特許 7152050 幹細胞からドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-03

(45)【発行日】2022-10-12

(54)【発明の名称】幹細胞からドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0793 20100101AFI20221004BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20221004BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20221004BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20221004BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0793 ZNA

A61K35/30

A61P25/16

C12N5/074

C12N1/00 F

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2020518613

(86)(22)【出願日】2020-03-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 KR2020004065

(87)【国際公開番号】W WO2021060637

(87)【国際公開日】2021-04-01

【審査請求日】2020-03-31

(31)【優先権主張番号】10-2019-0118370

(32)【優先日】2019-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0027801

(32)【優先日】2020-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】517119589

【氏名又は名称】エス－バイオメディックス

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ミョン ス

(72)【発明者】

【氏名】オム，ジャン ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ナム，スン テク

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５０１１９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５１０８０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１８３７３６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／０７９３

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次のステップを含む幹細胞からドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）への分化誘導方法：
ａ）ＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤を添加することにより、幹細胞（stem cells）を単一細胞層の形態に培養するステップ；
ｂ）ＢＭＰ信号経路抑制剤、アクチビン／ノーダル信号経路抑制剤、ＳＨＨ（sonic hedgehog）信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤を添加することにより、胚芽体（Embryoid Body）を形成させて維持培養するステップ；
ｃ）神経ロゼット（neural rosette）を形成させるステップ；及び
ｄ）神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ。

【請求項2】

前記方法は次のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ｅ）ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。

【請求項3】

前記幹細胞は、胚芽幹細胞（Embryonicstem cells）、誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells、ｉＰＳＣｓ）、成体幹細胞（Adult stem cells）、核置換胚芽幹細胞（Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell）、または直接分化法（direct reprograｍｍing）により生成される幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記方法は細胞外基質（extracellular matrix；ＥＣＭ）で培養することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ａ）ステップはステップの終了日から１－３日前から１日毎にＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記ｂ）ステップはステップの開始日から１日毎にＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤を添加し、ステップの開始日から２－６日目に１日毎にＳＨＨ（sonic hedgehog）信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ｃ）ステップはステップの開始日から１日毎にＳＨＨ信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ｄ）ステップはステップの開始日から１日毎にＳＨＨ信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記ｄ）ステップはステップの開始日から１日毎に培地を交替し、３日毎に継代培養して遂行されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ＢＭＰ信号経路抑制剤はドルソモルヒネ（dorsomorphin）であり、前記アクチビン／ノーダル信号経路抑制剤は４－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２イル）－ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）であることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。

【請求項11】

前記ＳＨＨ信号経路活性剤はＳＡＧ（Smoothened Agonist）であり、前記ＧＳＫ－３抑制剤はＣＨＩＲ９９０２１であることを特徴とする、請求項６から８のうち、いずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記方法はドーパミン神経前駆細胞への分化率が８０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ドーパミン神経前駆細胞はＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現が増加したことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ドーパミン神経前駆細胞はパーキンソン病の症状を緩和させるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

次のステップを含むドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）の大量生産方法：
ａ）ＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤を添加することにより、幹細胞（stem cells）を単一細胞層の形態に培養するステップ；
ｂ）ＢＭＰ信号経路抑制剤、アクチビン／ノーダル信号経路抑制剤、ＳＨＨ（sonic hedgehog）信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤を添加することにより、胚芽体（Embryoid Body）を形成させて維持培養するステップ；
ｃ）神経ロゼット（neural rosette）を形成させるステップ；
ｄ）神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ；及び
ｅ）ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は幹細胞由来中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞の分化誘導及び大量生産方法に関する。

【0002】

本発明は大韓民国保健福祉部の支援下で課題番号ＨＩ１８Ｃ００９６によりなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は韓国保健産業振興院、研究事業名は“先端医療技術開発”、研究課題名は“機能及び効能基盤全能幹細胞由来パーキンソン病細胞治療剤開発”、主管機関は株式会社エスバイオメディックス、研究期間は２０１８．０４．３０．～２０２２．１２．３１．である。

【0003】

本特許出願は２０１９年９月２５日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１１８３７０号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。

【0004】

〔背景技術〕
幹細胞（stem cell）とは、組織を構成する各細胞に分化（differentiation）される前段階の未分化細胞を総称し、特定分化刺激（環境）により特定細胞に分化が進行される。幹細胞はこれ以上分裂しない完全に分化された細胞とは異なり、細胞分裂により自身と同一な細胞が生産（self-renewal）できるので増殖（proliferation;expansion）する特性があり、また分化刺激が加えられれば特定細胞に分化されるが、他の環境または他の分化刺激により他の細胞にも分化できるので、分化に柔軟性（plasticity）を有していることが特徴である。

【0005】

現在幹細胞は細胞治療剤として脚光を浴びているが、神経細胞の損傷により誘発される多様な神経疾患（neurological diseases）の細胞治療剤としても多くの研究がなされている。特に、脳神経系疾患は他のどの疾病より細胞移植治療に最も適切な対象と見なされるが、これは脳神経系組織が他の組織とは異なり、免疫拒否反応がほとんどなくて、外部から細胞を移植した時、移植された細胞の長期間生存を期待することができるためである。

【0006】

一方、細胞治療剤としての幹細胞の有用性を高めるためには幹細胞を効率よく特定細胞に分化させる技術及び所望の時期に特定細胞が供給できる技術が必要である。

【0007】

しかしながら、現在まで幹細胞を臨床に適用できる水準の高収率で特定細胞（特に、ドーパミン神経細胞）に分化する技術及び適正段階で細胞を保管する技術は開発されていない状況である。

【0008】

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは脳神経系疾患のための細胞治療剤を開発するために幹細胞を中脳－特異的ドーパミン神経前駆細胞に分化誘導させることができる製造方法を開発するために努力した。その結果、中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞を臨床に適用できる程度の高収率で大量生産できる方法を考案することによって、本発明を完成するようになった。

【0009】

したがって、本発明の目的は幹細胞からドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）への分化誘導方法を提供することにある。

【0010】

本発明の他の目的は、ドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）の大量生産方法を提供することにある。

【0011】

〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは脳神経系疾患のための細胞治療剤を開発するために幹細胞を中脳－特異的ドーパミン神経前駆細胞に分化誘導させることができる製造方法を開発するために努力した。その結果、中脳－特異的ドーパミン神経前駆細胞を臨床に適用できる程度の高収率で大量生産できる方法を考案した。

