特許7148728７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－Ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド誘導体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-27
(45)【発行日】2022-10-05
(54)【発明の名称】７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－Ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド誘導体
(51)【国際特許分類】
C07D 487/04 20060101AFI20220928BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20220928BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220928BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220928BHJP
【ＦＩ】
C07D487/04 142
C07D487/04 CSP
A61K31/519
A61P37/02
A61P17/00
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021531412
(86)(22)【出願日】2019-12-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-26
(86)【国際出願番号】 US2019064427
(87)【国際公開番号】W WO2020123225
(87)【国際公開日】2020-06-18
【審査請求日】2021-06-01
(31)【優先権主張番号】62/777,395
(32)【優先日】2018-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100139310
【弁理士】
【氏名又は名称】吉光 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ザオゲン
(72)【発明者】
【氏名】ジェソップ，セオドア カーティス
【審査官】二星 陽帥
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５１９２２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０８７５９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０８１４８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／０７４２８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Moslin, R. 他，Identification of imidazo[1,2-b]pyridazine TYK2 pseudokinase ligands as potent and selective allosteric inhibitors of TYK2 signalling，Med. Chem. Comm.，2017年，8(4)，700-712
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ４８７／０４
Ａ６１Ｋ ３１／５１９
Ａ６１Ｐ １７／００ － ３７／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式の化合物であって、【化1】
式中、Ｒが、
【化2】
である、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
Ｒが、【化3】
である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
Ｒが、【化4】
である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
以下の式の請求項１または請求項２のいずれかに記載の化合物、【化5】
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
以下の式の請求項４に記載の化合物、【化6】
【請求項6】
以下の式の請求項１または請求項３のいずれかに記載の化合物、【化7】
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
以下の式の請求項６に記載の化合物、【化8】
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、患者における乾癬を治療するための医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、患者における全身性エリテマトーデスを治療するための医薬組成物。
【請求項10】
乾癬を治療するための薬剤の製造のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項11】
全身性エリテマトーデスを治療するための薬剤の製造のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を共に含む、医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＴＹＫ２のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）に結合し、かつある特定のサイトカインシグナル伝達、特にＩＬ－２３およびＩＦＮαシグナル伝達を阻害するある特定の新規化合物と、この化合物を含む医薬組成物と、乾癬などのある特定の自己免疫疾患を治療するためにこの化合物を使用する方法と、この化合物の合成に有用な中間体およびプロセスとに関する。
【背景技術】
【0002】
本発明は、ある特定の炎症性サイトカインのＴＹＫ２シグナル伝達によって媒介されると考えられる乾癬および／または糖尿病などの他の自己免疫疾患の治療の分野にある（例えば、Ｊ．Ｓ．Ｔｏｋａｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２９０（１７），ｐａｇｅｓ １１０６１－１１０７４（２０１５）、およびＬ．Ｍａｒｒｏｑｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ ３８０８－３８１７（２０１５）を参照されたい）。乾癬は慢性皮膚病であり、一般人口の約２％が罹患していると推定される。乾癬の治療選択肢には、例えば、コルチコステロイドなどの局所治療、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）光などの光線療法、およびメトトレキサートおよびアプレミラストなどの全身療法が挙げられる。残念ながら、そのような薬剤は効果的な治療を常に提供するとは限らず、種々の有害な副作用を伴う可能性がある。したがって、乾癬および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患の治療には満たされていないニーズが存在し、新たな治療選択肢が所望される。
【0003】
ＷＯ２０１７／０８７５９０は、ＴＹＫ２に作用してシグナル伝達阻害を引き起こすことによるＩＬ－１２、ＩＬ－２３、および／またはＩＦＮαの調節を通じて、乾癬またはＳＬＥなどの自己免疫状態の治療に有用なある特定のイミダゾピリダジン化合物を開示する。米国特許第７，５５７，１１０号は、炎症性疾患および自己免疫疾患などのキナーゼ媒介性障害の治療に有用なキナーゼ阻害剤としてある特定のピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン誘導体を開示する。ある特定のイミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジンＴＹＫ２シュードキナーゼリガンドは、ＴＹＫ２シグナル伝達の強力かつ選択的な阻害剤としてＲ．Ｍｏｓｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ ７００－７１２（２０１７）によって開示される。
【0004】
ＴＹＫ２ ＪＨ２ドメインに作用し、ＩＬ－２３およびＩＦＮαのシグナル伝達を阻害するさらなる化合物が望まれる。本発明は、ＴＹＫ２ ＪＨ２ドメインに結合するある特定の新規化合物を提供する。さらに、本発明は、ＩＬ－２３およびＩＦＮαシグナル伝達を阻害するある特定の新規化合物を提供する。したがって、本発明は、乾癬およびＳＬＥなどの自己免疫疾患の治療に有用なある特定の新規化合物を提供する。
【発明の概要】
【0005】
したがって、本発明は、式Ｉの化合物であって、
式中、Ｒが、
である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化1】
式中、Ｒが、
【化2】
である、化合物、
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0006】
本発明は、乾癬の治療を必要とする患者における乾癬を治療する方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法も提供する。本発明は、ＳＬＥの治療を必要とする患者におけるＳＬＥを治療する方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、体軸性脊椎関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、２型糖尿病、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）からなる群から選択される疾患の治療を必要とする患者におけるかかる疾患を治療する方法であって、患者に、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む、方法をさらに提供する。さらに、本発明は、療法に使用するための、特に乾癬の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。加えて、本発明は、ＳＬＥの治療に使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、ＲＡ、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、体軸性脊椎関節炎、ＭＳ、１型糖尿病、２型糖尿病、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）からなる群から選択される疾患の治療に使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩も提供する。
【0007】
本発明は、乾癬を治療するための薬剤の製造のための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。加えて、本発明は、ＳＬＥを治療するための薬剤の製造のための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。本発明は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬性関節炎、ＲＡ、円形脱毛症、アトピー性皮膚炎、体軸性脊椎関節炎、ＭＳ、１型糖尿病、２型糖尿病、および成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）からなる群から選択される疾患を治療するための薬剤の製造のための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。
【0008】
本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に含む、医薬組成物をさらに提供する。本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するためのプロセスをさらに提供する。本発明は、式Ｉの化合物の合成のための新規の中間体およびプロセスも包含する。
【0009】
本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療」、または「治療する」という用語は、既存の症状または障害の進行または重症度を抑制すること、遅延させること、阻止すること、または改善することを含む。
【0010】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、哺乳類、特にヒトを指す。
【0011】
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者への単回または複数回投与の際に、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を示す。
【0012】
有効量は、既知技法の使用によって、かつ同様の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者により容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、患者の人種、そのサイズ、年齢、および全体的な健康状態、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の程度または関与または重症度、個々の患者の反応、投与される特定の化合物、投与の法式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投与レジメン、付随する薬物の使用、ならびに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が担当診断医によって考慮される。
