特許 7148539 免疫抱合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-27

(45)【発行日】2022-10-05

(54)【発明の名称】免疫抱合体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220928BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220928BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220928BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220928BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220928BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220928BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220928BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220928BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220928BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220928BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220928BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

C07K14/55

C12N15/26

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12P21/08

A61P35/00

A61K38/20

A61K39/395 T

A61K47/68

【請求項の数】 40

(21)【出願番号】P 2019554366

(86)(22)【出願日】2018-03-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-30

(86)【国際出願番号】 EP2018058037

(87)【国際公開番号】W WO2018184965

(87)【国際公開日】2018-10-11

【審査請求日】2021-01-27

(31)【優先権主張番号】17164538.5

(32)【優先日】2017-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】コダッリ ディーク， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ラウナー， ラウラ

(72)【発明者】

【氏名】ゼーベル， シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ウマーニャ， パブロ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァルトハウアー， イニヤ

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５０６７９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３２１５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０７１４４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１５０４４７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ－２分子であり、ここで、当該アミノ酸置換における番号付けは、ヒトＩＬ－２配列の配列番号２２に対する番号付けであり、
二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合部分；及び
（ｉｉ）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、Ｔｉｍ－３に結合する第２の抗原結合部分
を含む、免疫抱合体。

【請求項2】

第１の抗原結合部分が、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項１に記載の免疫抱合体。

【請求項3】

第２の抗原結合部分が、
（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むか、又は
（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項１又は２に記載の免疫抱合体。

【請求項4】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドが更に、アミノ酸置換Ｔ３Ａ及び／又はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項5】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号２３の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項6】

免疫抱合体が、１つを超えない変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項7】

第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項8】

第１又は第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が、互いに置き換わっている、請求項１～７のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項9】

第１又は第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項10】

第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっており、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインにおいて、位置１２４のアミノ酸が、置換されたリシン（Ｋ）であり（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項11】

二重特異性抗原結合分子が、更に、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項12】

Ｆｃドメインが、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ_１サブクラスのＦｃドメインである、請求項１１に記載の免疫抱合体。

【請求項13】

Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、請求項１１又は１２に記載の免疫抱合体。

【請求項14】

Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項15】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な突起を第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項16】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）、（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項17】

Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１６に記載の免疫抱合体。

【請求項18】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、リンカーペプチドを介して融合する、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項19】

リンカーペプチドが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の免疫抱合体。

【請求項20】

第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合し、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に融合する、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項21】

第１及び第２の抗原結合部分が、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する、請求項２０に記載の免疫抱合体。

【請求項22】

Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１１～２１のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項23】

前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）の群から選択される１つ以上の位置にある、請求項２２に記載の免疫抱合体。

【請求項24】

Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）を含む、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項25】

配列番号２５の配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２６の配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２７の配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２８の配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項26】

免疫抱合体が、変異体ＩＬ－２ポリペプチド及びＩｇＧ_１免疫グロブリン分子からなり、Ｆａｂ分子の１つにおける重鎖及び軽鎖の可変又は定常領域が、互いに置き換わっており、リンカー配列によって接続している、請求項１～２５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫抱合体をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチドであって、免疫抱合体の全ての部分が１つの単離されたポリヌクレオチドにコードされるか、または免疫抱合体の全ての部分が２つ以上の単離されたポリヌクレオチドに分かれてコードされる、ポリヌクレオチド。

【請求項28】

請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、１つ以上のベクター。

【請求項29】

請求項２７に記載のポリヌクレオチド又は請求項２８に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項30】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含む、免疫抱合体を産生する方法であって、（ａ）免疫抱合体の発現に適した条件下、請求項２９に記載の宿主細胞を培養することと、場合により、（ｂ）免疫抱合体を回収することとを含む、方法。

【請求項31】

請求項３０に記載の方法によって産生される、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含む、免疫抱合体。

【請求項32】

請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体と、医薬的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。

【請求項33】

請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む医薬。

【請求項34】

請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、疾患の処置に使用するための医薬。

【請求項35】

前記疾患ががんである、請求項３４に記載の医薬。

【請求項36】

疾患の処置のための医薬の製造における請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体の使用。

【請求項37】

前記疾患ががんである、請求項３６に記載の使用。

【請求項38】

個体において疾患を処置するための医薬であって、請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、治療有効量の医薬的に許容される形態の組成物を含む、医薬。

【請求項39】

前記疾患ががんである、請求項３８に記載の医薬。

【請求項40】

個体において免疫系を刺激するための医薬であって、請求項１～２６又は３１のいずれか一項に記載の免疫抱合体を含む、有効量の医薬的に許容される形態の組成物を含む、医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的に、免疫抱合体に関し、特に、変異体インターロイキン－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含む免疫抱合体に関する。加えて、本発明は、免疫抱合体をコードするポリヌクレオチド分子、並びにかかるポリヌクレオチド分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は更に、変異体免疫抱合体を産生する方法、変異体免疫抱合体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）としても知られ、リンパ球の生成、生存及びホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす１５．５ｋＤａの球状糖タンパク質である。ＩＬ－２は、１３３アミノ酸長であり、その機能に必須な四次構造を形成する４つの平行ではない両親媒性αらせんからなる（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７、４１０－４１３（１９９２））。異なる種由来のＩＬ－２の配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ番号ＮＰ０００５７７（ヒト）、ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）又はＮＰ５１７４２５（チンパンジー）で見出される。

【0003】

ＩＬ－２は、３個の個々のサブユニットからなるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによって、その作用に媒介し、その異なる会合によって、ＩＬ－２に対するアフィニティが異なる受容体形態を生成し得る。α（ＣＤ２５）、β（ＣＤ１２２）及びγ（γ_ｃ、ＣＤ１３２）サブユニットの会合によって、ＩＬ－２のトリマー高アフィニティ受容体が得られる。βサブユニット及びγサブユニットからなるダイマーＩＬ－２受容体は、中程度アフィニティＩＬ－２Ｒと呼ばれる。αサブユニットは、モノマー低アフィニティＩＬ－２受容体を形成する。ダイマー中程度アフィニティＩＬ－２受容体は、トリマー高アフィニティ受容体よりも約１００分の１低いアフィニティでＩＬ－２に結合するが、ダイマー及びトリマーのＩＬ－２受容体バリアントは、両方ともＩＬ－２に結合するとシグナルを伝達することができる（Ｍｉｎａｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１、２４５－２６８ （１９９３））。したがって、α－サブユニットＣＤ２５は、ＩＬ－２シグナル伝達に必須ではない。α－サブユニットは、その受容体に対して高いアフィニティ結合を与え、一方、βサブユニットＣＤ１２２及びγサブユニットは、シグナル伝達にとって重要である（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＣＤ２５を含むトリマーＩＬ－２受容体は、（休止状態の）ＣＤ４^＋フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）^＋制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞によって発現される。これらは、従来の活性化されたＴ細胞でも一時的に誘発され、一方、休止状態では、これらの細胞は、ダイマーＩＬ－２受容体のみを発現する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで一貫して最も高いレベルのＣＤ２５を発現する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５））。

【0004】

ＩＬ－２は、活性化Ｔ細胞、特に、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞によって主に合成される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の増殖及び分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成並びに末梢血リンパ球から細胞毒性細胞及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞への分化を誘発し、Ｔ細胞によるサイトカイン及び細胞溶解性分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖及び分化並びにＢ細胞による免疫グロブリンの合成を容易にし、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生成、増殖及び活性化を刺激する（例えば、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，５９５－６０１（２００９）；Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ，Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４，ＲＡ１７９－８９ （２００８）；Ｍａｌｅｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２６，４５３－７９（２００８）にまとめられている）。

【0005】

ＩＬ－２がリンパ球の集合をｉｎ ｖｉｖｏで拡張する能力と、これらの細胞のエフェクター機能を増加させる能力は、ＩＬ－２に抗腫瘍効果を与え、ＩＬ－２免疫療法を、特定の転移性癌にとって魅力的な処置選択肢にしている。その結果、高用量ＩＬ－２処置は、転移性腎臓癌腫及び悪性黒色腫を有する患者において使用することが承認されてきた。

【0006】

しかし、ＩＬ－２は、エフェクター細胞の拡張及び活性を媒介するだけではなく、末梢免疫耐性の維持に大きく関わっているという点で、免疫応答において二重の機能を有する。

【0007】

末梢自己耐性の根底にある主要な機構は、Ｔ細胞におけるＩＬ－２によって誘発された活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）である。ＡＩＣＤは、完全に活性化されたＴ細胞が、ＣＤ９５（Ｆａｓとも呼ばれる）などの細胞表面で発現するデス受容体又はＴＮＦ受容体の係合によって、プログラムされた細胞死を受けるプロセスである。高アフィニティＩＬ－２受容体を発現する抗原活性化Ｔ細胞（ＩＬ－２に既に曝露した後）、増殖中に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を介し、抗原による再刺激がされると、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及び／又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現が誘発され、細胞が、Ｆａｓ介在性アポトーシスに適したものとなる。このプロセスは、ＩＬ－２依存性であり（Ｌｅｎａｒｄｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３，８５８－６１（１９９１）、ＳＴＡＴ５によって媒介される。Ｔリンパ球におけるＡＩＣＤのプロセスによって、耐性が、自己抗原に対して確立されるだけではなく、腫瘍抗原などの明確に宿主構成物の一部ではない持続性抗原に対しても確立され得る。

【0008】

更に、ＩＬ－２は、末梢ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞の管理にも関与する（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１ （２００５）；Ｄ’Ｃｒｕｚ ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；Ｍａｌｏｙ ａｎｄ Ｐｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１７１－７２ （２００５））、これらは、サプレッサーＴ細胞としても知られる。これらは、エフェクターＴ細胞がその（自己の）標的を破壊するのを、細胞－細胞接触によってＴ細胞の補助及び活性化を阻害することによって、又はＩＬ－１０又はＴＧＦ－βなどの免疫抑制性サイトカインの放出によって、抑制する。Ｔ_ｒｅｇ細胞を消耗させると、ＩＬ－２によって誘発される抗腫瘍免疫が高まることが示された（Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ ９８，４１６－２３ （２００７））。

【0009】

したがって、ＩＬ－２存在下、生成したＣＴＬが、腫瘍を自身で認識し、ＡＩＣＤを受けるか、又は免疫応答が、ＩＬ－２依存性Ｔ_ｒｅｇ細胞によって阻害されるため、ＩＬ－２は腫瘍成長の阻害のために最適とはいえない。

【0010】

ＩＬ－２免疫療法に関連する更なる問題は、組換えヒトＩＬ－２処置によって生じる副作用である。高用量ＩＬ－２処置を摂取する患者は、重篤な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経、皮膚、血液及び全身の有害事象を頻繁に経験し、集中的なモニタリングと入院患者管理が必要となる。これらの副作用の大部分は、いわゆる血管（又は毛細管）の漏れ症状（ＶＬＳ）の進行、複数の臓器における流体漏出を引き起こす血管透過性の病的な増加（例えば、肺及び皮膚の浮腫並びに肝細胞の損傷を引き起こす）、血管内の流体枯渇（血圧の低下、心拍の補償的増加を引き起こす）によって説明することができる。ＩＬ－２の離脱以外のＶＬＳの処置は存在しない。低用量ＩＬ－２レジメンは、ＶＬＳを回避するために患者で試験されたが、最適とはいえない治療結果であった。ＶＬＳは、ＩＬ－２によって活性化されたＮＫ細胞からの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどの炎症性サイトカインの放出によって引き起こされると考えられていた。しかし、近年、ＩＬ－２によって誘発される肺浮腫が、低濃度から中程度の濃度の機能性αβγ ＩＬ－２受容体を発現する肺内皮細胞に対するＩＬ－２の直接的な結合によって生じることが示された（Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７、１１９０６－１１ （２０１０））。

【0011】

ＩＬ－２免疫療法に関連するこれらの問題を克服するために、いくつかの手法が行われてきた。例えば、ＩＬ－２と特定の抗ＩＬ－２モノクローナル抗体との組み合わせは、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－２の処置効果を高める（Ｋａｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７，３０６－１４（２００６）；Ｂｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１，１９２４－２７（２００６））。代替的な手法では、ＩＬ－２は、その毒性を下げ、及び／又はその有効性を高めるために、種々の様式で変異された。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ １０１、４８５３－４８６１（２００３）、米国特許出願公開第２００３／０１２４６７８号）は、ＩＬ－２の血管浸透活性をなくすために、ＩＬ－２の位置３８のアルギニン残基をトリプトファンで置換している。Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２ （２０００））は、ＮＫ細胞よりもＴ細胞に対する選択性を高めるために、アスパラギン８８からアルギニンに変異している。Ｈｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３、２５９７－６０２（１９９３）；米国特許第５，２２９，１０９号）は、ＮＫ細胞からの炎症性サイトカインの分泌を減らすために、Ａｒｇ３８Ａｌａ及びＰｈｅ４２Ｌｙｓの２つの変異を導入した。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００７／００３６７５２号）は、ＶＬＳを減らすために、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対するアフィニティに寄与するＩＬ－２の３つの残基が置換されている（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８Ａｒｇ及びＧｌｎ１２６Ａｓｐ）。Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ ２００８／００３４４７３号）も、有効性を高めるために、アミノ酸置換Ａｒｇ３８Ｔｒｐ及びＰｈｅ４２ＬｙｓによってＩＬ－２とＣＤ２５との界面を変異させ、ＣＤ２５との相互作用と、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化を低下させた。同じ目的のために、Ｗｉｔｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ ２００９／０６１８５３号）は、ＣＤ２５に対するアフィニティを高めたが、受容体を活性化せず、アンタゴニストとして作用するＩＬ－２変異体を製造した。導入される変異は、受容体のβ－サブユニット及び／又はγ－サブユニットとの相互作用を破壊することを目的としたものであった。

【0012】

ＩＬ－２免疫療法に関連する上述の問題（ＶＬＳの誘発によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘発によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴ_ｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制）を克服するために設計された特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、ＷＯ２０１２／１０７４１７号に記載されている。位置４２のフェニルアラニン残基をアラニンに置換、位置４５のチロシン残基をアラニンに置換、ＩＬ－２の位置７２のロイシン残基をグリシンに置換すると、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニットに対するこの変異体ＩＬ－２ポリペプチドの結合が本質的になくなる。

【0013】

上述の手法に更に、ＩＬ－２免疫療法は、例えば、腫瘍細胞で発現する抗原に結合する抗体を含む免疫抱合体の形態で、腫瘍に対してＩＬ－２を選択的に標的化することによって高められてもよい。いくつかのこのような免疫抱合体が記載されている（例えば、Ｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００４）２７，２３２－２３９；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１７）６（３），ｅ１２７７３０６を参照）。

【0014】

しかし、腫瘍は、抗体の標的抗原を削減し、変異させ、又はダウンレギュレーションすることによって、このような標的化から逃避する場合がある。更に、腫瘍を標的とするＩＬ－２は、リンパ球を能動的に除外する腫瘍微小環境において、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのエフェクター細胞と最適な接触をしない場合がある。

【0015】

したがって、ＩＬ－２免疫療法を更に改善することが依然として必要である。腫瘍標的化の問題を回避し得る手法は、エフェクター細胞、特にＣＴＬに対してＩＬ－２を直接的に標的化することである。

【0016】

Ｇｈａｓｅｍｉ ｅｔ ａｌ．は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのＮＫＧ２Ｄを有する細胞に対してＩＬ－２を標的化するための、ＩＬ－２とＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質の融合タンパク質を記載している（Ｇｈａｓｈｅｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ （２０１６） ７、１２８７８）。

【0017】

プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１又はＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞で発現している（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様の細胞外ドメインと、免疫受容体阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなるモノマー型１膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化をダウンレギュレーションすることが示されているＰＤ－１の２種類のリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が特定されている（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔａｌ（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２は、両方ともＰＤ－１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。ＰＤ－１の１つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、種々のヒト腫瘍で豊富である（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用によって、腫瘍浸潤性リンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体が介在する増殖が減少し、癌生細胞による免疫回避が減少する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ． ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。免疫抑制（Ｔ細胞の機能不全又は消耗）は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の局所的相互作用を阻害することによって逆行させることができ、その効果は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の相互作用が同様にブロックされるとき、相加的である。（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ． （２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ７．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ９９：１２２９３－７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７－６６）。