【0012】

また、本発明者らは分化誘導された中脳－特異的ドーパミン神経前駆細胞を適正段階で作業用細胞銀行（working cell bank、ＷＣＢ）に貯蔵できる効率的な方法を糾明した。

【0013】

本発明は幹細胞からドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）への分化誘導方法及びドーパミン神経前駆細胞の大量生産方法に関するものである。

【0014】

以下、本発明をより詳細に説明しようとする。
本発明の一様態は次の段階を含む幹細胞からドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）への分化誘導方法に関するものである。
ａ）幹細胞（stem cells）を単一細胞層の形態に培養するステップ；
ｂ）胚芽体（embryoid body）を形成させて維持培養するステップ；
ｃ）神経ロゼット（neural rosette）を形成させるステップ；及び
ｄ）神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ。

【0015】

以下、本発明のドーパミン神経細胞製造方法に対して詳細に説明する。
ａ）ステップ

【0016】

本ステップは未分化幹細胞ステップでＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤で前処理して幹細胞に刺激を加える過程である。本過程により幹細胞は前記物質で前処理されない幹細胞に比べて外胚葉（ectoderm）、特に神経外胚葉（neurectoderm）への分化効率が増加する。

【0017】

前記幹細胞は胚芽幹細胞（embryonic stem cells）、誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells、ｉＰＳＣｓ）、成体幹細胞（Adult stem cells）、核置換胚芽幹細胞（Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell）、または直接分化法（direct reprogramming）により生成される幹細胞でありうる。

【0018】

本ステップは５－９日または８日間遂行されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0019】

前記範囲で分化を進行すれば胚芽体形成にコラーゲナーゼを使用しない方法により胚芽体を得ることができ、前記範囲から外れる場合、目的細胞でない自然分化が起こるか、または分化の次のステップである胚芽体形成に問題が発生することがある。一方、使われる幹細胞種類によって作用する期間が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適期間を設定することができる。

【0020】

本ステップはステップの終了日から１－３日前から１日毎にＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤が添加されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0021】

前記ＢＭＰ信号経路抑制剤はドルソモルヒネ（dorsomorphin）、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７、ノギン（Noggin）、コルジン（Chordin）、グレムリン （Gremlin）、Ｓｏｇ（shortgastrulation）、フォリスタチン（Follistatin）、ＤＡＮ（differential screening=selected gene aberrant in neuroblastoma）、ケルベルス（Cerberus）、ダンテ（Dante）及び／又はＰＲＤＣ（Protein Related to DAN and Cerberus）でありうるが、当業界に公知されている多様なＢＭＰ信号経路抑制剤は選択的に制限無しで使われることができる。

【0022】

本発明で“ドルソモルヒネ（dorsomorphin）”はＢＭＰ信号経路を抑制する物質であって、ＢＭＰ自体を抑制するか、またはＢＭＰがＢＭＰ受容体に結合することを抑制する役割をする。

【0023】

前記ドルソモルヒネは次のような化学式１で表示することができる:

【0024】

【化1】

【0025】

本ステップで添加されるＢＭＰ信号経路抑制剤の濃度は１．０乃至２０．０ｕＭ、４．０乃至６．０ｕＭ、または５．０ｕＭでありうるが、これに制限されるのではない。

【0026】

前記範囲から外れる場合、細胞死滅が起こる問題がある。一方、使われる幹細胞の種類によって作用する濃度が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に各々の最適濃度を設定することができる。

【0027】

前記アクチビン／ノーダル信号経路抑制剤は４－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２イル）－ベンズアミド、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７、及び／又はフォリスタチン（Follistatin）でありうるが、当業界に公知されている多様なアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤は選択的に制限無しで使われることができる。

【0028】

本発明で“４－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２イル）－ベンズアミド”は当業界でＳＢ４３１５４２として知られており、アクチビン／ノーダル（Activin/Nodal）信号経路を抑制する物質であって、アクチビン／ノーダル自体を抑制するか、またはアクチビン／ノーダルがその受容体に結合することを抑制する役割をする。

【0029】

前記４－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２イル）－ベンズアミドは次のような化学式２で表示できる：

【0030】

【化2】

【0031】

本発明において、前記化学式１で表示される化合物はＳＢ４３１５４２と混用して使われる。

【0032】

本ステップで添加されるアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤の濃度は１．０乃至５０．０ｕＭ、４．０乃至６．０ｕＭ、または５．０ｕＭでありうるが、これに制限されるのではない。

【0033】

前記範囲から外れる場合、細胞死滅が起こる問題がありうる。一方、使われる幹細胞の種類によって作用する濃度が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に各々の最適の濃度を設定することができる。

【0034】

本ステップはＴｅＳＲ２細胞培養培地で培養されるものでありうる。これは臨床進入及び細胞治療剤に使用するためであり、ＴｅＳＲ２細胞培養の培地だけでなく、臨床進入可能な幹細胞培養液は選択的に制限無しで使われることができる。

【0035】

ｂ）ステップ

【0036】

本ステップは胚芽体（Embryoid Body）を形成させ、形成された胚芽体を培養させながらＳＨＨ（sonic hedgehog）信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤で処理して胚芽体に刺激を加える過程である。本過程により胚芽体は前記物質で処理できない胚芽体に比べてドーパミン神経前駆細胞への分化収率が増加する。

【0037】

本発明で“胚芽体（Embryoid Body）”は胚芽幹細胞に代表される全能幹細胞の３次元集合体を意味し、全能幹細胞は胚芽体を通じて初期胚芽発生ステップの分化過程を再現することができ、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての三胚葉性体細胞に分化可能である。

【0038】

本ステップは３－６日、４日、５日、または６日間遂行されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0039】

前記範囲で遂行される場合、ドーパミン神経前駆細胞分化率（収率）が極大化できる効果があり、前記範囲から外れる場合、胚芽体状態に悪影響を及ぼして分化率が低調になる問題がありうる。一方、使われる幹細胞種類によって作用する期間が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適の期間を設定することができる。

【0040】

本ステップはステップの開始日から１日毎にＢＭＰ信号経路抑制剤及びアクチビン／ノーダル信号経路抑制剤が添加されるものでありうる。これにより神経外胚葉への分化効率がより増加できる。

【0041】

また、本ステップはステップの開始日から２－６日目に１日毎にＳＨＨ信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤が添加されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0042】

