特許7147060ラクトバチルス・カゼイ由来ガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーターを用いた常時的高発現表面発現ベクターおよびその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-26
(45)【発行日】2022-10-04
(54)【発明の名称】ラクトバチルス・カゼイ由来ガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーターを用いた常時的高発現表面発現ベクターおよびその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/74 20060101AFI20220927BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220927BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220927BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20220927BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220927BHJP
【ＦＩ】
C12N15/74 110Z
C12N1/21 ZNA
C12P21/02 C
A61K39/02
A61P31/00
【請求項の数】
24
(21)【出願番号】P 2021518738
(86)(22)【出願日】2019-10-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-13
(86)【国際出願番号】 KR2019013260
(87)【国際公開番号】W WO2020076078
(87)【国際公開日】2020-04-16
【審査請求日】2021-04-05
(31)【優先権主張番号】10-2018-0120546
(32)【優先日】2018-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519220124
【氏名又は名称】バイオリーダース コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】パク ヨン チュル
(72)【発明者】
【氏名】キ デ ウン
(72)【発明者】
【氏名】ナム ギョン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ビョン セ ウン
(72)【発明者】
【氏名】ムン ハ ナ
(72)【発明者】
【氏名】カン ヒュン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ハム キュン ス
【審査官】幸田 俊希
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－０５４７３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００９９８９２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５０００５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Gerard G. Bouffard et al，Dependence of Lactose Metabolism upon Mutarotase Encoded in the gal Operon in Escherichia coli.，J. Mol. Biol., 1994, Vol.244, pp.269-278，1994年12月02日，Vol.244, No.3，p.269-278，doi: 10.1006/jmbi.1994.1728
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーターであって、
配列番号１の塩基配列からなる
ことを特徴とするプロモーター。
【請求項2】
請求項１に記載のプロモーターおよび目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項3】
請求項２に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項4】
請求項１に記載のプロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体の遺伝子および目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されていることを特徴とする微生物表面発現ベクター。
【請求項5】
目的タンパク質は、抗原であることを特徴とする請求項４に記載の微生物表面発現ベクター。
【請求項6】
前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体の遺伝子は、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢおよびｐｇｓＣのうちの少なくともいずれか一種であることを特徴とする請求項４に記載の微生物表面発現ベクター。
【請求項7】
請求項４ないし６のいずれか一項に記載の微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項8】
微生物は、乳酸菌であることを特徴とする請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子は、ｐｇｓＡであり、配列番号１８～２１および２９～３１のうちのいずれか一つの塩基配列からなることを特徴とする請求項４に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項10】
前記遺伝子ｐｇｓＡは、ポリガンマグルタミン酸を産生するバチルス属菌株に由来したことを特徴とする請求項９に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項11】
前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号２２の塩基配列からなることを特徴とする請求項９に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項12】
前記遺伝子ｐｇｓＡの末端部位にリンカーが挿入されており、前記挿入されたリンカーに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項９に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項13】
前記目的タンパク質は、表面発現に有利であるように目的タンパク質のアミノ酸配列のうちの一部分が除去されたり位置特異的に突然変異されたりしたものであることを特徴とする請求項９に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項14】
前記ベクターは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に適用されることを特徴とする請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
【請求項15】
請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の表面発現ベクターで形質転換された微生物。
【請求項16】
形質転換に用いられた微生物は、目的タンパク質の細胞表面発現に有利であるように、発現された目的タンパク質を分解することに関わる細胞内または細胞外のタンパク質分解酵素を産生できないように変形されたものであることを特徴とする請求項１５に記載の形質転換された微生物。
【請求項17】
微生物は、乳酸菌であることを特徴とする請求項１５に記載の形質転換された微生物。
【請求項18】
請求項７に記載の形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質を微生物の表面に発現する方法。
【請求項19】
次のステップを含む微生物ワクチンの製造方法：（ａ）請求項５に記載の微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物を培養して微生物の表面に抗原を表面発現するステップ；及び
（ｂ）前記抗原が表面発現された微生物を回収するステップ。
【請求項20】
微生物は、乳酸菌であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
請求項１５に記載の形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞の表面に発現するステップおよび目的タンパク質が表面に発現された細胞を回収するステップを含む目的タンパク質の細胞表面発現方法。
【請求項22】
目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質もしくはその一部分、抗体もしくはその一部分、一本鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子および植物生体防御誘導タンパク質よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
請求項２２に記載の方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与して体液性免疫または細胞性免疫を誘導することを特徴とする方法。
【請求項24】
下記のステップを含むことを特徴とするグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の表面に目的タンパク質を発現する方法：（ａ）請求項１４に記載の目的タンパク質の表面発現ベクターに目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入して組換えベクターを製造するステップ；
（ｂ）前記組換えベクターでグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞を形質転換するステップ；及び
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して目的タンパク質を宿主細胞の表面に発現するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーターに係り、さらに詳しくは、配列番号１の塩基配列で示されるラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーター、前記プロモーターを含有する発現ベクターおよび前記発現ベクターで形質転換された微生物に関する。
【0002】
また、本発明は、バチルス属菌株由来のポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質（ｐｇｓＡ）を用いて外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現する新規なベクターに関するものであり、さらに、本発明は、バチルス属菌株由来のポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を微生物の表面に発現するタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0003】
食品微生物の中で最も重要な微生物群である乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、様々な食品に用いられてきたことに伴い、一般的に安全と認められている（ＧＲＡＳ：ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）微生物であり、プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾンなどを有していて遺伝子の導入のための自体ベクターの開発が可能であり、かつ、当業界において通常的に用いられる方法による形質転換が容易である他、食用選択マーカー遺伝子もまた確保されていることから、食用に用いる上で最も好適な菌株であるといえる。また、乳酸菌は、腸内有害菌の抑制作用および整腸作用、血中コレステロールの減少機能、栄養学的な価値の増進、病原体感染の抑制作用、肝硬変症の改善作用、抗癌作用、老化の抑制作用、大食細胞の活性化を通じた免疫増強作用などの効能を有している。
【0004】
乳酸菌から有用な外来タンパク質を産生するためには、高効率のプロモーター（Ｊ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．５３，ｐｐ ２４５２－２４５７，１９８７；Ｔｅｉｊａ Ｋｏｉｖｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ ３３３－３４０，１９９１；Ｐａｓｃａｌｌｅ Ｇ．Ｇ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ ３６６２－３６６７，１９９６）の確保が必要であるものの、現在まで乳酸菌遺伝体に関する研究はほとんど進んでいないのが現状である。乳酸菌の遺伝体は、現在まで、ビフィドバクテリウム・ロンガムＮＣＣ ２７０５（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＮＣＣ ２７０５）、エンテロコッカス・フェカーリスＶ５８３（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｖ５８３）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＷＦＣＳ１）に対してのみ遺伝体の塩基配列が解読された状態であり、現在のところ、多種多様な乳酸菌の遺伝体の解読の研究が行われており、ちなみに、これまで乳酸菌から分離されたプロモーターとしては、ストレブトコッカス・サーモフィラスＡ０５４、ラクトコッカス・ラクティスＭＧ１６１４、ラクトコッカス・クレモティスＷｇ２のゲノム由来の常時発現プロモーター（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ Ｓｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ １３３３－１３３９，１９９１；Ｔｅｉｊａ Ｋｏｉｖｕｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ ３３３－３４０，１９９１；Ｊ．Ｍ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．，Ｖｏｌ．５３，ｐｐ ２４５２－２４５７，１９８７）のみが知られている。
【0005】
最近、アメリカおよびヨーロッパにおいて、乳酸菌を用いたライブワクチンの開発、有用なホルモン剤の腸内運搬体に関する研究およびこのための効率よい遺伝子源の確保と乳酸菌用挿入ベクターの開発への取り組みが行われている。特に、乳酸菌に含有されている多量の構成成分である非メチル化された（ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ＣｐＧ ＤＮＡ、リポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）、ペプチドグリカンなどが免疫上昇剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）としての役割を果たすことが知られているので、乳酸菌のワクチン伝達体（ｖｅｈｉｃｌｅ）としての有用性が高く評価されている。また、乳酸菌は、胆汁酸および胃酸に抵抗性を示して腸までの抗原の伝達が可能であるので、腸内粘膜免疫を誘導することができるという点で多くの利点を有している（Ｊｏｓ Ｆ．Ｍ．Ｋ．Ｓｅｅｇｅｒｓ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ ５０８－５１５，２００２）。
【0006】
しかしながら、乳酸菌をワクチン伝達体として用いるためには、疾病予防用抗体の生成のための抗原タンパク質を菌体の内部または外部に提示して抗原抗体反応が円滑に行われるようにする技術の開発が必要であり、実際に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ：Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）のＬ１タンパク質が内部発現される乳酸菌を用いた抗体誘導能の確認（Ｋａｒｉｎａ Ａｒａｕｊｏ Ａｉｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．７２，ｐｐ ７４５－７５２，２００６）およびＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）の乳酸菌分泌発現菌株を用いた疾病治療効能の確認（Ｌｏｔｈａｒ Ｓｔｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．２１，ｐｐ ７８５－７８９，２００３）などが発表され、これらの他にも、乳酸菌がワクチン伝達体として用いて好適であることを窮め尽くした様々な研究結果が発表されている。
【0007】
上述したように、目的タンパク質を発現する乳酸菌に対する様々な用途の開発と学問的な研究が盛んに行われているものの、これまでは発現される目的タンパク質の発現量が不十分であるという問題と、誘導的発現プロモーターを用いたときに体内への投与時の持続的な発現が不可能である虞があるという問題などがある。
