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特許7150885トランスポーター阻害剤を含有する医薬品、医薬組成物及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-09-30
(45)【発行日】2022-10-11
(54)【発明の名称】トランスポーター阻害剤を含有する医薬品、医薬組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/136 20060101AFI20221003BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20221003BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221003BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221003BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221003BHJP
【ＦＩ】
A61K31/136
A61K31/198
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020568583
(86)(22)【出願日】2019-02-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-29
(86)【国際出願番号】 CN2019074548
(87)【国際公開番号】W WO2019165884
(87)【国際公開日】2019-09-06
【審査請求日】2020-11-09
(31)【優先権主張番号】201810176164.8
(32)【優先日】2018-03-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】506032129
【氏名又は名称】中国医学科学院基礎医学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(72)【発明者】
【氏名】黄 波
(72)【発明者】
【氏名】劉 玉英
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】Chiu, M. et al.，GPNA inhibits the sodium-independent transport system L for neutral amino acids，Amino Acids，2017年，Vol.49, No.8，p.1365-1372，doi:10.1007/s00726-017-2436-z
【文献】Kim, C. S. et al.，BCH, an inhibitor of system L amino acid transporters, induces apoptosis in cancer cells，Biological & Pharmaceutical Bulletin，2008年，Vol.31, No.6，p.1096-1100，doi:10.1248/bpb.31.1096
【文献】Imai, H. et al.，Inhibition of L-type amino acid transporter 1 has antitumor activity in non-small cell lung cancer，Anticancer Research，2010年，Vol.30, No.12，p.4819-4828
【文献】Hassanein, M. et al.，Targeting SLC1a5-mediated glutamine dependence in non-small cell lung cancer，International Journal of Cancer，2015年，Vol.137, No.7，p.1587-1597，doi:10.1002/ijc.29535
【文献】免疫チェックポイント阻害薬と抗体医薬の併用，小澤 雄一，がん分子標的治療，2016年07月，第14巻, 第2号，p.217-221
【文献】Zhang, Y. et al.，Programmed death-1 upregulation is correlated with dysfunction of tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes in human non-small cell lung cancer，Cellular & Molecular Immunology，2010年，Vol.7, Vol.5，p.389-395，doi:10.1038/cmi.2010.28
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００－４５／０８
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
ＰｕｂＭｅｄ
医中誌ＷＥＢ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を予防又は治療するための医薬品の製造における、トランスポーター阻害剤の使用であって、前記トランスポーターが、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４から選択され、
前記トランスポーター阻害剤が、Ｌ－γ－グルタミル－ｐ－ニトロアニリド（ＧＰＮＡ）、サルコシン（ＳＡＲ）、２-アミノ-２-ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上である、使用。
【請求項2】
前記疾患は、ＰＤ-１の発現上昇を伴うメラノーマ、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肝臓がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う乳がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肺がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う結腸直腸がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う卵巣がん、及びＰＤ-１の発現上昇を伴う白血病から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記医薬品は、さらに、その他のＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を治療する試薬を含み、前記その他の試薬は、免疫調節剤、ＩＤＯ阻害剤、ＡｈＲ阻害剤、放射線治療剤、及び化学療法剤から選択される１種以上であり、
前記免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーター、及び、細胞性免疫応答を促進する抗原提示を促進あるいは媒介する試薬から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項4】
前記医薬品は、前記トランスポーター阻害剤と、その他のＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を治療する医薬品との併用によってＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を予防又は治療するための医薬品である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項5】
前記その他の医薬品は、免疫調節剤、ＩＤＯ阻害剤、ＡｈＲ阻害剤、放射線治療剤、及び化学療法剤から選択される１種以上であり、前記免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーター、及び、細胞性免疫応答を促進する抗原提示を促進あるいは媒介する試薬から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
トランスポーター阻害剤を含む医薬品であって、前記トランスポーターが、ＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４から選択され、
前記トランスポーター阻害剤が、Ｌ－γ－グルタミル－ｐ－ニトロアニリド（ＧＰＮＡ）、サルコシン（ＳＡＲ）、２-アミノ-２-ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上である、ＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を予防又は治療するための医薬品。
【請求項7】
さらにその他のＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍疾患を治療する試薬を含み、前記その他の試薬は、免疫調節剤、ＩＤＯ阻害剤、ＡｈＲ阻害剤、放射線治療剤、及び化学療法剤から選択される１種以上であり、
前記免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーター、及び、細胞性免疫応答を促進する抗原提示を促進あるいは媒介する試薬から選択される、請求項６に記載の医薬品。
【請求項8】
前記疾患は、ＰＤ-１の発現上昇を伴うメラノーマ、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肝臓がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う乳がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肺がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う結腸直腸がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う卵巣がん、及びＰＤ-１の発現上昇を伴う白血病から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子生物学、医薬品及び腫瘍学の分野に関する。より具体的には、トランスポーター阻害剤を含有する医薬品、医薬組成物及びその使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍は、依然として人間の健康に対する最も致命的な脅威の１つである。それによる死亡の原因は、固形腫瘍にあることが多い。いくつかの腫瘍の治療が大幅に改善されていたが、腫瘍の全体的な５年生存率が、過去２０年間において約１０％しか改善されていなかった。腫瘍又は悪性腫瘍は、無秩序に急速に増殖や転移するため、素早く検出して治療することが極めて困難である。
【0003】
腫瘍の免疫療法は、手術、放射線療法、化学療法に続くがん治療法であり、がん治療に明らかな効果を持つ。かかる方法は、人体自身の免疫システムを活性化することで、腫瘍細胞に対抗して殺すものであって、がん治療の未来の開発方向の１つである。
【0004】
患者によって異なる免疫療法を使用すると、異なる情報が示されるので、腫瘍の免疫療法の効果をモニタリングするために、腫瘍の免疫療法を利用する患者に対して特異免疫システムの評価をする必要がある。
【0005】
プログラム細胞死受容体１（ＰＤ-１）は、慢性感染症、妊娠、組織同種移植片、自己免疫疾患、及び腫瘍中の免疫システムの応答の阻害に関わるタンパク質である。ＰＤ-Ｌ１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単核細胞の表面に発現する、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ-１）と呼ばれる抑制性受容体に結合することにより免疫応答を調節する。ＰＤ-１免疫療法の作用機序としては、ＰＤ-１又はＰＤ-Ｌ１に対して特定のタンパク質抗体を設計し、ＰＤ-１とＰＤ-Ｌ１の認識を阻止し、抗原特異性を有する腫瘍特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）の機能の一部を回復することによって、腫瘍細胞を死滅させることができる。
【0006】
しかしながら、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ-１）抗体は、多くの腫瘍種の臨床応用に成功していたが、腫瘍微小環境において、ＰＤ-１が腫瘍特異的細胞毒性ＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）でどのように調節しているかという潜在的なメカニズムについて、依然として十分に明らかにしていない。一方、腫瘍の再発と残りの腫瘍形成細胞との関連性を考慮すると、ＰＤ-１シグナル伝達の阻害効果が解除されたとしても、ＣＴＬは、再増殖できるがん幹細胞「腫瘍再増殖細胞（ＴＲＣ）」を破壊できない可能性がある。これらのＴＲＣｓは、自己再生型で腫瘍形成性の高いがん細胞サブポピュレーションであり、腫瘍形成の開始、促進及び進化において重要な役割を果たしている。
【0007】
また、最初に優れた治療結果が現れた患者群でも、その一部に再発が現れることがある。したがって、医療関係者は、依然として腫瘍疾患の治療用の新たな技術を必要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、以上の課題を解決するために、新たな腫瘍疾患を治療するするための技術を提供する。前記技術によれば、医薬品、及び前記医薬品を用いてＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患、特にＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍を治療する治療方法を提供する。
【0009】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を予防又は治療するための医薬品の製造における、トランスポーター阻害剤の使用を提供する。
【0011】
