、ロゼンジ、溶解可能な散剤または液体製剤の形態であり得る。必要に応じて、必要量の活性化合物を、上記の複数の他の成分を含有する好適な溶媒に混合した後、濾過および滅菌に供することにより、無菌注射溶液を調製する。一般に、複数の無菌有効成分を、塩基性分散媒および／または前記他の成分を含有する無菌担体に組み込むことにより、分散系を調製する。無菌注射溶液、懸濁液またはエマルションを調製するための無菌散剤の場合は、好ましい調製方法は、真空乾燥法または凍結乾燥法であり、これは、有効成分に加え、先に濾過した無菌液体培地からのいずれかの他の所望の成分を含有する粉末を生成する。必要な場合、液体培地を適切に緩衝する必要があり、注射前に十分な生理食塩水またはグルコースを用いることにより、液体希釈剤を等張にする必要がある。小さな領域に高濃度の活性薬剤を送達させるために、溶媒として用いるＤＭＳＯが非常に迅速な浸透をもたらすことが考えられる場合、直接注射のための高濃度組成物を調製することも企図される。
【0054】
本明細書で使用する場合、「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」は、被験体への投与後に治療効果をもたらすのに少なくとも十分である化合物を含有する物質、化合物、材料、または組成物の量を意味する。従って、これは、疾患または障害の症状を予防する、治癒する、改善する、遅延させるまたは部分的に遅延させるのに必要な量である。
【0055】
患者に投与される本発明の組成物の実際の用量は、以下の物理的および生理的因子：体重、性別、症状の重症度、処置される疾患の種類、以前のまたは現在の治療的介入、患者の病因不明な疾患、投与時間、特定の化合物の排泄率、および投与経路に従って、決定することができる。いずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度および個々の被験体に対する適当な用量は、投与の責任を有する医療従事者により決定されるであろう。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、１～１５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１～１００ｍｇ／ｋｇ体重、１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、１～３０ｍｇ／ｋｇ体重、１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、１～１５ｍｇ／ｋｇ体重、１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、１～５ｍｇ／ｋｇ体重、または３～５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。いくつかの特定の実施形態では、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤または医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、または２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎もしくは７日毎に１回投与される。
【0056】
いくつかの特定の実施形態では、注射された組成物の持続的吸収は、組成物中に遅延吸収薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組合せ）を用いることにより、達成することができる。
【実施例】
【0057】
本発明は、本明細書に示すいくつかの具体例を参照することにより、さらに理解することができ、これらの具体例は、本発明を説明することだけを目的とし、いずれの方法でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。明らかに、本発明の本質から逸脱することなく、多くの改変および変更を本発明に対して行うことができ、従って、これらの改変および変更も、本出願の範囲内である。
【0058】
例１．ラット平滑筋の収縮に対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の阻害効果
実験材料および方法
１．１ 実験動物：
１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２３０～２７０ｇの雌ウィスターラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
実験材料および方法
１．１ 実験動物：
１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２３０～２７０ｇの雌ウィスターラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
【0059】
１．２ 実験試薬：
オキシトシン注射液（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ、カタログ番号０５１０６９）；ジエチルスチルベストロール(diethylstibestrol)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号０５０６１５０）；ＰＧＦ２α、クレソキシムメチル、アセチルコリン、アゾキシストロビン、フルオキサストロビン、スティグマテリン、ミキソチアゾールおよびアトバコン、これらは総てＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した；トリフロキシストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、およびジモキシストロビン、これらは総てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；ならびにフルアクリピリム（ＦＡＰＭ）およびその誘導体、これらは実験室で合成した（Int J Cancer. 2010 Sep 1;127(6):1259-70）。
オキシトシン注射液（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ、カタログ番号０５１０６９）；ジエチルスチルベストロール(diethylstibestrol)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号０５０６１５０）；ＰＧＦ２α、クレソキシムメチル、アセチルコリン、アゾキシストロビン、フルオキサストロビン、スティグマテリン、ミキソチアゾールおよびアトバコン、これらは総てＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した；トリフロキシストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビン、およびジモキシストロビン、これらは総てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；ならびにフルアクリピリム（ＦＡＰＭ）およびその誘導体、これらは実験室で合成した（Int J Cancer. 2010 Sep 1;127(6):1259-70）。
【0060】
１．３ 実験機器
Ｐｃｌａｂ生体シグナル取得・処理システム(Pclab Biological Signal Acquisition and Processing System)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｉｇｈａｌｓｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）；ＣＳ５０２－３Ｃデジタルスーパーサーモスタット(CS502-3C Digital Superthermostat)（Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＳＤ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、温度変動０．５℃以下）；ＧＴＳバイオシグナルセンサー(GTS Biosignal Sensor)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｉｇｈａｌｓｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）；ＪＺ１０１筋張力トランスデューサー(JZ101 Muscle Tension Transducer)（Ｇａｏｂｅｉｄｉａｎ Ｘｉｎｈａｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
