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▶ チェックポイント セラピューティクス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-27
(45)【発行日】2022-10-05
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１特異的抗体およびそれを使用する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220928BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220928BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220928BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220928BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220928BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220928BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220928BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220928BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220928BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P37/04
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K35/17 Z
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2018567904
(86)(22)【出願日】2017-06-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-11-07
(86)【国際出願番号】 US2017039810
(87)【国際公開番号】W WO2018005682
(87)【国際公開日】2018-01-04
【審査請求日】2020-04-08
(31)【優先権主張番号】62/356,105
(32)【優先日】2016-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】518452582
【氏名又は名称】チェックポイント セラピューティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】ベルク，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】シャーキー，ネイサン，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ゴレリック，レオニド
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３５６９１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体またはその機能的フラグメントであって、ａ）ＣＤＲＨ１が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
ｂ）ＣＤＲＨ１が配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
ｃ）ＣＤＲＨ１が配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
ｄ）ＣＤＲＨ１が配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
ｅ）ＣＤＲＨ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
ｆ） ＣＤＲＨ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、または、
ｇ）ＣＤＲＨ１が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号７５のアミノ酸配列を含む、
抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項2】
可変重鎖フレームワーク領域１が、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項3】
可変重鎖フレームワーク領域１が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項4】
可変重鎖フレームワーク領域２が、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項5】
可変重鎖フレームワーク領域３が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項6】
可変重鎖フレームワーク領域４が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項7】
可変軽鎖フレームワーク領域１が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項8】
可変軽鎖フレームワーク領域２が、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項9】
可変軽鎖フレームワーク領域３が、配列番号３３、配列番号７７、または配列番号７８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項10】
可変軽鎖フレームワーク領域４が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項11】
可変重鎖領域が、配列番号３６、３７、３８、３９、４０および４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項12】
可変重鎖領域が、配列番号５１、５２、５３、５４、５５および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、可変軽鎖領域が、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項13】
可変重鎖領域が、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、
可変軽鎖領域が、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項14】
可変軽鎖領域が、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項15】
請求項１に記載の抗体またはその機能的フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項16】
重鎖可変領域が配列番号３６，３７，３８，３９，４０又は４１のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域が配列番号４２を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項17】
重鎖可変領域が配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項18】
重鎖可変領域が配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項19】
重鎖可変領域が配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項20】
重鎖可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項21】
重鎖可変領域が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項22】
重鎖可変領域が配列番号４１のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項23】
ＣＤＲＨ１が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項24】
ＣＤＲＨ１が配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号７５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項25】
ＣＤＲＨ１が配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項26】
ＣＤＲＨ１が配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項27】
ＣＤＲＨ１が配列番号５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項28】
ＣＤＲＨ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項29】
ＣＤＲＨ１が配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ２が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＨ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ２が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ３が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１７年６月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９９２６３－０８０２＿ＳＬ．ｔｘｔの名称で、４３，０８５バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１７年６月１９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９９２６３－０８０２＿ＳＬ．ｔｘｔの名称で、４３，０８５バイトのサイズである。
【0002】
発明の分野
本開示は、概してプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体およびその機能的結合フラグメントに関する。特に、本開示の抗体およびフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１と結合し、新規の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。最後に、本開示は、本開示の抗体およびフラグメントを、がんを有する対象に投与し、それによりがんの進行または増殖を処置することまたは遅らせることに関する。
本開示は、概してプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体およびその機能的結合フラグメントに関する。特に、本開示の抗体およびフラグメントは、ヒトＰＤ－Ｌ１と結合し、新規の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。最後に、本開示は、本開示の抗体およびフラグメントを、がんを有する対象に投与し、それによりがんの進行または増殖を処置することまたは遅らせることに関する。
【背景技術】
【0003】
ＰＤ－Ｌ１（以前はＢ７－Ｈ１）は、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）および活性化Ｔ細胞を含む、多くの細胞種において発現するＢ７ファミリーメンバーである（Ｙａｍａｚａｋｉら、（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５５３８）。ＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）およびＢ７－１の両方と結合する。ＰＤ－Ｌ１によるＴ細胞発現Ｂ７－１との結合およびＢ７－１によるＴ細胞発現ＰＤ－Ｌ１との結合の両方がＴ細胞阻害をもたらす（Ｂｕｔｔｅら、（２００７年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７：１１１）。その他のＢ７ファミリーメンバーと同様に、ＰＤ－Ｌ１も共刺激シグナルをＴ細胞に与えることができる証拠もある（Ｓｕｂｕｄｈｉら、（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：６９４；Ｔａｍｕｒａら、（２００１年）Ｂｌｏｏｄ ９７：１８０９）。さらに、細胞表面におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、ＩＦＮ－γ刺激により上方制御されることも示された。
【0004】
ＰＤ－１とそのリガンドパートナー、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ；ＣＤ２７３）との間の相互作用は、Ｔ細胞活性化の制御に関与する重要な負の共刺激シグナル伝達経路である。ＰＤ－１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化単球および樹状細胞（ＤＣ）において発現する場合がある。ＰＤ－１は、活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞によって発現するが、無刺激のヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞によっては発現しない。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３～８０（１９９６年）；Ｂｏｅｔｔｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：３５３２～４０（２００６年）。（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２および３または（ｉｖ）エクソン２から４を欠く転写物を含む、活性化ヒトＴ細胞からクローン化されたＰＤ－１の少なくとも４つの変異体が存在する。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３５：１０９～１６（２００５年）。
【0005】
