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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-29
(45)【発行日】2022-10-07
(54)【発明の名称】新規なＣＩＰ２Ａバリアント及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220930BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220930BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220930BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220930BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220930BHJP
C07K 14/82 20060101ALI20220930BHJP
C07K 16/32 20060101ALI20220930BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220930BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20220930BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20220930BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
G01N33/68
G01N33/50 P
G01N33/53 M
G01N33/53 D
G01N33/574 A
C07K14/82
C07K16/32
C12Q1/686 Z
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6813 Z
【請求項の数】
38
(21)【出願番号】P 2020527797
(86)(22)【出願日】2018-11-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-12
(86)【国際出願番号】 FI2018050844
(87)【国際公開番号】W WO2019097122
(87)【国際公開日】2019-05-23
【審査請求日】2020-07-17
(31)【優先権主張番号】20176032
(32)【優先日】2017-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】513323128
【氏名又は名称】トゥルン イリオピスト
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】メケレ、エレオノーラ
(72)【発明者】
【氏名】ウェステルマルク、ユッカ
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１９７１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００７０８３７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１１５５９９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Clinical Cancer Research，2009年，Vol.15, No.16，pp.5092-5100
【文献】Molecular Biology of the Cell ，2013年，Vol.24，pp.1638-1648
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ０７Ｋ １４／００－１６／３２
Ｃ１２Ｑ １／６８－１／７０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、ＣＩＰ２Ａの単離されたポリペプチドバリアント、又は
ｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、アミノ酸５４６～５５８によって形成される領域外の配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有し、かつ配列番号２に示されるＣＩＰ２Ａのポリペプチドバリアントのがんバイオマーカーとしての機能特性を保持するアミノ酸配列を含む、ＣＩＰ２Ａの単離されたポリペプチドバリアント。
【請求項2】
配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載のポリペプチドバリアント。
【請求項3】
配列番号１に示される核酸配列、又は配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される領域外の配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１又は２に記載のポリペプチドバリアント。
【請求項4】
請求項１又は３に定義されるＣＩＰ２Ａのポリペプチドバリアントをコードする単離されたＣＩＰ２Ａポリヌクレオチド。
【請求項5】
配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される核酸配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
ｃＤＮＡである、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
ｃＤＮＡである、請求項１又は２に定義されるポリペプチドをコードする単離されたＣＩＰ２Ａポリヌクレオチド。
【請求項8】
３’ＵＴＲをさらに含む、請求項４から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
配列番号１に示される核酸配列、又は配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される領域外の配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項４から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
がんバイオマーカーとしての、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項11】
がんが、リンパ系がん及び固形がんからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
リンパ系がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
固形がんが、扁平上皮がん（ＳＣＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
【請求項14】
全生存期間の減少を含む予後不良のバイオマーカーとしての、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項15】
エピトープが、配列番号２のアミノ酸５４６～５５８に対応する又は重複する配列から選択される５～２０個の連続アミノ酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントに特異的に結合する抗ＣＩＰ２Ａバリアント抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
配列番号２６～４４のいずれか一つに示される配列からなる、請求項４から９のいずれか一項に記載のＣＩＰ２Ａのポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを検出するための、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項17】
検出可能な標識を含む、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項18】
請求項４から９のいずれか一項に記載のＣＩＰ２Ａのポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するプライマー対であって、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３６～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列に包含される又は該配列と重複する標的配列と特異的にハイブリダイズする３’プライマーを含む、上記プライマー対。
【請求項19】
配列番号１のヌクレオチド１～１６３４によって形成される配列に包含される標的配列と特異的にハイブリダイズする５’プライマーを含む、請求項１８に記載のプライマー対。
【請求項20】
プライマーが、１０～４０個のヌクレオチド長を有する、請求項１８又は１９に記載のプライマー対。
【請求項21】
がんを予後判定、検出、スクリーニング、診断又は監視することにおいてに使用するための、患者からの試料中の請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントの発現レベル又は請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを提供する方法であって、該患者からの試料中の請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントの発現レベル又は請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップを含む、上記方法。
【請求項22】
前記発現レベルを測定するステップが、核酸増幅を実施することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記増幅が、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のプライマー対を使用して実施される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記発現レベルを測定するステップが、前記ポリヌクレオチドを請求項１６又は１７に記載のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記発現レベルを測定するステップが、前記試料中の請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントへの請求項１５に記載の抗体の結合を検出することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項26】
前記がんが、ＡＭＬ、ＣＭＬ及びＰＬＭを含むリンパ系がん、並びに扁平上皮がん（ＳＣＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんを含む固形がんからなる群から選択される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
対照の発現と比較した前記ポリペプチドバリアント又はポリヌクレオチドの発現レベルの増加が予後不良を示す、請求項２１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ＡＭＬと診断された対象が幹細胞療法を含む治療法の対象となることを示すための方法であって、対象からの生体試料を、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアント又は請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに特異的に結合する試薬と接触させるステップと；
上記結合に基づいてポリペプチドバリアント又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップと；
測定された発現レベルを対照と比較することによって、測定されたポリペプチドバリアント又はポリヌクレオチドの発現レベルが試料中で増加しているかどうかを判定するステップと；
該発現レベルが増加している場合、前記ＡＭＬと診断された対象が幹細胞療法を含む治療法の対象となることを示すステップと
を含む、上記方法。
【請求項29】
前記対照がＣＩＰ２Ａ又はハウスキーピング遺伝子である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
臨床試料中の請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントの存在を検出するためのイムノアッセイであって、前記試料を請求項１５に記載の抗体と接触させるステップと；
抗体の特異的結合があれば、定性的又は定量的に該抗体の特異的結合を検出するステップと
を含む上記イムノアッセイ。
【請求項31】
前記試料を、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントに特異的に結合するが、そのエピトープが請求項１５に記載の抗体のエピトープとは異なるさらなる抗体と接触させて、サンドイッチ免疫複合体を形成するステップと、免疫複合体の存在があれば、該免疫複合体の存在を定性的又は定量的に検出するステップとを含む、請求項３０に記載のイムノアッセイ。
【請求項32】
前記試料を、ＣＩＰ２Ａのポリペプチドに特異的に結合するが、そのエピトープが配列番号４のアミノ酸５４６と９０５との間にあるさらなる抗体と接触させて、第２のサンドイッチ免疫複合体を形成するステップと、第２の免疫複合体の存在があれば、定性的又は定量的に該第２の免疫複合体の存在を検出するステップとを含む、請求項３０又は３１に記載のイムノアッセイ。
【請求項33】
２つのサンドイッチ免疫複合体の比が決定される、請求項３２に記載のイムノアッセイ。
【請求項34】
生体試料中の請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、ａ）試料を請求項１６又は１７に記載のオリゴヌクレオチドプローブと接触させるステップと；
ｂ）オリゴヌクレオチドプローブの特異的ハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、上記方法。
【請求項35】
ａ）の前に、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のプライマー対を使用して、請求項４～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを増幅するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
生体試料中の請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、ａ）試料を請求項１８から２０のいずれか一項に記載のプライマー対と接触させるステップと；
ｂ）核酸増幅を実施するステップと；
ｃ）ステップｂ）で得られたアンプリコンを、請求項１６又は１７に記載のオリゴヌクレオチドプローブで定性的又は定量的に検出するステップと
を含む、上記方法。
【請求項37】
請求項１５に記載の抗体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドバリアントのレベルを測定するためのキット。
【請求項38】
請求項１６又は１７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又は請求項１８から２０のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、請求項４から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのレベルを測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規ながん関連バイオマーカー及びその様々な用途に関する。より具体的には、本発明は、ＮＯＣＩＶＡとして表されるＣＩＰ２Ａの新規なスプライスバリアント、ならびに同バリアントに特異的なプローブ、増幅プライマー及び抗体などの結合体に関する。上記スプライスバリアントに基づいてがんを検出及び予後判定する種々の方法、ならびに上記方法に使用するためのキットも提供される。これに限定されないが、本発明は、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのリンパ系がんに関する。
【背景技術】
【0002】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人に発症する最も一般的な急性白血病である。ＡＭＬの発生率は、年間１０万人当たり新規２～３例である。ＡＭＬは、正常な造血を破壊する不均質なクローン性血液悪性腫瘍であり、最も進行性の高いがん型の１つである。ＡＭＬの最初の根治療法は１９７０年代から８０年代に開発され、これより前は、ＡＭＬ患者は、わずか３か月という暗い予後であった。２０１０年代では、６０～６５歳未満のＡＭＬ患者の５０％が完全寛解を得ることができる。
【0003】
ＡＭＬの遺伝的多様性の理解の進歩により、ＡＭＬ症例内の予後サブグループの特定が可能になった。ＡＭＬサブタイプの分類はまた、治療戦略を最適化し、治療関連死亡率及び再燃リスクを低下させるために、臨床的に関連する。予後良好リスクカテゴリーの患者は化学療法で治療され、これにより患者の最大７０％が完全寛解に移行できる。あるいは、適切である予後が中程度及び予後不良の患者の治療は、同種幹細胞移植であり、これは依然として危険な手技であり、多くの起こり得る合併症があり、死亡率が３０％である。移植に関連する副作用は、数週間から数ヶ月続く短期的なもの、又は数年もしくは生涯続き得る長期的なものもあり得る。
【0004】
ＡＭＬの分子生物学に関する理解の進歩にもかかわらず、患者の最大半数では完全寛解が発生するが、多くの患者にとっては、再燃が一般に予想され、予後は暗い。したがって、現在の臨床課題は、予想される予後に従ってＡＭＬ患者をよりよく層別化することである。特に、現在のリスク群分類で好ましい予後の患者と判断されているが、標準的な化学療法では治癒できず、直ちに幹細胞移植に向けるべき患者を検出するための、より感度の高い診断方法を開発することが有用であり得る。
【0005】
したがって、ＡＭＬ予後及び最小限の残存病変監視のための新たな臨床及び分子マーカーが必要である。日常的な臨床診断の一部として、ＡＭＬ患者の試料は、ＡＭＬに特徴的な融合遺伝子及び突然変異についてＰＣＲで検査される。しかしながら、予後不良についてＡＭＬのＷＨＯ分類の背後にある遺伝子異常の全てが知られているわけではなく、実際、ＡＭＬ患者の半数についてのみ、関連する分子遺伝学的ＰＣＲ検査が利用可能である。したがって、ＡＭＬ患者のための治療戦略を設計及び最適化するために使用することができる新たな遺伝的変化を特定する明確な医学的ニーズがある。
【0006】
プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、三量体（Ａ－Ｂ－Ｃサブユニット）腫瘍抑制因子複合体である。がん細胞では、ＰＰ２Ａの腫瘍抑制活性が阻害される。しかしながら、ＰＰ２Ａ複合タンパク質は、全てのがん型でかなり低頻度で突然変異する。代わりに、がんにおけるＰＰ２Ａ阻害の最も一般的な様式は、ＣＩＰ２Ａ、ＳＥＴ及びＰＭＥ１などのＰＰ２Ａ阻害剤タンパク質の過剰発現であるようである。ＣＩＰ２Ａ過剰発現は、十数種を超えるヒト固形がん型で患者予後不良と関連している（Ｋｈａｎｎａ及びＰｉｍａｎｄａ、２０１５）。ＳＥＴはヒトＡＭＬで過剰発現されることが知られている（Ｃｒｉｓｔｏｂａｌ Ｉら、２０１０）。
【0007】
ＡＭＬなどのリンパ系がんを含むがんを予後判定するためのさらなるマーカーが依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、がんの診断及び予後判定の種々の態様のための手段及び方法を提供することである。この目的は、独立請求項に明言されていることを特徴とする配置によって達成される。いくつかの好ましい実施形態は、従属請求項に開示されている。
【0009】
本発明は、少なくとも部分的には、がん細胞が潜在的に異なる機能を有するＣＩＰ２Ａの異なるアイソフォームを発現し得ることを明らかにする試験に基づいている。ＣＩＰ２Ａの新規なアイソフォームが特定される。
【0010】
したがって、一態様では、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、ＮＯＣＩＶＡと命名されるＣＩＰ２Ａの単離されたポリペプチドバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、又はアミノ酸５４６～５５８によって形成される領域外の配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むもしくはからなる。いくつかのさらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される核酸配列を含む、又はＣＩＰ２Ａのイントロン１３の部分にインフレームでＣ末端結合したＣＩＰ２Ａのエクソン１～１３を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかのなおさらなる実施形態では、ポリペプチドが、配列番号１に示される核酸配列、又は配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される領域外の配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む又はからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
【0011】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする、単離されたＣＩＰ２Ａポリヌクレオチドバリアント、好ましくはｃＤＮＡバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される核酸配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドが、ＣＩＰ２Ａのイントロン１３の一部にインフレームでＣ末端結合したＣＩＰ２Ａのエクソン１～１３を含む。いくつかのなおさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドが３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかのなおさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドが、配列番号１に示される核酸配列の少なくとも一部を含む、又は配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって定義される領域外の配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含むもしくはからなる。
【0012】
がんバイオマーカーとしての本ポリペプチド又はポリヌクレオチドの使用も提供される。いくつかの実施形態では、上記がんが、リンパ系がん及び固形がんからなる群から選択される。いくつかのさらなる実施形態では、上記リンパ系がんが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択され；固形がんが、扁平上皮がん（ＳＣＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんからなる群から選択される。
【0013】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドに特異的に結合する抗ＣＩＰ２Ａ変異抗体、すなわち抗ＮＯＣＩＶＡ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
【0014】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブなどのオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３によって形成される配列に包含される又は重複する標的配列と特異的にハイブリダイズする。いくつかのさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３６～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列の８～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個の連続ヌクレオチドとハイブリダイズする。
【0015】
なおさらなる態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドの少なくとも一部を特異的に増幅するプライマー対を提供する。いくつかの実施形態では、プライマー対が、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３６～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列に包含される又は重複する標的配列と特異的にハイブリダイズする３’プライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマー対が、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４によって形成される配列に包含される標的配列と特異的にハイブリダイズする５’プライマーを含む。
【0016】
がんを予後判定、検出、スクリーニング、診断又は監視する方法も提供される。上記方法は、対象からの試料中の本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、例えば本発明によるプライマー対による核酸増幅、及び／又は本ポリヌクレオチドを本発明によるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを伴う。あるいは、本方法は、本発明による抗体を使用することを伴い得る。本方法はまた、例えば、次世代シーケンシング、ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション、及び質量分析による定量的標的プロテオミクス、例えば選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、ＳＷＡＴＨ及びマスサイトメトリーからなる群から選択される技術を使用して行われ得る。
【0017】
一態様では、本発明は、ＡＭＬと診断された対象に治療を割り当てる方法を提供する。本方法は、対象からの生体試料を、本発明によるポリペプチド又はポリヌクレオチドに特異的に結合する試薬と接触させるステップと；上記結合に基づいて上記ポリペプチド又は上記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップと；上記発現レベルを対照と比較することによって、決定された上記ポリペプチド又は上記ポリヌクレオチドの発現レベルが試料中で増加しているかどうかを測定するステップと；上記発現が増加している場合、幹細胞療法を含む治療法を割り当てるステップとを含む。
【0018】
さらなる態様では、本発明は、臨床試料中の本発明によるポリペプチドの存在を検出するためのイムノアッセイを提供する。イムノアッセイは、試料を本発明による抗体と接触させるステップと；抗体の特異的結合があれば、定性的又は定量的に検出するステップとを含む。
【0019】
なおさらなる態様では、本発明は、生体試料中の本発明によるポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供する。本方法は、ａ）試料を本発明によるオリゴヌクレオチドと接触させるステップと；ｂ）オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、ａ）の前に、本発明によるプライマー対を使用して、上記ポリヌクレオチドを増幅するステップを含み得る。
【0020】
なおさらなる態様では、本発明は、生体試料中の本発明によるポリヌクレオチドの存在を検出する方法を提供する。本方法は、ａ）試料を本発明によるプライマー対と接触させるステップと；ｂ）核酸増幅を実施するステップと；ｃ）ステップｂ）で得られたアンプリコンを、本発明によるオリゴヌクレオチドで定性的又は定量的に検出するステップとを含む。
【0021】
また、本発明によるポリペプチドのレベルを測定するためのキットであって、本発明による抗体を含むキット；ならびに本発明によるポリヌクレオチドのレベルを測定するためのキットであって、本発明によるオリゴヌクレオチド及び／又は本発明によるプライマー対を含むキットも提供される。
【0022】
本発明の他の目的、態様、実施形態、詳細及び利点は、以下の図面、詳細な説明、例及び従属請求項から明らかになるだろう。
【0023】
以下で、本発明を、添付の図面を参照して好ましい実施形態によって詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図１Ａ～図１Ｄは、新規なＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡバリアントの特定を示している。
プライマー、
インターカレートプライマー、
プローブ。
【図1A】ＲＡＣＥ－ＰＣＲで特定されたＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡアイソフォームの概略図である。３つのＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡバリアントが見つかった。ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡは、ＣＩＰ２Ａイントロン番号１３からの代替エクソンを含んでいるので、ユニークで以前は未知であったコード配列を形成する。非翻訳領域（５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）を点で示し、ＮＯＣＩＶＡのユニークな代替エクソンを垂直ライニングで示し、ＮＯＣＩＶＡ特異的３’ＵＴＲを灰色勾配の破線で示す。
【図1B】元のＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ配列とは異なる特徴を有するＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの３’末端を示す図である。ＣＩＰ２ＡとＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡとの間の共有ヌクレオチド配列には下線を付している。ＮＯＣＩＶＡタンパク質は、５４５個のＮ末端ＣＩＰ２Ａアミノ酸及びＣ末端上に１３個のユニークなアミノ酸（太字）を含む。終止コドンをアスタリスクで示す。ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲ（配列番号１の１６７５～２０１０）及びポリアデニル化シグナル（配列番号１の１９６２～１９６７のＡＡＴＡＡＡ）も含む。ポリアデニル化シグナル及びポリ（Ａ）テールをボックスで示す。配列番号１の部分的核酸配列及び配列番号２の部分的アミノ酸配列が示されている。
【図1C】いくつかの細胞株からのＮＯＣＩＶＡ特異的ｍＲＮＡ配列発現を検証するための確認ＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。ＮＴＣはテンプレートなしの対照（ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の略称である。得られたバンドを抽出し、特異的ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの存在を配列決定によって確認した。
【図1D】ＫＩＡＡ１５２４遺伝子からのＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ形成を例示し、ＫＩＡＡ１５２４の核酸配列（配列番号８９）の一部を示す図である。ＣＩＰ２Ａエクソン１３及びエクソン１４を下線で示す。通常の文字をエクソン１３と１４との間のイントロン配列に使用する。太字はＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡが産生されるイントロン領域である（配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３に対応）。太字配列は、エクソン１３と１４との間のイントロン配列の一部でもある。 図２Ａ～図２Ｅは、正常な及びがん性の細胞及び組織試料中のＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ発現を示している。
【図2A】患者由来のケラチノサイト（Ｋｅｒ）及び扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞における２つの異なるプライマープローブセットを用いてｑＰＣＲによって測定されたＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ発現を示す図である。ｂ－アクチン及びＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用し、Ｋｅｒ ４５Ｂ細胞におけるｍＲＮＡ発現レベルを値１として定義した。
【図2B】正常組織パネル（Ｈｕｍａｎ ＭＴＣパネルＩ＆ＩＩ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でのＮＯＣＩＶＡ、ＣＩＰ２Ａｅ１３（すなわち、エクソン１３とハイブリダイズする５’プライマー及びエクソン１４とハイブリダイズする３’プライマーを使用して決定されるＣＩＰ２Ａ）及びＣＩＰ２Ａｅ２０（すなわち、エクソン２０とハイブリダイズする５’プライマー及びエクソン２１とハイブリダイズする３’プライマーを使用して決定されるＣＩＰ２Ａ）のｍＲＮＡ発現を示す図である。ｂ－アクチン及びＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。
【図2D】指示されるＡＭＬ及びＣＭＬ細胞株中のＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａｅ２０ ｍＲＮＡ発現を示す図である。ＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＣＭＬ：慢性骨髄性白血病。Ｈｅｌａ、ＵＴ－７及びＭＣＦ７は、ここでは固形ヒトがんを表す。
【図2E】図２Ａのケラチノサイト及びＳＣＣ細胞中の平均発現と比較した、患者由来の診断用ＡＭＬ試料中のＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ発現を示す図である。 図３Ａ～図３Ｂは、診断用リンパ系試料中のＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ過剰発現を例示している。
【図3A】０値として定義された正常な骨髄試料と比較した、ＣＩＰ２Ａ又はＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの過剰発現又は過少発現を伴う９３種の診断用ヒトＡＭＬ試料の分布を示すウォーターフォールプロットである。ｂ－アクチン及びＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用した。
【図3B】正常な骨髄試料と比較した、指示される遺伝子の過剰発現を示す９３種の診断用ＡＭＬ患者試料の割合を示す図である。ＦＣ＞２：過剰発現が２倍超である試料の割合。 図４Ａ～図４Ｆは、ＡＭＬ患者材料の統計及び臨床的相関を示す。
【図4A】表で定義されるリスク群に応じた臨床フォローアップ情報を含む患者材料の分布を示す図である。生存率とは、フォローアップ時間後の生存患者を指す（０３／１７、中央フォローアップ５．４年）。
【図4B】多変量解析における患者の診断年齢及びリスク群と全生存期間の統計的相関を示す図である。
【図4C】試験した患者集団における指示されるマーカーの発現とリスク群の相関を示す図である。ＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ発現もＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ発現も、リスク群間で統計学的に異ならない（ｐ値を括弧内に示す）。
【図4D】多変量解析において、高いＮＯＣＩＶＡ発現が短い全生存期間と有意に関連していることを示す図である。
【図4E】低又は高に分割したＮＯＣＩＶＡ発現レベルによる、ＡＭＬ患者の全生存期間のカプラン・マイヤープロットを示す図である。中央値は、カットオフ値として機能する。
【図4F】多変量解析において、高いＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比が短い全生存期間と有意に関連していることを示す図である。
【図5】ＮＯＣＩＶＡ特異的抗体が正しいサイズ（およそ９０ｋＤａ）の組換えＧＳＴ－ＮＯＣＩＶＡタンパク質を検出するが、組換えＣＩＰ２Ａフラグメントを検出しないことを示す図である。ＮＯＣＩＶＡ－ブロッキングペプチドでシグナルをブロックすることができる。
【図6】ＰＣＲ又はｑＰＣＲを用いてＮＯＣＩＶＡ特異的配列を検出するためのオリゴ設計の非限定的な例の概略図である。破線は、通常のＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ配列の終わりとＮＯＣＩＶＡ特異的ｍＲＮＡ配列の始まりを示す。
【数1】
【数2】
【数3】
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、ＮＯＣＩＶＡと命名されるＰＰ２Ａ（ＣＩＰ２Ａ又はＫＩＡＡ１５２４）のがん性阻害剤の新規なバリアントを提供する。ｍＲＮＡレベルでは、バリアントが、ＫＩＡＡ１５２４遺伝子のエクソン１３と１４との間のイントロンの一部にＣ末端融合したＣＩＰ２Ａのエクソン１～１３を含む。このようにして形成されたＮＯＣＩＶＡ転写産物は、ユニークで以前は未知の配列であり、イントロン配列は、先行するＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ配列を含むコードフレーム内にあり、１３個のアミノ酸に対応する４０ヌクレオチドの後に、古典的な終止コドン（翻訳終止）ＴＡＡが続く。３つの主要な非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直後に続くｍＲＮＡのセクションであり、３’ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化及び安定性に影響を及ぼすことができる。ＮＯＣＩＶＡの潜在的な３’ＵＴＲは、ポリ（Ａ）テールと呼ばれるいくつかのアデニン残基の付加をｍＲＮＡ転写産物の終わりに向けるＡＡＴＡＡＡ配列を含むおよそ３５０ヌクレオチドからなる。したがって、ＮＯＣＩＶＡ遺伝子産物は、Ｃ末端に１３個の新たなアミノ酸（ＮＮＫＮＴＱＥＡＦＱＶＴＳ；配列番号３）を有する切断型ＣＩＰ２Ａタンパク質をコードする。重要なことに、この１３ａａペプチド配列は、Ｂｌａｓｔ相同性検索に基づくヒトプロテオームの既知のタンパク質配列と一致しない。配列番号１に示される核酸配列は、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を表し、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。配列番号３は、配列番号２のアミノ酸５４６～５５８に対応する。明確にするために、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ配列中の目的の構造を、配列番号１のそれぞれのＮＯＣＩＶＡ ＤＮＡ／ｃＤＮＡ配列を参照して示す。
【0026】
ＮＯＣＩＶＡ特異的ｍＲＮＡ（配列番号１のヌクレオチド１６３５～２０１０、長さ３７６ｎｔ）は、以下の構造を含む：
・ポリＡテールを含まないＮＯＣＩＶＡ特異的イントロンｍＲＮＡ配列：配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３（３５０ｎｔ）；
・新規なＮＯＣＩＶＡペプチド（１３アミノ酸）をコードするＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ配列：配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４（３９ｎｔ）；
・３’ＵＴＲ：配列番号１のヌクレオチド１６７５～２０１０（３３５ｎｔ）；
・ポリＡテールを含まない３’ＵＴＲ：配列番号１のヌクレオチド１６７５～１９８３（３１０ｎｔ）；
・ポリＡテール：配列番号１のヌクレオチド１９８４～２０１０；及び
ポリアデニル化シグナル：配列番号１のヌクレオチド１９６２－１９６７。
・ポリＡテールを含まないＮＯＣＩＶＡ特異的イントロンｍＲＮＡ配列：配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３（３５０ｎｔ）；
・新規なＮＯＣＩＶＡペプチド（１３アミノ酸）をコードするＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ配列：配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４（３９ｎｔ）；
・３’ＵＴＲ：配列番号１のヌクレオチド１６７５～２０１０（３３５ｎｔ）；
・ポリＡテールを含まない３’ＵＴＲ：配列番号１のヌクレオチド１６７５～１９８３（３１０ｎｔ）；
・ポリＡテール：配列番号１のヌクレオチド１９８４～２０１０；及び
ポリアデニル化シグナル：配列番号１のヌクレオチド１９６２－１９６７。
【0027】
ユニークなＮＯＣＩＶＡ配列の最初のヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１６３５）は、新規なＮＯＣＩＶＡペプチドに先行する最後のアミノ酸の変化をもたらさないが、これはＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡにまだ特異的であることに留意すべきである。
【0028】
ＮＯＣＩＶＡポリペプチド及び配列番号１～３に記載される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（但し、ＮＯＣＩＶＡの機能的特性を保持している）も含まれる。
【0029】
上記を考慮して、ＮＯＣＩＶＡポリペプチド及びポリペプチドは、その保存的配列バリアントを包含する。ポリペプチドに関して、「保存的配列バリアント」という用語は、当技術分野で周知の類似のアミノ酸（例えば、類似のサイズ及び類似の電荷特性を有するアミノ酸）によるアミノ酸置換から生じ、当のポリペプチドの生物学的特性を有意には変化させないアミノ酸配列修飾を指す。アミノ酸の欠失及び付加も熟慮される。ポリヌクレオチドに関連して、「保存的配列バリアント」という用語は、コードされたポリペプチドの生物学的特性を有意には変化させないヌクレオチド配列改変を指す。保存的ヌクレオチド配列バリアントには、遺伝暗号の変性及びサイレント突然変異から生じるバリアントが含まれる。ヌクレオチド置換、欠失及び付加も熟慮される。
【0030】
本明細書で使用される場合、２つの配列間の配列同一性％は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間の同一性％の決定は、当技術分野で利用可能な数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。これは、アミノ酸配列と核酸配列の両方に当てはまる。
【0031】
いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその保存的配列バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、アミノ酸５４６～５５８によって形成される領域外の配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性（又は上に示される任意の他の％配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。換言すれば、配列の変動にもかかわらず、このようなＮＯＣＩＶＡバリアントは、依然として、配列番号３に示されるアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸５４６～５５８に対応する）を含む。このようなＮＯＣＩＶＡバリアントは、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドの機能的特性を保持するべきである。一定のＮＯＣＩＶＡバリアントが配列番号２のＮＯＣＩＶＡポリペプチドの機能的特性を保持しているかどうかは、日常的な実験によって行うことができる。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその保存的配列バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドが、アミノ酸５４６～５５８によって形成される領域外の配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性（又は上に示される任意の他の％配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。換言すれば、配列の変動にもかかわらず、このようなＮＯＣＩＶＡバリアントは、依然として、配列番号３に示されるアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸５４６～５５８に対応する）を含む。このようなＮＯＣＩＶＡバリアントは、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドの機能的特性を保持するべきである。一定のＮＯＣＩＶＡバリアントが配列番号２のＮＯＣＩＶＡポリペプチドの機能的特性を保持しているかどうかは、日常的な実験によって行うことができる。
【0033】