前記ＳＨＨ信号経路活性剤は、ＳＡＧ（Smoothened Agonist）、パルモルファミン（Purmorphamine）、ハルシノニド（Halcinonide）、フルチカゾン（Fluticasone）、クロベタゾール（Clobetasol）、及び／又はフルオシノニド（Fluocinonide）でありうるが、当業界に公知されている多様なＳＨＨ信号経路活性剤は選択的に制限無しで使われることができる。

【0043】

本発明で“ＳＡＧ（Smoothened Agonist）”はＳＨＨ（sonic hedgehog）信号経路を活性化する低分子化合物で、ＳＨＨは神経外胚葉発生ステップで中脳腹側ドーパミン神経細胞の分化と分布に重要な役割をする。

【0044】

また、下記の実施例によれば、前記ＳＡＧはドーパミン神経前駆細胞の重要マーカーのうちの１つであるＦＯＸＡ２発現を増加させる役割をする。ＦＯＸＡ２（winged helix/forkhead box A2）（ＨＮＦ３ｂｅｔａ）は転写因子（transcription factor）で、中枢神経系（central nervous system、ＣＮＳ）発生に重要な役割をし、中脳特異的発達に関与するいろいろな遺伝子発現及び中脳特異的ドーパミン神経細胞生成に影響を及ぼす。

【0045】

一方、ＳＨＨ信号経路活性剤は下記で説明するＧＳＫ－３抑制剤と連係して高収率の中脳特異的ドーパミン前駆細胞分化に関与するので、ＳＨＨ信号経路活性剤単独使用では中脳特異的ドーパミン前駆細胞に分化が不可能である。
前記ＳＡＧは次のような化学式３で表示することができる：

【0046】

【化3】

【0047】

本ステップで添加されなるＳＨＨ信号経路活性剤の濃度は０．１乃至５．０ｕＭ、０．６乃至５．０ｕＭ、または１．０ｕＭでありうるが、これに制限されるのではない。

【0048】

前記範囲から外れる場合、他の細胞に分化できる問題がある。一方、使われる幹細胞種類によって作用する濃度が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適の濃度を設定することができる。

【0049】

前記ＧＳＫ－３抑制剤は6-[[2-[[4-（2,4-Dichlorophenyl）-5-（5-methyl -1H-imidazol-2-yl）-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile（CHIR99021）、3-（2,4-Dichlorophenyl）-4-（1-methyl-1H-indol-3-yl）-1H-pyrrole-2,5- dione（SB216763）、N6-[2-[[4-（2,4-Dichlorophenyl）-5-（1H-imidazol-2-yl）-2-pyri midinyl]amino]ethyl]-3-nitro-2,6-－pyridinediamine（CHIR98014）、TWS119、Tideglusib、3-[（3-Chloro-4-hydroxyphenyl）amino]-4-（2-nitrophenyl）-1H-pyrrol- 2,5-dione（SB415286）、（2’Z、3’E）-6-Bromoindirubin-3’-oxime（BIO）、Valproicacid、5-Iodo-7-β-D-ribofuranosyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine（Iodotubercidin）、１－Azakenpaullone、クルクミン（Curcumin）、オランザピン（Olanzapine）、及び／又はピリミジン（Pyrimidine）でありうるるが、当業界に公知されている多様なＧＳＫ－３抑制剤は選択的に制限無しで使われることができる。

【0050】

本発明で“ＣＨＩＲ９９０２１”はウィント／ベータ－カテニン（Wnt/beta-catenin）信号経路を活性化する低分子化合物（ＧＳＫ－３抑制剤）で、ウィント／ベータ－カテニン信号は外胚葉及び神経発生ステップを調節し、ＳＨＨと共に中脳ドーパミン神経細胞の分化に重要な役割をする。

【0051】

また、下記の実施例によれば、前記ＣＨＩＲ９９０２１はドーパミン神経前駆細胞の重要マーカーのうちの１つであるＬＭＸ１Ａ及びＥＮ－１の発現を増加させる役割をする。

【0052】

一方、ＧＳＫ－３抑制剤は前記で説明したＳＨＨ信号経路活性剤と連係して高収率の中脳特異的ドーパミン前駆細胞分化に関与するので、ＧＳＫ－３抑制剤単独使用ではドーパミン神経前駆細胞分化が不可能であり、後脳細胞側に徐々に発達し、処理を持続すれば細胞の増殖に関与するようになるが、移植時に安全性の問題が生じることがある。

【0053】

前記ＣＨＩＲ９９０２１は、次のような化学式４で表示することができる：

【0054】

【化4】

【0055】

本ステップで添加されるＧＳＫ－３抑制剤の濃度は０．１乃至５．０ｕＭ、１．６乃至５．０ｕＭ、または２．０ｕＭでありうるが、これに制限されるのではない。

【0056】

前記範囲から外れる場合、他の細胞に分化する問題がありうる。一方、使われる幹細胞種類によって作用する濃度が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適の濃度を設定することができる。

【0057】

本ステップはｂＦＧＦが含まれない（ｂＦＧＦ－ｆｒｅｅ）ＥＳ細胞培養培地で培養されるものでありうるが、ＥＢ培養可能な培養液は選択的に制限無しで使われることができる。

【0058】

ｃ）ステップ

【0059】

本ステップは神経ロゼット（neural rosette）を形成させる過程である。本過程により神経外胚葉細胞のうち、神経細胞側に分化が予定された細胞を増殖させ、選別できるようになる。

【0060】

本発明で“神経ロゼット（neural rosette）”はいろいろな種類の神経細胞になることができる運命を有する細胞集団を意味する。

【0061】

本ステップは、３－６日、４日、または５日間遂行されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0062】

前記範囲から外れる場合、神経ロゼットが維持されなくて分化が進行されないか、または他の分化方向に進行される問題がありうる。一方、使われる幹細胞の種類によって作用する期間が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適の期間を設定することができる。

【0063】

本ステップはステップの開始日から１日毎にＳＨＨ信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤が添加されるものでありうる。これによって、よりいろいろな種類の神経細胞に分化可能な一般的な神経ロゼットとは異なり、ドーパミン神経前駆細胞になることができる運命を有する細胞を大量に得ることができる。

【0064】

本ステップはＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地で培養されるものでありうるが、神経ロゼットが形成／維持可能な培養液は選択的に制限無しで使われることができる。