【0008】
また、細胞表面発現とは、タンパク質やペプチドなどを適切な表面発現母体（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）と融合してグラム陰性、陽性菌、カビ、酵母、動物細胞の表面に発現する技術のことをいう（Ｌｅｅ Ｓ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：４５５２，２００３）。最初の細胞表面発現技術は、１９８０年代に相対的に表面が単純なファージを用いてペプチドや小さなタンパク質を繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）のｐＩＩＩと融合して発現してこれを表面発現システム（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）と名付けたものである。ファージを用いた細胞表面発現は、抗体のスクリーニングや、エピトープ、高親和性リガンドなどのスクリーニングに用いられたが、ファージの表面に発現され得るタンパク質の大きさが相対的に制限されているため、限界を曝け出すことに至った。したがって、その代案として、バクテリアを用いた細胞表面発現が開発された。バクテリアや酵母などの微生物の表面タンパク質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）として用いて外来タンパク質を微生物の表面に安定的に発現する分野である。
【0009】
特定の有機体の外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を細胞の表面に発現するためには、適当な表面タンパク質と外来タンパク質を遺伝子のレベルで互いに連結して融合タンパク質が生合成されるようにし、これらが安定的に細胞内膜を通過して細胞の表面に付着されて保たれるようにしなければならない。このためには、次のような性質を有するタンパク質を表面発現の母体として用いることが好ましい：第一に、細胞内膜を通過できる分泌シグナル（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）をＮ－末端に有しており、第二に、細胞外膜の表面に安定的に付着され得る標的シグナル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を有していなければならず、第三に、細胞の成長に悪影響を及ぼさない範囲内において細胞の表面に多量に発現されてタンパク質の活性が高く現れることができ、かつ、最後に、タンパク質の大きさとは無関係に安定的に発現されて様々な反応に利用できなければならない（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１１：６，１９９３）。このような表面発現母体は、宿主細胞の表面に外膜タンパク質のＮ－末端やＣ－末端、またはタンパク質の中央に挿入されるように遺伝的に操作する必要もある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，２１：４５，２００３）。
【0010】
細菌の表面にタンパク質が発現されるためには、細胞内において生合成されたタンパク質が細胞膜を通過できる分泌シグナル（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）がそのタンパク質の一次配列の上になければならない。また、グラム陰性細菌である場合には、細胞内膜と細胞膜空間を通過して細胞外膜に挿入・付着されて膜の外部に突出するように定着されなければならない。細菌の場合、このような分泌シグナルと細胞の表面に定着されるようにする標的シグナル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を有しているタンパク質としては、表面タンパク質、特殊の酵素、毒素タンパク質などが挙げられる。実際に、これらのタンパク質が有する分泌シグナルと標的シグナルなどを適当なプロモーターと併用すれば、細菌の表面にタンパク質を成功的に発現することができる。外来タンパク質の表面発現に用いられた細菌の表面タンパク質は、細胞外膜タンパク質、リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌タンパク質、細胞表面器官タンパク質など大きく４種類に分けられる。現在まで主としてグラム陰性細菌に存在する表面タンパク質、例えば、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＯｍｐＡなどを用いて所要の外来タンパク質を細菌の表面に発現しようとする試みが行われた。これらのタンパク質を用いた場合、外来タンパク質を細胞の表面に突出したループ（ｌｏｏｐ）に挿入するため、構造的に挿入可能なタンパク質の大きさが制限される。また、挿入されるべき外来タンパク質のＣ－末端とＮ－末端が立体的に近く位置しなければならないため、その距離が遠い場合には、連結ペプチドで両末端同士を近付けなければならないという問題がある。
【0011】
実際に、ＬａｍＢやＰｈｏＥを用いた場合、５０～６０個以上のアミノ酸からなる外来ポリペプチドを挿入すれば、構造的な制限をもたらして安定的な膜タンパク質を形成することができなかった［Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：１６５８－１６６４（１９８７）；Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：８５－９１（１９９０）］。ＯｍｐＡを用いて外来タンパク質を突出されたループに挿入した場合もあるが、構造的な制限を克服するために細胞外膜に定着できるようにする最小限の標的シグナルを含む一部のＯｍｐＡ断片のみを用いた。このような方法で、β－ラクタマーゼ（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ）をＯｍｐＡ標的シグナルＣ－末端に連結して細胞の表面に発現したケースがある。
【0012】
さらに、最近に知られている表面発現に用いられたグラム陰性細菌の細胞外膜タンパク質であって、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来の氷核形成タンパク質（Ｉｃｅ－ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＮＰ）を用いた表面発現が試みられた［Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：５７６－５６０（１９９８），Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２（５）：３４８－３５４（１９９８），Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：６４５－６４８（２０００）］。ジョン（Ｊｕｎｇ）らは、Ｎ－末端、中央の繰り返し区間、並びにＣ－末端から構成された氷核形成タンパク質のＣ－末端にレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）を、かつ、中央の繰り返し区間が削除されたＮ－末端、およびＣ－末端から構成された氷核形成タンパク質のＣ－末端にカルボキシメチルセルラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ）を融合してそれぞれを表面発現して酵素活性を測定確認した。李（Ｌｅｅ）らは、同様に、Ｎ－末端、もしくはＮ－末端とＣ－末端から構成された氷核形成タンパク質のそれぞれの末端にＢ型肝炎ウィルスの表面抗原とＣ型肝炎ウィルスのコア（ｃｏｒｅ）抗原を大腸菌またはサルモネラ・ティフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２１ａ）菌株の表面に発現した後、これらが複合生ワクチンとして使用できることを確認した。
【0013】
リポタンパク質もまた、表面タンパク質として表面発現に用いられている。特に、大腸菌のリポタンパク質は、そのＮ－末端に分泌シグナルを有し、細胞内膜を通過することができ、末端のシステイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が共有結合で細胞外膜脂質または細胞内膜脂質と直接的に付着されている。主たるリポタンパク質であるＬｐｐは、Ｎ－末端は細胞外膜に、Ｃ－末端は細胞壁（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ；ＰＧ）に結合されていて細胞外膜タンパク質ＯｍｐＡ断片と連結される場合に安定的に外来タンパク質を細胞外膜まで分泌して表面発現することができる［Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８９：２７１３－２７１７（１９９２）］。他のリポタンパク質であるＴｒａＴは、リポタンパク質のこのような特性を用いてポリオウィルスのＣ３エピトープなどのペプチドを表面発現するのに用いられた［Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１－３１０（１９９１）］。また、未だ正確な機能は判明されていない細胞壁付着型リポタンパク質（Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＰＡＬ）もまた組換え抗体の表面発現に用いられた［Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９－１３７２（１９９１）］。この場合、ＰＡＬのＣ－末端は細胞壁に連結され、Ｎ－末端は組換え抗体に連結されて融合タンパク質が表面発現された。
【0014】
細胞外膜を通過する分泌タンパク質もまた、表面タンパク質として利用できるが、グラム陰性細菌の場合、分泌タンパク質が発達されておらず、いくつかの分泌タンパク質の場合にのみその特有の分泌機作に関与するタンパク質が存在して細胞外膜の通過を援助している。例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のプルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）は、リポタンパク質であって、そのＮ－末端が脂肪質に置換されて細胞外膜に付着されていて、完全に細胞培養液中に分泌される。コルナカー（Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ）らがプルラナーゼのＮ－末端断片を用いてβ－ラクタマーゼを細胞の表面に発現したが、発現されたプルラナーゼ－β－ラクタマーゼ融合タンパク質はしばらくの間細胞の表面に付着されていて、細胞培養液中に遊離されるという欠点があった。また、これを用いて細胞膜空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅ）タンパク質であるアルカリ・ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発現した場合、これの分泌のためには少なくとも１４個以上のタンパク質が関わるため、安定的に表面発現されなかった［Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｌ．，４：１１０１－１１０９（１９９０）］。
【0015】
ユニークな分泌体系を有している病原微生物ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のＩｇＡプロテアーゼは、Ｃ－末端に存在する断片にＮ－末端に存在するプロテアーゼを細胞外膜に定着させるシグナルを有している。一応細胞外膜に達して細胞の表面に突出したプロテアーゼは、自分の加水分解能により細胞培養液に分泌される。クラウザー（Ｋｌａｕｓｅｒ）らは、このＩｇＡプロテアーゼ断片を用いて約１２ｋＤａのコレラ毒素Ｂ小単位を安定的に細胞の表面に発現した［Ｋｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９９１－１９９９（１９９０）］。しかしながら、分泌過程の最中に細胞膜空間において起きたタンパク質の折り畳み（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ）により融合タンパク質の分泌は抑えられた。
【0016】
この他にも、グラム陰性細菌の場合、細胞の表面に存在して表面発現に応用できる細胞器官としては、べん毛（Ｆｌａｇｅｌｌａ）、線毛（Ｐｉｌｉ）および長縁毛（Ｆｉｍｂｒｉａｅ）などが挙げられる。べん毛の構成小単位であるべん毛タンパク質（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を用いてコレラ毒素Ｂ小単位とＢ型肝炎ウィルスに由来したペプチドが安定的に発現され、これらはそれに対する抗体と強力に反応した［Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：７０－７２（１９８９）］。細胞の表面にまるで糸のような形状をした長縁毛の構成タンパク質であるフィンブリリン（ｆｉｍｂｒｉｌｉｎ）を用いて外来ペプチドの発現を試みたところ、小さなペプチドの場合にのみ成功的に発現された［Ｈｅｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８５：１１５－１２４（１９８９）］。
【0017】
最近、上記のようなグラム陰性細菌の表面タンパク質による表面発現の試みの他に、グラム陽性細菌の表面タンパク質を用いた表面発現が試みられた［Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：１４７０－１４７６（１９９５）］。この場合にも、細胞内膜を通過できる分泌シグナルと細胞膜に付着される表面発現母体を必要とする。実際に、スタフィロコッカス・ヒイカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）由来のリパーゼを分泌シグナルとして用い、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡを膜付着母体として用いて８０個のアミノ酸からなるマラリア抗原（ｍａｌａｒｉａ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ）とストレプスコッカスタンパク質Ｇ由来のアルブミン付着タンパク質を効果的にグラム陽性細菌の表面に発現したケースがある。
【0018】
上記のグラム陰性および陽性細菌の表面発現に関する研究を通じて、多くの有用なタンパク質発現システムが開発されてアメリカ、ヨーロッパと日本国などにおいて出願されている。中でも、特に、グラム陰性細菌の細胞外膜タンパク質を用いた場合が５件（ＷＯ９５０４０６９、ＷＯ９３２４６３６、ＷＯ９３１０２１４、ＥＰ６０３６７２、ＵＳ５３５６７９７）報告され、細胞表面器官である線毛（ｐｉｌｉ）を用いた場合が１件（ＷＯ９４１０３３０）報告され、かつ、細胞表面リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた場合も１件（ＷＯ９５０４０７９）報告された。
【0019】
以上述べたように、細菌の細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を細胞の表面に発現するためには、適当な細胞外膜タンパク質と外来タンパク質を遺伝子のレベルで互いに連結して融合タンパク質が生合成されるように誘導し、これらが安定的に細胞内膜を通過して細胞外膜に付着されて保たれるようにしなければならない。しかしながら、上記の条件をいずれも満たす表面発現母体は未だ開発されていないのが現状であり、現在までは上記の場合の欠点を補うレベルに留まっている。
【0020】
一方、本発明者らは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ）属菌株由来のポリガンマグルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新規な表面発現母体として活用して、外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現する新規なベクターと前記ベクターで形質転換された微生物の表面に目的タンパク質を発現する方法を開発したことがある（大韓民国特許登録第０４６９８００号）。
【0021】
そこで、本発明者らは、前記特許に記載されている表面発現母体を用いて抗原または抗原決定期を乳酸菌において安定的に高発現し得るベクターが開発されれば、抗原が乳酸菌の表面に露出されるので生体との馴染みがよく、効率よく免疫反応を誘導し得るワクチンの製造が可能であると判断し、目的タンパク質を乳酸菌において高発現し得るプロモーターを選別する過程を行った結果、既存より用いられてきたプロモーターに比べて、ガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーターを用いる場合に、遺伝子の発現が向上することを確認し、さらに、バチルス属菌株由来のポリガンマグルタミン酸の合成遺伝子（ｐｇｓＡ）を新規な表面発現母体として活用することについて鋭意検討し且つ研究したところ、ｐｇｓＡ遺伝子を用いて、外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現する新規なベクター、および微生物の表面に外来タンパク質を多量に発現する方法を開発して本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0022】
本発明の主たる目的は、目的遺伝子の発現の上昇を誘導するラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来プロモーターを提供するところにある。
