特許 7152084 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-03

(45)【発行日】2022-10-12

(54)【発明の名称】組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/86 20060101AFI20221004BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20221004BHJP

   C07K 14/81 20060101ALI20221004BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20221004BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20221004BHJP

【ＦＩ】

G01N33/86

G01N33/50 T

C12N15/115 Z

C07K14/81

C07K16/40

C12Q1/37

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022025763

(22)【出願日】2022-02-22

【審査請求日】2022-02-22

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】520475827

【氏名又は名称】株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ

(74)【代理人】

【識別番号】100197642

【弁理士】

【氏名又は名称】南瀬 透

(74)【代理人】

【識別番号】100099508

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 久

(74)【代理人】

【識別番号】100182567

【弁理士】

【氏名又は名称】遠坂 啓太

(74)【代理人】

【識別番号】100219483

【弁理士】

【氏名又は名称】宇野 智也

(72)【発明者】

【氏名】神窪 勇一

(72)【発明者】

【氏名】森下 英理子

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－０９５５１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０２１－０２１７３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０１４０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５２１３２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２６６９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３７６６３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０２１－３６２２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Yuichi Kamikubo，Selective factor VIII activation by the tissue factor-factor VIIa-factor Xa complex，BLOOD，2017年10月05日，Vol.130 No.14，Page.1661-1670

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８

Ｃ０７Ｋ １４／７４５ー１６／４０

Ｃ１２Ｑ １／３７ ー １／５６

Ｃ１２Ｎ １５／１１５

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬セットであり、
組織因子と、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質と、を含む第一の混合試薬と、
ＴＦＰＩの阻害物質と、組織因子と、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質と、を含む第二の混合試薬と、を有する、検査試薬セット。

【請求項2】

前記凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質は、凝固第ＶＩＩＩ因子活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である請求項１に記載の検査試薬セット。

【請求項3】

前記ＴＦＰＩの阻害物質は、ＴＦＰＩ活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、硫酸化多糖類、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である請求項１または２に記載の検査試薬セット。

【請求項4】

生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査する検査方法であり、
組織因子と、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質と、を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、
ＴＦＰＩの阻害物質と、組織因子と、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質と、を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程と、を有する、検査方法。

【請求項5】

前記第二のトロンビン産生試験工程によるトロンビン産生量を、前記第一のトロンビン産生試験工程によるトロンビン量産生量との相対比で、
前記被験検体中のＴＦＰＩの抗凝固活性を表す、請求項４に記載の検査方法。

【請求項6】

ＴＦＰＩの阻害物質と、組織因子と、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質と、を含む、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血栓形成は、血液が血管内から血管外へ流失するのを防ぐ、いわゆる止血の重要な生体防御機構である。血栓は、血液凝固因子の一つであるトロンビンが、繊維性の血液凝固因子であるフィブリノーゲンをフィブリンに変換するとともに血小板を活性化する事によって形成する。

【0003】

トロンビンは、血液凝固カスケード反応によって生じる。血液凝固反応は、活性型凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）が組織因子（tissue factor、ＴＦ）と複合体を形成して凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化し、活性型のＦＸ（ＦＸａ）を作り出すことで開始する。

【0004】

その後、生成したＦＸａは活性型の凝固第Ｖ因子（ＦＶａ）に結合してプロトロンビナーゼ複合体を形成し、最終的にその複合体がプロトロンビンを活性化する事でトロンビンを産生する（非特許文献１）。

【0005】

しかしながらこのトロンビン産生は、ＴＦ－ＦＶＩＩａに対する特異的なインヒビターである組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor、ＴＦＰＩ）によって抑制される（非特許文献２）。

【0006】

ＴＦＰＩは血管内皮細胞、血漿、及び血小板に存在する血液凝固インヒビターであり、そのタンパク質構造の特徴からクニッツ型プロテアーゼインヒビターに分類される。実際に、ＴＦＰＩは三つのクニッツ（ｋｕｎｉｔｚ）ドメインと塩基性アミノ酸に富んだＣ－末端領域で構成されている。最初のクニッツドメインを介してＦＶＩＩａへ、また２番目のクニッツドメインを介してＦＸａに結合する事で、ＴＦＰＩ－ＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸａの４量体の複合体を形成し、最終的にＴＦ－ＦＶＩＩａ凝固経路によるトロンビン産生を抑制する（図１）。

【0007】

３番目のクニッツドメインはプロテアーゼ阻害活性を有していないが、プロテインＳと結合することでＴＦＰＩ活性を増強させる役割を果たす。ＴＦＰＩはまた、ＦＸａによるＦＶの活性化を阻害する事でプロトロンビナーゼ複合体の形成を抑制する。

【0008】

現在、ＴＦＰＩは、人為的に作成した欠損マウスが、血栓症の一つである汎発性血管内凝固症候群を引き起こして死に至ることから、血栓形成を制御する重要なインヒビターとして位置づけられている（非特許文献３）。

【0009】

マウスなどのモデル動物を用いた研究において、ＴＦＰＩの性状や量的な変化が血栓症などの血栓性疾患を引き起こす事が明らかとなった事から、血液あるいは血漿中に存在するＴＦＰＩを検査する事で血栓性疾患を診断する試みが行われた。実際、血漿中のＴＦＰＩ濃度が心筋梗塞などの血栓症患者において有意に上昇することが見出され、血漿ＴＦＰＩが血栓症の診断マーカーとなりうる可能性が示唆された（非特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【文献】特許第６８８３８９９号公報

【非特許文献】

【0011】

【文献】Mann. Thrombin generation in hemorrhage control and vascular occlusion. Circulation. 124: 225-235, 2011

【文献】Broze. The rediscovery and isolation of TFPI. J. Thromb. Haemost. 1: 1671-1675, 2003

【文献】Dahlback. Novel insights into the regulation of coagulation by factor V isoforms, tissue factor pathway inhibitorα, and protein S. J. Thromb. Haemost. 15: 1241-1250, 2017

【文献】Soejima et al. Heightened tissue factor associated with tissue factor pathway inhibitor and prognosis in patients with unstable angina. Circulation. 99: 2908-2913, 1999)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

しかし、こうした抗原検査の結果は、ＴＦＰＩの機能を直接反映しない事から、ＴＦＰＩ検査の臨床的価値を明確にするまでには至らなかった。

【0013】

ＴＦＰＩの抗凝固活性を検査する方法に関しては、ＴