特許 7152068 ＤＧＫδノックアウトマウス及びこれを用いた方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-03

(45)【発行日】2022-10-12

(54)【発明の名称】ＤＧＫδノックアウトマウス及びこれを用いた方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20221004BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20221004BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20221004BHJP

   A01K 67/027 20060101ALN20221004BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

C12Q1/06

G01N33/15 Z

C12N9/12

A01K67/027

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2021153201

(22)【出願日】2021-09-21

(62)【分割の表示】P 2017004729の分割

【原出願日】2017-01-13

(65)【公開番号】P2022003339

(43)【公開日】2022-01-11

【審査請求日】2021-09-21

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ １６４８，Ｐａｒｔ Ａ，１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１６、Ｐａｇｅｓ１９３－２０１

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100098729

【弁理士】

【氏名又は名称】重信 和男

(74)【代理人】

【識別番号】100204467

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 好文

(74)【代理人】

【識別番号】100148161

【弁理士】

【氏名又は名称】秋庭 英樹

(74)【代理人】

【識別番号】100195833

【弁理士】

【氏名又は名称】林 道広

(72)【発明者】

【氏名】坂根 郁夫

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５１７８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０４２４４１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２００９／１４３６２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】臼木貴子，モデルマウスを用いたジアシルグリセロールキナーゼδの脳における機能解析，千葉大学学術成果リポジトリ，2016年03月25日，1-113，https://opac.II.chiba-u.jp/da/curator/101934

【文献】臼木貴子 et al.，発達中マウスの脳におけるdiacylglycerol kinase δの発現とその脳特異的欠損マウスの表現型解析，ＢＭＢ２０１５(第３８回日本分子生物学会年会、第８８回日本生化学会大会 合同大会）講演要旨集，2015年，2P0491

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０６

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｃ１２Ｎ ９／１２

Ａ０１Ｋ ６７／０２７

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）の発現レベルに応じて神経細胞の分化状態を確認する方法。

【請求項2】

ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）からなる神経細胞の分化状態バイオマーカー。

【請求項3】

ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）を有効成分とする神経細胞の軸索/神経突起を調整する調整剤。

【請求項4】

脳特異的にジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）をノックアウトしたノックアウトマウスを用いたセロトニン神経系の異常を改善する強迫性障害の治療薬のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＧＫδノックアウトマウス及びこれを用いた方法に関する。

【背景技術】

【0002】

強迫性障害とは、自分の意思に反して特定のことが頭から離れず、何度も同じ確認を繰り返してしまう精神障害の一種であり、日常生活に大きな支障をきたしてしまうものである。なお、強迫性障害の中でも、意思に反して頭に浮かんでしまって払いのけることができない考えを強迫観念、特定の行為を繰り返してしまうことを強迫行為という。強迫行為としては、例えば、不潔を感じ過剰に手洗いを繰り返してしまう行為や、戸締りを過剰なまでに何度も確認してしまうといった行為が該当する。現在の日本では、５０人から１００人に一人の割合で強迫性障害にかかっている者がいるといわれている。

【0003】

ところで、下記非特許文献１には、Ｓａｐａｐ３欠損マウスが強迫性障害のモデルになりうることに関する記載がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｍ．Ｗｅｌｃｈら、“Ｃｏｒｔｉｃｏ－ｓｔｒｉ ａｔａｌ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｎｄ ＯＣＤ－ｌｉｋｅ ｂｅｈ ａｖｉｏｕｒｓ ｉｎ Ｓａｐａｐ３－ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ”、Ｖｏｌ．４４８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｎｏ．７１５６、ｐ８９４－９００

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、上記マウスでは事象傾向が強く、外界環境に対応した強迫行動（物体に対する強迫的・儀式的異常接触等）を示す強迫性障害の症状のモデルとしての妥当性に疑問が残る。また、強迫性障害の症状には多様性があり、それらに対応可能なモデルマウスの開発が必要である。更に、現在、強迫性障害の治療は、抗うつ薬のＳＳＲＩで状態を安定させてから認知行動療法に入るのが一般的であり、強迫性障害専用の治療薬はない。

【0006】

そこで、本発明は上記課題に鑑み、強迫性障害のモデルとなりうるノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決する本発明の一観点に係るマウスは、ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）をノックアウトしたノックアウトマウスである。

【0008】

また、本発明の他の一観点に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。

【発明の効果】

【0009】

以上、本発明により、強迫性障害のモデルとなりうるノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することができる。これにより、強迫性障害に効果的な治療薬の開発に寄与する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】新規物体認識試験の結果を示す図である。