【0023】
本発明の他の目的は、前記プロモーターおよび目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されていることを特徴とする発現ベクターを提供するところにある。
【0024】
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された微生物および前記形質転換された微生物を用いた目的タンパク質の製造方法を提供するところにある。
【0025】
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換された微生物を用いて微生物ワクチンを製造する方法を提供するところにある。
【0026】
本発明のさらに他の目的は、微生物の表面に外来タンパク質を大量に発現し得る表面発現母体としてバチルス属菌株に由来したポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択し、これを用いて、外来タンパク質やペプチドを微生物の表面に発現し得る目的タンパク質の表面発現ベクターを製造し、これにより形質転換された様々な形質転換体において外来タンパク質を効率よく形質転換体の表面に発現する方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【0027】
前記目的を達成するために、本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーターを提供する。
【0028】
本発明において、前記プロモーターは、配列番号１で示されることを特徴としてもよい。
【0029】
本発明は、また、前記プロモーターの末端に目的遺伝子が連結されていることを特徴とする発現ベクターおよび前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。
【0030】
本発明は、さらに、前記プロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子および目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されている微生物表面発現ベクターおよび前記表面発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。
【0031】
本発明において、前記目的タンパク質は、抗原であることを特徴としてもよい。具体的に、目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質もしくはその一部分、抗体もしくはその一部分、一本鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子および植物生体防御誘導タンパク質よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴としてもよい。
【0032】
本発明において、前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子は、ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢおよびｐｇｓＣのうちの少なくともいずれか一種であることを特徴としてもよい。
【0033】
本発明は、また、前記形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的タンパク質を微生物の表面に発現する方法を提供する。
【0034】
本発明は、さらに、（ａ）前記微生物表面発現ベクターで形質転換された微生物を培養して微生物の表面に抗原を表面発現するステップ；及び（ｂ）前記抗原が表面発現された微生物を回収するステップ；を含む微生物ワクチンの製造方法を提供する。
【0035】
前記目的を達成するために、本発明は、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡと目的タンパク質をコードする遺伝子を含む目的タンパク質の表面発現ベクターを提供する。
【0036】
本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＡは、ポリガンマグルタミン酸を産生するバチルス属菌株に由来したことを特徴としてもよい。
【0037】
本発明において、前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１８～２２および２９～３１のうちのいずれか一つの塩基配列を有することを特徴としてもよい。好ましくは、前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１８～２１および２９～３１のうちのいずれか一つの塩基配列を有することを特徴としてもよい。
【0038】
本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＡの末端部位にリンカーが挿入されており、前記挿入されたリンカーに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としてもよい。
【0039】
本発明において、前記目的タンパク質は、表面発現に有利であるように目的タンパク質のアミノ酸配列のうちの一部分が除去されたり位置特異的に突然変異されたりしたものであることを特徴としてもよい。
【0040】
本発明は、また、前記表面発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。本発明において、形質転換に用いられた微生物は、目的タンパク質の細胞表面発現に有利であるように、発現された目的タンパク質を分解することに関わる細胞内または細胞外のタンパク質分解酵素を産生できないように変形されたものであることを特徴としてもよい。
【0041】
本発明において、前記微生物は、乳酸菌であることを特徴としてもよい。本発明において、前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ストレプスコッカス属およびビフィドバクテリウム属を含んでいてもよい。代表的に、ラクトバチルス属は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｅｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニーＬＪＩ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＬＪＩ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）およびラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）；ストレプスコッカス属は、ストレプスコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；ビフィドバクテリウム属は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂ．ｐｓｕｅｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．・ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢｂ－１２（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－１２）およびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）などを宿主として用いることができ、さらに好ましくは、ラクトバチルス属である。
【0042】
本発明は、また、前記形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞の表面に発現するステップおよび目的タンパク質が表面に発現された細胞を回収するステップを含む目的タンパク質の細胞表面発現方法を提供する。
【0043】
本発明において、目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質もしくはその一部分、抗体もしくはその一部分、一本鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子および植物生体防御誘導タンパク質よりなる群から選ばれるいずれか一種であることを特徴としてもよい。
【0044】
本発明は、さらに、前記方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与して体液性免疫または細胞性免疫を誘導することを特徴とする方法を提供する。
【0045】
本発明は、さらにまた、前記方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与して免疫反応を誘導し、前記免疫反応により生成された抗体を回収することを特徴とする脊椎動物から抗体を製造する方法を提供する。
【0046】
本発明は、さらにまた、前記ベクターは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に適用されることを特徴とする目的タンパク質の表面発現ベクターを提供する。
【0047】
本発明は、さらにまた、（ａ）微生物表面発現用ベクターに目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入して組換えベクターを製造するステップ；（ｂ）前記組換えベクターでグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞を形質転換するステップ；及び（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して目的タンパク質を宿主細胞の表面に発現するステップ；を含むことを特徴とするグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の表面に目的タンパク質を発現する方法を提供する。
【発明の効果】
【0048】
本発明は、目的タンパク質を乳酸菌において高発現し得るラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来のガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）・プロモーターおよび前記プロモーターを用いた発現用ベクターを提供することができるという効果がある。前記ベクターは、目的タンパク質を表面発現する遺伝子を含有しているので、前記ベクターを用いた形質転換体においては目的タンパク質を効果的に菌体の表面に発現することができて乳酸菌をワクチン伝達体として活用することができる。
【0049】
また、本発明に係る目的タンパク質の表面発現ベクターは、目的タンパク質を安定的に発現することができ、本発明に係る表面発現ベクターは、目的タンパク質を常時的に発現しながら、これと同時に、組換え微生物に表面発現して必要とするワクチン製造用抗原の製作などに好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】本発明のガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）・プロモーターを得る方法を示すものである。
【図2】本発明のガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）・プロモーターを用いて構築された表面発現用ベクターの遺伝子地図を示すものである。
【図3】本発明の発現ベクターで形質転換した乳酸菌と比較して各プロモーター間の目的タンパク質の発現の度合いを、ウェスタンブロッティングを用いて示すものである。
【図4】共焦点蛍光顕微鏡を用いて本発明の発現ベクターにより目的タンパク質が微生物の表面に発現されることを確認したものである。
【図5】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図6】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－６０ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図7】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ２）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－７０ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図8】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ３）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－８０ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図9】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ4）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１００ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図10】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ５）、ｐＫＶ－ＰｇｓＡ １－１８８ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図11】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ６）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－６０ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図12】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ７）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－７０ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図13】本発明によるラクトバチルス・カゼイを宿主とする表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８）、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－１００ ａ．ａ －ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。
【図14】本発明の表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８で形質転換したラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰタンパク質の表面発現を示すウェスタンブロッティング写真を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【0051】
実施例２：ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを用いたＥＧＦＰタンパク質表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）の構築
ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターにより発現誘導されるＥＧＦＰタンパク質の発現ベクターを製造するために、大腸菌およびラクトバチルス・カゼイから複製可能なＲｅｐＥを複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）として有するベクターにラクトバチルス・カゼイ由来のガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを挿入した後、前記プロモーターのダウンストリームにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ）由来の表面発現母体であるｐｇｓＡを導入し、ｐｇｓＡのカルボキシ末端に目的遺伝子を挿入し得るＢａｍＨＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを追加してガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを含むｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターを製造した。前記ｐｇｓＡ遺伝子としては、大韓民国特許登録第０４６９８００号に開示されているものを用いた。
ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターにより発現誘導されるＥＧＦＰタンパク質の発現ベクターを製造するために、大腸菌およびラクトバチルス・カゼイから複製可能なＲｅｐＥを複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）として有するベクターにラクトバチルス・カゼイ由来のガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを挿入した後、前記プロモーターのダウンストリームにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ）由来の表面発現母体であるｐｇｓＡを導入し、ｐｇｓＡのカルボキシ末端に目的遺伝子を挿入し得るＢａｍＨＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを追加してガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを含むｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターを製造した。前記ｐｇｓＡ遺伝子としては、大韓民国特許登録第０４６９８００号に開示されているものを用いた。