扁桃腺、胎盤、ならびに肺および肝臓におけるマクロファージ様細胞の小さな部分を除く、正常なヒト組織が、その細胞表面にＰＤ－Ｌ１タンパク質をほとんど発現しないことは、正常な生理的条件下では、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡが厳しい転写後制御下にあることを示唆する。際立って対照的に、Ｃｈｅｎ ＆ Ｈａｎ， Ａｎｔｉ － ＰＤ－１ ／ ＰＤ－Ｌ１ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ：ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ， ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５、３３８４～３３９１（２０１５年）に示されているとおり、ＰＤ－Ｌ１タンパク質は種々のヒトがんの細胞表面に豊富に発現している。
【0006】
ＰＤ－Ｌ２発現は、一方では、ＰＤ－Ｌ１よりも制限される。例えば、ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、および骨髄由来肥満細胞に誘導的に発現する。
【0007】
さらに、いくつかの研究は、ＰＤ－１に非依存的なＰＤ－Ｌ１に対する受容体を示している。Ｂ７．１もＰＤ－Ｌ１に対する結合パートナーと特定された。Ｂｕｔｔｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２７：１１１～２２（２００７年）。化学的架橋研究は、ＰＤ－Ｌ１とＢ７．１がＩｇＶ様ドメインを介して相互作用する可能性があることを示唆している。Ｂ７．１：ＰＤ－Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞に阻害シグナルを誘導することが可能である。Ｂ７．１によるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＰＤ－Ｌ１とのライゲーションまたはＰＤ－Ｌ１によるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＢ７．１とのライゲーションは、阻害シグナルを送達する。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４のないＴ細胞は、抗ＣＤ３プラスＢ７．１被覆ビーズによって刺激されると、増殖およびサイトカイン産生の低減を示す。Ｂ７．１に対するすべての受容体（すなわち、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－Ｌ１）がないＴ細胞では、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生は抗ＣＤ３プラスＢ７．１被覆ビーズによってももはや阻害されない。これは、Ｂ７．１がＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４の不在下においてＴ細胞に対してＰＤ－Ｌ１を介して特異的に作用することを示す。同様に、ＰＤ－１のないＴ細胞は、抗ＣＤ３プラスＰＤ－Ｌ１被覆ビーズの存在下において刺激されると、増殖およびサイトカイン産生の低減を示し、これは、Ｔ細胞上のＢ７．１に対するＰＤ－Ｌ１のライゲーションの阻害効果を実証する。ＰＤ－Ｌ１に対するすべての公知の受容体がＴ細胞にない（すなわち、ＰＤ－１およびＢ７．１がない）場合、Ｔ細胞増殖は、抗ＣＤ３プラスＰＤ－Ｌ１被覆ビーズによってももはや損なわれない。このように、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７．１またはＰＤ－１のいずれによってもＴ細胞に対する阻害効果を発揮することが可能である。
【0008】
ヒト疾患との関連で、ＰＤ－Ｌ１発現は、ヒト肺、卵巣および結腸癌ならびにさまざまな骨髄腫を含む、いくつかのマウスおよびヒトがんで見出された（Ｉｗａｉら、（２００２年）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３～７；Ｏｈｉｇａｓｈｉら、（２００５年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７～５３）。ＰＤ－Ｌ１は、抗原特異的なＴ細胞クローンのアポトーシスを増加させることによって腫瘍免疫に関与することが示唆された（Ｄｏｎｇら、（２００２年）Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：７９３～８００）。ＰＤ－Ｌ１が腸管粘膜炎症に関与している可能性があり、ＰＤ－Ｌ１の阻害が大腸炎に関連する消耗性疾患を抑制することも示唆された（Ｋａｎａｉら、（２００３年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１：４１５６～６３年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
結果として、ＰＤ－Ｌ１の治療標的化は、医学的関心が集中する分野である。ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達の阻害が、がん（例えば、腫瘍免疫）ならびに急性および慢性（例えば、持続的）の両方の感染症を含む、感染症の処置に対してＴ細胞免疫を増強する手段として提案されてきた。しかしながら、今までにたった１つの標的化された抗ＰＤ－Ｌ１治療薬しかＦＤＡからの販売認可を受けていないため、満たされていない大きな医学的ニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本開示は、ＰＤ－Ｌ１と結合し、望ましい治療特性を示す単離抗体、特に、ヒト抗体を提供する。これらの特性は、ＰＤ－Ｌ１、特に、ヒトＰＤ－Ｌ１との高親和性結合を含む。
【0011】
一態様において、本開示は、ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号１のアミノ酸１～３および７～９を含むＣＤＲＨ１（アミノ酸４～６はＳＳＹではない）、配列番号８のアミノ酸９～１７を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１５を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号２０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２２、配列番号７５、もしくは配列番号７６を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含む、抗体またはその機能的フラグメントに関する。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲＨ１領域は、配列番号２、３、４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態において、ＣＤＲＨ２領域は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、可変重鎖フレームワーク領域１は、配列番号２６または配列番号２７を含む。いくつかの実施形態において、可変重鎖フレームワーク領域２は、配列番号２８を含み、可変重鎖フレームワーク領域３は、配列番号２９を含み、および／または可変重鎖フレームワーク領域４は、配列番号３０を含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、可変軽鎖フレームワーク領域１は、配列番号３１を含み、可変軽鎖フレームワーク領域２は、配列番号３２を含み、可変軽鎖フレームワーク領域３は、配列番号３３、配列番号７７、または配列番号７８を含み、および／または可変軽鎖フレームワーク領域４は、配列番号３４を含む。
【0015】
いくつかの実施形態において、可変重鎖配列は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０および４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、可変重鎖配列は、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、および５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、可変軽鎖配列は、配列番号４２を含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すか、抗体またはその機能的フラグメントは、抗腫瘍活性を示すか、抗体またはその機能的フラグメントは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害するか、あるいは抗体またはその機能的フラグメントは、ＰＤ－１が媒介するＴ細胞活性化の阻害を妨げる。
【0018】
いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、低フコース抗体またはその機能的フラグメントであり、いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、脱フコシル化されているか、またはフコシル化されていない。
【0019】
別の態様において、本開示は、配列番号３５を含む重鎖を含む、ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体またはその機能的フラグメントに関する。
【0020】
別の態様において、本開示は、ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）と結合する抗体またはその機能的フラグメントであって、配列番号１６を含むＣＤＲＨ１、配列番号１７を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１８のアミノ酸６～１３を含むＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号２３を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４を含むＣＤＲＬ２、および配列番号２５を含むＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含む、抗体またはその機能的フラグメントに関する。
【0021】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号１８を含み、いくつかの実施形態において、ＣＤＲＨ３は、配列番号１９を含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、可変重鎖フレームワーク領域１は、配列番号４９を含み、可変重鎖フレームワーク領域２は、配列番号２８を含み、可変重鎖フレームワーク領域３は、配列番号５０を含み、および／または可変重鎖フレームワーク領域４は、配列番号３０を含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、可変軽鎖フレームワーク領域１は、配列番号４５を含み、可変軽鎖フレームワーク領域２は、配列番号４６を含み、可変軽鎖フレームワーク領域３は、配列番号４７を含み、および／または可変軽鎖フレームワーク領域４は、配列番号３４を含む。
【0024】
いくつかの実施形態において、可変重鎖配列は、配列番号４８または４９を含み、いくつかの実施形態において、可変軽鎖配列は、配列番号５０を含む。
【0025】
いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示すか、抗体またはその機能的フラグメントは、抗腫瘍活性を示すか、抗体またはその機能的フラグメントは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害するか、あるいは抗体またはその機能的フラグメントは、ＰＤ－１が媒介するＴ細胞活性化の阻害を妨げる。
【0026】
いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、低フコース抗体またはその機能的フラグメントであり、いくつかの実施形態において、抗体またはその機能的フラグメントは、脱フコシル化されているか、またはフコシル化されていない。
【0027】
いくつかの実施形態は、本開示の抗体またはその機能的フラグメントを含む医薬組成物に関する。
【0028】
別の態様において、本開示は、対象におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、本開示の抗体またはその機能的フラグメントを、がんを有する対象に投与することを含む方法に関する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示は、対象における腫瘍細胞増殖を阻害する方法であって、少なくとも２．５０×１０－８のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１と結合し、ＣＤＲＨ３が配列番号１８のアミノ酸６～１３を含む抗体またはその機能的フラグメントを、がんを有する対象に投与することを含む方法に関する。同様に、いくつかの実施形態において、本開示は、対象におけるがん細胞増殖を阻害する方法であって、少なくとも８．３０×１０－９のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１と結合し、ＣＤＲＨ３が配列番号１５を含む抗体または機能的フラグメントを、がんを有する対象に投与することを含む方法に関する。
【0029】
いくつかの実施形態において、がんは、血液がん、神経系がん、乳がん、胃腸がん、腎細胞癌、または尿生殖器がんである。特に、いくつかの実施形態において、胃腸がんは結腸がんであり、尿生殖器がんは、卵巣がん、前立腺がんまたは膀胱がんであり、血液がんは、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫であり、あるいは腎細胞癌は、腎明細胞癌である。
【0030】
いくつかの実施形態において、がんは、メラノーマ、肺がん（非小細胞肺がんなど）、頭頸部がん、肝がん、膵がん、骨がん、または血管のがんである。
【0031】
いくつかの実施形態において、がんは、高免疫原性の癌であるか、またはがんは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんである。
【0032】
いくつかの実施形態において、本方法は、対象に追加の治療用化合物を投与するステップをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、追加の治療用化合物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞、腫瘍標的化抗体、免疫応答増強モダリティー、または小分子薬物である。
【0033】
いくつかの実施形態において、免疫応答増強モダリティーは、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、またはＴＬＲアゴニストである。
【0034】
いくつかの実施形態において、腫瘍標的化抗体は、抗ＣＡＩＸ抗体である。
【0035】