【図2】ビー玉埋込試験の結果を示す図である。

【図3】フルオキセチン治療による結果を示す図である。

【図4】初代培養皮質ニューロンにおける神経突起伸長を示す図である。

【図5】Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞における神経突起伸長を示す図である。

【図6】Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞における神経突起伸長を示す図である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0011】

以下、本発明の実施形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例における具体的な例示にのみ限定されるわけではない。

【0012】

本実施形態に係るノックアウトマウス（以下「本マウス」という。）は、ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）遺伝子を脳特異的に欠損させたもの（ノックアウトしたもの）である。

【0013】

本マウスは、後述の実施例の記載からも明らかであるが、強迫性障害を発症している。ここで強迫性障害とは、上記の通り、自分の意思に反して特定のことが頭から離れず、何度も同じ確認を繰り返してしまう精神障害をいう。特に、後述の実施例から明らかであるが、本マウスは、身近な物体に対する接触回数が著しく亢進するという強迫的・儀式的行動異常を示す。また、無害なビー玉を埋める行動が亢進するという強迫行為的行動異常も示す。更に、これらの異常行動は、強迫性障害の治療に用いられるＳＳＲＩ（セロトニン再取り込み阻害薬）によって顕著に減弱する。これらの結果はＤＧＫδが強迫性障害発症に関与するキーエンザイムの一つであることを強く示唆しているものである。

【0014】

また本マウスは、上記の通りＤＧＫδをノックアウトしたものであれば限定されず公知の種々の方法を応用することによって作製することができる。例えば（１）ターゲティングベクターを作製するステップ、（２）ターゲティングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入するステップ、（３）ＥＳ細胞を胚盤胞にインジェクションすることでキメラマウスを作製するステップ、（４）作製したキメラマウスと野生型のマウスを交配させるステップ、を経ることで作製することができる。

【0015】

（ＤＧＫδノックアウトマウスを用いる方法）
上記の通り、本実施形態において得られるノックアウトマウスを用いることで、様々な疾患に関するスクリーニングを行うことができる。より具体的に本実施形態に係る方法は、ジアシルグリセロールキナーゼδ（ＤＧＫδ）をノックアウトしたノックアウトマウスに被験物質を接触させる方法である。

【0016】

また本方法においては、対照マウスにも被験物質を接触させることが好ましい。具体的には、ノックアウトマウス及び対照マウスに複数の被験物質を接触させ、強迫性障害指標、が対照マウスよりもノックアウトマウスにおいて改善された被験物質を選択する。これにより、上記障害等を効果的に抑制する治療薬の候補物質をスクリーニングすることができる。

【0017】

以上、本実施形態により、強迫性障害等の各種疾患の解析に寄与するＤＧＫδノックアウトマウス及びこれを用いた方法を提供することができる。この詳細については、以下詳細に示す実施例により明らかとなる。なお、下記各試験において、一対比較の統計分析はスチューデントのｔ検定を用いて行った。また、２つ以上の群を比較する場合の統計分析は、テューキーの範囲検定に従う一元配置分散分析を用いて行った。なおこれら統計的有意性は、ｐ≦０．０５として定義した。

【実施例】

【0018】

ここで、上記実施形態に従い、実際にノックアウトマウスを作製しその効果を確認した。なお本実施例における動物実験については、必要な許可及び必要なガイドラインに準拠
して行われた。

【0019】

（脳特異的ＤＧＫδ欠損マウスの作製）
ＤＧＫδノックアウトマウス（アクセッション番号ＣＤＢ０６６０Ｋ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｌｓｔ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ａｒｇ／ｍｕｔａｎｔ％２０ｍｉｃｅ％２０ｌｉｓｔ．ｈｔｍｌ）は、当該記載される方法により作製した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｌｓｔ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ａｒｇ／Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｈｔｍｌ）。端的に説明すると、標的構築物は、ＤＧＫδのエキソン９に隣接するＬｏｘＰ部位を配置することによって調製した。

【0020】

また、ネオマイシン耐性のために選択された胚性幹細胞を、標的化カセットの内外のプライマーを用いて、長鎖および短鎖標的化アームにわたるＰＣＲによって相同組換えについてスクリーニングした。なお、後述の行動試験のために、カルモジュリン依存性キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩα）－Ｃｒｅ陽性雄と異型接合繁殖ペアの雌マウスで交配した。