Ｐｃｌａｂ生体シグナル取得・処理システム(Pclab Biological Signal Acquisition and Processing System)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｉｇｈａｌｓｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）；ＣＳ５０２－３Ｃデジタルスーパーサーモスタット(CS502-3C Digital Superthermostat)（Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＳＤ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、温度変動０．５℃以下）；ＧＴＳバイオシグナルセンサー(GTS Biosignal Sensor)（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｉｇｈａｌｓｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）；ＪＺ１０１筋張力トランスデューサー(JZ101 Muscle Tension Transducer)（Ｇａｏｂｅｉｄｉａｎ Ｘｉｎｈａｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）。
【0061】
１．４ 実験方法
体重２３０～２７０ｇの健康な雌ウィスターラットを実験に用いた。実験の２日前に、ジエチルスチルベストロール懸濁液を、０．１ｍｇ／ｋｇで１回腹膜内に注射し、人為的発情を誘起した。ラットを頸椎脱臼により屠殺し、開腹により子宮を除去し、タイロード液を含有するガラス板に直ちに置いた。子宮壁に付着した結合組織および脂肪組織を慎重に剥がし、子宮をメサンギウム線に沿って切開し、ガラス板の底に平らに置いた後、平滑筋に沿って走行している子宮収縮帯に沿って外科用ブレードを用いることにより、子宮の片側を左右の子宮筋条片に分割し、片側の子宮筋条片の２つの端をそれぞれワイヤーで結紮した後、酸素で通気され、タイロード液５ｍｌで満たされた栄養チューブに移し、３７．２±０．５℃に予熱し、下端を固定し、上端を張力センサーに連結した。材料を２０～３０分間静置し、液体を２～３回交換した後、子宮に対して１ｇの負荷を与え、子宮が規則的な収縮波を示すまで、子宮を３０～６０分間維持し、４０ｍＭ ＫＣＬ溶液を１０分間供給し、子宮筋条片の機能を評価した。次に、筋条片を弛緩させ、タイロード液で２～３回洗浄した後、３０分間静置した。静置後、子宮筋条片に対して１ｇの負荷を与え、３０～６０分間維持し、子宮筋条片が安定して収縮した（すなわち、マイクロコンピュータの表示画面に規則的な収縮波形が出現した）後、投与および観察を実施し、子宮平滑筋条片の収縮張力、振幅および収縮曲線下面積などの関連データの変化を記録し、投与した薬剤を評価した。実験中、タイロード液の作業温度を３７．２±０．５℃に維持し、酸素を、１～２気泡／秒で栄養チューブに連続的に通気した。累積投与法を採用し、低濃度～高濃度で毎回５μｌを投与した。最終薬物濃度は、マクファーランドチューブ中の５ｍｌタイロード液に溶解している薬剤の濃度を意味する。
体重２３０～２７０ｇの健康な雌ウィスターラットを実験に用いた。実験の２日前に、ジエチルスチルベストロール懸濁液を、０．１ｍｇ／ｋｇで１回腹膜内に注射し、人為的発情を誘起した。ラットを頸椎脱臼により屠殺し、開腹により子宮を除去し、タイロード液を含有するガラス板に直ちに置いた。子宮壁に付着した結合組織および脂肪組織を慎重に剥がし、子宮をメサンギウム線に沿って切開し、ガラス板の底に平らに置いた後、平滑筋に沿って走行している子宮収縮帯に沿って外科用ブレードを用いることにより、子宮の片側を左右の子宮筋条片に分割し、片側の子宮筋条片の２つの端をそれぞれワイヤーで結紮した後、酸素で通気され、タイロード液５ｍｌで満たされた栄養チューブに移し、３７．２±０．５℃に予熱し、下端を固定し、上端を張力センサーに連結した。材料を２０～３０分間静置し、液体を２～３回交換した後、子宮に対して１ｇの負荷を与え、子宮が規則的な収縮波を示すまで、子宮を３０～６０分間維持し、４０ｍＭ ＫＣＬ溶液を１０分間供給し、子宮筋条片の機能を評価した。次に、筋条片を弛緩させ、タイロード液で２～３回洗浄した後、３０分間静置した。静置後、子宮筋条片に対して１ｇの負荷を与え、３０～６０分間維持し、子宮筋条片が安定して収縮した（すなわち、マイクロコンピュータの表示画面に規則的な収縮波形が出現した）後、投与および観察を実施し、子宮平滑筋条片の収縮張力、振幅および収縮曲線下面積などの関連データの変化を記録し、投与した薬剤を評価した。実験中、タイロード液の作業温度を３７．２±０．５℃に維持し、酸素を、１～２気泡／秒で栄養チューブに連続的に通気した。累積投与法を採用し、低濃度～高濃度で毎回５μｌを投与した。最終薬物濃度は、マクファーランドチューブ中の５ｍｌタイロード液に溶解している薬剤の濃度を意味する。
【0062】
１．５ 統計処理
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用し、プロッティングにはｏｒｉｇｉｎｐｒｏ７．５ソフトウエアを使用した。画像処理にはＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２ソフトウエアを使用した。
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用し、プロッティングにはｏｒｉｇｉｎｐｒｏ７．５ソフトウエアを使用した。画像処理にはＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２ソフトウエアを使用した。
【0063】
２．実験結果
２．１ ＰＧＦ２αにより誘発されたラット平滑筋の収縮に対するＦＡＰＭおよびその誘導体の阻害効果
ＢＡＳＦ ＳＥおよびＮｉｐｐｏｎ Ｓｏｄａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．により開発された最初のストロビルリン殺ダニ剤であるフルアクリピリム（ＦＡＰＭ）は、ミトコンドリアシトクロムｂｃ１複合体のＱｏ部位阻害剤である。図１に示されるように、ＨＴＦＡＰＭ、ＦＡＰＭＡおよびＩＦＡＰＭは、実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭの３つの誘導体である。図２Ａに示されるように、通常環境下において、単離されたラット子宮平滑筋条片は、時々の自律性収縮を受け、律動性収縮を自然に生じることがあった。ＰＧＦ２α（４５０ｎＭ）を栄養チューブに加えた際、子宮平滑筋条片の収縮の振幅および頻度が、有意に亢進した。実験は、ＦＡＰＭが、ＰＧＦ２α誘発性ラット子宮平滑筋収縮の振幅および頻度を用量依存的に阻害したことを示した。同じ用量下において、ＩＦＡＰＭは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮を部分的に阻害したが、ＨＴＦＡＰＭおよびＦＡＰＭＡは、阻害効果を示さなかった。薬剤介入の前および異なる用量の薬剤介入の１０分後において、それぞれ平滑筋収縮曲線下面積を算出した。ＰＧＦ２αにより生じた平滑筋収縮曲線下面積を１００％とすることにより、薬物用量効果曲線をプロットし、子宮平滑筋収縮を阻害するための薬剤の半有効量（ＩＣ５０値）を算出した。図２Ｂに示されるように、ＦＡＰＭおよびＩＦＡＰＭのＩＣ５０値は、それぞれ１．８４±０．０８μＭおよび１８．５±３．０μＭであった。構造活性相関解析は、ＦＡＰＭのＯ１４のメトキシアクリレートは、子宮平滑筋収縮を阻害するための重要なエフェクター基であることを明らかにしている。
２．１ ＰＧＦ２αにより誘発されたラット平滑筋の収縮に対するＦＡＰＭおよびその誘導体の阻害効果