【0013】
本発明の化合物は、本化合物を生物学的に利用可能にする任意の経路によって投与される医薬組成物として製剤化される。より好ましくは、かかる組成物は、経口投与用である。かかる医薬組成物およびそれを調製するためのプロセスは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌ．Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｅｄｉｔｏｒ，２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１２を参照されたい）。
【0014】
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、本発明の治療方法に特に有用であり、鏡像異性体を含むすべての立体配置およびラセミ体を含むそれらの混合物が本発明の範囲内で企図される。これらの立体配置が、本発明の治療方法および化合物の両方に適用可能であることが理解されるであろう。
【0015】
本発明の化合物は、
ならびにそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【化3】
ならびにそれらの薬学的に許容される塩を含む。
【0016】
式Ｉａ（ｉｉ）および式Ｉｂ（ｉｉ）の化合物が好ましく、式Ｉａ（ｉｉ）の化合物およびその薬学的に許容される塩が特に好ましい。
【0017】
以下の調製に記載されるある特定の中間体は、１つ以上の窒素保護基を含んでもよい。保護基は、特定の反応条件および実施される特定の変換に応じて、当業者によって認識されるように変化し得ることが理解される。保護および脱保護条件は、当業者に周知であり、文献（例えば、”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００７を参照されたい）に記載される。
【0018】
鏡像異性体を含む個々の異性体は、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法によって、本発明の化合物の合成における任意の好都合な時点において、当業者により分離または分割されてもよい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１、およびＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照されたい）。
【0019】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩を、例えば、当該技術分野で周知の標準的な条件下で、ジエチルエーテルなどの好適な溶媒中で、本発明の化合物の適切な遊離塩基の、適切な薬学的に許容される酸の反応によって形成することができる。加えて、かかる薬学的に許容される塩の形成は、窒素保護基の脱保護と同時に起こり得る。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，“Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７－４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）を参照されたい。
【0020】
ある特定の略語は以下のように定義される。「ＢＩＮＡＰ」は、（±）－２，２′－ビス（ジフェニルホスフィノ）－１，１′－ビナフタレンを指し、「ＢＯＰ」は、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ」は、ジシクロヘキシル［３，６－ジメトキシ－２’，４’，６’－トリス（１－メチルエチル）［１，１’－ビフェニル］－２－イル］ホスフィンを指し、「ｔ－ＢｕＯＨ」は、ｔ－ブタノールおよびｔ－ブチルアルコールを指し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを指し、「ＣＤＩ」は、１，１’－カルボニルジイミダゾールを指し、「ＤＣＣ」は、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミドを指し、「ＤＣＥ」は、ジクロロエタンを指し、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指し、「ＤＥＭ」は、マロン酸ジエチルを指し、「ＤＩＣ」は、１，３－ジイソプロピルカルボジイミドを指し、「ＤＩＥＡ」は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを指し、「ＤＭＡＰ」は、ジメチルアミノピリジンを指し、「ＤＭＥＭ」は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍを指し、「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指し、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ＤＰＰＡ」は、ジフェニルホスホリルアジドを指し、「ＥＤＣＩ」は、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩を指し、「ＥｔＯＡｃ」は、酢酸エチルを指し、「ＥｔＯＨ」は、エタノールおよびエチルアルコールを指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「第二世代グラブス触媒」は、（１，３－ビス（２，４，６－トリメチルフェニル）－２－イミダゾリジニリデン）ジクロロ（フェニルメチレン）（トリシクロヘキシルホスフィン）ルテニウムを指し、「ＨＡＴＵ」は、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＢＴＵ」は、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）（ジメチルアミノ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルメタニミニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＨＥＰＥＳ」は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸を指し、「ＨＯＡｔ」は、１－ヒドロキシ－７－アゾベンゾトリアゾールを指し、「ＨＯＢｔ」は、１－ヒドロキシルベンゾトリアゾール水和物を指し、「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを指し、「ＩＦＮα」は、インターフェロンアルファを指し、「ＩＬ－１２」は、インターロイキン１２を指し、「ＩＬ－２３」は、インターロイキン２３を指し、「ＩＰＡ」は、イソプロパノールおよびイソプロピルアルコールを指し、「ＪＡＫ」は、ヤヌスキナーゼを指し、「ＬｉＨＭＤＳ」は、リチウムヘキサメチルジシラジドを指し、「ＭｅＩ」は、ヨウ化メチルを指し、「ＭｅＮＨ２」は、メチルアミンを指し、「ＭｅＯＨ」は、メタノールおよびメチルアルコールを指し、「ＭＴＢＥ」は、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを指し、「ＮａＯＥｔ」は、ナトリウムエトキシドを指し、「ＮｉＮＴＡ」は、ニッケル－ニトリロ三酢酸を指し、「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝生理食塩水を指し、「Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２」は、二塩化（１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウム（ＩＩ）を指し、「Ｐｄ（ＯＡｃ）２」は、酢酸パラジウム（ＩＩ）を指し、「ＰｙＢＯＰ」は、（ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）を指し、「ＰｙＢｒＯＰ」は、ブロモ（トリピロリジニル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを指し、「ＲＰＭ」は、１分あたりの回転数を指し、「ＲＰＭＩ」は、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを指し、「ＳＰＡ」は、シンチレーション近接アッセイを指し、「ＴＥＡ」は、トリエチルアミンを指し、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指し、「ＴＨＦ」は、テトラヒドロフランを指し、「ＴＹＫ２」は、チロシンキナーゼ２を指し、「ＵＶＢ」は、紫外線Ｂを指し、「ＳＴＡＴ」は、転写タンパク質のシグナル伝達物質および活性化因子を指し、「ＹＳＩ」は、ケイ酸イットリウムを指す。
【0021】
本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩は、当業者に既知の様々な手順によって調製されてもよく、そのうちのいくつかが、以下のスキーム、調製法、および実施例に示される。以下のスキームにおける各ステップの生成物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当該技術分野で周知の従来の方法によって回収することができる。以下のスキームにおいて、すべての置換基は、別途指示のない限り、すでに定義した通りである。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、以下のスキーム、調製、および実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【化4】
【0022】
スキーム１、ステップＡは、化合物（１）へのＤＥＭの添加、およびＥｔＯＨなどの溶媒中で約８０℃でＮａＯＥｔまたはカリウムｔ－ブトキシドなどの好適な塩基を使用した化合物（２）へのその後の環化を示す。
【0023】
ステップＢにおいて、化合物（２）の７－ヒドロキシおよび５－オキソ基を、約５０～１００℃で、アセトニトリルなどの好適な溶媒中でＰＯＣｌ３などの好適な塩素源およびピリジンなどの好適な有機塩基を使用して塩素化して、化合物（３）を得ることができる。
【0024】
ステップＣにおいて、化合物（３）の７－クロロ基上の選択的求核芳香族置換を、周囲温度で１，４－ジオキサンなどの好適な溶媒中で１－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－メチル－メタンアミンなどの求核試薬およびＤＩＥＡなどの好適な有機塩基を使用して、当該技術分野で周知の条件下で実施して、化合物（４）を得ることができる。
【0025】
ステップＤにおいて、Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングを、当該技術分野で周知の条件下で、クロマン－８－アミン塩酸塩または６－メチルピリジン－２－アミンなどのアミンと共に化合物（４）に対して実施して、Ｐｄ（ＯＡｃ）２およびＢｒｅｔｔＰｈｏｓなどの好適な触媒およびリガンドの組み合わせ、および約１，４－ジオキサンなどの溶媒中で炭酸カリウムなどの好適な塩基を使用して、約１３０℃でマイクロ波加熱しつつ実施して化合物（５）を形成することができる。
【0026】
化合物（５）を、１，４－ジオキサンおよびＭｅＯＨなどの溶媒中のＮａＯＨ水溶液で、約５０～８０℃で処理して、ステップＥに示すようにエステルの塩基性加水分解により化合物（６）を得ることができる。
【0027】
ステップＦにおいて、ＤＭＦなどの好適な溶媒中でＤＩＥＡなどの好適な有機塩基およびＢＯＰなどの好切なカップリング剤を使用して、化合物（６）と（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オンなどのアミンとの間でアミドカップリングを実施して、化合物（７）を得ることができる。当業者は、カルボン酸およびアミンとの反応から生じるアミド形成のためのいくつかの適切な方法があることを認識するであろう。例えば、ＤＩＥＡまたはＴＥＡなどの有機塩基を含むまたは含まないカップリング試薬の存在下でのアミン化合物の適切なカルボン酸との反応は、ステップＦの化合物を提供することができる。カップリング試薬には、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣＩなどのカルボジイミド、またはＣＤＩなどのカルボニルジイミダゾールが挙げられる。ＨＯＢｔおよびＨＯＡｔなどのアミドカップリング添加剤をまた使用して、反応を増強することができる。加えて、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢＯＰ、およびＰｙＢｒＯＰなどの非求核性アニオンのウロニウムまたはホスホニウム塩を、より伝統的なカップリング試薬の代わりに使用することができる。ＤＭＡＰなどの添加剤を使用して反応を増強し得る。
【0028】
ステップＧにおいて、化合物（７）を、約５０℃で、ＤＣＥなどの好適な溶媒中でＴＦＡなどの好適な酸を使用して、標準条件下で脱保護して、式Ｉの化合物を得る。
【化5】
【0029】
スキーム２、ステップＡにおいて、化合物（９）の形成を、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２などの好適な触媒と炭酸カリウムなどの好適な塩基とを、約９０℃で１，４－ジオキサンおよび水などの好適な溶媒系中で使用して、化合物（８）とビニルトリフルオロホウ酸カリウムとの間の鈴木・宮浦クロスカップリングとして示す。