ＮＯＣＩＶＡは正常なヒト組織で非常に低レベルでのみ発現されるが、頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの種々のがんの細胞で発現される。したがって、ＮＯＣＩＶＡは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルのいずれかで利用することができる新規ながん関連バイオマーカーである。本開示はいくつかのリンパ系がん、すなわちＡＭＬ、ＣＭＬ及び急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に焦点を当てているが、ＮＯＣＩＶＡは白血病などの血液がんのマーカーとしてだけでなく、それだけに限らないが、ＨＮＳＣＣなどの扁平上皮がん（ＳＣＣ）、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、腎がん及び膵がんを含む固形がんのマーカーとしても利用され得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「血液がん」という用語は、血液、骨髄又はリンパ節に発症する悪性腫瘍を指す。血液がんは、発症する細胞の種類に応じて、白血病、リンパ腫及び骨髄腫と呼ばれる。リンパ腫は、リンパ球から発生する血液がんの群である。形質細胞骨髄腫としても知られる多発性骨髄腫は、形質細胞のがんである。
【0035】
本明細書で使用される場合、「白血病」という用語は、造血組織、通常は骨髄で始まり、白血球に発症するがんである。白血病は、発症する白血球の種類（骨髄性又はリンパ性）によって分類され得る。白血病の非限定的な例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）及びこれらのサブグループが挙げられる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」及び「マーカー」という用語は互換的であり、見かけ上健康な対象、又は同じがんを有するが疾患の予後が異なる対象などの、対照の対象から採取された同等の試料と比較して、がんを有する対象から採取された試料中に異なって存在する分子を指す。
【0037】
患者の試料中のＮＯＣＩＶＡの測定は、疑われるがん又はそのサブタイプのありそうな存在、非存在又は予後と相関させることができる情報を提供する。ＮＯＣＩＶＡの測定は、疑われるがん型又はそのサブタイプに関連する他のマーカーのアッセイの前、アッセイと同時、又はアッセイの後に実施することができる。これはまた、がん又はそのサブタイプの存在、非存在又は予後が最終的に決定されないが、さらなる診断検査が正当化される場合を含むことを意味する。このような実施形態では、方法それ自体ががん又はそのサブタイプの存在、非存在又は予後を決定するわけではないが、さらなる診断検査が必要である、又は有益となることを示し得る。したがって、ＮＯＣＩＶＡは、上記がん又はそのサブタイプの存在、非存在又は予後の最終決定のために、１つ又は複数の他の診断方法又はマーカーと組み合わせて使用され得る。このような他の診断方法及びマーカーは、当業者に周知である。ＡＭＬに関して、このような他のマーカーには、それだけに限らないが、ＷＴ１、ＥＶＩ１及びＳＥＴが含まれる。
【0038】
したがって、ＮＯＣＩＶＡは、診断目的だけでなく、例えば、予後、予測、患者のグループ化又は層別化、経時的ながん進行の監視、起こり得るがんの寛解、再発又は再燃の監視、治療法選択、及び治療の監視にも使用され得る。
【0039】
本明細書で使用される場合、「予後」という用語は、疾患のありそうな経過又は臨床成績を指し、「予知する」及び「予後判定する」という表現は、疾患の将来の経過の予測を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、「予後良好」という用語は、一定期間の疾患のありそうな好ましい経過を指す。例えば、疾患の中央成績と比較した場合の、「全生存期間の延長」、「無病生存期間の延長」、「無再発生存期間の延長」及び「無増悪生存期間の延長」が、予後良好の非限定的な例である。当の血液がん及び実施形態に応じて、予後良好は、例えば、診断後１年超、２年超、３年超、４年超又は５年超生存する少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％の見込みを指し得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「予後不良」という用語は、一定期間の疾患のありそうな好ましくない経過を指す。例えば、疾患の中央成績と比較した場合の、「全生存期間の減少」、「無病生存期間の減少」、「無再発生存期間の減少」及び「無増悪生存期間の減少」が、予後不良の非限定的な例である。当の血液がん及び実施形態に応じて、予後不良は、例えば、診断後１年超、２年超、３年超、４年超又は５年超生存する６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満の可能性を指し得る。
【0042】
血液がんと診断された対象の予後不良の可能性などの、疾患の一定の臨床成績は、試験期間にわたる２つの実験アームにおける瞬間的リスクの比を指す「ハザード比」（ＨＲ）などの確率として表され得る。これは、任意の所与の時点での点推定を表す。
【0043】
したがって、予後不良に関して、例えば、特定のバイオマーカーレベルについてのＨＲリスク推定が１より大きい場合、これは、この特定のバイオマーカーレベルを有する対象が、特定のバイオマーカーレベルを有さない対象よりも予後不良のリスクが高いことを示す。対照的に、特定のバイオマーカーレベルについてのＨＲリスク推定が１未満である場合、これは、この特定のバイオマーカーレベルを有する対象が、特定のバイオマーカーレベルを有さない対象と比較して予後不良のリスクが低いことを示す。
【0044】
本明細書で使用される場合、「９５％信頼区間」（９５％ＣＩ）という用語は、母集団の真の平均を含むのが９５％確実であり得る値の推定範囲を指し、推定範囲は試料データの所定のセットから計算される。一般に、９５％ＣＩは、ＨＲの精度を推定するために使用される。広いＣＩはＨＲの精度が低レベルであることを示し、狭いＣＩはＨＲの精度が高いことを示す。
【0045】
本明細書に記載される多変量解析（Ｃｏｘ比例ハザードモデル）により、ＮＯＣＩＶＡ発現レベルと臨床成績との間の統計学的に有意な関連が明らかになり、結果としてＮＯＣＩＶＡ負荷が高い患者は、ＮＯＣＩＶＡ負荷が低い患者よりも全生存期間が短くなった（ｐ＝０．０２０５、ＨＲ：１．５１１；図４Ｄ）。興味深いことに、このような関連はＣＩＰ２Ａでは観察されなかった。実際、ＣＩＰ２Ａをバイオマーカーレベルとして使用した場合の全生存期間についてのＨＲリスク推定は１未満であり（ｐ＝０．０７７５、ＨＲ：０．１７３；図４Ｄ）、ＣＩＰ２Ａ負荷が低い患者よりも、ＣＩＰ２Ａ負荷が高い患者について短い全生存期間のリスクが低下していることを示している。
【0046】
特に、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの発現は、例えばＨａｒｔｍｕｔ Ｄｏｈｎｅｒらによる「成人におけるＡＭＬの診断及び管理：国際専門家パネルからの２０１７年ＥＬＮ勧告（Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＡＭＬ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ：２０１７ ＥＬＮ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｔ ｐａｎｅｌ）」に記載されるＡＭＬリスク群分類に依存するように見えないので、ＮＯＣＩＶＡ決定は、適切な治療手順を選択する際の臨床的意思決定を実質的に助けることができる。例えば、ＡＭＬを有する対象におけるＮＯＣＩＶＡの発現増加は、短い全生存期間、及びこのような対象を当技術分野で周知の治療様式である即時幹細胞移植に向けることが有益であり得ることを示す。他方、ＮＯＣＩＶＡの発現が増加していないＡＭＬ患者は化学療法のみで治療することで十分であるだろう。したがって、ＮＯＣＩＶＡは、対象を予後不良又は予後良好の群に層別化する、ならびに対象を様々な治療様式のために層別化するために使用され得る。
【0047】
上記に従って、本発明は、ＡＭＬと診断された対象に治療を割り当てる方法であって、対象から得られた生体試料を、本ＮＯＣＩＶＡポリペプチド又はポリヌクレオチドに特異的に結合する試薬（本明細書に提供される結合体など）と接触させるステップと；上記発現を関連対照と比較することによって、上記ポリペプチド又は上記ポリヌクレオチドの発現が上記試料中で増加しているかどうかを測定するステップと：上記発現が増加している場合、例えば幹細胞療法を含む治療法を割り当てるステップとを含む方法を提供する。
【0048】
本発明は、個々の患者のケアだけでなく、臨床試験のための患者のより良い選択及び層別化にも利点を提供する。例えば、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルに基づいてグループ化されたがん患者を、新たな医療手順又は薬物などの効率的な新たな個別化された治療ツールの開発を目的とした臨床研究に使用し得る。
【0049】
上記に従って、治療に対する反応の分析及び予測を、以下のコホートのいずれかで行うことができる：治療レジメンに有利に反応するコホート、治療レジメンに有利に反応しないコホート、治療レジメンに有意に反応するコホート、治療レジメンに有意には反応しないコホート、及び治療レジメンに不利に反応するコホート（例えば、１つ又は複数の副作用を示す）。これらのコホートは単なる例として提供され、他のコホート又はサブコホートを分析してもよい。したがって、対象をＮＯＣＩＶＡ発現レベルについて決定して、彼／彼女が治療レジメンに有利にもしくは有意に反応するか、治療レジメンに有利にもしくは有意に反応しないか、又は治療レジメンに不利に反応するかどうかを予測することができる。対象ががん治療に積極的に反応する可能性が高い場合、上記対象をそれに応じて治療することができる。他方、対象ががん治療に否定的に反応する可能性が高い（すなわち、正の効果を示さない、又は有害副作用を示す）場合、一連の代替治療を適用することができる。
【0050】
したがって、本発明は、上に示される目的のための種々の方法又はアッセイを提供する。これらの方法又はアッセイは、当の対象から得られた試料中のＮＯＣＩＶＡ発現レベルの決定を伴う。本明細書で使用される場合、「ＮＯＣＩＶＡの発現レベルを測定する」という用語、及び任意の対応する表現は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質の量に基づいてＮＯＣＩＶＡを定量化又は半定量化することを指す。「レベル」という用語は、「量」及び「濃度」という用語と互換的であり、絶対量又は相対量を指すことができる。ＮＯＣＩＶＡ発現を測定することは、ＮＯＣＩＶＡの非存在又は存在を定性的に測定することも含み得る。
【0051】
いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの相対発現レベルが、ＮＯＣＩＶＡ発現と、以前から知られているＣＩＰ２Ａ形態、すなわちエクソン１～２１を有するＣＩＰ２Ａの発現の相対比に基づき得る。ＣＩＰ２Ａの発現レベルは、例えば、エクソン１３（ＣＩＰ２Ａｅ１３）、エクソン１６（ＣＩＰ２Ａｅ１６）又はエクソン２０（すなわち、ＣＩＰ２Ａｅ２０）の発現レベルに基づいて決定され得る。好ましくは、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａの相対発現比は、同じ細胞におけるＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａの発現レベルを測定することに基づく。いくつかの実施形態では、ＣＩＰ２Ａｅ１３が、エクソン１３とハイブリダイズする５’プライマー及びエクソン１４とハイブリダイズする３’プライマーを使用することによって決定され；ＣＩＰ２Ａｅ１６が、エクソン１６とハイブリダイズする５’プライマー及びエクソン１７とハイブリダイズする３’プライマーを使用することによって決定され；ＣＩＰ２Ａｅ２０が、エクソン２０とハイブリダイズする５’プライマー及びエクソン２１とハイブリダイズする３’プライマーを使用することによって決定される。
【0052】
いくつかのさらなる実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルが、同じ細胞における、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルと適切なハウスキーピング遺伝子の発現レベルとの間の相対比として決定され得る。適切なハウスキーピング遺伝子の非限定的な例としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＡＣＴＢ（アクチン、β）、ＲＲＮ１８Ｓ（１８ＳリボソームＲＮＡ）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ＲＰＬ１３Ａ（リボソームタンパク質Ｌ１３ａ）、ＲＰＬＰ０（リボソームタンパク質、ラージ、Ｐ０）、Ｂ２Ｍ（β－２－ミクログロブリン）、ＹＷＨＡＺ（チロシン３－モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５－モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ζポリペプチド）、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、ＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１））、ＡＬＡＳ１（アミノレブリン酸、δ－、シンターゼ１）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、β）、ＨＭＢＳ（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）及びＴＵＢＢ（チューブリン、βポリペプチド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、好ましいハウスキーピング遺伝子が、ＧＡＰＤＨ及びＡＣＴＢを含む。
【0053】
検出されたＮＯＣＩＶＡ発現レベルが、がん又はその予後を示すかどうかを決定するためには、これを関連対照と比較するべきである。対照レベルが分かると、決定又は検出されたＮＯＣＩＶＡレベルをそれと比較することができ、標準的な統計学的方法を使用して差の有意性を評価することができる。いくつかの実施形態では、決定されたＮＯＣＩＶＡレベルと対照レベルとの間の統計学的に有意な差が、がん又はそのサブグループ（例えば、予後又は治療に対する予想される反応に基づくサブグループ）の存在を示す。いくつかのさらなる実施形態では、対照と比較する前に、ＮＯＣＩＶＡレベルを標準的な方法を使用して正規化する。
【0054】
本明細書で使用される場合、「対照」という用語は、多くの異なる種類の対照を指し得る。例えば、「陰性対照」又は「正常対照」は、同じ対象の非がん性組織から、又は見かけ上健康な個体もしくは見かけ上健康な個体のプールから得られた試料から決定される、単独で又は別のマーカーもしくは対照と比較した、ＮＯＣＩＶＡの対照レベルを意味する。「陽性対照」は、例えば、同じ対象のがん性組織、又は目的のがんと診断された個体もしくは以前がんと診断された個体のプールから得られた試料を意味し得る。当のがん又はそのサブグループの存在、非存在又は予後を示す所定の閾値も、対照、すなわち「閾値対照」として使用され得る。したがって、閾値は、正常な非がん性細胞におけるＮＯＣＩＶＡの発現レベルを指す、見かけ上健康な個体のプールから得られた陰性対照値であり得る；又は、閾値は、がん性組織中のＮＯＣＩＶＡの発現レベルを指す、がんを有する個体のプールから得られた陽性対照値であり得る。
【0055】
「内部対照」は、ＣＩＰ２Ａの発現レベル及び／又はＮＯＣＩＶＡの発現レベルと同じ細胞から決定された１つ又は複数の適切なハウスキーピング遺伝子の発現レベルを指し得る。換言すれば、内部対照は、分析される試料中のＮＯＣＩＶＡを定量化することを可能にするローディング対照を意味し得る。内部対照の例、換言すれば「ローディング対照」又は「定量対照」には、ハウスキーピング遺伝子及びハウスキーピングタンパク質が含まれる。ＮＯＣＩＶＡの量は、ＣＩＰ２Ａの別の形態などの「対照バイオマーカー」と比較して測定することもできる。「対照比」は、ＮＯＣＩＶＡと任意の選択された対照の関係、例えば、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａの別の形態の比を意味する。
【0056】
いくつかの好ましい実施形態では、ＣＩＰ２Ａｅ２０などのＣＩＰ２Ａの別の形態を対照として使用して、ＮＯＣＩＶＡの決定された発現レベルをＣＩＰ２Ａｅ２０の決定された発現レベルと比較して、ＮＯＣＩＶＡ発現とＣＩＰ２Ａｅ２０の発現の比を得る。次いで、上記得られた比を、上記所定の閾値と比較して、患者のがん状態を推定する。
【0057】
適切な対照又は閾値を決定するための統計学的方法は、当業者には容易に明らかであるだろう。対照又は閾値は、必要に応じて、同じ年齢群、人口統計学の特徴及び／又は疾患状態等の対象の試料から決定されたかもしれない。陰性対照又は閾値は、当のがん又はそのサブタイプを発症していない単一の個体に由来し得る、又は２人以上のこのような個体からプールされた値であり得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、「見かけ上健康な」という用語は、当のがんもしくはそのサブタイプの徴候を示さず、したがって、当の上記がんもしくはそのサブタイプを発症していないと考えられる、及び／又は当の上記がんもしくはそのサブタイプを発症しないと予測される個体又は個体のプールを指す。
【0059】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。この用語には、それだけに限らないが、家畜、ペット及びスポーツ用動物などの飼育動物などの哺乳動物が含まれる。このような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物、ならびにウマなどの有蹄動物が挙げられる。したがって、本発明は、ヒト医学と獣医学の両方に適用され得る。本明細書では、「対象」、「患者」及び「個体」という用語が互換的である。
【0060】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、ＮＯＣＩＶＡ発現レベルを測定する対象から得られた生体試料又は臨床試料を指す。典型的には、試料は、がん性組織又はがん性であると疑われる組織の試料である。白血病などの血液がんの場合、試料は、例えば生検又は穿刺によって得られた血液試料又は骨髄試料であり得る。試料は、パラフィン包埋組織試料であってもよい。血液試料の例としては、全血試料、血清試料、血漿試料、分画もしくは非分画末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の試料、又は他の精製された血液細胞型の試料が挙げられる。
【0061】
「試料」という用語は、それだけに限らないが、細胞集団などの試料の一定の成分についての遠心分離、濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、試薬による処理、洗浄又は濃縮を含む、その調達後に適切な方法で操作又は処理された試料も含む。
【0062】
本明細書で使用される場合、「発現増加」という用語は、関連対照と比較した試料中のバイオマーカーの量の増加を指す。上記増加は、当技術分野で知られている標準的な方法に従って、定性的及び／又は定量的に測定することができる。試料中のバイオマーカーの量又はレベルが、例えば、対照試料中の同じバイオマーカー（ＮＯＣＩＶＡ）又は対照バイオマーカー（例えば、ＣＩＰ２Ａもしくはハウスキーピング遺伝子）の対照値又は量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、９倍、倍倍、１０倍、２０倍又は３０倍である場合、発現が増加している。いくつかの実施形態では、「発現増加」という用語は、関連、好ましくは陰性対照のレベル又は量と比較した、バイオマーカーのレベル又は量の統計学的に有意な増加を指す。陰性対照と比較した発現増加は、対象が予後不良である、又はそのリスクが高いことを示す。
【0063】
本明細書で使用される場合、「発現が増加していない」という用語は、分析される試料と関連対照の両方で本質的に同じであるバイオマーカーの発現レベルを指す。陰性対照と比較して発現が増加していないとは、対象が予後不良でない、又はそのリスクがないことを示す。
【0064】
本明細書で使用される場合、「発現減少」という用語は、関連対照と比較した試料中のバイオマーカーの量の減少を指す。上記減少は、当技術分野で知られている標準的な方法に従って、定性的及び／又は定量的に測定することができる。試料中のバイオマーカーの量又はレベルが、例えば、対照試料中の同じバイオマーカー又は対照バイオマーカー（例えば、ＣＩＰ２Ａもしくはハウスキーピング遺伝子）の対照値又は量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、９倍、倍倍、１０倍、２０倍又は３０倍低い場合、発現が減少している。いくつかの実施形態では、「発現減少」という用語は、関連対照のレベル又は量と比較した、バイオマーカーのレベル又は量の統計学的に有意な減少を指す。陽性対照と比較した発現減少は、対象が予後不良でない、又はそのリスクがないことを示し得る。
【0065】
がんについて診断される、がんについて予後判定される、がん進行について監視される、起こり得るがんの寛解、再発もしくは再燃について監視される、治療法の選択を受ける、治療に対する反応について監視される、又は関連するがん関連の目的のためにグループ化もしくは層別化される対象から得られた試料中のＮＯＣＩＶＡの発現レベルの決定は、この目的に適したいずれかの利用可能な又は将来の手段によって測定することができる。上記決定は、当技術分野で周知のように、様々な分子レベル、好ましくはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はタンパク質レベルで実行され得る。本発明は、いかなる決定技術にも限定されない。したがって、異なる実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの発現について生体試料又は臨床試料を分析するための様々な手段又はこれらの組み合わせが使用され得る。
【0066】
一態様では、本発明は、ＮＯＣＩＶＡを特異的に認識するが、ＣＩＰ２Ａの他の形態、すなわちエクソン１３を超えるエクソンを含むＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡによってコードされるＣＩＰ２Ａポリペプチドを認識しない抗ＮＯＣＩＶＡ抗体を提供する。したがって、本抗ＮＯＣＩＶＡ抗体の好ましいエピトープは、配列番号２のアミノ酸５４６～５５８によって形成される配列に対応する又は重複する配列の５～２０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドを含む。
【0067】
提供される抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、組換え抗体、一本鎖抗体、又は機能的抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖであり得、これらの全てが「抗体」という用語に包含される。
【0068】