ＢＡＳＦ ＳＥおよびＮｉｐｐｏｎ Ｓｏｄａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．により開発された最初のストロビルリン殺ダニ剤であるフルアクリピリム（ＦＡＰＭ）は、ミトコンドリアシトクロムｂｃ１複合体のＱｏ部位阻害剤である。図１に示されるように、ＨＴＦＡＰＭ、ＦＡＰＭＡおよびＩＦＡＰＭは、実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭの３つの誘導体である。図２Ａに示されるように、通常環境下において、単離されたラット子宮平滑筋条片は、時々の自律性収縮を受け、律動性収縮を自然に生じることがあった。ＰＧＦ２α（４５０ｎＭ）を栄養チューブに加えた際、子宮平滑筋条片の収縮の振幅および頻度が、有意に亢進した。実験は、ＦＡＰＭが、ＰＧＦ２α誘発性ラット子宮平滑筋収縮の振幅および頻度を用量依存的に阻害したことを示した。同じ用量下において、ＩＦＡＰＭは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮を部分的に阻害したが、ＨＴＦＡＰＭおよびＦＡＰＭＡは、阻害効果を示さなかった。薬剤介入の前および異なる用量の薬剤介入の１０分後において、それぞれ平滑筋収縮曲線下面積を算出した。ＰＧＦ２αにより生じた平滑筋収縮曲線下面積を１００％とすることにより、薬物用量効果曲線をプロットし、子宮平滑筋収縮を阻害するための薬剤の半有効量（ＩＣ５０値）を算出した。図２Ｂに示されるように、ＦＡＰＭおよびＩＦＡＰＭのＩＣ５０値は、それぞれ１．８４±０．０８μＭおよび１８．５±３．０μＭであった。構造活性相関解析は、ＦＡＰＭのＯ１４のメトキシアクリレートは、子宮平滑筋収縮を阻害するための重要なエフェクター基であることを明らかにしている。
【0064】
２．２ ＰＧＦ２αにより誘発されたラット平滑筋収縮に対するストロビルリン殺真菌剤の阻害効果
ここで、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮の実験モデルにおいて、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチル、フルオキサストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビンおよびジモキシストロビンなどの種々のストロビルリン殺真菌剤の子宮平滑筋収縮に対する阻害効果を、系統的に比較した。図３および表１に示されるように、これらの化合物は、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は１．０５～４．０８μＭの間であり、これはＦＡＰＭと同等である。スティグマテリンおよびミキソチアゾールは、報告されているようにシトクロムｂｃ１複合体の最も強力な呼吸阻害剤であり、かつ、シトクロムｂｃ１複合体を検討するための最も慣用の小分子化合物プローブである。両方とも、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮に対する最も強力な阻害効果を示し、ＩＣ５０値はナノモルレベルであったことが見出されている。
ここで、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮の実験モデルにおいて、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチル、フルオキサストロビン、ピラクロストロビン、ピコキシストロビンおよびジモキシストロビンなどの種々のストロビルリン殺真菌剤の子宮平滑筋収縮に対する阻害効果を、系統的に比較した。図３および表１に示されるように、これらの化合物は、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は１．０５～４．０８μＭの間であり、これはＦＡＰＭと同等である。スティグマテリンおよびミキソチアゾールは、報告されているようにシトクロムｂｃ１複合体の最も強力な呼吸阻害剤であり、かつ、シトクロムｂｃ１複合体を検討するための最も慣用の小分子化合物プローブである。両方とも、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋収縮に対する最も強力な阻害効果を示し、ＩＣ５０値はナノモルレベルであったことが見出されている。
【0065】
【表1】
【0066】
２．３ オキシトシン、アセチルコリンおよび塩化カリウムにより誘発されたラット平滑筋の収縮に対するＦＡＰＭの阻害効果
オキシトシンは、子宮平滑筋に対する興奮剤であり、オキシトシン受容体を活性化することにより、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こす。アセチルコリンは、神経伝達物質であり、平滑筋Ｍ型コリン受容体を活性化して、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こすことができる。塩化カリウムは、平滑筋細胞膜を脱分極させることができ、高濃度の塩化カリウム（４０ｍＭ）は、子宮平滑筋の強直性収縮を引き起こすことができ、低濃度の塩化カリウム（１６ｍＭ）は、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こすことができる。図４～６に示されるように、ＦＡＰＭは、オキシトシン（１ｍＵ／ｍｌ）、アセチルコリン（０．２５μＭ）および塩化カリウム（１６ｍＭ）により誘発された子宮平滑筋収縮を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は、それぞれ１．６±０．０８μＭ、１．３６±０．０４μＭおよび１．２１±０．０７μＭであった。
オキシトシンは、子宮平滑筋に対する興奮剤であり、オキシトシン受容体を活性化することにより、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こす。アセチルコリンは、神経伝達物質であり、平滑筋Ｍ型コリン受容体を活性化して、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こすことができる。塩化カリウムは、平滑筋細胞膜を脱分極させることができ、高濃度の塩化カリウム（４０ｍＭ）は、子宮平滑筋の強直性収縮を引き起こすことができ、低濃度の塩化カリウム（１６ｍＭ）は、子宮平滑筋の律動性収縮を引き起こすことができる。図４～６に示されるように、ＦＡＰＭは、オキシトシン（１ｍＵ／ｍｌ）、アセチルコリン（０．２５μＭ）および塩化カリウム（１６ｍＭ）により誘発された子宮平滑筋収縮を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０値は、それぞれ１．６±０．０８μＭ、１．３６±０．０４μＭおよび１．２１±０．０７μＭであった。
【0067】
２．４ ＰＧＦ２αにより誘発されたラット平滑筋の収縮に対するアトバコンの阻害効果
アトバコンは、補酵素Ｑのホモログであるヒドロキシ１，４－ナフトキノリンであり、広域スペクトル抗原虫活性を有する。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、プラスモディウム、ニューモシスチスカリニ肺炎（ＰＣＰ）、トキソプラズマおよび他の感染症の治療用にアトバコンを２０１１年に承認し、米国感染症学会（ＩＤＳＡ）ガイドラインは、２００６年にトキソプラズマ症の治療用にアトルバスタチンを推奨した。アトバキノン(atovaquinone)は、原虫のシトクロムｂｃ１複合体に直接結合することができ、シトクロムｂｃ１複合体の活性の阻害は、広域スペクトル抗原虫活性を発揮するその分子薬理学的機序である(Siregar JE, Kurisu G, Kobayashi T, et al. Direct evidence for the atovaquone action on the Plasmodium cytochrome bc1 complex. Parasitol Int. 2015 Jun;64(3):295-300)。これに基づき、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋の収縮に対するアトルバスタチンの阻害効果を観察した。アトルバスタチンは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋の収縮を用量依存的に阻害でき、ＩＣ５０値は８．４４±０．７μＭであることが見出されている（図７）。
アトバコンは、補酵素Ｑのホモログであるヒドロキシ１，４－ナフトキノリンであり、広域スペクトル抗原虫活性を有する。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、プラスモディウム、ニューモシスチスカリニ肺炎（ＰＣＰ）、トキソプラズマおよび他の感染症の治療用にアトバコンを２０１１年に承認し、米国感染症学会（ＩＤＳＡ）ガイドラインは、２００６年にトキソプラズマ症の治療用にアトルバスタチンを推奨した。アトバキノン(atovaquinone)は、原虫のシトクロムｂｃ１複合体に直接結合することができ、シトクロムｂｃ１複合体の活性の阻害は、広域スペクトル抗原虫活性を発揮するその分子薬理学的機序である(Siregar JE, Kurisu G, Kobayashi T, et al. Direct evidence for the atovaquone action on the Plasmodium cytochrome bc1 complex. Parasitol Int. 2015 Jun;64(3):295-300)。これに基づき、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋の収縮に対するアトルバスタチンの阻害効果を観察した。アトルバスタチンは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋の収縮を用量依存的に阻害でき、ＩＣ５０値は８．４４±０．７μＭであることが見出されている（図７）。