【0030】
ステップＢにおいて、芳香族求核置換により、当該技術分野で周知の条件下で、化合物（９）とアリルアルコールとの間で、約６０℃で炭酸カリウムなどの適切な塩基を使用して化合物（１０）が得られることを示す。
【0031】
化合物（１０）の触媒閉環メタセシスにより、ＤＣＭなどの適切な溶媒中で、Ｇｒｕｂｂｓ触媒第２世代などの適切な触媒を使用して、化合物（１１）が得られることをステップＣに示す。
【0032】
ステップＤにおいて、化合物（１１）のパラジウム触媒によるニトロ／アルケン還元により、当該技術分野で周知の条件下で、ＭｅＯＨおよびＴＨＦなどの好適な溶媒系中で、水素雰囲気下で炭素上の１０％Ｐｄなどの適切な触媒を使用して、化合物（１２）が得られることを示す。
【化6】
【0033】
スキーム３、ステップＡにおいて、化合物（１４）の形成を、０～２２℃のＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの好適な有機塩基およびＨＡＴＵなどの適切なカップリング剤を使用する、化合物（１３）およびＭｅＮＨ２の間のスキーム１、ステップＦに一般的に記載されるような当該技術分野で周知の条件下でのアミドカップリングとして示す。
【0034】
ステップＢにおいて、ジメチルスルホニウムヨージド塩を形成するための化合物（１４）へのＭｅＩの添加、続いて０～２２℃でのＴＨＦなどの好適な溶媒中でＬｉＨＭＤＳなどの好適な塩基での処理を使用して、環化化合物（１５）を得ることができる。
【0035】
ステップＣにおいて、化合物（１５）を、約５５℃のアセトニトリルなどの好適な溶媒中で４－メチルベンゼンスルホン酸などの好適な酸を使用して、標準条件下で脱保護し、続いてＭＴＢＥなどの溶媒を添加して化合物（１６）を沈殿させる。
【化7】
【0036】
式Ｉａ（ｉｉ）およびＩｂ（ｉｉ）などの式Ｉの化合物はまた、当業者によって容易に理解される適切な対応する出発物質を利用して、スキーム４に記載のように調製することができる。より具体的には、例えば、スキーム４、ステップＡにおいて、化合物（３）の７－クロロ基上の選択的求核芳香族置換を、周囲温度で、ＴＨＦなどの好適な溶媒中でＭｅＮＨ２などの適切な求核試薬を使用して、当該技術分野で周知の条件下で実施して、化合物（１７）を得ることができる。
【0037】
スキーム４、ステップＡにおいて、化合物（３）の７－クロロ基上の選択的求核芳香族置換を、周囲温度で、ＴＨＦなどの好適な溶媒中でＭｅＮＨ２などの適切な求核試薬を使用して、当該技術分野で周知の条件下で実施して、化合物（１７）を得ることができる。
【0038】
ステップＢにおいて、Ｂｕｃｈｗａｌｄカップリングを、化合物（１２）と共に化合物（１７）で実施して、１，４－ジオキサンおよび２－メチル－２－ブタノールなどの適切な溶媒系中で、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体、ＢＩＮＡＰなどの好適な触媒およびリガンド系を酢酸カリウムなどの好適な塩基と共に使用し、１２５℃で加熱して、化合物（１８）を形成することができる。
【0039】
化合物（１８）を、還流下でＭｅＯＨおよびＴＨＦなどの好適な溶媒系中で水性ＬｉＯＨなどの好適な塩基で処理して、ステップＣに示すようにエステルの塩基性加水分解により化合物（１９）を得ることができる。
【0040】
ステップＤは、ＤＭＦなどの溶媒中でＤＩＥＡなどの好適な有機塩基およびＢＯＰなどの好適なカップリング剤を使用して、化合物（１９）と化合物（１６）との間での、スキーム１、ステップＦに一般的に記載されるような、当該技術分野で周知の条件下でのアミドカップリングによる式Ｉａ（ｉｉ）の形成を示す。
【0041】
調製物１
スキーム１、ステップＡ：エチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（１２．５ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）、およびＤＥＭ（１８．５ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（９０ｍＬ）に溶解する。この混合物に、ＮａＯＥｔ（ＥｔＯＨ中２１質量％、４５．１ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を９０℃で２４時間撹拌する。この後、反応物を周囲温度まで冷却する。次いで、混合物を５Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色の固体として得る（１１．７ｇ、６５．１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
【化8】
スキーム１、ステップＡ：エチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（１２．５ｇ、８０．６ｍｍｏｌ）、およびＤＥＭ（１８．５ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ（９０ｍＬ）に溶解する。この混合物に、ＮａＯＥｔ（ＥｔＯＨ中２１質量％、４５．１ｍＬ、１２１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を９０℃で２４時間撹拌する。この後、反応物を周囲温度まで冷却する。次いで、混合物を５Ｎ ＨＣｌ水溶液で酸性にし、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色の固体として得る（１１．７ｇ、６５．１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
【0042】
代替調製物１
スキーム１、ステップＡ：ＥｔＯＨ（６．００Ｌ）中のエチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（４００ｇ、２．５８ｍｏｌ）およびＤＥＭ（５８４ｍＬ、３．８７ｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ－ブトキシド（５７８ｇ、５．１６ｍｏｌ）を窒素下で、２５℃で添加する。溶液を８０℃で１２時間撹拌し、次いで反応物を２２℃まで冷却する。反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）で希釈し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを３に調整する。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオフホワイトの固体として得る（４６０ｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
スキーム１、ステップＡ：ＥｔＯＨ（６．００Ｌ）中のエチル５－アミノ－１Ｈ－ピラゾール－４－カルボキシレート（４００ｇ、２．５８ｍｏｌ）およびＤＥＭ（５８４ｍＬ、３．８７ｍｏｌ）の溶液に、カリウムｔ－ブトキシド（５７８ｇ、５．１６ｍｏｌ）を窒素下で、２５℃で添加する。溶液を８０℃で１２時間撹拌し、次いで反応物を２２℃まで冷却する。反応混合物を０．１Ｎ ＨＣｌ（２Ｌ）で希釈し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを３に調整する。混合物を濾過し、フィルターケーキを水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオフホワイトの固体として得る（４６０ｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２２４（Ｍ＋Ｈ）。
【0043】
調製物２
スキーム１、ステップＢ：エチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１１．７ｇ、５２．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に懸濁し、窒素で５分パージする。この混合物に、ＰＯＣｌ３（１４．８ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ）、続いてピリジン（４．２８ｍＬ、５２．４ｍｍｏｌ）を５０℃で添加し、次いで反応物を１００℃で５時間撹拌する。この後、反応物を周囲温度まで冷却し、氷／水混合物に注ぐ。この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和し、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色固体として得る（１３ｇ、９５．３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【化9】
スキーム１、ステップＢ：エチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１１．７ｇ、５２．４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）に懸濁し、窒素で５分パージする。この混合物に、ＰＯＣｌ３（１４．８ｍＬ、１５７ｍｍｏｌ）、続いてピリジン（４．２８ｍＬ、５２．４ｍｍｏｌ）を５０℃で添加し、次いで反応物を１００℃で５時間撹拌する。この後、反応物を周囲温度まで冷却し、氷／水混合物に注ぐ。この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和し、得られた沈殿物を濾過して、表題化合物を白色固体として得る（１３ｇ、９５．３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0044】
代替調製物２
スキーム１、ステップＢ：アセトニトリル（２Ｌ）中のエチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｇ、１．７９ｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（４１６ｍＬ、４．４８ｍｏｌ）およびピリジン（２１７ｍｌ、２．６９ｍｏｌ）を窒素下で、５０℃で滴下する。反応物を８０℃で１２時間撹拌する。反応混合物を蒸発させ、残留物を水（２Ｌ）に注ぐ。反応混合物を濾過し、固体を水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオレンジ色の固体として得る（３６０ｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
スキーム１、ステップＢ：アセトニトリル（２Ｌ）中のエチル７－ヒドロキシ－５－オキソ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｇ、１．７９ｍｏｌ）の懸濁液に、ＰＯＣｌ３（４１６ｍＬ、４．４８ｍｏｌ）およびピリジン（２１７ｍｌ、２．６９ｍｏｌ）を窒素下で、５０℃で滴下する。反応物を８０℃で１２時間撹拌する。反応混合物を蒸発させ、残留物を水（２Ｌ）に注ぐ。反応混合物を濾過し、固体を水（８００ｍＬ）で洗浄する。固体を真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物をオレンジ色の固体として得る（３６０ｇ、６６％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６０／２６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0045】
調製物３
スキーム１、ステップＣ：エチル５，７－ジクロロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（４０ｍＬ）に溶解する。この混合物に、１－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－メチル－メタンアミン（３．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（６．７ｍＬ、３８．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を周囲温度で２時間撹拌する。この後、反応を水（１００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出する。次いで、合わせた有機物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。この残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～７０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を濃厚な透明な油として得、これは静置すると白色の固体に固化する（３．５５ｇ、４９．３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３７５／３７７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【化10】