【0018】

しかし、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１経路のみを標的としても、常にＴ細胞消耗の逆行が常に起こるわけではなく（Ｇｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３７ （２００９）、６８２－６９０）、このことは、他の分子がおそらくＴ細胞消耗に関与していることを示している（Ｓａｋｕｉｓｈｉ、Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ． ２０７ （２０１０）、２１８７－２１９４）。

【0019】

Ｔｉｍ－３は、ＩＦＮ－γを分泌するＴｈ１細胞及びＴｃ１細胞で選択的に発現するものであるとして元々特定されている分子である（Ｍｏｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４１５ （２００２）、５３６－５４１）。Ｔｉｍ－３とそのリガンドのガレクチン－９との相互作用は、Ｔｉｍ－３^＋Ｔ細胞における細胞死を引き起こす。したがって、Ｔｉｍ－３及びＰＤ－１は、Ｔ細胞応答の負の制御因子として機能し得る。Ｔｉｍ－３が、固体悪性腫瘍及び血液悪性腫瘍の前臨床モデルにおいて、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の最も抑制されているか、又は機能不全の集合を記録することが示された（Ｓａｋｕｉｓｈｉ、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ．２０７（２０１０）、２１８７－２１９４；Ｚｈｏｕ、Ｂｌｏｏｄ １１７（２０１１）、４５０１－４５１０；Ｍａｊｅｔｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、１０６（２００９）、３３９６－３４０１）。これらのモデルにおいて、全てのＣＤ８＋Ｔｉｍ－３＋Ｔ細胞が、ＰＤ－１を一緒に発現し、これらの二重発現細胞は、両細胞周期の進行及びエフェクターサイトカイン産生［インターロイキン（ＩＬ）－２、ＴＮＦ及びＩＦＮ－γ］において、ＰＤ－１のみを発現する細胞よりも、大きな欠陥を示す。したがって、Ｔｉｍ－３経路は、ＰＤ－１経路と協働し、癌におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞の表現型の重篤な機能不全の進行を促進し得る。従って、Ｔｉｍ－３及びＰＤ－１経路を組み合わせた標的化は、腫瘍成長を制御する際に非常に効果的であると予想される。

【0020】

ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗体は、例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９２号に記載される。これらの二重特異性抗体は、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３両方の抗原を発現するＴ細胞でＰＤ－１及びＴｉｍ－３を効果的にブロックするだけではなく、これらの細胞に非常に選択的であり、それによって、固有の免疫細胞（例えば、ネイティブ樹状細胞（ＤＣ）及び単球）などの他の細胞上でＴｉｍ－３のブロックに関連する副作用を避け得る。

【発明の概要】

【0021】

本発明は、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクター細胞、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球に対する直接的な免疫療法にとって有利な特性を有する、ＩＬ－２の変異体形態を標的とする新規な手法を提供する。免疫エフェクター細胞に対する標的化は、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子に対する変異体ＩＬ－２分子の接合によって達成される。

【0022】

本発明で使用されるＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２免疫療法に関連する問題、特に、ＶＬＳの誘発によって引き起こされる毒性、ＡＩＣＤの誘発によって引き起こされる腫瘍耐性、及びＴ_ｒｅｇ細胞の活性化によって引き起こされる免疫抑制を克服するために設計されてきた。上述の腫瘍標的化からの腫瘍の逃避を迂回することに加え、免疫エフェクター細胞に対するＩＬ－２変異体の標的化によって、更に、免疫抑制性Ｔ_ｒｅｇ細胞よりもＣＴＬの優先的な活性化を増大させ得る。ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子を使用することによって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路及び／又はＴｉｍ－３によって誘発されるＴ細胞活性の抑制を更に逆行させ、そのため、免疫応答を高め得る。ＰＤ－１及びＴｉｍ－３の標的化を組み合わせると、特に、両抗原を発現する疲弊したＴ細胞に対する免疫抱合体の標的化を更に高める。

【0023】

第１の態様では、本発明は、免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ－２分子であり（ヒトＩＬ－２配列の配列番号２２に対する番号付け）、二重特異性抗原結合分子が、（ｉ）ＰＤ－１に結合する第１の抗原結合部分と、（ｉｉ）Ｔｉｍ－３に結合する第２の抗原結合部分とを含む、免疫抱合体を提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むか、又は（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは更に、アミノ酸置換Ｔ３Ａ及び／又はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む。いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２３の配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫抱合体は、１つを超えない変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。いくつかの実施形態では、第１又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっている。いくつかの実施形態では、第１又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっており、前記第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインにおいて、位置１２４のアミノ酸が、置換されたリシン（Ｋ）であり（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって、特にアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0028】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は更に、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧクラス、特に、ＩｇＧ_１サブクラスのＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、もっと小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合により、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかのこのような実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0029】

いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つ（特に、Ｆｃの第１のサブユニット）のカルボキシ末端アミノ酸に、場合によりリンカーペプチドを介して融合する。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。

【0030】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に、特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに融合し、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に、特に、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに融合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。

【0031】

いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特に、Ｆｃγ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能、特に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかのこのような実施形態では、前記１つ以上のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）の群から選択される１つ以上の位置にある。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスの番号付け）を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、免疫抱合体は、配列番号２５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２７の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２８の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、免疫抱合体は、変異体ＩＬ－２ポリペプチド及びＩｇＧ_１免疫グロブリン分子から本質的になり、Ｆａｂ分子の１つにおける重鎖及び軽鎖の可変又は定常領域が、互いに置き換わっており、リンカー配列によって接続している。

【0034】

本発明は、更に、本発明の免疫抱合体をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター（特に、発現ベクター）、及び前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0035】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含む、免疫抱合体を産生する方法であって、（ａ）前記免疫抱合体の発現に適した条件下、本発明の宿主細胞を培養することと、場合により、（ｂ）前記免疫抱合体を回収することとを含む、方法も提供される。また、本発明によって提供されるのは、この方法によって提供される、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含む、免疫抱合体である。

【0036】

本発明は更に、本発明の免疫抱合体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物、及び本発明の免疫抱合体を使用する方法を提供する。

【0037】

特に、本発明は、医薬として使用するための、また、疾患の処置に使用するための本発明に係る免疫抱合体を包含する。特定の実施形態では、前記疾患は、癌である。

【0038】

ある疾患の処置のための医薬の製造における本発明に係る免疫抱合体の使用も、本発明に包含される。特定の実施形態では、前記疾患は、癌である。

【0039】

個体において疾患を処置する方法であって、治療有効量の本発明に係る免疫抱合体を含む組成物を医薬的に許容される形態で前記個体に投与することを含む、方法が更に提供される。特定の実施形態では、前記疾患は、癌である。

【0040】

個体において免疫系を刺激する方法であって、有効量の本発明に係る免疫抱合体を含む組成物を医薬的に許容される形態で前記個体に投与することを含む、方法も提供される。

【0041】

発明の詳細な説明
（定義）
用語は、以下に他の意味であると定義されていない限り、当該技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。

【0042】

「インターロイキン－２」又は「ＩＬ－２」との用語は、本明細書で使用される場合、特に示されていない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＩＬ－２を指す。この用語は、未処理のＩＬ－２と、細胞の処理から生じるＩＬ－２の任意の形態を包含する。この用語は、ＩＬ－２の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を配列番号２２に示す。未処理のヒトＩＬ－２は、さらに、成熟ＩＬ－２分子には存在しない、配列番号３２の配列を有するＮ末端２０アミノ酸シグナルペプチドを含む。

【0043】

「ＩＬ－２変異体」又は「変異体ＩＬ－２ポリペプチド」との用語は、本明細書で使用される場合、全長ＩＬ－２、ＩＬ－２の先端切断された形態、ＩＬ－２が融合又は化学的抱合などによって別の分子に連結した形態を含め、ＩＬ－２分子の種々の形態の任意の変異体形態を包含することを意図している。「全長」は、ＩＬ－２を参照して使用される場合、成熟した天然の長さのＩＬ－２分子を意味することを意図している。例えば、全長ヒトＩＬ－２は、１３３個のアミノ酸を含む分子を指す（例えば、配列番号２２）。種々の形態のＩＬ－２変異体は、ＩＬ－２とＣＤ２５との相互作用に影響を与える少なくとも１つのアミノ酸変異を有することを特徴とする。この変異は、その位置に通常配置される野生型アミノ酸残基の置換、欠失、先端切断又は改変を含んでいてもよい。アミノ酸置換によって得られる変異体が好ましい。特に示されない限り、ＩＬ－２変異体は、本明細書では、変異体ＩＬ－２ペプチド配列、変異体ＩＬ－２ポリペプチド、変異体ＩＬ－２タンパク質又は変異体ＩＬ－２アナログと呼ばれてもよい。

【0044】

ＩＬ－２の種々の形態の命名は、本明細書では、配列番号２２に示される配列に対して行われる。同じ変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用してもよい。例えば、位置４２でのフェニルアラニンからアラニンへの変異は、４２Ａ、Ａ４２、Ａ_４２、Ｆ４２Ａ又はＰｈｅ４２Ａｌａとして示すことができる。

【0045】

「ヒトＩＬ－２分子」とは、本明細書で使用される場合、配列番号２２のヒトＩＬ－２配列に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９６％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２分子を意味する。特に、配列同一性は、少なくとも約９５％、更に特定的には、少なくとも約９６％である。特定的な実施形態では、ヒトＩＬ－２分子は、全長ＩＬ－２分子である。

【0046】

「アミノ酸変異」との用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び改変を包含することを意味している。置換、欠失、挿入及び改変の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、ＣＤ２５に対する結合の低下を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。末端の欠失の一例は、全長ヒトＩＬ－２の位置１にあるアラニン残基の欠失である。好ましいアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例えば、ＩＬ－２ポリペプチドの結合特徴を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。好ましいアミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸によって置き換えることを含む。アミノ酸置換としては、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、又は２０種類の標準的なアミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリシン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが挙げられる。アミノ酸変異は、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用いて作成することができる。遺伝的方法としては、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などが挙げられ得る。遺伝子操作以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。

【0047】

本明細書で使用される場合、ＩＬ－２の「野生型」形態は、野生型形態が、変異体ＩＬ－２ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸位置に野生型アミノ酸を有する以外は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと同じＩＬ－２の形態である。例えば、ＩＬ－２変異体が、全長ＩＬ－２である（すなわち、ＩＬ－２が、任意の他の分子に融合又は接合していない）場合、この異性体の野生型形態は、全長ネイティブヒトＩＬ－２である。ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２とＩＬ－２の下流（例えば、抗体鎖）をコードする別のポリペプチドとの融合である場合、このＩＬ－２異性体の野生型形態は、同じ下流のポリペプチドに融合した、野生型アミノ酸配列を有するＩＬ－２である。更に、ＩＬ－２変異体が、ＩＬ－２の先端切断された形態（ＩＬ－２の先端切断されていない部分の中の変異した形態又は改変された形態）である場合、このＩＬ－２変異型の野生型形態は、同様に、野生型配列を有する先端切断されたＩＬ－２である。種々の形態のＩＬ－２変異体のＩＬ－２受容体結合アフィニティ又は生体活性を、対応するＩＬ－２の野生型形態と比較する目的のために、野生型との用語は、天然に存在するネイティブＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２受容体結合に影響を与えない１つ以上のアミノ酸変異（例えば、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置のシステインをアラニンに置換）を含むＩＬ－２の形態を包含する。いくつかの実施形態では、本発明の目的のための野生型ＩＬ－２は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａを含む（配列番号３９を参照）。本発明に係る特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと比較される野生型ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。

【0048】

「ＣＤ２５」又は「ＩＬ－２受容体のα－サブユニット」との用語は、本明細書で使用される場合、特に示されていない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ２５を指す。この用語は、「全長」の未処理のＣＤ２５と、細胞の処理から生じるＣＤ２５の任意の形態を包含する。この用語は、ＣＤ２５の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。特定の実施形態では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。ヒトＣＤ２５のアミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）で見出される。

【0049】

「高アフィニティＩＬ－２受容体」との用語は、本明細書で使用される場合、受容体γ－サブユニット（共通のサイトカイン受容体γ－サブユニット、γ_ｃ、又はＣＤ１３２、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ１４７８４（バージョン１９２）を参照）、受容体β－サブユニット（ＣＤ１２２又はｐ７０としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ３１７８５（バージョン１９７）を参照）及び受容体α－サブユニット（ＣＤ２５又はｐ５５としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｐ０１５８９（バージョン１８５）を参照）からなる、ＩＬ－２受容体のヘテロトリマー形態を指す。「中程度アフィニティＩＬ－２受容体」との用語は、対照的に、γ－サブユニット及びβ－サブユニットのみを含み、α－サブユニットを含まないＩＬ－２受容体を指す（総説としては、例えば、Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ ａｎｄ Ｋａｓｐｒｚａｋ、Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ １４、ＲＡ１７９－１８９ （２００８）を参照）。

【0050】

「アフィニティ」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合対（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合アフィニティ」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合アフィニティを指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対するアフィニティは、一般的に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じである限り、等価なアフィニティが、異なる速度定数を含む場合がある。アフィニティは、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。アフィニティを測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0051】

ＩＬ－２受容体の種々の形態についての変異体又は野生型のＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティは、ＷＯ ２０１２／１０７４１７号に記載する方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と、組換え発現によって得られ得るような受容体サブユニットとを用い、決定することができる（例えば、Ｓｈａｎａｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２（２０００）を参照）。又は、ＩＬ－２受容体の異なる形態に対するＩＬ－２変異体の結合アフィニティは、１つの又は他のこのような形態の受容体を発現することが知られている細胞株を用いて評価されてもよい。結合アフィニティを測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態を、本明細書で以下に記載する。

【0052】

「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔ_ｒｅｇ細胞とは、他のＴ細胞の応答を抑制し得る特殊な種類のＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）のα－サブユニット及び転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現によって特徴付けられ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２、５３１－６２（２００４））、腫瘍によって発現するものを含め、抗原に対する末梢自己耐性の導入及び維持に重要な役割を果たす。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、その機能及び成長、その抑制特徴の誘発のために、ＩＬ－２を必要とする。

【0053】

本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」との用語は、ＩＬ－２の細胞毒性効果を媒介するリンパ球の集合を指す。エフェクター細胞としては、エフェクターＴ細胞、例えば、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びマクロファージ／単球が挙げられる。

【0054】

本明細書で使用される場合、「ＰＤ１」、「ヒトＰＤ１」、「ＰＤ－１」又は「ヒトＰＤ－１」（プログラムされた細胞死タンパク質１、又はプログラムされた死１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １）としても知られる）は、ヒトタンパク質ＰＤ１（配列番号３３、シグナル配列を含まないタンパク質）／（配列番号３４、シグナル配列を含むタンパク質）を指す。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ１５１１６（バージョン１５６）も参照。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１に結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＰＤ－１）」、「ＰＤ－１に特異的に結合する」、「ＰＤ－１に結合する（ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＰＤ－１）」又は抗体（又は抗原結合部分）又は「抗ＰＤ－１抗体」は、抗体が、ＰＤ－１を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、ＰＤ－１に、特に、細胞表面で発現するＰＤ－１ポリペプチドに結合可能な抗体（又は抗原結合部分）を指す。一実施形態では、無関係な非ＰＤ－１タンパク質に対する抗ＰＤ－１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ－１に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗体（又は抗原結合部分）は、ヒトＰＤ－１に対する結合に関する結合アフィニティのＫＤ値が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。一実施形態では、結合アフィニティのＫＤ値は、ヒトＰＤ－１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ－１－ＥＣＤ、配列番号３５を参照）を抗原として用いた表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。

【0055】

本明細書で使用される場合、「Ｔｉｍ－３」、「ヒトＴｉｍ－３」、「ＴＩＭ３」又は「ヒトＴＩＭ３」（「Ｔ細胞 疫グロブリン及びムチンドメインを含む分子３」としても知られる）との用語は、ヒトタンパク質Ｔｉｍ－３（配列番号３６、シグナル配列を含まないタンパク質）／（配列番号３７、シグナル配列を含むタンパク質）と呼ばれる。ＵｎｉＰｒｏｔエントリー番号Ｑ８ＴＤＱ０（バージョン１２３）も参照。本明細書で使用される場合、「Ｔｉｍ－３に結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｔｉｍ－３）」、「Ｔｉｍ－３に特異的に結合する」、「Ｔｉｍ－３に結合する（ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ｔｏ Ｔｉｍ－３）」抗体（又は抗原結合ドメイン）又は「抗Ｔｉｍ－３抗体」は、抗体が、Ｔｉｍ－３を標的とする際に診断及び／又は治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティで、Ｔｉｍ－３に、特に、細胞表面で発現するＴｉｍ－３ポリペプチドに結合可能な抗体（又は抗原結合ドメイン）を指す。一実施形態では、無関係な非Ｔｉｍ－３タンパク質に対する抗Ｔｉｍ－３抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、Ｔｉｍ－３に対する抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する抗体（又は抗原結合部分）は、ヒトＴｉｍ－３に対する結合に関する結合アフィニティのＫＤ値が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）である。一実施形態では、結合アフィニティのＫＤ値は、ヒトＴｉｍ－３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｔｉｍ－３－ＥＣＤ、配列番号３８を参照）を抗原として用いた表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。