【0052】
ＥＧＦＰ遺伝子は、合成ＥＧＦＰ遺伝子断片を鋳型として用い、かつ、配列番号４と配列番号５をプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った後に得た。
【0053】
配列番号４：
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
【0054】
配列番号５：
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
【0055】
その結果、５’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでおり、３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位を含んでいるＤＮＡ切片を確保した。ＥＧＦＰ遺伝子を含んでいる７５５ｂｐの確保されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断してｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターのｐｇｓＡＣ末端に連結することにより、乳酸菌宿主に形質転換した場合、ＥＧＦＰタンパク質を菌体の外部に表面発現できる発現ベクターｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰを完成した（図２）。
【発明を実施するための形態】
【0056】
本発明は、ある観点からみて、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーターに関するものである。
【0057】
本発明においては、ガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーターを得るために、ＰＣＲ方法を用いてラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）のゲノムから増幅し、遺伝子クローニング技術を用いてラクトバチルス・カゼイ由来７００ｂｐのプロモーター（配列番号１）を分離した。本発明のガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターは、ラクトバチルス・カゼイに存在するガラクトース・ムタロターゼ遺伝子の発現を誘導するプロモーターである。一般に、プロモーターは、ＲＮＡ（リボ核酸）重合酵素が結合して転写の開始を誘導する部分を含み、プロモーターの塩基配列に応じてＲＮＡの合成の度合いが決定されるため、プロモーターに応じて遺伝子の発現強度が異なる可能性がある。
【0058】
本発明のプロモーターによる発現誘導能力を測定するために、前記プロモーターを含む発現ベクターと既存のアルドラーゼ（ａｌｄｏｌａｓｅ）プロモーターを含む発現ベクターにそれぞれＥＧＦＰ遺伝子を挿入し、前記製作されたベクターを用いてラクトバチルス・カゼイを形質転換した後、各プロモーターにより発現誘導されたＥＧＦＰの発現の度合いをウエスタンブロッティングを用いて比較した。その結果、ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）・プロモーターを含むベクターの形質転換体においてＥＧＦＰの発現の度合いが効果的に増加したことが確認され、本発明のプロモーターの発現誘導の強度もまた既存のアルドラーゼ・プロモーターに比べて強いということを確認した。
【0059】
本発明は、他の観点からみて、前記ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび前記発現ベクターで形質転換された微生物に関するものである。
【0060】
発現ベクターは、通常、転写を可能にするプロモーター、プロモーターのダウンストリームに目的タンパク質を発現する遺伝子、微生物内において自己複製して増幅できる遺伝子および目的とするベクターを選別するための選択マーカー遺伝子が最小限に必要であり、目的遺伝子を除いた前記遺伝子は、ベクターのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）および選択された宿主に応じて異なってくることがある。ベクターの製作に当たって前記最小限に必要な遺伝子は当業者には広く知られており、遺伝子の発現条件および目的に応じて容易に選択することができる。通常、前記ベクターのバックボーンとしては、ｐＷＶ０１、ｐＡＭβ１の複製原点を有するものなどを用いることができ、これに限定されたことはない。
【0061】
目的遺伝子だけではなく、さらに調節部位を含む遺伝子の発現を目的とするベクターまたはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列を適切な宿主細胞に挿入するために様々な方法および手段を用いてもよい。例えば、トランスフォーメーション（形質転換）、トランスフェクション（形質移入）、接合（コンジュゲーション）、原形質体融合法およびカルシウム・フォスフェート沈殿法などの生化学的方法や、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ：ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｈｔｙｌ）デキストラン、またはエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）などの物理的な方法を用いてもよい。
【0062】
発現ベクターを適切な宿主細胞に挿入した後、当業界において知られている通常の技術を用いて形質転換体のみを選別できる抗生物質を含む宿主の生長に適した選択培地を用いて目的遺伝子を発現できるベクターを含有する形質転換体を選別してもよい。
【0063】
本発明は、さらに他の観点からみて、前記ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子および目的タンパク質をコードする遺伝子が連結されている微生物表面発現ベクターおよび前記表面発現ベクターで形質転換された微生物に関するものである。
【0064】
前記プロモーターのダウンストリームには表面発現母体であるポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体の遺伝子が含まれるが、前記表面発現母体は、ベクターのＤＮＡ配列上においてプロモーターと目的遺伝子との間に位置する。前記表面発現母体の遺伝子は、アミノ酸でコードされた後には、目的タンパク質の前半部に連結されて発現されたタンパク質が細胞膜の脂質と結合するように誘導する作用をするため、目的タンパク質が表面発現される上で決定的な役割を果たす。前記表面発現母体の遺伝子をプロモーターおよび目的遺伝子と連結する方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、制限酵素切断（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）およびライゲーション法（ｌｉｇａｔｉｏｎ）など当業者により容易に実施できる通常の技術が挙げられる。
【0065】
この明細書において、「宿主」、または「微生物」とは、プロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）のグラム陽性菌である乳酸菌のことをいい、一般的なプロバイオティック微生物の選別基準には、（ｉ）ヒト由来の微生物であること；（ｉｉ）胆汁、酸、酵素および酸素に安定的であること；（ｉｉｉ）腸内粘膜に付着する能力があること；（ｉｖ）消化器官内においてコロニーを形成できる能力があること；（ｖ）抗バクテリア性物質を産生できること；および（ｖｉ）効能や安定性が証明できることなどの条件が含まれている。前記条件を根拠として、乳酸菌は、人体内における成長が親和的であり、しかも、無害な菌であることが明らかである。したがって、乳酸菌を宿主とする形質転換体を人体に適用して疾病の予防または治療のための遺伝子の伝達またはタンパク質の伝達などの用途に用いる場合、菌株を用いる通常のワクチンの製造方法とは異なり、菌株の非毒性化または無毒性化の段階が求められない。
【0066】
本発明において、前記微生物は、ラクトバチルス属、ストレプスコッカス属およびビフィドバクテリウム属を含んでいてもよい。代表的に、ラクトバチルス属は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｅｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニーＬＪＩ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＬＪＩ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）およびラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）；ストレプスコッカス属は、ストレプスコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；ビフィドバクテリウム属は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂ．ｐｓｕｅｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢｂ－１２（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－１２）およびビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）などを宿主として用いることができ、さらに好ましくは、ラクトバチルス属である。
【0067】
本発明においては、前記プロモーターと表面発現母体であるｐｇｓＡとが連結された塩基配列を含み、目的遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子を発現できる発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を製作し、前記発現ベクターをラクトバチルス・カゼイに挿入してＥＧＦＰを発現する形質転換体を製造した。
【0068】
本発明の向上した遺伝子発現能力を有するプロモーターによって発現される目的タンパク質は、菌体の表面に発現され、したがって、本発明の形質転換された微生物は、ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）として用いることができる。
【0069】
本発明は、さらに他の観点からみて、前記表面発現ベクターで形質転換された乳酸菌を用いることを特徴とする微生物ワクチンの製造方法に関するものである。
【0070】
ワクチンは、疾病に対する予防の目的で生有機物を用いて免疫システムを刺激するのに用いられる薬剤である。免疫活性化とは、有機体内において抗体の生成、Ｔ－リンパ球の刺激、または他の免疫細胞（例えば、大食細胞）を刺激して抗原を効率よく除去するための過程のことをいう。上記に関する詳しい免疫学の概観は、当業界における通常の技術を有する者にとって容易に理解される（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８３）。
【0071】
抗原としての目的タンパク質を発現する形質転換された微生物ワクチンの投与の対象は哺乳動物であってもよく、さらに好ましくは、ヒトであってもよい。
【0072】
前記ワクチン組成物の製法は、標準技法を用いたものであってもよく、投与者に適した投与量は、遺伝子生成物の抗原性に応じて変わり、存在するワクチンの典型的な免疫反応を誘導するのに十分な量であればよく、日常的な実験過程を経て必要量を容易に判断することができる。典型的な初期のワクチンの容量は、体重１ｋｇ当たりに抗原０．００１～１ｍｇであり、好適なレベルの保護を提供するために、必要に応じて、量を増やしたり多重容量を用いたりする。上記の量は、当該技術分野に属する専門家により決定可能であり、製剤化方法、投与方式、投与者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によっても様々に処方可能である。
【0073】
ワクチンが抗体を生成するに当たって効果的であるためには、抗原性物質がワクチン処理の施された対象の抗体生成機序が実現できるように体内に取り込まれなければならない。したがって、免疫反応のためには、遺伝子産物の微生物運搬体が体内に先に取り込まれなければならない。本発明の形質転換体において提示される抗原による好適な反応を刺激するためには、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などの投与方法が採用可能であるが、経口投与、胃挿入により、または噴霧剤の形態で腸または肺に直接的に投与することが好ましい。
【0074】
ワクチン組成物を投与者に経口投与するためには、親液性の形態、例えば、カプセルの形態で提供されることが有用である。前記カプセルは、Ｅｕｄｒａｇａｔｅ Ｓ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇａｔｅ Ｌ（登録商標）、セルロースアセテート、セルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶被覆として提供される。前記カプセル類は、それ自体で用いてもよく、投与する前に懸濁液のように親液性物質を再組成して用いてもよい。再組成は、形質転換された微生物の生存に適したｐＨの緩衝液において行うことが効果的である。胃酸から前記形質転換された微生物およびワクチンを保護するために、毎回、ワクチンの投与前に重炭酸ナトリウム製剤を投与することが有用である場合がある。選択的に、ワクチンは、非経口投与、鼻内投与または乳腺内投与用に製造されてもよい。
【0075】
本発明のプロモーターを含み、抗原として作用できる目的タンパク質を発現する遺伝子を含有している形質転換された乳酸菌は、消化器官内の粘膜においてコロニーを形成しながら目的とする効能が得られるようにし、上記の乳酸菌が目的とする形質転換性質を保ち、円滑なコロニーの形成のためにベクター内の選択抗生物質を同時に投与してもよく、上記の手段をもって、形質転換体が分裂する過程にいて派生され得るベクターを有さない目的としない乳酸菌の発生を制御することができる。上記の選別方法は、当業界における通常の技術により容易に行われることができ、前記過程において使用できる選択抗生物質は、発現ベクター内に含まれている抗生物質遺伝子に応じて異なってくることがある。
【0076】
また、下記の実施例５において製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を用いて乳酸菌宿主においてさらに安定的に高い発現率を示せるように、ＰｇｓＡの遺伝子を断片とする改良を行った。
【0077】
まず、ＰｇｓＡ断片のうち、１－６０ ａ．ａ、１－７０ ａ．ａ、１－８０ ａ．ａ、１－１００ ａ．ａ、１－１８８ ａ．ａを含むＰｇｓＡ断片を確保するために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型として用い、かつ、配列番号８～１７のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。
【0078】
その結果、アルドラーゼ・プロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片を含むＤＮＡ切片を確保した。なお、前記切片の５’末端にはＳｐｈＩ制限酵素が含まれており、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。確保されたＤＮＡ切片にＳｐｈＩとＢａｍＨＩを処理して切片を確保した。なお、それぞれのＰｇｓＡ１～Ａ５ ｍｏｔｉｆ断片が配列番号１８～２２の塩基配列を有することを確認した。
【0079】
一方、ＰｇｓＡ断片のうち、２５－６０ ａ．ａ、２５－７０ ａ．ａ、２５－１００ ａ．ａを含むＰｇｓＡ断片を確保するために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型として用い、かつ、配列番号２３～２８のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。
【0080】
その結果、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片を含むＤＮＡ切片を確保した。なお、前記切片の５’末端にはＥｃｏＲＶ制限酵素が含まれており、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。確保されたＤＮＡ切片にＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩを処理して切片を確保した。なお、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片が配列番号２９～３１の塩基配列を有することを確認した。
【0081】