【0068】
例２．ラット平滑筋細胞におけるＭＬＣ２０のリン酸化に対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤としてのＦＡＰＭの阻害効果
１．実験材料および方法
１．１．実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２３０～２７０ｇの雌ウィスターラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
１．実験材料および方法
１．１．実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２３０～２７０ｇの雌ウィスターラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
【0069】
１．２．実験試薬：
ＷＢ ２×ＳＤＳローディング緩衝剤、５×トリス－グリシン電気泳動緩衝剤、電気泳動転写緩衝剤および分離ゲル緩衝剤、これらは総て自家調製したものであり（溶液の調製を参照）、ここで、試薬およびＸ線感光フィルムは、総てＢｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｓから購入した；ならびにリン酸化ミオシン軽鎖２（ｓｅｒ１９）に対するモノクローナル抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ発色基質ルミグロ(LumiGLO)（商標）基質、これらは総てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
ＷＢ ２×ＳＤＳローディング緩衝剤、５×トリス－グリシン電気泳動緩衝剤、電気泳動転写緩衝剤および分離ゲル緩衝剤、これらは総て自家調製したものであり（溶液の調製を参照）、ここで、試薬およびＸ線感光フィルムは、総てＢｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｓから購入した；ならびにリン酸化ミオシン軽鎖２（ｓｅｒ１９）に対するモノクローナル抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ発色基質ルミグロ(LumiGLO)（商標）基質、これらは総てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【0070】
１．３．実験機器：
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｐｅｒｌｏｎｇ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したＤＮＭ－９６０２Ｇマイクロプレートリーダー；ならびにＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した安定電圧・電流電源供給装置、タンパク質電気泳動機器、タンパク質電気泳動転写装置およびタンパク質分子量マーカー。
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｐｅｒｌｏｎｇ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したＤＮＭ－９６０２Ｇマイクロプレートリーダー；ならびにＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した安定電圧・電流電源供給装置、タンパク質電気泳動機器、タンパク質電気泳動転写装置およびタンパク質分子量マーカー。
【0071】
１．４．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット子宮平滑筋細胞の培養：
組織塊培養法を採用した：ジエチルスチルベストロールで処置したラットを脱臼により屠殺し、消毒のために７５％アルコールに浸漬し、無菌条件下で腹腔を開き、子宮を分離し、プレートに移し、子宮を切開して子宮の外膜を除去し、ブレードで子宮の内膜を緩やかに削り取り、ピンセットで子宮の外膜を緩やかに剥がし、無傷の平滑筋を１×１×１ｍｍ３未満の小片に切り出し、それらを培養瓶の壁に均一に付着させ、培養液を加えて底を上にし、５％ＣＯ２および３７℃で３～４時間培養した後、緩やかに回転させ、細胞が結合して小片となり、単層培養細胞を形成できるまで、ＲＰＭＩ－１６４０培養液（２０％仔血清含有）に約１週間浸漬する。この時、瓶中の培養液を注ぎ出し、瓶中の組織塊をＰＢＳで２回洗浄して除去し、適量の０．２５％トリプシンを加えた。ほとんどの細胞が収縮し、顕微鏡下で円形になった際、仔ウシ血清を加えて反応を停止させ、液体を注ぎ出し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、適量のＲＰＭＩ－１６４０を加え、溶出した細胞をピペットで緩やかに洗浄し、後で使用するための細胞懸濁液を調製した。
組織塊培養法を採用した：ジエチルスチルベストロールで処置したラットを脱臼により屠殺し、消毒のために７５％アルコールに浸漬し、無菌条件下で腹腔を開き、子宮を分離し、プレートに移し、子宮を切開して子宮の外膜を除去し、ブレードで子宮の内膜を緩やかに削り取り、ピンセットで子宮の外膜を緩やかに剥がし、無傷の平滑筋を１×１×１ｍｍ３未満の小片に切り出し、それらを培養瓶の壁に均一に付着させ、培養液を加えて底を上にし、５％ＣＯ２および３７℃で３～４時間培養した後、緩やかに回転させ、細胞が結合して小片となり、単層培養細胞を形成できるまで、ＲＰＭＩ－１６４０培養液（２０％仔血清含有）に約１週間浸漬する。この時、瓶中の培養液を注ぎ出し、瓶中の組織塊をＰＢＳで２回洗浄して除去し、適量の０．２５％トリプシンを加えた。ほとんどの細胞が収縮し、顕微鏡下で円形になった際、仔ウシ血清を加えて反応を停止させ、液体を注ぎ出し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、適量のＲＰＭＩ－１６４０を加え、溶出した細胞をピペットで緩やかに洗浄し、後で使用するための細胞懸濁液を調製した。
【0072】
１．５．全細胞タンパク質の抽出：
細胞を濃度１０５／ｍｌに調整し、密度４×１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種し、一晩の接着培養後、血清を２４時間取り除いた後、異なる濃度のＦＡＰＭで前処置した。ＰＧＦ２α刺激の５分後に細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、２×ＳＤＳローディング緩衝剤で溶解させた。細胞ライセートを回収し、１０分間煮沸した後、１２，０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離した。上清を回収し、サブパッケージし、後で使用するために－８０℃で保存した。
細胞を濃度１０５／ｍｌに調整し、密度４×１０５／ウェルで６ウェルプレートに接種し、一晩の接着培養後、血清を２４時間取り除いた後、異なる濃度のＦＡＰＭで前処置した。ＰＧＦ２α刺激の５分後に細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、２×ＳＤＳローディング緩衝剤で溶解させた。細胞ライセートを回収し、１０分間煮沸した後、１２，０００ｒ／ｍｉｎで５分間遠心分離した。上清を回収し、サブパッケージし、後で使用するために－８０℃で保存した。
【0073】
１．６．免疫ブロット検出（ウェスタンブロットハイブリダイゼーション）：
