ホーム > 特許ランキング > メディミューン，エルエルシー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-30
(45)【発行日】2022-10-11
(54)【発明の名称】ＢＣＭＡモノクローナル抗体薬剤コンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20221003BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20221003BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221003BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221003BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221003BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221003BHJP
A61K 31/537 20060101ALI20221003BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20221003BHJP
A61K 31/5517 20060101ALI20221003BHJP
C07K 5/062 20060101ALI20221003BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221003BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20221003BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20221003BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
C07K16/30 ZNA
C07K19/00
A61P35/00
A61K39/395 C
A61K39/395 L
A61K39/395 D
A61K39/395 T
A61K45/00
A61K31/537
A61K38/05
A61K31/5517
C07K5/062
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12P21/08
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2020505483
(86)(22)【出願日】2018-07-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-10-08
(86)【国際出願番号】 IB2018055753
(87)【国際公開番号】W WO2019025983
(87)【国際公開日】2019-02-07
【審査請求日】2021-07-15
(31)【優先権主張番号】62/539,825
(32)【優先日】2017-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/596,194
(32)【優先日】2017-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】504333972
【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】クリスタ・キニア
(72)【発明者】
【氏名】リーナ・バーキー
(72)【発明者】
【氏名】シャオドン・シャオ
(72)【発明者】
【氏名】エレイン・エム・ハート
(72)【発明者】
【氏名】デイビッド・タイス
【審査官】渡邉 潤也
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３４５７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５００２５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１３９２０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２００８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２０３０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０３１１０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１６６６２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Blood，2017年12月07日，130(Suppl 1): 3153
【文献】Blood，2016年，128(22): 1147
【文献】Mol. Cancer Ther.，2007年，6(11)，3009-3018
【文献】Blood，2016年，128(22): 1148
【文献】Blood，2017年12月07日，130(Suppl 1): 3070
【文献】MEDI2228 in subjects with relapsed/refractory multiple myeloma (MEDI2228)，Clinical Trials, Study No. NCT03489525，2018年04月05日
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞毒にコンジュゲートされたＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、前記モノクローナル抗体が、（ａ）配列番号１の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号４の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項3】
前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項4】
前記重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項5】
前記細胞毒が、抗微小管剤、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤、又はＤＮＡアルキル化剤である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項6】
前記細胞毒が、マイタンシノイド、アウリスタチン、及びチュブリシンからなる群から選択される抗微小管剤である、請求項５に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項7】
前記細胞毒が、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項５に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項8】
前記ピロロベンゾジアゼピンが、以下の式：【化1】
を有するＳＧ３２４９である、請求項７に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項10】
多発性骨髄腫を治療するための薬剤の製造における請求項９に記載の組成物の使用。
【請求項11】
（ａ）配列番号１の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号４の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項12】
前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項13】
前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１１又は請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項14】
前記重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項15】
請求項１１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項16】
Ｔ細胞活性化部分に連結された、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項17】
前記抗原結合ドメインが、前記モノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
電子的に提出された材料の参照による援用
２０１８年７月３１日に作成された「ＢＣＭＡ－１００－ＷＯ－ＰＣＴ－ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」という名称の１つの１６，４９８バイトのアスキー（テキスト）ファイルとして、本明細書と同時に提出され、明示されるコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が参照により本明細書中に援用される。
２０１８年７月３１日に作成された「ＢＣＭＡ－１００－ＷＯ－ＰＣＴ－ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」という名称の１つの１６，４９８バイトのアスキー（テキスト）ファイルとして、本明細書と同時に提出され、明示されるコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【0002】
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、クローン性形質細胞の蓄積によって特徴づけられる悪性腫瘍である（例えば、非特許文献１、及び非特許文献２を参照）。ＭＭに対する現在の治療法は、化学療法、放射線、手術、ビオホスホネート（ｂｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、及び自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を含む。これらの治療法は寛解の原因になることが多い一方で、ほぼすべての患者が、最終的には再発し、死亡する（例えば、非特許文献２、及び非特許文献３を参照）。
【0003】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞系統の細胞上に発現される腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）メンバーである（非特許文献４）。ＢＣＭＡの発現は、高分化型Ｂ細胞上に最も多い。ＢＣＭＡは、長期体液性免疫を維持するための形質細胞の生存を媒介することに関与する。ＢＣＭＡの発現は、いくつかのがん、自己免疫不全、及び感染症に関連している。数名の研究者により、ＢＣＭＡ ＲＮＡが多発性骨髄腫細胞内で広く検出されており、またＢＣＭＡタンパク質が多発性骨髄腫患者からの形質細胞の表面上で検出されている（例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；及び非特許文献８を参照）。そのようなことから、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫における有望な治療標的として検討されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｐａｌｕｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，３６４（１１）：１０４６－１０６０（２０１１）
【文献】Ｌｏｎｉａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７７（６）：１２６４－１２７７（２０１１）
【文献】Ｒａｊｋｕｍａｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ，５（８）：４７９－４９１（２０１１）
【文献】Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（７）：１１４７－１１５４（１９９４）
【文献】Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９－６９４（２００４）
【文献】Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３－５９０９（２００７）
【文献】Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５－３９５０（２００５）
【文献】Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０３（８）：３１４８－３１５７（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
多発性骨髄腫を治療するための方法において使用可能である組成物が必要とされ続けている。本発明は、かかる組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、細胞毒にコンジュゲートされたＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。モノクローナル抗体は、（ａ）配列番号１の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号４の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0007】
さらに、本開示は、前述の抗体薬剤コンジュゲートを含む組成物、及びＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞（多発性骨髄腫幹細胞を含む）を、多発性骨髄腫細胞をＡＤＣと接触させることにより殺滅する方法を提供する。
【0008】
本開示はまた、（ａ）配列番号１の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号４の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＢＣＭＡに特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、実施例１に記載のような、ｈｕＢＣＭＡ、ｃｙｎｏＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、及びＴＡＣＩを発現する接着性２９３（Ａｄ２９３）細胞に対する精製された抗体のＦＡＣＳ結合を図示する一連のグラフ（図１Ａ～１Ｃ）である。１５Ｂ２ＧＬモノクローナル抗体は、ＢＡＦＦ－Ｒ及び／又はＴＡＣＩに結合しない、試験対象で唯一のカニクイザル交差反応性抗体であった。
【図2】図２は、実施例４に記載のような、ＢＣＭＡ抗体薬剤コンジュゲートの多発性骨髄腫（ＭＭ）及び形質細胞白血病（ＰＣＬ）細胞をインビトロで殺滅する能力を図示するグラフである。図２Ａ～２Ｈは、指定のＡＤＣで処置された、特定のＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株の生存度を示す一方で、図２Ｉ及び２Ｊは、ＢＣＭＡを発現しない細胞株の生存度を示す。