【0056】

「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。抗体が特定の抗原（例えば、ＰＤ－１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られた他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７、３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８、２１７－２２９ （２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗体の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。本明細書に記載の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の抗原結合部分は、ＰＤ－１又はＴｉｍ－３に特異的に結合する。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」との用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線形に接続したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」との用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」との用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、又は相互に置き換え可能に使用されてもよい。「ポリペプチド」との用語も、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、又は天然に存在しないアミノ酸による改変を含め、ポリペプチドの発現後改変の産物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生体源から誘導されてもよく、又は組換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されなくてもよい。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で作られてもよい。ポリペプチドは、所定の三次元構造を有していてもよいが、ポリペプチドは、このような構造を必ずしも有していなければならないわけではない。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると呼ばれ、所定の三次元構造を有しておらず、むしろ多数の異なる配座をとり得るポリペプチドは、折りたたまれていないと呼ばれる。

【0058】

「単離された」ポリペプチド又はそのバリアント、又はその誘導体は、その天然の環境にはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと考えられ、任意の適切な技術によって、分離され、フラクション化され、又は部分的又は実質的に精製される、ネイティブポリペプチド又は組換えポリペプチドである。

【0059】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするのに適切なパラメータを決定することができる。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラム用い、又はその後のＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて作成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」、ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９６） 「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」 Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６：２２７－２５８；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（１９９７） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって記載されており、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．から公的に入手可能である。又は、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用し、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。

【0060】

「ポリヌクレオチド」との用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」との用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを指す。

【0061】

「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞内に維持されるか、又は溶液中で精製される（部分的に、又は実質的に）、組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々そのポリヌクレオチド分子を含む細胞に含まれているが、そのポリヌクレオチド分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在するポリヌクレオチド分子を含む。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明に係る単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、更に、合成によって作られるこのような分子を含む。これに加え、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなどの制御要素であってもよく、又はこれらの制御要素を含んでいてもよい。

【0062】

「［例えば、本発明の免疫抱合体］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖及び／又はＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、このような核酸分子が宿主細胞の１つ以上の位置に存在するこのようなポリヌクレオチド分子を含む。

【0063】

「発現カセット」との用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、本発明の免疫抱合体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。

【0064】

「ベクター」又は「発現ベクター」との用語は、細胞に作動可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入し、指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及び導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定なｍＲＮＡを大量に転写することができる。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質は、細胞内転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、本発明の免疫抱合体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む発現カセットを含む。

【0065】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」との用語は、相互に置き換え可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、又は選択されるのと同じ機能又は生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の免疫抱合体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。

【0066】

本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望な抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含む。

【0067】

本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及びその誘導体（例えばフラグメント）である。

【0068】

「二重特異性」との用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。

【0069】

「価数」との用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、「抗原に対する一価の結合」との用語は、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つ（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。

【0070】

「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基）を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。

【0071】

本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」との用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施形態では、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞に接続する部分（例えば、ＩＬ－２ポリペプチド）に指向することができる。抗原結合部分は、本明細書に更に定義される抗体及びそのフラグメントを含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、当該技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５種類のアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。

【0072】

本明細書で使用される場合、「抗原決定基」との用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞表面に、ウイルス感染した細胞表面に、他の疾患細胞表面に、免疫細胞表面に、血清中に遊離状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に見出されてもよい。

【0073】

「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指す。すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。このようなバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法、本明細書に記載するモノクローナル抗体を作るためのこのような方法及び他の例示的な方法を含め、種々の技術によって作られてもよい。

【0074】

「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された（すなわち、その天然環境にはない）ものである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離された抗体は、そのネイティブ環境又は天然環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生された抗体は、本発明の目的のために単離されたと考えられ、 は、任意の適切な技術によって、分離され、フラクション化され、又は部分的又は実質的に精製される、ネイティブ抗体又は組換え抗体である。このように、本発明の免疫抱合体は、単離される。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）方法によって決定される場合、純度が９５％より大きく、又は９９％より大きくなるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照。

【0075】

「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。

【0076】

「抗体フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及びシングルドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照。ｓｃＦｖフラグメントの総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照。また、ＷＯ ９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ ４０４，０９７号、ＷＯ １９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載される。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。

【0077】

「免疫グロブリン分子」との用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ_１（ＩｇＧ_１）、γ_２（ＩｇＧ_２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）及びα_２（ＩｇＡ_２）などの更なるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとからなる。

【0078】

「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインからなるタンパク質を指す。

【0079】

「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「クロスｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換された（すなわち、互いに置き換えられた）Ｆａｂ分子を意味する。すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。

【0080】

これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）とを含む。

【0081】

「抗原結合ドメイン」との用語は、ある抗原の一部又は全てに特異的に結合し、ある抗原の一部又は全てに対して相補的な抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。

【0082】

「可変領域」又は「可変ドメイン」との用語は、抗原に対する抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分な場合がある。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１）によって記載される番号付けシステムを指す。

【0083】

本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ （１９９１）に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる。特定的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０ページを参照）を、κ及びλアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３ページを参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と言及することによって更に明確にしている。

【0084】

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」との用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。本発明の例示的なＨＶＲとしては、以下のものが挙げられる。

【0085】

（ａ） アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ） アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；
（ｃ） アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに
（ｄ） （ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ、ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）及び９４－１０２（Ｈ３）を含む。

【0086】

特に示されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）に従って本明細書では番号付けされる。

【0087】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順位で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0088】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。このような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又はアフィニティを回復するか、又は向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基に由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に改変されるか、又は変更されているものである。

【0089】

「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施形態では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体フラグメントも、本発明のヒト抗体又はヒト抗体フラグメントであると考えられる。

【0090】

抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。５種類の主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１及びＩｇＡ_２に分けられてもよい。免疫グロブリンの異なる種類に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。

【0091】

「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで延びると定義される。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい（本明細書で「開裂下バリアント重鎖」とも呼ばれる）。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリシン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリシン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施形態では、本発明に係る免疫抱合体に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施形態では、本発明に係る免疫抱合体に含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、本発明の免疫抱合体の集合を含む。免疫抱合体の集合は、全長長鎖を含む分子と、開裂したバリアント重鎖を含む分子とを含んでいてもよい。免疫抱合体の集合は、全長重鎖を有する分子と、開裂したバリアント重鎖を有する分子との混合物からなっていてもよく、免疫抱合体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、開裂したバリアント重鎖を有する。本発明の一実施形態では、本発明の免疫抱合体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫抱合体を含む。本発明の一実施形態では、本発明の免疫抱合体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む免疫抱合体を含む。本発明の一実施形態では、このような組成物は、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子で構成される免疫抱合体の集合を含む。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照）に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、ダイマーＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドの１つ（すなわち、安定な自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチド）を指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３の定常ドメインを含む。

【0092】

「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変」は、ホモダイマーを形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を減らすか又は防ぐ、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後改変である。会合を促進する改変は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）それぞれに対し、別個の改変を含み、改変は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補性である。例えば、会合を促進する改変は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合する更なる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの実施形態では、会合を促進する改変は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、特定的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、会合を促進する改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、別個のアミノ酸変異、特定的にはアミノ酸置換を含む。

【0093】

「エフェクター機能」との用語は、抗体に言及しつつ使用される場合、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。

【0094】

抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、一般的にＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣの低下」との用語は、所与の時間で、標的細胞の周囲の培地中、所与の抗体濃度で溶解する標的細胞の数の減少、上に定義されるＡＤＣＣの機構によって、及び／又は所与の時間に、ＡＤＣＣの機構によって所与の数の標的細胞の溶解を達成するのに必要な、標的細胞の周囲にある培地中の抗体濃度の増加として定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な産生、精製、配合及び保存方法を用い（当業者には既知）、同じ種類の宿主細胞によって作られるが、操作されない同じ抗体が媒介するＡＤＣＣに対するものである。例えば、そのＦｃドメインを含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下である、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００６／０８２５１５号又はＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１２／１３０８３１号を参照）。

【0095】

「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「操作する、操作される、操作すること」との用語は、天然に存在するか、又は組換えポリペプチド又はこれらのフラグメントのペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後改変を含むと考えられる。操作とは、アミノ酸配列の改変、グリコシル化パターンの改変、又は個々のアミノ酸の側鎖基の改変、及びこれらの手法の組み合わせを含む。

【0097】

「結合の低下」、例えば、Ｆｃ受容体またはＣＤ２５に対する結合の低下は、例えばＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についてのアフィニティの低下を指す。明確性のために、この用語は、アフィニティがゼロまで低下する（又は分析方法の検出限界未満になる）こと、すなわち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合アフィニティの増加を指す。

【0098】

本明細書で使用される場合、「免疫抱合体」との用語は、少なくとも１つのＩＬ－２分子と少なくとも１つの抗体とを含むポリペプチド分子を指す。ＩＬ－２分子は、種々の相互作用によって、本明細書に記載の種々の構成で、抗体に接続することができる。特定的な実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを介して抗体に融合する。本発明に係る特定の免疫抱合体は、１つ以上のリンカー配列によって接続する、１つのＩＬ－２分子と、抗体（例えば二重特異性抗原結合分子）から本質的になる。

【0099】

「融合する」とは、構成要素（例えば、抗体及びＩＬ－２分子）が、ペプチド結合によって直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。

【0100】

本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインサブユニットなどに関する「第１」及び「第２」の用語は、それぞれの種類の部分が１つより多く存在する場合に、区別するのが簡便なように使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、免疫抱合体の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。

【0101】

ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。

【0102】

ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望な治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。ある薬剤の治療有効量は、例えば、ある疾患の副作用をなくし、減らし、遅らせ、最低限にし、又は防ぐ。

【0103】

「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は被験体は、ヒトである。

【0104】

「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、組成物が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。

【0105】

「医薬的に許容される担体」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、被験体にとって毒性ではない成分を指す。医薬的に許容される担体としては、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。

【0106】

本明細書で使用される場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において疾患の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。所望な処置効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減又は緩和、回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の免疫抱合体を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。

【発明を実施するための形態】

【0107】

変異体ＩＬ－２ポリペプチド
本発明に係る免疫抱合体は、免疫療法にとって有利な特性を有する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。特に、毒性に寄与するが、ＩＬ－２の有効性にとって必須ではないＩＬ－２の薬理学的特性は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドでは除去される。このような変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＷＯ ２０１２／１０７４１７号に詳細に記載される。上述のように、異なる形態のＩＬ－２受容体は、異なるサブユニットからなり、ＩＬ－２に対して異なるアフィニティを示す。中程度アフィニティＩＬ－２受容体は、β及びγ受容体サブユニットからなり、休止状態のエフェクター細胞で発現し、ＩＬ－２シグナル伝達にとって十分である。高アフィニティＩＬ－２受容体は、受容体のα－サブユニットを更に含み、制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞及び活性化されたエフェクター細胞で主に発現し、ＩＬ－２による係合によって、それぞれ、Ｔ_ｒｅｇ細胞が介在する免疫抑制又は活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を促進することができる。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対するＩＬ－２のアフィニティが低下するか、又はなくなると、制御性Ｔ細胞によるエフェクター細胞機能のＩＬ－２によって誘発されるダウンレギュレーションと、ＡＩＣＤプロセスによる腫瘍耐性の進行が減るはずである。一方、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対するアフィニティの維持は、ＩＬ－２によるＮＫ細胞及びＴ細胞などのエフェクター細胞の増殖及び活性化の誘発を保存すべきである。

【0108】

本発明に係る免疫抱合体に含まれる変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドは、それぞれの野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティをなくすか、又は減らし、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティを保存する、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。

【0109】

ＣＤ２５に対するアフィニティが低下したヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の変異体は、例えば、アミノ酸位置３５、３８、４２、４３、４５又は７２、又はこれらの組み合わせ（配列番号２２のヒトＩＬ－２配列に対する番号付け）でのアミノ酸置換によって作られてもよい。例示的なアミノ酸置換としては、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｆ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｗ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｋ４３Ｅ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋが挙げられる。本発明の免疫抱合体で有用な特定のＩＬ－２変異体は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５又は７２に対応するアミノ酸位置、又はこれらの組み合わせにアミノ酸変異を含む。一実施形態では、前記アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換であり、より特定的には、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇの群から選択されるアミノ酸置換である。これらの変異体は、中程度アフィニティＩＬ－２受容体と実質的に同様の結合アフィニティを示し、ＩＬ－２変異体の野生型形態と比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニット及び高アフィニティＩＬ－２受容体に対するアフィニティがかなり低下している。

【0110】

有用な変異体の他の特徴としては、ＩＬ－２受容体を含むＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の増殖を誘発する能力、ＩＬ－２受容体を含むＴ細胞及び／又はＮＫ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力、ＮＫ細胞によって二次サイトカインとしてインターフェロン（ＩＦＮ）－γを生成する能力、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による二次サイトカイン（特に、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－α）の生成を誘発する能力の低下、制御性Ｔ細胞を活性化する能力の低下、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する能力の低下、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールの低下が挙げられ得る。

【0111】

本発明に有用な特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティがないか、又は低いが、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティを保存する３アミノ酸変異を含む。一実施形態では、前記３アミノ酸変異は、ヒトＩＬ－２の残基４２、４５及び７２に対応する位置にある。一実施形態では、前記３アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、前記３アミノ酸変異は、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｎ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、Ｙ４５Ｋ、Ｌ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｒ及びＬ７２Ｋの群から選択されるアミノ酸置換である。具体的な実施形態では、前記３アミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（配列番号２２のヒトＩＬ－２配列に対する番号付け）である。

【0112】

特定の実施形態では、前記アミノ酸変異は、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティを少なくとも５分の１、特定的には少なくとも１０分の１、より特定的には少なくとも２５分の１まで下げる。ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティを下げる１つより多いアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティを少なくとも３０分の１、少なくとも５０分の１、又は更に少なくとも１００分の１まで下げてもよい。一実施形態では、前記アミノ酸変異、又はアミノ酸変異の組み合わせは、表面プラズモン共鳴によって結合が検出可能ではないように、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティをなくす。

【0113】

中程度アフィニティ受容体に対して実質的に同様に結合すること（すなわち、前記受容体に対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティの保存）は、ＩＬ－２変異体が、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２変異体の野生型のアフィニティの約７０％より大きなアフィニティを示す場合に達成される。本発明のＩＬ－２変異体は、このようなアフィニティの約８０％より大きく、さらには約９０％より大きいアフィニティを示してもよい。

【0114】

ＩＬ－２のＯ－グリコシル化をなくすことと組み合わせて、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットについてのＩＬ－２のアフィニティを下げると、改良された特性を有するＩＬ－２タンパク質が得られる。例えば、Ｏ－グリコシル化部位がないと、変異体ＩＬ－２ポリペプチドがＣＨＯ細胞又はＨＥＫ細胞などの哺乳動物細胞で発現するときに、より均一な産物が得られる。

【0115】

したがって、特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置にＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位がない更なるアミノ酸変異を含む。一実施形態では、ヒトＩＬ－２の残基３に対応する位置にあるＩＬ－２のＯ－グリコシル化部位をなくす更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ及びＴ３Ｐが挙げられる。具体的な実施形態では、前記更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｔ３Ａである。

【0116】

特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、本質的に、全長ＩＬ－２分子である。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２分子である。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、変異のない配列番号２２を含むＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティをなくすか、又は減らすが、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対する変異体ポリペプチドのアフィニティを保存する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号２２の配列を含む。別の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、変異のない配列番号３９を含むＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体のα－サブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドのアフィニティをなくすか、又は減らすが、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対する変異体ポリペプチドのアフィニティを保存する少なくとも１つのアミノ酸変異を有する配列番号３９の配列を含む。

【0117】

具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、活性化されたＴリンパ球細胞の増殖、活性化されたＴリンパ球細胞の分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化されたＢ細胞の増加、活性化されたＢ細胞の分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、活性化されたＴ細胞又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、ＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される１つ以上の細胞応答を誘発することができる。