本発明は、微生物の表面に外来タンパク質を大量に発現できる新規な表面発現母体としてバチルス属菌株に由来したポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択し、これを用いて外来タンパク質やペプチドを微生物の表面に発現できる表面発現ベクターを製造し、これにより形質転換された様々な形質転換体において外来タンパク質を効率よく形質転換体の表面に発現する方法を提供することを目的とする。
【0082】
前記目的を達成するために、本発明は、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をなす遺伝子ｐｇｓＡを含む微生物表面発現ベクターおよび前記ベクターにより形質転換された菌株を提供する。
【0083】
本発明は、また、前記目的を達成するために、前記微生物表面発現ベクターを用いて外来タンパク質を形質転換菌株の表面に発現する方法を提供する。
【0084】
遺伝子ｐｇｓＡがコードするタンパク質は、バチルス属に存在する細胞外膜タンパク質であって、バチルスサブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３６；納豆菌；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，２６３，６－１２，１９９９）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ９９４５；Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．５７（４），４３０－４３７，１９９８）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１，７２２－７３０，１９８９）などから産生される食用、水溶性、陰イオン性、生分解性高分子物質であるポリガンマグルタミン酸の合成に関与するタンパク質である。
【0085】
納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３６）の場合、細菌から分離された細胞外膜タンパク質は、合計で９２２個のアミノ酸からなるタンパク質であって、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣおよびｐｇｓＡからなっており、ｐｇｓＢは３９３アミノ酸から、ｐｇｓＣは１４９アミノ酸から、そしてｐｇｓＡは３８０アミノ酸から構成されている。アシウチ（Ａｓｈｉｕｃｈｉ）らは、バチルス納豆菌由来のポリガンマグルタミン酸の合成遺伝子をクローニングし、大腸菌に形質転換して大腸菌におけるポリガンマグルタミン酸の合成を観察したことがある［Ａｓｈｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６３：６－１２（１９９９）］。
【0086】
しかしながら、前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体をなすタンパク質ｐｇｓＡの具体的な役割および機能については未だ判明されていない。但し、複合体構成タンパク質のうち、ｐｇｓＢは、アミドリガーゼ系であって、ｐｇｓＢのＮ－末端の特異アミノ酸が細胞膜もしくは細胞壁と相互作用をし、ｐｇｓＡの場合、Ｎ－末端とＣ－末端に親水性の特異アミノ酸配列を有していて、ｐｇｓＢの援助とともにこれらのアミノ酸配列が細胞内膜を通過できる分泌シグナルと標的および付着シグナルを有していると推察される。
【0087】
本発明者らの研究の結果、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、そのアミノ酸一次配列の構造と特性からみて、外来タンパク質を細胞の表面に発現する表面発現母体として多くの利点を有していることが判明された：第一に、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、ポリガンマグルタミン酸の合成および細胞外への分泌のために細胞の表面に多量に発現でき、第二に、発現されたポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、細胞周期からみて、休止期においても安定的に保たれ、第三に、構造的に、特に、ｐｇｓＡの場合、細胞の表面に突出されており、第四には、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質はその起源がグラム陽性細菌の表面であって、様々なグラム陽性細菌だけではなく、グラム陰性細菌の表面において安定的に発現できるなどの利点がある。
【0088】
本発明は、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の特性を用いて外来タンパク質を細菌の表面に発現できる有用なベクターを提供するところにその目的がある。特に、本発明の目的タンパク質の表面発現ベクターは、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の一次配列の上に有している分泌シグナルと標的シグナルを含む。
【0089】
また、本発明は、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の特性を用いた表面発現ベクターを用いて外来タンパク質を微生物の表面に発現する方法を提供するところにその目的がある。特に、本発明は、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を用いて外来タンパク質を微生物の表面に発現することにより、細胞の破砕またはタンパク質の分離精製過程を経ずとも効率よく外来タンパク質を利用できる外来タンパク質の製造方法を提供する。
【0090】
さらに、本発明において、前記「目的タンパク質」または「外来タンパク質」とは、前記タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞においては正常的に存在し得ないタンパク質のことをいう。例えば、乳酸菌においてウィルス由来または腫瘍由来タンパク質を人為的に発現するように操作した場合、前記タンパク質を外来タンパク質または目的タンパク質と名付ける。
【0091】
より具体的に、前記目的タンパク質は、好ましくは、感染性微生物、免疫疾患由来抗原または腫瘍由来の抗原、例えば、真菌性病原体、バクテリア、寄生虫、腸内寄生虫（ｈｅｌｍｉｎｔｈ）、ウィルスまたはアレルギー誘発物質などを含んでいてもよく、これらに何ら限定されない。さらに詳しくは、前記抗原は、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）、インフルエンザウィルスの赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）または核タンパク質、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ）、ＨＩＶのｇｐ１２０またはその断片、ＨＩＶのｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、インスリンペプチドＢ、ばれいしょ粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）抗原、ビブリオース（Ｖｉｂｒｉｏｓｅ）抗原、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）抗原、ニューモコッカス抗原（Ｐｍｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ：Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）抗原、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）外膜タンパク質、ストレプスコッカス・ニューモニエ（肺炎レンサ球菌）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のピリン（ｐｉｌｉｎ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のピリン（ｐｉｌｉｎ）、黒色腫関連抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ－１、ＨＳＰ－７０、ｂｅｔａ－ＨＣＧ）、ＨＰＶ－１６、－１８、－３１、－－３５、または－４５に由来するＥ１、Ｅ２、Ｅ６およびＥ７を含むヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍｍａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＣＥＡ腫瘍抗原、正常または変異型ｒａｓタンパク質、正常または変異型ｐ５３、Ｍｕｃ１、ｐＳＡなどを含み、かつ、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、脳炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ポリオ、狂犬病、風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）、破傷風、結核、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、免疫反応誘発物質（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、アレルギー誘発物質（ａｌｌｅｒｇｅｎ）、固形腫瘍および血液担持腫瘍を含む癌、後天性免疫不全症候群、腎臓移植、心臓移植、膵臓移植、肺移植、骨移植、および肝臓移植などの移植拒絶反応のときに関与する因子などに由来する当業界において知られている抗原および自己免疫を誘発する抗原などを含んでいてもよい。
【0092】
したがって、本発明の表面発現方法により産生された外来タンパク質を様々な用途に供することができる。この用途には、抗体および酵素の効果的な産生があり、これらの他にも、抗原、付着または吸着タンパク質および新規な生理活性物質をスクリーニングするためのペプチドライブラリーの産生などが含まれる。
【0093】
バチルス属菌株に由来したポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質をはじめとするあらゆる種類のポリガンマグルタミン酸の合成に関与する遺伝子を用いた表面発現ベクターは、いずれも本発明の範囲に含まれる。
【0094】
また、本発明のポリガンマグルタミン酸の合成遺伝子を用いた表面発現ベクターは、外来タンパク質を微生物の表面に発現するためにあらゆる菌株に適用することができ、好ましくは、グラム陰性細菌、さらに好ましくは、大腸菌、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、ビブリオ・コレラ（コレラ菌）、マイコバクテリウム・ボビス（ウシ型結核菌）、赤痢菌、およびグラム陽性細菌、好ましくは、バチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、スタフィロコッカス（ブドウ球菌）、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス（レンサ球菌）菌株などに適用することができる。前記菌株を用いたあらゆる外来タンパク質の製造方法は、本発明の範囲に含まれる。
【0095】
必要に応じて、ポリガンマグルタミン酸の合成遺伝子のＮ－末端もしくはＣ－末端に全部または一部の制限酵素の様々な認識部位を挿入してもよく、これらの制限酵素部位が挿入された表面発現ベクターは、いずれも本発明の範囲に含まれる。
【0096】
具体的に、本発明は、バチルス属菌株に由来したポリガンマグルタミン酸合成遺伝子であるｐｇｓＡを含み、ｐｇｓＡのＣ－末端に制限酵素認識部位を挿入して様々な外来タンパク質遺伝子を手軽にクローニングできる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８を提供する。
【0097】
本発明は、ポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の複合体のうち、細胞外膜タンパク質の複合体であるｐｇｓＡから構成されてｐｇｓＡのＣ－末端にＥＧＦＰタンパク質のＮ－末端を連結して、ＥＧＦＰタンパク質を融合タンパク質の形態でグラム陽性菌の表面に発現し得る表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８を提供する。
【0098】
特に、一実施形態によれば、バチルス・サブチルス・チョンクッジャン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ，ＫＣＴＣ０６９７ＢＰ）からポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の遺伝子ｐｇｓＡを取得したが、遺伝子は、ポリガンマグルタミン酸を産生するあらゆるバチルス属菌株からｐｇｓＡを取得してベクターを製造したり、外来タンパク質を表面発現したりすることも本発明の範囲に含まれる筈である。例えば、バチルス・サブチルス・チョンクッジャンに存在するｐｇｓＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株由来のｐｇｓＡ遺伝子を用いてベクターを製造したり、外来タンパク質を表面発現したりすることも本発明の範囲に含まれる筈である。
【0099】
本発明の別の実施形態によれば、タンパク質が効率よく大腸菌細胞の表面に発現されるかどうかを調べるために強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）をモデルタンパク質として選択して確認した。「ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；強化緑色蛍光タンパク質）遺伝子」は、生体内において緑色の光を発光して当該タンパク質を発現する細胞を容易に観察できるようにする遺伝子であって、蛍光顕微鏡で観察が可能であるという利点がある。ＧＦＰは、クラゲ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ：Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）から起源する緑色蛍光タンパク質であって、色々な研究分野において遺伝子発現の重要なマーカーとして用いられている。ＥＧＦＰは、ＧＦＰの突然変異体であって、そもそもＧＦＰの６４番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）アミノ酸配列をロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）に、かつ、６５番目に位置しているセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）アミノ酸配列はトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）に置き換えることにより、本来のＧＦＰよりもさらに強い蛍光シグナルを発光するという利点がある。
【0100】
本発明者らは、前記製作されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８組換えベクターにＥＧＦＰ遺伝子を挿入して表面発現ベクターを製作し、これを用いてラクトバチルス・カゼイを形質転換した後、培養して発現を誘導し、培養液を一定量採取してタンパク質を得た。得た前記タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて分析し、抗ＥＧＦＰ抗体を用いてウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った結果、前記製作されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８組換えベクターにタンパク質ＥＧＦＰが成功的に挿入されて細胞の表面に発現されたことを確認した。
【0101】
また、前記実施形態においては、ＥＧＦＰタンパク質を外来タンパク質として用いたが、その他の酵素、抗原、抗体、付着タンパク質または吸着タンパク質などいかなるタンパク質もまた外来タンパク質になり得るということはいうまでもない。
【0102】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【0103】
特に、下記の実施例においては、表面発現ベクターを製作するためのモティフとしてｐｇｓＡ遺伝子を用いたが、この他にも、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣまたはこれらの組み合わせを用いた場合にも同様の結果が得られるということはこの出願人の先行特許（ＷＯ２００３／０１４３６０）から確認されたように、当業者にとって自明であるといえる。
【0104】
また、下記の実施例においては、グラム陽性菌に適用される表面発現ベクターを製造し、宿主細胞としてラクトバチルス・カゼイを用いたが、ラクトバチルス・カゼイ以外のいかなるグラム陽性菌もまた宿主細胞として活用することができ、グラム陽性菌の他にいかなるグラム陰性菌およびその他の細菌で形質転換することもまた当業者にとって自明であるといえる。
【0105】
実施例１：ラクトバチルス・カゼイ由来ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターの確保
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）のゲノムからガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーター部位に相当する７００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ方法を用いて確保した。