【図3】図３は、抗体薬剤コンジュゲート１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９による、可溶性ＢＣＭＡの存在下での多発性骨髄腫細胞株の殺滅を、実施例４に記載のような、ヒトＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞から収集された条件培地中のＩ０９－ＳＧ３２４９ ＡＤＣと比べて（図３Ａ）、又はヒトＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞から収集された条件培地中のＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ及びＪ６Ｍ０－ＳＧ３２４９ ＡＤＣと比べて（図３Ｂ）図示するグラフを含む。
【図4】図４は、ＢＣＭＡ標的化ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９、及びＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを用いた処置に応答した、多発性骨髄腫のＨ９２９異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を未処置マウスと比べて図示するグラフである。
【図5】図５は、ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９、Ｊ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ、及びアイソタイプ対照ＩｇＧ１－ＳＧ３２４９を用いた処置に応答した、多発性骨髄腫のＪＪＮ３異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を未処置マウスと比べて図示するグラフである。
【図6】図６は、ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９、及びＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを用いた処置に応答した、形質細胞白血病のＭＭ．１Ｓ異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を未処置マウスと比べて図示するグラフである。
【図7】図７は、ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９及びＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを用いた処置に応答した、形質細胞白血病のＭＭ．１Ｒ異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を未処置マウスと比べて図示するグラフである。
【図8】図８は、ＭＭ幹細胞でのＢＣＭＡの発現を図示する一連のグラフ及びフローサイトメトリープロットを含む。ＢＣＭＡの発現が、ＭＭ形質細胞（ＣＤ１９－ＣＤ１３８＋、灰色トレース）とＭＭ幹細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ１３８－、黒色トレース）の双方で検出された。
【図9】図９は、クローン原性アッセイにおける、ＡＤＣのＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦと比べての、ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９に対する患者試料ＭＭ２６３（図９Ａ）、ＭＭ２７６（図９Ｂ）、ＭＭ２７７（図９Ｃ）、及びＭＭ２８４（図９Ｄ）からのＭＭ幹細胞の感受性を図示する一連のグラフを含む。対照は、非処置細胞及び４００ｎｇ／ｍＬの最高用量での非特異的ＩｇＧ１－ＳＧ３２４９コンジュゲートを含む。形成されたコロニーの数は、１００％に設定された、非処置培養下で形成される数に正規化された。
【図10】図１０は、実施例７に記載のような、ＢＣＭＡ抗体薬剤コンジュゲートの多発性骨髄腫（ＭＭ）及び形質細胞白血病（ＰＣＬ）細胞をインビトロで殺滅する能力を図示するグラフである。図１０Ａ～１０Ｈは、指定のＡＤＣで処置された、特定のＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株の生存度を示す一方で、図１０Ｉ及び１０Ｊは、ＢＣＭＡを発現しない細胞株の生存度を示す。
【図11】図１１は、ＢＣＭＡ標的化ＡＤＣである１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００、Ｊ６Ｍ０－ＳＧ３４００、及びアイソタイプ対照ＩｇＧ１－ＳＧ３４００を用いた処置に応答した、多発性骨髄腫のＨ９２９異種移植片マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を未処置マウスと比べて図示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示は、細胞毒にコンジュゲートされたＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。用語「抗体薬剤コンジュゲート」は、本明細書で用いられるとき、化学的リンカーを介して細胞毒（一般に高い全身毒性を有する小分子薬剤）に結合されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む化合物を指す。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、リンカーを含むように化学修飾されている小分子細胞毒を含んでもよい。次に、リンカーは、細胞毒を抗体、又はその抗原結合断片にコンジュゲートするために用いられる。細胞の表面上の標的抗原への結合時、ＡＤＣは、内部移行され、リソソームに輸送され、そこで細胞毒は、（例えば、リソソーム内で見出されるカテプシンＢによる）切断可能リンカーのタンパク質加水分解、又は切断不能リンカーを介して細胞毒に結合される場合での抗体のタンパク質分解のいずれかにより放出される。次に、細胞毒は、リソソームから外部へ、またサイトゾル又は核内部へ移動し、そこで次に、その作用機構に依存して、その標的に結合しうる。
【0011】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いられるとき、Ｂ細胞の単一クローンによって産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。それに対し、用語「ポリクローナル抗体」は、異なるＢ細胞によって産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートは、全抗体又は抗体断片を含んでもよい。全抗体は、典型的には、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピー及び軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一コピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）領域を有し、且つ各軽鎖は、１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を有する。軽及び重鎖の各ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。ＶＨ及びＶＬ領域は、同じ一般構造を有し、各領域は、配列が比較的保存された、４つのフレームワーク領域を含む。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続される。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３として公知の３つのＣＤＲは、抗原結合に関与する、抗体の「超可変領域」を形成する。
【0012】
ＡＤＣは、抗体の抗原結合断片を含んでもよい。用語「抗体断片」、「抗原結合断片」、「抗体の機能断片」及び「抗原結合部分」は、本明細書で互換可能に用いられ、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１以上の断片又は部分を指す（一般に、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３（９）：１ １２６－１１２９（２００５）を参照）。抗体断片は、例えば、１以上のＣＤＲ、可変領域（又はその部分）、定常領域（又はその部分）、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。抗体断片の例として、限定はされないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）２つのドメインの単一のポリペプチド鎖としての合成を可能にする合成リンカーによって連結されたＦｖ断片の２つのドメイン（即ちＶＬ及びＶＨ）からなる一価分子である一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３（１９８８）；及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７７８（１９９８）を参照）、並びに（ｖ）ポリペプチド鎖の二量体である二重特異性抗体であって、各ポリペプチド鎖が同じポリペプチド鎖上でＶＨとＶＬとの間の対合を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによってＶＬに接続されたＶＨを含み、それにより異なるＶＨ－ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメイン間の対合を駆動し、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子が作製される二重特異性抗体、が挙げられる。抗体断片は、当該技術分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第２００９／００９３０２４Ａｌ号明細書に、より詳細に説明されている。
【0013】
一実施形態では、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９としても公知）に特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含む。ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９２（１）：１２９－１３５（２０００）、及びＭａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２３１－２６４（２００３）を参照）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．、上記、及びＫａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０４：４３－５４（２００５）を参照）。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは、大部分が形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットにおいて発現されることが報告されている（例えば、Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，７７（１１）：３８９７－３９０４（１９９２）；Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２（７）：１１４７－１１５４（１９９４）；Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．、上記；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９（１）：９１－９７（２００４）；及びＮｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７３（２）：８０７－８１７（２００４）を参照）。ＢＣＭＡが欠損したマウスは、健常であり、正常な数のＢ細胞を有するが、長命形質細胞の生存が障害される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ，上記；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（１２）：４０６７－４０７４（２００１）；及びＳｃｈｉｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３（５５３７）：２１１１－２１１４（２００１）を参照）。数名の治験責任医師により、ＢＣＭＡ ＲＮＡが多発性骨髄腫細胞内で広く検出されており、ＢＣＭＡタンパク質が多発性骨髄腫患者からの形質細胞の表面上に検出されている（例えば、Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１０３（２）：６８９－６９４（２００４）；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７３（１９）：５９０３－５９０９（２００７）；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５（１０）：３９４５－３９５０（２００５）；及びＭｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，７０３（８）：３１４８－３１５７（２００４）を参照）。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示は、抗体薬剤コンジュゲートと独立して上記のＢＣＭＡに特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片を提供する。モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号３のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）配列番号４の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。別の実施形態では、モノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号８のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む。
【0015】
ＢＣＭＡに特異的なモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、ＢＣＭＡ又はそのエピトープへの任意の好適な結合親和性を含んでもよい。用語「親和性」は、２つの薬剤の可逆的結合における平衡定数を指し解離定数（ＫＤ）として表される。目的の抗原又はエピトープに対する抗体又はその抗原結合断片の親和性は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されうる。かかる方法として、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ，ＰｒｏｔｅＯｎ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ、例えばＯｃｔｅｔ）、動力学排除アッセイ（例えば、ＫｉｎＥｘＡ）、分離可能ビーズ（例えば磁気ビーズ）、抗原パニング、及び／又はＥＬＩＳＡが挙げられる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１を参照）。特定抗体の結合親和性が、結合親和性を分析するために用いられる方法に応じて異なることは当該技術分野で公知である。
【0016】