本発明において、前記疾患は、ＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍発生によって引き起こされる疾患から選択される。前記ＰＤ-１の発現上昇を伴う腫瘍発生によって引き起こされる疾患は、ＰＤ-１の発現上昇を伴うメラノーマ、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肝臓がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う乳がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う肺がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う結腸直腸がん、ＰＤ-１の発現上昇を伴う卵巣がん、及びＰＤ-１の発現上昇を伴う白血病から選択される１種以上であることが好ましい。
【0012】
本発明において、前記トランスポーターは、トリプトファントランスポーターとＫｙｎトランスポーターのいずれか一方又はその組み合わせから選択される。前記トリプトファントランスポーターはＳＬＣ１Ａ５から選択され、前記ＫｙｎトランスポーターはＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４から選択されることが好ましい。
【0013】
本発明において、前記トランスポーター阻害剤は、ＧＰＮＡ、ＳＡＲ、ＢＣＨ及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上であってもよい。
【0014】
本発明において、前記医薬品は、さらに、その他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する試薬を含む。前記その他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する試薬は、免疫調節剤、ＩＤＯ阻害剤、ＡｈＲ阻害剤、放射線治療剤及び化学療法剤から選択される１種以上であることが好ましい。前記免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーター、及び、細胞性免疫応答を促進する抗原提示を促進あるいは媒介する試薬から選択してもよい。
【0015】
本発明は、さらに、トランスポーター阻害剤と、その他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する医薬品との併用による、ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を予防又は治療するための医薬品の製造における、トランスポーター阻害剤の使用を提供する。
【0016】
本発明において、前記ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する医薬品は、請求項５に記載のその他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する試薬から選択される。
【0017】
本発明は、さらに、ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を予防又は治療するための、トランスポーター阻害剤を含む医薬品を提供する。
【0018】
本発明において、前記トランスポーターは、トリプトファントランスポーターとＫｙｎトランスポーターのいずれか一方又はその組み合わせから選択される。前記トリプトファントランスポーターはＳＬＣ１Ａ５から選択され、前記ＫｙｎトランスポーターはＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４から選択されることが好ましい。前記トランスポーター阻害剤は、ＧＰＮＡ、ＳＡＲ、ＢＣＨ及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上であってもよい。
【0019】
本発明において、前記医薬品は、さらに、請求項５に記載のその他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する試薬を含む。
【0020】
本発明は、さらに、予防又は治療に有効の量の医薬品を投与するステップを含むことを特徴とする、ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0021】
本発明において、前記方法は、さらに、治療に有効の量の請求項５に記載のその他のＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を治療する試薬を投与するステップを含み、前記方法は、さらに手術治療ステップを含んでもよい。
【0022】
本発明において、前記医薬品は、さらに医薬品添加物を含む。
【発明の効果】
【0023】
本発明により提供される医薬品は、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を効果的に低減させ、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷を増強することができる。
【0024】
必要に応じて、本発明により提供される医薬品及び前記医薬品の投与又はその他の関連医薬品との組み合わせによれば、ＰＤ-１の発現上昇を伴う疾患を、効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図8】図８は、特異的ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現に対する、腫瘍細胞トリプトファントランスポーターＳＬＣ１Ａ５の阻害効果の測定結果を示す。ここで、図８Ａは、ＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマ細胞培養系にＩＦＮ-γを添加し、トリプトファントランスポーターＳＬＣ１Ａ５阻害剤ＧＰＮＡを添加した場合の、腫瘍細胞によるトリプトファンの取り込みの測定結果を示す。図８Ｂは、３Ｄ培養したＯＶＡ-Ｂ１６細胞と特異的なＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞とを共培養し、培養系にＳＬＣ１Ａ５阻害剤ＧＰＮＡを添加した場合の、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現への影響の測定結果を示す。
【図9】図９は、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現に対する、マウスＣＤ８+Ｔ細胞ＫｙｎトランスポーターＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８の阻害効果の測定結果を示す。ここで、図９Ａは、活性化されたＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞培養系にＫｙｎを添加し、トランスポーターＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８の発現の測定結果を示す。図９Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して活性化されたＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞に、Ｋｙｎを添加するとともに、ＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８阻害剤ＳＡＲとＢＣＨを添加し場合の、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現に対するＳＡＲとＢＣＨの影響の測定結果を示す。図９Ｃは、３Ｄ培養したＯＶＡ-Ｂ１６細胞と特異的なＯＴ-１ ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養し、培養系にＳＡＲ又はＢＣＨを添加し場合の、特異的なＴ細胞による腫瘍細胞の殺傷の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
【0027】
請求の範囲及び/又は明細書において、「含む」という用語と併用する場合、用語「一（ａ）」又は「一（ａｎ）」とは、「１つ」を意味することがあるが、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は１つ超え」を意味することもある。
【0028】
請求の範囲及び明細書で使用される「含む」、「有する」、「包括する」又は「含有する」という用語は、包括的又はオープン的な形式であって、その他のものや引用されていない素子または方法ステップを排除しないことを意味する。
【0029】
出願書類の全体において、「約」という用語とは、係る数値が、その値を測定するために使用される装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを意味する。
【0030】
開示された内容において、「又は」という用語とは、代替物のみと、「及び/又は」との両方の意味に定義されるが、代替物のみ、又は、代替物がお互い排他的な関係にあると記載されていない限り、請求の範囲に記載の「又は」という用語は「及び/又は」を意味する。
【0031】
「トランスポーター」又は「輸送体」という用語は、組織の細胞膜上のキャリアタンパク質の一つを指す。本発明において、前記用語は互換的に使用でき、同じ意味を表す。
【0032】
「医薬品」という用語とは、疾患を予防又は治療できる物質と定義する。医薬品は、疾患を治療するための１つの有効成分を含んでもよく、疾患を治療するための二つ以上の有効成分を含んでもよい。必要に応じて、前記医薬品はワクチンであってもよい。前記「医薬品」には、必要に応じて、例えば医薬品の保存期間の延長、安定性に寄与する成分や、より患者に吸収しやすい成分を添加してもよい。例示的に、前記成分は医薬品添加物から選択されてもよい。
【0033】
用語「免疫調節剤」は、免疫チェックポイントモジュレーターを含み、例えば、免疫チェックポイントタンパク質受容体及びそのリガンドは、Ｔ細胞媒介性細胞毒性の阻害を媒介して、通常、腫瘍又は腫瘍微小環境における不応答性Ｔ細胞によって発現され、腫瘍を免疫攻撃から逃避させる。免疫チェックポイントタンパク質受容体及びそのリガンドの活性の阻害剤は、腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞の攻撃が可能になるように、免疫抑制性腫瘍環境を克服することができる。免疫チェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ-１、ＰＤ-Ｌ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、及びＣＤ１０３が挙げられるが、これらに限定されない。このようなタンパク質の活性の調節（阻害を含む）は、免疫チェックポイントモジュレーターによって達成でき、例えばチェックポイントタンパク質をターゲットとする抗体、アプタマー、小分子、及びチェックポイント受容体タンパク質の可溶性形態等を含み得る。ＰＤ-１を標的とした阻害剤には、承認された医薬品試薬であるペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）とニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）が含まれ、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）は承認されたＣＴＬＡ-４阻害剤である。ＰＤ-Ｌ１、ＰＤ-Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１０３に特異的な抗体は既知及び/又は商品化されており、当業者で製造することもできる。
【0034】
免疫調節剤は、免疫チェックポイントモジュレーターに加えて、細胞性免疫応答を促進する抗原提示を媒介又は促進する試薬を含む。このような免疫調節剤は、例えば腫瘍抗原ワクチンを含むことができる。腫瘍抗原ワクチンには、特定の腫瘍抗原又は既知の腫瘍抗原のセットを含有する製剤を含んでもよく、被験者自身の樹状細胞又はアジュバントを有してもよい。或いは、腫瘍抗原ワクチンには、患者の腫瘍に由来する腫瘍細胞抗原の比較的粗い製剤を含んでよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで患者の細胞から生成された樹状細胞にエクスビボで曝露されると、樹状細胞ワクチンが患者に導入されたときに、Ｔ細胞を介して腫瘍を攻撃することが可能になる。一実施形態においては、免疫調節剤は腫瘍抗原ワクチンを含む。別の実施形態においては、腫瘍抗原ワクチンは樹状細胞腫瘍抗原ワクチンを含む。
【0035】
用語「ＩＤＯ」（インドールアミン２,３-ジオキシゲナーゼ）とは、トリプトファンの代謝に関わるプロテアーゼの一種を指す。インドールアミン２,３-ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）は、免疫細胞の機能を抑制的な表現型に調節するため、腫瘍が宿主の免疫監視から逃す原因の一部となる。ＩＤＯ１は、必須アミノ酸のトリプトファンをキヌレニンとその他の代謝産物に分解する。これらの代謝産物とトリプトファンの欠如は、エフェクターＴ細胞機能の阻害と制御性Ｔ細胞の分化の促進に繋がる。ＩＤＯ阻害剤は、既知及び/又は商品化されており、当業者で製造することもできる。
【0036】
用語「キヌレニン（ｋｙｎｕｒｅｎｉｎｅ,Ｋｙｎ）」とは、人体におけるトリプトファンの代謝中間体を指す。
【0037】
用語「ＡｈＲ（アリール炭化水素受容体）阻害剤」又は「ＡｈＲアンタゴニスト」とは、１種以上のＡｈＲシグナル伝達と構成的ＡｈＲシグナル伝達を含む下流エフェクター経路とを阻害する薬剤または化合物を指す。したがって、用語ＡｈＲ阻害剤とは、ＡｈＲポリペプチド又はＡｈＲをコードするポリヌクレオチドの発現を阻害するか、または結合して、前記ＡｈＲポリペプチド又はＡｈＲをコードするポリヌクレオチドの刺激を部分的に又は完全に遮断するか、前述ＡｈＲポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性化を低減、防止、遅延するか、前記ＡｈＲポリペプチド又はＡｈＲをコードするポリヌクレオチドの活性を不活性化、脱感作又はダウンレギュレーションする、薬剤を指す。このようなＡｈＲ阻害剤は、例えばＡｈＲ翻訳、ＡｈＲの翻訳後プロセシング、ＡｈＲポリペプチドの安定、分解或いは核局在や細胞質局在、又は、ＡｈＲをコードするポリヌクレオチドの転写、転写後プロセシング、安定或いは分解といったＡｈＲ発現をブロックすることができ、または、結合して、刺激作用、ＤＮＡ結合、或いはＡｈＲの転写因子活性を、部分的或いは完全にブロックすることができる。ＡｈＲ阻害剤は、直接的又は間接的に作用できる。ＡｈＲ阻害剤は既知及び/又は商品化されており、当業者によって製造することもできる。