スキーム１、ステップＣ：エチル５，７－ジクロロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（４０ｍＬ）に溶解する。この混合物に、１－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－メチル－メタンアミン（３．５ｇ、２０ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＥＡ（６．７ｍＬ、３８．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を周囲温度で２時間撹拌する。この後、反応を水（１００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出する。次いで、合わせた有機物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。この残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～７０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を濃厚な透明な油として得、これは静置すると白色の固体に固化する（３．５５ｇ、４９．３％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）３７５／３７７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0046】
調製物３ａ
スキーム４、ステップＡ：エチル５，７－ジクロロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５０．０ｇ、１９２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５０ｍＬ）に添加し、溶液を１０℃まで冷却する。次いで、ＭｅＮＨ２溶液（ＥｔＯＨ中３３％ｗ／ｗ）（７９ｍＬ、６３４ｍｍｏｌ）を添加し、温度を２０℃未満に保つ。反応混合物を撹拌し、２２℃まで温め、４時間撹拌する。次いで水（３００ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１時間撹拌する。
【化11】
スキーム４、ステップＡ：エチル５，７－ジクロロピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５０．０ｇ、１９２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５０ｍＬ）に添加し、溶液を１０℃まで冷却する。次いで、ＭｅＮＨ２溶液（ＥｔＯＨ中３３％ｗ／ｗ）（７９ｍＬ、６３４ｍｍｏｌ）を添加し、温度を２０℃未満に保つ。反応混合物を撹拌し、２２℃まで温め、４時間撹拌する。次いで水（３００ｍＬ）を添加し、混合物をさらに１時間撹拌する。
【0047】
得られた固体を濾過により収集し、ＴＨＦ／水混合物（２：３）（１００ｍＬ）および水（４００ｍＬ）で洗浄する。次いで、固体を真空（１０ｍｂａｒ／５０℃）下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体（４９．５ｇ、９０％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２５５／２５７［Ｍ＋Ｈ］＋。
【0048】
調製物４
スキーム２、ステップＡ：フラスコにビニルトリフルオロホウ酸カリウム（１７ｇ、１２０．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４０ｇ、２８６．５ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を入れる。フラスコを排気し、窒素を３回戻し充填する。１，４－ジオキサン（４５０ｍＬ）、水（１４０ｍＬ）、および１－ブロモ－２－フルオロ－３－ニトロベンゼン（２０ｇ、９０．１ｍｍｏｌ）を添加する。再びフラスコを排気し、窒素を戻し充填する。反応混合物を９０℃まで３．５時間加熱し、次いで室温まで冷却する。層を分離し、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を淡黄色の油（１３．１ｇ、８４％）として得る。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）δ８．０９－８．０３（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【化12】
スキーム２、ステップＡ：フラスコにビニルトリフルオロホウ酸カリウム（１７ｇ、１２０．６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４０ｇ、２８６．５ｍｍｏｌ）、およびＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を入れる。フラスコを排気し、窒素を３回戻し充填する。１，４－ジオキサン（４５０ｍＬ）、水（１４０ｍＬ）、および１－ブロモ－２－フルオロ－３－ニトロベンゼン（２０ｇ、９０．１ｍｍｏｌ）を添加する。再びフラスコを排気し、窒素を戻し充填する。反応混合物を９０℃まで３．５時間加熱し、次いで室温まで冷却する。層を分離し、有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を淡黄色の油（１３．１ｇ、８４％）として得る。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）δ８．０９－８．０３（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，１７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【0049】
調製物５
スキーム２、ステップＢ：アリルアルコール（１８．８ｇ、３２３ｍｍｏｌ）、２－フルオロ－１－ニトロ－３－ビニル－ベンゼン（１２．２ｇ、６９．３ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（３１ｇ、２２４ｍｍｏｌ）の混合物を６０℃まで１６時間加熱した後、室温まで冷却する。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、固体を濾過して廃棄する。濾液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１５％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を油として得る（１３．４ｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２０６（Ｍ＋Ｈ）。
【化13】
スキーム２、ステップＢ：アリルアルコール（１８．８ｇ、３２３ｍｍｏｌ）、２－フルオロ－１－ニトロ－３－ビニル－ベンゼン（１２．２ｇ、６９．３ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（３１ｇ、２２４ｍｍｏｌ）の混合物を６０℃まで１６時間加熱した後、室温まで冷却する。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、固体を濾過して廃棄する。濾液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～１５％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を油として得る（１３．４ｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２０６（Ｍ＋Ｈ）。
【0050】
調製物６
スキーム２、ステップＣ：ＤＣＭ（５００ｍＬ）中２－アリルオキシ－１－ニトロ－３－ビニル－ベンゼン（１３．４ｇ、６５．３ｍｍｏｌ）に、Ｇｒｕｂｎｂｓ触媒第２世代（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコを窒素でフラッシュし、室温で６時間撹拌する。次いで、混合物を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～２０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物をワックス状の黄色の固体（１０．６ｇ、９１％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１７８（Ｍ＋Ｈ）。
【化14】
スキーム２、ステップＣ：ＤＣＭ（５００ｍＬ）中２－アリルオキシ－１－ニトロ－３－ビニル－ベンゼン（１３．４ｇ、６５．３ｍｍｏｌ）に、Ｇｒｕｂｎｂｓ触媒第２世代（３００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加する。フラスコを窒素でフラッシュし、室温で６時間撹拌する。次いで、混合物を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～２０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物をワックス状の黄色の固体（１０．６ｇ、９１％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１７８（Ｍ＋Ｈ）。
【0051】
調製物７
スキーム２、ステップＤ：ＭｅＯＨ（３５０ｍＬ）およびＴＨＦ（３５０ｍＬ）中の８－ニトロ－２Ｈ－クロメン（２２．２ｇ、１２５ｍｍｏｌ）および炭素上の１０％Ｐｄ（６００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で水素１気圧下で撹拌する。４時間後、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）中の炭素上の１０％Ｐｄ（４５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のスラリーを添加し、混合物を、水素１気圧下、室温でさらに１６時間撹拌する。混合物を濾過し、濾液を蒸発させて、表題化合物を油として得る（１７．６ｇ、９２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１５０（Ｍ＋Ｈ）。
【化15】
スキーム２、ステップＤ：ＭｅＯＨ（３５０ｍＬ）およびＴＨＦ（３５０ｍＬ）中の８－ニトロ－２Ｈ－クロメン（２２．２ｇ、１２５ｍｍｏｌ）および炭素上の１０％Ｐｄ（６００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で水素１気圧下で撹拌する。４時間後、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）中の炭素上の１０％Ｐｄ（４５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）のスラリーを添加し、混合物を、水素１気圧下、室温でさらに１６時間撹拌する。混合物を濾過し、濾液を蒸発させて、表題化合物を油として得る（１７．６ｇ、９２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１５０（Ｍ＋Ｈ）。
【0052】
調製物８
スキーム３、ステップＡ：ＤＭＦ（４Ｌ）中の（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｄ－メチオニン（４００ｇ、１．６ｍｏｌ）、メチルアミン塩酸塩（１６２．４７ｇ、２．４ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７００ｍＬ、４．０１ｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、ＨＡＴＵ（７３２．１ｇ、１．９２ｍｏｌ）を添加する。反応物を周囲温度まで温める。２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させる。次いで、水（１０Ｌ）を添加し、水溶液をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機層を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。得られた残留物を、ヘキサン中のＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（３６８ｇ、８７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２６３（Ｍ＋Ｈ）。
【化16】
スキーム３、ステップＡ：ＤＭＦ（４Ｌ）中の（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－Ｄ－メチオニン（４００ｇ、１．６ｍｏｌ）、メチルアミン塩酸塩（１６２．４７ｇ、２．４ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（７００ｍＬ、４．０１ｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、ＨＡＴＵ（７３２．１ｇ、１．９２ｍｏｌ）を添加する。反応物を周囲温度まで温める。２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させる。次いで、水（１０Ｌ）を添加し、水溶液をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機層を合わせ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。得られた残留物を、ヘキサン中のＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（３６８ｇ、８７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２６３（Ｍ＋Ｈ）。
【0053】
調製物９