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）のゲノムからガラクトース・ムタロターゼ遺伝子のプロモーター部位に相当する７００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ方法を用いて確保した。
【0106】
ラクトバチルス・カゼイは、基本培地であるＭＲＳ培地（１％カゼイン加水分解物、１．５％酵母エキス、２％デキストロース、０．２％クエン酸アンモニウム、０．５％酢酸ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．０５％硫酸マンガンおよび０．２％リン酸二カリウム、アキュメディア・マニュファクチャラース社製）において培養し、培養されたラクトバチルス１ｘ１０9個の菌体を破砕して得られた溶液をＰＣＲの鋳型として用いた。
【0107】
遺伝子のクローニングの際にベクター内への挿入が容易になるようにＳｐｈＩとＸｈｏＩの切断部位がプライマー（配列番号２および配列番号３）の各末端に位置するように製作し、上記のプライマーを用いてＰＣＲを行った結果、総長さが７００ｂｐ（配列番号１）の増幅産物を確保し、ＰＣＲ増幅産物は、ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（米プロメガ社製）にクローニングして塩基配列を分析した（図１）。
【0108】
配列番号２：
５’－ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＧＡＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＧＡＴ－３’
【0109】
配列番号３：
５’－ＴＡＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＡＴＡＧ－３’
５’－ＴＡＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＣＣＴＡＡＴＡＧ－３’
【0110】
実施例２：ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを用いたＥＧＦＰタンパク質表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）の構築
ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターにより発現誘導されるＥＧＦＰタンパク質の発現ベクターを製造するために、大腸菌およびラクトバチルス・カゼイから複製可能なＲｅｐＥを複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）として有するベクターにラクトバチルス・カゼイ由来のガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを挿入した後、前記プロモーターのダウンストリームにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ）由来の表面発現母体であるｐｇｓＡを導入し、ｐｇｓＡのカルボキシ末端に目的遺伝子を挿入し得るＢａｍＨＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを追加してガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを含むｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターを製造した。前記ｐｇｓＡ遺伝子としては、大韓民国特許登録第０４６９８００号に開示されているものを用いた。
ガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターにより発現誘導されるＥＧＦＰタンパク質の発現ベクターを製造するために、大腸菌およびラクトバチルス・カゼイから複製可能なＲｅｐＥを複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）として有するベクターにラクトバチルス・カゼイ由来のガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを挿入した後、前記プロモーターのダウンストリームにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ）由来の表面発現母体であるｐｇｓＡを導入し、ｐｇｓＡのカルボキシ末端に目的遺伝子を挿入し得るＢａｍＨＩ、ＸｂａＩの制限酵素サイトを追加してガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターを含むｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターを製造した。前記ｐｇｓＡ遺伝子としては、大韓民国特許登録第０４６９８００号に開示されているものを用いた。
【0111】
ＥＧＦＰ遺伝子は、合成ＥＧＦＰ遺伝子断片を鋳型として用い、かつ、配列番号４と配列番号５をプライマーとして用いてＰＣＲを行った後に得た。
【0112】
配列番号４：
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
【0113】
配列番号５：
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
【0114】
その結果、５’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれており、３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位が含まれているＤＮＡ切片を確保した。ＥＧＦＰ遺伝子を含んでいる７５５ｂｐの確保されたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断してｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡベクターのｐｇｓＡＣ末端に連結することにより、乳酸菌宿主に形質転換した場合、ＥＧＦＰタンパク質を菌体の外部に表面発現し得る発現ベクターｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰを完成した（図２）。
【0115】
実施例３：ウェスタンブロッティングを用いた目的タンパク質の発現有無および発現誘導強度の確認
この実施例においては、実施例２において製作されたｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ発現ベクターでラクトバチルス・カゼイを形質転換し、前記形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを培養してＥＧＦＰタンパク質の発現を確認した。
この実施例においては、実施例２において製作されたｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ発現ベクターでラクトバチルス・カゼイを形質転換し、前記形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを培養してＥＧＦＰタンパク質の発現を確認した。
【0116】
新規なガラクトース・ムタロターゼ・プロモーターの発現誘導の強度を既存のアルドラーゼ・プロモーターと比較して新規なプロモーターの発現誘導力を確認するために各プロモーターにはレポーター遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子を連結して発現ベクターを構築し、ラクトバチルス・カゼイにそれぞれ形質転換した。そして、ＥＧＦＰの発現量をウェスタンブロッティングを用いて比較した。
【0117】
まず、本発明の表面発現ベクターで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，米国ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、３０℃において静置培養してＥＧＦＰタンパク質の表面発現を誘導した。
【0118】
前記培養されたラクトバチルス・カゼイの全細胞に対して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）およびＥＧＦＰに対する特異抗体を用いたウェスタンブロッティングを行って前記融合タンパク質の発現を確認した。
【0119】
具体的に、発現が誘導された形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの全細胞を同じ細胞濃度で得たタンパク質で変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させて試料を用意し、これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、分画されたタンパク質を二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ：ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ－ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）メンブレンに移した。タンパク質の移されたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ），ｐＨ ８．０）において１時間ブロッキングした後、ＥＧＦＰに対する各ウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ：Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合されたウサギ由来抗体に対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１００００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、洗浄されたメンブレンに基質（Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＳ－３ ａｃｒｉｄａｎ，Ｈ2０2）を添加して約２分間発色させ、ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラでＥＧＦＰに対する特異抗体と前記融合タンパク質との間の特異的な結合を確認した。
【0120】
図３は、本発明の細胞表面発現ベクターで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの全細胞においてＥＧＦＰタンパク質の発現量を確認するためにウェスタンブロッティングを行った結果を示すものである。それぞれ、レーンＳＭは、タンパク質サイズマーカー、レーン１は、ラクトバチルス・カゼイ（空きベクター）、レーン２及び３は、ラクトバチルス・カゼイ（ｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）、レーン４は、ラクトバチルス・カゼイ（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）の発現を示す。
【0121】
目的タンパク質の発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ（レーン４）と比べて、本発明のｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ（レーン２および３）発現ベクターにおいて目的タンパク質の発現が確認されただけではなく、さらに優れた発現量を示すことを確認した。これは、本発明のガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）・プロモーターが発現ベクター内において目的タンパク質を安定的に発現し、アルドラーゼ（Ａｌｄｏａｌｓｅ）・プロモーターと比べてさらに強く発現することができるということを示唆する（図３）。
【0122】
実施例４：共焦点蛍光顕微鏡を用いた両目的タンパク質の微生物表面発現の確認
本発明の表面発現ベクターの発現の度合いを確認するために蛍光イメージを共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）を用いて観察した。
本発明の表面発現ベクターの発現の度合いを確認するために蛍光イメージを共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００）を用いて観察した。
【0123】
本発明の表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐｇｍ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ）で形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，米国ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、３０℃において静置培養してＥＧＦＰタンパク質の表面発現を誘導した。そして、ＥＧＦＰの特異抗体で結合した後、Ａｌｅｘａ４８８（ｇｒｅｅｎ）で免疫染色して共焦点顕微鏡でＥＧＦＰの細胞表面発現を確認した。
【0124】
その結果、図４に示すように、本発明の発現ベクターで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおいて安定的に蛍光が発現されることを確認することができた。
【0125】
したがって、本発明の発現ベクターは、乳酸菌への形質転換を通じて、通常のワクチンの製造方法とは異なり、菌株の非毒性化または無毒性化の段階が求められず、目的タンパク質をさらに強く発現するので、微生物ワクチンの製造に活用できることが期待される。
【0126】
実施例５：表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰの製造
前記ＥＧＦＰ発現ベクターを製造するために、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７（大韓民国登録特許第１０－１４７１０４３号参照）から製造された表面発現ベクターを用いて、ＰｇｓＡのＣ－末端にＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子を挿入して乳酸菌において表面発現できるベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰを確保した。
前記ＥＧＦＰ発現ベクターを製造するために、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７（大韓民国登録特許第１０－１４７１０４３号参照）から製造された表面発現ベクターを用いて、ＰｇｓＡのＣ－末端にＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子を挿入して乳酸菌において表面発現できるベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰを確保した。
【0127】
まず、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７ベクターからｐｇｓＡと融合されたＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子を除去し、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を挿入した。合成ＥＧＦＰ遺伝子断片を鋳型として用い、かつ、配列番号６と配列番号７をプライマーとして用いてＰＣＲを行って得た。
【0128】
配列番号６：
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
【0129】
配列番号７：
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
【0130】
その結果、ＥＧＦＰ遺伝子を含んでいる７５５ｂｐの切片を確保した。なお、前記切片の５’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれており、前記切片の３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位が含まれている。確保されたＤＮＡ切片にＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素を処理して切断して７４１ｂｐ切片を確保した。
【0131】
ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断してＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子部分を除去し、ベクター部分を確保した。
【0132】
ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断したＥ７遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を同じ制限酵素で切断したベクターと連結してｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰを完成した（図５）。
【0133】