【0038】
用語「放射線治療剤」とは、ＤＮＡ損傷を引き起こす薬物の使用も含まれる。放射線療法は、癌と疾患の治療に広く使用されており、通常ガンマ線、Ｘ線と呼ばれるもの、及び/又は腫瘍細胞への放射性同位元素の標的化された送達が含まれる。
【0039】
用語「化学療法剤」とは、癌の治療するに使用できる化学的化合物を指す。化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、キナーゼ阻害剤、紡錘体毒物植物アルカロイド、細胞毒性/抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、光増感剤、抗エストロゲンと選択性エストロゲン受容体モジュレーター、抗プロゲステロン、エストロゲン受容体ダウンレギュレーション剤、エストロゲン受容体拮抗剤、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、抗アンドロゲン類、アロマターゼ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、異常な細胞増殖または腫瘍増殖に関与する遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の治療方法に使用できる化学療法剤は、細胞増殖阻害剤及び/又は細胞毒性剤が含まれる。
【0040】
用語「医薬品添加物」とは、医薬品製剤の基本的な材料と重要な組成部分を示す。医薬品添加物、薬物の特定の剤形を与えるだけでなく、薬物の効能の向上及び副作用の低減にも大きく関連する。医薬品添加物は、成形、ベクターとしての機能、安定性の向上に加えて、可溶化、溶解補助、徐放等の重要な機能を備えるものであって、薬品の品質、安全性および有効性に影響を与えられる重要な成分である。前記医薬品添加物は、溶媒、噴射剤、可溶化剤、溶解補助剤、乳化剤、着色剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、滑剤、濡れ剤、浸透圧調節剤、安定剤、流動促進剤、矯味剤、防腐剤、懸濁剤、コーティング材、芳香剤、付着防止剤、統合剤、浸透促進剤、ｐＨ調整剤、バッファー、可塑剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、クラスレート剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤、凝集防止剤、濾過助剤、リリースブロッカー等のタイプに分類できる。
【0041】
実施例
【0042】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例（本開示の具体的な実施形態として示される。）は、説明のために示されるものだけであり、係る詳細な説明を読んだ後、本開示の要旨及び範囲内で様々な変更及び修正ができることは、当業者であれば理解できる。
【0043】
本発明で使用される実験動物、試薬及び消耗品は以下の通りである。
【0044】
メスのＣ５７ＢＬ/６マウス（６～８週齢）、ＯＴ-Ｉトランスジェニックマウス、Ｐｍｅｌ-１トランスジェニックマウス、ＡｈＲ-/-マウス、ＭＭＴＶ-ＰｙＭＴマウスは、いずれも商業機関から購入した。これらの動物は、病原体なしの条件下で出願人の対応施設に保管された。マウスに関するすべての研究は、動物管理委員会によって承認された。
【0045】
マウス腫瘍細胞株ＯＶＡ-Ｂ１６（メラノーマ）、Ｈ２２（肝臓がん）、ＩＤ８（卵巣がん）、ヒト腫瘍細胞株Ａ３７５（メラノーマ）およびＨｅｐＧ２（肝臓がん）は、中国典型培養物寄託センター（中国北京）から購入したものであり、Ｈ２２細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）で培養した以外、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。
【0046】
Ｏｒｉｇｅｎｅ（ＭＤ,ＵＳＡ）から、ｐＧＦＰ-Ｃ-ｓｈＬｅｎｔｉ-ｓｈＩＤＯ１、ｐＧＦＰ-Ｃ-ｓｈＬｅｎｔｉ-ｓｈＳＬＣ１Ａ５、ｐＧＦＰ-Ｖ-ＲＳ-ｓｈＰＡＴ４、ｐＧＦＰ-Ｖ-ＲＳ-ｓｈＳＬＣ７Ａ８、およびｐＣＭＶ６-Ｅｎｔｒｙ-ＤＤＫ-ＳＬＣ１Ａ５を購入した。キヌレニン、キヌレン酸、インドキシル硫酸、メラトニン、１-Ｌ-ＭＴ、３',４'-ジメトキシフラボン（ＤＭＦ）、ＴＣＤＤ、サルコシン（ＳＡＲ）、２-アミノ-２-ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）、Ｌ－γ－グルタミル－ｐ－ニトロアニリド（ＧＰＮＡ）、および抗ＰＡＴ４抗体は、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳＴ、ＵＳＡ）から購入した。シクロスポリンＡは、ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。抗ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-α、ＰＤ-１とＰＤ-Ｌ１中和抗体、及び抗ＰＤ-１、ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-αとＣＤ１０７ａ抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ＩＦＮ-γは、Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。サケフィブリノーゲン、トロンビン、およびディスパーゼは、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ピューロマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳＤ、ＵＳＡ）から購入した。
【0047】
ヒト末梢血、切除されたヒト乳がん又は結腸直腸がん組織は、病院の患者から入手した。倫理的な許可は、対応する病院の臨床試験倫理委員会によって付与された。すべての患者は、研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供した。
【0048】
実験方法
【0049】
（１）バイオマーカーの検出方法
【0050】
前記方法は、いずれも、バイオマーカーのタンパク質発現レベルを測定することでバイオマーカーの存在及び/又は発現レベル/量を計測した。いくつかの実施形態では、前記方法は、バイオマーカーとの結合が可能な条件下で、生体試料を本明細書で記載のバイオマーカーに特異的に結合できる抗体（例えば抗ＰＤ-１抗体）と接触させ、抗体とバイオマーカーとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することが含まれる。このような方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはＩｎ ｖｉｖｏの方法であり得る。いくつかの場合において、例えば個人のバイオマーカーを選択するために、抗体を使用することで結合拮抗剤療法の使用に適格な対象を選択した。当技術分野で既知または本明細書で提供されたタンパク質発現レベルを測定する方法であれば、いずれも使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、フローサイトメトリー（例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳＴＭ））、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロット、イムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、分光法、質量分析、及びＨＰＬＣからなる群より選択される方法を用いてバイオマーカー（例えばＰＤ-１）のタンパク質発現レベルを測定した。
【0051】
（２）２Ｄ硬質シャーレ又は３Ｄフィブリンゲルで培養された腫瘍細胞
【0052】
従来の２Ｄ細胞培養について、完全培地を有する硬質シャーレで腫瘍細胞を維持した。具体的に、Ｔ７緩衝液（ｐＨ ７.４,５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてフィブリノゲン（Ｓｅａｒｕｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒｅｅｐｏｒｔ、ＭＥ）を２ｍｇ/ｍｌまで希釈した。その後、フィブリノゲンと細胞溶液の１：１（体積）混合物を作成した。２５０μｌの細胞/フィブリノゲン混合物を２４ウェルプレートに接種して、あらかじめ添加された５μｌのトロンビン（０.１Ｕ/μｌ、Ｓｅａｒｕｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）と十分に混合した。３７℃で３０分間インキュベートした後、これらの細胞に１ｍｌの完全培地を追加した。培養５日間後、ディスパーゼＩＩを入れて、３７℃で培養したゲルを１０分間消化させた。スフェロイドを採取し、さらに０.２５％トリプシンで３分間消化して以下の実験用の単一細胞の懸濁液を得た。
【0053】
（３）統計分析手法
【0054】
すべての実験は少なくとも３回行われた。結果は、平均値±ＳＥＭとして表される。分析はＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ検定によって行われた。Ｐ値<０.０５の場合、統計的に有意であると判断される。分析はＧｒａｐｈｐａｄ ６.０ソフトウェアを使用して実行した。サンプルの除外は行われていなかった。
【0055】
実施例１：腫瘍特異的ＣＤ８
+
Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現は、ＩＦＮ-γで刺激されたＴＲＣによって誘導される
【0056】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0057】
（１）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬを、単独で、又は従来の培養フラスコからのＯＶＡ-Ｂ１６細胞（分化したＯＶＡ-Ｂ１６）或いは３Ｄフィブリンマトリックスで成長したＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣと共に２４時間培養した。ＰＤ-１の発現は、フローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図１Ａに示す。
【0058】
（２）ＣＴＬと、分化されたＯＶＡ-Ｂ１６細胞又はＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとの共培養上清又は完全培地（陰性対照）を凍結乾燥により濃縮し、抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで活性化されたＯＶＡ-ＣＴＬと２４時間インキュベートした。ＰＤ-１の発現は、フローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図１Ｂに示す。
【0059】
（３）ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬを２４時間インキュベートし、上清をＥＬＩＳＡで分析した。測定の結果を図１Ｃに示す。
【0060】
（４）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬとＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとを２４時間共培養した。Ｔ細胞と腫瘍細胞におけるＩＦＮ-γの生成をフローサイトメトリーにより分析した。測定の結果を図１Ｄに示す。
【0061】
（５）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬを、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）、又はＩＦＮ-γで刺激したＣＴＬ或いはＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣの条件培地で２４時間処理した。その後、ＯＶＡ-ＣＴＬのＰＤ-１の発現をフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図１Ｅに示す。
【0062】
（６）従来の培養フラスコからのＯＶＡ-Ｂ１６細胞又は３ＤフィブリンゲルからのＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣと、抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬとを１:３０の比率で４時間共培養した。ＣＤ４５-腫瘍細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図１Ｆに示す。
【0063】
（７）抗ＰＤ-１中和抗体又はＩｇＧアイソタイプコントロール（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の存在下で、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣと抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬとを１:３０の比率で共培養した。４時間後、細胞生存率をフローサイトメトリーにより分析した。測定の結果を図１Ｇに示す。
【0064】