スキーム３、ステップＢ：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（１Ｒ）－１－（メチルカルバモイル）－３－メチルスルファニル－プロピル］カルバメート（３６８ｇ、１．４０ｍｏｌ）およびＭｅＩ（３．６８Ｌ、５９．１１ｍｏｌ）の混合物を、周囲温度で１８時間撹拌する。次いで、混合物を蒸発させる。得られた粗製ジメチルスルホニウムヨージド塩（２１０ｇ、０．５２ｍｏｌ）の一部分をＴＨＦ（４．７Ｌ）に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却し、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中の１．００Ｍ溶液（１．１６Ｌ、１．１６ｍｏｌ）を滴下する。次いで、反応混合物を周囲温度まで温める。４時間後、水（２．４Ｌ）を添加し、溶媒を蒸発させて半分の体積にする。混合物をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機物を合わせて蒸発させる。残留物を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（５０ｇ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２１５（Ｍ＋Ｈ）。キラルＨＰＬＣ：Ｒｔ（保持時間）＝９．１３分；ＬＣカラム：ＣｈｉｒａｌＰＡｃ ＩＡ ＯＤ ４．６×２５０ｍｍ ５μｍ；アイソクラティック：０．１％ジエチルアミン／ヘキサン／エタノール（８５／１５）；カラム温度：２５℃；流速：１．０ｍＬ／分。旋光度：［α］Ｄ ２０＝＋５３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
【化17】
スキーム３、ステップＢ：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（１Ｒ）－１－（メチルカルバモイル）－３－メチルスルファニル－プロピル］カルバメート（３６８ｇ、１．４０ｍｏｌ）およびＭｅＩ（３．６８Ｌ、５９．１１ｍｏｌ）の混合物を、周囲温度で１８時間撹拌する。次いで、混合物を蒸発させる。得られた粗製ジメチルスルホニウムヨージド塩（２１０ｇ、０．５２ｍｏｌ）の一部分をＴＨＦ（４．７Ｌ）に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却し、ＬｉＨＭＤＳ（ＴＨＦ中の１．００Ｍ溶液（１．１６Ｌ、１．１６ｍｏｌ）を滴下する。次いで、反応混合物を周囲温度まで温める。４時間後、水（２．４Ｌ）を添加し、溶媒を蒸発させて半分の体積にする。混合物をＤＣＭ（２×３Ｌ）で抽出する。有機物を合わせて蒸発させる。残留物を、ＤＣＭ中のＭｅＯＨで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、表題化合物を白色の固体として得る（５０ｇ）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ２１５（Ｍ＋Ｈ）。キラルＨＰＬＣ：Ｒｔ（保持時間）＝９．１３分；ＬＣカラム：ＣｈｉｒａｌＰＡｃ ＩＡ ＯＤ ４．６×２５０ｍｍ ５μｍ；アイソクラティック：０．１％ジエチルアミン／ヘキサン／エタノール（８５／１５）；カラム温度：２５℃；流速：１．０ｍＬ／分。旋光度：［α］Ｄ ２０＝＋５３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
【0054】
調製物１０
スキーム３、ステップＣ：アセトニトリル（５００ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］カルバメート（４６ｇ、２１４．６９ｍｍｏｌ）および４－メチルベンゼンスルホン酸（７４．５ｇ、４３３ｍｍｏｌ）を５５℃で加熱し、４時間撹拌する。次いで、ＭＴＢＥ（１Ｌ）を添加し、混合物を２２℃まで冷却する。得られた固体を濾過により収集し、追加のＭＴＢＥで洗浄し、真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物を白色の固体として得る（６０ｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１１５（Ｍ＋Ｈ）。旋光度：［α］Ｄ ２０＝＋３１．３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
【化18】
スキーム３、ステップＣ：アセトニトリル（５００ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］カルバメート（４６ｇ、２１４．６９ｍｍｏｌ）および４－メチルベンゼンスルホン酸（７４．５ｇ、４３３ｍｍｏｌ）を５５℃で加熱し、４時間撹拌する。次いで、ＭＴＢＥ（１Ｌ）を添加し、混合物を２２℃まで冷却する。得られた固体を濾過により収集し、追加のＭＴＢＥで洗浄し、真空下で恒重量まで乾燥させて、表題化合物を白色の固体として得る（６０ｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ１１５（Ｍ＋Ｈ）。旋光度：［α］Ｄ ２０＝＋３１．３°（Ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。
【0055】
調製物１１
スキーム１、ステップＤ：火炎乾燥マイクロ波バイアルに、５－クロロ－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、クロマン－８－アミン塩酸塩（２４０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４５０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（２０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加する。バイアルを排気し、窒素を３回戻し充填する。１，４－ジオキサン（４．５ｍＬ）を添加し、バイアルを再び窒素でフラッシュする。混合物をマイクロ波で１３０℃まで２５分間加熱し、室温まで冷却し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で希釈し、珪藻土で濾過し、蒸発させる。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を油として得る（２３２ｍｇ、４２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４８８（＋Ｈ）。
【化19】
スキーム１、ステップＤ：火炎乾燥マイクロ波バイアルに、５－クロロ－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（４００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、クロマン－８－アミン塩酸塩（２４０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４５０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＡｃ）２（２０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加する。バイアルを排気し、窒素を３回戻し充填する。１，４－ジオキサン（４．５ｍＬ）を添加し、バイアルを再び窒素でフラッシュする。混合物をマイクロ波で１３０℃まで２５分間加熱し、室温まで冷却し、ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で希釈し、珪藻土で濾過し、蒸発させる。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～４０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、表題化合物を油として得る（２３２ｍｇ、４２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４８８（＋Ｈ）。
【0056】
以下の化合物を、調製物１１の方法に本質的に類似する様式で調製する。
【表1】
【0057】
調製物１１ａ
スキーム４、ステップＢ：圧力フラスコにエチル５－クロロ－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１４ｇ、５５ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２．１ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体（６２０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）、および酢酸カリウム（１０．８ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を入れ、次いで窒素でフラッシュした。窒素を１０分間スパージしたクロマン－８－アミン（９ｇ、６０ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（１６０ｍＬ）中溶液を混合物に添加し、続いて２－メチルブタン－２－オール（２０ｍＬ）を添加する。フラスコを窒素でフラッシュし、１２５℃で加熱する。２時間後、混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈する。混合物を珪藻土で濾過し、蒸発させる。残留物をＥｔＯＡｃと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて赤色の半固体にする。この残留物にＤＣＭ（８５ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌する。得られた固体を収集し、追加のＤＣＭで洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、わずかに桃色の物質を得る。濾液を総量６０ｍＬまで濃縮し、５分間撹拌する。得られた固体を収集し、追加のＤＣＭで洗浄し、前の固体の収集物と組み合わせ、真空下で乾燥させて、１１．２ｇの生成物を得る。残りの濾液をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、さらに３．８ｇの生成物を得る。収集したすべての固体を合わせて、表題化合物（１５．０ｇ、７４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３６８．０（Ｍ＋Ｈ）。
【化20】
スキーム４、ステップＢ：圧力フラスコにエチル５－クロロ－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（１４ｇ、５５ｍｍｏｌ）、ＢＩＮＡＰ（２．１ｇ、３．３ｍｍｏｌ）、アリルパラジウム（ＩＩ）クロリド二量体（６２０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）、および酢酸カリウム（１０．８ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を入れ、次いで窒素でフラッシュした。窒素を１０分間スパージしたクロマン－８－アミン（９ｇ、６０ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（１６０ｍＬ）中溶液を混合物に添加し、続いて２－メチルブタン－２－オール（２０ｍＬ）を添加する。フラスコを窒素でフラッシュし、１２５℃で加熱する。２時間後、混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈する。混合物を珪藻土で濾過し、蒸発させる。残留物をＥｔＯＡｃと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて赤色の半固体にする。この残留物にＤＣＭ（８５ｍＬ）を添加し、混合物を５分間撹拌する。得られた固体を収集し、追加のＤＣＭで洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、わずかに桃色の物質を得る。濾液を総量６０ｍＬまで濃縮し、５分間撹拌する。得られた固体を収集し、追加のＤＣＭで洗浄し、前の固体の収集物と組み合わせ、真空下で乾燥させて、１１．２ｇの生成物を得る。残りの濾液をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中０～５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、さらに３．８ｇの生成物を得る。収集したすべての固体を合わせて、表題化合物（１５．０ｇ、７４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３６８．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0058】
調製物１３
スキーム１、ステップＥ：エチル５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（２３２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、５Ｎ ＮａＯＨ（１ｍＬ、５ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）、および１，４－ジオキサン（４ｍＬ）の混合物を５０℃で撹拌する。１６時間後、反応物を室温まで冷却し、蒸発させる。残留物に、ＤＣＭ（２５ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、および５Ｎ ＨＣｌ（１ｍＬ）を添加する。５分後、層を分離する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、薄桃色の固体として表題化合物を得る（１８４ｍｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４６０（Ｍ＋Ｈ）。