本発明による抗ＮＯＣＩＶＡ抗体は、種々の技術又はこれらの任意の適切な組み合わせによって得ることができる。例えば、抗体は、伝統的な免疫化方法、ＣＤＲグラフト、インビトロタンパク質発現、無細胞タンパク質発現、無細胞翻訳もしくは無細胞タンパク質合成によって産生され得る、又は例えばファージディスプレイに基づく戦略を使用することによって、組換え発現ライブラリーから得られえる。機能的抗体フラグメント及び一本鎖抗体は、当技術分野で周知にように、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって産生され得る。
【0069】
いくつかの実施形態では、本抗ＮＯＣＩＶＡ抗体が、精製、単離、固定化及び／又は検出を容易にする１つ又は複数のペプチド又は小タンパク質タグにコンジュゲートもしくは他の方法で付着され得る、又はこれとの融合体として産生され得る。精製又は固定化の目的に適したアフィニティータグの非限定的な例としては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）及びビオチンタグが挙げられる。適切な検出タグには、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、及び発色基質との接触時に着色生成物を生成する酵素タグが含まれる。適切な酵素タグの非限定的な例としては、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が挙げられる。また、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンなどの他のタグを検出目的で使用することもできる。これらは、酵素、フルオロフォア又は他のレポーター分子にコンジュゲートしたビオチン／アビジン／ストレプトアビジン結合タンパク質で検出することができる。このような検出可能及び／又は固定化可能な抗ＮＯＣＩＶＡ抗体を産生するための手段及び方法は、当技術分野で容易に利用可能である。
【0070】
本抗ＮＯＣＩＶＡ抗体は、上記で設定された任意の目的のためにタンパク質レベルでＮＯＣＩＶＡ発現を検出するために使用され得る。これは、それだけに限らないが、下記の方法及びアッセイを含む当技術分野で利用可能な任意の適切な技術を使用することによって達成され得る。ＮＯＣＩＶＡは細胞内タンパク質であるため、上記方法及びアッセイは、当技術分野で周知の手段及び方法によって、細胞を溶解もしくは破壊すること、細胞膜を透過処理すること、又はタンパク質を単離することを含み得る。
【0071】
一般に、タンパク質レベルでＮＯＣＩＶＡ発現のレベルを測定することは、上記決定を必要とする対象から得られた試料を、結合体がＮＯＣＩＶＡと特異的に相互作用するが、そのアミノ酸配列が配列番号４に示される完全長ＣＩＰ２Ａとは相互作用しない条件下で、ＮＯＣＩＶＡポリペプチドを特異的に認識する抗体などの結合体と接触させることと；上記相互作用（あれば）を検出することとを含み；上記相互作用の存在又は程度は、上記試料中のＮＯＣＩＶＡの存在又はＮＯＣＩＶＡ発現のレベルと相関する。タンパク質レベルでＮＯＣＩＶＡ発現を測定するのに適した抗体及びそのフラグメントの代替となる結合体には、それだけに限らないが、オリゴヌクレオチド又はペプチドアプタマー、受容体、及び生物学的に相互作用するタンパク質が含まれる。
【0072】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、生体試料又は臨床試料中のＮＯＣＩＶＡ発現を検出及び分析するためのイムノアッセイであって、ＮＯＣＩＶＡに特異的に結合する抗体を用意するステップと；好ましくは透過処理又は破壊した細胞を含む試料を抗体と接触させるステップと；試料中のＮＯＣＩＶＡに結合した抗体の複合体の存在を検出するステップとを含むイムノアッセイを提供する。所望であれば、抗体を試料と接触させる前に、抗体を固体支持体に固定して、複合体の洗浄及びその後の検出を容易にすることができる。試料を抗ＮＯＣＩＶＡ抗体とインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成された抗体－ＮＯＣＩＶＡ複合体を検出することができる。これは、例えば、検出可能な抗体、すなわち検出可能に標識された抗体、又は酵素で標識された抗体を使用し、複合体を検出試薬、すなわち酵素の基質とインキュベートすることによって達成することができる。あるいは、例えば、第２の標識された抗体を使用して、形成された抗体－ＮＯＣＩＶＡ複合体を検出する間接アッセイを使用して、ＮＯＣＩＶＡを検出することができる。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルが、非競合アッセイ形式を使用して決定され得る。試薬過剰アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノメトリックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）又は２サイトアッセイ（ｔｗｏ－ｓｉｔｅ ａｓｓａｙ）としても知られている非競合イムノアッセイは、一般に、抗原の異なるエピトープを標的とする２つの抗体の使用を伴い、一方の抗体は抗原捕捉、他方は検出のための標識を行う。好ましくは、第１の抗体が本抗ＮＯＣＩＶＡ抗体であり、第２の抗体が配列番号２のアミノ酸１～５４５によって形成される配列内のエピトープを標的とするものである。このような第２の抗体は、ＣＩＰ２ＡとＮＯＣＩＶＡの両方に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗体が捕捉抗体として使用され、第２の抗体が検出抗体として使用される。いくつかの他の実施形態では、第１の抗体が検出抗体として使用され、第２の抗体が捕捉抗体として使用される。当業者であれば、単独で又はＣＩＰ２Ａの別の形態もしくは任意の他の対照に関連して、ＮＯＣＩＶＡの存在、非存在又はレベルを測定するための結合アッセイを確立することが十分に実施し得る。したがって、抗体－ＮＯＣＩＶＡ複合体の形成は、いくつかの十分認識されている非競合免疫学的結合アッセイのいずれかを使用して測定することができる。有用なアッセイには、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）；時間分解免疫蛍光アッセイ（ＴＲ－ＩＦＭＡ）などの蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）；化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）及び放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。
【0074】
使用するアッセイの種類に応じて、第１の抗体もしくは第２の抗体のいずれか、又は両方を、それだけに限らないが、光学剤、例えば種々の有機及び／又は無機小分子と種々の蛍光タンパク質及びその誘導体を含む蛍光標識、燐光標識、化学発光標識及び発色標識；γ線、陽電子、βもしくはα粒子、又はＸ線を放出する放射性核種などの放射性標識、ならびにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び（西洋ワサビ）水素ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を含む群から選択される検出可能な標識とコンジュゲート又は他の方法で会合することができる。上記会合は、例えば共有結合を介して直接的、又は例えば二次結合剤、キレート剤もしくはリンカーを介して間接的であることができる。検出可能な薬剤を抗体にコンジュゲート又は他の方法で会合するための技術は周知であり、抗体標識キットは数十の供給元から市販されている。抗体の一方又は両方はまた、組換え技術により、検出可能な標識又は検出タグを有する融合タンパク質として発現され得る。
【0075】
非競合イムノアッセイのいくつかの実施形態では、検出抗体が検出可能に標識される。いくつかの他の実施形態では、検出抗体が、検出可能な標識を含むさらなる抗体によって認識される。いくつかのさらに他の実施形態では、検出抗体が、検出可能な標識を含むさらなる抗体によって認識可能なタグを含む。いくつかのさらなる実施形態では、検出抗体及び上記さらなる抗体が、例えば感度を向上させるため、同じ標識で標識される。いくつかの他の実施形態では、検出抗体及び上記さらなる抗体が、異なる標識で標識される。
【0076】
本発明によるイムノアッセイは、ラテラルフローアッセイなどの固相イムノアッセイ、及び例えばマイクロタイタープレート、スティック、カード、アレイ、センサー、ビーズ又はマイクロビーズの形態の、ガラス、プラスチック、セラミック、金属などの固体表面、又は紙などの繊維状もしくは多孔質材料上で行われる従来のサンドイッチアッセイを含む。上記固相イムノアッセイは、不均一系であっても均一系であってもよい。不均一系アッセイでは、遊離抗原又は抗体が、例えば洗浄によって、形成された免疫複合体から物理的に分離されるが、多くの形態のバイオセンサーを含む均一系アッセイでは、このような分離は必要ではない。
【0077】
本均一系イムノアッセイは、固相アッセイ形式に限定されず、溶液中で行われる均一系イムノアッセイも包含する。このような溶液中イムノアッセイは、固定化ステップも洗浄ステップも必要とされず、それらを実施するのを単純かつ容易にするため、特に有利である。したがって、いくつかの実施形態では、イムノアッセイが液体ベースの均一系イムノアッセイである。
【0078】
上記のイムノアッセイのいずれかを、同じ試料中のＣＩＰ２Ａの別の形態の発現レベルを測定するためのさらなるイムノアッセイと組み合わせて使用することができる。このような実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの決定された発現レベルを、ＣＩＰ２Ａの決定された発現レベルと比較して、ＮＯＣＩＶＡ発現とＣＩＰ２Ａ発現の比を得る。上記比を測定することは、上に示されるいずれかの目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、関連対照のそれと比較した、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａの比の増加が、予後不良を示す。
【0079】
上記目的に適した抗体には、ＣＩＰ２Ａを特異的に認識するが、ＮＯＣＩＶＡを特異的に認識しないものが含まれる。このような抗体のエピトープは、エクソン１３のＣ末端にある。換言すれば、エピトープが、配列番号４のアミノ酸５４６と９０５との間にある。ＣＩＰ２Ａの発現レベルが非競合イムノアッセイによって決定される場合、使用される第２の抗体は、配列番号４のアミノ酸領域１～５４５（ＮＯＣＩＶＡのアミノ酸領域１～５４５に対応する、配列番号２）を標的とするものであり得る。このような第２の抗体は、ＣＩＰ２ＡとＮＯＣＩＶＡの両方に特異的に結合する。
【0080】
タンパク質レベルでのＮＯＣＩＶＡの発現レベルを測定するための適切な方法のさらなる例としては、従来のウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ及び免疫組織化学に基づくアッセイ形式が挙げられる。さらに、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーを、抗体－ＮＯＣＩＶＡ複合体を検出するために使用することができる。さらに、タンパク質レベルでＮＯＣＩＶＡの発現レベルを測定するのに適した技術には、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、ＳＷＡＴＨ及びユニークなペプチドに基づくがん細胞試料からのマスサイトメトリーなどのＭＳベースの検出方法が含まれる。また、このような実施形態では、本方法が、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルをＣＩＰ２Ａの発現レベルと比較するステップを含み得る。
【0081】
さらなる態様では、本発明は、例えば本明細書に開示される方法によって、核酸レベルでＮＯＣＩＶＡ発現を測定するのに使用するための核酸結合体を提供する。このような結合体は、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに特異的なプローブ、ならびにＮＯＣＩＶＡの特異的増幅のためのプライマーを含む。
【0082】
核酸レベルでＮＯＣＩＶＡの発現を測定するのに特に適した領域には、ポリＡテールを含まないＮＯＣＩＶＡ特異的配列（配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３）；新規なＮＯＣＩＶＡペプチドをコードする配列（配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４）；及びポリＡテールを含まない３’ＵＴＲ（配列番号１のヌクレオチド１６７５～１９８３）が含まれる。
【0083】
ＮＯＣＩＶＡ－ｍＲＮＡの存在／非存在及び／又は量を決定するための１つの好ましい実施形態は、
ａ）対象から得られ、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡを含むことが疑われる生体試料を用意するステップと；
ｂ）場合により、例えば、ランダム又はポリＴプライマー又は配列特異的プライマーを使用して、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を実施するステップと；
ｃ）場合により、もしあれば、上記試料中のＮＯＣＩＶＡ特異的ＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）上記作業に適したいずれかの選択された方法で、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は増幅されたＤＮＡなどのＮＯＶＩＣＡ特異的配列を検出するステップと
を含み、
ステップｃ）及びｄ）は別々に又は同時に実施することができる。
ａ）対象から得られ、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡを含むことが疑われる生体試料を用意するステップと；
ｂ）場合により、例えば、ランダム又はポリＴプライマー又は配列特異的プライマーを使用して、ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を実施するステップと；
ｃ）場合により、もしあれば、上記試料中のＮＯＣＩＶＡ特異的ＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）上記作業に適したいずれかの選択された方法で、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は増幅されたＤＮＡなどのＮＯＶＩＣＡ特異的配列を検出するステップと
を含み、
ステップｃ）及びｄ）は別々に又は同時に実施することができる。
【0084】
他のヒトｍＲＮＡと比較してほとんどの部分でユニークであるＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの配列のために、多くの代替のオリゴヌクレオチド設計を本方法に使用することができる。当業者であれば、ＮＯＣＩＶＡに特異的である、あるいは、例えば、ＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａのいくつかの他の形態を分離及び／又は定量化することができるアッセイを容易に設計することができる。
【0085】
このようなオリゴヌクレオチド、特にプローブを使用する適用可能な方法には、核酸の集合、例えば固体表面に付着したＤＮＡスポットであるマイクロアレイが含まれる。各ＤＮＡスポットは、プローブ又は捕捉プローブとして知られる特異的ＤＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを含む。これらは、高ストリンジェンシー条件下で試料中の標的ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡとも呼ばれる）をハイブリダイズするために使用される遺伝子又は他のオリゴヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＬＮＡ要素など）の短いセクションからなることができる。プローブ－標的ハイブリダイゼーションは、例えばフルオロフォア－、銀－又は化学発光－標識された標的核酸を検出して、試料中の相対存在量を測定することによって、検出及び／又は定量化することができる。いくつかのアレイ型では、表面結合プローブ－標的核酸相互作用を定量可能なシグナルに変換することができる認識要素（トランスデューサー）を組み込むことができる。利用可能ないくつかの様々な型のトランスデューサーの中で、特に電気化学的又は光学的検出に基づくトランスデューサーが当技術分野で一般的である。他の核酸分析方法と同様に、両型のセンサーは、標識フリー又は標識使用として実行することができ、洗浄の要件に基づいて不均一系アッセイ形式と均一系アッセイ形式に分割することもできる。
【0086】
１つの適切な用途は、ＤＮＡマイクロアレイのバリエーションであるＮａｎｏＳｔｒｉｎｇのｎＣｏｕｎｔｅｒ技術である。これは、分子「バーコード」及び顕微鏡画像を使用して、１つのハイブリダイゼーション反応で最大数百ものユニークな転写産物を検出及びカウントする。それぞれの色分けされたバーコードが、目的の遺伝子に対応する単一の標的特異的プローブに付着している。いくつかの実施形態では、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇなどのアレイベースの技術の使用が、ＮＯＣＩＶＡ発現を検出するために有益である。プローブとして本明細書に記載される任意のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを、他の実施形態でプライマーとして使用してもよく、逆もまた同様である。より一般的には、本発明は、ＮＯＣＩＶＡポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、すなわち、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに相補的なポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを提供する。本ＮＯＣＩＶＡ特異的結合体は、当技術分野で周知のように、ならびに図６及び表２に例示されるように設計され得る。ＮＯＣＩＶＡを検出するのに適したプローブの非限定的な例としては、配列番号２６～４４に示される配列を含む又はからなるプローブが挙げられる。
【0087】
本ＮＯＣＩＶＡ特異的オリゴヌクレオチドは、酵素合成又は固相合成などの当技術分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成方法によって生成することができる。固相合成を実行するための機器及び試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。このような合成のための他の手段も使用することができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内であり、確立された方法論を介して達成することができる。
【0088】
本発明はまた、本明細書に開示される核酸結合体又は標的核酸配列の相補的配列に関する。「相補的」という用語は当技術分野で周知であり、標的モチーフ配列中の核酸塩基アデニン（Ａ）が対応する結合単位中で核酸塩基チミン（Ｔ）によって表される、又はその逆のワトソンクリック塩基対形成を意味する。したがって、標的モチーフ中の核酸塩基シトシン（Ｃ）は、対応する結合単位中で核酸塩基グアニン（Ｇ）によって表される、又はその逆である。換言すれば、例えば５’－Ｔ－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｇ－３’に対する相補的配列は３’－Ａ－Ａ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－５’である。
【0089】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸結合体がプライマーである。本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、適切な条件下で標的配列にアニーリング（ハイブリダイズ）することができ、それによってＤＮＡ合成の開始点として役立つことができる二本鎖領域を作り出すことができるオリゴヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「プライマー対」という用語は、本明細書では、任意の利用可能な増幅技術、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって選択された核酸配列を増幅する際に一緒に使用される一対のオリゴヌクレオチドを指す。好ましくは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）をｍＲＮＡ試料に行うべきである。他の種類の増幅方法には、それだけに限らないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅、転写媒介増幅、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅、ローリングサークル増幅、ループ媒介増幅、複数置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、単一プライマー等温増幅又は環状ヘリカーゼ依存性増幅が含まれる。当技術分野で一般に知られているように、プライマーは、選択された条件下でそれらの相補的配列に結合するように設計される。プライマー対は、５’プライマー、すなわち、「順方向プライマー」及び３’プライマー、すなわち、「逆方向プライマー」を含む。
【0090】
本オリゴヌクレオチドプライマーは、使用される特定のアッセイ形式に応じて、任意の適切な長さであり得る。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーが、１０～４０個、好ましくは１５～３５個より好ましくは２０～３０個のヌクレオチド長を有し、選択された核酸増幅システムに特に適するように適合され得る。当技術分野で一般的に知られるように、オリゴヌクレオチドプライマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーションの融点（すなわち、融解温度、Ｔｍ）を考慮することによって設計することができる。非常に短いオリゴヌクレオチドでさえも十分に高い溶融温度が達成されるように、溶融温度を上げるための多くの方法が存在する。これらの方法には、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）技術などの修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。
【0091】