いくつかの実施形態において、小分子薬物は、ＢＴＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ＢＥＴ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、またはＰＩ３Ｋデルタ阻害剤などの腫瘍標的化小分子薬物である。
【0036】
前述の概括的な説明および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本開示のさらなる説明を提供することが意図される。他の目的、利点、および新規の特長は、本開示の以下の図面の簡単な説明および詳細な説明から当業者に容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるＰＤ－Ｌ－１＋細胞とのＰＤ－１の結合の阻害パーセントを示すグラフである。結果は、ＦＡＣＳ分析を使用して得た。
【図2A】例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＣＴＩ－４８の（Ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に対する結合動態を示すグラフである。
【図2B】例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＣＴＩ－４８の（Ｂ）マウスＰＤ－Ｌ１に対する結合動態を示すグラフである。
【図2C】例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＣＴＩ－４８の（Ｃ）カニクイザルＰＤ－Ｌ１に対する結合動態を示すグラフである。
【図3】例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＣＴＩ－４８がプライマリーＮＫ細胞によりＰＤ－Ｌ１＋リンパ腫細胞に対してＡＤＣＣ活性を示すことを示すグラフである。
【図4】選択された抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた免疫遮断のレポーター（ＮＦＡＴ）バイオアッセイにおけるＰＤ－Ｌ１によるＴ細胞阻害の逆転を示すグラフである。
【図5】ＣＴＩ－４８および臨床対照ｍＡｂによるＰＤ－Ｌ１のＢ７．１との結合の遮断を示すグラフである。
【図6】ＩＦＮ－γ産生に対する本開示の抗体の効果を示すグラフである。抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）培養物に与えた。データをビヒクル対照に対して正規化し、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝６）と組み合わせて示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、ダネットの多重比較事後検定を用いて通常の一元配置分散分析法を使用した適切なアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）と比較した場合の統計的有意性を示す。この図は、ＣＴＩ－４８および臨床対照ｍＡｂの対照比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本開示の組成物および方法は、別に指示がある場合を除いて、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年、および定期的な更新版）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．、１９８８年）；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓら、２００１年）などの文献において完全に説明されている。
【0039】
Ｉ．定義
方法は、記載されている特定の実施形態に限定されないため、変化する場合もあることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図しないことも理解されるべきである。本技術の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる。
方法は、記載されている特定の実施形態に限定されないため、変化する場合もあることが理解されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図しないことも理解されるべきである。本技術の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる。
【0040】
本明細書中で使用される場合、特定の用語は、以下の定義される意味を有する場合もある。本明細書および請求項において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り、単数および複数の言及を含む。例えば、「ある細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、それらの混合物を含む、１つの細胞ならびに複数の細胞を含む。
【0041】
本明細書中で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が挙げられた要素を含むが、その他を除外しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的に～からなること（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物または方法に本質的に重要ないかなる他の要素も除外することを意味するものとする。「からなること（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、その特許請求される組成物および実質的な方法ステップに対する他の成分のわずかではない要素を除外することを意味するものとする。これらの移行語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。したがって、方法および組成物は、追加のステップおよび構成要素を含んでもよい（含むこと）、あるいは重要でないステップおよび組成物を含む（本質的に～からなること）、あるいは明記される方法ステップまたは組成物のみからなることが意図される。
【0042】
本明細書中で使用される場合、「約」は、プラスまたはマイナス１０％を意味する。
【0043】
本明細書中で使用される場合、「任意の」または「任意に」は、次に記載される事象または状況が起こっても、または起こらなくてもよいこと、さらに説明が前記事象または状況が起こる例およびそれが起こらない例を含むことを意味する。
【0044】
本明細書中で使用される場合、「個体」、「患者」または「対象」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、もしくはウマ）、またはヒトであってもよい。好適な実施形態において、個体、患者、または対象はヒトである。
【0045】
本明細書中で使用される場合、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－Ｌ１と結合しない抗体を実質的に含まない）抗体を指すことが意図される。ただし、ＰＤ－Ｌ１のエピトープと特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－Ｌ２またはＰＤ－１、ならびに異なる種由来のタンパク質などの他のタンパク質との交差反応性を有する場合もある。しかしながら、抗体は、好ましくは常にヒトＰＤ－Ｌ１と結合する。さらに、単離抗体は、一般にはその他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。
【0046】
本明細書中で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体のＣＤＲ、ならびにヒト抗体のフレームワーク（ＦＲ）領域および定常領域を含む抗体を指す。人体におけるヒト化抗体の抗原性が低下するため、ヒト化抗体は本開示による治療用薬剤中の有効な構成成分として有用である。
【0047】
本明細書中で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製するか、発現させるか、作り出すか、または単離するすべてのヒト抗体を含み、以下に限定されるものではないが、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関するトランスジェニックまたは染色体導入動物（例えば、マウス）またはそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から（例えば、トランスフェクトーマから）単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列とスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製するか、発現させるか、作り出すか、または単離する抗体が挙げられる。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列および／または非生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列に関するトランスジェニック動物が使用される場合、インビボにおける体細胞突然変異誘発）に供されてもよく、それにより、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来するならびにそれに関連するが、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に本来存在しない可能性のある配列である。
【0048】
本明細書中で使用される場合、「グリコシル化パターン」という用語は、タンパク質と、より具体的には免疫グロブリンタンパク質と共有結合した炭水化物単位のパターンと定義される。
【0049】
本明細書中で使用される場合、「治療有効量」および「治療レベル」という語句は、それぞれ薬物投与量または対象中の血漿中濃度を意味し、これは、処置、すなわち、がん、悪性疾患またはがん細胞増殖の症状または影響を低減するか、回復させるか、または排除するために処置を必要とする対象において、薬物が投与される特定の薬理学的効果をもたらす。当該投与量が治療有効量であると当業者が考えても、治療有効量または治療レベルの薬物が、本明細書に記載されている状態／疾患を処置する際に常に有効である訳ではないことを強調する。治療有効量は、数ある要素のなかでも投与経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／またはがん、悪性疾患、もしくはがん細胞増殖の種類およびステージを含む、対象の状態に基づいて変化することもある。
【0050】
「高免疫原性のがん」という用語は、Ｔ細胞もしくはリンパ球が浸潤しているか、または類似のリンパ応答を持つようになったがんを指す。多くの場合に、腫瘍免疫原性は、増加した突然変異率と関連づけられると考えられている。このように、腫瘍が多くの突然変異を有する程、腫瘍抗原が免疫応答を引き起こすことができる確率が高い。
【0051】
「処置」または「処置すること」という用語は、がん、悪性疾患、またはがん細胞増殖に関して本明細書中で使用される場合、がん、悪性疾患、またはがん細胞増殖の１つまたは複数の症状または影響を低減するか、回復させるか、あるいは排除することを指す。
【0052】
ＩＩ．抗ＰＤ－Ｌ１抗体
数ある理由のなかでもとりわけ、がんを処置するために使用することができる抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、本明細書において提供される。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に起因する少なくとも１つの負の共刺激シグナルの拮抗作用により宿主免疫応答の共刺激を増強させると考えられている。
数ある理由のなかでもとりわけ、がんを処置するために使用することができる抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、本明細書において提供される。本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に起因する少なくとも１つの負の共刺激シグナルの拮抗作用により宿主免疫応答の共刺激を増強させると考えられている。
【0053】
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントは、がんまたは悪性疾患を処置するためのさまざまな機能特性を有することになり、以下に限定されるものではないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有すること、抗腫瘍活性を有すること、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１との結合を阻害すること、およびＰＤ－１が媒介するＴ細胞活性化の阻害を妨げることが挙げられる。
【0054】
さらに、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１、Ｂ７．１のいずれか、またはその両方と相互作用するのを遮断することを含む、ＰＤ－Ｌ１によるシグナル伝達の拮抗作用の結果として、本開示の抗体および機能的フラグメントは、ＰＤ－Ｌ１が負の共刺激シグナルをＴ細胞および他の抗原提示細胞に送るのを妨げることになり、それにより、抗腫瘍免疫およびがんおよび悪性疾患に対する免疫学的防御を増強する。さらに、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および機能的フラグメントは、以下に限定されるものではないが、ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＡＩＸ、抗ＩＬ１３Ｒａ２、または抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞）、その他の腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＣＡＩＸ抗体）、免疫応答増強モダリティー（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、またはＴＬＲアゴニスト）および小分子薬物（例えば、ＢＴＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＢＥＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤）を含む、追加の治療用化合物と組み合わされてもよい。
【0055】
本開示の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト、部分的もしくは完全ヒト化、および／または組換え型であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ポリクローナル抗体またはＰＤ－Ｌ１と結合するその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、モノクローナル抗体またはＰＤ－Ｌ１と結合するその機能的フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体およびその機能的フラグメントは、ヒト、カニクイザル、および／またはマウスのＰＤ－Ｌ１と結合することができる。