実施例１の結果から分かるように、モデル腫瘍抗原卵白アルブミン（ＯＶＡ）を発現するＢ１６メラノーマＴＲＣ及びＯＴ-１ Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス由来のＯＶＡ-特異的ＣＴＬを使用することで、ＴＲＣが抗-ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化（ｂｅａｄ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＯＴ-１ Ｔ細胞を強く誘導し、共培養（ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）の期間中でＰＤ-１の発現をアップレギュレートした（図１Ａ）。このようなＰＤ-１のアップレギュレートは、ｇｐ１００-特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＯＶＡペプチド活性化ＯＴ-１細胞にも確認された。なお、ＰＤ-１＋細胞の前記増加は、ＰＤ-１－細胞の枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）又はＰＤ-１＋細胞の増幅によらず、ＰＤ-１－からＰＤ-１＋Ｔ細胞への形質転換によるものである。ＰＤ-１－からＰＤ-１＋Ｔ細胞への形質転換は、ＰＤ-１－ＯＴ-１細胞とＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとの共培養においてＰＤ-１＋Ｔ細胞が産生したことや、ＰＤ-１+細胞をＴＲＣと共培養または共培養しない場合、ＰＤ-１＋Ｔ細胞の増殖が変化せず、ＰＤ-１の発現がアップレギュレートしたことによるものである。また、前記共培養上清は、無関係なＣＤ８+Ｔ細胞においてＰＤ-１の発現をアップレギュレートすることができる（図１Ｂ）。これは、ＴＲＣ又はＴ細胞自体がある因子を放出してＰＤ-１の発現を誘導することを示している。Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を増強する細胞の相互作用により生成する因子を特定したところ、本発明者らは、ＴＲＣ単培養からの上清はＰＤ-１の発現をアップレギュレートすることができないことが分かった。これは、ＰＤ-１をアップレギュレートする可溶性因子を生成するためには、Ｔ細胞が必要とすることを示している。活性化されたＴ細胞は上清に多量の細胞因子を放出し、特にＩＦＮ-γの放出が顕著である（図１Ｃ）。明らかなように、ＩＦＮ-γ中和が前記ＰＤ-１上昇を阻害したが、ＴＮＦ-α中和がＰＤ-１上昇を阻害しない。これと一致して、ＩＦＮ-γはＯＴ-１細胞のみで発現され、ＴＲＣによって発現されないことが分かった（図１Ｄ）。ＩＦＮ-γを重要な分子として認識したので、本発明者らは、Ｔ細胞とＴＲＣを組み換えＩＦＮ-γで別途処理し、ＩＦＮ-γで処理したＴＲＣの上清のみがＴ細胞のＰＤ-１の発現をアップレギュレートできることが分かった（図１Ｅ）。従って、これらのデータは、ＴＲＣと腫瘍浸潤性Ｔ細胞とが相互作用をする際に、Ｔ細胞によって生成されたＩＦＮ-γが直接にＴＲＣを刺激して、ＰＤ-１の発現を促進する因子を放出することを示している。ここでは、本発明者らはさらに、当該アップレギュレートされたＰＤ-１は機能していることも確認した。本発明者らは、ＯＶＡ特異的ＣＴＬは、前記共培養でＯＶＡ-ＴＲＣを殺傷することが困難である（図１Ｆ）が、中和された抗ＰＤ-１抗体を添加すると、ＣＴＬによるＴＲＣの殺傷を大幅に向上することができる（図１Ｇ）ことが分かった。抗ＰＤ-１抗体の効果は、ＰＤ-Ｌ１のアップレギュレーションによるものではない。確かに、ＩＦＮ-γはＰＤ-Ｌ１の発現をアップレギュレートしたが、共培養への抗ＰＤ-Ｌ１抗体の補充は、ＴＲＣの殺傷になんの影響も与えなかった。
【0065】
実施例２：ＴＲＣにより生成されたキヌレニンがＰＤ-１のアップレギュレーションを媒介したことが確認され、また、ＩＦＮ-γがＴＲＣでトリプトファン輸送タンパク質ＳＬＣ１Ａ５をアップレギュレートしてＴｒｐの取り込みとＫｙｎの生成を促進した
【0066】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0067】
（１）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬと、従来の培養フラスコからのＯＶＡ-Ｂ１６細胞又は３Ｄフィブリンマトリックスで成長したＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとを２４時間共培養した。上清中のＫｙｎをＥＬＩＳＡで測定した。測定の結果を図２Ａに示す。
【0068】
（２）抗ＩＦＮ-γ中和抗体又はアイソタイプコントロールの存在下で、ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＶＡ-ＣＴＬとＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとを２４時間共培養した。上清中のＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。測定の結果を図２Ｂに示す。
【0069】
（３）培養フラスコで培養したＯＶＡ-Ｂ１６細胞又はＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣをＩＦＮ-γ（１０ｎｇ/ｍｌ）で２４時間処理した。上清中のＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。測定の結果を図２Ｃに示す。
【0070】
（４）異なる濃度のＫｙｎの存在下で、分離された膵臓ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズとをインキュベートした。ＰＤ-１の発現はフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図２Ｄに示す。
【0071】
（５）２００μＭ Ｋｙｎを用いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を示されているような異なる時間で処理した以外、（４）と同様である。測定の結果を図２Ｅに示す。
【0072】
（６）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＴＬを、ＰＢＳ、２００μＭ Ｋｙｎ又はトリプトファン経路からのその他の代謝産物（５００μＭ）（メラトニン、キヌレニン酸（ｋｙｎｕｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）とインドキシル硫酸塩）で処理した。２４時間後、ＰＤ-１の発現をフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図２Ｆに示す。
【0073】
（７）対照（ｓｃｒａｍｂｌｅ）又はｓｈＩＤＯ１-（Ｓｈ１又はＳｈ２）-ＯＶＡ Ｂ１６ ＴＲＣと抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＴ-１ Ｔ細胞とを共培養した。４時間又は２４時間後、ＴＲＣアポトーシス（図２Ｇ）又はＴ細胞のＰＤ-１発現（図２Ｈ）をフローサイトメトリーにより分析した。分析の結果をそれぞれ図２Ｇと図２Ｈに示す。
【0074】
（８）ＩＦＮ-γの存在下または非存在下で、対照とｓｈＳＬＣ１Ａ５-（Ｓｈ１又はＳｈ２）-Ｂ１６ ＴＲＣにおいて、ＥＬＩＳＡにより細胞ライセートのトリプトファンレベルを２４時間測定した。測定の結果を図２Ｉに示す。
【0075】
（９）対照とｓｈＳＬＣ１Ａ５-（Ｓｈ１又はＳｈ２）-ＯＶＡ Ｂ１６ ＴＲＣと抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＯＴ-１ Ｔ細胞とを共培養した。４時間又は２４時間後、ＴＲＣアポトーシス（図２Ｊ）又はＰＤ-１の発現（図２Ｋ）をフローサイトメトリーにより分析した。分析の結果をそれぞれ図２Ｊと図２Ｋに示す。
【0076】
（１０）Ｂ１６ ＴＲＣをベクター又はＦｌａｇ-ＳＬＣ１Ａ５プラスミドで一過性にトランスフェクトした。ＳＬＣ１Ａ５の過剰発現はウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）（左）で確認した。上清中のトリプトファンレベルをＥＬＩＳＡで測定し、Ｔｒｐ消費を算出した（右）。確認結果を図２Ｌに示す。
【0077】
（１１）ベクター（Ｖｅｃ-）又はリジッドプレート（ｒｉｇｉｄ ｐｌａｔｅ）で培養したＳＬＣ１Ａ５-Ｂ１６細胞をＰＢＳ又はＩＦＮ-γ（１０ｎｇ/ｍｌ）で２４時間処理した。上清中のＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡで測定した。測定の結果を図２Ｍに示す。*ｐ<０.０５、**ｐ<０.０１。データは平均値±ＳＥＭを表す。
【0078】
実施例２の結果から分かるように、分化したＢ１６細胞-Ｔ細胞と共培養の上清と比較して、Ｂ１６ＴＲＣ-Ｔ細胞と共培養の上清においてより高いレベルのＫｙｎが見られ（図２Ａ）。そして、ＩＦＮ-γ中和は、Ｋｙｎの生成を阻害した（図２Ｂ）。この結果と一致して、本発明者らは、ＩＦＮ-γが、分化したＢ１６細胞ではなくＢ１６ ＴＲＣを直接刺激することで、より高レベルのＫｙｎを放出できることを発見した（図２Ｃ）。また、その他の腫瘍種（マウスＨ２２肝臓がんとヒトＡ３７５メラノーマ）から生成したＴＲＣも、ＩＦＮ-γ刺激下でかなりの量のＫｙｎを放出した。ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣがＫｙｎを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ-１発現をアップレギュレートしたことを確認するために、抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズの存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞にＫｙｎを直接添加したところ、Ｔ細胞が用量及び時間と依存するようにＰＤ-１発現を顕著にアップレギュレートした（図２Ｄと２Ｅ）。本発明者らは、さらに、Ｋｙｎが増加したＰＤ-１＋細胞は、ＰＤ-１－からＰＤ-１＋Ｔ細胞への形質転換によるものであり、ＰＤ-１－の枯渇又はＰＤ-１＋細胞の増幅によるものではないことを判明した。Ｋｙｎ以外、その他のトリプトファン分解代謝産物（キヌレン酸、インドキシル硫酸とメラトニン）についても、ＰＤ-１発現をアップレギュレートする能力をテストした。しかしながら、それらの中で、Ｔ細胞上のＰＤ-１の発現を変えられるものはないことがが分かった（図２Ｆ）。ここで、本発明者らは、比較可能な方法として、トリプトファンを含まない培地を使用してＯＴ-１細胞とＴＲＣを共培養し、ＫｙｎによるＰＤ-１のアップレギュレーションをさらに調査した。その結果、トリプトファンの欠如は、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-αとＣＤ１０７ａ（パーフォリン/グランザイムＢの脱顆粒マーカー）の発現のアップレギュレーション、及びＴＲＣアポトーシスの増強と同時に、Ｔ細胞におけるＰＤ-１のダウンレギュレーションをもたらすことが分かった。また、トリプトファンを含まない方式で共培養した場合の上清は、抗ＣＤ３/ＣＤ２８活性化ＯＴ-１ Ｔ細胞でＰＤ-１発現をアップレギュレートすることができなかった。このように、これらのデータは、ＩＦＮ-γ刺激ＴＲＣによって放出されたＫｙｎが、Ｔ細胞でＰＤ-１の発現をアップレギュレートできることを示している。
【0079】
これと同時に、分化した対応物と比較して、基礎ＩＤＯ１の発現は全てのタイプのＴＲＣで遥かに高く、ＩＦＮ-γによってさらにアップレギュレートできる。また、活性化されたＯＴ-１Ｔ細胞と共培養する場合、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣでＩＤＯ１の発現が増加したが、ＴＤＯが検出されなかった。一方、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣで阻害剤１-ＭＴによってＩＤＯ１活性が遮断され又はＩＤＯ１がノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）されると、共培養系でＴＲＣアポトーシスが増加になり（図２Ｇ）、ＰＤ-１発現がアップレギュレートした（図２Ｈ）が、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-αとＣＤ１０７ａの発現がアップレギュレートした。これは、ＩＤＯ１-Ｋｙｎが、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を特異的に制御したことを示す。ＩＤＯ１発現の誘導は急速なＫｙｎ生成の初期段階に明らかに重要であるが、ＴＲＣで高Ｋｙｎ生成を維持するには、ＩＤＯ１の基質として十分な細胞外トリプトファンを投入する必要があり、Ｋｙｎがさらに代謝されて細胞外空間に放出されることを考慮するとなおさら必要となる。ＩＤＯ１活性が高いため、ＴＲＯのトリプトファン消費量が高くなるが、分化した腫瘍細胞と比較して、細胞質のトリプトファンレベルは減少しなかった。これは、ＴＲＣがアクティブなトランスポートによりトリプトファンの貯蔵を補充したことを示す。従って、本発明者らは、必須アミノ酸を細胞に輸送するための３つの一般的な中性アミノ酸トランスポーター（ＳＬＣ７Ａ５、ＳＬＣ７Ａ８、及びＳＬＣ１Ａ５）の発現について、さらに調査を行った。その結果、ＴＲＣには、ＳＬＣ１Ａ５の発現が高いが、ＳＬＣ７Ａ５またはＳＬＣ７Ａ８がそうではなかったことが分かった。ＳＬＣ１Ａ５の発現は、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方でＩＦＮ-γ処理によって増強された。また、ｓｈＲＮＡによるＳＬＣ１Ａ５のノックダウン、または阻害剤であるＬ-グルタミン酸γ-（ｐ-ニトロアニリン）塩酸塩（ＧＰＮＡ）によるＳＬＣ１Ａ５活性の遮断は、ＴＲＣトリプトファンの細胞内レベルを低下させ（図２Ｉ）、それと伴い、より多くのＴＲＣアポトーシス、ＰＤ-１のダウンレギュレーション、及びＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-α、ＣＤ１０７ａ発現のアップレギュレーションが生じた（図２Ｊ、２Ｋ）。逆に、ＳＳＬＣ１Ａ５の過剰発現は、トリプトファンの消費を増加させ（図２Ｌ）、分化した細胞でのＫｙｎの生成を促進した（図２Ｍ）。このように、これらのデータは、ＩＦＮ-γ-アップレギュレートされたＳＬＣ１Ａ５がトリプトファンの取り込みを増加させることで、ＴＲＣがアクティブなトリプトファン-ＩＤＯ１-Ｋｙｎ代謝経路を維持できるようになることを示した。