【化21】
スキーム１、ステップＥ：エチル５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（２３２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、５Ｎ ＮａＯＨ（１ｍＬ、５ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）、および１，４－ジオキサン（４ｍＬ）の混合物を５０℃で撹拌する。１６時間後、反応物を室温まで冷却し、蒸発させる。残留物に、ＤＣＭ（２５ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、および５Ｎ ＨＣｌ（１ｍＬ）を添加する。５分後、層を分離する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、薄桃色の固体として表題化合物を得る（１８４ｍｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４６０（Ｍ＋Ｈ）。
【0059】
調製物１３ａ
スキーム４、ステップＣ：ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）およびＴＨＦ（２５ｍＬ）中のエチル５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（２１．８ｇ、５９ｍｍｏｌ）に、水（１２０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（５．７ｇ、２４０ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。混合物を窒素下で１時間加熱還流し、次いで室温まで冷却させる。５Ｎ ＨＣｌを添加して、ｐＨを約２に調整する。氷（１２５ｇ）を混合物に添加し、フラスコを氷水浴に入れる。３０分間撹拌した後、得られた固体を濾過し、氷冷水（７５ｍＬ）で洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体（１８．２ｇ、９０％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３４０．０（Ｍ＋Ｈ）。
【化22】
スキーム４、ステップＣ：ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）およびＴＨＦ（２５ｍＬ）中のエチル５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（２１．８ｇ、５９ｍｍｏｌ）に、水（１２０ｍＬ）中のＬｉＯＨ（５．７ｇ、２４０ｍｍｏｌ）の溶液を添加する。混合物を窒素下で１時間加熱還流し、次いで室温まで冷却させる。５Ｎ ＨＣｌを添加して、ｐＨを約２に調整する。氷（１２５ｇ）を混合物に添加し、フラスコを氷水浴に入れる。３０分間撹拌した後、得られた固体を濾過し、氷冷水（７５ｍＬ）で洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、表題化合物を淡褐色の固体（１８．２ｇ、９０％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３４０．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0060】
調製物１４
スキーム１、ステップＥ：エチル７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］－５－［（６－メチル－２－ピリジル）アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５３８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、５Ｎ ＮａＯＨ（０．８ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）、および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）の混合物を８０℃で撹拌する。４時間後、混合物を室温まで冷却し、一晩撹拌する。次いで、混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを約３に調整する。得られた固体を濾過し、真空下、室温で乾燥させて、表題化合物をベージュ色の固体として得る（４９３ｍｇ、９９＋％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４１９（Ｍ＋Ｈ）。
【化23】
スキーム１、ステップＥ：エチル７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］－５－［（６－メチル－２－ピリジル）アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキシレート（５３８ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、５Ｎ ＮａＯＨ（０．８ｍＬ、４ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）、および１，４－ジオキサン（５ｍＬ）の混合物を８０℃で撹拌する。４時間後、混合物を室温まで冷却し、一晩撹拌する。次いで、混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、５Ｎ ＨＣｌでｐＨを約３に調整する。得られた固体を濾過し、真空下、室温で乾燥させて、表題化合物をベージュ色の固体として得る（４９３ｍｇ、９９＋％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４１９（Ｍ＋Ｈ）。
【0061】
調製物１５
スキーム１、ステップＦ：ＤＭＦ（４ｍＬ）中の５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（１８８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン（７５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．１５ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）にＢＯＰ（３００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）添加する。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃと水とに分配する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中０～４０％ＭｅＯＨ）により精製して、表題化合物を白色固体として得る（１９１ｍｇ、８４％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ５５６（Ｍ＋Ｈ）。
【化24】
スキーム１、ステップＦ：ＤＭＦ（４ｍＬ）中の５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（１８８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン（７５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．１５ｍＬ、０．９ｍｍｏｌ）にＢＯＰ（３００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）添加する。室温で３０分間撹拌した後、反応混合物をＥｔＯＡｃと水とに分配する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中０～４０％ＭｅＯＨ）により精製して、表題化合物を白色固体として得る（１９１ｍｇ、８４％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ５５６（Ｍ＋Ｈ）。
【0062】
以下の化合物を、基本的に調製物１５の方法に類似する様式で調製する。
【表2】
【0063】
調製物１７
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ用のトレーサーの調製
（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－［４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］－１－ピペリジル］－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホネート；トリエチルアンモニウム
２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリン（５．９５ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍＬ）中のエチル５－クロロ－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（６．８ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で撹拌する。９０分後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。固体を、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層をさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、エチル５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレートを薄黄色の固体として得る。（１０．１２ｇ、８２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４０２．２（Ｍ＋Ｈ）。
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ用のトレーサーの調製
（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－［４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］－１－ピペリジル］－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホネート；トリエチルアンモニウム
２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリン（５．９５ｇ、２９．１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍＬ）中のエチル５－クロロ－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（６．８ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で撹拌する。９０分後、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄する。固体を、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層をさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、エチル５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレートを薄黄色の固体として得る。（１０．１２ｇ、８２％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４０２．２（Ｍ＋Ｈ）。
【0064】
５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキシレート（１０．１２ｇ、２３．７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦに溶解した２Ｍ ＭｅＮＨ２（７５ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）中で、室温で４時間撹拌する。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌する。得られた固体を収集し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて、５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミドを淡黄色の固体として得る（８．０３ｇ、７８％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３８７．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0065】