核酸アッセイでＮＯＣＩＶＡ特異性を提供する方法がいくつか存在する。ＰＣＲなどの少なくとも２つのプライマーを使用するいくつかの実施形態では、ペプチドコード領域が試料中に存在する場合にのみ、ＮＯＣＩＶＡ特異的アンプリコンの産生がもたらされるように、少なくとも３’プライマーが、ＮＯＣＩＶＡタンパク質のユニークなＣ末端領域、すなわち配列番号１のヌクレオチド１６３５～１６７４によって形成されるペプチドコードイントロン領域をコードする配列の少なくとも一部と特異的にアニーリング又はハイブリダイズするよう設計される。あるいは、３’プライマーが、完全長ＮＯＣＩＶＡ特異的核酸（ポリＡテールを含まない）の別の部位又はＮＯＣＩＶＡの３’ＵＴＲに特異的に設計されている場合にも、同様の特異性が達成される、すなわち、これが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３又は１６７５～１９８３によって形成される又はこれらと重複する配列の少なくとも一部と特異的にアニーリング又はハイブリダイズし得る。これは、タンパク質には存在しないが、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列がほとんどの部分でＮＯＣＩＶＡにユニークであるためである。あるいは、３’プライマーはまた、ペプチドコード領域とＮＯＣＩＶＡの３’ＵＴＲの境界と重複する配列番号１の配列と特異的にアニーリング又はハイブリダイズし得る。換言すれば、３’プライマーは、配列番号１のヌクレオチド１６７５～１９８３によって形成される配列に包含される、又はその中にある、又は重複する標的領域にハイブリダイズする。これに関連して、「に包含される」という用語は、プライマーが上記ヌクレオチドによって形成される配列全体とハイブリダイズするのではなく、標的配列に対応するその部分配列とハイブリダイズすることを意味する。この定義は、プライマーだけでなく、プローブなどの他の結合体にも適用する。
【0092】
プライマー対のＮＯＣＩＶＡ特異性が３’プライマーによって提供されることで十分であるので、ＮＯＣＩＶＡポリヌクレオチドに沿った５’プライマーのアニーリング部位をより自由に設計することができる。したがって、５’プライマーを、少なくとも部分的にＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａによって共有される核酸配列、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４に包含される核酸配列とハイブリダイズするように設計することができる。あるいは、５’プライマーはＮＯＣＩＶＡ特異的であり得る、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３によって形成されるイントロン領域の一部、配列番号１のヌクレオチド１６３６～１６７４によって形成されるＮＯＣＩＶＡペプチドコード配列の一部、配列番号１のヌクレオチド１６７５～１９８３によって形成されるＮＯＣＩＶＡの３’ＵＴＲ領域の一部、又はＮＯＣＩＶＡのペプチドコード領域と３’ＵＴＲの重複する領域と特異的にアニーリング又はハイブリダイズするよう設計され得る。
【0093】
より一般的に言えば、本発明は、ＮＯＣＩＶＡの特異的増幅のためのプライマー対を提供し、少なくとも３’－プライマーがＮＯＣＩＶＡ特異的である、すなわち、完全長イントロン領域に完全に又は部分的に対応する配列番号１の部分配列、ペプチドコードイントロン領域、又は３－ＵＴＲイントロン領域（それぞれ、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３６～１６７４又は１６７５～１９８３）とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、５’プライマーと３’プライマーの両方がＮＯＣＩＶＡ特異的である。いくつかの他の実施形態では、５’－プライマーが、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａによって共有される配列の少なくとも一部と特異的にアニーリング又はハイブリダイズする配列、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４によって形成される配列を含む。典型的には、イントロンＮＯＣＩＶＡ配列、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３のみを標的とするように設計された場合に、アンプリコンの長さが約５０ヌクレオチド～約３５０ヌクレオチドとなるように、プライマーが設計される。換言すれば、核酸増幅アッセイに使用する場合、プライマーは、約５０～約３５０ヌクレオチドで変動する長さの増幅産物を産生する。
【0094】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明のプライマー対が、ＮＯＣＩＶＡ特異的イントロン配列のみ、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３によって定義される配列の少なくとも一部を増幅する。このような実施形態では、プライマー対の３’－プライマーが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３５～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列の１０～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個の連続ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、５’－プライマーが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３５～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列の１０～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個の連続ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。
【0095】
いくつかの他の実施形態では、アンプリコンがＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａによって共有される配列、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４によって形成される配列中の１つ又は複数のヌクレオチドに及ぶように、本発明のプライマー対が、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３によって定義されるＮＯＣＩＶＡ特異的配列の一部のみを増幅する。このような実施形態では、プライマー対の少なくとも３’プライマーが、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３、１６３５～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列の１０～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個の連続ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。さらなる実施形態では、５’プライマーが、配列番号１のヌクレオチド１～１９８４、１～１６３５、１６３５～１９８３、１６３５～１６７４又は１６７５～１９８３によって形成される配列の１０～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個の連続ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする。このような実施形態の多くでは、５’プライマー及び３’プライマーによって産生されるアンプリコンの長さが、約５０～約２０００、好ましくは約６０～約１０００、より好ましくは約７０～約５００、さらにより好ましくは、約７５～約２５０ヌクレオチドと異なる。適切な５’プライマー及び３’プライマーのいくつかの非限定的な例は、表２に示され、配列番号５～２５に示される配列からなる群から選択される５’プライマー、及び／又は配列番号４５～６５に示される配列からなる群から選択される３’プライマーが挙げられる。当業者であれば、両増幅プライマー、及び場合により１つ又は複数のプローブを所望のフレームに適合させるためのスペース要件を考慮に入れて、概説される実施形態のいずれかに従ってプライマーを設計することが十分に可能である。
【0096】
高い増幅効率が追求される多くの実施形態では、プライマー対の５’プライマー及び３’プライマーが、適合性の融解温度（Ｔｍ）、例えば、７℃未満、好ましくは５℃未満、より好ましくは４℃未満、最も好ましくは３℃未満、理想的には３℃～０℃の間だけ異なる融解温度を有する。
【0097】
プライマー及びプローブなどのＮＯＣＩＶＡ特異的オリゴヌクレオチドを設計する際に考えられるオフターゲッティングを考慮するための手段及び方法、ならびにＮＯＣＩＶＡの検出アッセイは、当技術分野で容易に利用可能である。使用するオリゴヌクレオチドの組み合わせ又はアッセイが、全体として、ＮＯＣＩＶＡ発現の信頼できる検出を可能にするのに十分なＮＯＣＩＶＡ特異性を提供していれば十分である。
【0098】
増幅産物を検出するために使用される技術に応じて、プライマーは、検出のためにプローブが必要とされないように検出可能であり得る。あるいは、インターカレート標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）を使用することができる。融解曲線分析と組み合わせると、インターカレート標識を使用して、プローブを使用する必要なく、わずかな差であってもアンプリコンを検出及び識別することができる。本発明の例示的な実施形態では、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａの両方に共通の５’プライマーを、その一方が各配列に特異的な２つの３’プライマーと組み合わせて、使用し得る。
【0099】
上記に従って、核酸レベルでのＮＯＣＩＶＡの発現を、核酸増幅を用いる又は用いない任意の適切な方法を使用して測定することができる。例えば、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡを、最初に逆転写酵素の助けを借りてその相補的ｃＤＮＡに変換し、引き続いて例えば、それだけに限らないが、リアルタイムＰＣＲとしても知られる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によってＤＮＡ増幅することができる。発現されたＮＯＶＩＣＡ ｍＲＮＡポリヌクレオチド又は増幅産物又はその特性の存在、非存在又は濃度を、当技術分野で利用可能な方法に従って、例えばＮＯＣＩＶＡ特異的捕捉又は検出プローブを使用することによって評価することができる。選択した方法に応じて、逆転写ステップ及び／又は核酸増幅ステップを用いて又は用いないで、核酸レベルでＮＯＶＩＣＡの発現を測定するのに適したさらなる潜在的な方法には、それだけに限らないが、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、分子ビーコンベースオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ、オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はインターカレート標識と組み合わせた融解曲線分析、ゲル電気泳動分析、サザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ及びＲＮＡマイクロアレイなどのマイクロアレイ、直接プロービング、ならびにシグナル蓄積アッセイが含まれる。
【0100】
したがって、いくつかの実施形態では、結合体が、本発明の種々の態様で利用することができるオリゴヌクレオチドプローブである。好ましくは、プローブが、ＮＯＣＩＶＡのユニークな配列領域、すなわちＫＩＡＡ１５２４遺伝子のエクソン１３と１４との間のイントロン領域（配列番号１の核酸１６３５～１９８４に対応する）に完全に又は部分的に対応する配列又はその相補物と特異的にハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチドである。本発明はまた、上に示される配列に相補的な配列にハイブリダイズするプローブを包含する。いくつかの実施形態では、プローブが、上記ユニークな配列領域全体に相補的ではなく、その一部のみに相補的である配列を含む、又はからなり得る。換言すれば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、上記イントロン領域の少なくとも一部と重複する又はこれを含む核酸配列とハイブリダイズするように設計することができる。
【0101】
本ＮＯＣＩＶＡ特異的プローブは、長さが異なっていてもよい。当業者であれば、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルを測定するために適用される技術に適切又は最適である長さを有するプローブを容易に設計することができる。例えば、プローブの標的特異的部分は、８～４０個、好ましくは１５～３５個、より好ましくは２０～３０個のヌクレオチド長を有し得る。いくつかの実施形態では、プローブが、当業者に明らかである中程度～厳しいハイブリダイゼーション条件下で、ＮＯＣＩＶＡに特異的にハイブリダイズするが、以前から知られているＣＩＰ２Ａアイソフォームにはハイブリダイズしない。したがって、このようなプローブは、ＮＯＣＩＶＡのユニークなイントロン領域を含む又は少なくとも部分的にこれに重複する領域に特異的にハイブリダイズし、そのイントロン領域は３５０ヌクレオチド長であり、配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３に対応する。このようなプローブは、例えば、どの発現又は増幅産物が存在するかに関係なく、ＮＯＣＩＶＡ特異的配列のみが検出される実施形態に有用である。
【0102】
他のいくつかの実施形態では、プローブが、ＮＯＣＩＶＡ特異的配列に先行する領域、すなわち、既知のＣＩＰ２Ａアイソフォームにも少なくとも部分的に存在し、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４のヌクレオチドに対応する領域とハイブリダイズ又は重複する。このようなプローブは、例えば、以前から知られているＣＩＰ２Ａアイソフォーム及びＮＯＣＩＶＡが別々の反応ウェルで増幅され、例えば、定量化の理由のために、好ましくは同じ又は本質的に同様のプローブで検出される実施形態で有用である。このようなプローブはまた、例えばプローブの標的配列が存在する実施形態で有用である、すなわち、分析される試料がＮＯＣＩＶＡ－ポリヌクレオチドを含んでいる場合にのみ、増幅産物が分析に利用可能である。
【0103】
なおさらなる実施形態では、少なくとも２つのプローブが使用され、一方が配列番号１のヌクレオチド１６３５～１９８３に対応するイントロンＮＯＣＩＶＡ領域と特異的にハイブリダイズ又は重複し、他方が配列番号１のヌクレオチド１～１６３４に対応する全てのＣＩＰ２Ａアイソフォームに共通の領域と特異的にハイブリダイズ又は重複する。このようなプローブは、例えば、異なるＣＩＰ２Ａアイソフォームの増幅及び検出が多重化反応で実施される実施形態で有用である。このようなアッセイでは、例えば、エクソン１～１３、１４～１９及び／又は２０～２１をカバーする領域に追加又は代替のプローブを設計することもできる。
【0104】
適切なプローブのいくつかの非限定的な例を表２に示す。
【0105】
本ＮＯＣＩＶＡ特異的プローブを本プライマー対の使用を伴う方法で使用する場合、いくつかの実施形態では、その溶融温度が、使用されるプライマー対の融解温度と適合するようにプローブを設計することが有利となり得る。
【0106】
本発明のＮＯＣＩＶＡ特異的オリゴヌクレオチド、すなわちプライマー及び／又はプローブは、例えば、当業者に明らかであるように、修飾骨格、非天然ヌクレオシド間結合、及び／又は１つもしくは複数の塩基修飾もしくは置換を含むものを含む。さらに、プローブの化学組成は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい、又はこれらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡもしくは他の核酸類似体の任意の数のモノマーを含む混合ポリマーで構成されてもよい。さらに、プローブは、マイナーグルーブバインディング（ＭＧＢ）プローブとして構築されてもよい。
【0107】
上記に従って、本発明は、核酸レベルでＮＯＣＩＶＡの発現レベルを測定する方法を提供する。このような方法は、例えば、上記決定を必要とし、試料から得られるＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ又は単離ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡを含むことが疑われる対象からの試料を、ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ又はＮＯＣＩＶＡ特異的核酸アッセイ増幅産物と特異的に相互作用するプローブなどのオリゴヌクレオチド結合体と、結合体が上記意図した標的と特異的にハイブリダイズする条件下で接触させるステップと；ハイブリダイゼーション複合体があれば検出するステップとを含み、上記ハイブリダイゼーション複合体の存在は、上記試料中のＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの存在と相関する。
【0108】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、当技術分野で利用可能な任意の適切な方法によって行うことができる。いくつかのアッセイ方法では、ハイブリダイゼーション複合体を、ハイブリダイズしていない核酸から物理的に分離し（例えば、１つ又は複数の洗浄ステップを使用して過剰な標的ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、プローブ、又は両方を洗い流すことにより）、次いで、複合体に結合した検出可能な標識を検出する。しかしながら、より頻繁には、ハイブリダイズした分子とハイブリダイズしていない分子の物理的な分離が必要とされない場合、均一系検出を使用する。核酸増幅アッセイでは、均一系検出を、増幅後の別のステップとして、すなわち、均一系エンドポイント検出を使用して実施することができる。アンプリコンの蓄積は、ｑＰＣＲタイプの方法を使用して、増幅アッセイ中に均一に監視することもできる。種々の均一系検出方法は、プローブ使用形式と非プローブ使用形式にさらに分類することができる。
【0109】
検出可能な標識は、当技術分野で標準的に使用されている放射性、蛍光、生物学的又は酵素的タグ又は標識を指す。検出可能な標識を、オリゴヌクレオチドプローブ又は標的ポリヌクレオチドのいずれかにコンジュゲートすることができる。当業者に自明であるように、特定の検出可能な標識の選択は、それをプローブ又は標的配列に結合する様式、ならびに検出に使用される技術を指示する。本発明は、特定の核酸配列を検出するために標識の使用に特に依存しないが、このような標識は、検出の感度又は特異性を向上し、アッセイの多重化を単純化することによって有益となり得る。さらに、検出可能な標識は自動化をよりよく可能にし得る。
【0110】
インターカレート色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）を使用して、ＰＣＲなどの核酸増幅反応中に目的のＤＮＡフラグメントの増幅を検出することができる。インターカレーションは、適切なサイズ及び化学的性質のリガンドがＤＮＡの平面塩基対の間に位置すると生じる。これらのリガンドは、主に多環式、芳香族及び平面であるので、しばしば適切な核酸染色を行う。蛍光強度は増幅中にそれぞれ増加し、別個のオリゴヌクレオチドプローブを必要とすることなくリアルタイムで測定することができる。
【0111】
当業者に理解されるように、種々の対照及び添加剤を使用してハイブリダイゼーションアッセイの精度を向上することができる。例えば、試料をハイブリダイゼーションの前に無関係のプローブとハイブリダイズさせる、及び／又はＲＮＡｓｅ Ａで処理して、誤ったハイブリダイゼーションを評価する、又は非特異的もしくは望ましくない効果を防止することができる。
【0112】
いくつかの実施形態では、上記の検出方法が、容易に入手可能である、又は当技術分野で入手可能な手段及び方法を使用して設計することができるＣＩＰ２Ａ特異的プライマー及び／又はプローブを使用することによって、ＣＩＰ２Ａの発現レベルを検出するステップを含み得る。ＮＯＣＩＶＡの発現レベルをＣＩＰ２Ａの発現レベルと比較することができ、ＮＯＣＩＶＡの発現増加は予後不良を示す。
【0113】
いくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡの発現を測定することが、配列決定技術によって実施される。この目的に適した多数の方法が当技術分野で記載されており、それだけに限らないが、従来のサンガー法及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術が含まれる。本実施形態は、いかなるブランド化技術にも限定されない。
【0114】
ＮＯＣＩＶＡの存在又は量が存在する場合、配列決定によって検出する、本発明のいくつかの実施形態により使用するのに適した代表的な商用プラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａの合成による配列決定（ＳＢＳ）技術、特にＴｒｕＳｅｑ（登録商標）技術である。ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）技術を適用するには、目的の領域の上流及び下流にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプローブを設計及び合成する必要がある。各プローブは、ユニークな標的特異的配列及びユニバーサルアダプター配列を含む。伸長－ライゲーション反応を使用して２つのプローブを合体し、共通の末端を有する新たなテンプレート分子のライブラリーを作成する。次いで、アダプターがライゲーションされたＤＮＡをＰＣＲ増幅に供し、両端にインデックス及びシーケンスプライマーを付加する。次いで、成長中のＤＮＡ鎖に組み込まれる単一塩基の検出を可能にする可逆的ターミネーターに基づく方法を利用して、ＭｉＳｅｑ（登録商標）シーケンサーなどの任意の適切な機器によって配列決定を実施することができる。
【0115】
本配列決定目的に適した機器の非限定的な例としては、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＮＥｘｔＳｅｑ５００（商標）及びＨｉＳｅｑ（商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）２０００及びＨｉＳｅｑ（商標）３０００）などのＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンサー、ならびにＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）シーケンサー及びＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ（商標）シーケンサーなどのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのシーケンサーが挙げられる。これらの機器のいずれかを利用するには、適切な配列決定技術及び化学を使用する必要があることを理解すべきである。