【0080】
実施例３：Ｋｙｎがアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）を活性化することでＴ細胞におけるＰＤ-１をアップレギュレートした
【0081】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0082】
（１）膵臓から分離したＣＤ８＋Ｔ細胞を２００μＭ Ｋｙｎ又はＫｙｎ+抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで４８時間刺激した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を固定し、抗ＡｈＲ抗体で染色し、共焦点顕微鏡で画像化した。画像化の結果を図３Ａに示す。エラーバー（Ｂａｒ）、１０μＭ。
【0083】
（２）ＡｈＲのウエスタンブロット分析の前に細胞質タンパク質と核タンパク質を部分的に分離した以外、（１）と同様にした。静止/Ｋｙｎ群に対する強度を算出した。算出結果を図３Ｂに示す。
【0084】
（３）ＰＢＳ又はＫｙｎ（２００μＭ）で４８時間処理した静止ＣＤ８＋Ｔ細胞と抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞について、ＡｈＲ発現のウエスタンブロット分析を実施した。Ｋｙｎ（-）群に対するＮｕｃ/ＣｙｔのＡｈＲ比率を算出した。分析の結果を図３Ｃに示す。
【0085】
（４）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＳ、Ｋｙｎ又はＫｙｎ/ＤＭＦ（１０μＭ又は２０μＭ）で７２時間処理した。ＰＤ-１の発現はフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図３Ｄに示す。
【0086】
（５）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化野生型又はＡｈＲ-/-ＯＴ-１マウスと、ＯＶＡ-Ｂ１６細胞又はＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣとを共培養した。腫瘍細胞のアポトーシス（図３Ｅ）又はＴ細胞におけるＰＤ-１の発現（図３Ｆ）をフローサイトメトリーにより分析した。分析の結果をそれぞれ図３Ｅと図３Ｆに示す。
【0087】
（６）ＰＤ-１プロモーターに結合したルシフェラーゼレポーター遺伝子ＰＧＬ３で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＡｈＲまたは空のプラスミドと共に２４時間かけてコトランスフェクトし、その後、さらにＫｙｎで４８時間処理した。検出の結果を図３Ｇに示す。
【0088】
（７）活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞をＴＣＤＤで４８時間処理した後、ＰＤ-１発現をｑＰＣＲ（左）とフローサイトメトリー（右）で分析した。分析の結果を図３Ｈに示す。**ｐ<０.０１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0089】
実施例３の結果から、蛍光顕微鏡法及びウエスタンブロッティングにより証明されたように、Ｋｙｎの添加により細胞質ＡｈＲが活性化Ｔ細胞の核に輸送されたことが分かった（図３Ａと３Ｂ）。興味深いことに、ＡｈＲの活性化以外、ＡｈＲは初期Ｔ細胞及び活性化Ｔ細胞で過少発現されているものの、Ｋｙｎ刺激下の静止時Ｔ細胞ではアップレギュレーションされ、活性化Ｔ細胞でさらに増加したことが分かった（図３Ｃ）。一方、ＤＭＦまたはＣＨ-２２３１９１を使用してＡｈＲ活性を阻害する場合、ＰＤ-１のＫｙｎ依存性の増加が阻止された（図３Ｄ）。ＰＤ-１のアップレギュレーションにおけるＡｈＲの役割をさらに具体的に確認するために、本発明者らは、ＡｈＲ-/-ＯＴ-１Ｔ細胞を使用してＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣと共培養した。確かに、ＡｈＲ欠乏症は、より多くのＴＲＣアポトーシスを引き起こし（図３Ｅ）、ＰＤ-１のダウンレギュレーションも伴っていた（図３Ｆ）。また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰＤ-１ルシフェラーゼレポーター遺伝子とＡｈＲ過剰発現を促進するプラスミドで同時トランスフェクトしたとき、Ｋｙｎを追加すると、固有のＡｈＲ発現を伴うＨＥＫ２９３Ｔ細胞（空のコントロールプラスミドでトランスフェクトした）においてルシフェラーゼ活性が４倍に増加したこと、及びＡｈＲを過剰発現する細胞において１２倍増加したこと（図３Ｇ）が分かった。ＡｈＲはさまざまな外因性毒素を認識するため、ＡｈＲの外因性リガンドであるＴＣＤＤもテストした。その結果、仮説と一致して、ＴＣＤＤもＴ細胞におけるＰＤ-１発現をアップレギュレートした（図３Ｈ）。まとめると、これらのデータは、Ｋｙｎが、ＡｈＲを誘導及び活性化することによって、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現をアップレギュレートできることを示した。
【0090】
実施例４：ＡｈＲは転写レベルでＣＤ８
+
Ｔ細胞トランスポーターの発現を制御して、外因性のＫｙｎを取り込んだ
【0091】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0092】
（１）静止又は抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞（細胞１×１０４個）を溶解し、ＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡにより分析した。分析の結果を図４Ａに示す。
【0093】
（２）活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞をＰＢＳ又はＫｙｎ（２００μＭ）２４時間処理した。ＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８の発現はリアルタイムＰＣＲ（左）と免疫染色（右）で測定した。測定の結果を図４Ｂに示す。エラーバー（Ｂａｒ）、１０μＭ。
【0094】
（３）対照ｓｈＲＮＡ、又はＳＬＣ７Ａ８とＰＡＴ４に対するｓｈＲＮＡがレトロウイルスを介して活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞に２４時間送達され、その後、形質導入Ｔ細胞をＫｙｎ（２００μＭ）で４８時間処理した。上清中のＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡで測定し、Ｋｙｎ消費を算出した。測定の結果を図４Ｃに示す。
【0095】
（４）（３）と同様にしたが、ＰＤ-１の発現をフローサイトメトリーにより分析した。分析の結果を図４Ｄに示す。
【0096】
（５）活性化されたＯＴ-１ Ｔ細胞を対照ｓｈＲＮＡ、ＰＡＴ４ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈ１とＳｈ２）又はＳＬＣ７Ａ８ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈ１とＳｈ２）で７２時間トランスフェクトし、その後、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣと共培養した。ＴＲＣアポトーシスをフローサイトメトリーにより分析した。分析の結果を図４Ｅに示す。
【0097】
（６）ＰＢＳ、Ｋｙｎ、Ｋｙｎ/ＣＨ-２２３１９１（１０μＭ）又はＫｙｎ/ＤＭＦ（２０μＭ）で４８時間処理して活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞において、ＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８のｍＲＮＡ発現を測定した。測定の結果を図４Ｆに示す。
【0098】
（７）静止又は活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞をＰＢＳ又はＫｙｎで４８時間処理した。抗ＡｈＲ抗体とＳＬＣ７Ａ８又はＰＡＴ４プロモーターに特異的なｑＰＣＲライマーとを用いてＣｈｉｐ-ｑＰＣＲ分析を行った。分析の結果を図４Ｇに示す。
【0099】
（８）ＡｈＲベクターとＳＬＣ７Ａ８またはＰＡＴ４プロモーターに結合されたルシフェラーゼレポーター遺伝子ＰＧＬ３とを用いてＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を一過性コトランスフェクトし、その後、Ｋｙｎで４８時間処理した。測定の結果を図４Ｈに示す。**ｐ＜０.０１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0100】
実施例４の結果から、外因性のＫｙｎがどのようにＴ細胞に入るのかを検討し続けた。内因性ＫｙｎはＣＤ８+Ｔ細胞ではほとんど検出されず（図４Ａ）、これらのＴ細胞は非常に低レベルのＩＤＯ１を発現することが分かった。これは、ＣＤ８+Ｔ細胞が外因性Ｋｙｎに依存してＡｈＲを活性化し、さらにＰＤ-１発現をアップレギュレートしたことを示した。細胞におけるＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５、ＳＬＣ７Ａ８、及びＰＡＴ４を含むいくつかのトランスポーターに、Ｋｙｎが輸送される。これらの４つのトランスポーターはＣＤ８+Ｔ細胞において発現することが判明したが、驚くべきことに、Ｋｙｎの追加により、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４の発現がアップレギュレーションされた（図４Ｂ）。特筆すべきことに、静止ＣＤ８+Ｔ細胞と比較して、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４の発現は抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズによって活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞においてアップレギュレーションされ、Ｋｙｎ処理によってさらに増強された。また、ＩＦＮ-γ処理がＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８の発現に影響を及ぼさないことが分かった。これらの結果から、これらの２つのトランスポーターがＣＤ８+Ｔ細胞における主たるＫｙｎインポートであると推測した。従って、レトロウイルスを使用して、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４ ｓｈＲＮＡを初代Ｔ細胞、またはＳＬＣ７Ａ８に対する阻害剤である２-アミノ-２-ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）もしくはＰＡＴ４に対するサルコシンで処理されたＴ細胞に送達する。結果、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４を阻害またはノックダウンすると、ＫｙｎがＴ細胞に入ることを遮断し（図４Ｃ）、ＡｈＲ活性を阻害し、ＰＤ-１アップレギュレーションを排除した（図４Ｄ）。また、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣに対するＯＴ-１Ｔ細胞毒性を増加した（図４Ｅ）。これと同時に、ＡｈＲ阻害剤ＤＭＦまたはＣＨ-２２３１９１がＫｙｎ誘導によるＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４アップレギュレーションを効果的に阻害できることが分かった（図４Ｆ）。チップＰＣＲ分析により、ＡｈＲが実際にＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４遺伝子のプロモーターに結合することがさらに確認された（図４Ｇ）。また、ルシフェラーゼ分析は、ＡｈＲが結合するとＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４の発現が増強されることを示した（図４Ｈ）。多くの輸送システムにおける逆輸送機能に関して、ＳＬＣ７Ａ８とＰＡＴ４の他の必須アミノ酸の輸送への影響も分析した。Ｋｙｎありまたはなしの４８時間処理後、抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞が、ＬＣ-ＱＥ-ＭＳによるサイトゾル中の必須アミノ酸の分析に使用された。結果は、スレオニン強度の若干低減以外、Ｋｙｎ処理はほとんどの必須アミノ酸に影響を及ぼさないことを示した。まとめると、これらのデータは、ＡｈＲが転写によってＫｙｎトランスポーターを活性化し、外因性ＫｙｎのＴ細胞への取り込みを促進することを示した。
【0101】
実施例５：Ｋｙｎ-ＡｈＲによって制御されるＰＤ-１経路はＴＣＲシグナル伝達に依存しないが、ＴＣＲシグナル伝達によって促進された
【0102】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0103】
（１）ＣＤ８+Ｔ細胞をＫｙｎ（２００μＭ）で所定の時間処理した。ＰＤ-１の発現はフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図５Ａに示す。
【0104】
（２）ＰＤ-１発現は、野生型またはＡｈＲ-/-マウスから分離された、静止または抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８+Ｔ細胞において、フローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図５Ｂに示す。
【0105】
（３）静止及びＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現は、フローサイトメトリーにより所定の時点で測定した。測定の結果を図５Ｃに示す。
【0106】