ＢＣＭＡの可溶性形態（ｓＢＣＭＡ）は、多発性骨髄腫患者の血清中で検出されており、３．８～１０６２ｎｇ／ｍＬの範囲の報告値を有し（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１６，Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１２）、分子の全細胞外ドメインからなる（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１５）。したがって、ｓＢＣＭＡは、抗体に基づく治療法の効果を低下させうる。ＢＣＭＡ及び組換え単量体ヒトＢＣＭＡの機能的特徴は類似している（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１５）。したがって、ＢＣＭＡ抗体薬剤コンジュゲートの有効性に対するｓＢＣＭＡの潜在的効果を緩和するため、組換え単量体ヒトＢＣＭＡに対する弱い結合及び膜結合ＢＣＭＡに対する強力な結合を有する抗体成分を選択することが望ましい。
【0017】
リガンドに対する結合剤の親和性、例えばエピトープに対する抗体の親和性は、例えば、約１ピコモル（ｐＭ）～約１マイクロモル（μＭ）（例えば、約１ピコモル（ｐＭ）～約１ナノモル（ｎＭ）、又は約１ｎＭ～約１マイクロモル（μＭ））でありうる。一実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、１００ナノモル以下（例えば、１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、若しくは約１０ｎＭ、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲）のＫＤでＢＣＭＡに結合してもよい。別の実施形態では、モノクローナル抗体は、１０ナノモル以下（例えば、約９ｎＭ、約８．５ｎＭ、約８ｎＭ、約７．５ｎＭ、約７ｎＭ、約６．５ｎＭ、約６ｎＭ、約５．５ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００１ｎＭ、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲）のＫＤでＢＣＭＡに結合してもよい。別の実施形態では、モノクローナル抗体は、２００ｐＭ以下（例えば、約１９０ｐＭ、約１７５ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１２５ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７５ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約１ｐＭ、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲）のＫＤでＢＣＭＡに結合してもよい。
【0018】
一実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるような、ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合断片の単量体ＢＣＭＡに対する親和性は、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲、例えば、約５０ｎＭ～約７０ｎＭ、約５５ｎＭ～約６５ｎＭ、若しくは約５８ｎＭ～約６２ｎＭである。
【0019】
一実施形態では、ＦＡＣＳによって測定されるような、ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合断片の膜結合ＢＣＭＡに対する親和性は、１０ナノモル以下（例えば、約９ｎＭ、約８．５ｎＭ、約８ｎＭ、約７．５ｎＭ、約７ｎＭ、約６．５ｎＭ、約６ｎＭ、約５．５ｎＭ、約５ｎＭ、約４．５ｎＭ、約４ｎＭ、約３．５ｎＭ、約３ｎＭ、約２．５ｎＭ、約２ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０２５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００１ｎＭ、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲）である。
【0020】
モノクローナル抗体の抗原結合部分又は断片は、部分がＢＣＭＡに結合する限り、任意のサイズでありうる。これに関連して、ＢＣＭＡに特異的なモノクローナル抗体（本明細書中で「抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体」とも称される）の抗原結合部分又は断片は、望ましくは約５～１８の間（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は上記値のいずれか２つによって規定される範囲）のアミノ酸を含む。
【0021】
一実施形態では、抗体薬剤コンジュゲートは、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の可変領域を含む。これに関連して、ＡＤＣは、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域、重鎖可変領域、又は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の双方を含んでもよい。好ましくは、ＡＤＣは、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。ＢＣＭＡに結合するモノクローナル抗体は、例えば国際特許出願公開の国際公開第２０１０／１０４９４９号パンフレットに開示されている。一実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣのモノクローナル抗体は、（ａ）ＳＹＳＭＮ（配列番号１）の相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、ＳＩＳＧＳＳＮＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＧＧＮＹＹＶＥＹＦＱＹ（配列番号３）のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに（ｂ）ＲＡＳＱＹＩＳＳＮＹＬＡ（配列番号４）の相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、ＧＡＳＮＲＡＴ（配列番号５）のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＱＱＹＧＳＳＰＩＴ（配列番号６）のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣのモノクローナル抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び／又は配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【0022】
用語「細胞毒」及び「細胞傷害性薬物」は、細胞の機能を阻害又は阻止し、且つ／若しくは細胞の破壊（細胞死）を引き起こし、且つ／又は抗増殖効果を発揮する任意の分子を指す。ＡＤＣの細胞毒又は細胞傷害性薬物が、当該技術分野でＡＤＣの「ペイロード」とも称されることは理解されるであろう。細胞傷害性薬物のいくつかのクラスは、ＡＤＣ分子における潜在的な有用性を有することが当該技術分野で公知であり、本明細書に記載のＡＤＣにおいて使用可能である。細胞傷害性薬物のかかるクラスとして、例えば、抗微小管剤（例えば、アウリスタチン及びマイタンシノイド）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、アマトキシン）、及びＤＮＡアルキル化剤（例えば、インドリノベンゾジアゼピン疑似二量体）が挙げられる。本明細書に記載のＡＤＣ中で用いてもよい具体的な細胞傷害性薬物の例として、限定はされないが、アマニチン、アウリスタチン、カリケアマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、エンジイン、レキシトロプシン、タキサン、ピューロマイシン、マイタンシノイド、ビンカアルカロイド、チュブリシン、及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が挙げられる。より具体的には、細胞傷害性薬物は、例えば、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、アウリスタチンＥ、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ－１０６５、ＳＮ－３８、トポテカン、モルホリノ－ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン－１０、エキノマイシン、コンブレタットスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｔｓｔａｔｉｎ）、カリケアミシン（ｃｈａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ビンブラスチン、メトトレキサート、ネトロプシン、又はその誘導体若しくは類似体であってもよい。ＡＤＣにおける使用に適した細胞毒はまた、例えば、国際特許出願公開番号の国際公開第２０１５／１５５３４５号パンフレット及び国際公開第２０１５／１５７５９２号パンフレットに記載されている。
【0023】
一実施形態では、細胞傷害性薬物は、抗微小管剤、例えば、チュブリシン、マイタンシノイド、アウリスタチン、又はその誘導体であってもよい。用語「抗微小管剤」及び「微小管標的化剤」は、同義であり、微小管に干渉することにより細胞分裂を阻害する薬剤を指す。チュブリシンは、ミクソバクテリア種から単離された天然生成物のクラスのメンバーであり（Ｓａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，５３：８７９－８８５（２０００））、チューブリン重合を阻害し、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす有糸分裂毒素として作用する（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３：４８８８－４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：６７８－６８３（２００６）；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３９６：２３５－２４２（２００６））。チュブリシンの例が、例えば、国際特許出願公開番号として国際公開第２０１５／１５７５９４号パンフレット、国際公開第２００４／００５３２６号パンフレット、国際公開第２０１２／０１９１２３号パンフレット、国際公開第２００９／１３４２７９号パンフレット、国際公開第２００９／０５５５６２号パンフレット、国際公開第２００４／００５３２７号パンフレット；米国特許第７，７７６，８４１号明細書、米国特許第７，７５４，８８５号明細書、及び米国特許第７，８１６，３７７号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１０／０２４０７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１１／００２１５６８号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１／０２６３６５０号明細書に開示されている。
【0024】
特定の態様では、チュブリシンは、国際公開第２０１５／１５７５９４号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に記載の化合物、例えば、以下の構造：
を有する化合物、又は以下の構造：
を有する化合物などである。
【化1】
【化2】
【0025】
マイタンシノイドは、微小管タンパク質チューブリンの重合を阻害し、それにより微小管の形成を阻止する（例えば、米国特許第６，４４１，１６３号明細書及びＲｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８９：１００２－１００５（１９７５）を参照）。マイタンシノイドは、細胞培養モデルを用いてインビトロで、また実験動物系を用いてインビボで、腫瘍細胞増殖を阻害することが示されている。さらに、マイタンシノイドの細胞傷害性は、通常の化学療法剤、例えば、メトトレキサート、ダウノルビシン、及びビンクリスチンよりも１，０００倍大きい（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照）。マイタンシノイドは、メイタンシン、マイタンシノール、マイタンシノールのＣ－３エステル、並びに他のマイタンシノール類似体及び誘導体を含む（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書及び米国特許第６，４４１，１６３号明細書を参照）。マイタンシノールのＣ－３エステルは、天然に存在しうる、又は合成的に誘導されうる。さらに、天然及び合成Ｃ－３マイタンシノールエステルは、単純なカルボン酸とのＣ－３エステル、又はＮ－メチル－Ｌ－アラニンの誘導体とのＣ－３エステルとして分類可能であり、後者は、前者よりも細胞傷害性が高い。合成マイタンシノイド類似体はまた、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１：３１－３７（１９７８）に記載されている。マイタンシノール並びにその類似体及び誘導体を作製するための方法は、例えば、米国特許第４，１５１，０４２号明細書に記載されている。本明細書に記載のＡＤＣと関連して用いてもよいマイタンシノイドの例として、限定はされないが、Ｎ２’－デアセチラーゼ－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソプロピル）－メイタンシン（ＤＭ１）及びＮ２’－デアセチラーゼ－Ｎ２’－（４－メルカプト－４－メチル－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ４）が挙げられる。
【0026】
アウリスタチンは、十分な耐用量で実質的な前臨床活性を示している、高度に強力な抗有糸分裂剤のクラスを表す（Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６：２３２８－２３３７（２００６）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：２５９１－２５９６（２００６）；Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：１３７３－１３８２（２００６）；及びＯｆｌａｚｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１４２：６９－７３（２００８）、及びＯｆｌａｚｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１４：６１７１－６１８０（２００８））。アウリスタチンＡＤＣは現在、前臨床及び臨床試験において評価されつつある。本明細書に記載のＡＤＣと関連して用いてもよいアウリスタチンの例として、限定はされないが、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及び関連分子のモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）が挙げられる（例えば、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：７７８－７８４（２００３）；及びＤｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１７：１１４－１２４（２００６）を参照）。
【0027】
一実施形態では、細胞傷害性薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又はＰＢＤ誘導体であってもよい。ＰＢＤは、それがＤＮＡに架橋する核に移動し、有糸分裂中の複製を阻止し、一本鎖破壊を誘導することによりＤＮＡを損傷させ、且つ結果的にアポトーシスをもたらす。一部のＰＢＤはまた、ＤＮＡの特異的配列を認識し、それに結合する能力を有する。ＰＢＤは、一般構造が