【0118】

一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、制御性Ｔ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力が低下している。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｔ細胞における活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）をほとんど誘発しない。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールが低下している。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、血清半減期が長くなっている。

【0119】

本発明で有用な特定の変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基３、４２、４５及び７２に対応する位置に４つのアミノ酸置換を含む。具体的なアミノ酸置換は、Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。ＷＯ ２０１２／１０７４１７号に示されるように、前記四重変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＣＤ２５に対する検出可能な結合を示さず、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する能力の低下、Ｔ_ｒｅｇ細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を誘発する能力の低下、及びｉｎ ｖｉｖｏでの毒性プロフィールの低下を示す。しかし、エフェクター細胞においてＩＬ－２シグナル伝達を活性化する能力、エフェクター細胞の増殖を誘発する能力、ＮＫ細胞により二次サイトカインとしてＩＦＮ－γを生成する能力を保持している。

【0120】

更に、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ＷＯ ２０１２／１０７４１７号に記載されるように、表面疎水性の低下、良好な安定性及び良好な発現収率などの更に有利な特性を有する。予想できないことだが、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、血清半減期も長くなっている。

【0121】

本発明で有用なＩＬ－２変異体は、ＣＤ２５又はグリコシル化部位を有するＩＬ－２の界面を形成するＩＬ－２の領域に変異を有することに加え、これらの領域の外側のアミノ酸配列に１つ以上の変異を有していてもよい。ヒトＩＬ－２におけるこのような更なる変異は、発現又は安定性の増加などの更なる利点を与えてもよい。例えば、位置１２５のシステインは、セリン、アラニン、トレオニン又はバリンなどの中性アミノ酸と置き換わっていてもよく、米国特許第４，５１８，５８４号に記載されるように、それぞれ、Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２、Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２、Ｃ１２５Ｔ ＩＬ－２又はＣ１２５Ｖ ＩＬ－２が得られる。ここに記載されるように、ＩＬ－２のＮ末端アラニン残基を欠失すると、ｄｅｓ－Ａ１ Ｃ１２５Ｓ又はｄｅｓ－Ａ１ Ｃ１２５Ａなどの変異体が得られ得る。これに代えて、又はこれと組み合わせて、ＩＬ－２変異体は、変異を含んでいてもよく、それにより、野生型ヒトＩＬ－２の位置１０４に通常存在するメチオニンが、アラニンなどの中性アミノ酸と置き換わっている（米国特許第５，２０６，３４４号を参照）。得られる変異体、例えば、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ ＩＬ－２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２、Ｍ１０４Ａ ＩＬ－２、Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２、ｄｅｓ－Ａ１ Ｍ１０４Ａ Ｃ１２５Ａ ＩＬ－２又はＭ１０４Ａ Ｃ１２５Ｓ ＩＬ－２（これらの変異体及び他の変異体は、米国特許第５，１１６，９４３号及びＷｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０、２９５－３００ （１９８９）に見出される）を、本発明の特定のＩＬ－２変異と組み合わせて使用してもよい。

【0122】

したがって、特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、ヒトＩＬ－２の残基１２５に対応する位置に、更なるアミノ酸変異を含む。一実施形態では、前記更なるアミノ酸変異は、アミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。

【0123】

当業者は、どの更なる変異が、本発明の目的にとって更なる利点を与え得るかを決定することができる。例えば、中程度アフィニティＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２のアフィニティを下げるか、又はなくすＩＬ－２配列のアミノ酸変異、例えば、Ｄ２０Ｔ、Ｎ８８Ｒ又はＱ１２６Ｄ（例えば、ＵＳ ２００７／００３６７５２号を参照）は、本発明に係る変異体ＩＬ－２ポリペプチドに含むことが適切ではない場合があることを理解する。

【0124】

一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号２２のヒトＩＬ－２配列と比較して、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、又は５以下のアミノ酸変異を含む。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、対応する野生型ＩＬ－２配列、例えば、配列番号２２のヒトＩＬ－２配列と比較して、５以下のアミノ酸変異を含む。

【0125】

一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２３の配列を含む。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号２３の配列からなる。

【0126】

免疫抱合体
本明細書に記載の免疫抱合体は、ＩＬ－２分子と、二重特異性抗原結合分子とを含む。このような免疫抱合体は、ＩＬ－２を例えば腫瘍微小環境に直接的に標的化することによって、ＩＬ－２治療の有効性を顕著に高める。本発明によれば、免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、全抗体又は免疫グロブリン、又は抗原特異的な結合アフィニティなどの生物学的機能を有するこれらの一部又はバリアントであってもよい。

【0127】

免疫抱合体治療の一般的な利益は、容易に明らかである。例えば、免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、腫瘍特異的なエピトープを認識し、腫瘍部位に対し、免疫抱合体分子が標的化される。したがって、高濃度のＩＬ－２を腫瘍微小環境に送達することができ、それによって、未抱合ＩＬ－２で必要とされるよりもかなり少ない用量の免疫抱合体を用い、本明細書に述べた種々の免疫エフェクター細胞の活性化及び増殖が引き起こされる。更に、免疫抱合体の形態でＩＬ－２を適用すると、サイトカイン自体を低用量にすることが可能であるため、ＩＬ－２の望ましくない副作用の可能性が制限され、免疫抱合体による身体の特定の部位へのＩＬ－２の標的化によっても、全身曝露量が減り、そのため、未抱合ＩＬ－２を用いて得られるよりも副作用が小さくなる。加えて、未抱合ＩＬ－２と比較して、免疫抱合体の血中半減期が増加することは、免疫抱合体の有効性に寄与する。しかし、ＩＬ－２免疫抱合体のこの特徴は、ＩＬ－２分子の潜在的な副作用を再び悪化させる場合がある。血流中のＩＬ－２免疫抱合体の血中半減期が、未抱合ＩＬ－２と比較して、顕著に長いため、ＩＬ－２又は融合タンパク質部分の他の部分が、血管系内に一般的に存在する構成要素を活性化する可能性が高まる。同じ問題を、Ｆｃ又はアルブミンなどの別の部分に融合したＩＬ－２を含む他の融合タンパク質にも適用し、血中のＩＬ－２の半減期を長くする。したがって、ＩＬ－２の野生型形態と比較して毒性が低い、本明細書及びＷＯ ２０１２／１０７４１７号に記載される変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫抱合体は、特に有利である。

【0128】

本明細書で上に記載したように、腫瘍細胞ではなく、免疫エフェクター細胞に対してＩＬ－２を直接的に標的化することは、ＩＬ－２免疫療法にとって有利であり得る。

【0129】

したがって、本発明は、本明細書で以下に記載される変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施形態では、免疫抱合体は、１つを超えない変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、二重特異性抗原結合分子とが、融合タンパク質を形成し、すなわち、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、二重特異性抗原結合分子とペプチド結合を共有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によりリンカーペプチドを介して融合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、全長抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン分子であり、特に、ＩｇＧクラス免疫グロブリン分子であり、より特定的には、ＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリン分子であり、Ｆａｂ分子（結合アーム）の１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域（それぞれＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／ＣＬ）が、互いに交換され／置き換わっている。１つのこのような実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖の１つと、アミノ末端ペプチド結合を共有している。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、抗体フラグメントである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ分子又はｓｃＦｖ分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｆａｂ分子を含む。別の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、ｓｃＦＶ分子を含む。本発明の免疫抱合体は、第１及び第２の抗原結合部分を含む。それぞれの抗原結合部分は、独立して、抗体及び抗体フラグメントの種々の形態から選択することができる。例えば、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子であってもよく、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖ分子であってもよい。具体的な実施形態では、前記第１及び前記第２の抗原結合部分はそれぞれｓｃＦｖ分子であるか、又は前記第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ分子である。特定の実施形態では、前記第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ分子である。

【0130】

免疫抱合体フォーマット
例示的な免疫抱合体フォーマットは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１１／０２０７８３号に記載されている。これらの免疫抱合体は、少なくとも２つの抗原結合部分を含む。したがって、一実施形態では、本発明に係る免疫抱合体は、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、少なくとも第１及び第２の抗原結合部分とを含む。特定の実施形態では、前記第１及び第２の抗原結合部分は、独立して、Ｆｖ分子（特に、ｓｃＦｖ分子）及びＦａｂ分子からなる群から選択される。具体的な実施形態では、前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、前記第１の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、前記第２の抗原結合部分は、（ｉ）変異体ＩＬ－２ポリペプチド又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、免疫抱合体は、１つ以上のリンカー配列によって接続する、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、第１及び第２の抗原結合部分、特にＦａｂ分子とから本質的になる。このようなフォーマットは、標的抗原（ＰＤ－１及びＴｉｍ－３）に対して高いアフィニティで結合するが、ＩＬ－２受容体に対するモノマー結合のみを与え、そのため、標的部位以外の他の位置にあるＩＬ－２受容体を生じる免疫細胞に対して免疫抱合体が標的化するのを避けるという利点を有する。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の抗原結合部分（特に第１のＦａｂ分子）と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗原結合部分（特に第２のＦａｂ分子）と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗原結合部分（特に第１のＦａｂ分子）は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗原結合部分（特に第２のＦａｂ分子）と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の抗原結合部分（特に第１のＦａｂ分子）は、第１の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の抗原結合部分（特に第２のＦａｂ分子）と、カルボキシ末端ペプチドを共有する。特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の重鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の重鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２の軽鎖可変領域と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに接続し、更に、アミノ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に接続する。別の実施形態では、第１の重鎖又は軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに接続し、更に、カルボキシ末端ペプチド結合によって、第２の重鎖又は軽鎖可変領域に接続する。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。別の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、アミノ末端ペプチド結合を共有する。他の実施形態では、第１のＦａｂ重鎖又は軽鎖は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、アミノ末端ペプチド結合を共有し、更に、第２のＦａｂ重鎖又は軽鎖と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、免疫抱合体は、１つ以上のｓｃＦＶ分子と、アミノ末端ペプチド結合を共有し、１つ以上のｓｃＦＶ分子と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む。

【0131】

他の例示的な免疫抱合体フォーマットは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１２／１４６６２８号に記載されている。これらの免疫抱合体は、抗原結合部分として免疫グロブリン分子を含む。

【0132】

本発明の免疫抱合体は、特定的な実施形態では、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より特定的にはＩｇＧ_１分子であり、Ｆａｂ分子（結合アーム）の１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域（それぞれＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／ＣＬ）が、互いに交換され／置き換わっている。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒトである。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、ヒト定常領域、例えば、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む。一実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、免疫グロブリン分子と、アミノ末端ペプチド結合又はカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。一実施形態では、免疫抱合体は、１つ以上のリンカーペプチドによって接続する、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、より特定的にはＩｇＧ_１分子から本質的になる。具体的な実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、場合によりリンカーペプチドを介して融合する。

【0133】

変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、二重特異性抗原結合分子に直接的に、又は１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０アミノ酸を含むリンカーペプチドを介して融合していてもよい。リンカーペプチドは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、１５アミノ酸長を有する。一実施形態では、リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）_ｎ又は（ＧｘＳ）_ｎＧ_ｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝３である。特定の実施形態では、リンカーペプチドは、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号２４）である。一実施形態では、リンカーペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む（又は配列番号２４のアミノ酸配列からなる）。

【0134】

特定の実施形態では、免疫抱合体は、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、二重特異性抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧクラス免疫グロブリン分子、より特定的にはＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリン分子であり、Ｆａｂ分子（結合アーム）の１つにおいて、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域（それぞれＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／ＣＬ）が、互いに交換され／置き換わっており、変異体ＩＬ－２分子は、そのアミノ末端アミノ酸で、免疫グロブリン重鎖の１つのカルボキシ末端アミノ酸に、配列番号２４のリンカーペプチドを介して融合する。

【0135】

特定の実施形態では、免疫抱合体は、本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含み、変異体ＩＬ－２分子は、そのアミノ末端アミノ酸で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのカルボキシ末端アミノ酸に、配列番号２４のリンカーペプチドを介して融合する。

【0136】

ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子
本発明の免疫抱合体は、二重特異性抗原結合分子、すなわち、２つの別個の抗原決定基（例えばＰＤ－１及びＴｉｍ－３）に対して特異的に結合可能な少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子を含む。

【0137】

本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３、特に、ヒトＰＤ－１及びヒトＴｉｍ－３に結合し、例えば、腫瘍に関連する、ＰＤ－１及び／又はＴｉｍ－３が発現する標的部位に対し、特に、ＰＤ－１及び／又はＴｉｍ－３が発現するＴ細胞に対し、変異体ＩＬ－２ポリペプチドを指向させることができる。

【0138】

本発明の免疫抱合体で使用可能な適切なＰＤ－１／Ｔｉｍ－３二重特異性抗原結合分子は、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９２号に記載される。

【0139】

本発明の特定の実施形態によれば、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である（すなわち、重鎖及び軽鎖で構成される抗原結合ドメイン、それぞれが可変ドメインと定常ドメインを含む）。一実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、前記Ｆａｂ分子は、ヒトである。特定の実施形態では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト化されている。更に別の実施形態では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。

【0140】

好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような改変は、異なるＦａｂ分子からの重鎖と軽鎖のミスマッチを減らし、それによって、組換え産生における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高める。本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子にとって有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子において、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬとＶＨ）が置き換わっている。しかし、このドメイン交換を用いても、二重特異性抗原結合分子の調製は、うまく対にならなかった重鎖と軽鎖との間のいわゆるＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型の相互作用に起因して特定の副生成物を含む場合がある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８ （２０１１） １１１８７－１１１９１を参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖及び軽鎖の誤った対形成を更に減らし、それにより、所望な二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を上げるために、反対の電荷で帯電したアミノ酸を、本明細書でさらに記載するように、ＰＤ－１に結合するＦａｂ分子またはＴｉｍ－３に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入してもよい。電荷改変は、二重特異性抗原結合分子 に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１Ａ、Ｂに示されるもの）、又は二重特異性抗原結合分子に含まれる（ＶＨ／ＶＬ）クロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｃ、Ｄに示されるもの）のいずれかでなされる（しかし、両方ではない）。特定的な実施形態では、電荷改変は、二重特異性抗原結合分子（特定の実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子においてなされる。

【0141】

第１の抗原結合部分
本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－１、特にヒトＰＤ－１（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定的な実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換され／置き換わっているＦａｂ分子）である。このような実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である（例えば、図１Ａ、Ｃに示されるような）。

【0142】

代替的な実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換され／置き換わっているＦａｂ分子）である。このような実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である（例えば、図１Ｂ、Ｄに示されるような）。

【0143】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列とを含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト化抗体である（ヒト化抗体から誘導される）。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、第１の抗原結合部分は、上のいずれかの実施形態と同じＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＨ配列と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１の群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＬ配列とを含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のＶＨ配列と、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１の群から選択されるＶＬ配列とを含む。

【0150】

特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。

【0151】

特定の実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のＶＨ配列と、配列番号８のＶＬ配列とを含む。

【0152】

一実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号４１及び４２（それぞれヒトκ及びλＣＬドメイン）及び配列番号４３（ヒトＩｇＧ_１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列、特に配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷改変」の状態で本明細書に記載するアミノ酸変異を含んでいてもよく、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子である場合、１つ以上の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特定的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷改変」状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。

【0153】

一実施形態では、ＰＤ－１に結合する１つを超えない抗原結合部分が、二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち、二重特異性抗原結合分子は、ＰＤ－１に対する一価の結合を提供する）。

【0154】

第２の抗原結合部分
本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、Ｔｉｍ－３、特にヒトＴｉｍ－３（第２の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。

【0155】

特定的な実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。このような実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗原結合部分は、好ましくは、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換され／置き換わっているＦａｂ分子）である（図１Ａ、Ｃを参照）。

【0156】

代替的な実施形態では、ＰＤ－１に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。このような実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが互いに交換され／置き換わっているＦａｂ分子）である（図１Ｂ、Ｄを参照）。

【0157】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３とを含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト化抗体である（ヒト化抗体から誘導される）。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化ＶＨであり、及び／又はＶＬは、ヒト化ＶＬである。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、上のいずれかの実施形態と同じＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。いくつかの実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖可変領域は、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号１９又は配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。他の実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＨ配列と、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＬ配列とを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＨ配列と、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のＶＬ配列とを含む。

【0162】

特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。更に特定の実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号１８のＶＨ配列と、配列番号１９のＶＬ配列とを含む。

【0163】

一実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。更なる実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号２０のＶＨ配列と、配列番号２１のＶＬ配列とを含む。