（４）ＣＤ８+Ｔ細胞を抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで４時間前処理し、その後、ＰＢＳ又はＫｙｎで２４時間処理した。ＰＤ-１発現はフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図５Ｄに示す。
【0107】
（５）静止又は抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＳＬＣ７Ａ８又はＰＡＴ４のｍＲＮＡレベルを測定した。測定の結果を図５Ｅに示す。
【0108】
（６）抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズ活性化ＣＤ８+Ｔ細胞をＣｓＡ（１μＭ）で４８時間処理した。ＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８のｍＲＮＡ発現はリアルタイムＰＣＲで測定した。測定の結果を図５Ｆに示す。
【0109】
（７）ＣｓＡ（１μＭ）の存在又は非存在下で、活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞をＫｙｎ（２００μＭ）で４８時間処理した。細胞を溶解し、ＫｙｎのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。測定の結果を図５Ｇに示す。
【0110】
（８）静止又は活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞をＰＢＳ、Ｋｙｎ（２００μＭ）、ＣｓＡ（１μＭ）、Ｋｙｎ/ＣｓＡで４８時間処理した。ＰＤ-１レベルはフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図５Ｈに示す。
【0111】
（９）抗ＮＦＡＴｃ１抗体と、ＰＡＴ４またはＳＬＣ７Ａ８プロモーターに特異的なｑＰＣＲライマーとを用いて静止又は活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞においてＣｈｉｐ-ｑＰＣＲ分析を行った。分析の結果を図５Ｉに示す。
【0112】
（１０）ＩｇＧ又は抗ＰＤ-１中和抗体（１０μｇ/ｍｌ）の存在下で、パルスで放出された（ｐｕｌｓｅｄ ｗｉｔｈ）ＯＶＡ ２５７-２６４（２μｇ/ｍｌ）の膵臓のＡＰＣとＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞とを７２時間共培養した。ＩＦＮ-γ発現はフローサイトメトリーにより測定した（左）。又は、ＯＴ-１マウスからのＣＤ８+Ｔ細胞をＫｙｎ（２００μＭ）で７２時間処理した後、ＯＶＡ-ペプチドが搭載されたＡＰＣと共培養し、抗ＰＤ-１中和抗体の存在又は非存在下で７２時間処理した（右）。測定の結果を図Ｊに示す。**ｐ＜０.０１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0113】
実施例５の結果から、Ｋｙｎ-ＡｈＲ経路とＴＣＲシグナル伝達が互いに独立してＰＤ-１発現を誘導できることが分かった。Ｔ細胞活性化シグナルの存在下での前記ＫｙｎによるＰＤ-１アップレギュレーションにもかかわらず（図２Ｄ及び２Ｅ）、静止ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１をアップレギュレートするには、実際にＫｙｎだけで十分であった（図５Ａ）。しかしながら、このような誘導は、緩やかなプロセスであり、４８時間の時点で増加が始まった。一方、ＡｈＲ欠損を有するＣＤ８+Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化シグナル伝達中にＰＤ-１発現もアップレギュレートした（図５Ｂ）。特筆すべきことは、ＴＣＲシグナル伝達によって誘導されるＰＤ-１の発現は急速なプロセスであり、最初の時点で増加し始めることが分かった（図５Ｃ）。ＣＤ８+Ｔ細胞を抗ＣＤ３/ＣＤ８マイクロビーズと４時間インキュベートした。ビーズが取り除かれた後、これらの細胞をＫｙｎで処理した。この短いＴＣＲの活性化により、ＰＤ-１の発現が高くなり（図５Ｄ）、ＴＣＲシグナル伝達がＫｙｎ-ＡｈＲでＰＤ-１の誘導を促進することを示した。ＫｙｎインポートはＫｙｎ-ＡｈＲ依存経路の制限ステップであるため、ＴＣＲシグナル伝達がＫｙｎ-トランスポーターに影響するかどうか、及びどのように影響するかを調査した。ナイーブＴ細胞は低レベルのＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４を発現するが、活性化Ｔ細胞は２つのトランスポーターの有意に高い発現を示すことがわかった（図５Ｅ）。ＣＤ８+Ｔ細胞の活性化中に、ＴＣＲシグナル伝達によって引き起こされる転写因子が多く活性化され、ＰＤ-１の発現増強に関与する可能性がある。その中で、Ｔ細胞ｃ１（ＮＦＡＴｃ１）を活性化する核因子は重要であるようである。ＮＦＡＴｃ１は通常、リン酸化不活性形としてサイトゾルに局在するが、脱リン酸化の時に細胞核へ移行する。阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）はＮＦＡＴｃ１の核移行を遮断し、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を阻害する。ＣｓＡを使用してＮＦＡＴｃ１を遮断すると、活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞におけるＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４のアップレギュレーションも遮断される（図５Ｆ）。これに伴い、Ｋｙｎの取り込みが弱くなることも観察された（図５Ｇ）。ＴＣＲシグナル伝達によるＫｙｎ/ＡｈＲ誘導のＰＤ-１発現の促進効果もＣｓＡにより阻害された（図５Ｈ）。Ｊａｓｐａｒ及びＧｅｎｏｍａｔｒｉｘソフトウェアを使用した分析により、ＮＦＡＴｃ１がＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４のプロモーターに結合するための複数の共有シスエレメントの存在が明らかにした。これは、ＣｈＩＰアッセイによって確認され、ＮＦＡＴｃ１が確実にかかるプロモーターに結合したことを示した（図５Ｉ）。ＣＤ８+Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）を共培養することにより、ＰＤ-１遮断がＩＦＮ-γの産生を抑制するのに対して、ＰＤ-１遮断時に、Ｋｙｎ処理がＩＦＮ-γの産生をアップレギュレーションすることが分かった（図５Ｊ）。まとめると、これらのデータは、Ｋｙｎ-ＡｈＲによって制御されるＰＤ-１経路がＴＣＲシグナル伝達に依存しないが、ＴＣＲシグナル伝達によって促進されることを示した。
【0114】
実施例６：Ｋｙｎ/ＡｈＲは担癌マウスのＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１発現を制御した
【0115】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0116】
（１）ＷＴ Ｃ５７ＢＬ/６マウスにＰＢＳまたはＫｙｎ（１日１回、５０μｇ）を５日間腹腔内注射し、ＦＡＣＳによりＣＤ８+Ｔ細胞を膵臓及び腸間膜リンパ節からソーティングした。ＰＤ-１発現はフローサイトメトリーにより測定した（図６Ａ）。膵臓からの一部のＣＤ８+Ｔ細胞をＡｈＲ及びＤＡＰＩで免疫染色し（図６Ｂ）、ＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで測定した（図６Ｃ）。前記実験の結果をそれぞれ図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃに示す。エラーバー（Ｂａｒ）、１０μＭ。
【0117】
（２）ＡｈＲ-/-マウスを使用した以外、（１）と同様にした。実験の結果を図６Ｄに示す。
【0118】
（３）ＰＢＳまたはＫｙｎを５日間注射したＡｈＲ-/-Ｃ５７ＢＬ/６マウスから分離した、静止または抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズで活性化された膵臓のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を測定した。測定の結果を図６Ｅに示す。
【0119】
（４）様々なタイミングで、ＷＴまたはＡｈＲ-/-Ｃ５７ＢＬ/６マウスに抗ＣＤ３抗体（５μｇ、ｉ.ｐ.）を注射または注射せずにして、フローサイトメトリーによりＰＤ-１発現を測定した。測定の結果を図６Ｆに示す。
【0120】
（５）Ｃ５７ＢＬ/６マウスに抗ＣＤ３抗体を７２時間注射した後、これらのマウスにＫｙｎ（５０μｇ）を投与した。膵臓ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現は、４８時間後にフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図６Ｇに示す。
【0121】
（６）５×５ｍｍ ＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマを有するＣ５７ＢＬ/６マウスに、ＣＦＳＥ標識ＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞（４×１０６個/マウス、３日ごとに１回）を３回養子移植した。同時に、一部のマウスにはＫｙｎ（２日ごとに１回、５０μｇ/マウス）を３回腹腔内注射した。移植後７日目に、ＣＦＳＥ+ＣＤ８+Ｔ細胞を腫瘍から分離して、ＰＤ-１発現のフローサイトメトリー分析に供した。分析の結果を図６Ｈに示す。
【0122】
（７）スクランブル、ｓｈＰＡＴ４-またはｓｈＳＬＣ７Ａ８-レトロウイルスでトランスフェクトされたＣＤ４５.２ ＯＴ-１ Ｔ細胞４ｘ１０６個を、５×５ｍｍ ＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマを有するＣＤ４５.１マウスに３回養子移植した（３日ごとに１回）。腫瘍成長を測定し（左）、長期生存率を分析した（右）。測定の結果を図６Ｉに示す。
【0123】
（８）Ｃ５７ＢＬ/６マウスをＫｙｎ、ＤＭＦ（５μｇ/マウス、ｏ.ｔ.、１日２回）、またはＫｙｎ+ＤＭＦで６日間処理した以外、（７）と同様にした。腫瘍由来のＣＦＳＥ+ＣＤ８+Ｔ細胞を単離して、ＰＤ-１発現のフローサイトメトリー分析に供した。分析の結果を図６Ｊに示す。
【0124】
（９）５×５ｍｍ Ｂ１６メラノーマを有するＣ５７ＢＬ/６マウスをＰＢＳ、Ｋｙｎ（５０μｇ/マウス、ｉ.ｐ.、２日ごとに１回）、ＤＭＦ（５μｇ/マウス、ｏ.ｔ.、１日１回）またはＫｙｎ+ＤＭＦで６日間処理した。腫瘍から分離されたＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現は、フローサイトメトリーにより測定した（ｎ=５）。測定の結果を図６Ｋに示す。
【0125】
（１０）Ｃ５７ＢＬ/６マウスに１×１０６個のＩＤ８卵巣がん細胞を腹腔内注射した。１０日後、マウスにＰＢＳ、Ｋｙｎ、ＤＭＦまたはＫｙｎ+ＤＭＦを６日間腹腔内投与した。腹水由来のＣＤ８+Ｔ細胞を分離し、ＰＤ-１発現をフローサイトメトリーで測定した（ｎ＝５）。測定の結果を図６Ｌに示す。
【0126】
（１１）ＭＭＴＶ-ＰｙＭＴマウスで自発的に形成した乳腺腫瘍からＣＤ４５-ＡＬＤＨ+及びＣＤ４５-ＡＬＤＨ-腫瘍細胞を選別した。細胞をそれぞれ、９０Ｐａソフト３Ｄフィブリンゲルに播種した。４日後、コロニーの数をカウントした。カウント結果を図６Ｍに示す。
【0127】
（１２）ＣＤ４５+、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ+及びＣＤ４５-ＡＬＤＨ-細胞を溶解し、ＥＬＩＳＡによりＫｙｎレベルを測定した。測定の結果を図６Ｎに示す。
【0128】
（１３）５×５ｍｍ ＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマを有するＣ５７ＢＬ/６マウスに、ＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞（４×１０６個細胞/マウス）を使用または使用せずに、３日ごとに３回養子移植した。同時に、これらのマウスをＰＢＳ、ＤＭＦ（５μｇ/マウス、ｏ.ｔ.、１日２回）または抗ＰＤ-１中和抗体（２５０μｇ/日、２日ごとに１回、２回）で２０日間処理した。腫瘍成長を測定し（左）、長期生存率を分析した（右）。測定の結果を図６Ｏに示す。
【0129】
（１４）（９）と同様にしたが、腫瘍の重さを計った。計量結果を図６Ｐに示す。*ｐ＜０.０５、**ｐ＜０.０１；ＣＴＬ群に対して、＃ｐ＜０.０５、＃＃ｐ＜０.０１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0130】
実施例６の結果から、膵臓及びリンパ節の分析により、ＣＤ８+Ｔ細胞は５日目に増殖しなかったが、ＰＤ-１発現がアップレギュレートされたことが示された（図６Ａ）。同時に、これらのＣＤ８+Ｔ細胞におけるＡｈＲが細胞核に移行し（図６Ｂ）、ＫｙｎトランスポーターＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４はアップレギュレートされたことが観察された（図６Ｃ）。上記のｉｎ ｖｉｔｒｏデータと一致するように、この外因性ＫｙｎはＡｈＲ-/-マウスにおけるＰＤ-１発現を誘導できなかった（図６Ｄと６Ｅ）。一方、ＷＴまたはＡｈＲ-/-マウスに刺激性抗ＣＤ３抗体を注射してから、６時間の時点で膵臓ＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１を急速にアップレギュレートすることが観察されたが、７２時間後に低下し始めた（図６Ｆ）。この７２時間の時点で、Ｋｙｎをマウスに注射した。Ｋｙｎ誘導のＰＤ-１発現が第一ＴＣＲシグナル伝達によって増強されることを発見し（図６Ｇ）、ＴＣＲシグナル伝達がＫｙｎ-ＡｈＲによるＰＤ-１誘導を促進することをさらに示した。ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおけるＰＤ-１のアップレギュレーションを研究するために、ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣ（５×１０５/マウス）を皮下注射した３日後のＣＤ４５.１マウスに、ＣＤ４５.２ ＯＴ-１ Ｔ細胞を養子移植し、さまざまなタイミングで、ＰＤ-１の発現を分析し、腫瘍部位のＫｙｎ濃度を測定した。Ｋｙｎのレベルが徐々に増加し、９日目にプラトーに達したことが分かった。偶然にも、ＣＤ４５.２ ＯＴ-１ Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現も徐々に増加し、９日目にプラトーに達した。これは、ＫｙｎとＰＤ-１発現との固有相関が示唆された。次に、ＣＦＳＥ標識ＯＴ-１ Ｔ細胞を養子移植した後、ＫｙｎでＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマ（５×５ｍｍ）を有するマウスを処理した。上記のデータと一致するように、腫瘍浸潤ＣＦＳＥ+Ｔ細胞においてより高いレベルのＰＤ-１発現が観察された（図６Ｈ）。