である。
【化3】
【0028】
ＰＢＤは、置換基の数、種類、及び位置が、それらの芳香族Ａ環及びピロロＣ環の双方が、またＣ環の飽和度が異なる。Ｂ環では、アルキル化ＤＮＡに関与する求電子性中心である、Ｎ１０～Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ－ＣＨ（ＯＨ））、又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ－ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。公知の天然産物のすべてが、Ｃ環からＡ環の方に向かって右巻きねじれをもたらす、キラルＣ１１ａ位に（Ｓ）－立体配置を有する。この特徴はまた、Ｂ型ＤＮＡの小溝に対してイソらせん性（ｉｓｏｈｅｌｉｃｉｔｙ）になるための適切な三次元形状をＰＢＤに与え、結合部位での整然とした一致をもたらす（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ＩＩＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３－１１（１９７５）；及びＨｕｒｌｅｙ ａｎｄ Ｎｅｅｄｈａｍ－ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９：２３０－２３７（１９８６））。ＰＢＤは、小溝内に付加物を形成し、ＤＮＡプロセシングへの干渉をもたらしうる。
【0029】
最初のＰＢＤ抗腫瘍抗生物質アントラマイシンは、１９６５年に発見された（Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９３－５７９５（１９６５）；Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８７：５７９１－５７９３（１９６５））。それ以降、いくつかの天然に存在するＰＢＤが報告されており、種々の類似体において１０を超える合成経路が開発されている（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，４３３－４６５（１９９４）；及びＡｎｔｏｎｏｗ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１１１：２８１５－２８６４（２０１１））。ファミリーメンバーは、アベイマイシン（Ｈｏｃｈｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４０：１４５－１４８（１９８７））、チカマイシン（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３７：２００－２０６（１９８４））、ＤＣ－８１（日本特許第５８１８０４８７号公報；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．，２６：７６７－７７２（１９９０）；及びＢｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：７５１－７５８（１９９２））、マゼトラマイシン（Ｋｕｍｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３３：６６５－６６７（１９８０））、ネオトラマイシンＡ及びＢ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９：９３－９６（１９７６））、ポロトラマイシン（Ｔｓｕｎａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１：１３６６－１３７３（１９８８））、プロトラカルシン（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２９：２４９２－２５０３（１９８２）；及びＬａｎｇｌｅｙ ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２：９１－９７（１９８７））、シバノマイシン（ＤＣ－１０２）（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１：７０２－７０４（１９８８）；及びＩｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４１：１２８１－１２８４（１９８８））、シビロマイシン（Ｌｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１０：２９９２－２９９３（１９８８））、及びトママイシン（Ａｒｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２５：４３７－４４４（１９７２））を含む。ＰＢＤとともに、ＰＢＤを含むＡＤＣについても、国際特許出願公開番号として国際公開第２０１５／１５５３４５号パンフレット及び国際公開第２０１５／１５７５９２号パンフレットに記載されている。
【0030】
一実施形態では、ＰＢＤは、ＰＢＤ３２４９であり（本明細書中で「ＳＧ３２４９」とも称される）、国際公開第２０１４／０５７０７４号パンフレット中で詳述され、以下の構造：
を有する。
【化4】
を有する。
【0031】
別の実施形態では、ＰＢＤは、ＰＢＤ３３１５であり（本明細書中で「ＳＧ３３１５」とも称される）、国際公開第２０１５／０５２３２２号パンフレット中で詳述され、以下の構造：
を有する。
【化5】
【0032】
別の実施形態では、ＰＢＤは、ＳＧ３４００であり（化合物２３とも称される）、２０１７年２月１０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２９８８号明細書中で詳述され、以下の構造：
を有する。
【化6】
【0033】
ＢＣＭＡモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片は、部位特異的又は非部位特異的なコンジュゲーション方法を含む当該技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて、細胞毒にコンジュゲートされてもよい。抗体に対する通常のコンジュゲーション方法は、典型的には、ペイロードを抗体、その抗原結合断片に、リジン又はシステインを通じて無作為に（即ち非特異的に）コンジュゲートすることに依存する。したがって、いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合断片は、例えば抗体又は抗体断片の部分的還元により、無作為に細胞傷害性薬物にコンジュゲートされ、その後、所望される薬剤との反応が付着されるリンカー部分の存在下又は不在下でなされる。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ，）又は類似の還元剤を用いて還元されてもよい。次に、細胞傷害性薬物は、それに付着されるリンカー部分の存在下又は不在下で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下で還元された抗体又は抗体断片に過剰なモルで添加されうる。コンジュゲーション後、未反応の薬剤をクエンチするため、過剰な遊離システインが添加されてもよい。次に、反応混合物は、精製され、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換されてもよい。
【0034】
他の実施形態では、細胞傷害性薬物は、特定の反応性アミノ酸残基で部位特異的なコンジュゲーション方法を用いてＢＣＭＡモノクローナル抗体にコンジュゲートされることで、均一な化学量論を有する均一なＡＤＣ製剤を得てもよい。部位特異的なコンジュゲーションは、システイン残基又は非天然アミノ酸を通じてもよい。一実施形態では、細胞傷害性薬物は、少なくとも１つのシステイン残基を通じて、抗体、又はその抗原結合断片にコンジュゲートされてもよい。特に、例えば、細胞傷害性薬物は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体のＦｃ領域内の特定のＫａｂａｔ位置でのアミノ酸の側鎖に化学的にコンジュゲートされてもよい。これに関連して、細胞傷害性薬物は、抗体のＦｃ領域内の任意の好適な位置でのシステイン残基、例えば限定はされないが、２３９、２４８、２５４、２７３、２７９、２８２、２８４、２８６、２８７、２８９、２９７、２９８、３１２、３２４、３２６、３３０、３３５、３３７、３３９、３５０、３５５、３５６、３５９、３６０、３６１、３７５、３８３、３８４、３８９、３９８、４００、４１３、４１５、４１８、４２２、４４０、４４１、４４２、４４３及び４４６位の少なくとも１つでのシステインを通じて、ＢＣＭＡモノクローナル抗体にコンジュゲートされてもよく、ここで付番はＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに対応する。一実施形態では、細胞傷害性薬物は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体の特定のＫａｂａｔ位置２３９及び／若しくは４４２でのシステイン残基を通じて、且つ／又はＢＣＭＡ抗体のＫａｂａｔ位置２３９及び２４０間に挿入されたアミノ酸残基を通じて、ＢＣＭＡモノクローナル抗体にコンジュゲートされてもよい（Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，１４（５）：１５０１－１５１６（２０１７）。或いは、細胞傷害性薬物は、チオール－マレイミド結合を通じて、例えばヒンジ及び重鎖－軽鎖でのスルフヒドリル反応基を介して、ＢＣＭＡモノクローナル抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされてもよい。
【0035】
本明細書に記載のＢＣＭＡモノクローナル抗体は、それにコンジュゲートされた少なくとも１つの細胞毒分子を含むが、所望される治療効果を達成するため、ＢＣＭＡモノクローナル抗体は、それにコンジュゲートされた任意の好適な数の細胞毒分子（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上の細胞毒分子）を含んでもよい。望ましくは、本明細書に記載のＡＤＣは、ＢＣＭＡモノクローナル抗体にコンジュゲートされた２つの細胞毒分子を含む。
【0036】
本明細書に記載のＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡを標的にすることが望ましい場合の任意の治療法、例えば、養子細胞移入（ＡＣＴ）、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）、及びナノ粒子にとって有用である。一実施形態では、本開示は、Ｔ細胞活性化部分に連結された本明細書に記載のＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、Ｔ細胞シグナル伝達又はＴ細胞活性化部分に連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドである。ＣＡＲ構造は、直近の２０年にわたり、最も一般的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＴＣＲζ鎖からのシグナル伝達モチーフを組み込むように進化している（「第１世代」ＣＡＲと称される（例えば、Ｏｋｕｒ，Ｆ．Ｖ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６５１：３１９－４５（２０１０）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．，１８（１０）：２７８０－２７９０（２０１２）を参照）。より最近では、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び／又はＣＤ１３４（ＯＸ－４０）からの１つ（「第２世代」）又は２つ（「第３世代」）の同時刺激活性化モチーフを組み込んだ第２及び第３世代のＣＡＲが開発されており、それらは、増殖、細胞傷害性、及び持続性をインビボで増強する（例えば、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：１０４－１３（２００４）；Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１８：６７６－８４（２００４）；Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：７０－５（２００２）；Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１７：１４５３－６４（２００９）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）。
【0037】
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書に記載の通り、全モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片を含んでもよい。一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含んでもよい。キメラ抗原受容体及びＣＡＲを作製するための方法は、例えば、Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．ａｎｄ Ｍ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２５（５）：１１１７－１１２４（２０１７）；Ｄａｖｉｌａ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｍ．Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１０４（１）：６－１７（２０１６）；及び米国特許出願公開第２０１５／００５１２６６Ａ１号明細書にさらに記載されている。
【0038】
本開示はまた、上記の抗体又は抗体薬剤コンジュゲート及び薬学的に許容できる（例えば生理学的に許容できる）担体を含む組成物を提供する。当該技術分野で公知の任意の好適な担体は、本発明と関連する範囲内で使用可能である。担体の選択は、部分的には、組成物が投与されてもよい特定部位、及び組成物を投与するために用いられる特定の方法により判定されることになる。組成物は、任意選択的には無菌状態であってもよい。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）に記載される通常の技術に従って作製されうる。
【0039】
組成物は、望ましくは、抗体又は抗体薬剤コンジュゲートを、多発性骨髄腫を治療又は予防するのに有効な量で含む。したがって、本開示は、多発性骨髄腫細胞を殺滅する方法であって、ＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞を、本明細書に記載の抗体若しくは抗体薬剤コンジュゲート、又は本明細書に記載の抗体若しくはＡＤＣを含む組成物と接触させ、それにより抗体又は抗体薬剤コンジュゲートが多発性骨髄腫細胞上のＢＣＭＡに結合し、多発性骨髄腫細胞を殺滅する、方法を提供する。本開示はまた、多発性骨髄腫を治療するための薬剤の作製における、本明細書に記載の抗体若しくはＡＤＣ、又は抗体若しくはＡＤＣを含む組成物の使用を提供する。本明細書で考察される通り、形質細胞骨髄腫又はカーレル病としても知られる多発性骨髄腫は、通常は抗体の産生に関与する白血球の一種である形質細胞のがんである（Ｒａａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３７４：３２４－３２９（２００９））。多発性骨髄腫は、１年間で１００，０００人あたり１～４人が罹患する。疾患は、男性でより一般的であり、いまだ未知の理由から、アフリカ系アメリカ人では、コーカサス系アメリカ人の２倍の頻度で一般的である。多発性骨髄腫は、極めてまれな血液悪性腫瘍（１４％）であり、すべてのがんの１％を構成する（Ｒａａｂ ｅｔ ａｌ．，上記）。多発性骨髄腫の治療は、典型的には高用量化学療法とその後の造血幹細胞移植（同種又は自家）を含むが、かかる治療を受けている多発性骨髄腫患者では、高頻度の再発が一般的である。上で考察したように、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞により高度に発現される（例えば、Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，上記；及びＭｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，上記を参照）。