【0056】
ポリクローナル抗体は、選択した動物をＰＤ－Ｌ１抗原を用いて免疫化し、その動物から血清を収集し、血清から抗体を単離および／または精製することなどにより、当技術分野において公知の方法によって得ることができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、例えば、抗体産生細胞を不死化細胞と融合してハイブリドーマを得ることにより、および／またはコンビナトリアル抗体ライブラリー技法を使用して免疫した動物の骨髄および脾臓細胞から抽出したｍＲＮＡからｍＡｂを生成することにより、当技術分野において公知の方法によって得ることができる。組換え抗体は、例えば、ファージもしくは酵母菌ディスプレイ技法を使用して、および／または抗体ポリペプチドを発現もしくは同時発現させて、当技術分野において公知の方法によって得ることができる。抗体を作製するためのその他の技術は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている方法に使用される抗体を得るために使用することができる。
【0057】
一般に、抗体は、同一の２つのコピーの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つのコピーの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの４つのポリペプチドからなる。一般に、それぞれの重鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域および３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）領域を含み、それぞれの軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域および１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む。軽鎖および重鎖の各組の可変領域が抗体の抗原結合部位を形成する。
【0058】
「ＰＤ－Ｌ１と結合する機能的フラグメント」または「機能的フラグメント」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＰＤ－Ｌ１と結合する能力を保持する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結びつけられた２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む）；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインを含む）、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインを含む）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ ＣＤＲ３が挙げられる。その他の例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）構築物が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３～２６（１９８８年）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９～８３（１９８８年）を参照。その他の例としては、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドと融合したＰＤ－Ｌ１結合ドメインポリペプチド（重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはリンカーペプチドにより軽鎖可変領域と融合した重鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質が挙げられる。
【0059】
本開示の抗体のヒンジ領域は、二量体形成を妨げるために１つまたは複数のシステイン残基を、例えば、セリン残基で置き換えることによって改変されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号、米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号を参照。さらに、いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、以下に限定されるものではないが、点突然変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ、もしくはＩ３３２Ｅ、またはその任意の組み合わせを有するＩｇＧ１の変異Ｆｃ部分、あるいは点突然変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４の変異Ｆｃ部分を含む、他の突然変異を含んでもよい。そのような改変は、本開示の抗体および機能的フラグメントのＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合を変えることができ、いくつかの実施形態において、抗体は、さらに安定するよう改変されてもよく、いくつかの実施形態において、抗体は、ＡＤＣＣ機能を増強させるために改変されてもよい。残基の番号を決定する場合、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号が付けけられた配列を有する抗体の配列の相同領域におけるアライメントによって所与の抗体に関する残基のＫａｂａｔ番号付けが決定されてもよい。
【0060】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体のグリコシル化パターンは改変されてもよく、または変えられてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、低フコース抗体であってもよく、または脱フコシル化されていてもよく、あるいは抗体にフコースが完全にない（すなわち、フコシル化されない）ような方法で抗体を発現させてもよく、または作製してもよい。抗体または機能的フラグメントのフコース含有量の改変は、当技術分野において公知のさまざまな手段、例えば、ＦＵＴ８欠損であるか、またはＦＵＴ８の突然変異型を有する細胞中で抗体または機能的フラグメントを発現させることにより達成することができる。低フコース抗体または脱フコシル化抗体および機能的フラグメントは、ＡＤＣＣ活性が増加する。フコースの変更に加えて、本開示の抗体および機能的フラグメントは、グリコシル化パターンにその他の機能的改変を含んでもよい。例えば、位置２９７（例えば、Ｎ２９７ＡおよびＮ２９７Ｑ）の改変は、Ｆｃ領域のグリコシル化を完全に防ぎ、それによりＦｃ機能、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣを排除することができる。
【0061】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＣＴＩ－０７、ＣＴＩ－０９、ＣＴＩ－４８、ＣＴＩ－４９、ＣＴＩ－５０、ＣＴＩ－７６、ＣＴＩ－７７、ＣＴＩ－７８、ＣＴＩ－５７、もしくはＣＴＩ－５８またはその機能的フラグメントである。表１および２は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントの例示的なＣＤＲ配列を提供する。
【0062】
【表1】
【0063】
【表2】
【0064】
さらに、本開示の抗体および機能的フラグメントはまた、さまざまなフレームワーク領域を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体および機能的フラグメントは、配列番号２６～３４および／または４３～４７を含む。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域に対する特定の変更は、特に有利である場合もある。例えば、抗体の重鎖の一方にあるフレームワーク領域の第１の位置のグルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）で置換すると、製造製品の安定有効性を増加させることができる。したがって、本開示の抗体およびフラグメントのいくつかの実施形態は、この改変を含むことになる。このように、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントの重鎖は、配列番号３６～４１を含むことになるが、他の実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントの重鎖は、配列番号４８～４９または５１～５６を含むことになる。さらに、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントの重鎖は、配列番号７１～７２、または配列番号５９～６８を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドを含むことになる。
【0065】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントの軽鎖は、配列番号４２または５０を含むことになる。さらに、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントの軽鎖は、配列番号６９～７０を含む核酸配列によってコードされるポリペプチドを含むことになる。
【0066】
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体および機能的フラグメントの結合親和性または機能を損なうことなく、特定の変更を本開示の配列に行うことができることを当業者は理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または機能的フラグメントは、本開示の配列と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を共有することになる。
【0067】
いくつかの実施形態において、本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメントをコードする単離された核酸配列、例えば、配列番号５９～７０を提供する。
【0068】
本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、配列によって、または機能的特徴によって定義することができる。例えば、本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、少なくとも３．０×１０－８、少なくとも２．５×１０－８、少なくとも２．０×１０－８、少なくとも１．５×１０－８、少なくとも１．０×１０－８、少なくとも０．５×１０－８、少なくとも９．９５×１０－９、少なくとも９．９０×１０－９、少なくとも９．８５×１０－９、少なくとも９．８０×１０－９、少なくとも９．７５×１０－９、少なくとも９．７０×１０－９、少なくとも９．６５×１０－９、少なくとも９．６０×１０－９、少なくとも９．５５×１０－９、少なくとも９．５×１０－９、少なくとも９．４５×１０－９、少なくとも９．４０×１０－９、少なくとも９．３５×１０－９、少なくとも９．３０×１０－９、少なくとも９．２５×１０－９、少なくとも９．２０×１０－９、少なくとも９．１５×１０－９、少なくとも９．１０×１０－９、少なくとも９．０５×１０－９、少なくとも９．０×１０－９、少なくとも８．９５×１０－９、少なくとも８．９０×１０－９、少なくとも８．８５×１０－９、少なくとも８．８０×１０－９、少なくとも８．７５×１０－９、少なくとも８．７０×１０－９、少なくとも８．６５×１０－９、少なくとも８．６０×１０－９、少なくとも８．５５×１０－９、少なくとも８．５×１０－９、少なくとも８．４５×１０－９、少なくとも８．４０×１０－９、少なくとも８．３５×１０－９、少なくとも８．３０×１０－９、少なくとも８．２５×１０－９、少なくとも８．２０×１０－９、少なくとも８．１５×１０－９、少なくとも８．１０×１０－９、少なくとも８．０５×１０－９、少なくとも８．０×１０－９、少なくとも７．９５×１０－９、少なくとも７．９０×１０－９、少なくとも７．８５×１０－９、少なくとも７．８０×１０－９、少なくとも７．７５×１０－９、少なくとも７．７０×１０－９、少なくとも７．６５×１０－９、少なくとも７．６０×１０－９、少なくとも７．５５×１０－９、少なくとも７．５×１０－９、少なくとも７．４５×１０－９、少なくとも７．４０×１０－９、少なくとも７．３５×１０－９、少なくとも７．３０×１０－９、少なくとも７．２５×１０－９、少なくとも７．２０×１０－９、少なくとも７．１５×１０－９、少なくとも７．１０×１０－９、少なくとも７．０５×１０－９、少なくとも７．０×１０－９、少なくとも６．９５×１０－９、少なくとも６．９０×１０－９、少なくとも６．８５×１０－９、少なくとも６．８０×１０－９、少なくとも６．７５×１０－９、少なくとも６．７０×１０－９、少なくとも６．６５×１０－９、少なくとも６．６０×１０－９、少なくとも６．５５×１０－９、少なくとも６．５×１０－９、少なくとも６．４５×１０－９、少なくとも６．４０×１０－９、少なくとも６．３５×１０－９、少なくとも６．３０×１０－９、少なくとも６．２５×１０－９、少なくとも６．２０×１０－９、少なくとも６．１５×１０－９、少なくとも６．１０×１０－９、少なくとも６．０５×１０－９、少なくとも６．０×１０－９、少なくとも５．９５×１０－９、少なくとも５．９０×１０－９、少なくとも５．８５×１０－９、少なくとも５．８０×１０－９、少なくとも５．７５×１０－９、少なくとも５．７０×１０－９、少なくとも５．６５×１０－９、少なくとも５．６０×１０－９、少なくとも５．５５×１０－９、少なくとも５．５×１０－９、少なくとも５．４５×１０－９、少なくとも５．４０×１０－９、少なくとも５．３５×１０－９、少なくとも５．３０×１０－９、少なくとも５．２５×１０－９、少なくとも５．２０×１０－９、少なくとも５．１５×１０－９、少なくとも５．１０×１０－９、少なくとも５．０５×１０－９、少なくとも５．０×１０－９、少なくとも４．９５×１０－９、少なくとも４．９０×１０－９、少なくとも４．８５×１０－９、少なくとも４．８０×１０－９、少なくとも４．７５×１０－９、少なくとも４．７０×１０－９、少なくとも４．６５×１０－９、少なくとも４．６０×１０－９、少なくとも４．５５×１０－９、少なくとも４．５×１０－９、少なくとも４．４５×１０－９、少なくとも４．４０×１０－９、少なくとも４．３５×１０－９、少なくとも４．３０×１０－９、少なくとも４．２５×１０－９、少なくとも４．２０×１０－９、少なくとも４．１５×１０－９、少なくとも４．