実施例６：表面発現ベクターＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆの改良
この実施例においては、実施例５において製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を用いて乳酸菌宿主においてさらに安定的に高い発現率を示し得るようにＰｇｓＡの遺伝子を断片とする改良を行った。
この実施例においては、実施例５において製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を用いて乳酸菌宿主においてさらに安定的に高い発現率を示し得るようにＰｇｓＡの遺伝子を断片とする改良を行った。
【0134】
まず、ＰｇｓＡ断片のうち、１－６０ ａ．ａ、１－７０ ａ．ａ、１－８０ ａ．ａ、１－１００ ａ．ａ、１－１８８ ａ．ａを含むＰｇｓＡ断片を確保するために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型として用い、かつ、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。
【0135】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－６０ ａ．ａ
【0136】
配列番号８：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
【0137】
配列番号９：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’
【0138】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－７０ ａ．ａ
【0139】
配列番号１０：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
【0140】
配列番号１１：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
【0141】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－８０ ａ．ａ
【0142】
配列番号１２：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
【0143】
配列番号１３：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡ－３’
【0144】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１００ ａ．ａ
【0145】
配列番号１４：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
【0146】
配列番号１５：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
【0147】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１８８ ａ．ａ
【0148】
配列番号１６：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
【0149】
配列番号１７：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴ－３’
【0150】
その結果、アルドラーゼ・プロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片を含むＤＮＡ切片を確保した。なお、前記切片の５’末端にはＳｐｈＩ制限酵素が含まれており、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。確保されたＤＮＡ切片にＳｐｈＩとＢａｍＨＩを処理して切片を確保した。また、それぞれのＰｇｓＡ１～Ａ５ ｍｏｔｉｆ断片が以下のような塩基配列を有することを確認した。
【0151】
ＰｇｓＡ１－６０ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ１）
【0152】
配列番号１８：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’
【0153】
ＰｇｓＡ１－７０ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ２）
【0154】
配列番号１９：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’
【0155】
ＰｇｓＡ１－８０ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ３）
【0156】
配列番号２０：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡ－３’
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡ－３’
【0157】
ＰｇｓＡ１－１００ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ４）
【0158】
配列番号２１：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’
【0159】
ＰｇｓＡ１－１８８ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ５）
【0160】
配列番号２２：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣ－３’
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣ－３’
【0161】
前記ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰをＳｐｈＩとＢａｍＨＩで切断してアルドラーゼ・プロモーターとＰｇｓＡ遺伝子部分を除去したベクター部分を確保した。
【0162】
ＳｐｈＩとＢａｍＨＩで切断したアルドラーゼ・プロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を同じ制限酵素で切断したベクターと連結して改良されたベクターを完成した（図６から図１０）。
【0163】
一方、ＰｇｓＡ断片のうち、２５－６０ ａ．ａ、２５－７０ ａ．ａ、２５－１００ ａ．ａを含むＰｇｓＡ断片を確保するために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型として用い、かつ、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行って得た。
【0164】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－６０ ａ．ａ
【0165】
配列番号２３：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
【0166】
配列番号２４：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’
【0167】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－７０ ａ．ａ
【0168】
配列番号２５：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
【0169】
配列番号２６：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
【0170】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－１００ ａ．ａ
【0171】
配列番号２７：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
【0172】
配列番号２８：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
【0173】
その結果、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片を含むＤＮＡ切片を確保した。なお、前記切片の５’末端にはＥｃｏＲＶ制限酵素が含まれており、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。確保されたＤＮＡ切片にＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩを処理して切片を確保した。また、それぞれのＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片が以下のような塩基配列を有することを確認した。
【0174】
ＰｇｓＡ２５－６０ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ６）
【0175】
配列番号２９：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’
【0176】
ＰｇｓＡ２５－７０ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ７）
【0177】
配列番号３０：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’
【0178】
ＰｇｓＡ２５－１００ ａ．ａ断片配列（ＰｇｓＡ８）
【0179】
配列番号３１：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’
【0180】
ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰをＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断してＰｇｓＡ遺伝子部分を除去したベクター部分を確保した。
【0181】
【0182】
実施例７：ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ改良表面発現ベクター形質転換体の発現の確認
この実施例においては、実施例５において製作されたＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ改良表面発現ベクターでラクトバチルス・カゼイを形質転換し、前記形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを培養してＥＧＦＰタンパク質の発現を確認した。形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおいて改良された断片ｐｇｓＡ１～Ａ８のうちのいずれか一つと融合されたＥＧＦＰタンパク質の発現有無を調べた。
この実施例においては、実施例５において製作されたＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ改良表面発現ベクターでラクトバチルス・カゼイを形質転換し、前記形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを培養してＥＧＦＰタンパク質の発現を確認した。形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおいて改良された断片ｐｇｓＡ１～Ａ８のうちのいずれか一つと融合されたＥＧＦＰタンパク質の発現有無を調べた。
【0183】
ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片表面発現ベクターで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイをＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳ，米国ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー（ＢＤ）社製）、３０℃において静置培養してポリガンマグルタミン酸を合成する遺伝子断片ｐｇｓＡ１～Ａ８のうちのいずれか一つのＣ－末端と融合されたＥＧＦＰタンパク質の表面発現を誘導した。
【0184】
前記培養されたラクトバチルス・カゼイの全細胞に対して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）およびＥＧＦＰに対する特異抗体を用いたウェスタンブロッティングを行って前記融合タンパク質の発現を確認した。
【0185】
具体的に、発現が誘導された形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの全細胞を同じ細胞において得たタンパク質で変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）させて試料を用意し、これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分析した後、分画されたタンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ－ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）メンブレンに移した。タンパク質の移されたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）、ｐＨ ８.０）において１時間振とうしてブロッキングした後、ＥＧＦＰに対するウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、ＨＲＰが接合されたウサギに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１００００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、洗浄されたメンブレンに基質（ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＳ－３ ａｃｒｉｄａｎ，Ｈ2０2）を添加して約２分間発色させ、ＣＣＤカメラでＥＧＦＰに対する特異抗体と前記融合タンパク質との間の特異的な結合を確認した（図１４）。
【0186】
図１４は、本発明と比較して対照群として設定された未改良のｐｇｓＡが挿入されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ組換え発現ベクターに伴うラクトバチルス・カゼイにおける発現様相（レーン６および１１）および本発明に係る改良されたｐｇｓＡ１～Ａ８が挿入されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１～Ａ８組換え発現ベクターに伴うラクトバチルス・カゼイにおける発現様相（レーン１～５およびレーン７～１０）を示す。
【0187】
具体的に、図１４のレーン１は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－６０ ａ．ａにＥＧＦＰを発現した形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイであり、レーン２は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－７０ ａ．ａ、レーン３は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－８０ ａ．ａ、レーン４は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１００ ａ．ａにＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの発現である。レーン５は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１８８ ａ．ａにＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイのタンパク質の発現を示す。レーン６は、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイのタンパク質の発現を示す。
【0188】
また、図１４のレーン７は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－６０ ａ．ａにＥＧＦＰを発現した形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイであり、レーン８は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－７０ ａ．ａ、レーン９は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ ２５－１００ ａ．ａにＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの発現である。レーン１０は、ＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ １－１８８ ａ．ａにＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイのタンパク質の発現を示す。レーン１１は、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰが形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイのタンパク質の発現を示す。