【0040】
本明細書中に示されるように、ＢＣＭＡはまた、多発性骨髄腫幹細胞で発現される。そのように、本開示は、多発性骨髄腫幹細胞を殺滅する方法であって、ＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫幹細胞を、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲート、又は本明細書に記載のＡＤＣを含む組成物と接触させ、それにより抗体薬剤コンジュゲートが多発性骨髄腫幹細胞上のＢＣＭＡに結合し、多発性骨髄腫幹細胞を殺滅する、方法を提供する。多発性骨髄腫幹細胞は、多発性骨髄腫患者の骨髄において、ＣＤ１９のそれらの表面発現及びＣＤ１３８表面発現の欠如により同定可能である（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２３３２－６（２００４）を参照）。これらの細胞は、本質的にクローン原性であり、免疫不全マウスに生着する一方で、ＣＤ１３８＋ＣＤ１９－と規定される骨髄腫形質細胞は生着しない。多発性骨髄腫幹細胞はまた、現在の治療法に対して抵抗性である（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８：１９０－７（２００８））。
【0041】
本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲート、又は抗体薬剤コンジュゲートを含む組成物は、生体外、インビボ、又はインビトロでＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞の集団と接触されてもよい。「生体外」は、天然状態の変更を最小にした生物外部の人工的環境下で、細胞又は組織の内部又は表面で実施される方法を指す。それに対し、用語「インビボ」は、生体内で、その正常なインタクトな状態で実施される方法を指す一方で、「インビトロ」方法は、通常の生物学的状況から単離されている生物の成分を用いて実施される。一実施形態では、多発性骨髄腫細胞は、本明細書に記載のＡＤＣ、又はＡＤＣを含む組成物とインビボで接触されるヒト多発性骨髄腫細胞である。
【0042】
本明細書で用いられるとき、用語「治療」、「治療する」などは、所望される薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。好ましくは、効果は、治療的である、即ち、効果は、疾患及び／又は疾患に起因し得る有害症状を部分的に又は完全に治癒させる。この目的のため、本発明の方法は、「治療有効量」の抗体若しくはＡＤＣ又は抗体若しくはＡＤＣを含む組成物及び薬学的に許容できる担体を投与することを含む。「治療有効量」は、所望される治療的結果を達成するための、必要な用量及び期間での有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望される応答を誘発する抗体若しくはＡＤＣの能力などの要素に応じて変化してもよい。例えば、本発明のＡＤＣの治療有効量は、多発性骨髄腫細胞上のＢＣＭＡに結合し、それらを破壊するする量である。
【0043】
或いは、薬理学的及び／又は生理学的効果は、予防的であってもよい、即ち、効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する。これに関連して、本発明の方法は、「予防有効量」のＡＤＣ又はＡＤＣを含む組成物を、多発性骨髄腫になりやすい哺乳動物に投与することを含む。「予防有効量」は、所望される予防的結果（例えば疾患発症の予防）を達成するための、必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【0044】
治療的又は予防的有効性は、治療患者の定期的評価により監視されうる。一実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、ＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞の増殖を少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％）阻害又は抑制する。細胞増殖は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて測定可能であり、例えば標識ヌクレオシド（例えば、３Ｈ－チミジン又はブロモデオキシウリジンＢｒｄ（Ｕ））のゲノムＤＮＡへの組み込みの測定が挙げられる（例えば、Ｍａｄｈａｖａｎ，Ｈ．Ｎ．，Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．，３（１）：１２－１４（２００７）を参照）。
【0045】
本明細書に記載の抗体若しくはＡＤＣ、又は抗体若しくはＡＤＣを含む組成物は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下を含む標準的な投与技術を用いて哺乳動物（例えばヒト）に投与可能である。より好ましくは、抗体若しくはＡＤＣ又はそれを含有する組成物は、静脈内注射により哺乳動物に投与される。
【0046】
本明細書に記載の抗体若しくはＡＤＣ、又は抗体若しくはＡＤＣを含む組成物は、哺乳動物に同時投与可能である、１以上の追加的な治療薬とともに投与されうる。用語「同時投与する」は、本明細書で用いられるとき、１以上の追加的な治療薬及び本明細書に記載の抗体若しくはＡＤＣ、又は抗体若しくはＡＤＣ含有組成物を、抗体若しくはＡＤＣが１以上の追加的な治療薬の効果を増強しうる、又はその逆であるような十分に短い時間内に投与することを指す。これに関連して、抗体若しくはＡＤＣ又はそれを含有する組成物が最初に投与され、且つ１以上の追加的な治療薬が２番目に投与されてもよい、又はその逆でもよい。例えば、多発性骨髄腫の治療又は予防のため、抗体若しくはＡＤＣ又はそれを含有する組成物が、他の薬剤（例えばアジュバントとして）と組み合わせて投与されてもよい。これに関連して、抗体若しくはＡＤＣ又は抗体若しくはＡＤＣ含有組成物は、少なくとも１つの他の抗がん剤、例えば、当該技術分野で公知の任意の好適な化学療法剤、イオン化放射線、小分子抗がん剤、癌ワクチン、生物学的治療薬（例えば、他のモノクローナル抗体、がん殺傷ウイルス（ｃａｎｃｅｒ－ｋｉｌｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ）、遺伝子療法剤、及び養子Ｔ細胞移入）、及び／又は手術と併用可能である。
【0047】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然ながら、決してその範囲を限定するように解釈されるべきでない。
【実施例】
【0048】
実施例１
本実施例は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体の産生について記述する。
本実施例は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なモノクローナル抗体の産生について記述する。
【0049】
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６（４）：３８１－３８９（１９９７）に記載のＲＩＭＭＳ免疫化レジームに従い、６週齢雌Ａｂｌｅｘｉｓトランスジェニックマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は、精製組換えヒト（ｒＨｕ） ＢＣＭＡ－Ｆｃ単独の皮下注射６回（キャンペーン１）、又はｒＨｕ ＢＣＭＡ－ＦｃとカニクイザルＢＣＭＡ－Ｆｃ（Ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ－Ｆｃ）の双方又はＨｕ ＢＣＭＡ若しくはＣｙｎｏ ＢＣＭＡのいずれかを発現する接着性２９３細胞（Ａｄ２９３）による交互免疫（キャンペーン２）を複数部位で受けた。マウスは、２～３日間隔で１３日間にわたり免疫した。免疫の各回において、まずマウスをイソフルランで麻酔した。免疫原を完全又は不完全フロイントアジュバント及びＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で乳化し、複数部位で両側性に注射した。試験出血を１３日目に収集し、ヒト及びカニクイザルＢＣＭＡを発現する接着性２９３細胞に対する抗原ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ結合にてアッセイした。良好な血清力価を有するマウスに、前融合追加免疫を腹腔内投与し、１７日目に屠殺した。リンパ節細胞を収集し、ポリエチレングリコール融合法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従って骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３に融合し、安定なハイブリドーマを作製した。
【0050】
抗ＢＣＭＡに特異的なハイブリドーマを、ＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞に対する直接結合ＥＬＩＳＡ、その後のＦＡＣＳにてハイブリドーマ上清をスクリーニングすることにより同定した。陽性ハイブリドーマを、インビトロでＮＣＩ－Ｈ９２９多発性骨髄腫細胞に対して結合、内部移行、及び殺滅するそれらの能力について、二次サポリンコンジュゲートＦａｂ－ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＩＴ－４８）を用いて、また細胞株で発現される内因性ＢＣＭＡに対するＦＡＣＳ結合により、さらに試験した。次に、内部移行及び細胞殺傷効力に基づき、ハイブリドーマを限界希釈法でクローン化し、拡大し、抗体精製及び可変領域の遺伝子救済を意図した。
【0051】
第１のキャンペーンから、４４のヒト専用結合剤、並びに４つのヒト及びカニクイザル交差反応性結合剤のパネルが得られた。次に、これら４８の抗体を、ＢＣＭＡを発現する接着性２９３細胞及び内因性ｈｕＢＣＭＡを発現するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株で、ＦＡＣＳによりさらに試験した。２５のハイブリドーマ系統のリードパネルを、抗体を内因性ヒトＢＣＭＡへの最良の結合により順位付けすることにより同定した。全部で１１のハイブリドーマをサブクローニング、スケールアップ、配列決定、及び精製に進めた。クローンもまた、Ｆａｂ Ｚａｐに基づく殺滅について評価した。さらなる評価のため、１つの抗体（クローン４６７９）を、ヒトＩｇＧ１として組換え的にクローニングした。
【0052】
第２のキャンペーンから、ｒＨｕ／Ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ－Ｆｃでの免疫用の９８の結合剤、ｒＨｕ／Ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ－Ｆｃ及びＣｙｎｏ ＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞での免疫用の９つの結合剤、並びにＨｕ及びＣｙｎｏ ＢＣＭＡ双方を発現するＡｄ２９３細胞での免疫用の０の結合剤のパネルが得られた。これらのハイブリドーマを、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ－Ｒへの結合についてＦＡＣＳによりさらに試験し、ＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ－Ｒに対して何らかの検出可能な結合性を示す抗体を除去した。Ｆａｂ Ｚａｐアッセイに伴うこれらの二次スクリーンから、限界希釈クローニング（ＬＤＣ）において前進した８つのハイブリドーマの同定が得られた。さらなる評価のため、それらの活性に基づき、次に２つのクローン（クローン７５６及び１５Ｂ２）をヒトＩｇＧ１に変換した。
【0053】
抗体４６７９、７５６、及び１５Ｂ２ＧＬ（下記の通り）をＦＡＣＳにより分析し、抗体のヒトＢＣＭＡ、カニクイザルＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、及びＢＡＦＦ－Ｒへの結合を、Ａｄ２９３細胞上で安定的に発現される受容体の組換え形態を用いて評価した。結合アッセイを、抗体４６７９、７５６、及び１５Ｂ２ＧＬを２００，０００個の細胞とともに４℃で４５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄することにより実施した。次に、細胞をＡｌｅｘａ－Ｆｌｏｕｒ ６４７標識二次抗体とともに４℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。抗ＢＡＦＦ－Ｒ、抗ＴＡＣＩ、及び抗ヒトＢＣＭＡ－ＡＰＣ標識抗体を、対照ウェルにおける製造業者推奨の希釈法に従って添加した。細胞を２００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋ＤＡＰＩに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＩＩ血球計数器を用いて、生細胞に結合する抗体を分析した。抗体１５Ｂ２ＧＬは、図１に示す通り、ＢＡＦＦ－Ｒ及び／又はＴＡＣＩに結合しない試験対象で唯一のカニクイザル交差反応性抗体であった。
【0054】
１５Ｂ２における４つの非生殖系列化残基を突然変異させるように設計したプライマーを用いて、１５Ｂ２モノクローナル抗体を生殖系列形態（１５Ｂ２ＧＬ）に突然変異させた。１５Ｂ２野生型ＤＮＡをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ用の鋳型ＤＮＡとして用いた（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。ＳＴＢＩＩＩ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を形質転換用に用いた。配列検証後、ＢＣＭＡ結合及び動力学アッセイを実施し、１５Ｂ２ＧＬ及び１５Ｂ２ＷＴの結合を比較し、１５Ｂ２ＧＬのリード最適化（ＬＯ）クローンの集団を作製した。つまり、１５Ｂ２を細菌発現用に設計したＦＡｂ発現ベクターにクローン化した。重鎖中の２７の残基及び軽鎖中の１９の残基を各々、１９の異なるアミノ酸からのシステイン除去を可能にするように設計したプライマーを用いて、節約的に突然変異させた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、突然変異誘発を実施した。
【0055】