サブパッケージした細胞ライセートを室温で解凍した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に供した。サンプルをマイクロシリンジでコーム穴に慎重に加え、ブロモフェノールブルーバンドが分離ゲルの外側に流れるまで、電圧を１００Ｖに安定化させた後、電圧を２００Ｖに調整した。電気泳動後、氷浴中で安定電流１６０ｍＡの下、１時間膜移行を行い、タンパク質をニトロセルロース膜に移行させ、膜をプレートに移し、室温にて５％脱脂乳で１時間ブロックし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間３回洗浄し、適当な割合の一次抗体希釈液で一晩インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間４回洗浄し、翌日、適当な割合の二次抗体希釈液でもう１時間インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間４回洗浄し、ルミグロ(LumiGLO)（商標）基質で暗所にて１分間インキュベートした。Ｘ線フィルムの現像を、暗室にて行った。必要に応じて、膜は、他の抗体で再標識することができ、膜は、６５℃にて３０分間透明化緩衝剤(clearing buffer)でインキュベートでき（溶液の調製を参照）、透明化後、膜をＴＢＳ／Ｔで洗浄でき、抗体は、ブロッキング後に標識することができる。
サブパッケージした細胞ライセートを室温で解凍した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に供した。サンプルをマイクロシリンジでコーム穴に慎重に加え、ブロモフェノールブルーバンドが分離ゲルの外側に流れるまで、電圧を１００Ｖに安定化させた後、電圧を２００Ｖに調整した。電気泳動後、氷浴中で安定電流１６０ｍＡの下、１時間膜移行を行い、タンパク質をニトロセルロース膜に移行させ、膜をプレートに移し、室温にて５％脱脂乳で１時間ブロックし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間３回洗浄し、適当な割合の一次抗体希釈液で一晩インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間４回洗浄し、翌日、適当な割合の二次抗体希釈液でもう１時間インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔで各５分間４回洗浄し、ルミグロ(LumiGLO)（商標）基質で暗所にて１分間インキュベートした。Ｘ線フィルムの現像を、暗室にて行った。必要に応じて、膜は、他の抗体で再標識することができ、膜は、６５℃にて３０分間透明化緩衝剤(clearing buffer)でインキュベートでき（溶液の調製を参照）、透明化後、膜をＴＢＳ／Ｔで洗浄でき、抗体は、ブロッキング後に標識することができる。
【0074】
１．７．統計処理
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用し、プロッティングにはｏｒｉｇｉｎｐｒｏ７．５ソフトウエアを使用した。画像処理にはＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２ソフトウエアを使用した。
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用し、プロッティングにはｏｒｉｇｉｎｐｒｏ７．５ソフトウエアを使用した。画像処理にはＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ２ソフトウエアを使用した。
【0075】
２．結果
図８に示されるように、ＰＧＦ２α刺激は、ラット子宮平滑筋細胞におけるＭＬＣ２０のリン酸化を有意に亢進した。事前の異なる濃度のＦＡＰＭによる前処置の後、ＭＬＣ２０のリン酸化度は、有意に減少した。グレイ解析は、５μＭおよび１０μＭのＦＡＰＭは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋細胞におけるＭＬＣ２０のリン酸化を有意に阻害したことを示した。この結果は、ＦＡＰＭなどのシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ＭＬＣ２０のリン酸化を防ぐことにより、平滑筋収縮を阻害し得ることを示した。
図８に示されるように、ＰＧＦ２α刺激は、ラット子宮平滑筋細胞におけるＭＬＣ２０のリン酸化を有意に亢進した。事前の異なる濃度のＦＡＰＭによる前処置の後、ＭＬＣ２０のリン酸化度は、有意に減少した。グレイ解析は、５μＭおよび１０μＭのＦＡＰＭは、ＰＧＦ２αにより誘発されたラット子宮平滑筋細胞におけるＭＬＣ２０のリン酸化を有意に阻害したことを示した。この結果は、ＦＡＰＭなどのシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤は、ＭＬＣ２０のリン酸化を防ぐことにより、平滑筋収縮を阻害し得ることを示した。
【0076】
例３．マクロファージによる一酸化窒素産生に対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の阻害効果
１．材料および方法
１．１ 細胞株；
マウス単核マクロファージＲＡＷ２６４．７は、Ｘｉｅｈｅ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入した。
１．材料および方法
１．１ 細胞株；
マウス単核マクロファージＲＡＷ２６４．７は、Ｘｉｅｈｅ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから購入した。
【0077】
１．２ 試薬および機器
Ｓｉｇｍａから購入したリポ多糖（ＬＰＳ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＲＰＭＩ１６４０培地、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した一酸化窒素検査キット；ならびにＢｅｉｊｉｎｇ Ｐｅｒｌｏｎｇ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したＮＭ－９６０２Ｇマイクロプレートリーダー。
Ｓｉｇｍａから購入したリポ多糖（ＬＰＳ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＲＰＭＩ１６４０培地、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した一酸化窒素検査キット；ならびにＢｅｉｊｉｎｇ Ｐｅｒｌｏｎｇ Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したＮＭ－９６０２Ｇマイクロプレートリーダー。
【0078】
１．３ 細胞培養
マウス単核マクロファージを、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ・ｍＬ－１ストレプトマイシン、および１００単位・ｍＬ－１ペニシリンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に培養し、３７℃および５％ＣＯ２にて恒温インキュベーターでインキュベートし、翌日継代した。
マウス単核マクロファージを、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ・ｍＬ－１ストレプトマイシン、および１００単位・ｍＬ－１ペニシリンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に培養し、３７℃および５％ＣＯ２にて恒温インキュベーターでインキュベートし、翌日継代した。
【0079】
１．４ 放出されたＮＯの測定
サンプル中のＮＯ含量を、グリースアッセイにより測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、５×１０５個／ｍＬを含有する単一細胞懸濁液に調製し、９６ウェル細胞培養プレート（２００μＬ／ウェル）に接種した。３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベーターでの１２時間のインキュベーション後、異なる濃度の試験サンプルを各ウェルに加え、３０分間のインキュベーション後にＬＰＳ（終濃度１μｇ・ｍＬ－１）を加えた。ＬＰＳおよびブランク対照群を設定し、各サンプルに対して３反復ウェルとした。インキュベーターでの２４時間のインキュベーション後、培養液の１００μＬ上清を酵素標識プレートに吸引し、等容量のグリース試薬を加え、室温での反応の１０分後に、５４０ｎｍの吸光度を測定した。阻害率は、以下のように算出した：