【0164】

一実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特に、ヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号４１及び４２（それぞれヒトκ及びλＣＬドメイン）及び配列番号４３（ヒトＩｇＧ_１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列、特に配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷改変」の状態で本明細書に記載するアミノ酸変異を含んでいてもよく、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子である場合、１つ以上の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特定的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷改変」状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。

【0165】

一実施形態では、Ｔｉｍ－３に結合する１つを超えない抗原結合部分が、二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち、二重特異性抗原結合分子は、Ｔｉｍ－３に対する一価の結合を提供する）。

【0166】

電荷改変
本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（または２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合にはさらに多い）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂ由来の二重／多重特異性抗原結合分子の産生で生じ得るマッチしない重鎖との軽鎖の間違った対形成（Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ型副生成物）を減らすのに特に効果的であるアミノ酸置換を含んでいてもよい。（その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１５／１５０４４７号、特に、その中の実施例も参照）。所望ではない副生成物（特に、結合アームの１つにあるＶＨ／ＶＬドメインの交換を伴う二重特異性抗原結合分子中に存在するＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物）と比較した場合の、所望な二重特異性抗原結合分子の比率は、帯電したアミノ酸に、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を導入することによって向上させることができる（本明細書では、「電荷改変」と呼ばれることがある）。

【0167】

したがって、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に、第１の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、いくつかの実施形態では、
ｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
二重特異性抗原結合分子は、（ｉ）及び（ｉｉ）で述べられる両方の改変を含まない。ＶＨ／ＶＬが置き換わっている抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに交換されていない（すなわち、置き換わらないままである）。
より具体的な実施形態では、
ｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
ｉｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、又は
１つのこのような実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0168】

更なる実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0169】

特定の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0170】

より特定の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0171】

更に特定の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0172】

特定的な実施形態では、上の実施形態に係るアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。

【0173】

又は、上の実施形態に係るアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされていてもよい。特定のこのような実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。

【0174】

したがって、一実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0175】

更なる実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0176】

更に別の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0177】

一実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0178】

別の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0179】

特定の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－１に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合部分とを含み、
第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0180】

特定の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＰＤ－１に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
（ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合部分とを含み、
第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の字実施形態では、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0181】

二重特異性抗原結合分子フォーマット
本発明に係る免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の構成要素は、種々の構成で互いに融合していてもよい。例示的な構成は、図１に示される。適切な二重特異性抗原結合分子フォーマットは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００９０８０２５２号及び第ＷＯ２００９０８０２５３号に記載される。

【0182】

特定的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。このような実施形態では、第１、第２などの抗原結合部分は、それぞれ、本明細書では、第１、第２などのＦａｂ分子と呼ばれる場合がある。

【0183】

特定的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。

【0184】

二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有していてもよく、すなわち、第１及び第２の抗原結合部分が、互いに、また、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接に、又は好ましくは、１つ以上の適切なリンカーペプチドを介し、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に対するものである場合、その融合は、典型的には、免疫グロブリンヒンジ領域を介する。

【0185】

いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ分子であり、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合する。特定のこのような実施形態では、第２の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに交換され／置き換わっているＦａｂ分子）である。他のこのような実施形態では、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第１のＦａｂ分子は、従来のＦａｂ分子である。

【0186】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のＦａｂ分子から本質的になり、Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットと、場合により１つ以上のリンカーペプチドで構成され、第１及び第２のＦａｂ分子は、それぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端をＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合する。このような構成は、図１に模式的に示される（図１Ａ及び１Ｃの例では、第１の抗原結合ドメインが、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子であり、図１Ｂ及び１Ｄの例では、第２の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に、又はリンカーペプチドを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ_１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。

【0187】

Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端をＦｃドメインのそれぞれのサブユニットのＮ末端に融合する二重特異性抗原結合分子の構成において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。なお更なる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_４サブクラス免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特に、ヒトＦｃ領域を含む。

【0188】

抗原結合部分は、Ｆｃドメインに（又は互いに）直接的に、又は１つ以上のアミノ酸、又は典型的には約２～２０アミノ酸を含むリンカーペプチドを介して融合してもよい。リンカーペプチドは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ、（ＳＧ_４）_ｎ、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ又はＧ_４（ＳＧ_４）_ｎリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、前記リンカーペプチドは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。一実施形態では、前記リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）_ｎ又は（ＧｘＳ）_ｎＧ_ｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施形態では、前記リンカーペプチドは、（Ｇ_４Ｓ）_２である。リンカーペプチドはまた、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるリンカーペプチドを伴い、又は伴わずに融合してもよい。

【0189】

特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。例えば、図１Ａ及び１Ｃを参照。

【0190】

他の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と置き換わっている）、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。例えば、図１Ｂ及び１Ｄを参照。

【0191】

特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（１）－ＣＬ_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（２）－ＣＨ１_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ_（１）－ＣＨ１_（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（２）－ＣＬ_（２））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。

【0192】

更に他の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域と置き換わっている）、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（２）－ＣＬ_（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドと、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、Ｆｃドメインサブユニット（ＶＨ_（１）－ＣＨ１_（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、更に、ポリペプチドを含み、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ_（２）－ＣＨ１_（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ_（１）－ＣＬ_（１））と、カルボキシ末端ペプチド結合を共有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。

【0193】

特定の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
ａ）ＰＤ－１に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＬ１が互いに置き換わったＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、
ここで、
（ａ）での第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端を、（ｃ）でのＦｃドメインのサブユニットの１つ（特に第１のサブユニット）のＮ末端に融合し、（ｂ）での第２の抗原結合部分は、（ｃ）でのＦｃドメインのＦａｂ重鎖のＣ末端を、サブユニットの他の１つ（特に第２のサブユニット）のＮ末端に融合する。

【0194】

特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。

【0195】

別の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
ａ）ＰＤ－１に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、
ここで、
（ａ）での第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端を、（ｃ）でのＦｃドメインのサブユニットの１つ（特に第１のサブユニット）のＮ末端に融合し、（ｂ）での第２の抗原結合部分は、（ｃ）でのＦｃドメインのＦａｂ重鎖のＣ末端を、サブユニットの他の１つ（特に第２のサブユニット）のＮ末端に融合する。

【0196】

特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。

【0197】

二重特異性抗原結合分子の異なる構成の全てにおいて、本明細書に記載するアミノ酸置換は、存在する場合、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインのいずれかにあってもよい。好ましくは、これらは、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン内にある。本発明の概念によれば、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においてなされる場合、このようなアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においてはなされない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においてなされる場合、このようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子においてはなされない。アミノ酸置換は、特定的には、Ｆａｂ分子を含む二重特異性抗原結合分子でなされ、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置き換わっている。

【0198】

二重特異性抗原結合分子の特定の実施形態では、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子内で行われる実施形態では、第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。二重特異性抗原結合分子の他の実施形態では、特に、本明細書に記載のアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子内で行われる実施形態では、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬと、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。

【0199】

特定の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
ａ）ＰＤ－１に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第２の抗原結合部分とを含み、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、
ここで、（ｂでの第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（ｂ）での第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ここで、
（ａ）での第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端を、（ｃ）でのＦｃドメインのサブユニットの１つ（特に第１のサブユニット）のＮ末端に融合し、（ｂ）での第２の抗原結合部分は、（ｃ）でのＦｃドメインのＦａｂ重鎖のＣ末端を、サブユニットの他の１つ（特に第２のサブユニット）のＮ末端に融合する。

【0200】

特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。

【0201】

別の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、
ａ）ＰＤ－１に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合部分と、
ｂ）Ｔｉｍ－３に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わったＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、
ここで、（ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（ａ）での第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ここで、
（ａ）での第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端を、（ｃ）でのＦｃドメインのサブユニットの１つ（特に第１のサブユニット）のＮ末端に融合し、（ｂ）での第２の抗原結合部分は、（ｃ）でのＦｃドメインのＦａｂ重鎖のＣ末端を、サブユニットの他の１つ（特に第２のサブユニット）のＮ末端に融合する。

【0202】

特定の実施形態では、第１及び第２の抗原結合部分は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。

【0203】

Ｆｃドメイン
特定的な実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。

【0204】

二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、１つを超えないＦｃ分子を含む。

【0205】

一実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ_４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ_４抗体のＦａｂアーム交換を減らす（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。更により特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号４０で与えられる。

【0206】

ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明に係る免疫抱合体は、変異体ＩＬ－２ポリペプチド、特に、１つの（１つを超えない）変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合部分とを含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットが、２つの非同一なポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。

【0207】

したがって、特定的な実施形態では、本発明に係る免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施形態では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。

【0208】

ヘテロ二量化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で改変するためにいくつかの手法が存在し、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１号、ＷＯ ９８／０５０４３１号、ＥＰ １８７０４５９号、ＷＯ ２００７／１１０２０５号、ＷＯ ２００７／１４７９０１号、ＷＯ ２００９／０８９００４号、ＷＯ ２０１０／１２９３０４号、ＷＯ ２０１１／９０７５４号、ＷＯ ２０１１／１４３５４５号、ＷＯ ２０１２０５８７６８号、ＷＯ ２０１３１５７９５４号、ＷＯ ２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのこのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインが、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）が、自身とホモ二量化せず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量化するように仕向けられている相補的な様式で操作されている（その結果、第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量化し、第１又は第２のＣＨ３ドメインの間のホモ二量体は形成されない）。改良された重鎖ヘテロ二量化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤った対形成と、Ｂｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物が低下した二重特異性抗原結合分子において、重鎖－軽鎖改変と組み合わせた異なる代替例として想定される（例えば、１つの結合アームでのＶＨ及びＶＬの交換／置き換えと、ＣＨ１／ＣＬ界面で、帯電したアミノ酸を反対の電荷で置換したものの導入）。

【0209】

具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、いわゆる「ホールにノブを入れる」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」改変と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」改変とを含む。

【0210】

ホールにノブを入れる技術は、例えば、ＵＳ ５，７３１，１６８号、ＵＳ ７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。

【0211】

したがって、特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。

【0212】

好ましくは、より大きな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。

【0213】

好ましくは、より小さな側鎖容積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。

【0214】

突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作成することができる。

【0215】

具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0216】

なお更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。

【0217】

特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0218】

特定の実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」改変を含む）に（場合によりリンカーペプチドを介して）融合している。理論によって束縛されることを望まないが、Ｆｃドメインのノブを含有するサブユニットに対する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの融合は、２つの変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫抱合体の生成を（更に）最小化する（２つのノブを含有するポリペプチドの立体的な衝突）。

【0219】

ヘテロ二量化を強化するためのＣＨ３改変の他の技術は、本発明の代替例として想定され、例えば、ＷＯ ９６／２７０１１号、ＷＯ ９８／０５０４３１号、ＥＰ １８７０４５９号、ＷＯ ２００７／１１０２０５号、ＷＯ ２００７／１４７９０１号、ＷＯ ２００９／０８９００４号、ＷＯ ２０１０／１２９３０４号、ＷＯ ２０１１／９０７５４号、ＷＯ ２０１１／１４３５４５号、ＷＯ ２０１２／０５８７６８号、ＷＯ ２０１３／１５７９５４、ＷＯ ２０１３／０９６２９１号に記載されている。

【0220】

一実施形態では、ＥＰ １８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置への反対の電荷で帯電したアミノ酸の導入に基づく。本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の１つの好ましい実施形態は、アミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるＫ３７０Ｅ及びアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他の１つにおけるＥ３５７Ｋ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。

【0221】

別の実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインに更なるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0222】

別の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、更に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0223】

一実施形態では、ＷＯ ２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）から選択されるアミノ酸変異を含む。

【0224】

一実施形態では、ＷＯ ２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、ＷＯ ２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２にある更なるアミノ酸変異、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0225】

一実施形態では、ＷＯ ２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸改変を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0226】

一実施形態では、上に記載するホールにノブを入れる技術も使用する、第ＷＯ ２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量化手法が、代わりに使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0227】

一実施形態では、二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ_２サブクラスであり、ＷＯ ２０１０／１２９３０４号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。

【0228】

代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する改変を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。１つのこのような実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、又はこれに代えて、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）によるアミノ酸置換を含む。

【0229】

なお更なる実施形態では、ＷＯ ２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0230】

更に別の実施形態では、ＷＯ ２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。

【0231】

一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0232】

Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を下げるＦｃドメイン改変
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化によって、サイトカインが放出され、ＩＬ－２ポリペプチドと、長い半減期の二重特異性抗原結合分子とが組み合わさり、全身投与すると、サイトカイン受容体が過剰に活性化し、重篤な副作用が起こる。これと一致して、従来のＩｇＧ－ＩＬ－２免疫抱合体は、注入反応と関係があることが記載されている（例えば、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２２、４４６３－４４７３ （２００４）を参照）。

【0233】

したがって、特定的な実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の結合アフィニティを示し、及び／又はネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメインドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘発しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインのドメインは、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合アフィニティを示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、ＦｃＲｎに対して約７０％より大きく、特に約８０％より大きく、より特定的には約９０％より大きい結合アフィニティを示す場合に達成される。

【0234】

特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティが低下し、及び／又はエフェクター機能が低下するように操作される。特定的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティ及び／又はエフェクター機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを下げる。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを下げる１つより多いアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティを少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は更に少なくとも５０分の１まで下げてもよい。一実施形態では、操作されたＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、Ｆｃ受容体の結合アフィニティの２０％未満、特に１０％未満、より特定的には５％未満を示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する結合アフィニティ（特定的にはＣ１ｑに対する結合アフィニティ）も低下する。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合アフィニティは、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合（すなわち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティの保護）は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの操作されていない形態（又はＦｃのこの操作されていない形態を含む二重特異性抗原結合分子）の結合アフィニティの約７０％を超える結合アフィニティを示す場合に達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、このようなアフィニティの約８０％より大きく、更に約９０％より大きいアフィニティを示してもよい。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、標的に結合する抗体の架橋の低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。一実施形態では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクター機能の減少は、ＡＤＣＣの減少である。一実施形態では、ＡＤＣＣの低下は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）によって誘発されるＡＤＣＣの２０％未満である。

【0235】

一実施形態では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合アフィニティ及び／又はエフェクター機能を下げるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５のアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。特定的には、特定的な実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み、すなわち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）と置き換わっており、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）と置き換わっている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0236】

１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ_１ＦｃドメインのＦｃγ受容体（及び相補体）の結合をほとんど完全になくす。ＷＯ ２０１２／１３０８３１号は、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体の結合又はエフェクター機能などの特性を決定する方法も記載する。

【0237】

ＩｇＧ_４抗体は、ＩｇＧ_１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの低下と、エフェクター機能の低下を示す。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ_４Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。Ｆｃ受容体及び／又はそのエフェクター機能に対する結合アフィニティを更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。別の実施形態では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ_４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、特異的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。このようなＩｇＧ_４Ｆｃドメイン変異体及びそのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開第２０１２／１３０８３１号に記載される。

【0238】

特定の実施形態では、ネイティブＩｇＧ_１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティの低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び場合によりＰ３２９Ｇを含むトＩｇＧ_１Ｆｃドメイン、又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び場合によりＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ_４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0239】

特定の実施形態では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化は、除去されている。１つのこのような実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７にアミノ酸変異、特定的には、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。

【0240】

本明細書に記載され、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ ２０１２／１３０８３１号に記載されるＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）も含む。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0241】

変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異導入法、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。

【0242】

Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。又は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子の結合アフィニティは、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。

【0243】

Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３ （１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１－１３６１ （１９８７）に記載される。又は、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞毒性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６^{（登録商標）}非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これに代えて、又はこれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６ （１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。

【0244】

いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが、エフェクター機能が低下するように操作されたいくつかの実施形態では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下を含む。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子が、Ｃ１ｑに結合することができ、したがって、ＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイが行われてもよい。例えば、ＷＯ ２００６／０２９８７９号およびＷＯ ２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３ （１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２ （２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３ （２００４）を参照）。

【0245】

ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を用いても行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ、Ｓ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ’ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９－１７６９ （２００６）；ＷＯ ２０１３／１２０９２９号を参照）。

【0246】

本発明の特定の態様
特定の態様では、本発明は、免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
前記変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号２２に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子であり、
前記二重特異性抗原結合分子が、
ｉ）ＰＤ－１に結合し、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）Ｔｉｍ－３に結合し、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第２の抗原結合部分とを含む、免疫抱合体を提供する。