約１００のコロニー／位を、全部で６０００クローンについて結合ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ結合は、低密度のヒトＢＣＭＡを捕捉し、細菌発現の４８時間後の細菌上清を用いることにより測定した。ヒットは、１５Ｂ２ＧＬ対照を２倍超で上回るものと定義した。個別のアミノ酸ヒットを、カニクイザルＢＣＭＡに対するＥＬＩＳＡにより確認し、非特異的タンパク質に対する結合が認められなかった。次に、簡素なスクリーンからの同定されたヒットをプライマー設計用に組み合わせ、コンビナトリアルライブラリーを作成した。ＥＬＩＳＡ結合による上記ＦＡｂスクリーニング手法を、親鋳型及びＥＬＩＳＡ対照としての１５Ｂ２ＧＬを用いたコンビナトリアルライブラリーとして反復させた。次に、コンビナトリアルスクリーニング後に同定したヒットを、ＡＤＣコンジュゲーション用に設計したＩｇＧ哺乳動物発現ベクター（「Ｍａｉａ」）にクローン化した。さらなる試験のため、タンパク質を２９３ＨＥＫ細胞において発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【0056】
１５Ｂ２ＧＬ抗体及び１５Ｂ２ＧＬのＬＯクローンがインビトロでＨ９２９多発性骨髄腫細胞に対して結合、内部移行、及び殺滅する能力を、Ｆａｂ－ＺＡＰを用いて、且つ上記のような細胞株に発現される内因性ＢＣＭＡへのＦＡＣＳ結合により評価した。つまり、抗体を２００，０００個の細胞とともに４℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。細胞を１００ｕＬの低温ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、４℃で維持した。特定の時点で、細胞を洗浄し、加温ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳに再懸濁し、３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）内に入れた。実験終了時、細胞を洗浄し、次にＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ６４７標識二次抗体とともに４℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。細胞を２００μＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋ＤＡＰＩに再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＩＩ血球計数器を用いて、抗体の生細胞への結合を分析した。１５Ｂ２ＧＬ抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体Ｊ６Ｍ０（米国特許第９，２７３，１４１号明細書に記載）及びＬＯ抗体と比較するとき、この方法により、固有の迅速な内部移行を示した。
【0057】
ＢＣＭＡ結合、動力学スクリーン（上で考察）、及び内部移行に基づき、モノクローナル抗体１５Ｂ２ＧＬを選択し、５つのＬＯクローン（即ち、Ｉ０９、Ｌ１５、Ｐ１０、Ｎ２２、及びＭ０２）を、精製及び１５Ｂ２ＧＬとのコンジュゲーション用に選択した。
【0058】
モノクローナル抗体１５Ｂ２（野生型及び生殖系列化）並びにＬＯクローンＩ０９、Ｌ１５、Ｐ１０、Ｎ２２、及びＭ０２の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表１に示す。
【0059】
【表1】
【0060】
【表2】
【0061】
本実施例の結果は、ＢＣＭＡに特異的なモノクローナル抗体の産生を示す。
【0062】
実施例２
本実施例は、本開示に従って細胞毒にコンジュゲートされたＢＣＭＡモノクローナル抗体を含む抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生する方法を示す。
本実施例は、本開示に従って細胞毒にコンジュゲートされたＢＣＭＡモノクローナル抗体を含む抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生する方法を示す。
【0063】
実施例１に記載の１５Ｂ２ＧＬモノクローナル抗体及び最適化クローンを、部位特異的コンジュゲーションを用いて、ＰＢＤペイロードＳＧ３２４９にコンジュゲートした（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２３６：１００－１１６（２０１６）；Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１７ Ｍａｙ １；１４（５）：１５０１－１５１６）。具体的には、精製抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中の４０モル過剰な還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）とともに３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、還元剤を、１０，０００ＭＷＣＯ透析カセットを用いての４℃、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡでの２回透析により除去し、次いでデヒドロアスコルビン酸の２０モル等価物とともに２５℃で４時間インキュベートした。その後、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中の保存液からのＰＢＤペイロードＳＧ３２４９の８つの等価物を順次添加し、次いで穏やかに回転しながら室温で１時間インキュベートした。コンジュゲーション反応は、Ｎ－アセチルシステインの（ＳＧ３２４９にわたる）４モル等価物の添加によりクエンチした。
【0064】
コンジュゲーションプロセスは、８～１０％の凝集体形成をもたらした。高分子凝集体、コンジュゲーション試薬、例えばシステインでクエンチしたＳＧ３２４９などを、前述のようにセラミックハイドロキシアパタイトＩＩ型クロマトグラフィー（ＣＨＴ）を用いて除去した（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２３６：１００－１１６（２０１６））。部位特異的なＡＤＣを２５ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、７％スクロース、０．０２％ポリソルベート－８０（ｐＨ６）中で配合した。
【0065】
単量体含量、凝集体、及び断片を測定するため、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、東京、日本）に負荷した１００μｇ（１００μＬの体積）の抗体若しくはＡＤＣを用いて、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）を実施した。移動相は、０．１Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム、及び１０％イソプロパノール（ｐＨ６．８）から構成された。流速は１ｍＬ／分であり、且つ各分析は、室温で２０分間実施した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）を、コンジュゲーション及び薬剤負荷分布を評価するために用い、ブチル－非多孔質樹脂（ＮＰＲ）カラム（４．６μｍＩＤ×３．５ｃｍ、２．５μｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて実施した。移動相Ａは、２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ８．０）から構成され；且つ移動相Ｂは、２５ｍＭトリス－ＨＣｌ及び５％イソプロパノール（ｐＨ８．０）から構成された。１ｍｇ／ｍＬの濃度での１００μＬの抗体若しくはＡＤＣを負荷し、１３分にわたる５％Ｂ～１００％Ｂの勾配を用いて、１ｍＬ／分の流速で溶出させた。還元逆相クロマトグラフィー（ｒＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて、鎖特異的コンジュゲーションを確認した。抗体及びＡＤＣは、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中４２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて、３７℃で２０分間還元された。１０μｇの還元された抗体若しくはＡＤＣを、ポリマー逆相媒体（ＰＬＲＰ－Ｓ）１０００Ａカラム（２．１×５０ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に負荷し、２５分にわたる５％Ｂ～１００％Ｂの勾配を用いて、１ｍＬ／分の流速、８０℃で溶出させた（移動相Ａ：水中、０．１％トリフルオロ酢酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中、０．１％トリフルオロ酢酸）。
【0066】
重鎖及び軽鎖でのコンジュゲーション並びに薬剤：抗体比（ＤＡＲ）は、還元液体クロマトグラフィー質量分析（ｒＬＣＭＳ）をＡｇｉｌｅｎｔ ６２３０ＴＯＦ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に共役されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０シリーズｕＨＰＬＣ上で実施することにより判定した。２μｇの還元された抗体若しくはＡＤＣを、ＺＯＲＢＡＸラピッドレゾリューションｈｉｇｈ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ（ＲＲＨＤ）の３００－ジフェニルカラム（２．１×５０ｍｍ、１．８μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）に負荷し、２．１分後の８０％Ｂの階段状勾配を用いて、０．５ｍＬ／分の流速で溶出させた（移動相Ａ：水中の０．１％ギ酸、及び移動相Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ギ酸）。正飛行時間型質量分析走査を得て、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて、データの収集及び加工を実施した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記に記載のように、ｒＬＣＭＳデータを用いて、ＤＡＲを算出した。
【0067】
コンジュゲーションの効率を、以下の方程式（２の理論上のＤＡＲを用いる）を用いて判定した。
試験抗体のコンジュゲーション効率及びＤＡＲを表２に示す。
【数1】
【0068】
【表3】
【0069】
本実施例の結果は、本開示に従ってピロロベンゾジアゼピンにコンジュゲートされたＢＣＭＡモノクローナル抗体を含むＡＤＣの産生を示す。
【0070】
実施例３
本実施例は、本明細書に記載のモノクローナルＢＣＭＡ抗体の単量体（可溶性）及び膜結合ＢＣＭＡに対する結合親和性を示す。
本実施例は、本明細書に記載のモノクローナルＢＣＭＡ抗体の単量体（可溶性）及び膜結合ＢＣＭＡに対する結合親和性を示す。
【0071】
１５Ｂ２ＧＬモノクローナル抗体及び最適化クローンＩ０９、Ｌ１５、Ｐ１０、Ｎ２２、及びＭ０２（実施例１に記載）の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い、単量体ヒトｓＢＣＭＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて評価した。比較用にＪ６Ｍ０の結合についても評価した。標準アミンカップリングを用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中で調製した２５μｇ／ｍｌの抗Ｆｃポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、２０ｍＭ ＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）及び５ｍＭスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）で約２００－６００共鳴単位（ＲＵ）の密度で予備活性化したＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣバイオセンサーチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の表面に固定化した。引き続き、固定化された抗Ｆｃポリクローナル抗体による捕捉のため、１５Ｂ２ＧＬ、Ｉ０９、Ｌ１５、Ｐ１０、Ｎ２２、Ｍ０２、及びＪ６Ｍ０を１μｇ／ｍｌの濃度で注射した。１００～６．２５ｎＭの範囲の、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製したｓＢＣＭＡの２倍段階希釈物を、捕捉された表面上に７５μＬ／分で１５０秒間流す（６００秒の解離時間を伴う）ことにより、センサーグラムを記録した。ＰｒｏｔｅＯｎデータ分析ソフトウェアを用いて、データを分析した。
【0072】
この実験の結果を、図１３及び１４並びに表３に示す。
【0073】
【表4】
【0074】
１５Ｂ２ＧＬ、Ｉ０９、Ｌ１５、及びＪ６Ｍ０の膜結合ヒトＢＣＭＡへの結合を、ＢＣＭＡを内因性に発現する多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株（各々、ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ）において、フローサイトメトリーを用いて評価した。１５Ｂ２ＧＬ、Ｉ０９、Ｌ１５の膜結合ヒトＢＣＭＡへの結合もまた、ヒトＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞において評価した。結合アッセイを、抗ＢＣＭＡ抗体を２００，０００個の細胞とともに４℃で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄することにより実施した。種々の抗体濃度を、１２ポイントの３倍希釈系列を用いて評価した。次に、細胞を５ｕｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＡＦ６４７二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）とともに４℃でインキュベートし、次いでＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。細胞を２００ｕＬのＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋ＤＡＰＩに再懸濁した。
【0075】
生きた単細胞の蛍光を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＳＲＩＩ血球計数器及びＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて測定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、データを分析した。平均蛍光強度値を用いて、結合の百分率を判定し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてＥＣ５０を決定した。この実験の結果を図１５に示す。ＳＰＲ及びフローサイトメトリーの「見かけの親和性」データの概要を表４に示す。
【0076】
【表5】
【0077】
本実施例の結果は、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体１５Ｂ２ＧＬが、膜結合ＢＣＭＡに強く、且つ単量体（可溶性）ＢＣＭＡに弱く結合し、それはこれらアッセイにて分析した他のモノクローナル抗体と比べてユニークであることを示す。
【0078】
実施例４
本実施例は、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いて、インビトロで多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を殺滅する方法を示す。