【0065】

前記細胞培養培地はN2 supplement CTS、human insulin及びbFGFを追加的に含むことができる。

【0066】

ｄ）ステップ

【0067】

本ステップは神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）に分化させる過程である。本過程により神経ロゼットのみ選別して神経細胞を除外した他の分化細胞を排除し、より好ましくはドーパミン神経前駆細胞分化が強化できるようになる。

【0068】

本発明で“神経細胞（neural cells）”は神経系を構成する細胞で、ニューロン（neuron）と同一な意味として使われることができる。

【0069】

本発明で“ドーパミン神経細胞（dopaminergic neural cells）”は神経伝達物質であるドーパミン（dopamine）を分泌する神経細胞を意味する。

【0070】

本発明で“前駆細胞（precursor cells）”は完全に分化が終了した細胞の形質を発現する以前の分裂可能な細胞を意味し、”progenitors“、”precursors“及び”precursor cell“全て同一な意味として使われることができる。

【0071】

したがって、本発明で“ドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）”は生体内移植後、成熟ステップ（maturation）を経てドーパミンを分泌する神経細胞に分裂可能な細胞を意味する。

【0072】

本ステップは８－１０日、または９日間遂行されるものでありうるが、これに制限されるのではない。

【0073】

前記範囲未満時、ドーパミン前駆細胞分化率が低くなることがあり、前記範囲超過時、大量生産が不可能でありうる。一方、使われる幹細胞の種類によって作用する期間が相異するので、前記範囲内で幹細胞別に最適の期間を設定することができる。

【0074】

本ステップはステップの開始日から１日毎にＳＨＨ信号経路活性剤及びＧＳＫ－３抑制剤が添加されるものでありうる。これにより分化日数が経るほど大部分の細胞（約８０％以上まで）がドーパミン神経前駆細胞に分化できる。

【0075】

本ステップはステップの開始日から１日毎に培地を交替し、３日毎に継代培養して遂行されるものでありうる。これによりドーパミン神経前駆細胞を大量増殖させ、ドーパミン神経前駆細胞の状態を最上に維持することができ、分化率を高めることができる。

【0076】

本ステップはＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地で培養されるものでありうるが、ドーパミン前駆細胞が分化／増殖可能な培養液は選択的に制限無しで使われることができる。

【0077】

前記細胞培養培地はN2 supplement CTS及びB-27 supplement CTSをさらに含むことができる。

【0078】

前記の方法は次のステップをさらに含むものでありうる。

【0079】

ｅ）ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。

【0080】

ｅ）ステップ

【0081】

本ステップはドーパミン神経前駆細胞を増殖させて大量生産する過程である。本過程により安定した細胞供給が可能であるだけでなく、ドーパミン神経前駆細胞の分化率を高めるようになる。

【0082】

前記方法により誘導されたドーパミン神経前駆細胞には分化率が８０％以上でありうるが、これに制限されるのではない。

【0083】

前記方法により誘導されたドーパミン神経前駆細胞はＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、及び／又はＥｎ１発現が増加されたものでありうる。

【0084】

本発明の一実施例によれば、前記方法により誘導されたドーパミン神経前駆細胞はパーキンソン病の症状を緩和させるものでありうる。

【0085】

前記方法の各ステップの細胞培養には細胞外基質（extracellular matrix；ＥＣＭ）がさらに含まれたものでありうる。これは未分化幹細胞及び神経細胞は自力で培養皿に付着して成長できないので、細胞外基質または他の支持細胞の助けを受けなければ維持培養できないためである。

【0086】

前記細胞外基質は、例えば、ラミニン（Laminin）でありうるが、これに制限されるのではない。細胞外基質はラミニンの他にも他の物質単独または混合して使用可能であり、幹細胞の種類によって他の細胞外基質を使用することができる。

【0087】

前記細胞外基質の濃度は３．５－５．５、４．０、または５．０ｕｇ／ｍＬでありうるが、これに制限されるのではない。

【0088】

前記範囲から外れる場合、ドーパミン神経前駆細胞に分化不可能であるか、または付着力の問題によって製造過程上の問題が発生することがある。

【0089】

前記の方法により収得した神経前駆細胞は、特に神経退行性疾患、例えばアルツハイマー病、ハンティングトン疾病、パキスン氏疾病、及び筋萎縮性側索硬化症に適用されてこれらの疾患を治療することができる。

【0090】

本発明の他の様態は次のステップを含むドーパミン神経前駆細胞（dopaminergic neural precursor cells）の大量生産方法に関するものである。
ａ）幹細胞（stem cells）を培養するステップ；
ｂ）胚芽体（embryoid body）を形成させて維持培養するステップ；
ｃ）神経ロゼット（neural rosette）を形成させるステップ；
ｄ）神経ロゼットをドーパミン神経前駆細胞に分化させるステップ；及び
ｅ）ドーパミン神経前駆細胞を継代培養して増殖させるステップ。

【0091】

前記ドーパミン神経前駆細胞の大量生産方法において、前記ドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法と重複する内容は本明細書の複雑性を考慮して省略する。

【0092】

〔発明の効果〕
本発明は幹細胞からドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法及びドーパミン神経前駆細胞の大量生産方法に関するものである。本発明の方法を用いる場合、幹細胞を効率よく神経前駆細胞に分化させることができるところ、これを関連の研究開発及び製品化に有用に使用することができる。

【0093】

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本発明の一実施例に従うドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法を模式化した図である。
〔図２ａ及び図２ｂ〕本発明の一実施例に従って最適の幹細胞培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図３〕本発明の一実施例に従って最適の胚芽体培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図４ａ乃至図４ｃ〕本発明の一実施例に従って胚芽体培養時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適処理時期を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図５ａ及び図５ｂ〕本発明の一実施例に従って胚芽体形成ステップの必要か否かを確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図６〕神経ロゼット形成時、最適の培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図７ａ及び図７ｂ〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、最適の培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図８ａ乃至図８ｄ〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図９ａ乃至図９ｃ〕本発明の一実施例に従ってＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図１０ａ及び図１０ｂ〕本発明の一実施例に従ってＥＣＭの最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図１１ａ及び図１１ｂ〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の最終分化率を確認した図である。（１１ａ：胚芽幹細胞由来、１１ｂ：誘導多能性幹細胞由来）
〔図１２〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の大量生産を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）
〔図１３ａ及び図１３ｂ〕本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の生体内（in vivo）効能を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【0094】

〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。

【0095】

人間胚芽幹細胞（human Embryonic stem cells、ｈＥＳＣ）培養

【0096】

ドーパミン神経細胞分化のための未分化されたｈＥＳＣｓ（ＳＮＵ３２、ソウ大学校幹細胞銀行）はＣＥＬＬｓｔａｒｔコーティング培養皿でＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、ＳＣＲ５８６０）培養液を使用して培養した。

【0097】

この際、未分化幹細胞は単一（monolayer）細胞層形態に培養した。７日間培養を原則とし、かつ９０～９５％位の細胞が増殖すればＶｅｒｓｅｎｅ（ＧＩＢＣ０、１５０４０－０６６）を使用して４分間３７℃培養基で反応後、スクラッパー（scraper）で細胞を回収し、１５ｍｌチューブに移した。１０００Ｐピペットで 約８～１２回ピペッティング後１：７割合（ＣＥＬＬｓｔａｒｔ－ＣＴＳ ｃｏａｔｉｎｇ ｄｉｓｈ基準）で継代培養し、７日間毎日２４時間が経る前に培養液を交替して維持した。

【0098】

誘導多能性幹細胞（Induced pluripotent stem cells、ｉＰＳＣｓ）培養

【0099】

前記ｈＥＳＣ培養方法と同一な方法によりドーパミン神経細胞分化のための未分化されたｉＰＳＣｓ（ｈＦＳｉＰＳ１、国家幹細胞銀行、寄託機関：国立保健研究院難治性疾患課）を培養した。

【0100】

免疫細胞化学（Immunocytochemistry）分析

【0101】

細胞を４％パラホルムアルデヒ溶液に１０分間固定させた。

【0102】

各々の抗体が細胞質内によく透過されるようにするために、０．１％ Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ－１００（ｉｎ ＰＢＳ）溶液で１５分間反応させ、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｉｎ ＰＢＳ）溶液で室温で１時間の間反応させた。

【0103】

次に、一次抗体（下記の表１参照）と４℃で細胞を結合させた。前記一次抗体が結合された細胞を確認するために、各々の一次抗体由来種に合う（下記の表１参照）二次抗体を使用した。

【0104】

最後に、細胞核を確認するために、４'，６－ダイアミノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）が含まれたＰＢＳに１０分間反応させて核染色を完了した後、蛍光顕微鏡を使用してイメージを獲得し、重要マーカーを確認及び分析した。

【0105】

【表1】

【0106】

遺伝子発現（Gene expression）分析（ｑＲＴ－ＰＣＲ）

【0107】

細胞を回収して総ＲＮＡはEasy-Spin Total RNA抽出キット（iNtRON Biotechnology）を使用して分離した。ｃＤＮＡはPrimeScript^TMRT Master Mix（TAKARA Bio Inc.）を使用して総ＲＮＡ １ｕｇで合成した。ｍＲＮＡ水準はSYBR（登録商標）Premix Ex Taq^TM（TAKARA Bio Inc.）及びCFX96 Real-Time System（Bio-Rad）を使用してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析で定量化した。遺伝子発現分析に使われたプリマーの序列は下記の表２に示した。

【0108】

【表2】

【0109】

実施例．ドーパミン神経前駆細胞への分化プロトコル

【0110】

前記で培養されたｈＥＳＣまたはｉＰＳＣに対して、ＭＣＢ（Master Cell Bank）を解凍した時点から２回継代培養で安定化を経て３回目継代培養皿を使用してドーパミン神経前駆細胞分化を始めた。

【0111】

３回目継代培養皿を作る日を分化開始日（ｄ０）にして、分化６日目（ｄ６）にｈＥＳＣ培養液（ＴｅＳＲ２、ＳＴＥＭＣＥＬＬ、ＳＣＲ５８６０）に５ｕＭのドルソモルヒネ（dorsomorphin、以下、ＤＭ）（Millipore、１７１２６０）及び５ｕＭのＳＢ４３１５４２（以下、 ＳＢ）（Sigma、Ｓ４３１７）を８日目まで２日間前処理して神経外胚葉への分化占有度を高めた。

【0112】

分化８日目（ｄ８）に単一細胞層形態に培養中であるｈＥＳＣに対して、１ｍｌ ２６Ｇ注射器を使用して１．５ｍｍ間隔で碁盤形態（格子）を作り、約３０分間３７℃培養基に入れて放置するか、またはコラゲナーゼ（Collagenase；Animal Origin Free（ＣＬＳＡＦＣ）、Worthington、ＬＳ００４１３８）を２ｍｌ入れて、約５分間３７℃培養基に入れて反応させて胚芽体の土台になる１．５ｍｍ正方形細胞シートを形成して胚芽体（Embryoid Body；以下、ＥＢ）を誘導し、ｂＦＧＦ－ｆｒｅｅ ｈＥＳＣ培養液（ＥＢ培養液）で培養した。この際、前処理１５ｕＭ ＤＭ及び５ｕＭ ＳＢは分化１２日目まで４日間処理し、分化１０日目（ｄ１０）から１２日目（ｄ１２）まではドーパミンパターニング因子１．０ｕＭ ＳＡＧ（smoothened agonist、Millipore、５６６６６１、以下、ＳＡＧ）及び２．０ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Milteny、１３０－１０６－５３９）をさらに前処理して中脳ドーパミン神経前駆細胞の占有度を高めた。

【0113】

分化１２日目（ｄ１２）に２０ｕｇ／ｍＬヒトインシュリン溶液及び２０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（ｍＮ２＋ｂ）を使用してLaminin－５２１－コーティング培養皿に前記ステップで形成されたＥＢを付着（ｐＥＢステップ）し、５日間ドーパミンパターニング因子１．０ｕＭ ＳＡＧ（smoothened agonist）及び２．０ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１を処理した。