【0247】

特定の態様では、本発明は、免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ７２Ｇ及びＣ１２５Ａ（ヒトＩＬ－２配列の配列番号２２に対する番号付け）を含むヒトＩＬ－２分子であり；
前記二重特異性抗原結合分子が、
ｉ）ＰＤ－１に結合し、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）Ｔｉｍ－３に結合し、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第２の抗原結合部分とを含む、免疫抱合体を提供する。

【0248】

特定の態様では、本発明は、免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、
前記二重特異性抗原結合分子が、
ｉ）ＰＤ－１に結合し、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）Ｔｉｍ－３に結合し、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第２の抗原結合部分とを含む、免疫抱合体を提供する。

【0249】

上の態様のいずれか１つに係るいくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっており、第２の抗原結合部分が、（従来の）Ｆａｂ分子である。いくつかのこのような実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0250】

上の態様のいずれか１つに係るいくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子は更に、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。いくつかのこのような実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に（特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに）融合し、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に（特に、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに）融合する。

【0251】

特定の態様では、本発明は、免疫抱合体であって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、ＰＤ－１及びＴｉｍ－３に結合する二重特異性抗原結合分子とを含み、
変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含み、
前記二重特異性抗原結合分子が、
ｉ）ＰＤ－１に結合し、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わったＦａｂ分子であり、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分と、
ｉｉ）Ｔｉｍ－３に結合し、（従来の）Ｆａｂ分子であり、（ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含み、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リシン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リシン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、第２の抗原結合部分と、
ｉｉｉ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、
第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に（特に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに）融合し、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインのサブユニットの他の１つのＮ末端に（特に、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに）融合する。

【0252】

本発明の上のいずれかの態様に係るいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基は、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっており（Ｙ４０７Ｖ）、場合により、位置３６６のトレオニン残基は、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基は、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかのこのような実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0253】

本発明の上のいずれかの態様に係るいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基と置き換わっている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。

【0254】

本発明の上のいずれかの態様に係るいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃドメインである。

【0255】

本発明の上の態様のいずれかに係るいくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、そのアミノ末端アミノ酸で、配列番号２４のリンカーペプチドを介し、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのカルボキシ末端アミノ酸に融合する。

【0256】

特定の具体的な実施形態では、免疫抱合体は、配列番号２５の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２６の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２７の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２８の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。更に特定の特定的な実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0257】

ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の免疫抱合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド又はそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、前記フラグメントは、抗原結合フラグメントである。

【0258】

本発明の免疫抱合体をコードするポリヌクレオチドは、完全な免疫抱合体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な免疫抱合体を形成してもよい。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖と変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む免疫抱合体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫抱合体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち１つと変異体ＩＬ－２ポリペプチドとを含む免疫抱合体の一部は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方を含む免疫抱合体の一部に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、Ｆｃドメインサブユニットが会合し、Ｆｃドメインを形成する。

【0259】

いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る免疫抱合体全体をコードする。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る免疫抱合体に含まれるポリペプチドをコードする。

【0260】

一実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の重鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖）と変異体ＩＬ－２ポリペプチドをコードする。別の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の軽鎖をコードする。

【0261】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。

【0262】

組換え方法
本発明で有用な変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、欠失、置換、挿入又は改変によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異導入法、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。この観点で、ネイティブＩＬ－２のヌクレオチド配列は、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３０２，３０５－１０（１９８３））に記載されており、ヒトＩＬ－２をコードする核酸は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロックビル、ＭＤ）などの公的な寄託機関から入手可能である。ネイティブヒトＩＬ－２の配列を配列番号２２に示す。置換又は挿入は、天然アミノ酸残基及び非天然アミノ酸残基を含んでいてもよい。アミノ酸改変は、例えば、グリコシル化部位の付加又は炭水化物の接続など、化学修飾の周知の方法を含む。

【0263】

本発明の免疫抱合体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生について、免疫抱合体（フラグメント）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、更なるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１つ以上のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。一実施形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、免疫抱合体（フラグメント）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ （１９８９）に記載される技術を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であってもよく、又は核酸フラグメントであってもよい。発現ベクターは、免疫抱合体（フラグメント）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写要素又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に例えば、単一のベクター上に存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に例えば別個の（異なる）ベクター上に存在していてもよい。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、異種コード領域をコードし、本発明の免疫抱合体をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント又は誘導体に融合するか、又は融合しなくてもよい。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡフラグメント（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡフラグメント間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力卯を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復 （ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。

【0264】

本発明のポリヌクレオチド 及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。例えば、ヒトＩＬ－２は、ポリペプチドのＮ末端にある２０アミノ酸シグナル配列を用いて翻訳され、その後、開裂して、成熟１３３アミノ酸ヒトＩＬ－２を生成する。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、例えばＩＬ－２ シグナルペプチド 又は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分裂を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。又は、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。

【0265】

後の精製を容易にするために使用可能な（例えば、ヒスチジンタグ）、又は免疫抱合体を標識するのに役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードする免疫抱合体（フラグメント）の末端に、又は末端の中に含まれていてもよい。

【0266】

更なる実施形態では、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。１つのこのような実施形態では、宿主細胞は、本発明の免疫抱合体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを含む（例えば、形質転換されるか、又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」との用語は、本発明の免疫抱合体又はそのフラグメントを生成するように操作することが可能任意の種類の細胞系を指す。免疫抱合体を複製し、免疫抱合体の発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の免疫抱合体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬ抗体^ＴＭ技術）を参照。脊椎動物細胞も、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６、５９（１９７７）に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３，４４－６８（１９８２）に記載されるもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ^－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ， ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ． ２５５－２６８ （２００３）を参照。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

【0267】

これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかに融合する変異体ＩＬ－２ポリペプチドを発現する細胞は、発現した変異体ＩＬ－２の融合産物が、重鎖と軽鎖の両方を含む抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように操作されてもよい。

【0268】

一実施形態では、本発明に係る免疫抱合体を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に提供されるように、免疫抱合体の発現に適した条件下、免疫抱合体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から免疫抱合体を回収することとを含む。

【0269】

本発明の免疫抱合体では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、二重特異性抗原結合分子に遺伝的に融合していてもよく、又は二重特異性抗原結合分子に化学的に抱合していてもよい。二重特異性抗原結合分子に対するＩＬ－２ポリペプチドの遺伝的融合は、ＩＬ－２配列が、ポリペプチドに直接的に融合するか、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。特定のリンカーペプチドは、本明細書に記載される。また、更なる配列が、開裂部位を組み込み、融合の個々の構成要素を分離するために含まれていてもよい（所望な場合、例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。これに加え、ＩＬ－２融合タンパク質は、当該技術分野で周知であるように、ポリペプチド合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）を用い、化学的に合成されてもよい。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、周知の化学抱合方法を用い、他の分子（例えば抗体）に化学的に抱合されてもよい。二官能架橋試薬（例えば、当該技術分野で周知のホモ官能性及びヘテロ官能性架橋試薬）をこの目的で使用することができる。使用する架橋試薬の種類は、ＩＬ－２にカップリングする分子の性質に依存し、当業者なら容易に特定することができる。これに代えて、又はこれに加え、変異体ＩＬ－２及び／又は抱合されることを意図した分子は、これも当該技術分野で周知なように、これら２つを別個の反応で抱合することができるように化学的に誘導体化されてもよい。

【0270】

本発明の免疫抱合体は、二重特異性抗原結合分子を含み、抗体（の一部）を含んでいてもよい。抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照）構築することができる。免疫抱合体、抗体、及びこれらを産生する方法も、例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＰＣＴ出願公開番号第ＷＯ ２０１１／０２０７８３号、第ＷＯ ２０１２／１０７４１７号及び第ＷＯ ２０１２／１４６６２８号に記載されている。

【0271】

任意の動物種の抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の免疫抱合体で使用してもよい。本発明で有用な非限定的な抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト由来であってもよい。免疫抱合体がヒトへの使用を意図したものである場合、抗体の定常領域がヒト由来であるキメラ形態の抗体を使用してもよい。抗体のヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティ又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びこれを製造する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３ （２００８）に記載され、更に、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２９ （１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフト接合を記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８ （１９９１）（「リサーフェシング」を記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０ （２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載する）；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：６１－６８ （２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０ （２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド付き選択」手法を記載する）に記載される。ヒト化に使用可能なフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」方法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６ （１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞性変異を受けた）フレームワーク領域又はヒト生殖系フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリのスクリーニングから誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が挙げられる。

【0272】

ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の方法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト抗体は、免疫原を、インタクトなヒト抗体又は抗原性チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。このような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含み、内因性免疫グロブリン遺伝子座が置き換わっているか、又は動物の染色体に外部の染色体が存在するか、又は無作為に組み込まれている。このようなトランスジェニックマウスにおいて、外因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術）を記載する米国特許出願公開第ＵＳ ２００７／００６１９００号も参照。このような動物から作られるインタクト抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に改変されてもよい。

【0273】

ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても製造することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作られるヒト抗体は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載される。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）及びＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１ （２００５）に記載される。

【0274】

ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリからの単離によって作られてもよい。

【0275】

本発明に有用な抗体は、所望な１つ以上の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されてもよい。コンビナトリアルライブラリをスクリーニングする方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ１６：４９８－５０８（２０１６）にまとめられている。例えば、ファージディスプレイを作成し、所望な結合特徴を有する抗体について、このようなライブラリをスクリーニングする種々の方法が、当該技術分野で既知である。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ８：１１７７－１１９４ （２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８ （２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９ （２０１６）及びＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．編集、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ編集、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）にまとめられている。

【0276】

特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローン化され、ファージライブラリに無作為に組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１２： ４３３－４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、又はＦａｂフラグメントとして、抗体フラグメントを提示する。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高アフィニティ抗体を与える。又は、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されるように、免疫化することなく、非自己から自己抗原までの広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最後に、ナイーブライブラリーも、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞から再整列していないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用い、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再整列を達成することによって、合成的に作成することができる。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許刊行物としては、例えば、以下のものが挙げられる。米国特許第５，７５０，３７３号、第７，９８５，８４０号、第７，７８５，９０３号及び第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０２３７７６４号及び第２００７／０２９２９３６号。所望な１つ以上の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする当該技術分野で既知の方法の更なる例としては、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、及び細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞上での抗体提示及び選択のための方法が挙げられる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５０３：１３５－５６ （２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ１３１９：１５５－１７５ （２０１５）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ８８９：７３－８４ （２０１２）にまとめられている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４ （１９９７） ａｎｄ ｉｎ Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ９４：４９３７－４９４２ （１９９７）に記載される。

【0277】

本発明の免疫抱合体の更なる化学修飾が望ましい場合がある。例えば、免疫原性及び半減期の問題は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの実質的に直鎖のポリマーへの抱合によって改良され得る（例えば、ＷＯ ８７／０００５６号を参照）。

【0278】

本明細書で記載するように調製される免疫抱合体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野で既知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかである。抗体のアフィニティクロマトグラフィー精製について、リガンド受容体又は抗原を、免疫抱合体が結合するものに対して使用してもよい。例えば、変異体ＩＬ－２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用してもよい。本発明の免疫抱合体のアフィニティクロマトグラフィー精製の場合、プロテインＡ又はＧを含むマトリックスを使用してもよい。例えば、連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用し、本質的に実施例に記載されるように、免疫抱合体を単離することができる。免疫抱合体の純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどの任意の種々の周知の分析方法によって決定することができる。

【0279】

組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、以下のいずれかの治療方法で使用するための、本明細書に記載の免疫抱合体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は、本明細書で与えられるいずれかの免疫抱合体と、医薬的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書で提供される免疫抱合体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、以下に記載するもの）とを含む。

【0280】

更に提供されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与に適した形態で本発明の免疫抱合体を産生する方法であって、この方法は、（ａ）本発明に係る免疫抱合体を得ることと、（ｂ）免疫抱合体と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを配合し、それによって、免疫抱合体の製剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために配合することとを含む、方法である。

【0281】

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体に溶解又は分散した治療有効量の免疫抱合体を含む。「医薬的又は薬理学的に許容される」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。免疫抱合体と、場合により更なる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当該技術分野で既知である。更に、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって必要とされるような滅菌性、発熱原性、全体的な安全性及び純度の基準を満たすべきであることは理解される。好ましい組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、当業者には知られているように（例えば、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、ｐｐ． １２８９－１３２９を参照）、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、このような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。任意の従来の担体が、有効成分と不適合である場合を除き、治療組成物又は医薬組成物における使用が想定される。

【0282】

本発明の免疫抱合体（及び任意の更なる治療薬剤）は、非経口、肺内、鼻内を含む任意の適切な手段によって投与されてもよく、所望な場合、局所処置では、病変内投与によって投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。

【0283】

非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明の免疫抱合体は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。又は、免疫抱合体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水を用いて使用前に構築するための粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の免疫抱合体を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な医薬的に許容される担体としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなど）を含んでいてもよい。場合により、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。更に、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔｓ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。

【0284】

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。

【0285】

既に記載した組成物に加え、免疫抱合体は、デポー製剤として配合されてもよい。このような長く作用する製剤は、移植によって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、免疫抱合体は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。

【0286】

本発明の免疫抱合体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。

【0287】

免疫抱合体は、遊離酸又は遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。医薬的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生体活性を実質的に保持する塩である。医薬的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸などの無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄などの無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。

【0288】

治療方法及び組成物
本明細書で与えられるいずれかの免疫抱合体を治療方法に使用してもよい。本発明の免疫抱合体は、例えば、癌の処置において、免疫治療剤として使用されてもよい。

【0289】

治療方法で使用するために、本発明の免疫抱合体は、良好な医療での実施に一致した様式で配合され、用量に分けられ、投与される。この観点で考慮する因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医学専門家には既知の他の因子が挙げられる。

【0290】

本発明の免疫抱合体は、宿主の免疫系の刺激が有益である疾患状態、特に、高められた細胞免疫応答が望ましい状態を処置する際に特に有用であり得る。これらは、宿主免疫応答が不十分であるか、又は不足している疾患状態を含んでいてもよい。本発明の免疫抱合体が投与され得る疾患状態は、例えば、細胞免疫応答が、特定の免疫にとって重大な機構である腫瘍又は感染を含む。本発明の免疫抱合体は、そのまま投与されてもよく、又は任意の適切な医薬組成物で投与されてもよい。

【0291】

一態様では、医薬として使用するための本発明の免疫抱合体が提供される。さらなる態様では、疾患の処置に使用するための本発明の免疫抱合体が提供される。特定の実施形態では、処置方法に使用するための本発明の免疫抱合体が提供される。一実施形態では、本発明は、疾患の処置を必要とする個体に、疾患の処置に使用するための本明細書に記載の免疫抱合体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、個体に治療有効量の免疫抱合体を投与することを含む、疾患を有する個体を処置する方法で使用するための免疫抱合体を提供する。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、癌である。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、処置される疾患が癌である場合、抗癌剤）を投与することを含む。さらなる実施形態では、本発明は、免疫系を刺激するのに使用するための免疫抱合体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、個体に有効量の免疫抱合体を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法で使用するための免疫抱合体を提供する。上のいずれかの実施形態に係る「個人」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加などのうち任意の１つ以上を含んでいてもよい。

【0292】

更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の免疫抱合体の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、疾患の処置を必要とする個体において、疾患の処置のためのものである。一実施形態では、医薬は、疾患を有する個体に、治療有効量の医薬を投与することを含む、疾患を処置する方法で使用するためのものである。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、癌である。一実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、処置される疾患が癌である場合、抗癌剤）を投与することを含む。更なる実施形態では、医薬は、免疫系を刺激するためのものである。更なる実施形態では、医薬は、個体に有効量の免疫抱合体を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法で使用するためのものである。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加などのうち任意の１つ以上を含んでいてもよい。

【0293】

更なる態様では、本発明は、個体において疾患を処置するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、このような疾患を有する個体に、治療有効量の本発明の免疫抱合体を投与することを含む。一実施形態では、組成物は、前記個体に投与され、本発明の免疫抱合体を医薬的に許容される形態で含んでいる。特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患は、癌である。特定の実施形態では、この方法は、更に、個体に、治療有効量の少なくとも１つの更なる治療薬剤（例えば、処置される疾患が癌である場合、抗癌剤）を投与することを含む。更なる態様では、本発明は、個体に有効量の免疫抱合体を投与し、免疫系を刺激することを含む、個体において免疫系を刺激するための方法を提供する。上のいずれかの実施形態に係る「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。上のいずれかの実施形態に係る「免疫系の刺激」は、免疫機能の一般的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性又はリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加などのうち任意の１つ以上を含んでいてもよい。