本実施例は、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いて、インビトロで多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を殺滅する方法を示す。
【0079】
ＳＧ３２４９にコンジュゲートされた、１５Ｂ２ＧＬ、又はその親和性最適化クローンを含む抗体薬剤コンジュゲートによる多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株の殺滅を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にて推奨されるプロトコルを用いてインビトロで評価した。フリーウォーヘッド（ｆｒｅｅ ｗａｒｈｅａｄ）ＳＧ３１９９による多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株の殺滅もまた、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にて推奨されるプロトコルを用いて評価した。つまり、８０μＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中の５×１０３個の細胞を、白色壁９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の内部ウェルに添加した。以下のＢＣＭＡ発現細胞株：ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＥＪＭ、ＭＭ．１Ｒ．ＪＪＮ３、ＯＰＭ－２、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ２６６．Ｂ１、及びＬ３６３を試験した。ＢＭＣＡ陰性細胞株Ｒａｊｉ及びＪｕｒｋａｔもまた試験した。抗体薬剤コンジュゲートを、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、５×ストック（２．５μｇ／ｍＬ）に希釈した。次に、処置物をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で１：３に連続希釈した。この系列２０μＬを細胞に二通りに添加し、最高濃度での０．５μｇ／ｍＬから最低濃度での３×１０－６μｇ／ｍＬの範囲の、抗体薬剤コンジュゲートの１２ポイント用量曲線を得た。アイソタイプ抗体薬剤コンジュゲート（ＩｇＧ１－ＳＧ３２４９及びＩｇＧ１－ｍｃ－ＭＭＡＦ）及び培地のみの対照もまた含めた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時、基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）１００μＬを各ウェルに添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、発光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて分析及びグラフ化し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を判定した。
【0080】
各細胞株に対する染色体転座情報を、Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ，２０１１及びＢｏｅｒｓｍａ－Ｖｒｅｕｇｄｅｎｈｉｌ ｅｔ ａｌ，２００４から取得した。ＢＣＭＡ受容体数を、ＡＦ６４７標識１５Ｂ２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７用Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＭＥＳＦキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）を用いて測定した。
【0081】
この実験の結果を表５及び図２Ａ～２Ｊに示す。
【0082】
【表6】
【0083】
１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣの、Ｉ０９－ＳＧ３２４９ ＡＤＣと比べての多発性骨髄腫細胞を可溶性ＢＣＭＡ（ｓＢＣＭＡ）の存在下でインビトロで殺滅する能力は、試験対象の細胞株を、ヒトＢＣＭＡを発現するＡｄ２９３細胞から収集したＢＣＭＡ含有条件培地でも処置したこと以外では上記のプロトコルを用いて、ＭＭ．１Ｓ細胞において評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。ｓＢＣＭＡの存在下での１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣ細胞の殺滅を、抗ＢＣＭＡ抗体Ｊ６Ｍ０を含むＡＤＣと比べた（米国特許第９，２７３，１４１号明細書に記載される）。この実験の結果を図３に示し、それは、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣ活性が、Ｉ０９－ＳＧ３２４９（図３Ａ）、Ｊ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ、及びＪ６Ｍ０－ＳＧ３２４９ ＡＤＣよりも大きい程度までの臨床的に関連するレベルのｓＢＣＭＡの存在下で維持されることを示す（図３Ｂ及び表６）。
【0084】
【表7】
【0085】
本実施例の結果は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣが多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞をインビトロで殺滅し、且つ細胞殺滅活性が、可溶性ＢＣＭＡの存在下であっても維持されることを示す。特に、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣは、ＭＭ．１ＳとＮＣＩ－Ｈ９２９の双方に対してインビトロで細胞傷害性があり、最大７２０ｎｇ／ｍＬのレベルのｓＢＣＭＡの存在下で平均で腫瘍細胞の９５％を殺滅し、ＩＣ５０に対する影響はほとんどなかった。単量体ＢＣＭＡと膜結合ＢＣＭＡとの間での類似の親和性を有する抗体から開発したＡＤＣは、効力においてｓＢＣＭＡ用量依存性の低下を示し、ＩＣ５０が７２０ｎｇ／ｍＬのｓＢＣＭＡの存在下で２０倍変化した。
【0086】
実施例５
本実施例は、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いてインビボで殺滅する方法を示す。
本実施例は、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いてインビボで殺滅する方法を示す。
【0087】
多発性骨髄腫及び形質細胞白血病の皮下異種移植片マウスモデルを、ＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫又は形質細胞白血病細胞株（即ち、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＪＪＮ－３、ＭＭ．１Ｓ、及びＭＭ．１Ｒ）を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、雌ＣＢ－１７ ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃ－ｓｃｉｄ）又は胸腺欠損ヌード（Ｆｏｘｎ１ｎｕ）マウスに移植することにより作製した。一旦腫瘍が約１８０ｍｍ３（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞）、１９０ｍｍ３（ＪＪＮ３細胞）、１６０ｍｍ３（ＭＭ．１Ｓ細胞）、又は１７５ｍｍ３（ＭＭ．１Ｒ細胞）に達すると、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為化し、投与群に配置し、ＢＣＭＡ標的化ＡＤＣで処置した（下記の通り）。
【0088】
ＮＣＩ－Ｈ９２９異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量０．３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週あたり０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後９９日間観察したが、図４に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量０．３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週あたり０．３ｍｇ／ｋｇの用量で２週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後９９日間観察したが、図４に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0089】
ＪＪＮ３異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ ＡＤＣを週あたり１ｍｇ／ｋｇの用量で３週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後１０４日間観察したが、図５に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ ＡＤＣを週あたり１ｍｇ／ｋｇの用量で３週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後１０４日間観察したが、図５に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0090】
ＭＭ．１Ｓ異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週２回、１ｍｇ／ｋｇの用量で４週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後９９日間観察したが、図６に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、Ｌ１５－ＳＧ３２４９ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週２回、１ｍｇ／ｋｇの用量で４週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９、Ｉ０９－ＳＧ３２４９、及びＬ１５－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後９９日間観察したが、図６に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0091】
ＭＭ．１Ｒ異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９で処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週あたり３ｍｇ／ｋｇの用量で４週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後１０９日間観察したが、図７に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９で処置するか、又はＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦを週あたり３ｍｇ／ｋｇの用量で４週間、静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９で処置したマウスを腫瘍移植後１０９日間観察したが、図７に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0092】
本実施例の結果は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣが、ＢＣＭＡ発現細胞を標的にする他のＡＤＣと比べて、インビボで抗腫瘍有効性の増強を示すことを示す。
【0093】
実施例６
本実施例は、多発性骨髄腫幹細胞がＢＣＭＡを発現することを示す。
本実施例は、多発性骨髄腫幹細胞がＢＣＭＡを発現することを示す。
【0094】
多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の骨髄は、患者の骨髄において、ＣＤ１９のそれらの表面発現やＣＤ１３８表面発現の欠如により同定可能ながん幹細胞（ＣＳＣ）の小集団を含有する（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２３３２－６（２００４））。
【0095】
ＢＣＭＡ発現は、４つの多発性骨髄腫患者試料の幹細胞集団上でフローサイトメトリーにより評価した。試料は、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手し（表７を参照）、個体の多発性骨髄腫（ＭＭ）試料を３７℃の水槽内で解凍した。
【0096】
【表8】
【0097】
解凍した細胞をＰＢＳ１０ｍＬに添加し、ＶｉＣＥＬＬ（商標）カウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて計数した。コロニー形成アッセイのため、一定分量の細胞懸濁液を調製した一方で、細胞懸濁液の残りを低速で遠心分離し、細胞をペレット化した。細胞を製造業者の使用説明書に従ってＦｃブロッキングし、次に９６ウェルプレート内に２００，０００細胞／ウェルで蒔いた。プレートを遠心分離し、細胞をペレット化し、Ｆｃブロッキング溶液をデカントし、細胞試料をＢＶ染色緩衝液に再懸濁し、次いで市販の直接コンジュゲート抗体からなる適切な抗体パネルで染色したものを表８及び９に示す。
【0098】
【表9】
【0099】
【表10】
【0100】
さらに、コンペンセーションビーズを、試験抗体で個別に染色した。プレートを４℃の暗所で３０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞をＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、次いで２００μＬのＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋ＤＡＰＩに再懸濁した。各ウェルからの細胞をＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）上で評価し、ＦＣＳファイルを作成した。細胞の同定は、以下のゲーティング方法を用いて実施した。即ち、コンペンセーションビーズ及び単一の染色データを利用する、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）におけるａｕｔｏ ｃｏｍｐ ｍａｔｒｉｘを用いてコンペンセーションを実施した。次に、ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａプロットを通じてゲーティングした形質細胞を、ＤＡＰＩ対ＳＳＣ－Ｗプロットを通じて生きた単細胞について選択した。次に、除外ゲートを用いて、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ１９３について陽性染色した細胞をＢＶ－５１０対ＳＳＣ－Ａプロットを通じて除去した。次に、ＣＤ１３８－ＰＥ対ＣＤ１９－ＡＰＣプロットにおいて、この集団を分析した。ＣＤ１９＋／ＣＤ１３８－と規定したＭＭ ＣＳＣ集団、及びＣＤ１９－／ＣＤ１３８＋と規定したＭＭ形質細胞集団に対して、ＢＣＭＡ発現に対するヒストグラムを作成した。分析ゲートは、適切な蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照に基づいて設定した。図７に示す通り、すべての試料が、ＢＣＭＡ発現について陽性であるＣＤ１３８＋ＣＤ１９－細胞を小さい百分率で示した。幹細胞集団に対するＢＣＭＡ発現のレベルは、ＭＭ２７７を除き、形質細胞に対して認められたレベルと一般に同等であり、その場合、レベルは低下してもＢＣＭＡ発現について依然として陽性であった。