【0116】
ＮＧＳ技術に関連するいくつかの実施形態では、ＮＯＣＩＶＡバリアントｍＲＮＡの検出が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（商標）３０００プラットフォーム、１５０ｂｐの読み取り長及びペアエンドライブラリーで実施されるものなどのディープシーケンシングで可能である。
【0117】
ＮＧＳベースの技術のいくつかの実施形態では、使用される第１のプローブが、配列番号１のヌクレオチド１～１６３４に包含される核酸配列、すなわちＫＩＡＡ１５２４のエクソン１～１３に対応し、ＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａによって共有される領域にハイブリダイズするが、使用される第２のプローブが、ＮＯＣＩＶＡに特異的な核酸配列、すなわち、本出願の他の場所でより詳細に記載されるユニークなイントロン領域又は３’ＵＴＲのいずれかにハイブリダイズする。
【0118】
ＮＯＣＩＶＡの発現レベルを検出するのに適した他の方法には、それだけに限らないが、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＣＤ）及びＶｉｅｗＲＮＡ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション技術が含まれる。
【0119】
上記に従って、本発明は、それだけに限らないが、それを必要とする対象のがんを予後判定、検出、スクリーニング、診断又は監視することを含む、上に示されるいずれかの目的のための方法であって、上記対象から得られた試料を、本ＮＯＣＩＶＡポリペプチド又はＮＯＣＩＶＡポリヌクレオチドに特異的に結合する試薬と接触させるステップと；上記試薬の結合に基づいて、上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定するステップと；決定された発現レベルを関連対照と比較するステップとを含み；上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現増加は予後不良を示す方法を提供する。典型的には、上記試薬が、本発明によるＮＯＣＩＶＡ特異的結合体、例えば抗ＮＯＣＩＶＡ抗体又は少なくとも１つのＮＯＣＩＶＡ特異的オリゴヌクレオチド、例えばプローブ及び／又はプライマー対である。
【0120】
さらなる態様では、本発明は、上に示されるいずれかの目的のために、生体試料又は臨床試料中のＮＯＣＩＶＡの発現レベルを検出するためのキットを提供する。好ましくは、キットが、ＮＯＣＩＶＡ特異的結合体、例えば抗ＮＯＣＩＶＡ抗体又は少なくとも１つのＮＯＣＩＶＡ特異的オリゴヌクレオチド、例えばプローブ及び／又はプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、結合体が、検出可能な標識を含み得る。当業者であれば、ＮＯＣＩＶＡの発現レベルの決定を行うための所望の技術に応じて、キットに含まれるべき任意のさらなる試薬を容易に測定することができる。したがって、キットは、例えばイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫組織化学アッセイ、核酸増幅アッセイ、シグナル増幅アッセイ、インサイチューＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析アッセイ又は配列決定アッセイを実施するための少なくとも１つの試薬をさらに含み得る。
【0121】
いくつかの実施形態では、適切な対照試薬又は試料又は閾値がキットに含まれ得る。キットはまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのコンピュータ実行可能命令を含む、コンピュータ可読媒体を含み得る。
【0122】
技術が進歩するにつれて、本発明の概念を種々の方法で実施することができることは、当業者に自明である。本発明及びその実施形態は、下記の例に限定されず、特許請求の範囲内で変化し得る。
【0123】
実験部
材料及び方法
３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ
Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキットで抽出した全ＲＮＡをＲＡＣＥ実験のテンプレートとして使用した。３’末端と５’末端の両方のｃＤＮＡ増幅のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ３’ＲＡＣＥ（カタログ番号１８３７４３－０１９）及び５’ＲＡＣＥ（カタログ番号１８３７４－０５８）キットを製造元のプロトコルに従って使用した。複数の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を設計し、ｃＤＮＡ末端の適切なＣＩＰ２Ａ関連増幅に使用した。増幅した配列をアガロースゲルに泳動し（予測フラグメントサイズに結合した割合）、切断し、ＤＮＡ抽出し（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）、分析用にＤＮＡ配列決定した。シーケンシングプライマーを、ＧＳＰの下流になるように設計した。
材料及び方法
３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ
Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキットで抽出した全ＲＮＡをＲＡＣＥ実験のテンプレートとして使用した。３’末端と５’末端の両方のｃＤＮＡ増幅のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ３’ＲＡＣＥ（カタログ番号１８３７４３－０１９）及び５’ＲＡＣＥ（カタログ番号１８３７４－０５８）キットを製造元のプロトコルに従って使用した。複数の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を設計し、ｃＤＮＡ末端の適切なＣＩＰ２Ａ関連増幅に使用した。増幅した配列をアガロースゲルに泳動し（予測フラグメントサイズに結合した割合）、切断し、ＤＮＡ抽出し（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）、分析用にＤＮＡ配列決定した。シーケンシングプライマーを、ＧＳＰの下流になるように設計した。
【0124】
ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡを、細胞株又は抽出された単核細胞（患者の骨髄試料）の細胞ペレットから単離した。細胞株からの全ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で抽出し、患者の試料から、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）全ＲＮＡキットＩ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ）を使用して、製造元の指示に従って単核細胞からの全ＲＮＡを単離した。単離後、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（ＮＤ－１０００；ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。
全ＲＮＡを、細胞株又は抽出された単核細胞（患者の骨髄試料）の細胞ペレットから単離した。細胞株からの全ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で抽出し、患者の試料から、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）全ＲＮＡキットＩ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ）を使用して、製造元の指示に従って単核細胞からの全ＲＮＡを単離した。単離後、ＮａｎｏＤｒｏｐ装置（ＮＤ－１０００；ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。
【0125】
出発材料として１μｇの全ＲＮＡを使用して、全ての試料についてのｃＤＮＡ合成を実施した。Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、Ｒｎａｓｅ（Ｈ－）（Ｍ３６８２、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ランダムプライマー（Ｃ１１８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｎ２５１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｄＮＴＰミックス（それぞれ１０ｍＭ、番号Ｒ０１９２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、細胞株のｃＤＮＡを合成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（１８０８００９３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ランダムプライマー（Ｃ１１８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＲｉｂｏＬｏｃｋ（ｔｍ）リボヌクレアーゼ阻害剤（番号ＥＯ０３８１、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ、ＢＩＯ－３９０２８、Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、患者試料のｃＤＮＡを合成した。温度及び体積を含むＲＴ反応を、酵素の製造元の指示に従って実施した。
【0126】
定量的リアルタイムＰＣＲ
各遺伝子特異的アッセイのプライマーを、可能であれば、ゲノムＤＮＡの増幅を回避するために、異なるエクソン配列に配置されるように設計した。各反応のプライマー濃度は３００ｎＭ、プローブ濃度は２００ｎＭであった。ｑＰＣＲ反応の特異性を、アガロースゲル電気泳動及び融解曲線分析によって検証した。予想されるサイズの１つのバンド及び単一ピークがそれぞれ必要であった。製造元の指示に従って、ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び７９００ ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、標的ｃＤＮＡの増幅を実施した。定量的リアルタイムＰＣＲを以下の条件下で実行した：９５℃で１０分間、引き続いて９５℃で１５秒と６０℃で１分間の４５サイクル。相対遺伝子発現データを、ＳＤＳソフトウェア（バージョン２．４．１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による２＾－ΔΔＣ（ｔ）方法を使用して、内因性ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβアクチンの発現レベルに正規化した。結果は、少なくとも２つの独立した実験及び２つの技術的複製の平均から導出した。
各遺伝子特異的アッセイのプライマーを、可能であれば、ゲノムＤＮＡの増幅を回避するために、異なるエクソン配列に配置されるように設計した。各反応のプライマー濃度は３００ｎＭ、プローブ濃度は２００ｎＭであった。ｑＰＣＲ反応の特異性を、アガロースゲル電気泳動及び融解曲線分析によって検証した。予想されるサイズの１つのバンド及び単一ピークがそれぞれ必要であった。製造元の指示に従って、ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び７９００ ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、標的ｃＤＮＡの増幅を実施した。定量的リアルタイムＰＣＲを以下の条件下で実行した：９５℃で１０分間、引き続いて９５℃で１５秒と６０℃で１分間の４５サイクル。相対遺伝子発現データを、ＳＤＳソフトウェア（バージョン２．４．１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による２＾－ΔΔＣ（ｔ）方法を使用して、内因性ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβアクチンの発現レベルに正規化した。結果は、少なくとも２つの独立した実験及び２つの技術的複製の平均から導出した。
【0127】
ＣＩＰ２Ａ ｅ１３アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ｃａｇｔｃｔｇｇａｃｔｇａｇａａｔａｔｔａｔｔｇｇａ（配列番号２３）、逆方向ｇｇｃａｔｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃｔａｔａｃｔｔｔ（配列番号６６）、プローブｔｃｃａｃｔｇｃ（配列番号４２）であった。ＣＩＰ２Ａ ｅ２０アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ｇａａｃａｇａｔａａｇａａａａｇａｇｔｔｇａｇｃａｔｔ（配列番号６７）、逆方向ｃｇａｃｃｔｔｃｔａａｔｔｇｔｇｃｃｔｔｔｔ（配列番号６８）、プローブｃｔｔｃｃｔｃｃ（配列番号６９）であった。ｂアクチンアッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ｔｃａｃｃｃａｃａｃｒｇｔｇｃｃｃａｔｃｔａｃｇｃ（配列番号７０）、逆方向ｃａｇｃｇｇａａｃｃｇｃｔｃａｔｔｇｃｃａａｔｇｇ（配列番号７１）、プローブａｔｇｃｃｃｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃａｔｃｃｔｇｃｇｔ（配列番号７２）であった、ＧＡＰＤＨアッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ａｃｃｃａｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔｔｔｇａ（配列番号７３）、逆方向ｔｔｇｃｔｇｔａｇｃｃａａａｔｔｃｇｔｔｇｔ（配列番号７４）、プローブａｃｇａｃｃａｃｔ－ｔｔｇｔｃａａｇｃｔｃａｔｔｔｃｃｔｇｇｔ（配列番号７５）であった。ＥＶＩ１アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ＡＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＧ（配列番号７６）、逆方向ＴＴＴＧＡＧＧＣＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣ（配列番号７７）、プローブＣＣＣＣＡＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＡ－ＡＧＡＧＧＡ（配列番号７８）であった。ＷＴ１アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ＧＧＧＣＧＴＧＴＧＡＣＣＧＴＡＧＣＴ（配列番号７９）、逆方向ＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＣＡ－ＧＧＧＴＴＡ（配列番号８０）、プローブＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧ（配列番号８１）であった。ＰＭＥ１アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ａｃａｇｇｔｔｔｇｃａｇａａｃｃｃａｔｃ（配列番号８２）、逆方向ｇｇａｃａｇｃａｇｇｔｃａｃｔａａｃａｇｃ（配列番号８３）、プローブｔｃｃａｇｔｇｔ（配列番号８４）であった。ＡＲＰＰ１９アッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ｃａｇａｇｇｇａｇｃａｃｔａｔｇｔｃｔｇｃ（配列番号８５）、逆方向ｇｃｔｔｔｔａａｔｔｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｔｇｃｔ（配列番号８６）、プローブユニバーサルプローブライブラリー（ＵＰＬ）番号６８であった。ＴＩＰＲＬアッセイのプライマー及びプローブの配列は、順方向ｃａｔｇａｔｇａｔｃｃａｃｇｇｃｔｔｃ（配列番号８７）、逆方向ｔｃａｇｇｇａｇａｇａｔｇｇｃａｔａｔｇｔａ（配列番号８８）、プローブＵＰＬ番号８１であった。使用したＳＥＴアッセイは、ＳＥＴ５－６－３、ＡＩＹ９ＡＸＧ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓであった。
【0128】
タンパク質の発現及び精製
ヒトＣＩＰ２Ａの切断型ドメイン（１～５６０、１～３３０、５６１～９０５）及び完全長ＮＯＣＩＶＡを、Ｎ末端ＧＳＴタグ及びその間にＴＥＶ切断部位を有するｐＧＥＸ‐４Ｔ１ベクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。全ての構築物を、ＬＢ培地で増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で過剰発現させた。細菌細胞を、ＯＤ６００が０．５～０．７に達するまで３７℃で培養し、次いで、０．２ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって１６℃で一晩誘導した。細菌ペレットを回収し、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂカラム（ＧＥ１７－０７５６－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）によって精製した。試料の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルーによる染色を使用して検証した。
ヒトＣＩＰ２Ａの切断型ドメイン（１～５６０、１～３３０、５６１～９０５）及び完全長ＮＯＣＩＶＡを、Ｎ末端ＧＳＴタグ及びその間にＴＥＶ切断部位を有するｐＧＥＸ‐４Ｔ１ベクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。全ての構築物を、ＬＢ培地で増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）で過剰発現させた。細菌細胞を、ＯＤ６００が０．５～０．７に達するまで３７℃で培養し、次いで、０．２ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって１６℃で一晩誘導した。細菌ペレットを回収し、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂカラム（ＧＥ１７－０７５６－０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）によって精製した。試料の純度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルーによる染色を使用して検証した。
【0129】
抗体
以下の抗体を使用した：マウスモノクローナル抗ＣＩＰ２Ａ（ｓｃ－８０６５９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；マウスモノクローナル抗ヌクレオリンＣ２３（ｓｃ－１７８２６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＣＬ ＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体（４８８抗ウサギ、５９４抗マウス、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
以下の抗体を使用した：マウスモノクローナル抗ＣＩＰ２Ａ（ｓｃ－８０６５９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；マウスモノクローナル抗ヌクレオリンＣ２３（ｓｃ－１７８２６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＣＬ ＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体（４８８抗ウサギ、５９４抗マウス、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【0130】
ウエスタンブロット
タンパク質抽出物を、変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離し（４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｇｅｌｓ）、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。膜を５％ミルク－ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングし、指示された一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＥＣＬ ＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＲＴで１時間インキュベートした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロット試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を膜に添加し、フィルムを現像した。
タンパク質抽出物を、変性条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離し（４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸ Ｇｅｌｓ）、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。膜を５％ミルク－ＴＢＳＴ（トリス緩衝生理食塩水及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングし、指示された一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＥＣＬ ＨＲＰ結合二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とＲＴで１時間インキュベートした。ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロット試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を膜に添加し、フィルムを現像した。
【0131】
免疫染色