【0131】
次に、対照のｓｈＰＡＴ４またはｓｈＳＬＣ７Ａ８ ＯＴ-１ Ｔ細胞を、３×３ｍｍ ＯＶＡ-Ｂ１６メラノーマを有するＣＤ４５.１マウスに養子移植した。ＰＡＴ４またはＳＬＣ７Ａ８のノックダウンにより、ＰＤ-１の発現は大幅に減少したが、ＯＴ-１ Ｔ細胞におけるＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αの発現が増加し、これに伴い、腫瘍の成長遅延及びマウスの生存延長が見られ（図６Ｉ）、Ｋｙｎが腫瘍微小環境でのＰＤ-１発現を誘導することを示した。また、腫瘍塊、膵臓、またはリンパ節から分離されたＣＦＳＥ+Ｔ細胞で観察されるように、ＡｈＲ阻害剤ＤＭＦの存在下で、このＫｙｎによる腫瘍特異的なＣＤ８+Ｔ細胞でのＰＤ-１発現のアップレギュレーションが抑制された（図６Ｊ）。それと一致するように、Ｔ細胞におけるＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-α発現のアップレギュレーションが観察された。また、Ｂ１６メラノーマ腫瘍を有するマウスは、Ｋｙｎ、Ｋｙｎ+ＤＭＦまたはＤＭＦによる処理も受け入れた。それと一致するように、Ｋｙｎは腫瘍、膵臓、またはリンパ節から分離されたＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現をアップレギュレートできるが、ＤＭＦによって遮断されることが分かった（図６Ｋ）。卵巣癌を含む腹膜腫瘍は、通常ＰＤ-１発現がアップレギュレートされたＣＤ８+Ｔ細胞に浸潤する。ここでは、ＩＤ８卵巣癌とＨ２２肝癌腹水の２種類のマウス腹膜腫瘍モデルをさらに使用して、上記のＰＤ-１発現の結果を検証した。同様に、Ｋｙｎは、腹膜、膵臓、またはリンパ節のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を促進し、ＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αの発現を阻害したが（図６Ｌ）、ＰＤ-１、ＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-αの発現パターンはＤＭＦによって逆転された。
【0132】
自発的に形成された乳がんＭＭＴＶ-ＰｙＭＴマウスでは、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ+腫瘍細胞が発がん性細胞として同定された。９０Ｐａ ３Ｄフレキシブルフィブリンゲルでは、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ-腫瘍細胞ではなく、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ+細胞のみがコロニーに成長するため、これらをさらにＴＲＣとして同定した（図６Ｍ）。予想通りに、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ-腫瘍細胞とＣＤ４５+免疫細胞でのＩＤＯ１発現とＫｙｎレベルは非常に低かったが、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ+ＴＲＣでは著しく高かった（図６Ｎ）。それと一致するように、ＣＤ４５-ＡＬＤＨ-細胞でなく、ＩＦＮ-γ処理されたＣＤ４５-ＡＬＤＨ+細胞からの上清はＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現をアップレギュレートした。一方、同じ量のＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣまたはＯＶＡ-Ｂ１６細胞をメラノーマを有するＣＤ４５.１ Ｃ５７ＢＬ/６マウスに腫瘍内投与するとともにＣＤ４５.２ ＯＴ-１細胞を養子移植した。ＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣ群のＯＴ-１ Ｔ細胞は、３日後にＯＶＡ-Ｂ１６群よりも高いＰＤ-１発現を示した。同時に、Ｂ１６ ＴＲＣによって形成されたメラノーマにおけるＩＤＯ１ノックダウンは、養子移植されたｇｐ-１００特異的なＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現の有意な減少、及びこれらのＴ細胞におけるＩＦＮ-γ及びＴＮＦ-α発現の増加をもたらした。
【0133】
ＯＶＡ-Ｂ１６ＴＲＣ、Ｂ１６ＴＲＣ、ＯＶＡ-Ｂ１６細胞またはＢ１６細胞を、ＯＶＡ特異的なＣＤ４５.２ ＯＴ-１Ｔ細胞とＯＶＡ非特異的なＣＤ４５.１ ＣＤ８+Ｔ細胞とともに２４時間共培養した。非特異的なＣＤ４５.１ ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１アップレギュレーションは、上記の腫瘍細胞タイプによって誘導されるものではない一方、ＯＶＡ-Ｂ１６細胞は、抗原特異的なＯＴ-１ Ｔ細胞におけるＰＤ-１アップレギュレーションをわずかに誘導した。しかしながら、ＯＴ-１ Ｔ細胞におけるＰＤ-１アップレギュレーションは明らかにＯＶＡ-Ｂ１６ ＴＲＣによって誘導され、ＰＤ-１の発現は抗原のみによって制限されでなく、局所的なＫｙｎ濃度によっても制御されることを示している。ＯＶＡ特異的なＣＤ８+Ｔ細胞の養子移植は、マウスＯＶＡ-Ｂ１６のメラノーマに対する治療効果を生み出し、ＰＤ-１抗体の投与により増強された（図６Ｏ）。ＰＤ-１抗体に比較して、ＤＭＦの場合にも同様な処理効果を示した（図６Ｏ）。また、Ｋｙｎ処理で加速された腫瘍成長が、ＤＭＦ処理により逆転された（図６Ｐ）。まとめると、これらのデータは、担癌マウスにおけるＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１発現がＫｙｎ-ＡｈＲ経路によって調節されていることを示している。
【0134】
実施例７：がん患者のＣＤ８
+
Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現は、Ｋｙｎ-ＡｈＲ経路によりアップレギュレートされた
【0135】
本実施例で使用される形態のステップ及びその結果は以下の通りである。
【0136】
（１）健康な被験者（ｎ＝５０）、あるいは乳がん患者（ｎ＝８４）、結腸がん患者（ｎ＝２８）又は肺がん患者（ｎ＝１５）の末梢血からＣＤ８+Ｔ細胞を分離した。或いは、乳がん（ｎ＝９）又は結腸がん（ｎ＝１７）の腫瘍組織からＣＤ８+Ｔ細胞を分離した。ＰＤ-１発現は、フローサイトメトリーにより分析した。分析の結果を図７に示す。
【0137】
（２）健康な被験者（ｎ＝３１）と、乳がん患者（ｎ＝７３）、肺がん患者（ｎ＝１０）又は結腸がん患者（ｎ＝２６）の血清におけるＫｙｎのレベルを測定した。或いは、新鮮なヒト乳腺（ｎ＝１１）又は結腸（ｎ＝８）の腫瘍組織及び隣接する正常組織由来のライセートを調製し、Ｋｙｎのレベルを測定した。測定の結果を図７Ｂに示す。
【0138】
（３）健常者（左、ｎ＝３７）と乳がん患者（右、ｎ＝６２）におけるＰＤ-１発現とＫｙｎレベルの相関を分析した。分析の結果を図７Ｃに示す。
【0139】
（４）乳がんまたは肺がん患者のＰＢＭＣから分離されたＣＤ８+Ｔ細胞は、抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズによって活性化され、ＰＢＳ、Ｋｙｎ（２００μＭ）またはＫｙｎ/ＤＭＦ（２０μＭ）で４８時間処理された。ＰＤ-１の発現はフローサイトメトリーにより測定した。測定の結果を図７Ｄに示す。
【0140】
（５）乳がんまたは肺がん患者から分離されたＣＤ８+Ｔ細胞をＤＭＦ（２０μＭ）で４８時間処理した。ＰＤ-１発現はフローサイトメトリーにより測定した（ｎ＝６）。測定の結果を図７Ｅに示す。
【0141】
（６）健常なドナー、または乳がんもしくは肺がん患者のＰＢＭＣから、ＰＤ-１高ＣＤ８+またはＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞をソートした。リアルタイムＰＣＲでＡｈＲ ｍＲＮＡ発現を分析した（ｎ＝８、図７Ｆ）。これらの細胞集団は、抗ＡｈＲ抗体とＤＡＰＩで免疫染色され、共焦点顕微鏡でイメージした（図７Ｇ）。実験の結果をそれぞれ図７Ｆと図７Ｇに示す。エラーバー（Ｂａｒ）、１０μＭ。
【0142】
（７）ＰＤ-１プロモーターへのＡｈＲ結合のチップ-ｑＰＣＲ分析を行った。分析の結果を図７Ｈに示す。
【0143】
（８）乳がん患者からのＣＤ８+Ｔ細胞をＰＢＳ、Ｋｙｎ（２００μＭ）、Ｋｙｎ/ＤＭＦ（２０μＭ）又はＫｙｎ/ＣＨ（５０μＭ）で４８時間処理した。ＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８の発現はリアルタイムＰＣＲで測定した。測定の結果を図７Ｉに示す。
【0144】
（９）乳がんと肺がん患者からのＰＤ-１高ＣＤ８+Ｔ細胞又はＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４又はＳＬＣ７Ａ８のｍＲＮＡ発現を測定した。発現の結果を図７Ｊに示す。
【0145】
（１０）乳がん患者のＰＢＭＣから分離されたＰＤ-１高ＣＤ８+Ｔ細胞またはＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞において、抗ＡｈＲ抗体と、ＳＬＣ７Ａ８またはＰＡＴ４のプロモーターに特異的なｑＰＣＲプライマーとを使用してチップ-ｑＰＣＲ分析を行った。分析の結果を図７Ｋに示す。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0146】
（１１）ＣＤ８+Ｔ細胞においてＰＤ-１がどのようにアップレギュレートされるかを概略図で示す。結果を図７Ｌに示す。**ｐ＜０.０１、***ｐ＜０.００１。データは平均値±ＳＥＭとして表す。
【0147】
実施例７の結果から、フローサイトメトリー分析は、健常なドナーの対照群よりも、乳がん、結腸がん、及び肺がん患者からの末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞が高いＰＤ-１発現を示した（図７Ａ）。また、乳がん及び結腸がん患者の腫瘍浸潤ＣＤ８+Ｔ細胞で非常に高いＰＤ-１発現が見られた（図７Ａ）。この結果と一致するように、これらの癌患者の血漿及び腫瘍組織におけるＫｙｎレベルは有意に上昇した（図７Ｂ）。特筆すべきことは、Ｋｙｎレベルは、乳がん及び結腸がん患者のＰＤ-１発現と強く相関しているが、健常者においては相関していない（図７Ｃ）。Ｋｙｎ産生の細胞源を明らかにするために、患者の乳腺（ｎ=１０）及び結腸（ｎ=１４）の腫瘍組織から分離されたＣＤ４５+免疫細胞及びＣＤ４５-腫瘍細胞を分析した。ＩＤＯ１発現及びＫｙｎレベルは、ＣＤ４５+細胞中でなく、ＣＤ４５-細胞中において支配的であった。次に、１-ＭＴの存在下または非存在下で、ＣＤ４５-腫瘍細胞をＩＦＮ-γによりｉｎ ｖｉｔｒｏで２４時間処理した。上清は患者の末梢血Ｔ細胞に用いて２４時間処理した。フローサイトメトリー分析は、ＰＤ-１発現がＣＤ８+Ｔ細胞でアップレギュレートされたことを示し、このプロセスは、１-ＭＴの添加により遮断された。これは、Ｋｙｎがヒト腫瘍組織において、主に腫瘍細胞によって産生され、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を促進することを示した。ＫｙｎレベルがＴｒｐトランスポーターで制御されることを考慮して、ＳＬＣ１Ａ５が患者の乳腺及び結腸腫瘍組織で高レベルで発現していることをさらに発見した。
【0148】
Ｋｙｎを使用し、抗ＣＤ３/ＣＤ２８マイクロビーズの刺激がある又はなしにして、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、上記ヒトサンプル由来のＣＤ８+Ｔ細胞を処理した。Ｋｙｎは、健常なドナーと、乳がん及び肺がんの患者とからの静止及び活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現をアップレギュレートした。また、Ｋｙｎ処理は、乳がん及び肺がん患者からの静止及び活性化された末梢ＣＤ８+Ｔ細胞において、細胞質ゾルから核へのＡｈＲの移行を促進する。それと一致するように、ＡｈＲ核移行は乳がん及び結腸がん患者の腫瘍浸潤Ｔ細胞においても見られた。ＡｈＲ活性を遮断するためにＤＭＦまたはＣＨ-２２３１９１を使用した。ＤＭＦまたはＣＨ-２２３１９１の添加は、ヒトＣＤ８+Ｔ細胞におけるＫｙｎによるＰＤ-１アップレギュレーションを阻害することが分かった（図７Ｄ）。さらに重要なことに、ＤＭＦを単独で添加すると、患者のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を直接にダウンレギュレートでき（図７Ｅ）、ＡｈＲが癌患者のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を促進する重要なシグナル伝達分子である可能性があることを示している。
【0149】
がん患者のＰＤ-１高とＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞のＡｈＲ活性を比較した。健常な対照ではなく、肺がん及び乳がん患者から選別されたＰＤ-１高ＣＤ８+Ｔ細胞は、対応して設定されたＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞よりもはるかに高いＡｈＲ ｍＲＮＡレベルを発現した（図７Ｆ）。さらなる免疫染色分析により、核移行によって実証されたように、患者由来のＰＤ-１高Ｔ細胞は確かにＡｈＲ活性がより高いことが確認された（図７Ｇ）。健常な対照と比較して、このような核ＡｈＲは乳がん患者由来のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１のプロモーターに強く結合した（図７Ｈ）。ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４は、外因性Ｋｙｎの輸送によりＰＤ-１の発現に関与し、マウスＣＤ８+Ｔ細胞においてＡｈＲによって制御された（図４Ｄと４Ｅ）。