【0101】
本実施例の結果は、ＢＣＭＡが多発性骨髄腫がん幹細胞上で発現されることを示す。
【0102】
実施例７
本実施例は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９抗体薬剤コンジュゲートが多発性骨髄腫幹細胞を殺滅することを示す。
本実施例は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９抗体薬剤コンジュゲートが多発性骨髄腫幹細胞を殺滅することを示す。
【0103】
ＭＭ幹細胞がインビトロでコロニーを形成する能力があるとき（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２３３２－６（２００４））、ＡＤＣ１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９の、実施例２で特徴づけたＭＭ骨髄生検におけるクローン原性細胞を殺滅する能力を試験した。特に、細胞を、ＶｉＣＥＬＬ（商標）カウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて計数し、ＩＭＤＭ＋２％ＦＢＳに、プレーティング用に必要とされる密度よりも１０倍高い密度で再懸濁した。ＭＥＴＨＯＣＵＬＴ（商標）Ｈ４４３４ Ｃｌａｓｓｉｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を、製造業者の使用説明書に従い、ＭＭ２６３、ＭＭ２８４、及びＭＭ２７６について２０００個の細胞／ｍＬと、またＭＭ２７７について４０００個の細胞／ｍＬと混合した。次に、２５～４００ｎｇ／ｍＬの試験１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９及びＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦ ＡＤＣを、適切なチューブに添加した。対照ＩｇＧ１－ＳＧ３２４９抗体は、４００ｎｇ／ｍＬの高用量のみで添加した。すべてのチューブを徹底的にボルテックス混合し、次に静置しておき、気泡が上面まで上昇できるようにした。一旦気泡が上昇したら、４００μＬを１６ゲージの平滑末端針で除去し、２４ウェルの極低付着プレート（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）の１ウェルに慎重に蒔いた。各処置物は、プレートの内部ウェルに二通りに蒔いた。ＰＢＳを外部ウェルに添加し、プレートを３７℃で７～１０日間インキュベートした。Ｃｅｌｉｇｏ（登録商標）Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）上の走査プレートによるコロニー形成の記録とともに、コロニーを目視で計数した。図８に示す通り、４つすべての場合に、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９は、クローン原性細胞を殺滅することができた一方で、Ｊ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦはできなかった。試験した最高用量（４００ｎｇ／ｍＬ）で、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９は、ＭＭ２６３及びＭＭ２８４についてコロニーの１００％を、またＭＭ２７６及びＭＭ２７７については各々コロニーの８７．５％及び９１％を殺滅することができた。それに対し、４００ｎｇ／ｍＬのＪ６Ｍ０－ｍｃ－ＭＭＡＦは、ＭＭ２６３について形成されたコロニーの数を低減せず、ＭＭ２７６、ＭＭ２７７、及びＭＭ２８４についてのコロニー形成において、各々、１２．５％、４０％、及び５０％の減少をもたらすに過ぎなかった。
【0104】
本実施例の結果は、抗体薬剤コンジュゲート１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９がＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫がん幹細胞を標的にし、殺滅することを示す。
【0105】
実施例８
本実施例は、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いてインビトロで殺滅する方法を示す。
本実施例は、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞を、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いてインビトロで殺滅する方法を示す。
【0106】
ＳＧ３４００にコンジュゲートされた１５Ｂ２ＧＬを含む抗体薬剤コンジュゲートによる多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞株の殺滅を、実施例４に記載のように、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてインビトロで評価した。以下のＢＣＭＡを発現する細胞株：ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＥＪＭ、ＭＭ．１Ｒ．ＪＪＮ３、ＯＰＭ－２、ＭＭ．１Ｓ、Ｕ２６６．Ｂ１、及びＬ３６３を試験した。ＢＭＣＡ陰性細胞株Ｒａｊｉ及びＪｕｒｋａｔもまた試験した。抗体薬剤コンジュゲートを、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、５倍ストック（２５μｇ／ｍＬ）に希釈した。次に、処置物をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中で１：３に連続希釈した。この系列２０μＬを細胞に二通りに添加し、最高濃度での５μｇ／ｍＬから最低濃度での２．８×１０－５μｇ／ｍＬの範囲の、抗体薬剤コンジュゲートの１２ポイント用量曲線を得た。アイソタイプ抗体薬剤コンジュゲート（ＩｇＧ１－ＳＧ３４００）及び培地専用対照もまた含めた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で９６時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時、基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）１００μＬを各ウェルに添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、発光を測定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて分析及びグラフ化した。この実験の結果を図１０Ａ～１０Ｊに示す。
【0107】
本実施例の結果は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣが多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞をインビトロで殺滅することを示す
【0108】
実施例９
本実施例は、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いて、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞をインビボで殺滅する方法を示す。
本実施例は、本明細書に記載の抗体薬剤コンジュゲートを用いて、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病細胞をインビボで殺滅する方法を示す。
【0109】
ＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫又は形質細胞白血病細胞株（即ち、ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＭＭ．１Ｓ）をＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて雌ＣＢ－１７ ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨｓｄ－Ｐｒｋｄｃ－ｓｃｉｄ）マウスに移植することにより、多発性骨髄腫及び形質細胞白血病の皮下異種移植片マウスモデルを作製した。一旦腫瘍が約２００ｍｍ３（ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞）又は１８０ｍｍ３（ＭＭ．１Ｓ細胞）に達すると、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為化し、投与群に配置し、ＢＣＭＡ標的化ＡＤＣで処置した（下記の通り）。
【0110】
ＮＣＩ－Ｈ９２９異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１－ＳＧ３４００若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００を０．３ｍｇ／ｋｇ若しくは１ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００で処置したマウスを腫瘍移植後７４日間観察したが、図１１に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１－ＳＧ３４００若しくは０．３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００を０．３ｍｇ／ｋｇ若しくは１ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００で処置したマウスを腫瘍移植後７４日間観察したが、図１１に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0111】
ＭＭ．１Ｓ異種移植片モデル
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１－ＳＧ３４００若しくは１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００を１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。３ｍｇ／ｋｇのＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００で処置したマウスを腫瘍移植後８５日間観察したが、図１２に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
マウスを、単回静脈内用量１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１－ＳＧ３４００若しくは１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣのいずれかで処置するか、又はＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００を１ｍｇ／ｋｇ若しくは３ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。対照マウスは、未処置のままであった。３ｍｇ／ｋｇのＪ６Ｍ０－ＳＧ３４００で処置したマウスを腫瘍移植後８５日間観察したが、図１２に示す通り、腫瘍再増殖の証拠は認められなかった。投与群のいずれにおいても体重減少は認められなかった。
【0112】
本実施例の結果は、１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３４００ ＡＤＣがインビボで抗腫瘍有効性を呈することを示す。
【0113】
本実施例に記載のデータは、モノクローナル抗体１５Ｂ２ＧＬを含むＡＤＣが、ＭＭの前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を呈することを示す。重要なことに、インビトロ実験は、この活性がｓＢＣＭＡの存在下で維持されることを示唆する。これらのデータは、強力なＰＢＤペイロードを有する１５Ｂ２ＧＬ－ＳＧ３２４９ ＡＤＣが、大部分の骨髄腫形質細胞と、この遺伝的に異質性の疾患におけるより耐久性のある臨床応答のための機会を提供することがある、より静止状態のＣＤ１９＋／ＣＤ１３８－クローン原性細胞との双方を有効に標的にすることをさらに示す。
【0114】
本明細書に引用される出版物、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献はここで、あたかも各参考文献が参照により援用されるように個別且つ具体的に示され、その全体が本明細書において示されたのと同程度まで参照により援用される。
【0115】
本発明の説明との関連での（特に以下の特許請求の範囲との関連での）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」並びに類似の参照対象の使用は、本明細書中に別段の指示がない、又は文脈上明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の双方を包含するように解釈されるべきである。用語「少なくとも１つ」とそれに続く１以上の項目のリスト（例えば「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）は、本明細書中に別段の指示がない、又は文脈上明らかに矛盾しない限り、列挙項目（Ａ又はＢ）又は列挙項目の２以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）から選択される１つの項目を意味するように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、制限のない用語（即ち、「限定はされないが、～を含む」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、あくまで範囲内に含まれる別々の各値を個別に参照する簡潔な表現方法として役立つことが意図され、別々の各値は、あたかも本明細書中で個別に列挙されたように、本明細書中に包含される。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書中に別段の指示がない、又は特に文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施されうる。ありとあらゆる例、又は本明細書に提供される例示的用語（例えば「など」）の使用は、特別に主張されない限り、あくまで本発明をより十分に明確化し、本発明の範囲に対して限定を設けないことが意図される。本明細書中で、いずれの特許請求されない要素も本発明の実施にとって不可欠なものとして示すように解釈されるべき用語はない。
【0116】
本発明を実施するための発明者にとって公知のベストモードを含む、本発明の好ましい実施形態が、本明細書に説明される。それら好ましい実施形態の変更は、前述の説明の通読時に、当業者にとって明白となってもよい。本発明者は、当業者がかかる変更を適宜利用することを想定し、また本発明者は、本発明が、本明細書で詳細に説明されるよりも異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容される通り、本明細書に貼付される特許請求の範囲中で述べられる主題のあらゆる修飾及び均等物を含む。さらに、そのあらゆる考えられる変更における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書中に別段の指示がない、又は特に文脈上明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】