１０×１０－９、少なくとも４．０５×１０－９、少なくとも４．０×１０－９、少なくとも３．９５×１０－９、少なくとも３．９０×１０－９、少なくとも３．８５×１０－９、少なくとも３．８０×１０－９、少なくとも３．７５×１０－９、少なくとも３．７０×１０－９、少なくとも３．６５×１０－９、少なくとも３．６０×１０－９、少なくとも３．５５×１０－９、少なくとも３．５×１０－９、少なくとも３．４５×１０－９、少なくとも３．４０×１０－９、少なくとも３．３５×１０－９、少なくとも３．３０×１０－９、少なくとも３．２５×１０－９、少なくとも３．２０×１０－９、少なくとも３．１５×１０－９、少なくとも３．１０×１０－９、少なくとも３．０５×１０－９、少なくとも３．０×１０－９、少なくとも２．９５×１０－９、少なくとも２．９０×１０－９、少なくとも２．８５×１０－９、少なくとも２．８０×１０－９、少なくとも２．７５×１０－９、少なくとも２．７０×１０－９、少なくとも２．６５×１０－９、少なくとも２．６０×１０－９、少なくとも２．５５×１０－９、少なくとも２．５×１０－９、少なくとも２．４５×１０－９、少なくとも２．４０×１０－９、少なくとも２．３５×１０－９、少なくとも２．３０×１０－９、少なくとも２．２５×１０－９、少なくとも２．２０×１０－９、少なくとも２．１５×１０－９、少なくとも２．１０×１０－９、少なくとも２．０５×１０－９、少なくとも２．０×１０－９、少なくとも１．９５×１０－９、少なくとも１．９０×１０－９、少なくとも１．８５×１０－９、少なくとも１．８０×１０－９、少なくとも１．７５×１０－９、少なくとも１．７０×１０－９、少なくとも１．６５×１０－９、少なくとも１．６０×１０－９、少なくとも１．５５×１０－９、少なくとも１．５×１０－９、少なくとも１．４５×１０－９、少なくとも１．４０×１０－９、少なくとも１．３５×１０－９、少なくとも１．３０×１０－９、少なくとも１．２５×１０－９、少なくとも１．２０×１０－９、少なくとも１．１５×１０－９、少なくとも１．１０×１０－９、少なくとも１．０５×１０－９、少なくとも１．０×１０－９、少なくとも０．９５×１０－９、少なくとも０．９０×１０－９、少なくとも０．８５×１０－９、少なくとも０．８０×１０－９、少なくとも０．７５×１０－９、少なくとも０．７０×１０－９、少なくとも０．６５×１０－９、少なくとも０．６０×１０－９、少なくとも０．５５×１０－９、少なくとも０．５×１０－９、少なくとも０．４５×１０－９、少なくとも０．４０×１０－９、少なくとも０．３５×１０－９、少なくとも０．３０×１０－９、少なくとも０．２５×１０－９、少なくとも０．２０×１０－９、少なくとも０．１５×１０－９、少なくとも０．１０×１０－９、少なくとも０．０５×１０－９、少なくとも９．５×１０－１０、少なくとも９．０×１０－１０、少なくとも８．５×１０－１０、少なくとも８．０×１０－１０、またはその間の任意の値のＫＤを有してもよい。例えば、本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、８．２×１０－１０、２．３１×１０－０９、８．２４×１０－０９、３．２５×１０－０９、３．４６×１０－０９、１．９１×１０－０９、７．９７×１０－０８、２．４１×１０－０８、９．５×１０－１０、または８．６×１０－１０のＫＤ値を有してもよい。
【0069】
同様に、本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、４．０×１０－５μｇ／ｍｌから９．５×１０－７μｇ／ｍｌの間またはその間の任意の値のＩＣ５０値を有してもよい。例えば、本開示の抗体およびその機能的フラグメントは、９．１９×１０－７、４．１５６×１０－５、９．９８５×１０－７、１．０３７×１０－６、または３．４６３×１０－６のＩＣ５０値を有してもよい。
【0070】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはＰＤ－Ｌ１と結合するその機能的フラグメントは、下でより詳細に論じるとおり、標的の対象に意図される投与経路によって投与するのに適した医薬組成物に製剤化されてもよい。
【0071】
ＩＩＩ．医薬組成物および製剤
本明細書に記載されている方法に使用するのに適した医薬組成物は、治療的に活性な薬剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメント）および薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。
本明細書に記載されている方法に使用するのに適した医薬組成物は、治療的に活性な薬剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメント）および薬学的に許容される担体または希釈剤を含んでもよい。
【0072】
本組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、口腔、経鼻、肺、眼、経膣、または直腸投与のために製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメントは、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与のために液剤、懸濁剤、乳剤、リポソーム製剤などに製剤化される。本医薬組成物は、当技術分野において公知の技術を使用して即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出組成物などであるように製剤化されてもよい。
【0073】
さまざまな剤形のための薬理学的に許容される担体は、当技術分野において公知である。例えば、固体調製物のための賦形剤、滑沢剤、結合剤、および崩壊剤が公知であり、液体調製物のための溶媒、可溶化剤、懸濁化剤、等張剤、バッファー、および無痛化剤が公知である。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、１つまたは複数の保存料、酸化防止剤、安定化剤などの１つまたは複数の追加の構成成分を含む。
【0074】
さらに、本開示の医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適したその他の指示された構造として製剤化されてもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびに適したそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの実施形態において、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【0075】
滅菌した注射可能な溶液は、上で挙げた１つの成分または成分の組み合わせを含む適切な溶媒に必要とされる量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、基礎の分散媒および上で挙げたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌したビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌した注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）であり、予め滅菌ろ過したその溶液から活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
【0076】
本開示の医薬組成物は、その他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。例えば、併用療法は、少なくとも１つの本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメントを、以下に限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９、抗Ｈｅｒ２、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＳ－１、抗ＰＳＣＡ、抗ＣＡＩＸ、抗ＩＬ１３Ｒ、または抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞）、その他の腫瘍標的化抗体（例えば、抗ＣＡＩＸ抗体）、免疫応答増強モダリティー（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、またはＴＬＲアゴニスト）、および小分子薬物（例えば、ＢＴＫ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＢＥＴ阻害剤、ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、またはＰＡＲＰ阻害剤）を含む、少なくとも１つまたは複数の追加の治療用薬剤とともに含む医薬組成物を含んでもよい。本開示の医薬組成物はまた、放射線療法と併せて投与されてもよい。
【0077】
ＩＶ．がんを処置する方法
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いてがん、悪性疾患、またはがん細胞増殖を処置する方法が本明細書において提供される。さらに具体的には、本開示は、治療有効量の任意の上記の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または組成物を投与することを含む、Ｔ細胞の機能および抗腫瘍免疫を増強する方法を提供する。
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いてがん、悪性疾患、またはがん細胞増殖を処置する方法が本明細書において提供される。さらに具体的には、本開示は、治療有効量の任意の上記の抗ＰＤ－Ｌ１抗体または組成物を投与することを含む、Ｔ細胞の機能および抗腫瘍免疫を増強する方法を提供する。
【0078】
Ｔ細胞の機能および抗腫瘍免疫を増強することは、がん、悪性疾患、またはがん細胞増殖を処置することに対する広範囲のアプローチを提供する。したがって、多くの種類のがんを、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントを投与することによって処置することができる。例えば、いくつかの実施形態において、がんは、血液がん（例えば、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、もしくは多発性骨髄腫）、神経系がん、乳がん、胃腸がん（例えば、結腸がん）、腎細胞癌（例えば、腎明細胞癌）、または尿生殖器がん（例えば、卵巣がん）である。いくつかの実施形態において、がんは、メラノーマ、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、頭頸部がん、肝がん、膵がん、骨がん、前立腺がん、膀胱がん、または血管のがんである。
【0079】
いくつかの実施形態において、本開示の方法により処置されるがんは、高免疫原性の癌である。さらに、いくつかの実施形態において、本開示の方法により処置されるがんは、ＰＤ－Ｌ１を発現するがんである。
【0080】
投与計画は、最適な所望の応答（例えば、腫瘍退縮または寛解のような治療応答）をもたらすよう調節される。例えば、いくつかの実施形態において、１回の急速投与で投与されてもよいが、いくつかの実施形態においては、いくつかの分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、あるいは用量は、状況によって示されるとおり、比例的に低減されてもよく、または増加されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントは、皮下または静脈内注射によって週に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントは、皮下注射によって月に１回または２回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントは、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、または６か月に１回投与されてもよい。
【0081】
例示的な用量は、処置される個体の大きさおよび健康、ならびに処置される状態により変化することがある。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または機能的フラグメントは、１～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本開示の抗体および機能的フラグメントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。
【0082】
さらに、本開示の処置の方法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその機能的フラグメントに加えて、第２の治療用化合物の投与をさらに含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態において、追加の治療用化合物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍標的化抗体、免疫応答増強モダリティー、または小分子薬物である。
【0083】