【0189】
未改良のｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ表面発現ベクターによるＥＧＦＰ融合タンパク質の発現と比較すれば、改良されたＰｇｓＡ ｍｏｔｉｆ断片を含むＥＧＦＰ融合タンパク質がさらに強く発現されることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0190】
本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）由来ガラクトース・ムタロターゼ（ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｍｕｔａｒｏｔａｓｅ）遺伝子のプロモーターおよびバチルス属菌株由来のポリガンマグルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質（ｐｇｓＡ）を用いて外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現する新規なベクターに関するものであり、前記ベクターは、目的タンパク質を表面発現する遺伝子を含有しているので、前記ベクターを用いた形質転換体においては目的タンパク質を効果的に菌体の表面に発現することができて、乳酸菌をワクチン伝達体として活用することができ、かつ、目的タンパク質の表面発現ベクターは目的タンパク質を安定的に発現することができ、本発明に係る表面発現ベクターは、目的タンパク質を常時的に発現しながら、これと同時に、組換え微生物に表面発現して必要とするワクチン製造用抗原の製作などに好適に用いることができるという点で、産業上の利用可能性が存在する。
［配列目録フリーテキスト］
配列番号１
５’－ｔｔｇａａｔｔｇｇｔ ｔｔｃｔｔａｃｇａｔ ｇｇｔａａｇａｃｃａ ａｃｇａａａｃｔｇｇ ｔａｃａｇｃｔｇｃａ ｔｇｇｇｃｔａａａｇ ｃｔａａｇｃｃｔｇａ ａａａｇｇｔｃａｔｃ ａａｇａｔｃａｃｃａ ａｇｇａａｔｔｃａｇ ｃａａｇｃｃｇｃａａ ｔａｃａａｔｇｔｔｔ ｃｔｇｔｔｔｔｇａａ ｇｃｔｔｇａａｇｔｔ ｃｃａｇｔｔｇａｔｃ ａａａａｇｔｔｔｇｔ ｔｇａａｇｇｃｔａｃ ａｃｃｇａｔｇａｃｇ ｇｃｇｔｔａｃｃｃｃ ｔｇｔｔｔａｃａｇｃ ａａｇｇａａｇａａｇ ｃｃｇｃｔａａｇｔａ ｔｔａｃａａｇｇａａ ｃａｇｔｃａｇａｔｇ ｃａａｃｇｇａｔｃｔ ｃｃｃａｔｔｃａｔｃ ｔｔｃｃｔｇｔｃｃｇ ｃｔｇｇｔｇｔｃａｃ ｃａａｃｇａａｔｔｇ ｔｔｃｃｔｔｇａａｇ ａａｃｔｃａａｇｔｔ ｔｇｃｔａａｇｃａａ ｇｃａｇｇｔｔｃａｇ ｃｃｔｔｔａａｔｇｇ ｔｇｔｔｃｔｃｔｇｔ ｇｇｃｃｇｔｇｃａａ ｃｔｔｇｇａａｇｃｃ ｇｇｇｔｇｔｔａａｇ ｃｃａｔａｔｇｃｔｇ ｃｔｇａａｇｇｃｇａ ａｇｃｔｇｃｔｇｇｔ ａａｇａａｇｔｇｇｃ ｔｇｃａｇａｃｃｇａ ａｇｇｃａａｇｇｃｔ ａａｃａｔｔｇａｔｃ ｇｔｔｔｇａａｃａａ ｇｇｔｇｃｔｔｇｃａ ｇａａａｃｔｇｃａａ ｃｃｃｃｔｔｇｇａｃ ｔｇａｃａａａｇｔｔ ｇａａｇｇｔｔａａｔ ｃｔｔｔａａｃｃａｔ ａｇｔｔｇｃａａｇａ ａａｇｇａｃｃｇａｔ ｔａｔｇａｔｇａｔｃ ｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔ ｔｔａｔｇａｃｔｇｃ ｇｇａｃａｔｇｔｔｔ ｔｔｇｔｇａｃｃａｃ ｔｇｃａａａｃａｔｃ ａａａｔｇａａｇｔ ｔｃｇａａａａａｃｔ ｔｇｃｔａａｃａａｔ ｃａｔｔａｃａｇｇｔ ｃａｇｔｇａｔｃｃａ ｇｔｇｇｔａｇａｃｔ ｇｔａｔｔｇａａｔ ｇｃｇｔｔｔｔｃｇｔ ｃｔａｔｔａｇｇａｇ ｇｔａａｔｔｃａａｃ－３’
配列番号２
５’－ｔａｃｇｇｃａｔｇｃ ｔｔｇａａｔｔｇｇｔ ｔｔｃｔｔａｃｇａｔ－３’
配列番号３
５’－ｔａｃｇｃｔｃｇａｇ ｇｔｔｇａａｔｔａｃ ｃｔｃｃｔａａｔａｇ－３’
配列番号４
５’－ｔｇｇｔｇｇａｔｃｃ ｇｔｇａｇｃａａｇｇ ｇｃｇａｇｇａｇｃｔ ｇ－３’
配列番号５
５’－ｔｇａｃｔｃｔａｇａ ａｃｔａｇｔｇｔｃｇ ａｃｇｇｔａｃｃｔｔ ａｃｔｔｇｔａｃａｇ ｃｔｃｇｔｃｃ－３’
配列番号６
５’－ｔｇｇｔｇｇａｔｃｃ ｇｔｇａｇｃａａｇｇ ｇｃｇａｇｇａｇｃｔ ｇ－３’
配列番号７
５’－ｔｇａｃｔｃｔａｇａ ａｃｔａｇｔｇｔｃｇ ａｃｇｇｔａｃｃｔｔ ａｃｔｔｇｔａｃａｇ ｃｔｃｇｔｃｃ－３’
配列番号８
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号９
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇａｇａｇｔａｃｇｔ ｃｇｔｃａｇａａｔａ ｃｇｔｔ－３’
配列番号１０
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１１
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｃｃｃａｔｃａｔａａ ｔａｔｃｇｃｃｔａｃ ａａａｔ－３’
配列番号１２
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１３
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｔｔｔｔｇｃｔｃｃｇ ｔｔａｃｔｔｔｔｔｃ ａａｃａ－３’
配列番号１４
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１５
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇｃｔａｃａｔａａｔ ｃｃｇａｇｇｃｔｃｔ ａａａｇ－３’
配列番号１６
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１７
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｇ ａｃｔｔｔｃｔｇｇｔ ａｃｇａａａｔｔｔｔ ｃｔｔｔ－３’
配列番号１８
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ－３’
配列番号１９
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ－３’
配列番号２０
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ－３’
配列番号２１
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ ｇｇｇｇｃａｇａｃａ ｇｔａｔｔｔｔｔｃａ ａｔａｔｇｔｔｇａａ ｃｃｇａｔｃｔｔｔａ ｇａｇｃｃｔｃｇｇａ ｔｔａｔｇｔａｇｃａ－３’
配列番号２２
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ ｇｇｇｇｃａｇａｃａ ｇｔａｔｔｔｔｔｃａ ａｔａｔｇｔｔｇａａ ｃｃｇａｔｃｔｔｔａ ｇａｇｃｃｔｃｇｇａ ｔｔａｔｇｔａｇｃａ ｇｇａａａｃｔｔｔｇ ａａａａｃｃｃｇｇｔ ａａｃｃｔａｔｃａａ ａａｇａａｔｔａｔａ ａａｃａａｇｃａｇａ ｔａａａｇａｇａｔｔ ｃａｔｃｔｇｃａｇａ ｃｇａａｔａａｇｇａ ａｔｃａｇｔｇａａａ ｇｔｃｔｔｇａａｇｇ ａｔａｔｇａａｔｔｔ ｃａｃｇｇｔｔｃｔｃ ａａｃａｇｃｇｃｃａ ａｃａａｃｃａｃｇｃ ａａｔｇｇａｔｔａｃ ｇｇｃｇｔｔｃａｇｇ ｇｃａｔｇａａａｇａ ｔａｃｇｃｔｔｇｇａ ｇａａｔｔｔｇｃｇａ ａｇｃａａａａｃｃｔ ｔｇａｔａｔｃｇｔｔ ｇｇａｇｃｇｇｇａｔ ａｃａｇｃｔｔａａｇ ｔｇａｔｇｃｇａａａ ａａｇａａａａｔｔｔ ｃｇｔａｃｃａｇａａ ａｇｔｃ－３’
配列番号２３
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２４
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇａｇａｇｔａｃｇｔ ｃｇｔｃａｇａａｔａ ｃｇｔｔ－３’
配列番号２５
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２６
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｃｃｃａｔｃａｔａａ ｔａｔｃｇｃｃｔａｃ ａａａｔ－３’
配列番号２７
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２８
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇｃｔａｃａｔａａｔ ｃｃｇａｇｇｃｔｃｔ ａａａｇ－３’
配列番号２９
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａ－３’
配列番号３０
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａｇｃ ｃｔｃａｔｔｔｇｔａ ｇｇｃｇａｔａｔｔａ ｔｇａｔｇｇｇａ－３’
配列番号３１
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａｇｃ ｃｔｃａｔｔｔｇｔａ ｇｇｃｇａｔａｔｔａ ｔｇａｔｇｇｇａｃｇ ｃｔａｔｇｔｔｇａａ ａａａｇｔａａｃｇｇ ａｇｃａａａａａｇｇ ｇｇｃａｇａｃａｇｔ ａｔｔｔｔｔｃａａｔ ａｔｇｔｔｇａａｃｃ ｇａｔｃｔｔｔａｇａ ｇｃｃｔｃｇｇａｔｔ ａｔｇｔａｇｃａ－３’
［配列目録フリーテキスト］
配列番号１
５’－ｔｔｇａａｔｔｇｇｔ ｔｔｃｔｔａｃｇａｔ ｇｇｔａａｇａｃｃａ ａｃｇａａａｃｔｇｇ ｔａｃａｇｃｔｇｃａ ｔｇｇｇｃｔａａａｇ ｃｔａａｇｃｃｔｇａ ａａａｇｇｔｃａｔｃ ａａｇａｔｃａｃｃａ ａｇｇａａｔｔｃａｇ ｃａａｇｃｃｇｃａａ ｔａｃａａｔｇｔｔｔ ｃｔｇｔｔｔｔｇａａ ｇｃｔｔｇａａｇｔｔ ｃｃａｇｔｔｇａｔｃ ａａａａｇｔｔｔｇｔ ｔｇａａｇｇｃｔａｃ ａｃｃｇａｔｇａｃｇ ｇｃｇｔｔａｃｃｃｃ ｔｇｔｔｔａｃａｇｃ ａａｇｇａａｇａａｇ ｃｃｇｃｔａａｇｔａ ｔｔａｃａａｇｇａａ ｃａｇｔｃａｇａｔｇ ｃａａｃｇｇａｔｃｔ ｃｃｃａｔｔｃａｔｃ ｔｔｃｃｔｇｔｃｃｇ ｃｔｇｇｔｇｔｃａｃ ｃａａｃｇａａｔｔｇ ｔｔｃｃｔｔｇａａｇ ａａｃｔｃａａｇｔｔ ｔｇｃｔａａｇｃａａ ｇｃａｇｇｔｔｃａｇ ｃｃｔｔｔａａｔｇｇ ｔｇｔｔｃｔｃｔｇｔ ｇｇｃｃｇｔｇｃａａ ｃｔｔｇｇａａｇｃｃ ｇｇｇｔｇｔｔａａｇ ｃｃａｔａｔｇｃｔｇ ｃｔｇａａｇｇｃｇａ ａｇｃｔｇｃｔｇｇｔ ａａｇａａｇｔｇｇｃ ｔｇｃａｇａｃｃｇａ ａｇｇｃａａｇｇｃｔ ａａｃａｔｔｇａｔｃ ｇｔｔｔｇａａｃａａ ｇｇｔｇｃｔｔｇｃａ ｇａａａｃｔｇｃａａ ｃｃｃｃｔｔｇｇａｃ ｔｇａｃａａａｇｔｔ ｇａａｇｇｔｔａａｔ ｃｔｔｔａａｃｃａｔ ａｇｔｔｇｃａａｇａ ａａｇｇａｃｃｇａｔ ｔａｔｇａｔｇａｔｃ ｇｇｔｔｃｔｔｔｔｔ ｔｔａｔｇａｃｔｇｃ ｇｇａｃａｔｇｔｔｔ ｔｔｇｔｇａｃｃａｃ ｔｇｃａａａｃａｔｃ ａａａｔｇａａｇｔ ｔｃｇａａａａａｃｔ ｔｇｃｔａａｃａａｔ ｃａｔｔａｃａｇｇｔ ｃａｇｔｇａｔｃｃａ ｇｔｇｇｔａｇａｃｔ ｇｔａｔｔｇａａｔ ｇｃｇｔｔｔｔｃｇｔ ｃｔａｔｔａｇｇａｇ ｇｔａａｔｔｃａａｃ－３’
配列番号２
５’－ｔａｃｇｇｃａｔｇｃ ｔｔｇａａｔｔｇｇｔ ｔｔｃｔｔａｃｇａｔ－３’
配列番号３
５’－ｔａｃｇｃｔｃｇａｇ ｇｔｔｇａａｔｔａｃ ｃｔｃｃｔａａｔａｇ－３’
配列番号４
５’－ｔｇｇｔｇｇａｔｃｃ ｇｔｇａｇｃａａｇｇ ｇｃｇａｇｇａｇｃｔ ｇ－３’
配列番号５
５’－ｔｇａｃｔｃｔａｇａ ａｃｔａｇｔｇｔｃｇ ａｃｇｇｔａｃｃｔｔ ａｃｔｔｇｔａｃａｇ ｃｔｃｇｔｃｃ－３’
配列番号６
５’－ｔｇｇｔｇｇａｔｃｃ ｇｔｇａｇｃａａｇｇ ｇｃｇａｇｇａｇｃｔ ｇ－３’
配列番号７
５’－ｔｇａｃｔｃｔａｇａ ａｃｔａｇｔｇｔｃｇ ａｃｇｇｔａｃｃｔｔ ａｃｔｔｇｔａｃａｇ ｃｔｃｇｔｃｃ－３’
配列番号８
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号９
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇａｇａｇｔａｃｇｔ ｃｇｔｃａｇａａｔａ ｃｇｔｔ－３’
配列番号１０
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１１
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｃｃｃａｔｃａｔａａ ｔａｔｃｇｃｃｔａｃ ａａａｔ－３’
配列番号１２
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１３
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｔｔｔｔｇｃｔｃｃｇ ｔｔａｃｔｔｔｔｔｃ ａａｃａ－３’
配列番号１４
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１５
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇｃｔａｃａｔａａｔ ｃｃｇａｇｇｃｔｃｔ ａａａｇ－３’
配列番号１６
５’－ｔｃｇａｇｃａｔｇｃ ａａｔａｃｃｃａｃｔ ｔａｔｔｇｃｇａｔｔ ｔｇｃｔ－３’
配列番号１７
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｇ ａｃｔｔｔｃｔｇｇｔ ａｃｇａａａｔｔｔｔ ｃｔｔｔ－３’
配列番号１８
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ－３’
配列番号１９
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ－３’
配列番号２０
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ－３’
配列番号２１
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ ｇｇｇｇｃａｇａｃａ ｇｔａｔｔｔｔｔｃａ ａｔａｔｇｔｔｇａａ ｃｃｇａｔｃｔｔｔａ ｇａｇｃｃｔｃｇｇａ ｔｔａｔｇｔａｇｃａ－３’
配列番号２２
５’－ａｔｇａａａａａａｇ ａａｃｔｇａｇｃｔｔ ｔｃａｔｇａａａａｇ ｃｔｇｃｔａａａｇｃ ｔｇａｃａａａａｃａ ｇｃａａａａａａａｇ ａａａａｃｃａａｔａ ａｇｃａｃｇｔａｔｔ ｔａｔｔｇｃｃａｔｔ ｃｃｇａｔｃｇｔｔｔ ｔｔｇｔｃｃｔｔａｔ ｇｔｔｃｇｃｔｔｔｃ ａｔｇｔｇｇｇｃｇｇ ｇａａａａｇｃｇｇａ ａａｃｇｃｃｇａａｇ ｇｔｃａａａａｃｇｔ ａｔｔｃｔｇａｃｇａ ｃｇｔａｃｔｃｔｃａ ｇｃｃｔｃａｔｔｔｇ ｔａｇｇｃｇａｔａｔ ｔａｔｇａｔｇｇｇａ ｃｇｃｔａｔｇｔｔｇ ａａａａａｇｔａａｃ ｇｇａｇｃａａａａａ ｇｇｇｇｃａｇａｃａ ｇｔａｔｔｔｔｔｃａ ａｔａｔｇｔｔｇａａ ｃｃｇａｔｃｔｔｔａ ｇａｇｃｃｔｃｇｇａ ｔｔａｔｇｔａｇｃａ ｇｇａａａｃｔｔｔｇ ａａａａｃｃｃｇｇｔ ａａｃｃｔａｔｃａａ ａａｇａａｔｔａｔａ ａａｃａａｇｃａｇａ ｔａａａｇａｇａｔｔ ｃａｔｃｔｇｃａｇａ ｃｇａａｔａａｇｇａ ａｔｃａｇｔｇａａａ ｇｔｃｔｔｇａａｇｇ ａｔａｔｇａａｔｔｔ ｃａｃｇｇｔｔｃｔｃ ａａｃａｇｃｇｃｃａ ａｃａａｃｃａｃｇｃ ａａｔｇｇａｔｔａｃ ｇｇｃｇｔｔｃａｇｇ ｇｃａｔｇａａａｇａ ｔａｃｇｃｔｔｇｇａ ｇａａｔｔｔｇｃｇａ ａｇｃａａａａｃｃｔ ｔｇａｔａｔｃｇｔｔ ｇｇａｇｃｇｇｇａｔ ａｃａｇｃｔｔａａｇ ｔｇａｔｇｃｇａａａ ａａｇａａａａｔｔｔ ｃｇｔａｃｃａｇａａ ａｇｔｃ－３’
配列番号２３
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２４
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇａｇａｇｔａｃｇｔ ｃｇｔｃａｇａａｔａ ｃｇｔｔ－３’
配列番号２５
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２６
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｃｃｃａｔｃａｔａａ ｔａｔｃｇｃｃｔａｃ ａａａｔ－３’
配列番号２７
５’－ｃｇｃｔｇｇａｔａｔ ｃｔａｃａｔｇｃａｃ ｇｔａｔｔｔａｔｔｇ ｃｃａｔｔｃｃｇ－３’
配列番号２８
５’－ｔａｃｇｇｇａｔｃｃ ａｃｃａｇａａｃｃａ ｃｃａｇａａｃｃａｃ ｃａｇａａｃｃａｃｃ ａｇａａｃｃａｃｃｔ ｇｃｔａｃａｔａａｔ ｃｃｇａｇｇｃｔｃｔ ａａａｇ－３’
配列番号２９
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａ－３’
配列番号３０
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａｇｃ ｃｔｃａｔｔｔｇｔａ ｇｇｃｇａｔａｔｔａ ｔｇａｔｇｇｇａ－３’
配列番号３１
５’－ｃａｃｇｔａｔｔｔａ ｔｔｇｃｃａｔｔｃｃ ｇａｔｃｇｔｔｔｔｔ ｇｔｃｃｔｔａｔｇｔ ｔｃｇｃｔｔｔｃａｔ ｇｔｇｇｇｃｇｇｇａ ａａａｇｃｇｇａａａ ｃｇｃｃｇａａｇｇｔ ｃａａａａｃｇｔａｔ ｔｃｔｇａｃｇａｃｇ ｔａｃｔｃｔｃａｇｃ ｃｔｃａｔｔｔｇｔａ ｇｇｃｇａｔａｔｔａ ｔｇａｔｇｇｇａｃｇ ｃｔａｔｇｔｔｇａａ ａａａｇｔａａｃｇｇ ａｇｃａａａａａｇｇ ｇｇｃａｇａｃａｇｔ ａｔｔｔｔｔｃａａｔ ａｔｇｔｔｇａａｃｃ ｇａｔｃｔｔｔａｇａ ｇｃｃｔｃｇｇａｔｔ ａｔｇｔａｇｃａ－３’
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】