【0114】

分化１７日目（ｄ１７）に付着されたＥＢで形成された神経ロゼットをアキュターゼ（Accutase；Millipore、ＳＣＲ００３）で２分間処理する方法、またはガラスピペットを加工して研究者が直接分離する方法を使用して別途のLaminin-521コーティング培養皿に再付着した。再付着時、培養液はドーパミン神経前駆細胞培養液に使用中であるＮ２（Ｎ－２ supplement、ＣＴＳ等級、ＧＩＢＣＯ、Ａ１３７０７０１、以下、Ｎ２）及びＢ２７（Ｂ－２７ supplement xenofree、ＣＴＳ等級、ＧＩＢＣＯ、Ａ１４８６７０１、以下、Ｂ２７）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（Ｎ２Ｂ２７培養液）に１．０ｕＭ ＳＡＧ及び２．０ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１を追加した培養液を使用するが、再付着する時は１０ｕＭ Ｙ２７６３２を追加して１時間の間細胞の付着を助けて、１時間後Ｙ２７６３２のない培養液に再交替してくれた。２０日目（ｄ２０）まで毎日２４時間が経る前に培養液を交替し、ドーパミン神経前駆細胞分化を続けて誘導した。この際、アキュターゼを処理する場合には神経ロゼットを除外した他の細胞を分離除去し、スクラッパーを使用して神経ロゼット塊りのみ１５ｍｌチューブに移し２００Ｐピペットでピペッティング約４０回に細かく壊してLaminin－５２１コーティング培養皿に再付着した。また、ガラスピペットを使用する方法は実体顕微鏡下でロゼット部分のみガラスピペットに落とし、浮遊させて１５ｍｌチューブに移した後、２００Ｐピペットでピペッティング約４０回に細かく壊してLaminin－５２１コーティング培養皿に再付着した。

【0115】

分化２０日目（ｄ２０）にアキュターゼを使用してドーパミン神経前駆細胞を単一細胞に分離し、Ｎ２Ｂ２７培養液に１．０ｕＭ ＳＡＧ及び２．０ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１を追加した培養液で４．０x１０^６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍ ｄｉｓｈ密度でLaminin－５２１コーティング培養皿に再付着した。毎日培養液を交替し、３日間隔で４．０x１０^６ｃｅｌｌｓ／３５ｍｍ ｄｉｓｈ密度でLaminin－５２１コーティング培養皿に再付着して細胞を大量増殖させた後、２６日目（ｄ２６）にＷＣＢ（Working Cell Bank）を製造した。

【0116】

［臨床進入］２６日目に製造されたＷＣＢから再付着方法のようにアキュターゼを使用してドーパミン神経前駆細胞を単一細胞に分離し、３．０x１０^６ｃｅｌｌｓ／ｖｉａｌ単位または凍結液で保証する範囲内に分株してバイアル（ｖｉａｌ）を製造した。

【0117】

［移植細胞準備］ＷＣＢを解凍して９日後使用した。３５ｍｍ培養皿基準４．０x１０^６細胞が必要であるので、２バイアル（３．０x１０^６ｃｅｌｌ基準）を使用してトリパンブルー溶液を使用して細胞個数を把握し、生きている細胞４．０x１０^６個を３５ｍｍ Laminin－５２１コーティング培養皿に付着した後、Ｎ２Ｂ２７培養液で総分化３５日目（ｄ３５）まで毎日培養液を交替して培養した。この時にも３５日目まで３日間隔で再付着する方法を使用して分化誘導及び増殖させた。

【0118】

具体的なプロトコルは、図１に示した。

【0119】

実験例１．幹細胞培養ステップ
１－１．ＤＭ及びＳＢ４３１５４２処理時期の最適化

【0120】

培養６日目からＤＭ及びＳＢ４３１５４２を処理する代わり、培養８日目からＤＭ及びＳＢ４３１５４２を処理する方法を使用して本発明の方法と比較した。

【0121】

図２ａから確認できるように、胚芽体形成ステップである培養８日目からＤＭ及びＳＢ４３１５４２を処理する場合（既存の方法）に比べて、幹細胞培養ステップである培養６日目からＤＭ及びＳＢ４３１５４２を前処理する場合（本発明の方法）形成された神経ロゼットの状態及び収率がより良くなることが分かった。

【0122】

このような結果は、胚芽体形成の以前である未分化細胞ステップからＤＭ及びＳＢ４３１５４２を前処理することによって胚芽体形成時、神経外胚葉性分化占有度を高めるだけでなく、最終ドーパミン神経前駆細胞の分化率を画期的に増加させることができることを示唆する。

【0123】

１－２．培養期間の最適化

【0124】

培養８日目に胚芽体形成のための格子を作る代わり、７日目から９日目までＤＭ及びＳＢ４３１５４２を前処理し、培養９日目に胚芽体形成のための格子を形成させる方法を使用して本発明の方法と比較した。

【0125】

図２ｂから確認できるように、培養９日目に胚芽体を形成させれば細胞の付着力が非常に弱くなって線を引いた時、細胞がそのまま培養液に浮かんでしまい格子を出す前に培養皿から剥けて１．５ｍｍ正方形細胞シートを作ることが難しかったが（図２ｂ左方）、培養８日目に胚芽体形成のための格子を作れば（本発明の方法）正常に１．５ｍｍ細胞シートを作ることができることが分かった（図２ｂ右方）。

【0126】

実験例２．胚芽体（Embryoid Body）形成及び維持培養ステップ
２－１．培養期間の最適化

【0127】

培養１２日目（胚芽体形成／維持４日目）にＥＢを培養皿に付着する代わり、培養１３日目までＤＭ及びＳＢ４３１５４２を処理しながらＥＢを誘導する方法を使用して本発明の方法と比較した。

【0128】

図３から確認できるように、４日目（培養１２日目）まではＥＢが大部分単独によく維持されるが、５日目（培養１３日目）以後、高い頻度でＥＢが互いに付いてまた大きい塊りになる現象が発生した。

【0129】

２－２．ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１処理時期の最適化

【0130】

培養１０日目からＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する代わり、培養６日目または８日目からＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する方法を使用して本発明の方法と比較した。

【0131】

図４ａ乃至４ｃから確認できるように、分化６日目にＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する場合（図４ａ）、神経ロゼットは正しく形成されず、他の分化細胞形態がたくさん発見され、分化８日目にＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する場合（図４ｂ）、分化１０日目からＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する場合（図４ｃ）に比べて神経ロゼット部分の形態が崩れながら神経ロゼットの状態が悪くなることが分かった。

【0132】

２－３．単一（monolayer）分化比較

【0133】

培養／分化工程の単純化が可能か否かを確認するために、胚芽体形成過程（培養８日目～１２日目）無しで残りの条件は前記実施例の方法と同一なプロトコルを使用してドーパミン神経前駆細胞に分化させた後、総分化２７日目のＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現有無を本発明の方法と比較した。