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、さまざまな機能的特徴を有する抗体およびその機能的フラグメントを利用することができる。例えば、本開示の方法は、少なくとも３．０×１０－８、少なくとも２．５×１０－８、少なくとも２．０×１０－８、少なくとも１．５×１０－８、少なくとも１．０×１０－８、少なくとも０．５×１０－８、少なくとも９．９５×１０－９、少なくとも９．９０×１０－９、少なくとも９．８５×１０－９、少なくとも９．８０×１０－９、少なくとも９．７５×１０－９、少なくとも９．７０×１０－９、少なくとも９．６５×１０－９、少なくとも９．６０×１０－９、少なくとも９．５５×１０－９、少なくとも９．５×１０－９、少なくとも９．４５×１０－９、少なくとも９．４０×１０－９、少なくとも９．３５×１０－９、少なくとも９．３０×１０－９、少なくとも９．２５×１０－９、少なくとも９．２０×１０－９、少なくとも９．１５×１０－９、少なくとも９．１０×１０－９、少なくとも９．０５×１０－９、少なくとも９．０×１０－９、少なくとも８．９５×１０－９、少なくとも８．９０×１０－９、少なくとも８．８５×１０－９、少なくとも８．８０×１０－９、少なくとも８．７５×１０－９、少なくとも８．７０×１０－９、少なくとも８．６５×１０－９、少なくとも８．６０×１０－９、少なくとも８．５５×１０－９、少なくとも８．５×１０－９、少なくとも８．４５×１０－９、少なくとも８．４０×１０－９、少なくとも８．３５×１０－９、少なくとも８．３０×１０－９、少なくとも８．２５×１０－９、少なくとも８．２０×１０－９、少なくとも８．１５×１０－９、少なくとも８．１０×１０－９、少なくとも８．０５×１０－９、少なくとも８．０×１０－９、少なくとも７．９５×１０－９、少なくとも７．９０×１０－９、少なくとも７．８５×１０－９、少なくとも７．８０×１０－９、少なくとも７．７５×１０－９、少なくとも７．７０×１０－９、少なくとも７．６５×１０－９、少なくとも７．６０×１０－９、少なくとも７．５５×１０－９、少なくとも７．５×１０－９、少なくとも７．４５×１０－９、少なくとも７．４０×１０－９、少なくとも７．３５×１０－９、少なくとも７．３０×１０－９、少なくとも７．２５×１０－９、少なくとも７．２０×１０－９、少なくとも７．１５×１０－９、少なくとも７．１０×１０－９、少なくとも７．０５×１０－９、少なくとも７．０×１０－９、少なくとも６．９５×１０－９、少なくとも６．９０×１０－９、少なくとも６．８５×１０－９、少なくとも６．８０×１０－９、少なくとも６．７５×１０－９、少なくとも６．７０×１０－９、少なくとも６．６５×１０－９、少なくとも６．６０×１０－９、少なくとも６．５５×１０－９、少なくとも６．５×１０－９、少なくとも６．４５×１０－９、少なくとも６．４０×１０－９、少なくとも６．３５×１０－９、少なくとも６．３０×１０－９、少なくとも６．２５×１０－９、少なくとも６．２０×１０－９、少なくとも６．１５×１０－９、少なくとも６．１０×１０－９、少なくとも６．０５×１０－９、少なくとも６．０×１０－９、少なくとも５．９５×１０－９、少なくとも５．９０×１０－９、少なくとも５．８５×１０－９、少なくとも５．８０×１０－９、少なくとも５．７５×１０－９、少なくとも５．７０×１０－９、少なくとも５．６５×１０－９、少なくとも５．６０×１０－９、少なくとも５．５５×１０－９、少なくとも５．５×１０－９、少なくとも５．４５×１０－９、少なくとも５．４０×１０－９、少なくとも５．３５×１０－９、少なくとも５．３０×１０－９、少なくとも５．２５×１０－９、少なくとも５．２０×１０－９、少なくとも５．１５×１０－９、少なくとも５．１０×１０－９、少なくとも５．０５×１０－９、少なくとも５．０×１０－９、少なくとも４．９５×１０－９、少なくとも４．９０×１０－９、少なくとも４．８５×１０－９、少なくとも４．８０×１０－９、少なくとも４．７５×１０－９、少なくとも４．７０×１０－９、少なくとも４．６５×１０－９、少なくとも４．６０×１０－９、少なくとも４．５５×１０－９、少なくとも４．５×１０－９、少なくとも４．４５×１０－９、少なくとも４．４０×１０－９、少なくとも４．３５×１０－９、少なくとも４．３０×１０－９、少なくとも４．２５×１０－９、少なくとも４．２０×１０－９、少なくとも４．１５×１０－９、少なくとも４．１０×１０－９、少なくとも４．０５×１０－９、少なくとも４．０×１０－９、少なくとも３．９５×１０－９、少なくとも３．９０×１０－９、少なくとも３．８５×１０－９、少なくとも３．８０×１０－９、少なくとも３．７５×１０－９、少なくとも３．７０×１０－９、少なくとも３．６５×１０－９、少なくとも３．６０×１０－９、少なくとも３．５５×１０－９、少なくとも３．５×１０－９、少なくとも３．４５×１０－９、少なくとも３．４０×１０－９、少なくとも３．３５×１０－９、少なくとも３．３０×１０－９、少なくとも３．２５×１０－９、少なくとも３．２０×１０－９、少なくとも３．１５×１０－９、少なくとも３．１０×１０－９、少なくとも３．０５×１０－９、少なくとも３．０×１０－９、少なくとも２．９５×１０－９、少なくとも２．９０×１０－９、少なくとも２．８５×１０－９、少なくとも２．８０×１０－９、少なくとも２．７５×１０－９、少なくとも２．７０×１０－９、少なくとも２．６５×１０－９、少なくとも２．６０×１０－９、少なくとも２．５５×１０－９、少なくとも２．５×１０－９、少なくとも２．４５×１０－９、少なくとも２．４０×１０－９、少なくとも２．３５×１０－９、少なくとも２．３０×１０－９、少なくとも２．２５×１０－９、少なくとも２．２０×１０－９、少なくとも２．１５×１０－９、少なくとも２．１０×１０－９、少なくとも２．０５×１０－９、少なくとも２．０×１０－９、少なくとも１．９５×１０－９、少なくとも１．９０×１０－９、少なくとも１．８５×１０－９、少なくとも１．８０×１０－９、少なくとも１．７５×１０－９、少なくとも１．７０×１０－９、少なくとも１．６５×１０－９、少なくとも１．６０×１０－９、少なくとも１．５５×１０－９、少なくとも１．５×１０－９、少なくとも１．４５×１０－９、少なくとも１．４０×１０－９、少なくとも１．３５×１０－９、少なくとも１．３０×１０－９、少なくとも１．２５×１０－９、少なくとも１．２０×１０－９、少なくとも１．１５×１０－９、少なくとも１．１０×１０－９、少なくとも１．０５×１０－９、少なくとも１．０×１０－９、少なくとも０．９５×１０－９、少なくとも０．９０×１０－９、少なくとも０．８５×１０－９、少なくとも０．８０×１０－９、少なくとも０．７５×１０－９、少なくとも０．７０×１０－９、少なくとも０．６５×１０－９、少なくとも０．６０×１０－９、少なくとも０．５５×１０－９、少なくとも０．５×１０－９、少なくとも０．４５×１０－９、少なくとも０．４０×１０－９、少なくとも０．３５×１０－９、少なくとも０．３０×１０－９、少なくとも０．２５×１０－９、少なくとも０．２０×１０－９、少なくとも０．１５×１０－９、少なくとも０．１０×１０－９、少なくとも０．０５×１０－９、少なくとも９．５×１０－１０、少なくとも９．０×１０－１０、少なくとも８．５×１０－１０、少なくとも８．０×１０－１０、またはその間の任意の値のＫＤを有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントを含んでもよい。例えば、本開示の方法は、８．２×１０－１０、２．３１×１０－０９、８．２４×１０－０９、３．２５×１０－０９、３．４６×１０－０９、１．９１×１０－０９、７．９７×１０－０８、２．４１×１０－０８、９．５×１０－１０、または８．６×１０－１０のＫＤ値を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントを含んでもよい。
【0084】
同様に、本開示の方法は、４．０×１０－５μｇ／ｍｌから９．５×１０－７μｇ／ｍｌの間またはその間の任意の値のＩＣ５０値を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントを含んでもよい。例えば、本開示の方法は、９．１９×１０－７、４．１５６×１０－５、９．９８５×１０－７、１．０３７×１０－６、または３．４６３×１０－６のＩＣ５０値を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその機能的フラグメントを含んでもよい。
【0085】
いくつかの実施形態において、免疫応答促進モダリティーは、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、ＴＬＲアゴニスト、または抗ＣＤ４０抗体を含んでもよい。
【0086】
いくつかの実施形態において、腫瘍標的化抗体は、抗ＣＡＩＸ抗体、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＳ－１、抗ＣＤ２０（例えば、ウブリツキシマブ）、抗Ｈｅｒ２、抗ＰＣＳＡ、または抗ＦｃＲＬ５を含んでもよい。
【0087】
いくつかの実施形態において、小分子薬物は、腫瘍標的化小分子薬物、または、例えば、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ）、ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、ＣＫ－１０１）、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＣＫ－１０３）、ＰＡＲＰ阻害剤（例えば、オラパリブもしくはＣＫ－１０２）、ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤（例えば、ＴＧＲ－１２０２）、またはＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ）を含んでもよい。
【0088】
特定の処置計画は、所与の患者の予後が改善するかどうかにより評価されてもよく、これは、処置計画が再発のリスクを低下させるか、または所与のがんの無増悪生存期間の可能性を増加させることを意味する。
【0089】
したがって、本開示の目的では、望ましい臨床結果を含む１つまたは複数の有益な結果または所望の結果が得られるなら、対象は処置される。例えば、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、以下のものの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されるものではない：疾患の結果として生じる１つまたは複数の症状を低減すること、疾患を患っている個体の生活の質を高めること、疾患を処置するのに必要とされる他の医薬の用量を低減すること、疾患の進行を遅延させること、および／または個体の生存期間を延長すること。
【0090】
さらに、方法の対象は一般にがん患者であるが、患者の年齢は限定されない。本開示の方法は、すべての年齢群およびコホートにわたりさまざまな再発および予後の転帰を有するがん、悪性疾患、またはがん細胞増殖を処置するのに有用である。したがって、いくつかの実施形態において、対象は小児対象であってもよいが、他の実施形態においては、対象は成人対象であってもよい。
【0091】
以下の実施例は、本発明を説明するために示される。ただし、本発明がこれらの実施例に記載されている特定の条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例1】
【0092】
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を用いたがん患者の処置
この実施例は、がんの処置に抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用する方法を説明する。
この実施例は、がんの処置に抗ＰＤ－Ｌ１抗体を使用する方法を説明する。
【0093】
がんを有することがわかっているか、またはその疑いがある患者に抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む治療有効量の医薬組成物を静脈内注射または皮下注射によって投与する。疼痛、虚弱などが挙げられるが、それらに限定されない、がんに関連する徴候および症状の存在および／または重症度に関して患者を評価し、１つまたは複数の徴候／症状が低減されるか、回復されるか、または排除されるまで患者を処置する。任意に、処置後のがんの進行を監視するために患者からサンプルを採取してもよい。任意に、徴候／症状が持続する場合および／またはがんが進行もしくは再発する場合、別の用量の医薬組成物を投与する。
【実施例2】
【0094】
最適化抗体の作製
ＰｉｅｒｃｅのＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抗原をビオチン化した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２カッパ－ＦＩＴＣ（ＬＣ－ＦＩＴＣ）、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＰＥ（ＥＡ－ＰＥ）およびストレプトアビジン－６３３（ＳＡ－６３３）を、それぞれＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手した。ストレプトアビジンマイクロビーズおよびＭＡＣＳ ＬＣ分離カラムをＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した。
ＰｉｅｒｃｅのＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して抗原をビオチン化した。ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２カッパ－ＦＩＴＣ（ＬＣ－ＦＩＴＣ）、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－ＰＥ（ＥＡ－ＰＥ）およびストレプトアビジン－６３３（ＳＡ－６３３）を、それぞれＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳｉｇｍａおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手した。ストレプトアビジンマイクロビーズおよびＭＡＣＳ ＬＣ分離カラムをＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃから購入した。
【0095】
親和性成熟
ナイーブなクローンの結合最適化は、以下の３つの成熟方法を利用して行った：ＶＨ ＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２の多様化、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ突然変異誘発およびＣＤＲＨ３に重点を置いたＶＨ突然変異誘発。
ナイーブなクローンの結合最適化は、以下の３つの成熟方法を利用して行った：ＶＨ ＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２の多様化、ＶＨ遺伝子のＰＣＲ突然変異誘発およびＣＤＲＨ３に重点を置いたＶＨ突然変異誘発。
【0096】
ＣＴＩ－０７系列
最適化の第１のサイクルは、当技術分野において公知の技術を使用した突然変異誘発ＰＣＲによってＣＴＩ－０７ＶＨ遺伝子を多様化したライブラリーから改善された結合体を選択することに重点を置いた。ラウンド１：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０７ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを１００ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした後、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）およびＳＡ－６３３（抗原結合の検出）によってＩｇＧ発現ならびにヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。上位の抗原結合／ＩｇＧ発現細胞をＦＡＣＳによって選択した。ラウンド２：ラウンド１に従って選択を行ったが、抗原結合の識別のために１０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を使用した。ラウンド３：ラウンド１および２に従ってライブラリー発現を行った。ラウンド３は、選択生成物から非特異的抗体を除去するために多特異性試薬（ＰＳＲ）の使用を採用した（Ｙ．Ｘｕら、「Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ａ ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ， Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ．」ＰＥＤＳ ２６．１０（２０１３年）：６６３～７０）。これらのライブラリーを１：１０希釈のビオチン化ＰＳＲ試薬とともにインキュベーションし、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）によってＩｇＧ発現を検出し、ＥＡ－ＰＥ（抗原結合の検出）によってＰＳＲ結合およびヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。ＩｇＧ陽性、ＰＳＲ陰性、ＰＩ陰性細胞の上位１～２％を選別し、ラウンド４に持ち越した。ラウンド４：ラウンド２に従って選択を行ったが、抗原結合の識別のために１ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を使用した。上位のクローンを播き、固有のＩｇＧ配列を決定するために配列決定を行った。固有のＩｇＧ配列を抗体作製、精製および特徴づけのために提示した。