細胞を４％ＰＦＡにより室温で５分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋３０％ウマ血清で１５分間透過処理し、ＰＢＳ中３０％ウマ血清で室温で３０分間ブロッキングした。細胞を洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３０％ウマ血清に希釈した指示される一次抗体（１：１００）で４℃で一晩染色した。次いで、細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体（１：２００）及び４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核染色、１：１００００）ＰＢＳ中３０％ウマ血清と室温で１時間インキュベートした。細胞の光学フィールドを、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ ２００Ｍ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）倒立蛍光顕微鏡で画像化した。
細胞を４％ＰＦＡにより室温で５分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００＋３０％ウマ血清で１５分間透過処理し、ＰＢＳ中３０％ウマ血清で室温で３０分間ブロッキングした。細胞を洗浄し、次いで、ＰＢＳ中３０％ウマ血清に希釈した指示される一次抗体（１：１００）で４℃で一晩染色した。次いで、細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体（１：２００）及び４’６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核染色、１：１００００）ＰＢＳ中３０％ウマ血清と室温で１時間インキュベートした。細胞の光学フィールドを、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ ２００Ｍ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）倒立蛍光顕微鏡で画像化した。
【0132】
免疫組織化学
組織材料を、標準的な組織学の慣例に従って調製した、すなわち、緩衝ホルマリン（ｐＨ７．０）に固定し、パラフィンブロックに包埋した。免疫組織化学（ＩＨＣ）を３μｍに切断した切片に実施した。抗原回復のために、組織切片を、電子レンジ中、クエン酸緩衝液（Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓ２０３１、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）で２回、それぞれ７分間処理した。ＩＨＣをＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ４８０（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、米国）を使用して行い、シグナルを、色素原としてジアミノベンジジンを用いて、製造元のプロトコル（ＤＰＶＢ＋１１０ＨＲＰ；Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｗｅｌｌ、ＭＡ、米国）に従って、ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ポリマーキットを適用して検出した。ＮＯＣＩＶＡ特異的抗体（２つ別個、ウサギポリクローナル、Ｂｉｏｇｅｎｅｓ）を１：２０００の希釈で適用した。
組織材料を、標準的な組織学の慣例に従って調製した、すなわち、緩衝ホルマリン（ｐＨ７．０）に固定し、パラフィンブロックに包埋した。免疫組織化学（ＩＨＣ）を３μｍに切断した切片に実施した。抗原回復のために、組織切片を、電子レンジ中、クエン酸緩衝液（Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｓ２０３１、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）で２回、それぞれ７分間処理した。ＩＨＣをＬａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ４８０（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、米国）を使用して行い、シグナルを、色素原としてジアミノベンジジンを用いて、製造元のプロトコル（ＤＰＶＢ＋１１０ＨＲＰ；Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｏｒｗｅｌｌ、ＭＡ、米国）に従って、ＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎ＋ポリマーキットを適用して検出した。ＮＯＣＩＶＡ特異的抗体（２つ別個、ウサギポリクローナル、Ｂｉｏｇｅｎｅｓ）を１：２０００の希釈で適用した。
【0133】
統計解析
統計解析及び比較を、ＪＭＰ Ｐｒｏ １２プログラムを使用して実施した。連続変数を記述統計（中央値、四分位範囲及び範囲）によって要約し、頻度及び百分率をカテゴリーデータについて計算した。連続変数の場合、独立した試料間の比較にはマン・ホイットニーのＵ検定を使用し、対応のあるデータにはウィルコクソンの順位和検定を使用した。全生存期間関数をカプラン・マイヤー推定法によって推定し、群間の比較にはログ・ランク検定を使用した。多変量解析を実施して、遺伝子発現レベル（中央値より下又は上）と応答（ＯＳについて死亡ｖｓ生存、再燃について再燃ｖｓ非再燃）の関係を調べた。全ての試験を、５％有意水準で両側とした。
統計解析及び比較を、ＪＭＰ Ｐｒｏ １２プログラムを使用して実施した。連続変数を記述統計（中央値、四分位範囲及び範囲）によって要約し、頻度及び百分率をカテゴリーデータについて計算した。連続変数の場合、独立した試料間の比較にはマン・ホイットニーのＵ検定を使用し、対応のあるデータにはウィルコクソンの順位和検定を使用した。全生存期間関数をカプラン・マイヤー推定法によって推定し、群間の比較にはログ・ランク検定を使用した。多変量解析を実施して、遺伝子発現レベル（中央値より下又は上）と応答（ＯＳについて死亡ｖｓ生存、再燃について再燃ｖｓ非再燃）の関係を調べた。全ての試験を、５％有意水準で両側とした。
【0134】
新規なＣＩＰ２ＡスプライシングバリアントＮＯＣＩＶＡの特定
ＣＩＰ２Ａの潜在的なｍＲＮＡバリアントを特定するために、ｃＤＮＡ末端ＰＣＲアッセイ（３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ）の迅速な増幅を、ヒト細胞株ｍＲＮＡ試料に使用した。結果として、ＲＴ－ＰＣＲ及び配列決定によりさらに検証した３つのＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡバリアントを特定した（図１Ａ）。１つのバリアント形態はＣＩＰ２Ａエクソン１～１９のみを含み、もう１つのバリアント形態はエクソン１～２１を含んでいたが、３’ＵＴＲを欠いていた。ＮＯＣＩＶＡと命名される新たなｍＲＮＡ配列が特定され、これはエクソン１３と１４との間のイントロンの一部にＣ末端融合したＣＩＰ２Ａのエクソン１～１３を含んでいた。図１Ｄは、選択的スプライシングによるＫＩＡＡ１５２４遺伝子からのＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ形成を示している。ＫＩＡＡ１５２４遺伝子エクソン１３とエクソン１４（図１Ｄ中下線）の間のイントロン領域（図１Ｄ中太字）は、スプライシング機構によって代替エクソンとみなされ、エクソン１３の端に付着している。プレｍＲＮＡを処理してｍＲＮＡを成熟させた後、ポリ（Ａ）テールをＮＯＣＩＶＡ転写産物の３’末端に付着させる。よって、ＮＯＣＩＶＡ転写産物は、ユニークで、以前は未知の配列を形成した（図１Ａ及び図１Ｂ）。興味深いことに、ＮＯＣＩＶＡ特異的イントロン配列はコーディングフレーム内にあり、ＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ配列が先行し、１３アミノ酸に対応する４０ヌクレオチドの後に、古典的終止コドンＴＡＡが続く（図１Ｂ）。ＮＯＣＩＶＡの潜在的３´ＵＴＲは、およそ３５０ヌクレオチド、引き続いてＡＡＴＡＡＡ配列、及び古典的ポリＡ配列からなる。したがって、ＮＯＣＩＶＡ遺伝子産物は、Ｃ末端に１３個の新たなアミノ酸（ＮＮＫＮＴＱＥＡＦＱＶＴＳ）を有する切断型ＣＩＰ２Ａをコードする（図１Ｂ）。重要なことに、この１３ａａペプチド配列は、Ｂｌａｓｔ相同性検索に基づくヒトプロテオームの既知のタンパク質配列と一致しない（表１）。ＮＯＣＩＶＡ発現についての検証ＰＣＲを、ＮＯＣＩＶＡのユニークなＣ末端部分をコードするｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用して、複数の細胞株で行った（図１Ｃ）。その後、ゲルからの正しいサイズのバンドを配列決定して、ＰＣＲ産物がＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ産物を表すことを確認した。
ＣＩＰ２Ａの潜在的なｍＲＮＡバリアントを特定するために、ｃＤＮＡ末端ＰＣＲアッセイ（３’ＲＡＣＥ及び５’ＲＡＣＥ）の迅速な増幅を、ヒト細胞株ｍＲＮＡ試料に使用した。結果として、ＲＴ－ＰＣＲ及び配列決定によりさらに検証した３つのＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡバリアントを特定した（図１Ａ）。１つのバリアント形態はＣＩＰ２Ａエクソン１～１９のみを含み、もう１つのバリアント形態はエクソン１～２１を含んでいたが、３’ＵＴＲを欠いていた。ＮＯＣＩＶＡと命名される新たなｍＲＮＡ配列が特定され、これはエクソン１３と１４との間のイントロンの一部にＣ末端融合したＣＩＰ２Ａのエクソン１～１３を含んでいた。図１Ｄは、選択的スプライシングによるＫＩＡＡ１５２４遺伝子からのＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ形成を示している。ＫＩＡＡ１５２４遺伝子エクソン１３とエクソン１４（図１Ｄ中下線）の間のイントロン領域（図１Ｄ中太字）は、スプライシング機構によって代替エクソンとみなされ、エクソン１３の端に付着している。プレｍＲＮＡを処理してｍＲＮＡを成熟させた後、ポリ（Ａ）テールをＮＯＣＩＶＡ転写産物の３’末端に付着させる。よって、ＮＯＣＩＶＡ転写産物は、ユニークで、以前は未知の配列を形成した（図１Ａ及び図１Ｂ）。興味深いことに、ＮＯＣＩＶＡ特異的イントロン配列はコーディングフレーム内にあり、ＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡ配列が先行し、１３アミノ酸に対応する４０ヌクレオチドの後に、古典的終止コドンＴＡＡが続く（図１Ｂ）。ＮＯＣＩＶＡの潜在的３´ＵＴＲは、およそ３５０ヌクレオチド、引き続いてＡＡＴＡＡＡ配列、及び古典的ポリＡ配列からなる。したがって、ＮＯＣＩＶＡ遺伝子産物は、Ｃ末端に１３個の新たなアミノ酸（ＮＮＫＮＴＱＥＡＦＱＶＴＳ）を有する切断型ＣＩＰ２Ａをコードする（図１Ｂ）。重要なことに、この１３ａａペプチド配列は、Ｂｌａｓｔ相同性検索に基づくヒトプロテオームの既知のタンパク質配列と一致しない（表１）。ＮＯＣＩＶＡ発現についての検証ＰＣＲを、ＮＯＣＩＶＡのユニークなＣ末端部分をコードするｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用して、複数の細胞株で行った（図１Ｃ）。その後、ゲルからの正しいサイズのバンドを配列決定して、ＰＣＲ産物がＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ産物を表すことを確認した。
【表1】
【0135】
がん細胞におけるＮＯＣＩＶＡ発現
正常組織及びがん性組織におけるＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡバリアントの発現を試験するために、正常細胞及びがん性細胞のパネルで２つのＮＯＣＩＶＡ特異的プライマー－プローブセット（表２のプライマーとプローブのペア１６及び１７）を使用してｑＰＣＲを行った。患者由来のケラチノサイト（Ｋｅｒ）試料を、正常組織のモデルとして使用し、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞試料を、がん性組織のモデルとして使用した。以前に、ＣＩＰ２ＡがＨＮＳＣＣ試料で有意に過剰発現されることが示されており、その高発現はヒトＨＮＳＣＣの患者の予後不良と相関している（Ｖｅｎｔｅｌａら、２０１５）。興味深いことに、ＮＯＣＩＶＡ発現も、Ｋｅｒと比較してＳＣＣ試料における有意に上昇した発現を示した（図２Ａ）。
正常組織及びがん性組織におけるＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡバリアントの発現を試験するために、正常細胞及びがん性細胞のパネルで２つのＮＯＣＩＶＡ特異的プライマー－プローブセット（表２のプライマーとプローブのペア１６及び１７）を使用してｑＰＣＲを行った。患者由来のケラチノサイト（Ｋｅｒ）試料を、正常組織のモデルとして使用し、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣ）細胞試料を、がん性組織のモデルとして使用した。以前に、ＣＩＰ２ＡがＨＮＳＣＣ試料で有意に過剰発現されることが示されており、その高発現はヒトＨＮＳＣＣの患者の予後不良と相関している（Ｖｅｎｔｅｌａら、２０１５）。興味深いことに、ＮＯＣＩＶＡ発現も、Ｋｅｒと比較してＳＣＣ試料における有意に上昇した発現を示した（図２Ａ）。
【0136】
次に、正常なヒト組織ｃＤＮＡのパネルでＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡの発現を評価した（Ｈｕｍａｎ ＭＴＣパネルＩ＆ＩＩ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３６７４２＆６３６７４３）。特に、ＣＩＰ２Ａｅ１３、ＣＩＰ２Ａｅ２０及びＮＯＣＩＶＡ ＰＣＲプライマーを、発現レベルの潜在的な差が技術的なＰＣＲアッセイ関連の理由による可能性を排除して、同様の増幅効率をもたらすよう最適化した。公開された証拠と一致して（Ｖｅｎｔｅｌａら、２０１２）、ＣＩＰ２Ａは、精巣を除く正常なヒト組織のほとんどで低レベルで発現されていた（図２Ｂ）。興味深いことに、ＣＩＰ２Ａを特異的に増幅するがＮＯＣＩＶＡを増幅しないＣＩＰ２Ａエクソン１３プライマー（ＣＩＰ２Ａｅ１３）は、ＣＩＰ２Ａエクソン２０プライマー（ＣＩＰ２Ａｅ２０）よりも著しく高い発現レベルを示した。ＣＩＰ２Ａと比較して、ＮＯＣＩＶＡは正常なヒト組織全体で非常に低レベルの発現を示した（図２Ｂ）。
【0137】
ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡは全てのヒト正常組織で非常に低レベルで発現されたが、ＮＯＣＩＶＡ発現とＣＩＰ２Ａ ｅ１３発現の相関により、ＮＯＣＩＶＡ発現がＣＩＰ２Ａに対して比較的豊富な組織の分析が容易になった。分析した組織のうち、白血球が最高のＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比を示した（図２Ｃ）。したがって、正常組織とがん性組織との間で既に観察された差（図２Ａ）が他のがん型に関連するかどうかを調べるために、次に、リンパ系がんである急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に焦点を当てた。特に、固形ヒトがんＵＴ－７（ＨＮＳＣＣ）、ＭＣＦ－７（乳がん）及びＨｅＬａ（子宮頸がん）を表すがん細胞株と比較して、多くのＡＭＬ細胞株だけでなく、ＣＭＬ細胞株もＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡの明らかに高い発現を示した（図２Ｄ）。さらに興味深いことに、ＵＴ－７よりも高いレベルでＮＯＣＩＶＡを発現したＡＭＬ及びＣＭＬ細胞株はまた、ＣＩＰ２Ａｅ２０よりも比較的高いＮＯＣＩＶＡの発現を示した（図２Ｄ）。実際、ＣＩＰ２Ａｅ２０よりも高いＮＯＣＩＶＡの発現は、ＵＴ－７細胞でもある程度観察された。これらの結果は、ＡＭＬ及びＣＭＬを含むリンパ系がんが、ＮＯＣＩＶＡの発現が増加し、臨床的に関連し得るがん型からなることを明らかにしている。したがって、発がん性形質転換時に、完全長ＣＩＰ２Ａと比較してＮＯＣＩＶＡコード代替転写産物の発現を増加させるスプライシングスイッチがあると仮定する。ＡＭＬにおけるＮＯＣＩＶＡの過剰発現を検証するために、ＡＭＬ診断患者の骨髄試料の小コホートを分析し、それらのＮＯＣＩＶＡレベルをケラチノサイト又はＨＮＳＣＣ細胞の平均発現と比較した。特に、ＡＭＬ患者試料の６／８が、ＨＮＳＣＣ細胞から見られる平均レベルよりも明らかに高いＮＯＣＩＶＡの発現を示した（図２Ｅ）。
【0138】
ヒトリンパ系診断試料におけるＮＯＣＩＶＡ過剰発現
ＡＭＬ患者試料におけるＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡの状態をさらに検証するために、診断ＡＭＬ患者の骨髄試料のより大きな試料パネルでｑＰＣＲを使用した。試料パネルは、２０００年１月～２０１０年７月の間に収集し、１８～６５歳の、トゥルク大学中央病院（ＴＹＫＳ）で初発ＡＭＬ又は二次性ＡＭＬと診断された合計９３人の患者からなる。ここで説明する試料収集と発現プロファイリングの両方について、有効な倫理的許可が得られた。各試料の発現正規化のためのハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ及びｂ－アクチンを使用した。ＡＭＬにおける過剰発現の程度を推定するために、ＡＭＬ試料におけるＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａ ｅ２０の両方の発現を、市販の正常な骨髄（ＢＭ）対照試料（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるこれらの遺伝子のレベルに正規化した。ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡに加えて、既知のＡＭＬマーカーであるＷＴ１とＥＶＩ１の発現、及び以前にＡＭＬに関連付けられた他のＰＰ２Ａ阻害剤タンパク質、ＳＥＴについて試料を分析した（Ｃｉｃｃｏｎｅら、２０１５）。ほぼ全ての患者が正常な骨髄試料と比較して低レベルのＣＩＰ２Ａｅ１３又はＣＩＰ２Ａｅ２０を発現したが、ＡＭＬ試料の合計７８％がＮＯＣＩＶＡの過剰発現を示した（図３Ａ及び図３Ｂ）。正常な骨髄試料の２倍を超えるＮＯＣＩＶＡ過剰発現を示す患者の割合は６８％であった。ＷＴ１、ＥＶＩ１及びＳＥＴは、公開された文献に一致する発現パターンを示した。
ＡＭＬ患者試料におけるＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａ ｍＲＮＡの状態をさらに検証するために、診断ＡＭＬ患者の骨髄試料のより大きな試料パネルでｑＰＣＲを使用した。試料パネルは、２０００年１月～２０１０年７月の間に収集し、１８～６５歳の、トゥルク大学中央病院（ＴＹＫＳ）で初発ＡＭＬ又は二次性ＡＭＬと診断された合計９３人の患者からなる。ここで説明する試料収集と発現プロファイリングの両方について、有効な倫理的許可が得られた。各試料の発現正規化のためのハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ及びｂ－アクチンを使用した。ＡＭＬにおける過剰発現の程度を推定するために、ＡＭＬ試料におけるＮＯＣＩＶＡとＣＩＰ２Ａ ｅ２０の両方の発現を、市販の正常な骨髄（ＢＭ）対照試料（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）におけるこれらの遺伝子のレベルに正規化した。ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡに加えて、既知のＡＭＬマーカーであるＷＴ１とＥＶＩ１の発現、及び以前にＡＭＬに関連付けられた他のＰＰ２Ａ阻害剤タンパク質、ＳＥＴについて試料を分析した（Ｃｉｃｃｏｎｅら、２０１５）。ほぼ全ての患者が正常な骨髄試料と比較して低レベルのＣＩＰ２Ａｅ１３又はＣＩＰ２Ａｅ２０を発現したが、ＡＭＬ試料の合計７８％がＮＯＣＩＶＡの過剰発現を示した（図３Ａ及び図３Ｂ）。正常な骨髄試料の２倍を超えるＮＯＣＩＶＡ過剰発現を示す患者の割合は６８％であった。ＷＴ１、ＥＶＩ１及びＳＥＴは、公開された文献に一致する発現パターンを示した。
【0139】
ヒトＡＭＬ診断試料におけるＮＯＣＩＶＡ発現の臨床的関連性
上記で分析した９３人の患者のうち、８０人の患者の臨床フォローアップ情報が利用可能であった。その遺伝的プロファイルに基づく臨床的に使用されるリスク群へのこれらの患者の分布を図４Ａに提示する。全生存期間（ＯＳ）についての多変量解析では、診断年齢、及び中程度（リスク群２）リスク群と有害（リスク群３）リスク群の両方が、短い患者の生存期間と有意に相関していた（図４Ｂ）。次に、ＮＯＣＩＶＡ、ＣＩＰ２Ａｅ１３、ＣＩＰ２Ａｅ２０、ＷＴ１、ＥＶＩ１又はＳＥＴの発現がリスク群と関連するかどうかを評価した。全てのリスク群間の差と比較した場合、唯一の統計学的に有意な関連性がＥＶ１発現で見られた（図４Ｃ）。これらのデータは、ＮＯＣＩＶＡ発現が現在使用されているＡＭＬリスク群分類と独立していることを示している。重要なことに、高いＮＯＣＩＶＡ発現は、多変量解析の短いＯＳと有意に相関し、ハザード比がＥＶＩ１の発現よりも高かった（１．５１１対１．２６５）（図４Ｄ）。代わりに、非常に興味深いことに、低いＣＩＰ２Ａｅ１３発現は、ハザード比０．１７３でより良好な患者の生存期間の境界の有意な予測因子であった（図４Ｄ）。ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ発現レベルを中央値と比較して高と低の２つの群に分けて使用した患者の全生存期間のカプラン・マイヤー分析では、ＮＯＣＩＶＡの高発現患者も有意に短い生存期間を示した（図４Ｅ、ｐ＝０．０２２）。最後に、高いＮＯＣＩＶＡは短いＯＳと関連しているが、低いＣＩＰ２Ａｅ１３はむしろ良好なＯＳと関連しているように見えるため、高いＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比が短いＡＭＬ患者のＯＳを予測する新規な診断マーカーとして機能することができるかどうかを試験した。図４Ｆに示されるように、これはＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比が多変量解析で短いＯＳと統計学的に非常に有意な関連を示した場合に当てはまる。