サンプル中のＮＯ含量を、グリースアッセイにより測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、５×１０５個／ｍＬを含有する単一細胞懸濁液に調製し、９６ウェル細胞培養プレート（２００μＬ／ウェル）に接種した。３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベーターでの１２時間のインキュベーション後、異なる濃度の試験サンプルを各ウェルに加え、３０分間のインキュベーション後にＬＰＳ（終濃度１μｇ・ｍＬ－１）を加えた。ＬＰＳおよびブランク対照群を設定し、各サンプルに対して３反復ウェルとした。インキュベーターでの２４時間のインキュベーション後、培養液の１００μＬ上清を酵素標識プレートに吸引し、等容量のグリース試薬を加え、室温での反応の１０分後に、５４０ｎｍの吸光度を測定した。阻害率は、以下のように算出した：
【数1】
【0080】
２．結果
マウス腹膜マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７は、炎症試験用の慣用の細胞モデルの１つである。ＬＰＳを用いてＲＡＷ２６４．７細胞を刺激してＮＯを産生させ、マクロファージによるＮＯ産生に対するシトクロムｂｃ１複合体の種々の阻害剤の阻害効果を観察した。表２に示されるように、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチルおよびＦＡＰＭは総て、ＮＯ産生を有意に阻害し、ＩＣ５０はそれぞれ１．８９±０．３５μＭ、０．６４±０．２１μＭ、２．７７±０．６９μＭ、および３．８０μＭであった。最大阻害率は、総て８０％超であり、有効濃度は、子宮平滑筋収縮の阻害のものと同等であった。スティグマテリンおよびミキソチアゾールは、子宮平滑筋収縮に対する最も強力な阻害活性を示し、ＮＯ産生の阻害に対するそれらのＩＣ５０値も最低であり、それぞれ６．２４±１．１５ｎＭおよび２．８ｎＭであり、最大阻害率は、それぞれ８８．３±３．９％および９５％である。
マウス腹膜マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７は、炎症試験用の慣用の細胞モデルの１つである。ＬＰＳを用いてＲＡＷ２６４．７細胞を刺激してＮＯを産生させ、マクロファージによるＮＯ産生に対するシトクロムｂｃ１複合体の種々の阻害剤の阻害効果を観察した。表２に示されるように、シトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、アゾキシストロビン、トリフロキシストロビン、クレソキシムメチルおよびＦＡＰＭは総て、ＮＯ産生を有意に阻害し、ＩＣ５０はそれぞれ１．８９±０．３５μＭ、０．６４±０．２１μＭ、２．７７±０．６９μＭ、および３．８０μＭであった。最大阻害率は、総て８０％超であり、有効濃度は、子宮平滑筋収縮の阻害のものと同等であった。スティグマテリンおよびミキソチアゾールは、子宮平滑筋収縮に対する最も強力な阻害活性を示し、ＮＯ産生の阻害に対するそれらのＩＣ５０値も最低であり、それぞれ６．２４±１．１５ｎＭおよび２．８ｎＭであり、最大阻害率は、それぞれ８８．３±３．９％および９５％である。
【0081】
【表2】
【0082】
例４.ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の鎮痛効果に関する検討
１．材料および方法
１．１ 実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２２～２８ｇの雌雄清潔昆明マウス、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
１．材料および方法
１．１ 実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２２～２８ｇの雌雄清潔昆明マウス、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
【0083】
１．２ 実験薬および試薬
オキシトシン注射液（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ、カタログ番号：０５１０６９）；ジエチルスチルベストロール（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号：０５０６１５０）；Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入したインドメタシン、ＰＧＦ２α、クレソキシムメチルおよびアゾキシストロビン；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したトリフロキシストロビン、ピコキシストロビンおよびジモキシストロビン；ならびに実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭ（Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70）。
オキシトシン注射液（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆａｃｔｏｒｙ、カタログ番号：０５１０６９）；ジエチルスチルベストロール（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｍｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．、カタログ番号：０５０６１５０）；Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入したインドメタシン、ＰＧＦ２α、クレソキシムメチルおよびアゾキシストロビン；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したトリフロキシストロビン、ピコキシストロビンおよびジモキシストロビン；ならびに実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭ（Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70）。
【0084】
１．３ マウスに対する酢酸ライジング試験
Xu Shuyunの「Pharmacological Experimental Methodology」におけるマウスに対する酢酸ライジング試験を参照し、マウスにおける腹膜炎の疼痛モデルを再現した。成体健康雄昆明マウスを無作為にグループ化し、１群６～１０匹とした。実験の１時間前に、マウスに対して異なる種類および用量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を腹膜内または胃内投与し、インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射した後、０．６％氷酢酸を０．１ｍｌ／１０ｇで腹膜内注射し、ライジング開始時間（反応潜時）および３０分以内のライジング回数を観察および記録した。
Xu Shuyunの「Pharmacological Experimental Methodology」におけるマウスに対する酢酸ライジング試験を参照し、マウスにおける腹膜炎の疼痛モデルを再現した。成体健康雄昆明マウスを無作為にグループ化し、１群６～１０匹とした。実験の１時間前に、マウスに対して異なる種類および用量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を腹膜内または胃内投与し、インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射した後、０．６％氷酢酸を０．１ｍｌ／１０ｇで腹膜内注射し、ライジング開始時間（反応潜時）および３０分以内のライジング回数を観察および記録した。
【0085】
１．４ マウス月経困難症モデルの確立
Yang L., Cao Z., Yu B. ＆ Chai C. An in vivo mouse model of primary dysmenorrhea. Exp Anim. 2015, Aug 64, 295-303を参照し、マウス月経困難症モデルを確立した。成体健康雌昆明マウスを無作為にグループ化し、各群１０匹とした。成体健康雌昆明マウスを無作為にグループ化し、各群１０匹とした。実験マウスに対し、ジエチルスチルベストロール０．２ｍｇを１日１回１２日間胃内投与した。最終投与の３０分後に、異なる種類および用量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を、腹膜内または胃内投与した。インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射し、１時間後にＰＧＦ２α（１．３ｍｇ／ｋｇ）またはオキシトシン（２０Ｕ／ｋｇ）を腹膜内注射し、ライジング開始時間（反応潜時）および３０分以内のライジング回数を観察および記録した。