【0134】

図５ａ及び５ｂから確認できるように、胚芽体形成無しで単層に神経外胚葉に分化を進行する場合（図５ａ）、胚芽体を形成して分化を進行する場合（本発明の方法、図５ｂ）に比べてＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現水準が相当に低く表れた。

【0135】

実験例３．神経ロゼット（neural rosette）の形成ステップ
３－１．分化期間の最適化

【0136】

培養１７日目（神経ロゼット形成５日目）に神経ロゼットを別途の培養皿に再付着する代わり、培養１８日目（神経ロゼット形成６日目）まで神経ロゼットを形成させる方法を使用して本発明の方法と比較した。

【0137】

図６から確認できるように、神経ロゼット形成５日目までは神経ロゼットが良い状態に維持され増加する一方（本発明の方法）、６日目になれば高い頻度で外方の神経ロゼットから白く浮かぶ現象が発生した。また、細胞の形態が変わりながら中間のロゼット中心部は黒く変わってＰＢＳで洗いか（水洗）、または培養液を交替する時、細胞が大部分死んで自然に落ちるようになって神経ロゼット需給に困難性があった。

【0138】

一方、神経外胚葉分化と中脳ドーパミン神経細胞への分化を誘導する過程で分化誘導有無を判別する初期チェックポイントは神経前駆細胞が増殖しながら形成される神経ロゼットの形成有無であり、ロゼット形成量及び維持期間は、今後、中脳ドーパミン神経前駆細胞の生成及び量的確保に非常に重要である。

【0139】

実験例４．ドーパミン神経前駆細胞への分化ステップ
４－１．分化期間の最適化

【0140】

ドーパミン神経前駆細胞への分化率の最も高いＷＣＢ製造時期を確立するために、培養２６日目にＷＣＢを製作する代わり、培養２３日目にＷＣＢを製作する方法を使用してドーパミン神経前駆細胞への最終分化率を本発明の方法と比較した。

【0141】

図７ａ及び７ｂから確認できるように、２３日目にＷＣＢを製作し解凍（Thawing）して使用する場合（図７ａ）、２６日目にＷＣＢを製作し解凍して使用する場合（本発明の方法、図７ｂ）に比べて分化率が低く表れた。

【0142】

４－２．ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１処理期間の最適化

【0143】

培養２６日目までＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する代わり、培養２０日目または３５日目までＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を処理する方法を使用してドーパミン神経前駆細胞に分化させ、Ｅｎ１発現有無及び細胞形態を本発明の方法と比較した。

【0144】

図８ａ乃至８ｄから確認できるように、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を２０日目までのみ処理した場合（図８ａ）、分化が進行するほどＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を３５日目まで処理した場合（図８ｂ）に比べてＥｎ１発現が速い速度で減少する問題が発生した。また、図８ｃから確認できるように、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を３５日目まで処理した場合、細胞増殖率は減少しない、かつ細胞形態はドーパミン神経前駆細胞からもう少し分化が進行した成熟した細胞の形態を示し始める問題が発生した。一方、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を２６日目までのみ処理した場合（本発明の方法、図８ｄ）、Ｅｎ１発現が少なく減少し、細胞形態も前駆細胞形態を帯びる期間に２６日までＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１を処理する方法（図８ｄ）を選定するようになった。

【0145】

実験例５．ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１処理濃度の最適化

【0146】

ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を各々１．０ｕＭ及び２．０ｕＭ濃度で処理する代わり、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を各々０．５ｕＭ及び１．０ｕＭ濃度または１．０ｕＭ及び１．５ｕＭ濃度で処理する方法を使用してドーパミン神経前駆細胞に分化させ、ＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現有無を本発明の方法と比較した。

【0147】

図９ａ乃至９ｃから確認できるように、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を各々０．５ｕＭ及び１．０ｕＭ濃度で処理するか（図９ａ）、または各々１．０ｕＭ及び１．５ｕＭ濃度で処理する場合（図９ｂ）に比べてＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１を１．０ｕＭ及び２．０ｕＭ濃度で処理する場合（本発明の方法、図９ｃ）ＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現水準が最も高く表れた。

【0148】

実験例６．ＥＣＭ処理濃度の最適化

【0149】

ＣＥＬＬｓｔａｒｔ及び多様な濃度（２～７ｕｇ／ｍＬ）のＥＣＭ（Laminin ５２１）に対して、前記実施例の方法と同一なプロトコルを使用して幹細胞を培養させて細胞付着力テストを進行した。

【0150】

図１０ａ及び１０ｂから確認できるように、ＣＥＬＬｓｔａｒｔの場合、幹細胞培養ステップ及び神経ロゼット維持培養ステップまでは何らの問題がなかったが、ドーパミン前駆細胞に分化させて増殖させるステップで細胞がほとんど付着できず落ちるか、または網形態を示しながら育つ現象が表れた（図１０ａ）。Laminin－５２１の場合、２ｕｇ／ｍＬ及び３ｕｇ／ｍＬ濃度では実験遂行が難しい程度に付着力が非常に落ちており、６ｕｇ／ｍＬ及び７ｕｇ／ｍＬ濃度では高い頻度で自然分化が発生した。一方、４ｕｇ／ｍＬ及び５ｕｇ／ｍＬ濃度では比較的優れる付着力を示しており、同じ期間の細胞の形態や個数の観点では５ｕｇ／ｍＬ濃度が最も優れた（図１０ｂ）。

【0151】

前記結果に基づいて、幹細胞培養ステップではＣＥＬＬｓｔａｒｔを使用し、以後、胚芽体ステップを除外した全てのステップではLaminin－５２１ ５ｕｇ／ｍＬを使用することが最も適合すると判断した。

【0152】

実験例７．ドーパミン神経前駆細胞の大量増殖（分化率増加）確認

【0153】

一般に、ＧＭＰ施設での大量生産のためには未分化幹細胞を大量に増殖させて保管するＭＣＢ（Master Cell Bank）と移植のためにドーパミン神経前駆細胞を大量増殖させて保管するＷＣＢ（Working Cell Bank）とにプロトコル工程を分離して使用する。したがって、分化率を高めて、細胞の増殖率はある程度減少させて移植時の増殖に対する安定性を高めるために、ＭＣＢを使用してＷＣＢを作る時点及びＷＣＢを解凍して大量にドーパミン前駆細胞を増殖させる時点が非常に重要である。