【0150】
Ｋｙｎを入れると、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４がヒトＣＤ８+Ｔ細胞にアップレギュレートされた（図７Ｉ）。免疫組織の化学染色は、乳がんと結腸がん患者の腫瘍浸潤Ｔ細胞においてＰＡＴ４が高度に発現された。しかしながら、このようなアップレギュレーションは、ＡｈＲ阻害剤ＤＭＦまたはＣＨ-２２３１９１によって遮断される可能性がある（図７Ｉ）。それと一致するように、がん患者から選別されたＰＤ-１低ＣＤ８+Ｔ細胞でなく、ＰＤ-１高ＣＤ１+Ｔ細胞のみがＳＬＣ７Ａ５及びＰＡＴ４の高発現を有した（図７Ｊ）。また、ヒトＣＤ８+Ｔ細胞において、ＳＬＣ７Ａ８及びＰＡＴ４のプロモーターへのＡｈＲの結合及びそれらの発現の調節は確認された（図７Ｋ）。まとめると、これらのデータは、がん患者のＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現上昇は、主にＫｙｎ-ＡｈＲ経路による可能性があることが示唆された。
【0151】
実施例８：ＧＰＮＡ（Ｌ－γ－グルタミル－ｐ－ニトロアニリド）は、腫瘍細胞へのトリプトファンの取り込みを大幅に阻害でき、特異的なＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１発現を低減した
【0152】
１、腫瘍細胞へのトリプトファンの取り込みに対するＧＰＮＡの影響を検出する実験
【0153】
１）実験ステップ
【0154】
マウスＯＶＡ-Ｂ１６細胞をＲＰＭＩ-１６４０培地でｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0155】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0156】
対照群２（ＧＰＮＡ）：培地＋ＧＰＮＡ １０μＭ
【0157】
実験群３（ＩＦＮ-γ）：培地＋ＩＦＮ-γ ５０ｎｇ/ｍＬ
【0158】
実験群４（ＩＦＮ-γ+ＧＰＮＡ）：培地＋ＩＦＮ-γ５０ｎｇ/ｍＬ＋ＧＰＮＡ １０μＭ
【0159】
２４時間後、各グループの細胞を収集して超音波処理し、ライセートを使用してＥＬＩＳＡでトリプトファン濃度を測定したとともに、ＢＣＡタンパク質アッセイを実施した。
【0160】
２）実験の結果
【0161】
図８Ａからわかるように、ＩＦＮ-γは腫瘍細胞へのトリプトファンの取り込みを大幅に向上させることができ、ＧＰＮＡを使用してトリプトファン輸送体ＳＬＣ１Ａ５を阻害した後、腫瘍細胞へのトリプトファンの取り込みが大幅に減少した。
【0162】
２、特異的なＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現に対するＧＰＮＡの影響を検出する実験
【0163】
１）実験ステップ
【0164】
３Ｄ培養されたＯＶＡ-Ｂ１６細胞は、以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0165】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0166】
実験群２（ＧＰＮＡ）：培地＋ＧＰＮＡ １０μＭ
【0167】
１２時間処理後、４８時間活性化されたＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞と１:１０で共培養し、４時間後にフローサイトメトリーによりＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１発現を測定した。
【0168】
２）実験の結果
【0169】
図８Ｂから分かるように、ＧＰＮＡは腫瘍細胞へのトリプトファンの取り込みを阻害し、腫瘍細胞と共培養された特異的なＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞のＰＤ-１発現を有意に阻害することができる。
【0170】
実施例９：ＳＡＲ（サルコシン）とＢＣＨ（２-アミノ-２-ノルボルナンカルボン酸）は、ＣＤ８
+
Ｔ細胞のＰＤ-１発現を有意に阻害することができる
【0171】
１、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８の発現に対するＫｙｎの影響を検出する実験
【0172】
１）実験ステップ
【0173】
磁気ビーズソーティングにてＯＴ-１マウスの膵臓のＣＤ８+Ｔ細胞を取得し、２４ウェルプレートに播種した（１００万/ウェル）とともに抗ＣＤ３/ＣＤ２８磁気ビーズを入れて、Ｔ細胞を活性化した。培地はＲＰＭＩ-１６４０にマウスＩＬ-２を１０ｎｇ/ｍＬ添加したものとβ-メルカプトエタノール５０ｎＭである。以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0174】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0175】
実験群２（Ｋｙｎ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ
【0176】
４８時間後、各グループの細胞からＲＮＡを収集し、蛍光定量ＰＣＲによってＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８の発現を測定した。
【0177】
２）実験の結果
【0178】
図９Ａからわかるように、ＫｙｎはマウスＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８を大幅にアップレギュレートでき、トランスポーターＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８がＫｙｎ輸送プロセスで重要な役割を果たす。
【0179】
２、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現に対するＳＡＲ（サルコシン）とＢＣＨの影響を検出する実験
【0180】
１）実験ステップ
【0181】
磁気ビーズソーティングにてマウス膵臓ＣＤ８+Ｔ細胞を取得し、Ｕ底９６ウェルプレートに播種（１０万/ウェル）したとともに抗ＣＤ３/ＣＤ２８磁気ビーズを入れて、Ｔ細胞を活性化した。培地はＲＰＭＩ-１６４０にマウスＩＬ-２を１０ｎｇ/ｍＬ添加したものとβ-メルカプトエタノール５０ｎＭである。以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0182】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0183】
実験群２（Ｋｙｎ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ
【0184】
実験群３（Ｋｙｎ+ＳＡＲ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ＋ＳＡＲ １０ｍＭ
【0185】
実験群４（Ｋｙｎ+ＢＣＨ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ＋ＢＣＨ １００μＭ
【0186】
４８時間後、各グループのＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。
【0187】
２）実験の結果
【0188】
図９Ｂから分かるように、ＫｙｎはＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を有意に向上させた上で、ＳＡＲ及びＢＣＨを使用して、ＫｙｎトランスポーターＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８をそれぞれ阻害し、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を大幅に低減させることができる。
【0189】
３、特異的なＣＤ８+Ｔ細胞の機能に対するＳＡＲ及びＢＣＨの影響を検出する実験
【0190】
１）実験ステップ
【0191】
磁気ビーズソーティングにてＯＴ-１マウスの膵臓のＣＤ８+Ｔ細胞を取得し、Ｕ底９６ウェルプレートに播種した(１０万/ウェル）。以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0192】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0193】
実験群２（ＳＡＲ）：培地＋ＳＡＲ １０ｍＭ
【0194】
実験群３（ＢＣＨ）：培地＋ＢＣＨ １００μＭ
【0195】
Ｔ細胞を２４時間前処理した後、３Ｄ培養ＯＶＡ-Ｂ１６及びＯＴ-１ ＣＤ８+Ｔ細胞を１：１０で共培養し、４時間後、フローサイトメトリーにてＯＶＡ-Ｂ１６細胞のアポトーシスを測定した。
【0196】
２）実験の結果
【0197】
図９Ｃから分かるように、ＳＡＲ及びＢＣＨで前処理されたＴ細胞と共培養されたＯＶＡ-Ｂ１６腫瘍細胞は、アポトーシス割合が大幅に増加した。これは、ＳＡＲ及びＢＣＨがＴ細胞へのＫｙｎの取り込みを大幅に抑制し、ＰＤ-１発現をダウンレギュレートし、ＣＤ８+Ｔ細胞の殺傷機能を増強できる。
【0198】
実施例１０：ＳＡＲ及びＢＣＨは、ヒト末梢血ＣＤ８
+
Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を有意に阻害できる
【0199】
１、ヒト末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８の発現に対するＫｙｎの影響を検出する実験
【0200】
１）実験ステップ
【0201】
Ｆｉｃｏｌｌを使用して乳がん患者の末梢血を分離し、単核細胞を取得した。磁気ビーズにてＣＤ８+Ｔ細胞をソーティングし、Ｕ底９６ウェルプレートに播種した（１０万/ウェル）とともに抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズを入れて、Ｔ細胞を活性化した。培地はＲＰＭＩ-１６４０にヒトＩＬ-２を１０ｎｇ/ｍＬ添加したものである。以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0202】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0203】
実験群２（Ｋｙｎ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ
【0204】
４８時間後、細胞の各グループからＲＮＡを収集し、蛍光定量ＰＣＲによってＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８の発現を測定した。
【0205】
２）実験の結果
【0206】
図１０Ａからわかるように、Ｋｙｎは乳がん患者の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８を大幅にアップレギュレートでき、トランスポーターＰＡＴ４とＳＬＣ７Ａ８がＫｙｎ輸送プロセスで重要な役割を果たす。
【0207】
２、ヒト末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現に対するＳＡＲ及びＢＣＨの影響を検出する実験
【0208】
１）実験ステップ
【0209】
Ｆｉｃｏｌｌを使用して乳がん患者の末梢血を分離し、単核細胞を取得した。磁気ビーズにてＣＤ８+Ｔ細胞をソーティングし、Ｕ底９６ウェルプレートに播種した（１０万/ウェル）とともに抗ＣＤ３/ＣＤ２８ビーズを入れて、Ｔ細胞を活性化した。培地はＲＰＭＩ-１６４０にヒトＩＬ-２を１０ｎｇ/ｍＬ添加したものである。以下のようにグループを分けて薬物処理した。
【0210】
対照群１（ＰＢＳ）：培地＋ＰＢＳ
【0211】
実験群２（Ｋｙｎ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ
【0212】
実験群３（Ｋｙｎ+ＳＡＲ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ＋ＳＡＲ １０ｍＭ
【0213】
実験群４（Ｋｙｎ+ＢＣＨ）：培地＋Ｋｙｎ ２００μＭ＋ＢＣＨ １００μＭ
【0214】
４８時間後、各グループのＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。
【0215】
２）実験の結果
【0216】
図１０Ｂからわかるように、Ｋｙｎは乳がん患者の末梢血ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１発現を有意に増加させた上で、ＳＡＲ及びＢＣＨを使用して、ＫｙｎトランスポーターＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８をそれぞれ阻害し、ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を大幅に低減させることができる。
【0217】
本開示の実施例８～１０の結果によれば、阻害剤ＧＰＮＡを使用して腫瘍細胞のトリプトファン輸送体を阻害することにより、或いは阻害剤ＳＡＲ及びＢＣＨを使用してＣＤ８+Ｔ細胞ｋｙｎトランスポーターＰＡＴ４及びＳＬＣ７Ａ８をそれぞれ阻害することにより、特異的なＣＤ８+Ｔ細胞におけるＰＤ-１の発現を効果的に低減させ、特異的なＣＤ８+Ｔ細胞の腫瘍細胞への殺傷を増強することができる。
【0218】
本開示の上記実施例は、本開示を明確に説明するための例示にすぎず、本開示の実施形態を限定することを意図するものではない。当業者であれば、上記の説明に基づいて、他の異なる形態の変更または変動を行うこともできる。ここですべての実施形態を挙げることができず、その必要もない。本開示の要旨及び原理の範囲内で行われた修正、同等の変更及び改善は、本開示の請求の範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