ｍ－クロロペルオキシ安息香酸（７０３ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２．５ｍＬ）中の５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－メチルスルファニル－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミド（５００ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）の懸濁液に０℃で添加し、室温まで温める。３０分後、ｔｅｒｔ－ブチル４－（４－アミノピラゾール－１－イル）ピペリジン－１－カルボキシレート（５２０ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で撹拌する。２４時間後、混合物をＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム水溶液とに分配する。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させる。得られた固体をジエチルエーテルで数回粉砕し、真空下で乾燥させて、ｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－）イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］ピペリジン－１－カルボキシレートを８６％純粋な黄色の固体として得る（７２０ｍｇ、８１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ６０５．２（Ｍ＋Ｈ）。
【0066】
ジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ（２．５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル４－［４－［［５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－６－（メチルカルバモイル）－１，２，４－トリアジン－３－イル］アミノ］ピラゾール－１－イル］ピペリジン－１－カルボキシレート（７２０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加し、室温で撹拌する。７２時間後、混合物を蒸発させる。得られた物質をＤＣＭ（１００ｍＬ）と水（２０ｍＬ）とに分配する。水層のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨを添加して＞８に調整し、３：１のクロロホルム／イソプロパノールで抽出する。有機層を混合し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた固体をジエチルエーテルで粉砕し、次いで真空下で乾燥させて、５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－［［１－（４－ピペリジル）ピラゾール－４－イル］アミノ］－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミドを８６％純粋な黄色の固体として得る（５８５ｍｇ、９７％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ５０５．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0067】
ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の（２Ｅ）－２－［（２Ｅ、４Ｅ）－５－［３－［６－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）オキシ－６－オキソ－ヘキシル］－３－メチル－５－スルホナト－１－（３－スルホナトプロピル）インドール－１－イウム－２－イル］ペンタ－２，４－ジエニリデン］－３，３－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）インドリン－５－スルホンナートトリエチルアンモニウム（１０ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の５－［２－メトキシ－３－（１－メチル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）アニリノ］－Ｎ－メチル－３－［［１－（４－ピペリジル）ピラゾール－４－イル］アミノ］－１，２，４－トリアジン－６－カルボキサミド（４．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．００２ｍＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応バイアルを光から保護するためにアルミホイルで包み、室温で一晩撹拌した。得られた残留物を、水中の０～２０％のアセトニトリルで溶出する分取ＨＰＬＣ（Ｋｉｎｅｔｅｘ ＥＶＯ Ｃ１８ ３０ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）によって精製して、表題化合物を明るい青色の固体（８．５ｍｇ、６５％）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ６７３．４（Ｍ＋Ｈ）。
【0068】
実施例１
スキーム１、ステップＧ：ＤＣＥ（３ｍＬ）中の５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－［（４－メトキシフェニル）メチル－－アミノ］－Ｎ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（１９１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）に、ＴＦＡ（１．５ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を５０℃まで４時間加熱し、室温まで冷却して、一晩撹拌する。混合物を蒸発させ、ＤＣＭと飽和重炭酸ナトリウム溶液とに分配する。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた残留物を高ｐＨＬＣ／ＭＳにより精製して、表題化合物を白色の固体として得る（３１ｍｇ、２１％）。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４３６（Ｍ＋Ｈ）。
【化25】
【0069】
実施例１の調製のための代替手順
５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）－Ｎ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド
スキーム４、ステップＤ：ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン４－メチルベンゼンスルホン酸塩（１５ｇ、５１ｍｍｏｌ）にＤＩＥＡ（２９ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）を添加する。５分間撹拌した後、５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（１４ｇ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＢＯＰ（２４ｇ、５３ｍｍｏｌ）を添加する。３０分間撹拌した後、水（２００ｍＬ）、続いて飽和重炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ）を添加し、フラスコを氷水浴中で冷却する。９０分間撹拌した後、得られた固体を濾過し、追加の水で洗浄し、真空下で乾燥させる。固体をクロロホルム：イソプロパノールの３：１混合物に溶解し、２Ｎ ＮａＯＨおよび飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させる。この物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物をオフホワイトの固体（６．７ｇ）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４３６．０（Ｍ＋Ｈ）。
５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）－Ｎ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド
スキーム４、ステップＤ：ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の（３Ｒ）－３－アミノ－１－メチル－ピロリジン－２－オン４－メチルベンゼンスルホン酸塩（１５ｇ、５１ｍｍｏｌ）にＤＩＥＡ（２９ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）を添加する。５分間撹拌した後、５－（クロマン－８－イルアミノ）－７－（メチルアミノ）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボン酸（１４ｇ、４１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＢＯＰ（２４ｇ、５３ｍｍｏｌ）を添加する。３０分間撹拌した後、水（２００ｍＬ）、続いて飽和重炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ）を添加し、フラスコを氷水浴中で冷却する。９０分間撹拌した後、得られた固体を濾過し、追加の水で洗浄し、真空下で乾燥させる。固体をクロロホルム：イソプロパノールの３：１混合物に溶解し、２Ｎ ＮａＯＨおよび飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させる。この物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０～８％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物をオフホワイトの固体（６．７ｇ）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ４３６．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0070】
実施例２
スキーム１、ステップＧ：ＴＦＡ（１ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＥ（２ｍＬ）中の７－［（４－メトキシフェニル）メチル－メチル－アミノ］－Ｎ－［（３Ｒ）－１－メチル－２－オキソ－ピロリジン－３－イル］－５－［（６－メチル－２－ピリジル）アミノ］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－カルボキサミド（９３ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）に添加し、この混合物を５０℃まで加熱する。１時間後、混合物を室温まで冷却し、蒸発させる。残留物に、ＤＣＭおよび飽和重炭酸ナトリウム溶液を添加する。混合物を１０分間撹拌し、得られた固体を収集する。固体を水およびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空下で乾燥させて、表題化合物をベージュ色の固体（７２ｍｇ）として得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ３９５（Ｍ＋Ｈ）。
【化26】
【0071】
ＴＹＫ２－ＪＨ２トレーサー結合アッセイ
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有するヒトＪＡＫ（細胞質チロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリー）ファミリーチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿００３３２２）のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）を、バキュロウイルス中で発現させ、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と好適なＴＹＫ２ ＪＨ２バインダーのコンジュゲートである調製物１７で調製した化合物を、本明細書では「トレーサー」と呼ぶ。実施例１および実施例２の化合物の３倍、１０点段階希釈を１００％ＤＭＳＯ、５０ｎＬ／ウェルで調製し、音響液体処理を使用して、Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４Ｆホワイトプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００８２８０）に移す。阻害率を決定するために使用した対照ウェルには、１００％ＤＭＳＯ（５０ｎＬ）と、トレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最小、低ＦＲＥＴ）または希釈ＴＹＫ２－ＪＨ２酵素（最終濃度０．２００ｎＭ）およびトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最大、高ＦＲＥＴ）のいずれかのアッセイバッファーが含まれていた。
Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有するヒトＪＡＫ（細胞質チロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリー）ファミリーチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ＿００３３２２）のシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２）を、バキュロウイルス中で発現させ、ＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と好適なＴＹＫ２ ＪＨ２バインダーのコンジュゲートである調製物１７で調製した化合物を、本明細書では「トレーサー」と呼ぶ。実施例１および実施例２の化合物の３倍、１０点段階希釈を１００％ＤＭＳＯ、５０ｎＬ／ウェルで調製し、音響液体処理を使用して、Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４Ｆホワイトプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００８２８０）に移す。阻害率を決定するために使用した対照ウェルには、１００％ＤＭＳＯ（５０ｎＬ）と、トレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最小、低ＦＲＥＴ）または希釈ＴＹＫ２－ＪＨ２酵素（最終濃度０．２００ｎＭ）およびトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）（最大、高ＦＲＥＴ）のいずれかのアッセイバッファーが含まれていた。
【0072】
アッセイバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのエチレングリコール－ビスβ－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、０．０１％Ｂｒｉｊ－３５およびＭｉｌｌｉ－Ｑ）水中の５．０μＬのＨｉｓタグ付きＴＹＫ２－ＪＨ２（０．４０２ｎＭ）およびＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗－ＨＩＳ抗体（４．０２ｎＭ、ＬｉｆｅＴｅｃｈ、ＰＶ５５９７）を５０ｎＬの希釈化合物を含むＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ－３８４プレートおよび対照ウェルに添加する。アッセイバッファー中の５．０μＬのトレーサー（最終濃度２．００ｎＭ）をプレートに添加し、室温で３０分間平衡化させる。３０分後、プレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎで、励起（３４０ｎｍ）、トレーサー発光（６６５ｎｍ）、ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗－Ｈｉｓ抗体発光（６１５ｎｍ）の設定で計数する。ＬａｎｔｈａＳｃｒｅｅｎ Ｅｕ－抗－Ｈｉｓ抗体発光（６１５ｎｍ）に対するトレーサー発光（６６５ｎｍ）の比率を決定する。各阻害剤濃度での阻害パーセント比を最大と最小の対照ウェルを使用して計算し、ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）の４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させて、実施例１の化合物について＜０．０００２５４μＭ（ｎ＝２）、および実施例２の化合物について＜０．０００２５４μＭ（ｎ＝１）のＩＣ５０を得る。この結果は、実施例１および実施例２の化合物がインビトロでＴＹＫ２－ＪＨ２シュードキナーゼドメインに結合することを実証する。
【0073】
ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を介したＩＦＮαシグナル伝達の阻害
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＬ－２００３）を、１０％透析ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、および２ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養する。ＴＦ１細胞（ウェルあたり１００Ｋ）を、無血清ＤＭＥＭ中、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジン被覆プレートに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。実施例１を、ＤＭＳＯで段階希釈し、細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮα２で、３７℃で２０分間刺激する。培地を除去した後、細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７８４４１）を含むバッファー中、室温で３０分間溶解する。ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）の量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬＳＵ－ＰＳＴ１－Ａ５０Ｋ）を使用して、ベンダーの推奨プロトコルに従って６１５ｎｍでの発光として定量化する。各阻害剤濃度のパーセント阻害を計算し、実施例１の化合物について０．００７μＭ（±０．００２μＭ、Ｎ＝４）および実施例２の化合物について０．１００μＭ（±０．０１４μＭ、ｎ＝４）のＩＣ５０を与えるＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）を使用して４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させ、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表す。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を介したＩＦＮαシグナル伝達の阻害剤であることを実証する。
ＴＦ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＬ－２００３）を、１０％透析ＦＢＳ、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、および２ｎｇ／ｍＬ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補充したＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養する。ＴＦ１細胞（ウェルあたり１００Ｋ）を、無血清ＤＭＥＭ中、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジン被覆プレートに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２下で一晩インキュベートする。実施例１を、ＤＭＳＯで段階希釈し、細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮα２で、３７℃で２０分間刺激する。培地を除去した後、細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃７８４４１）を含むバッファー中、室温で３０分間溶解する。ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）の量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－Ｓｔａｔ１（Ｔｙｒ７０１）アッセイキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ＃ＡＬＳＵ－ＰＳＴ１－Ａ５０Ｋ）を使用して、ベンダーの推奨プロトコルに従って６１５ｎｍでの発光として定量化する。各阻害剤濃度のパーセント阻害を計算し、実施例１の化合物について０．００７μＭ（±０．００２μＭ、Ｎ＝４）および実施例２の化合物について０．１００μＭ（±０．０１４μＭ、ｎ＝４）のＩＣ５０を与えるＧｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）を使用して４パラメータ非線形ロジスティック方程式に適合させ、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表す。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、ＴＦ１細胞におけるｐＳＴＡＴ１を介したＩＦＮαシグナル伝達の阻害剤であることを実証する。
【0074】
ＩＬ２３ ｐＳＴＡＴ３ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
内因性ＩＬ２３受容体を発現するＩＬ２依存性Ｋｉｔ２２５細胞に、ホタルルシフェラーゼに連結されたＬｅｎｔｉ ＳＴＡＴ３ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に形質導入させる。これらの細胞を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡテクノロジー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＬＳＵ－ＴＳＴ３－Ａ５０Ｋ）を使用するＩＬ２の存在下のＩＬ２３による誘導に続くＳＴＡＴ３リン酸化によって引き起こされる遺伝子発現を定量化することによって、ＴＹＫ２活性を監視する。細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２）、１ＸＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、２００ｎｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）、および新鮮な１０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０２－ＩＬ－５０）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ２２４００）で培養する。
内因性ＩＬ２３受容体を発現するＩＬ２依存性Ｋｉｔ２２５細胞に、ホタルルシフェラーゼに連結されたＬｅｎｔｉ ＳＴＡＴ３ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＳ－６０２８Ｌ）を安定的に形質導入させる。これらの細胞を使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡテクノロジー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＬＳＵ－ＴＳＴ３－Ａ５０Ｋ）を使用するＩＬ２の存在下のＩＬ２３による誘導に続くＳＴＡＴ３リン酸化によって引き起こされる遺伝子発現を定量化することによって、ＴＹＫ２活性を監視する。細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １００８２）、１ＸＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５１４０－１２２）、２００ｎｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｐ９６２０）、および新鮮な１０ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０２－ＩＬ－５０）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ ２２４００）で培養する。
【0075】
アッセイ準備のために、細胞をＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｄ５７９６）中のＢｉｏｃｏａｔブラックポリ－ｄ－リジン被覆透明底３８４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ－Ｃｏａｔ ３５－４６４０）内に３００，０００細胞／ウェルで分注し、３７℃で一晩インキュベートさせる。ＤＭＳＯに可溶化された化合物を、１：３で段階希釈し、１０点濃度応答曲線を作成する（最終ＤＭＳＯ＝０．１％）。細胞を、実施例１と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、次いでＩＬ２３（最終２５ｎｇ／ｍＬ）で３０分間刺激する。２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを、１：１溶解バッファー（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨａｌｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ＆Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １８６１２８１）の混合物で３０分間溶解する。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ反応を、ベンダーが推奨するプロトコルに従って実施し、ルシフェラーゼレベルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定する。相対的ＩＣ５０を、実施例１の化合物について０．００７μＭ（±０．００１μＭ、Ｎ＝３）および実施例２の化合物について０．０６６μＭ（±０．０１４μＭ、ｎ＝３）のＩＣ５０を与える４パラメータ非線形ロジスティック方程式（ＧｅｎｅＤａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３．０．５）を使用して計算し、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有するＧｅｏＭｅｔｒｉｃ平均として表す。この結果は、実施例１および実施例２の化合物が、細胞ベースのアッセイにおいてＩＬ－２３シグナル伝達の阻害剤であることを実証する。