【0294】

特定の実施形態では、処置される疾患は、増殖性障害、特に癌である。癌の非限定的な例としては、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、胃癌、前立腺癌、血液がん、皮膚癌、扁平細胞癌腫、骨がん及び腎臓癌が挙げられる。本発明の免疫抱合体を用いて処置可能な他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前癌状態又は病変及び癌転移も含まれる。特定の実施形態では、癌は、腎臓癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌及び膀胱癌からなる群から選択される。当業者は、多くの場合に、免疫抱合体が、治癒を与えないが、部分的な利益のみを与える場合があることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、いくつかの利益を有する生理学的変化も、治療利益であると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、生理学的変化を与える免疫抱合体の量は、「有効量」又は「治療有効量」と考えられる。処置が必要な被験体、患者又は個体は、典型的には、哺乳動物であり、より特定的には、ヒトである。

【0295】

いくつかの実施形態では、有効量の本発明の免疫抱合体が細胞に投与される。他の実施形態では、治療有効量の本発明の免疫抱合体が、疾患を処置するために個体に投与される。

【0296】

疾患の予防又は処置のために、本発明の免疫抱合体の適切な投薬量（単独で使用される場合、又は１つ以上の他の更なる治療薬剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患の種類、投与経路、患者の体重、分子の種類（例えば、Ｆｃドメインを含むか、又は含まないか）、疾患の重篤度及び経過、免疫抱合体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び免疫抱合体に対する応答、及び主治医の判断によって変わる。投与の責任を担う医師は、いずれにしても、組成物中の有効成分の濃度、個々の被験体に適切な投薬量を決定する。限定されないが、種々の時間点にわたる単回又は複数回の投与、ボーラス投与、パルス注入を含む種々の投薬計画が本明細書で想定される。

【0297】

免疫抱合体は、一度に、又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の免疫抱合体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかによらず、患者に投与するための初期の候補投薬量であってもよい。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はさらに長く繰り返し投与する場合、状態に応じて、処置は、一般的に、疾患症状の所望な抑制が起こるまで続けられる。免疫抱合体の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。他の非限定的な例では、投薬量はまた、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重までを含んでいてもよく、又は投与あたり更に多くてもよく、これらから誘導される任意の範囲であってもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などが、上述の数に基づいて投与されてもよい。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１回以上の投薬を患者に投与してもよい。このような投薬量を、断続的に、例えば、毎週、又は３週間ごとに投与してもよい（例えば、患者は、約２～約２０回、又は例えば約６回の免疫抱合体の投薬を受ける）。初期の高負荷用量の後、１回以上の低用量を投与してもよい。しかし、他の投薬レジメンが有用な場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。

【0298】

本発明の免疫抱合体は、一般的に、意図した目的を達成するのに効果的な量で使用される。疾患状態を処置又は予防するための使用のために、本発明の免疫抱合体、又はその医薬組成物が、治療有効量で投与されるか、又は塗布される。治療有効量の決定は、特に、本明細書に与えられる詳細な開示の観点で、十分に当業者の能力の範囲内である。

【0299】

全身投与の場合、治療有効投薬量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物で決定されるようなＩＣ_５０を含む血中濃度範囲を達成するために、投薬量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。

【0300】

初期投薬量も、ｉｎ ｖｉｖｏデータから、例えば、動物モデルから、当該技術分野で周知の技術を用いて概算することができる。当業者は、動物データに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。

【0301】

治療効果を維持するのに十分な免疫抱合体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は、個々に調節されてもよい。注射による投与に有用な患者投薬量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿濃度は、各日に複数回投薬量を投与することによって達成されてもよい。血漿中の量は、例えば、ＨＰＬＣによって測定されてもよい。

【0302】

局所投与又は選択的な取り込みの場合には、免疫抱合体の有効な局所濃度は、血漿濃度と関係がない場合がある。当業者は、過度な実験を行うことなく、治療に有効な局所投薬量を最適化することができる。

【0303】

本明細書に記載の免疫抱合体の治療に有効な投薬量は、実質的な毒性を引き起こすことなく、一般的に治療利益を与える。免疫抱合体の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ_５０（集団の５０％が致死に至る用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％が治療に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果との間の投薬比は、治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表すことができる。大きな治療指数を示す免疫抱合体が好ましい。一実施形態では、本発明に係る免疫抱合体は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、全くない状態で、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、使用される投薬量、利用される投与経路、被験体の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動してもよい。実際の製剤、投与経路及び負う薬量は、患者の状態という観点で個々の医師によって選択されてもよい。（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれるＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照。）

【0304】

本発明の免疫抱合体で処置される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ投与を中止するか、中断するか、又は調整するかを知っている。逆に、主治医は、臨床応答が十分ではない場合（毒性を生じずに）、処置をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の障害の管理において投与される投薬量の大きさは、処置される状態の重篤度、投与経路などに伴って変動する。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。更に、投薬量と、おそらく投薬頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わる。

【0305】

本明細書に記載の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを含む免疫抱合体の最大治療用量は、野生型ＩＬ－２を含む免疫抱合体に使用するものから増加してもよい。

【0306】

他の薬剤及び処置
本発明に係る免疫抱合体は、治療において、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の免疫抱合体は、少なくとも１つの更なる治療薬剤と一緒に投与されてもよい。「治療薬剤」との用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。このような更なる治療薬剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態では、更なる治療薬剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。特定の実施形態では、更なる治療薬剤は、抗癌剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。

【0307】

このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わせた状態で存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される免疫抱合体の量、障害又は処置の種類、上述の他の因子に依存する。免疫抱合体は、一般的に、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量および任意の経路で使用される。

【0308】

上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の免疫抱合体の投与は、更なる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。また、本発明の免疫抱合体を、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。

【0309】

製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から作られてもよい。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の免疫抱合体である。ラベル又はパッケージ添付文書は、その組成物が、選択した条件を処置するために使用されることを示す。更に、製造物品は、（ａ）中に組成物が入っており、組成物が、本発明の免疫抱合体を含む、第１の容器と、（ｂ）中に組成物が入っており、組成物が、更なる細胞毒性剤又はその他の治療薬剤を含む、第２の容器とを備えていてもよい。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を処置するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、医薬的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0310】

【図1】本明細書に記載の免疫抱合体に含まれる二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（Ａ、Ｃ）ＰＤ－１に結合するＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子と、Ｔｉｍ－３に結合する（従来の）Ｆａｂ分子と、Ｆｃドメインとを含む、二重特異性抗原結合分子。（Ｂ、Ｄ）ＰＤ－１に結合する（従来の）Ｆａｂ分子と、Ｔｉｍ－３に結合するＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子と、Ｆｃドメインとを含む二重特異性抗原結合分子。黒点：ヘテロ二量化を促進する、Ｆｃドメインにおける任意の改変。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意に導入される反対の電荷のアミノ酸クロスオーバーＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、特に、ＣＨ１及びＣＬドメインに電荷改変が導入されない実施形態では、これに代えて、ＣＨ１及びＣＬドメインの交換を含んでいてもよい。

【図2】ＰＤ１ ＩｇＧ及びＣＥＡ－ＩＬ２ｖと比較した、ＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化されたＰＭＢＣ内のＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ）に対するＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖの結合。

【図3】２日後に測定された、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖによって誘発されるヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２の増殖。

【図4】抗ＰＤ－１のみ、又はＩＬ－２ｖと組み合わせて、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ、又はこれらの組み合わせが存在する状態で、又は抗ＰＤ－１、抗ＴＩＭ－３及びＩＬ－２ｖの組み合わせで、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後のＣＤ４ Ｔ細胞がＩＬ－２（Ａ）、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ又はＩＦＮ－γ（Ｃ）を分泌する能力。

【図5-1】抗ＰＤ－１のみ、又はＩＬ－２ｖと組み合わせて、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ、又はこれらの組み合わせが存在する状態で、又は抗ＰＤ－１、抗ＴＩＭ－３及びＩＬ－２ｖの組み合わせで、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後のＩＬ－２及びＩＦＮ－γの両方を分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ及びＢ）又はＩＦＮ－γのみを分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ、Ｅ）の分化状態。

【図5-2】抗ＰＤ－１のみ、又はＩＬ－２ｖと組み合わせて、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ、又はこれらの組み合わせが存在する状態で、又は抗ＰＤ－１、抗ＴＩＭ－３及びＩＬ－２ｖの組み合わせで、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後のＩＬ－２及びＩＦＮ－γの両方を分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ及びＢ）又はＩＦＮ－γのみを分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ、Ｄ、Ｅ）の分化状態。

【図6】図６Ａ～Ｄ抗ＰＤ－１のみ、ＴＩＭ－３とＩＬ－２ｖとの組み合わせ、又は融合タンパク質として存在する状態で、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後に、ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＩＬ－２（図６Ａ）、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ（図６Ｂ）又はＩＦＮ－γ（図６Ｃ）を分泌する能力、増殖する能力（図６Ｄ）。

【図7】抗ＰＤ－１のみ、ＴＩＭ－３とＩＬ－２ｖとの組み合わせ、又は融合タンパク質として存在する状態で、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後に、ＩＦＮ－γを分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌの発現あたりの分化状態。

【図8】図８Ａ及び８Ｂ同じサンプル内で、Ｔｒｅｇに対し、Ｔｃｏｎｖに結合した所与の抗体の頻度のΔ値。それぞれの記号は、別個のドナーを表し、水平線は、Ｎ＝４のメジアンを示す（図８Ａ）。Ｔｃｏｎｖ（黒色線）及びＴｒｅｇ（灰色）に対する結合を示す代表的なドナーの１つからのデータ（図８Ｂ）。

【図9】同時培養５日後のＴｃｏｎｖによって分泌したグランザイムＢ（図９Ａ）及びインターフェロン－γ（図９Ｂ）のＴｒｅｇによる抑制の割合。それぞれの記号は、別個のドナーを表し、水平線は、Ｎ＝５のメジアンを示し、０％の点線は、Ｔｒｅｇによる抑制がないことを表す。Ｐは、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図10】図１０Ａ～Ｄ第１のドナー（ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ））の休止状態のＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイ。

【図11】図１１Ａ～Ｄ第２のドナー（ＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ）、制御性Ｔ細胞（Ｃ）及びＮＫ細胞（Ｄ））の休止状態のＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイ。

【図12】図１２Ａ～Ｄ第３のドナー（ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ））の休止状態のＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイ。

【図13】図１３Ａ～Ｄ第４のドナー（ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ））の休止状態のＰＢＭＣに対するＳＴＡＴ５アッセイ。

【0311】

【実施例】

【0312】

以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に提供した一般的な記載が与えられ、種々の実施形態が実施されてもよいことが理解される。

【0313】

実施例１
ヒトＰＤ１－Ｔｉｍ３－ＩＬ－２ｖのクローニング及び発現
ＰＤ１－Ｔｉｍ３－ＩＬｖ構築物のための発現ベクター（配列番号２５、２６、２７及び２８）を、ＰＣＴ特許出願番号第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９２号に記載されるように調製した。

【0314】

振とうするフラスコ中、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と適切なプラスミドのプラスミド比率１：１：１：１での同時トランスフェクションによって、ヒト抗ＰＤ１－Ｔｉｍ３－ＩＬ－２ｖ構築物を作成した。１週間後、上清を収集し、滅菌フィルターで濾過し、標準的な方法によって精製した（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７３１９２号を参照）。簡単に言うと、上清からの精製は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせによって行われた。得られた生成物を、質量分析法によって属性について特性決定し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）によって純度、モノマー含有量及び安定性などの分析特性を特性決定した。免疫抱合体は、良好な収率で産生することができ、安定であった。

【0315】

実施例２
実施例２Ａ．活性化されたＣＤ８細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対するＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖの結合
健康なドナー由来の新しく単離したＰＢＭＣを、ＣＤ３及びＣＤ２８で一晩刺激し、Ｔ細胞でのＰＤ１のアップレギュレーションを誘発した。ＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＣＤ３（クローンＯＫＴ３、３１７３０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用い、３７℃で１時間被覆した細胞培養フラスコ中の培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン）に接種した。ＣＤ２８を、溶液でＰＭＢＣに濃度２μｇ／ｍｌの濃度で加えた（クローンＣＤ２８．２、３０２９１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。次の日に、ＰＢＭＣを収集し、９６ウェル丸底プレートに移した（ウェルあたり２００，０００個の細胞）。細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＦＢＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％ ＮａＮ_３）で洗浄し４０μｌのＦＡＣＳバッファー中の指定した分子（ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１ ＩｇＧ、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ）で、４℃で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、結合していない分子を除去した。次いで、４０μｌの希釈したＰＥ抗ヒトＦｃ特異的二次抗体（１０９－１１６－１７０、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。Ｔ細胞を検出するために、ＰＭＢＣを４０μｌのＣＤ３ ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１、３００４０６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＡＰＣ（クローンＲＰＡ－Ｔ４、３００５１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＣＤ８ ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ－Ｔ８、３０１０３６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の混合物で、４℃で３０分間染色した。結合していない抗体を、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄することによって除去した。最後に、細胞を、１％ ＰＦＡのＦＡＣＳバッファー溶液で固定し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４ Ｔ細胞）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８ Ｔ細胞）に対するＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａゲーティングを用いて測定した。

【0316】

図２は、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ及び対応するＰＤ１ ＩｇＧが、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に同様に結合することを示す。ＣＥＡを標的とする類似の融合タンパク質ＣＥＡ－ＩＬ２ｖを、標的化していないコントロールとして加え、Ｔ細胞に対するＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖの結合に対し、Ｔ細胞に対するＩＬ２ｖ単独の結合を比較した。

【0317】

実施例２Ｂ．ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖを用いたＮＫ９２の増殖
ＮＫ９２細胞を収集し、計測し、生存率について評価した。細胞をＰＢＳで３回洗浄して残留ＩＬ－２を除去し、ＩＬ－２を含まない培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、１％ グルタミン）に再懸濁させた。洗浄したＮＫ９２細胞を、細胞インキュベーター内で２時間インキュベートした（ＩＬ－２飢餓状態）。飢餓状態にした後、細胞を、ＩＬ－２を含まない新しい培地に、１ｍｌあたり２００，０００細胞になるまで再懸濁させ、５０μｌの細胞懸濁物を９６ウェル細胞培養物処理した平底プレートに移し、５０μｌの希釈した分子ＰＤ１－Ｔｉｍ３－ＩＬ２ｖ（ＩＬ－２を含まない培地中）、プロロイキン（１．５μｇ／最終濃度（ｍｌ））又は培地（コントロールウェル）を追加し、最終容積をウェルあたり１００μｌにした。インキュベーター中、プレートを２日間インキュベートした。

【0318】

２日後、細胞Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬及び細胞培養プレートを室温になるまで平衡状態にした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ溶液を、製造業者の指示に記載されているように調製し、１００μｌの溶液を各ウェルに添加した。１０分間インキュベートした後、ピペットによって残った凝集物を再懸濁させ、１５０μｌの混合物を白色平底プレートに移した。Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍマルチモードリーダーを用い、発光を測定した。

【0319】

図３は、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖが、濃度に依存する様式でＮＫ９２細胞の増殖を誘発することができることを示す。

【0320】

実施例３
ＰＤ－１又はＰＤ－１及びＴＩＭ－３ブロックのいずれかによる、消耗したウイルス特異的なＴ細胞へのＩＬ－２ｖ送達の効果
近年、更なる免疫チェックポイントであるＴＩＭ－３は、ＰＤ－１単独の陽性よりも大きな機能不全度を有する、これらのＰＤ－１陽性ウイルス特異的なＴ細胞の表面で同定された。したがって、本願発明者らは、高度に機能不全のウイルス特異的Ｔ細胞にＩＬ－２ｖを送達するために、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３の同時標的化の効果を評価した。

【0321】

図４に示される結果は、ＩＬ－２ｖをウイルス特異的なＴ細胞に送達するためにＰＤ－１とＴＩＭ－３を標的化する効果の組み合わせを、ＰＤ－１のみを標的とする場合と比較して、強調する。興味深いことに、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ－２ｖ構築物は、ＰＤ－１のブロックのみと比較すると、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ（図４Ｂ、ｐ≦０．００１）を一緒に分泌することができ、及びＩＦＮ－γのみ（図４Ｃ、ｐ≦０．０１）を分泌することができる保護性ＣＭＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を非常に顕著に高める。ＰＤ１－ＩＬ２ｖ（ＰＤ－１のみを標的化する類似分子、配列番号２９、３０及び３１を参照）は、ＰＤ－１のブロックのみと比較すると、顕著に拡大した保護多重機能性で、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖに対して同様の傾向を示し、また、ＩＦＮ－γのみを分泌するＣＭＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞も同様の傾向を示す（図４Ｂ、ｐ≦０．０５及び図４ＣＣ、ｐ≦０．０１）。ＰＤ－１－ＩＬ－２ｖ及びＰＤ－１－ＴＩＭ－３－ＩＬ－２ｖは、両方とも、ＩＬ－２を単独で分泌するＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を顕著に増加させなかった。