【0154】

これと関連して、前記実施例のプロトコルを使用して幹細胞をドーパミン前駆細胞に分化させ、ＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａ発現有無を参考にした結果、図１１ａ及び１１ｂから確認できるように、分化２７日から３６日目まで前記ＦＯＸＡ２及び／又はＬＭＸ１Ａの発現が続けて増加することが分かった。但し、３５日目以上分化を進行するようになる場合、分化率がむしろ減少し、細胞形態が徐々に前駆細胞の範囲から外れるので（図８ｃの分化３５日目ＳＡＧ、ＣＨＩＲ９９０２１中断のような形態を示す）分化３５日目の細胞を最終分化と判断した。

【0155】

ここに、本発明では分化２６日をＷＣＢ製造時点に設定し（実験例４－１の結果に基づいて、細胞を凍らせずに連続して分化させる方法と凍らせて解凍した時にも連続して分化させる方法が同一な分化率を示さなければならないので）、２６日目ＷＣＢを解凍して９日間増殖させて３５日目の細胞を移植細胞に選定した。

【0156】

したがって、前記本発明のプロトコルを使用してＭＣＢ（Master Cell Bank）１ｖｉａｌ（約３x１０６／細胞）でドーパミン神経前駆細胞分化を始める場合、図１２から確認できるように、約１，３００億個のドーパミン神経前駆細胞の大量生産が可能であることが分かる。
実験例８．本発明のプロトコルを使用して製造された細胞の生体内（in vivo）移植効果確認

【0157】

８－１．６－ＯＨＤＡ損傷パーキンソン病（ＰＤ）－モデル製作

【0158】

２００－２５０ｇの雌Sprague－Dawley系ラット（Orient Bio Inc.）を移植対象に使用した。３０ｍｇ／ｋｇ Zoletil（Virbac）及び１０ｍｇ／ｋｇ Rompun（Bayer）を混合して痲酔剤に使用した。座標（ＡＰ－０．４０、ＭＬ－０．１３、ＤＶ－０．７０、ＴＢ－０．４５）によって３ｕＬの３０ｍＭ ６－ＯＨＤＡをラットの内側前脳（medial forebrain）バンドルに注入して半－パーキンソン病モデル（hemi-parkinsonian model）を誘導した。

【0159】

８－２．本発明のプロトコルを使用して製造された細胞移植後のＰＤ－モデルの行動回復確認

【0160】

前記実施例の分化プロトコルを使用して幹細胞を分化させた後、分化３５日（ｄ３５）細胞を使用した。最終濃度が８．７５x１０^４細胞／ｕＬになるようにＰＢＳ（ＣＴＳ）に懸濁させて移植用細胞懸濁液を製造した。この際、対照群（Control）にはＰＢＳのみを移植したグループを使用した。前記実験例８－１の６－ＯＨＤＡ損傷４週後、動物群分離を完了し、移植２日前からネズミが犧牲される時まで実験期間の間毎日１０ｍｇ／ｋｇのサイクロスポリンＡ（cyclosporine A、鐘根堂）を腹腔内注射して免疫抑制（Immunosuppressive）処理した。製造された細胞懸濁液を座標（ＡＰ＋０．０８、ＭＬ－０．３０、ＤＶ－０．４０、及び－０．５０、ＴＢ－０．２４）に従ってラット当たり４ｕＬずつ定位方法により移植した。移植前、移植後４、８、１２または１６週にアンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ、Sigma‐Aldrich）を腹腔内注射し、３０分間ラットの回転有無を記録した。比較のためにＨ９胚芽幹細胞（Ｈ９ ｈＥＳＣｓ、WiCell Inc., 米国）由来ドーパミン神経前駆細胞で同一な実験を遂行した。

【0161】

図１３ａ及び図１３ｂから確認できるように、本発明の方法（プロトコル）以前の方法により分化させた細胞（前記Ｈ９胚芽幹細胞由来ドーパミン神経前駆細胞）は移植１６週後のみに対照群に比べて有意な運動機能向上を示した一方（図１３ａ）、本発明の方法（プロトコル）を使用して分化させた細胞を移植したグループは移植８週、１２週、そして１６週全て対照群に比べて有意に運動機能が向上したことを確認した（図１３ｂ）。

【0162】

このような結果は、本発明の方法（プロトコル）により製造された細胞が生体内でより多く生存可能であり、運動機能を改善させる効果がより大きいということを示す。

【0163】

〔産業上の利用可能性〕
本発明は幹細胞由来中脳特異的ドーパミン神経前駆細胞の分化誘導及び大量生産方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0164】

【図1】本発明の一実施例に従うドーパミン神経前駆細胞の分化誘導方法を模式化した図である。

【図2a】本発明の一実施例に従って最適の幹細胞培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図2b】本発明の一実施例に従って最適の幹細胞培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図3】本発明の一実施例に従って最適の胚芽体培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図4a】本発明の一実施例に従って胚芽体培養時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適処理時期を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図4b】本発明の一実施例に従って胚芽体培養時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適処理時期を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図4c】本発明の一実施例に従って胚芽体培養時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適処理時期を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図5a】本発明の一実施例に従って胚芽体形成ステップの必要か否かを確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図5b】本発明の一実施例に従って胚芽体形成ステップの必要か否かを確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図6】神経ロゼット形成時、最適の培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図7a】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、最適の培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図7b】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、最適の培養期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図8a】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図8b】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図8c】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図8d】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞への分化時、ＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理期間を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図9a】本発明の一実施例に従ってＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図9b】本発明の一実施例に従ってＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図9c】本発明の一実施例に従ってＳＡＧ及びＣＨＩＲ９９０２１の最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図10a】本発明の一実施例に従ってＥＣＭの最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図10b】本発明の一実施例に従ってＥＣＭの最適の処理濃度を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図11a】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の最終分化率を確認した図である。（１１ａ：胚芽幹細胞由来、１１ｂ：誘導多能性幹細胞由来）

【図11b】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の最終分化率を確認した図である。（１１ａ：胚芽幹細胞由来、１１ｂ：誘導多能性幹細胞由来）

【図12】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の大量生産を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図13a】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の生体内（in vivo）効能を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図13b】本発明の一実施例に従ってドーパミン神経前駆細胞の生体内（in vivo）効能を確認した図である。（胚芽幹細胞由来）

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【配列表】

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