最適化の第１のサイクルは、当技術分野において公知の技術を使用した突然変異誘発ＰＣＲによってＣＴＩ－０７ＶＨ遺伝子を多様化したライブラリーから改善された結合体を選択することに重点を置いた。ラウンド１：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０７ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを１００ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした後、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）およびＳＡ－６３３（抗原結合の検出）によってＩｇＧ発現ならびにヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。上位の抗原結合／ＩｇＧ発現細胞をＦＡＣＳによって選択した。ラウンド２：ラウンド１に従って選択を行ったが、抗原結合の識別のために１０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を使用した。ラウンド３：ラウンド１および２に従ってライブラリー発現を行った。ラウンド３は、選択生成物から非特異的抗体を除去するために多特異性試薬（ＰＳＲ）の使用を採用した（Ｙ．Ｘｕら、「Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ａ ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ， Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ．」ＰＥＤＳ ２６．１０（２０１３年）：６６３～７０）。これらのライブラリーを１：１０希釈のビオチン化ＰＳＲ試薬とともにインキュベーションし、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）によってＩｇＧ発現を検出し、ＥＡ－ＰＥ（抗原結合の検出）によってＰＳＲ結合およびヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。ＩｇＧ陽性、ＰＳＲ陰性、ＰＩ陰性細胞の上位１～２％を選別し、ラウンド４に持ち越した。ラウンド４：ラウンド２に従って選択を行ったが、抗原結合の識別のために１ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を使用した。上位のクローンを播き、固有のＩｇＧ配列を決定するために配列決定を行った。固有のＩｇＧ配列を抗体作製、精製および特徴づけのために提示した。
【0097】
最適化の第２のサイクルは、ＣＤＲＨ３内の突然変異誘発率を増加させるために、変性したＣＤＲＨ３オリゴも利用しながら突然変異誘発ＰＣＲによってＶＨ遺伝子を多様化したライブラリーから改善された結合体を選択することに焦点を置いた。この増幅技術は、当技術分野において周知の技術を使用して実施した。ラウンド１：酵母菌の表面に完全長親ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを１０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした後、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）およびＳＡ－６３３（抗原結合の検出）によってＩｇＧ発現ならびにヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。上位の抗原結合／ＩｇＧ発現細胞をＦＡＣＳによって選択した。ラウンド２：ラウンド１に従って選択を行ったが、抗原結合の識別のために２ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１を使用した。上位のクローンを播き、固有のＩｇＧ配列を決定するために配列決定を行った。固有のＩｇＧ配列を抗体作製、精製および特徴づけのために提示した。
【0098】
ＣＴＩ－０９系列
ＣＴＩ－０９最適化は、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の多様化の使用を採用した：ＣＴＩ－０９のＣＤＲＨ３をＰＣＲによって増幅した後、１×１０８の多様性のＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２変異体を含む予め作製したベクターライブラリーに再結合させた。ラウンド１：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０９ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを１００ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳシステムによる磁気分離によって抗原陽性細胞を選択した。要するに、ｂ－ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションしたライブラリーを、ストレプトアビジン磁気ビーズとともにインキュベーションした。酵母菌／ビーズ複合体がＭＡＣＳ ＬＳカラムにおいて捕捉され、非標識細胞は廃棄物にまで通過した。ｂ－ＰＤ－Ｌ１結合細胞を、その後、選択プロセスのラウンド２のための増殖用培地に溶出した。ラウンド２：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０７ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを２０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした後、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）およびＳＡ－６３３（抗原結合の検出）によってＩｇＧ発現ならびにヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。上位の抗原結合／ＩｇＧ発現細胞をＦＡＣＳによって選択した。ラウンド３：ラウンド１および２に従ってライブラリーの発現を行った。ラウンド３は、選択生成物から非特異的抗体を除去するために多特異性試薬（ＰＳＲ）の使用を採用した（Ｙ．Ｘｕら、「Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ａ ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ， Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ．」ＰＥＤＳ ２６．１０（２０１３年）：６６３～７０）。これらのライブラリーを１：１０希釈のビオチン化ＰＳＲ試薬とともにインキュベーションし、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）によってＩｇＧ発現を検出し、ＥＡ－ＰＥ（抗原結合の検出）によってＰＳＲ結合およびヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。ＩｇＧ陽性、ＰＳＲ陰性、ＰＩ陰性細胞の上位１～２％を選別し、ラウンド４に持ち越した。ラウンド４：誘導されたラウンド３の生成物を２０ｎＭのｂ－ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした。細胞をペレット状にし、残ったあらゆるｂ－ＰＤ－Ｌ１を除去するために洗浄した。この細胞ペレットを１ｕＭの非標識ＰＤ－Ｌ１に再懸濁させた。長い期間ｂ－ＰＤ－Ｌ１抗原を保持する能力によって上位の抗原結合体を識別した。上位のクローンを播き、固有のＩｇＧ配列を決定するために配列決定を行った。固有のＩｇＧ配列を抗体作製、精製および特徴づけのために提示した。
ＣＴＩ－０９最適化は、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の多様化の使用を採用した：ＣＴＩ－０９のＣＤＲＨ３をＰＣＲによって増幅した後、１×１０８の多様性のＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２変異体を含む予め作製したベクターライブラリーに再結合させた。ラウンド１：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０９ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを１００ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳシステムによる磁気分離によって抗原陽性細胞を選択した。要するに、ｂ－ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションしたライブラリーを、ストレプトアビジン磁気ビーズとともにインキュベーションした。酵母菌／ビーズ複合体がＭＡＣＳ ＬＳカラムにおいて捕捉され、非標識細胞は廃棄物にまで通過した。ｂ－ＰＤ－Ｌ１結合細胞を、その後、選択プロセスのラウンド２のための増殖用培地に溶出した。ラウンド２：酵母菌の表面に完全長ＣＴＩ－０７ ＩｇＧのＶＨ変異型を提示することによって選択を行った。これらのライブラリーを２０ｎＭのビオチン化ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした後、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）およびＳＡ－６３３（抗原結合の検出）によってＩｇＧ発現ならびにヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。上位の抗原結合／ＩｇＧ発現細胞をＦＡＣＳによって選択した。ラウンド３：ラウンド１および２に従ってライブラリーの発現を行った。ラウンド３は、選択生成物から非特異的抗体を除去するために多特異性試薬（ＰＳＲ）の使用を採用した（Ｙ．Ｘｕら、「Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｙｅａｓｔ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：ａ ＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ， Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｏｌ．」ＰＥＤＳ ２６．１０（２０１３年）：６６３～７０）。これらのライブラリーを１：１０希釈のビオチン化ＰＳＲ試薬とともにインキュベーションし、抗ＬＣ ＦＩＴＣ試薬（ＩｇＧ発現）によってＩｇＧ発現を検出し、ＥＡ－ＰＥ（抗原結合の検出）によってＰＳＲ結合およびヨウ化プロピジウム染色によって生細胞を検出した。ＩｇＧ陽性、ＰＳＲ陰性、ＰＩ陰性細胞の上位１～２％を選別し、ラウンド４に持ち越した。ラウンド４：誘導されたラウンド３の生成物を２０ｎＭのｂ－ＰＤ－Ｌ１とともにインキュベーションした。細胞をペレット状にし、残ったあらゆるｂ－ＰＤ－Ｌ１を除去するために洗浄した。この細胞ペレットを１ｕＭの非標識ＰＤ－Ｌ１に再懸濁させた。長い期間ｂ－ＰＤ－Ｌ１抗原を保持する能力によって上位の抗原結合体を識別した。上位のクローンを播き、固有のＩｇＧ配列を決定するために配列決定を行った。固有のＩｇＧ配列を抗体作製、精製および特徴づけのために提示した。
【0099】
抗体作製および精製
酵母菌クローンを飽和状態まで成長させた後、振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後、酵母菌細胞をペレット状にし、その上清を精製のために回収した。プロテインＡカラムを使用してＩｇＧを精製し、酢酸、ｐＨ２．０で溶出した。Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって生成し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）により精製した。
酵母菌クローンを飽和状態まで成長させた後、振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後、酵母菌細胞をペレット状にし、その上清を精製のために回収した。プロテインＡカラムを使用してＩｇＧを精製し、酢酸、ｐＨ２．０で溶出した。Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって生成し、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）により精製した。
【実施例3】
【0100】
ＰＤ－Ｌ１抗体を用いた競合的ＦＡＣＳ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＰＤ－Ｌ１発現ベクターによりトランスフェクトし、続いてタンパク質の発現（ＰＤ－Ｌ１＋細胞）に関して選択した。そのＣＨＯ細胞を１μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＤ－１とともに１時間インキュベーションした。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＰＤ－Ｌ１発現ベクターによりトランスフェクトし、続いてタンパク質の発現（ＰＤ－Ｌ１＋細胞）に関して選択した。そのＣＨＯ細胞を１μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＤ－１とともに１時間インキュベーションした。
【0101】
ビオチン標識ＰＤ－１とのインキュベーション後、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を１０μｍ／ｍｌから開始して４倍希釈で上清に添加し、１時間インキュベーションした。その細胞を洗浄した後、ストレプトアビジン－ＰＥと接触させた。ストレプトアビジン－ＰＥ染色をフローサイトメトリーによって分析して、抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるＰＤ－１結合の阻害パーセントを求めた。