【0021】

Ｃｒｅ^－／－：ｌｏｘＰ^＋／＋マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＢＡのバックグラウンドに由来し、次いでＣ５７ＢＬ／６マウス（日本国ＳＬＣ、静岡、日本）と５世代にわたって戻し交配され、観察された表現型に対する背景効果を排除した。

【0022】

Ｃｒｅ^－／－：ｌｏｘＰ^＋／＋マウスをｃｒｅ^＋／－：ｌｏｘＰ^－／－と交配させて、ＤＧＫの脳特異的欠損を達成した。従って、ｃｒｅ^＋／－：ｌｏｘＰ^＋／＋マウスのゲノムの＞９９％はＣ５７ＢＬ／６由来とした。なお行動実験は、１０：００～１８：００の間に実施した。また、ｃｒｅ^＋／－：ｌｏｘＰ^＋／＋（脳特異的ＤＧＫδノックアウトマウス）の対照マウスとしてｃｒｅ^－／－：ｌｏｘＰ^＋／＋（対照）同腹子を用いた。

【0023】

（ジェノタイピング）
ところで、ｌｏｘＰ遺伝子の遺伝子型決定は、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行った。
フォワードプライマー：５’－ＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣ－３’リバースプライマー：５’－ＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＴＧＡＣ－３’

【0024】

ＰＣＲ条件は、次の通りでおこなった：９４℃で３分間；９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃２分のサイクルを３２サイクル；そして７２℃で５分間。

【0025】

また、ｃｒｅ遺伝子の遺伝子型決定は、以下のプライマーを用いて行った。
フォワードプライマー：
５’－ＡＣＧＧＧＡＡＣＡＧＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣ－３’
リバースプライマー：
５’－ＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＧＧ－３’

【0026】

またこのＰＣＲ条件は以下の通りである：９４℃で３分間； ９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃１．５分間の３２サイクル；そして７２℃で５分間。

【0027】

また、ｃｒｅ遺伝子のＰＣＲ条件は、以下のプライマーを用いて行った。
フォワードプライマー：
５’－ＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＴＣＡＧＧＴ－３’
リバースプライマー：
５’－ＧＴＴＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴ－３’

【0028】

（ウェスタンブロッティング）
ところで脳のウェスタンブロッティングは、従前の報告（Ｔｓｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．、ＤｉａｃｙｌｇｌｙＣｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｚｅ γ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｒａｃｌ ａｎｄ ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉｕｍ ｆｏｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、２８６０３－２８６１３”、２００４）により、抗ＤＧＫδ（Ｓａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．、“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓｅ δ ｇｅｎｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｔｗｏ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎｄ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７７，４３５１９－４３５２６”、２００２）及び抗ＧＦＰ抗体（ｓｃ－９９９６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。

【0029】

（脳特異的ＤＧＫδ欠損マウスの確認）
まず、インビボでの脳におけるＤＧＫδの潜在的役割を調べるため、マウスにおけるＤＧＫδの生殖系列欠損による出生直後の致死を回避しながらエキソン９を標的とした脳特異的ＤＧＫδアレルを作製した。尾由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲスクリーニングの結果、ＬｏｘＰ部位がＤＧＫαのエキソン９に隣接して配置されていることが示された。

【0030】

また、対照マウス（ｃｒｅ^－／－：ｌｏｘＰ^＋／＋）で発現しているＤＧＫδ２タンパク質は、このＤＧＫδノックアウトマウスの脳では検出されなかった（ｃｒｅ^＋／－：ｌｏｘＰ^＋／＋）。一方、野生型マウスの精巣において強く発現されるＤＧＫδ２タンパク質の発現レベルは、本マウスと同胞子（対照マウス）とほぼ同じであった。

【0031】

また、脳内において、ＤＧＫδの欠損が、他のＤＧＫアイソザイム（α、β、γ、η、κ、ε、ζ、ι、及びθ）のタンパク質発現に有意に影響していないことを確認した。

【0032】

本ＤＧＫδノックアウトは正常に増殖し、再生産的に活性であった。一方で、また、ＤＧＫδ遺伝子を欠く女性の患者及び雌のマウスが発作を起こす報告がなされている。そのため、このマウスに対し、閾値以下の用量のペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）を用いた発作感受性試験を行い潜在的発作表現型を調べた。しかしながら、ＰＴＺにより誘発される発作に関し有意差は確認されなかった。