上記で分析した９３人の患者のうち、８０人の患者の臨床フォローアップ情報が利用可能であった。その遺伝的プロファイルに基づく臨床的に使用されるリスク群へのこれらの患者の分布を図４Ａに提示する。全生存期間（ＯＳ）についての多変量解析では、診断年齢、及び中程度（リスク群２）リスク群と有害（リスク群３）リスク群の両方が、短い患者の生存期間と有意に相関していた（図４Ｂ）。次に、ＮＯＣＩＶＡ、ＣＩＰ２Ａｅ１３、ＣＩＰ２Ａｅ２０、ＷＴ１、ＥＶＩ１又はＳＥＴの発現がリスク群と関連するかどうかを評価した。全てのリスク群間の差と比較した場合、唯一の統計学的に有意な関連性がＥＶ１発現で見られた（図４Ｃ）。これらのデータは、ＮＯＣＩＶＡ発現が現在使用されているＡＭＬリスク群分類と独立していることを示している。重要なことに、高いＮＯＣＩＶＡ発現は、多変量解析の短いＯＳと有意に相関し、ハザード比がＥＶＩ１の発現よりも高かった（１．５１１対１．２６５）（図４Ｄ）。代わりに、非常に興味深いことに、低いＣＩＰ２Ａｅ１３発現は、ハザード比０．１７３でより良好な患者の生存期間の境界の有意な予測因子であった（図４Ｄ）。ＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡ発現レベルを中央値と比較して高と低の２つの群に分けて使用した患者の全生存期間のカプラン・マイヤー分析では、ＮＯＣＩＶＡの高発現患者も有意に短い生存期間を示した（図４Ｅ、ｐ＝０．０２２）。最後に、高いＮＯＣＩＶＡは短いＯＳと関連しているが、低いＣＩＰ２Ａｅ１３はむしろ良好なＯＳと関連しているように見えるため、高いＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比が短いＡＭＬ患者のＯＳを予測する新規な診断マーカーとして機能することができるかどうかを試験した。図４Ｆに示されるように、これはＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１３比が多変量解析で短いＯＳと統計学的に非常に有意な関連を示した場合に当てはまる。
【0140】
Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ、ＩＤＴ ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ Ｔｏｏｌ及びＲｏｃｈｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒを使用して、図６に例示される一般的なラインに従って、ＮＯＣＩＶＡ特異的ｃＤＮＡの増幅及び検出のためのプライマーとプローブ配列の様々なセットを設計した。設計はＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓの提案を利用して手動で行った、又は使用したオリゴヌクレオチド設計プログラムによって推奨された。融解温度を、アッセイの設計中にプログラムによって計算した。アッセイを、主にｑＰＣＲ設定で使用されるように設計したが、伝統的なＰＣＲのための追加のアッセイもＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓで設計した。プライマーを、典型的には７０～１５０ｂｐの産物を増幅するように設計した。典型的には、プライマー長を１８～２３ｂｐ、プライマーＴｍを５８～６２℃、プライマーＧＣ％を３０～８０、プライマー対の最大Ｔｍ差を３℃に設定した。典型的には、プローブ長を１８～２７ｂｐ、オリゴＴｍを６０～６８℃、オリゴＧＣ％を２０～８０に設定した。マイナーグルーブバインディング（ＭＧＢ）又はロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを設計する場合、化学修飾がプローブＴｍを６８～７０℃近くに上昇させるように、プローブのＴｍを６０℃に近いと計算した。ＭＧＢアッセイ設計はＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓを使用して手動で行い、ＬＮＡアッセイ設計はＲｏｃｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｒｅによって自動的に行った。Ｒｏｃｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｒｅは、設計にＲｏｃｈｅのユニバーサルプローブライブラリーを使用する。各アッセイ設計の配列、融解温度及びプローブ化学の詳細を表２に示す。
【表2】
【0141】
ＣＩＰ２Ａエクソン１６アッセイの開発及びＮＯＣＩＶＡ／ＣＩＰ２Ａｅ１６比に基づく既存の結果の再評価
ＣＩＰ２Ａを、エクソン１６（ＣＩＰ２Ａｅ１６）の存在に基づいてＮＯＣＩＶＡと識別することができる。この目的のために、以下に記載されるアッセイを開発する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＩＰ２Ａエクソン１６、Ｈｓ００４０５４１３＿ｍ１用のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイはすでに存在しており、これも同じ試料材料で試験する。あるいは又はさらに、ＣＩＰ２Ａを、上記の例に記載されるように、ＣＩＰ２Ａｅ１３又はＣＩＰ２Ａｅ２０に基づいてＮＯＣＩＶＡと識別することができる。
ＣＩＰ２Ａを、エクソン１６（ＣＩＰ２Ａｅ１６）の存在に基づいてＮＯＣＩＶＡと識別することができる。この目的のために、以下に記載されるアッセイを開発する。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＩＰ２Ａエクソン１６、Ｈｓ００４０５４１３＿ｍ１用のＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイはすでに存在しており、これも同じ試料材料で試験する。あるいは又はさらに、ＣＩＰ２Ａを、上記の例に記載されるように、ＣＩＰ２Ａｅ１３又はＣＩＰ２Ａｅ２０に基づいてＮＯＣＩＶＡと識別することができる。
【0142】
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って合成する。ＣＩＰ２Ａ ｅ１６の発現の定量化を、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施する。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ及びβアクチンを内部対照として使用する。ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキットを、ｑＰＣＲ反応に使用し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムをプレート分析に使用する。ＰＣＲ反応サイクル：１：９５℃ １０分、２：９５℃ １５秒、３：６０℃ １分；ステップ２～３を４５回繰り返す。相対遺伝子発現データの分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌｏｕｄソフトウェアによる２－ΔΔＣＴ法を使用して実施する。遺伝子を、その発現値が、正常なＢＭ対照試料の分析によって定義される（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｔｏｔａｌ ｒｎａ）各遺伝子について確立されたカットオフ値（平均＋３ ｓ．ｄ．）よりも高い又は低い場合、脱制御されているとみなす。
【0143】
慢性骨髄性白血病細胞及び他の血液悪性腫瘍におけるＮＯＣＩＶＡ Ｔａｑｍａｎ
Ｒｏｃｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｒｅで設計されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用して、他の血液悪性腫瘍及び確立された細胞株（慢性骨髄性白血病を含む）におけるＮＯＣＩＶＡ遺伝子発現の発現の定量化を実施する。融解曲線及び増幅効率分析によってアッセイを検証する。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してモノクローナル細胞抽出物から全ＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って合成する。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ及びβアクチンを内部対照として使用する。ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキットを、ｑＰＣＲ反応に使用し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムをプレート分析に使用する。ＰＣＲ反応サイクル：１：９５℃ １０分、２：９５℃ １５秒、３：６０℃ １分；ステップ２～３を４５回繰り返す。相対遺伝子発現データの分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌｏｕｄソフトウェアによる２－ΔΔＣＴ法を使用して実施する。遺伝子を、その発現値が、正常なＢＭ対照試料の分析によって定義される（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｔｏｔａｌ ｒｎａ）各遺伝子について確立されたカットオフ値（平均＋３ ｓ．ｄ．）よりも高い又は低い場合、脱制御されているとみなす。
Ｒｏｃｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｒｅで設計されたＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用して、他の血液悪性腫瘍及び確立された細胞株（慢性骨髄性白血病を含む）におけるＮＯＣＩＶＡ遺伝子発現の発現の定量化を実施する。融解曲線及び増幅効率分析によってアッセイを検証する。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してモノクローナル細胞抽出物から全ＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造元の指示に従って合成する。グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ及びβアクチンを内部対照として使用する。ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲキットを、ｑＰＣＲ反応に使用し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステムをプレート分析に使用する。ＰＣＲ反応サイクル：１：９５℃ １０分、２：９５℃ １５秒、３：６０℃ １分；ステップ２～３を４５回繰り返す。相対遺伝子発現データの分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌｏｕｄソフトウェアによる２－ΔΔＣＴ法を使用して実施する。遺伝子を、その発現値が、正常なＢＭ対照試料の分析によって定義される（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ｔｏｔａｌ ｒｎａ）各遺伝子について確立されたカットオフ値（平均＋３ ｓ．ｄ．）よりも高い又は低い場合、脱制御されているとみなす。
【0144】
固形がんのＮＯＣＩＶＡを検出するためのインサイチュー技術
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＣＤ）及びＶｉｅｗＲＮＡ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション技術を、種々のホルマリン固定固形がん細胞株及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料（少なくとも乳房、前立腺、ＨＮＳＣＣ）で、製造元の指示に従って、ＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａ検出について試験する。ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ検出用の同様の試料の以前のｑＰＣＲ分析に基づいて、陰性及び陽性の生物学的対照を選択する。製造元の指示に従って、技術的対照を実験設定に含める。ＡＣＤ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに、ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡインサイチュー検出用の新規なプローブ設計について連絡をする。ＡＣＤ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎが、ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ検出用のインサイチューハイブリダイゼーションプローブを設計及び製造する。受け取った読出しの分析を、製造元の指示に従って調べる。
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＡＣＤ）及びＶｉｅｗＲＮＡ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション技術を、種々のホルマリン固定固形がん細胞株及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料（少なくとも乳房、前立腺、ＨＮＳＣＣ）で、製造元の指示に従って、ＮＯＣＩＶＡ及びＣＩＰ２Ａ検出について試験する。ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ検出用の同様の試料の以前のｑＰＣＲ分析に基づいて、陰性及び陽性の生物学的対照を選択する。製造元の指示に従って、技術的対照を実験設定に含める。ＡＣＤ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに、ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ ｍＲＮＡインサイチュー検出用の新規なプローブ設計について連絡をする。ＡＣＤ及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎが、ＣＩＰ２Ａ及びＮＯＣＩＶＡ検出用のインサイチューハイブリダイゼーションプローブを設計及び製造する。受け取った読出しの分析を、製造元の指示に従って調べる。
【0145】
ＮＯＣＩＶＡ特異的抗体の作製
ＢｉｏＧｅｎｅｓ ＧｍｂＨによるＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドＮＮＫＮＴＱＥＡＦＱＶＴＳ（配列番号３）に対してウサギを免疫化することにより、２つのＮＯＣＩＶＡ特異的抗体を作製した。ペプチド合成（純度少なくとも８０％、ＨＰＬＣ及びＭＳによる品質管理）の際に、担体タンパク質との指向されたコンジュゲーションのために、追加のＮ末端システインをＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドに付加した。
ＢｉｏＧｅｎｅｓ ＧｍｂＨによるＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドＮＮＫＮＴＱＥＡＦＱＶＴＳ（配列番号３）に対してウサギを免疫化することにより、２つのＮＯＣＩＶＡ特異的抗体を作製した。ペプチド合成（純度少なくとも８０％、ＨＰＬＣ及びＭＳによる品質管理）の際に、担体タンパク質との指向されたコンジュゲーションのために、追加のＮ末端システインをＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドに付加した。
【0146】
単一特異性ＩｇＧ抗体を、アフィニティーマトリックスとしてＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）を用いたＮＯＣＩＶＡペプチド（配列番号３）抗原カラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって、免疫後血清から精製した。
【0147】
アフィニティー精製した抗体の特異性を、細菌で発現された組換えタンパク質（図５）、ならびに細胞内で過剰発現されたＧＦＰ－ＮＯＣＩＶＡ融合タンパク質で試験した。同様に配列番号３で構成されるブロッキングペプチドを対照として使用した。両抗体は、細菌によって産生された組換え精製ＧＳＴ－ＮＯＣＩＶＡ（図５）とＨｅｌａ細胞で過剰発現されたＧＦＰ－ＮＯＣＩＶＡの両方を検出した（データは示さず）。重要なことに、ＮＯＣＩＶＡ抗体は特異的であり、組換えＣＩＰ２Ａフラグメントのいずれも認識しなかった（図５）。
【0148】
固形ヒトがん組織試料における診断免疫組織化学のためのＮＯＣＩＶＡ特異的抗体の使用
診断用免疫組織化学（ＩＨＣ）について上記のように作製されたＮＯＣＩＶＡ特異的抗体の適用性を試験及び最適化した。信頼できる検出結果のために、適切なＩＨＣ方法を選択することが重要である。頭頸部扁平上皮がん及び乳がん組織からのパラフィン包埋試料からなる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドに対して作製された抗体で染色した。
診断用免疫組織化学（ＩＨＣ）について上記のように作製されたＮＯＣＩＶＡ特異的抗体の適用性を試験及び最適化した。信頼できる検出結果のために、適切なＩＨＣ方法を選択することが重要である。頭頸部扁平上皮がん及び乳がん組織からのパラフィン包埋試料からなる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を、ＮＯＣＩＶＡ特異的ペプチドに対して作製された抗体で染色した。
【0149】
標識ストレプトアビジンビオチン（ＬＳＡＢ）技術は、いくつかの抗原発現に対する感受性を有さず、その代わりにポリマーシステム又はチラミン増幅の使用が必要となり得る。ｐＨ６とｐＨ９の熱誘導エピトープ回復（ｈｅａｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（ＨＩＥＲ）緩衝液を２つの希釈／濃度での抗体のインキュベーションと合わせて比較すると、どの組み合わせがさらに検討に値するかが最初に示される。試験する他のバリエーションには、ＨＩＥＲの温度と時間、抗体の希釈／濃度の範囲、及び一次抗体インキュベーションが含まれる。研究活動領域と臨床活動領域の両方の組織コレクションの大部分が中性緩衝ホルムアルデヒドを利用しているので、代替固定液を調査することができるが、適用できるのは少数の試料群のみである。また、技術のバリエーションに体系的にアプローチし、検証全体で同じ試薬バッチを使用し、標準化されたレポートテンプレートを使用して染色結果を記録するように注意が払わされる。
【0150】
診断用ＩＨＣ使用のための新たな抗体の検証及び最適化に日常的に使用されるアプローチに加えて、ＮＯＣＩＶＡ枯渇細胞を、発明者らの実験室で最近開発された細胞溶解物マイクロアレイ（ＣＭＡ）形式の特異性対照として使用する。ＮＯＣＩＶＡ枯渇細胞は、この設定で陰性生物学的対照として役立つ。陽性対照は、ＮＯＣＩＶＡ検出用の同様の組織試料の事前のウエスタンブロット分析に基づいて選択する。研究目的のために、ＮＯＣＩＶＡ特異的抗体も試験し、その性能を種々の組織及び細胞溶解物試料（乳房、前立腺及びＨＮＳＣＣ試料を含む）で検証して、ＮＯＣＩＶＡがバイオマーカーとして機能する全ての使用適応症（がん型）を評価する。
【0151】
血液がんと固形がんの両方での診断用ＦＡＣＳ分析のためのＮＯＣＩＶＡ特異的抗体の使用
上記のように作製されたＮＯＣＩＶＡ特異的抗体を、診断用蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に使用するために検証及び最適化する。この目的のために、診断時に新たに収集した末梢血及び骨髄試料中のＮＯＣＩＶＡを測定するプロトコルを開発して予測値を調査する。試料調製を、ＦＡＣＳ分析用の血液患者試料を取り扱うためのＴＹＫＳｌａｂのプロトコルに従って行う。血液試料の典型的なＦＡＣＳプロトコルでは、細胞を５００μｌの２％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、３７℃で１０分間固定し、氷上で１分間冷却する。遠心分離（７７０ｇ、３分）によって細胞を回収し、５００μｌの９０％メタノールを添加した後、試料を短時間ボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し（リン酸緩衝生理食塩水及び０．５％ウシ血清アルブミンを含有する１ｍｌのインキュベーション緩衝液で完全に）、回収し、２５μｌのインキュベーション緩衝液に再懸濁する。この後、試料を室温で１０分間インキュベートする。抗体を最終濃度３０μｇ／ｍｌになるように添加し、ボルテックスし、室温で４０分間インキュベートする。試料を２回洗浄し、フルオレセイン標識した二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１０μｇ／ｍｌ）に再懸濁し、暗所中室温で３０分間インキュベートする。次いで、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ又は類似）を使用して、２回洗浄した細胞を、データ分析用のｃｅｌｌｑｕｅｓｔ ｐｒｏソフトウェア（又は類似）で分析する。試料中に存在するＮＯＣＩＶＡタンパク質のレベルを、幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）－対照試料のＭＦＩ値として決定する。ＮＯＣＩＶＡ枯渇細胞は、この設定でも陰性生物学的対照として役立つ。陽性対照は、ＮＯＣＩＶＡ検出用のＡＭＬ試料の事前のウエスタンブロット分析に基づいて選択する。研究目的で、ＮＯＣＩＶＡ特異的ＦＡＣＳも試験し、その性能を種々の固形がん細胞株及び組織試料（乳房、前立腺及びＨＮＳＣＣ試料を含む）で検証する。
上記のように作製されたＮＯＣＩＶＡ特異的抗体を、診断用蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に使用するために検証及び最適化する。この目的のために、診断時に新たに収集した末梢血及び骨髄試料中のＮＯＣＩＶＡを測定するプロトコルを開発して予測値を調査する。試料調製を、ＦＡＣＳ分析用の血液患者試料を取り扱うためのＴＹＫＳｌａｂのプロトコルに従って行う。血液試料の典型的なＦＡＣＳプロトコルでは、細胞を５００μｌの２％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、３７℃で１０分間固定し、氷上で１分間冷却する。遠心分離（７７０ｇ、３分）によって細胞を回収し、５００μｌの９０％メタノールを添加した後、試料を短時間ボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し（リン酸緩衝生理食塩水及び０．５％ウシ血清アルブミンを含有する１ｍｌのインキュベーション緩衝液で完全に）、回収し、２５μｌのインキュベーション緩衝液に再懸濁する。この後、試料を室温で１０分間インキュベートする。抗体を最終濃度３０μｇ／ｍｌになるように添加し、ボルテックスし、室温で４０分間インキュベートする。試料を２回洗浄し、フルオレセイン標識した二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（１０μｇ／ｍｌ）に再懸濁し、暗所中室温で３０分間インキュベートする。次いで、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ又は類似）を使用して、２回洗浄した細胞を、データ分析用のｃｅｌｌｑｕｅｓｔ ｐｒｏソフトウェア（又は類似）で分析する。試料中に存在するＮＯＣＩＶＡタンパク質のレベルを、幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）－対照試料のＭＦＩ値として決定する。ＮＯＣＩＶＡ枯渇細胞は、この設定でも陰性生物学的対照として役立つ。陽性対照は、ＮＯＣＩＶＡ検出用のＡＭＬ試料の事前のウエスタンブロット分析に基づいて選択する。研究目的で、ＮＯＣＩＶＡ特異的ＦＡＣＳも試験し、その性能を種々の固形がん細胞株及び組織試料（乳房、前立腺及びＨＮＳＣＣ試料を含む）で検証する。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5】
【図6】
【配列表】