Yang L., Cao Z., Yu B. ＆ Chai C. An in vivo mouse model of primary dysmenorrhea. Exp Anim. 2015, Aug 64, 295-303を参照し、マウス月経困難症モデルを確立した。成体健康雌昆明マウスを無作為にグループ化し、各群１０匹とした。成体健康雌昆明マウスを無作為にグループ化し、各群１０匹とした。実験マウスに対し、ジエチルスチルベストロール０．２ｍｇを１日１回１２日間胃内投与した。最終投与の３０分後に、異なる種類および用量のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤を、腹膜内または胃内投与した。インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射し、１時間後にＰＧＦ２α（１．３ｍｇ／ｋｇ）またはオキシトシン（２０Ｕ／ｋｇ）を腹膜内注射し、ライジング開始時間（反応潜時）および３０分以内のライジング回数を観察および記録した。
【0086】
１．５ 統計処理
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用した。
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用した。
【0087】
２．結果
２．１ マウスにおける酢酸誘発性ライジングに対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の阻害効果
疼痛は、急性または潜在的組織傷害に起因する不快な感情および情動的経験である。氷酢酸などの化学的刺激により得られる疼痛モデルは、現在最も検討され、広く使用されている疼痛モデルである。これらの炎症刺激薬は、好中球走化性を介して急性炎症性疼痛を引き起こし、マクロファージ浸潤を媒介して持続性疼痛を引き起こす。マウス酢酸ライジング試験は、非麻薬性鎮痛薬のスクリーニングに好適であり、特に、ステロイド系抗炎症薬の鎮痛効果をスクリーニングするための感度が高い簡便な方法である。表３～６に示されるように、氷酢酸（０．６％、０．１ｍｌ／１０ｇ）の腹腔内注射後３０分以内に、マウスは約４０回のライジングを示し、潜時は２～３分であった。実験１時間前のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、ＦＡＰＭ（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）ならびにトリフロキシストロビン（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射またはアゾキシストロビン（５０、１００、２００および４００ｍｇ／Ｋｇ）の胃内投与は、マウスのライジング回数を用量依存的に阻害した。対照群と比較して、ＦＡＰＭ群およびトリフロキシストロビン群のライジング開始時間（反応潜時）は有意に延長し、用量効果が認められたが、アゾキシストロビン群のライジング開始時間は有意に延長しなかった。１００ｍｇ／ＫｇのＦＡＰＭ、トリフロキシストロビンおよびアゾキシストロビンは、治療効果の点で、５０ｍｇ／Ｋｇのインドメタシンと同等であった。２００ｍｇ／Ｋｇの用量における、胃内投与されたシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、ジモキシストロビン、クレソキシムメチルおよびピコキシストロビンの、マウスにおける酢酸誘発性ライジングに対する阻害効果を比較した。これらの３つの阻害剤は、マウスのライジング回数を明らかに阻害したが、ライジング開始時間は延長しなかったことが認められた。
２．１ マウスにおける酢酸誘発性ライジングに対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤の阻害効果
疼痛は、急性または潜在的組織傷害に起因する不快な感情および情動的経験である。氷酢酸などの化学的刺激により得られる疼痛モデルは、現在最も検討され、広く使用されている疼痛モデルである。これらの炎症刺激薬は、好中球走化性を介して急性炎症性疼痛を引き起こし、マクロファージ浸潤を媒介して持続性疼痛を引き起こす。マウス酢酸ライジング試験は、非麻薬性鎮痛薬のスクリーニングに好適であり、特に、ステロイド系抗炎症薬の鎮痛効果をスクリーニングするための感度が高い簡便な方法である。表３～６に示されるように、氷酢酸（０．６％、０．１ｍｌ／１０ｇ）の腹腔内注射後３０分以内に、マウスは約４０回のライジングを示し、潜時は２～３分であった。実験１時間前のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、ＦＡＰＭ（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）ならびにトリフロキシストロビン（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射またはアゾキシストロビン（５０、１００、２００および４００ｍｇ／Ｋｇ）の胃内投与は、マウスのライジング回数を用量依存的に阻害した。対照群と比較して、ＦＡＰＭ群およびトリフロキシストロビン群のライジング開始時間（反応潜時）は有意に延長し、用量効果が認められたが、アゾキシストロビン群のライジング開始時間は有意に延長しなかった。１００ｍｇ／ＫｇのＦＡＰＭ、トリフロキシストロビンおよびアゾキシストロビンは、治療効果の点で、５０ｍｇ／Ｋｇのインドメタシンと同等であった。２００ｍｇ／Ｋｇの用量における、胃内投与されたシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤、ジモキシストロビン、クレソキシムメチルおよびピコキシストロビンの、マウスにおける酢酸誘発性ライジングに対する阻害効果を比較した。これらの３つの阻害剤は、マウスのライジング回数を明らかに阻害したが、ライジング開始時間は延長しなかったことが認められた。
【0088】
【表3】
【0089】
【表4】
【0090】
【表5】
【0091】
【表6】
【0092】
２．２ 月経困難症モデルマウスに対するシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤ＦＡＰＭおよびアゾキシストロビンの鎮痛効果
月経困難症は、最も一般的な婦人科症状の１つであり、原発性月経困難症および続発性月経困難症の２種類に分けられる。原発性月経困難症は、生殖器官における器質的病変がない月経困難症を意味し、月経困難症の９０％超を占め、続発性月経困難症は、骨盤腔の器質的疾患に起因する月経困難症を意味する。原発性月経困難症の発症は、月経中の子宮内膜におけるプロスタグランジン含量の増加に主に関連している。ＰＧＦ２α含量の増加は、月経困難症の主因である。月経困難症の病態生理学的機序および参考文献に基づき、ジエチルスチルベストロール感作およびＰＧＦ２α疼痛誘発を含む２段階方法により誘発されたマウス月経困難症モデルを確立した。
月経困難症は、最も一般的な婦人科症状の１つであり、原発性月経困難症および続発性月経困難症の２種類に分けられる。原発性月経困難症は、生殖器官における器質的病変がない月経困難症を意味し、月経困難症の９０％超を占め、続発性月経困難症は、骨盤腔の器質的疾患に起因する月経困難症を意味する。原発性月経困難症の発症は、月経中の子宮内膜におけるプロスタグランジン含量の増加に主に関連している。ＰＧＦ２α含量の増加は、月経困難症の主因である。月経困難症の病態生理学的機序および参考文献に基づき、ジエチルスチルベストロール感作およびＰＧＦ２α疼痛誘発を含む２段階方法により誘発されたマウス月経困難症モデルを確立した。
【0093】
表７および表８に示されるように、ジエチルスチルベストロールによる感作の後、ＰＧＦ２α（１．３ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後３０分以内に、マウスのライジング回数は約２０に達し、潜時は１～２分であった。実験１時間前のシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤ＦＡＰＭ（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内注射またはアゾキシストロビン（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）の胃内投与は、マウスのライジング回数を用量依存的に阻害し、各用量群と対照群との間に統計的差が認められた。ライジング開始時間が有意に延長した２００ｍｇ／Ｋｇ ＦＡＰＭ群を除き、他の群のライジング開始時間は、対照群のそれと有意差を示さなかった。５０ｍｇ／ＫｇのＦＡＰＭおよびアゾキシストロビンは、治療効果の点で、５０ｍｇ／Ｋｇのインドメタシンと同等であった。