【0033】

さらに、活動及び不安の異常の確認のためのオープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、社交性試験、認知欠陥を調べるバーンズ迷路試験、不安以上の確認のための綿棒咬合試験、抗うつ活動を調べる尾懸垂試験をノックアウトマウス及び対照マウスに対しそれぞれ行った。しかしながら、ＤＧＫδノックアウトマウスと対照マウスとの間に実質的な差異は観測されなかった。

【0034】

（新規物体認識試験）
次に、これらマウスに対し新規物体認識試験を行った。

【0035】

新規物体認識試験は、空の箱にマウス（１５～２０週齢）を入れ５分間探索させて慣れさせ、その後、マウスと２つの同一の物体をマウスから同じ距離に置き、１０分間観察し、更にその後、上記慣れた物体と別の物体の双方が存在する状態で、１０分間マウスをオープンフィールドにおいて探索させ、この探索において費やされた時間及び上記各物体への接触回数を記録することによって行った。なお、慣れた物体と別の物体（新規物体）は、形状、色、テクスチャが異なるものである。この結果を図１Ａに示す。

【0036】

本図で示すように、ＤＧＫδノックアウトマウスは、対照マウスに比べ、新規物体に対しても、慣れた物体に対しても頻繁に戻ることが確認され、その接触回数は、対照マウスと比較しても優位に（約６～７倍）増加していることを確認した。

【0037】

また、接触時間に関しても、ＤＧＫδノックアウトマウスは、対照マウスに比べ、新規物体に対しても、慣れた物体に対しても優位に（約１１～１２倍）長くなっていることを確認した。この結果を図１Ｂに示す。

【0038】

これら結果は、ＤＧＫδノックアウトが、物体に対し分別なく接触を行うことを示している。そして従前の報告である“Ｊｏｅｌ Ｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｏｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ．、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３０、３７４－８８”等に基づくと、ＤＧＫδノックアウトマウスはＯＣＤ様行動を示したと考えられる。

【0039】

なお、新規物体及び双方の物体に費やされた時間、並びに、新規物体及び両方の物体に接触した回数において、対照マウスと有意な差を見出すことができず、ＤＧＫδノックアウトマウスの新規嗜好性は検出されなかった（図１Ｃ、Ｄ参照）。

【0040】

（ビー玉埋込試験）
ビー玉埋込試験は強迫行動に関連しており、ＯＣＤ様表現型を解析するために使用され
る。そのため、本試験をＤＧＫδノックアウトマウスに対し行った。

【0041】

ビー玉埋込試験は、ケージを約３ｃｍの深さで寝かせ、これを軽く詰めて平坦な表面にし、各マウス（１０～２０週齢）をケージに３０分間ビー玉なしで放置し、慣れた後、表面に均等に間隔をおいて１５個のガラスビーズを置き、マウスをビー玉のケージに入れ、３０分間放置し、埋め込み動作によって表面の５０％が埋まっていたビー玉の数を測定することにより行った。この結果を図２に示す。

【0042】

この結果、ＤＧＫδノックアウトマウスは対照マウスよりも顕著に多くビー玉を埋め込んだ。この結果は、ＤＧＫδノックアウトマウスがＯＣＤ様行動を示したことを意味する。

【0043】

（フルオキセチン治療）
選択的セロトニン再取込み阻害薬（ＳＳＲＩ）であるフルオキセチンは、ＯＣＤ治療薬として利用されている。そこで、新規物体認識試験とビー玉埋設試験におけるＳＳＲＩの異常行動への影響を分析し、その効果を確認した。

【0044】

フルオキセチン治療は、フルオキセチン（Ｆ１３２ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．９％生理食塩水に溶解し、マウス（１０～２１週齢）に１０ｍｇ／ｋｇを１日１回６日間腹腔内注射し、その行動をフルオキセチン処置の前後で試験することによって行った。この結果を図３Ａ乃至Ｃに示す。

【0045】

図３Ａ、Ｂによると、ＳＳＲＩの投与により、ＤＧＫδノックアウトマウスにおける新規物体への接触数および時間の増加が基礎レベルまで有意に軽減されることが確認できた。

【0046】

さらに図３Ｃによると、ＤＧＫδノックアウトマウスに対するビー玉埋込試験においても、ＳＳＲＩの投与によって基礎レベルｄにまで有意に低下したことが確認できた（図３Ｃ）。