【0322】

ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖが、保護ウイルス特異的な多重機能性Ｔ細胞のエフェクター機能を拡大／向上させる能力は、慢性感染及び癌において消耗／機能不全の抗原特異的Ｔ細胞を標的化するこの分子の潜在的な用途に関連する特徴である。

【0323】

多機能性ＣＤ４ Ｔ細胞が、固有の増殖能力を有し、そのため、寿命になるまでの間自己維持する能力を有することが記載されているため、本願発明者らは、異なる構築物存在下、ｐｐ６５再刺激を行ったときの分化状態を特性決定した。興味深いことに、本願発明者らは、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ及びＰＤ１－ＩＬ２ｖで処置すると、多重機能性ＣＤ４ Ｔ細胞内で、エフェクターメモリ（ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^－）及び中心メモリプール（ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋）の増加傾向を観察した（図５Ａ及びＢ）。

【0324】

ＩＦＮ－γを分泌するＣＤ４ Ｔ細胞は、多重機能性の対象物から誘導され、さらに多く分化することが記載されているため、その増殖する能力を失っている。ＣＭＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞のこの部分集合において、本願発明者らは、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ及びＰＤ１－ＩＬ２ｖで処置すると、エフェクター及び中心メモリ細胞の頻度の増加に気づいただけではなく（図５Ｃ、ｐ≦０．０１及び図５Ｄ）、最後まで分化したエフェクターの頻度の増加にも気づいた（ＣＤ４５ＲＯ^－ＣＤ６２Ｌ^－）（図５Ｃ）。

【0325】

全てをまとめると、データは、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖが、寿命の長い保護性ウイルス特異的多重機能性Ｔ細胞の頻度を高め、増殖する固有の能力を失ったこれらのウイルス特異的なエフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の拡張も可能にする。

【0326】

実施例４
ＰＤ－１又はＰＤ－１及びＴＩＭ－３ブロックのいずれかによる、消耗したウイルス特異的なＴ細胞へのＩＬ－２ｖ送達の効果
ＰＤ－１発現は、最初に、消耗したウイルス特異的なＴ細胞で、ウイルス抗原に慢性的に曝露した結果、Ｔ細胞が有効な抗ウイルス応答をすることができないことと関係があると記載されている。ＩＬ－２とＩＦＮ－γを同時に分泌することができるウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞は、慢性感染においてウイルス再活性化からの保護を与える。実際に、ＣＤ４ Ｔ細胞の多重機能性シグネチャは、数年間にわたって症状がないままである、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）及びヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）に感染した健康な個体及びヒト免疫不全ウイルスに感染した個体におけるウイルス制御と関係がある。

【0327】

近年、更なる免疫チェックポイントであるＴＩＭ－３は、ＰＤ－１単独の陽性よりも大きな機能不全度を有する、これらのＰＤ－１陽性ウイルス特異的なＴ細胞の表面で同定された。したがって、ＩＬ－２（ＩＬ－２ｖ）の変異態様を機能不全抗原特異的なＴ細胞に送達するためにＰＤ－１及びＴＩＭ－３を標的化する効果を評価するために、ｉｎ－ｖｉｔｒｏアッセイが開発された。このアッセイに適したドナーの量に対する制限を回避するために、集団のほぼ８０％がＣＭＶ血清学的陽性であるＴ細胞の回収抗原としてのＣＭＶ免疫原性ウイルスタンパク質（ｐｐ６５）を選択した。したがって、健康なヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、濃度１０μｇ／ｍｌの構築物存在下、ＣＭＶ－ｐｐ６５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で刺激した。４３時間後、ゴルジから輸送したタンパク質を、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）を添加することによってブロックし、細胞を３７℃で更に５時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯ抗体で表面を染色した後、ＦｏｘＰ３転写ＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過化した。最後に、ＩＬ－２について、ＩＦＮ－γ及びＫｉ６７（両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）の細胞内染色を行った。

【0328】

図６は、抗ＰＤ－１のみ、ＴＩＭ－３とＩＬ－２ｖとの組み合わせ、又は融合タンパク質として存在する状態で、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後に、ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＩＬ－２（Ａ）、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ（Ｂ）又はＩＦＮ－γ（Ｃ）を分泌する能力、増殖する能力（Ｄ）を示す。図６に示される結果は、ＰＤ－１ブロックのみ、又は標的ではないＩＬ－２ｖに対し、ＰＤ－１とＴＩＭ－３をブロックしつつ、ＩＬ－２ｖをウイルス特異的なＴ細胞に送達する組み合わせた効果を強調する。興味深いことに、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ－２ｖ構築物は、ＰＤ－１のブロックのみと比較して、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γを一緒に（図６Ｂ）、ＩＦＮ－γのみ（図６Ｃ、Ｐ≦０．０００１）を分泌することができるＣＭＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を高めた。逆に、ＤＰ４７－ＩＬ２ｖは、ＩＬ－２単機能性ＣＤ４ Ｔ細胞を増加させた（図６Ａ）。予想されるように、標的化されたＩＬ－２ｖ又は標的化されていないＩＬ－２ｖで処置した全ての細胞が、Ｋｉ６７染色に対する陽性によって示されるように、増殖した（図６Ｄ）。

【0329】

図７は、抗ＰＤ－１のみ、ＴＩＭ－３とＩＬ－２ｖとの組み合わせ、又は融合タンパク質として存在する状態で、ＣＭＶ免疫原性タンパク質ｐｐ６５を用いた回収から４８時間後に、ＩＦＮ－γを分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ６２Ｌの発現あたりの分化状態を示す。拡張されたＩＦＮ－γを分泌するウイルス特異的なＣＤ４ Ｔ細胞の表現型特性決定（図７）から、エフェクター－メモリ（ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^－）プロフィールが判明した。

【0330】

したがって、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ融合タンパク質を介する消耗したＣＭＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞へのＩＬ－２ｖの送達によって、分化したメモリプロフィール及びＩＬ－２とＩＦＮ－γを両方とも分泌する能力によって特徴付けられる、長く生存する保護性ウイルス特異的な集団の拡張がみられたと結論付けることができる。このことは、慢性感染及び癌における消耗／機能不全の抗原特異的なＴ細胞を標的とするこの分子の潜在的な用途に関連する特徴である。

【0331】

実施例５
実施例５Ａ．活性化された制御性Ｔ細胞を上回る、活性化された従来のＴ細胞に対するＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖの優先的な結合。
活性化された従来のＴ細胞及び制御性Ｔ細胞に対するＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖの結合特性を、競争結合アッセイで評価した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^ｄｉｍ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、２段階のＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、番号１３０－０９４－７７５）を用いて単離した。並行して、ＣＤ２５陽性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、番号１３０－０９２－９８３）の陰性フラクションを集め、その後、ＣＤ４^＋が豊富なもの（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、番号１３０－０４５－１０１）を選択することによって、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－従来のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）を単離した。Ｔｃｏｎｖを、ＣＦＳＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃６５－０８５０－８４）で標識し、Ｔｒｅｇを、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５７）で標識し、両集団の増殖を追跡した。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇは、培養プレートに一緒に接種され、１μｇ／ｍｌ ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、番号３１７３１５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用い、４℃で一晩被覆された。ＣＤ２８を、溶液で、濃度１ｇ／ｍｌ ＣＤ２８の濃度で加えた（クローンＣＤ２８．２、３０２９２３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。刺激から５日後に、研究室内でＡＦ６４７で両方とも標識したＰＤ１（０３７６）及びＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ（０５９２）を用いて結合アッセイを行った。

【0332】

図８Ａは、同じサンプル内で、Ｔｒｅｇと比較して、Ｔｃｏｎｖに結合した所与の抗体の頻度のΔ値を示し、それぞれの記号は、別個のドナーを表し、平行線は、Ｎ＝４でのメジアンを示す。図８Ｂは、Ｔｃｏｎｖ（黒色線）及びＴｒｅｇ（灰色）に対する結合を示す代表的なドナーの１つからのΔ値を示す。ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ三重特異性抗体は、ＰＤ１と匹敵する結合プロフィールを示す（図８Ａ及び８Ｂ）。両方の分子は、ＴｒｅｇよりもＴｃｏｎｖでのＰＤ－１発現レベルが高いため、ＴｒｅｇよりもＴｃｏｎｖに対して高い結合能力を示す。従って、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ二重特異性抗体は、ＩＬ２ｖが抗体に結合するにも関わらず、ＰＤ１の結合特性を維持する。

【0333】

実施例５Ｂ．Ｔｒｅｇ抑制アッセイにおいてＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ処置したときのＴｃｏｎｖエフェクター機能の救済
次の工程で、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖが、ＴｃｏｎｖのＴｒｅｇ抑制を回復することができるかどうかを試験した。したがって、本願発明者らは、アロ特異的刺激について無関係のドナーからのＣＤ４^－ＣＤ２５^－存在下、ブロッキング抗体を含み、又は含まずに、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇを５日間一緒に培養する抑制機能アッセイを確立した。この目的のために、Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇを、上に記載したとおりに単離し、標識した。ゴルジ複合体内のサイトカインの蓄積は、ＦＡＣＳ染色の前に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ番号５５５０２９、ＢＤ ａｎｄ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ番号５５４７２４、ＢＤ）を５時間適用することによって向上した。

【0334】

Ｔｒｅｇ存在下及び非存在下で、増殖したＴｃｏｎｖがグランザイムＢ（ＧｒｚＢ）及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を分泌する能力を測定した。Ｔｒｅｇ抑制を以下の式を用いて計算した。
サイトカイン抑制％＝１００－（サイトカイン％_{Ｔｃｏｎｖ＋Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体}）／（サイトカイン％_{Ｔｃｏｎｖ未処置}）＊１００）
式中、サイトカイン％_{（Ｔｃｏｎｖ＋Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体）}は、Ｔｒｅｇ±ブロッキング抗体存在下、Ｔｃｏｎｖによって分泌するサイトカインのレベルであり、サイトカイン％_{（Ｔｃｏｎｖ未処置）}は、Ｔｒｅｇ非存在下、Ｔｃｏｎｖによって分泌するサイトカインのレベルである。図９において、同時培養５日後のＴｃｏｎｖによって分泌したグランザイムＢ（図９Ａ）及びインターフェロン－γ（図９Ｂ）のＴｒｅｇによる抑制の割合が示される。それぞれの記号は、別個のドナーを表し、水平線は、Ｎ＝５のメジアンを示し、０％の点線は、Ｔｒｅｇによる抑制がないことを表す。Ｐは、一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算された（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【0335】

ＰＤ１抗体（０３７６）を用いて処置すると、未処置群の抑制のメジアン６８．６％と比較して、Ｔｃｏｎｖ機能抑制のメジアンが４７．７％である（統計的有意性なし）。同様に、アテゾリズマブ、ニボルマブ及びペンブロリズマブを用いたＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用のブロックは、研究室内のＰＤ１での傾向と同じ傾向を示した。興味深いことに、ＤＰ４７－ＩＬ２ｖ（メジアン＝－１１．３％、ｐ＝０．００１１）及びＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ（メジアン＝－３７．３％、ｐ＜０．０００１）は、Ｔｒｅｇ抑制から、Ｔｃｏｎｖ ＧｒｚＢエフェクター機能を救済した。更に、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖは、ＰＤ１単独の場合よりも、更に有意に（ｐ＝０．００１６）更に強力であった。これと並行して、ＴｒｅｇによるＴｃｏｎｖのＩＮＦγ抑制について、同じ分析を行った。ＤＰ４７－ＩＬ２ｖ（メジアン＝５１．７７％、ｐ＝０．０２５１）及びＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖ（メジアン＝２１．５８％、ｐ＝０．０００１）は、Ｔｒｅｇ抑制からＴｃｏｎｖ ＩＦＮγエフェクター機能を救済した。

【0336】

実施例６
実施例６Ａ．ドナー１及び２の細胞活性化（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）
健康なドナーから新しく単離したＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート（２００，０００細胞／ウェル）内の温かい培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ グルタミン）に接種した。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞を５０μｌのＩＬ２分子を含有する培地に再懸濁させ、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保存するために、刺激の直後に、等量のあらかじめ温めておいたＣｙｔｏｆｉｘバッファー（５５４６５５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、３７℃で１０分間かけて細胞を固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞内染色を可能にするために、細胞を、２００μｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、４℃で３０分欠けて透過化した。次いで、細胞を１５０μｌの冷たいＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２つの９６ウェル丸底プレートに分け、それぞれを２０μｌの抗体ミックス又はＩＩを用い、冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用し、ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用し、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり２％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー２００μｌで再懸濁した。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて分析を行った。
表１及び表２に係るＦＡＣＳ抗体ミックスを使用した。

【0337】

【0338】

図１０は、ドナー１の休止時ＰＭＢＣをＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ及びＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔで処置したときの、ＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す。試験した３種類全ての分子は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対して等しく強力である（Ｔｒｅｇを除く）。ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化し、その後にＰＤ１－ＩＬ２ｖを用いたときに、より強力である。ＦＡＰ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇについて、最も低い活性を有する。

【0339】

図１１は、ドナー２の休止時ＰＢＭＣをＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＩＬ２ｃ、ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔ及びＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖで処置したときの、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ａ）、ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ）、制御性Ｔ細胞（Ｃ）及びＮＫ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す。試験した４種類全ての分子は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対して匹敵する活性がある（Ｔｒｅｇを除く）。ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化し、その後にＰＤ１－ＩＬ２ｖを用いたときに、より強力である。ＦＡＰ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇについて、最も低い活性を有する。

【0340】

実施例６Ｂ．ドナー３及び４の細胞活性化（ｐＳＴＡＴ５アッセイ）
健康なドナーから単離し、凍結したＰＢＭＣを解凍し、３７℃で一晩培養した。次の日に、細胞を、９６ウェル丸底プレート（２００，０００細胞／ウェル）内の温かい培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン）に接種した。プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞を５０μｌのＩＬ２分子を含有する培地に再懸濁させ、３７℃で２０分間刺激した。リン酸化状態を保存するために、刺激の直後に、等量のあらかじめ温めておいたＣｙｔｏｆｉｘバッファー（５５４６５５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、３７℃で１０分間かけて細胞を固定した。その後、プレートを３００ｇで１０分間遠心分離処理し、上清を除去した。細胞内染色を可能にするために、細胞を、２００μｌのＰｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（５５８０５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中、４℃で３０分欠けて透過化した。次いで、細胞を１５０μｌの冷たいＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、２つの９６ウェル丸底プレートに分け、それぞれを２０μｌの抗体ミックス又はＩＩを用い、冷蔵庫内で６０分間染色した。抗体ミックスＩを使用し、ＣＤ４ Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞中のｐＳＴＡＴ５を染色し、抗体ミックスＩＩを使用し、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のｐＳＴＡＴ５を染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ウェルあたり２％のＰＦＡを含有するＦＡＣＳバッファー２００μｌで再懸濁した。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを用いて分析を行った。表３及び表４に係るＦＡＣＳ抗体ミックスを使用した。

【0341】

【0342】

図１２は、ドナー３の休止時ＰＭＢＣを、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔ、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖで処置したときのＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す。試験した４種類全ての分子は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対して匹敵する活性がある（Ｔｒｅｇを除く）。ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化し、その後にＰＤ１－ＩＬ２ｖを用いたときに、より強力である。ＦＡＰ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇについて、最も低い活性を有する。

【0343】

図１３は、ドナー４の休止時ＰＭＢＣを、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ、ＰＤ１－ＩＬ２ｖ、ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔ、ＰＤ１－ＴＩＭ３－ＩＬ２ｖで処置したときのＣＤ８ Ｔ細胞（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）、ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｃ）及び制御性Ｔ細胞（Ｄ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化を示す。試験した４種類全ての分子は、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ４ Ｔ細胞に対して匹敵する活性がある（Ｔｒｅｇを除く）。ＦＡＰ－ＩＬ２ｗｔは、ＴｒｅｇでＳＴＡＴ５リン酸化し、その後にＰＤ１－ＩＬ２ｖを用いたときに、より強力である。ＦＡＰ－ＩＬ２ｖは、Ｔｒｅｇについて、最も低い活性を有する。
＊ ＊ ＊
上述の発明を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、その全体が参考として明示的に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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