【0094】
オキシトシンは、子宮平滑筋に対する刺激物質である。図９に示されるように、ジエチルスチルベストロール感作およびオキシトシン疼痛誘発を含む２段階方法により誘発されたマウス月経困難症モデルにおいて、マウスのライジング回数は、ほぼ４０であった。アゾキシストロビン（５０、１００および２００ｍｇ／Ｋｇ）の胃内投与は、マウスのライジング回数を用量依存的に阻害し、各用量群と対照群との間に統計的差が認められた。このモデルにおいて、５０ｍｇ／Ｋｇのアゾキシストロビンは、治療効果の点で、５０ｍｇ／Ｋｇのインドメタシンと同等であった。
【0095】
【表7】
【0096】
【表8】
【0097】
【表9】
【0098】
例５．ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシトクロムｂｃ１複合体の阻害剤ＦＡＰＭの抗炎症効果に関する検討
１．材料および方法
１．１ 実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２２～２８ｇの雌清潔昆明マウスおよび体重１２０～１４０ｇのＳＤラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
１．材料および方法
１．１ 実験動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから提供された体重２２～２８ｇの雌清潔昆明マウスおよび体重１２０～１４０ｇのＳＤラット、医動物のカタログ番号：Ｄ０１－３０３９。
【0099】
１．２ 実験薬および試薬
Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入したインドメタシン、デキサメタゾンおよびカラゲナンキシレン；ならびに実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭ（Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70）。
Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入したインドメタシン、デキサメタゾンおよびカラゲナンキシレン；ならびに実験室において本発明者らが合成したＦＡＰＭ（Int J Cancer. 2010 Sep 1; 127(6): 1259-70）。
【0100】
１．３ キシレン誘発性マウス耳介腫脹試験
健康成体雄マウス５０匹を無作為に５群に分けた。実験マウスに対し、異なる用量のＦＡＰＭ（５０、１００および２００ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ１回腹膜内注射した。対照群に対し、同じ量の溶媒を注射し、インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射した。投与１時間後に、キシレン２０μＬを、マウスの右耳の両側に均一に適用し、自己対照としての左耳にはキシレンは適用しなかった。１時間後に、２つの耳を切断し、６ｍｍ穴あけ器を用いて、２つの耳の同じ部位から２つの耳小片を除去した。２つの耳小片を精密天秤で秤量し、腫脹度（右耳小片重量－左耳小片重量）および腫脹阻害率（右耳小片重量－左耳小片重量）／左耳小片重量×１００％）を算出した。
健康成体雄マウス５０匹を無作為に５群に分けた。実験マウスに対し、異なる用量のＦＡＰＭ（５０、１００および２００ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ１回腹膜内注射した。対照群に対し、同じ量の溶媒を注射し、インドメタシン（５０ｍｇ／ｋｇ）を陽性対照として腹膜内注射した。投与１時間後に、キシレン２０μＬを、マウスの右耳の両側に均一に適用し、自己対照としての左耳にはキシレンは適用しなかった。１時間後に、２つの耳を切断し、６ｍｍ穴あけ器を用いて、２つの耳の同じ部位から２つの耳小片を除去した。２つの耳小片を精密天秤で秤量し、腫脹度（右耳小片重量－左耳小片重量）および腫脹阻害率（右耳小片重量－左耳小片重量）／左耳小片重量×１００％）を算出した。
【0101】
１．４ カラゲナン誘発性ラット足腫脹試験
健康成体雄マウス１８匹を無作為に３群に分けた。ＦＡＰＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間連続で腹膜内投与した。対照群に対し、同じ量の溶媒を注射し、陽性薬デキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間連続で胃内投与した。最終投与の３０分後に、１％カラゲナン０．１ｍＬを各ラットの右後足に皮下注射し、注射前ならびに注射の１、２および３時間後に足底厚を測定した。３時間後に、ラットを脱臼により屠殺した。足を膝関節から切断し、精密天秤で秤量した。足の腫脹度（右足重量－左足重量）を算出した。
健康成体雄マウス１８匹を無作為に３群に分けた。ＦＡＰＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間連続で腹膜内投与した。対照群に対し、同じ量の溶媒を注射し、陽性薬デキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、３日間連続で胃内投与した。最終投与の３０分後に、１％カラゲナン０．１ｍＬを各ラットの右後足に皮下注射し、注射前ならびに注射の１、２および３時間後に足底厚を測定した。３時間後に、ラットを脱臼により屠殺した。足を膝関節から切断し、精密天秤で秤量した。足の腫脹度（右足重量－左足重量）を算出した。
【0102】
１．５ 統計処理
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用した。
総ての実験データは、「ｘ±ｓ」として表し、統計解析のための単一因子マルチレベルｔ検定(single-factor multi-level T test)を実施するために、ＳＡＳソフトウエアを使用した。
【0103】
２．結果
炎症は、有害な刺激に対する身体により生じる重要な防御機序である。炎症反応は、身体の最も基本的な抗傷害反応である。炎症は、創傷治癒の促進に役立つが、関節炎、喘息および身体障害などの多くの傷害も引き起こし得る。炎症は、病因によって、感染性炎症、無菌性炎症（非特異性炎症）およびアレルギー性炎症に分けることができる。キシレン誘発性マウス耳介腫脹試験およびカラゲナン誘発性ラット足腫脹試験は、抗炎症薬の評価およびスクリーニングのための最も慣用の方法である。表１０～１２に示されるように、１００ｍｇ／ｋｇ ＦＡＰＭの腹腔内投与は、キシレン誘発性マウス耳介腫脹およびカラゲナン誘発性ラット足腫脹を有意に阻害し、対照群と比較して統計的差が認められた。陽性薬インドメタシン（１０ｍｇ／Ｋｇ）群の耳介腫脹度は、対照群のものよりも低かったが、統計的差は認められなかった。陽性薬デキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）は、カラゲナン誘発性ラット足腫脹を有意に阻害し、その治療効果は、ＦＡＰＭよりもわずかに優れている。
炎症は、有害な刺激に対する身体により生じる重要な防御機序である。炎症反応は、身体の最も基本的な抗傷害反応である。炎症は、創傷治癒の促進に役立つが、関節炎、喘息および身体障害などの多くの傷害も引き起こし得る。炎症は、病因によって、感染性炎症、無菌性炎症（非特異性炎症）およびアレルギー性炎症に分けることができる。キシレン誘発性マウス耳介腫脹試験およびカラゲナン誘発性ラット足腫脹試験は、抗炎症薬の評価およびスクリーニングのための最も慣用の方法である。表１０～１２に示されるように、１００ｍｇ／ｋｇ ＦＡＰＭの腹腔内投与は、キシレン誘発性マウス耳介腫脹およびカラゲナン誘発性ラット足腫脹を有意に阻害し、対照群と比較して統計的差が認められた。陽性薬インドメタシン（１０ｍｇ／Ｋｇ）群の耳介腫脹度は、対照群のものよりも低かったが、統計的差は認められなかった。陽性薬デキサメタゾン（４ｍｇ／ｋｇ）は、カラゲナン誘発性ラット足腫脹を有意に阻害し、その治療効果は、ＦＡＰＭよりもわずかに優れている。
【0104】
【表10】
【0105】
【表11】
【0106】
【表12】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