【0047】

以上これらの結果から、ＤＧＫδノックアウトマウスがＯＣＤ様行動を示していたことがわかる。

【0048】

（ＤＧＫδ欠損によるニューロン細胞機能への影響）
ここで、ＤＧＫδ欠損によるニューロン細胞機能への影響を調べるために、初代培養皮質ニューロンをＤＧＫδノックアウトから調製した。

【0049】

初代培養皮質ニューロンは、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、胚性マウス皮質を胚期Ｅ１３．５とＥ１４．５との間で分離し、細胞を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中において、カバーガラスを備えたポリ－Ｌ－リシンコート皿に１．５×１０^４細胞／皿の密度で、Ｂ－２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含む１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（和光純薬工業（株））の存在下において播種した。

【0050】

対照およびＤＧＫδノックアウトマウスの皮質ニューロンにおいて、０、１、２および３以上の軸索／神経突起を有する細胞の定量を行った。この結果を図４に示しておく。本図で示すように、３つ以上の軸索／神経突起を有する細胞の割合は、対照細胞と比較して、ＤＧＫδノックアウトマウスのニューロンにおいて有意に（約２．５倍）増加していることが確認できた。

【0051】

一方で、軸索／神経突起の伸長に対するＤＧＫδ欠損の効果を確認するために、ＤＧＫδ特異的ｓｉＲＮＡをＮｅｕｒｏ－２ａ神経芽細胞腫細胞にトランスフェクトし、軸索／神経突起伸長を観察した。

【0052】

細胞培養及びトランスフェクションは以下の手順にて行った。まず、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ 和光純薬工業）に播種し、３７℃で維持し、５％ＣＯ_２を含む雰囲気中でインキュベートし、Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞を、ｓｉＲＮＡトランスフェクションのための２．０×１０ ５細胞／皿の密度およびＡｃＧＦＰ－ＤＧＫのトランスフェクションのための０．５×１０^５細胞／皿の密度でカバースリップを有するポリ－Ｌ－リシン被覆６０ｍｍ皿に播種した。

【0053】

次に、マウスＤＧＫδの発現を沈黙させるために、以下のステルスＲＮＡｉ二本鎖（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
（ＤＧＫｈｄ－ｓｉＲＮＡ）
５’－ＵＡＣＵＣＡＣＡＧＡＧＡＣＵＧＡＧＧＵＧＣＵＣＣＡ－３’、
５’－ＵＧＧＡＧＣＡＣＣＵＣＡＧＵＣＵＣＵＧＵＧＡＧＵＡ－３’
（対照ｓｉＲＮＡ）
５’－ＵＧＧＣＡＣＣＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＵＡＧＡＧＧＵＡ－３’、
５’－ＵＡＵＣＵＵＵＧＣＡＵＣＣＡＡＧＣＣＡＡＵＧＣＣＡ－３’

【0054】

そして、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、エレクトロポレーション（３５０Ｖ、３００μＦで）により二重鎖をＮｅｕｒｏ－２ａ細胞にトランスフェクトした。

【0055】

次いで、トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ中で増殖させた。また、ＡｃＧＦＰ－Ｃ１ベクターまたはＡｃＧＦＰ－Ｃ１－ＤＧＫδ２を、製造社の指示に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を２０μＭレチノイン酸を含む２％ＦＢＳを補充したＤ－ＭＥＭに交換した。そして、レチノイン酸処理７２時間後に細胞を観察した。

【0056】

この結果を図５に示す。

【0057】

また、コントロールおよびＤＧＫδノックダウンＮｅｕｒｏ－２ａ細胞において、０、１、２および３を超える軸索／神経突起を有する細胞の数を計数した。この結果を図６に示す。

【0058】

ＤＧＫδノックダウンＮｕｅｒｏ－２ａ細胞（図５）およびＤＧＫδ欠損神経細胞（図４）とは対照的に、３ａｘ／神経突起以上で軸索／神経突起を有さない細胞の割合は有意に減少し、図６ＡおよびＢと比較して、ＤＧＫδ２過剰発現細胞においてそれぞれ有意に高かった。

【0059】

以上の結果から、ＤＧＫδがニューロン細胞の軸索／神経突起を負に調節することを確認し、更に上記の様々な結果より、脳特異的にＤＧＫδがノックアウトされたマウスは、強迫性障害のモデルマウスとして用いることが可能であり、強迫性障害に効果的な治療薬の開発に寄与することが可能である。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、ＤＧＫδノックアウトマウス及びこれを用いた方法として産業上の利用可能性がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】