【0102】
【表3】
【0103】
（配列番号７３によって表されるＶＨドメインおよび配列番号７４によって表されるＶＬドメインによって定義される）臨床対照ｍＡｂ、ＣＴＩ－０９、ＣＴＩ－４８、ＣＴＩ－５０、およびＣＴＩ－５８を含む、いくつかの抗体のＩＣ５０値を算出し、それらは、表３で見出すことができる。図１は、この研究の結果を示す。
【実施例4】
【0104】
抗体結合動態、特異性、および選択性
抗体結合動態を評価するための親和性測定値を求める際にＯｃｔｅｔデータ解析を使用した。２ｍＬの充填サンプルを、動態バッファー中において２０ｕｇ／ｍＬ（デフォルト濃度）で調製した。黒い９６ウェルプレートに少なくとも２００ｕＬずつ等分する。サンプルの濃度範囲は、（利用可能であれば）相互作用の推定されるＫＤに基づくものとした。一般に、段階希釈は、０．１ＫＤから１０ＫＤの範囲であった。サンプル希釈液として動態バッファーを使用して、７段階希釈をサンプルカラムに行った。サンプルカラムの最後のウェルを、後でデータ解析において参照ウェルとして使用し、これは動態バッファーのみを含んでいなければならない。
抗体結合動態を評価するための親和性測定値を求める際にＯｃｔｅｔデータ解析を使用した。２ｍＬの充填サンプルを、動態バッファー中において２０ｕｇ／ｍＬ（デフォルト濃度）で調製した。黒い９６ウェルプレートに少なくとも２００ｕＬずつ等分する。サンプルの濃度範囲は、（利用可能であれば）相互作用の推定されるＫＤに基づくものとした。一般に、段階希釈は、０．１ＫＤから１０ＫＤの範囲であった。サンプル希釈液として動態バッファーを使用して、７段階希釈をサンプルカラムに行った。サンプルカラムの最後のウェルを、後でデータ解析において参照ウェルとして使用し、これは動態バッファーのみを含んでいなければならない。
【0105】
バイオセンサーを動態バッファー（１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナトリウム）中、室温で１０分間水和させた。
【0106】
【表4】
【0107】
１つの例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＣＴＩ－４８に関する動態値を表４に見出すことができ、実験結果を図２に示す。
【実施例5】
【0108】
抗体結合親和性
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を、概して以前に記載されたとおり実施した（例えば、Ｅｓｔｅｐら、２０１３年を参照）。簡単にいえば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、ＩｇＧをオンラインでＡＨＱセンサーにローディングすることによって実施した。センサーをオフラインでアッセイバッファー中において３０分間平衡化した後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間監視した。ローディングしたＩｇＧを伴うセンサーを１００ｎＭの抗原に５分間曝露した後、それを解離速度測定のために５分間アッセイバッファーに移した。１：１結合モデルを使用して動態を分析した。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を、概して以前に記載されたとおり実施した（例えば、Ｅｓｔｅｐら、２０１３年を参照）。簡単にいえば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、ＩｇＧをオンラインでＡＨＱセンサーにローディングすることによって実施した。センサーをオフラインでアッセイバッファー中において３０分間平衡化した後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間監視した。ローディングしたＩｇＧを伴うセンサーを１００ｎＭの抗原に５分間曝露した後、それを解離速度測定のために５分間アッセイバッファーに移した。１：１結合モデルを使用して動態を分析した。
【0109】
【表5】
【0110】
いくつかの例示的な抗体に関する結合値を表５に示す。
【実施例6】
【0111】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＡＤＣＣ活性
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を決定するためにレポーターバイオアッセイを実施した。アッセイには、ＳＵＤＨＬ－１リンパ腫細胞およびドナーＰＢＭＣを利用した。さまざまな抗体を１または３ｕｇ／ｍｌの濃度で試験した。
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を決定するためにレポーターバイオアッセイを実施した。アッセイには、ＳＵＤＨＬ－１リンパ腫細胞およびドナーＰＢＭＣを利用した。さまざまな抗体を１または３ｕｇ／ｍｌの濃度で試験した。
【0112】
図３において例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＣＴＩ－４８に関して示しているこの研究の結果は、本開示の抗体との４時間のインキュベーション後の細胞傷害性パーセントによって表されている。
【実施例7】
【0113】
免疫遮断レポーターアッセイ
９６ウェルプレートにおいてＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１８７１１１）を使用して免疫遮断アッセイを実施した。このアッセイにおいて３つの主要な事象が生じる。事象１：操作されたジャーカットＰＤ－１エフェクター細胞およびａＡＰＣ（人工的な抗原提示細胞）ＰＤ－Ｌ１細胞がＴＣＲ／ＴＣＲ活性化因子相互作用により結合すると、ＴＣＲが媒介するＮＦＡＴ活性化が生じる。事象２：遮断抗体が存在しない場合のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１のライゲーションによるＮＦＡＴシグナルの阻害。事象３：抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の添加によるＮＦＡＴシグナルの回復。
９６ウェルプレートにおいてＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１８７１１１）を使用して免疫遮断アッセイを実施した。このアッセイにおいて３つの主要な事象が生じる。事象１：操作されたジャーカットＰＤ－１エフェクター細胞およびａＡＰＣ（人工的な抗原提示細胞）ＰＤ－Ｌ１細胞がＴＣＲ／ＴＣＲ活性化因子相互作用により結合すると、ＴＣＲが媒介するＮＦＡＴ活性化が生じる。事象２：遮断抗体が存在しない場合のＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１のライゲーションによるＮＦＡＴシグナルの阻害。事象３：抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の添加によるＮＦＡＴシグナルの回復。
【0114】
アッセイの前日に、２．５ｍＬのＦＢＳを２２．５ｍＬのＦ－１２に添加することによって、２５ｍＬの細胞回復培地（１０％ ＦＢＳ／Ｆ－１２）をＴｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＰＤ－Ｌ１細胞用の５０ｍＬのコニカルチューブ中に作製した。Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＰＤ－Ｌ１細胞（ＣＳ１８７１０３）の１つのバイアルを冷凍庫から取り出し、ドライアイス上の台に移した。細胞がちょうど解凍されるまで（約３～４分間）、３７℃の水浴においてバイアルを解凍した。細胞懸濁液を、ピペットを上下することによってバイアル中で穏やかに混合し、すべての細胞（０．５ｍＬ）を１４．５ｍＬの細胞回復培地を入れた「ＰＤ－Ｌ１細胞」のラベルを貼ったチューブに移し、続いて穏やかに逆さまにした。細胞懸濁液を滅菌した試薬リザーバーに移した。すぐに、マルチチャネルピペットを使用して、アッセイプレートに対して外側のウェルに１ウェル当たり１００μＬの細胞回復培地を添加した。そのプレートをＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベーションした。
【0115】
アッセイの日に、新しいアッセイバッファー（ＲＰＭＩ １６４０＋１％ＦＢＳ）を調製し、２×最終濃度の試験抗体のそれぞれに対して７段階３倍段階希釈をアッセイバッファーにおいて行った。９５μＬの培地をアッセイプレートのすべてのウェルから除去し、４０μＬの試験抗体の段階希釈液をＰＤ－Ｌ１細胞を入れたウェルに添加した。１ウェル当たり８０μＬのアッセイバッファーを各プレートに対して外側のウェルに添加した。
【0116】
Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＰＤ－１エフェクター細胞（ＣＳ１８７１０５）をアッセイプレートに移し、そのプレートをＣＯ２インキュベーター中において３７℃で６時間インキュベーションした。６時間の誘導後、そのアッセイプレートをＣＯ２インキュベーターから取り出し、周囲温度で５～１０分間平衡化させた。８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬をすべての試験ウェルに添加し、そのプレートを周囲温度でさらに５～１０分間インキュベーションした。０．５秒のインテグレーションでＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーにおいて発光を測定した。
【0117】
以下の抗体を１０μｇ／ｍＬ、３．３３μｇ／ｍＬ、１．１１μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ｍＬ、０．１２３μｇ／ｍＬ、０．０４１μｇ／ｍＬ、および０．０１４μｇ／ｍＬの最終濃度で試験した：ＣＴＩ－２、臨床対照ｍＡｂ、ＣＴＩ－０９、ＣＴＩ－４８、ＣＴＩ－５０、ＣＴＩ－０７、およびＣＴＩ－５８。
【0118】
臨床対照ｍＡｂ、ＣＴＩ－４８、およびＣＴＩ－４９を含む、例示的な抗体に関する結果を下記表６に示す。
【0119】
【表6】
【実施例8】
【0120】
ＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１阻害剤スクリーニングアッセイ
本開示の抗体の相互作用およびＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１相互作用をスクリーニングし、プロファイルするために市販のアッセイキットを使用した。キットは、１００の結合反応用のビオチン標識Ｂ７－１（ＣＤ８０）、精製ＰＤ－Ｌ１、ストレプトアビジン標識ＨＲＰ、およびアッセイバッファーを伴う、９６ウェル形式で売られている。ストレプトアビジン－ＨＲＰによってビオチン標識Ｂ７．１を検出するためにキットを使用した。
本開示の抗体の相互作用およびＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１相互作用をスクリーニングし、プロファイルするために市販のアッセイキットを使用した。キットは、１００の結合反応用のビオチン標識Ｂ７－１（ＣＤ８０）、精製ＰＤ－Ｌ１、ストレプトアビジン標識ＨＲＰ、およびアッセイバッファーを伴う、９６ウェル形式で売られている。ストレプトアビジン－ＨＲＰによってビオチン標識Ｂ７．１を検出するためにキットを使用した。
【0121】
まず、ＰＤ－Ｌ１で９６ウェルプレートをコーティングした。次に、本開示の抗体、陽性対照、基質対照、またはブランクのいずれか１つをそれぞれのウェルに添加し、インキュベーションした後にＢ７．１－ビオチンを添加した。最後に、そのプレートをストレプトアビジン－ＨＲＰで処理し、続いてＨＲＰ基質を添加して、化学発光をもたらし、その発光は、その後、化学発光リーダーを使用して測定することができる。
【0122】
以下の抗体をＰＤ－Ｌ１とＢ７．１の結合に対するその阻害効果に関して３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、３．３３μｇ／ｍＬ、１．１１μｇ／ｍＬ、０．３７μｇ／ｍＬ、および０．１２３μｇ／ｍＬの濃度で試験した：ＣＴＩ－１、ＣＴＩ－２、ＣＴＩ－３３、ＣＴＩ－４８、およびＣＴＩ－５５。
【0123】
例示的な結果は、本開示の抗体の結合阻害に関するＩＣ５０が０．１８１６から０．５０５６μｇ／ｍＬの間に及んでいることを示す。例えば、ＣＴＩ－４８のＩＣ５０は、０．１８１６μｇ／ｍＬであると算出された。ＣＴＩ－４８と臨床対照ｍＡｂの活性の比較を図５に示す。
【実施例9】
【0124】
抗体のＩＦＮ－γ産生に対する効果
ＩＦＮ－γ産生に対する本開示の抗体の効果を判断するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）培養物に抗体を与えた。１０μｇ／ｍＬの濃度の抗体とのＭＬＲ培養の４日後にＩＦＮ－γの産生における倍率変化を求めた。例示的な結果は、適切なアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）のものを含む。図６に示したとおり、ＣＴＩ－４８は臨床対照ｍＡｂと同等の応答を誘導し、試験抗体の多くが、対照レベルに対してＣＴＩ－３３およびＣＴＩ－５５によるおおよそ１０倍の増加を含む、ＩＦＮ－γ産生の統計学的に有意な増加を引き出した。
ＩＦＮ－γ産生に対する本開示の抗体の効果を判断するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）培養物に抗体を与えた。１０μｇ／ｍＬの濃度の抗体とのＭＬＲ培養の４日後にＩＦＮ－γの産生における倍率変化を求めた。例示的な結果は、適切なアイソタイプ対照（ｈＩｇＧ１）のものを含む。図６に示したとおり、ＣＴＩ－４８は臨床対照ｍＡｂと同等の応答を誘導し、試験抗体の多くが、対照レベルに対してＣＴＩ－３３およびＣＴＩ－５５によるおおよそ１０倍の増加を含む、ＩＦＮ－γ産生の統計学的に有意な増加を引き出した。
【0125】
本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、本開示が属する分野の当業者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が参照により組み込まれることを具体的におよび個別に示されたのと同程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。
【0126】
さらに、当業者は、目的を果たすためならびに言及される目的および利点ならびにそれに固有のものを得るために本開示が十分に適合されることを容易に理解する。当業者ならその改変およびその他の使用を思いつくであろう。これらの改変は、本開示の趣旨の範囲内に包含され、本開示の非限定的実施形態を記載する特許請求の範囲によって定義される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】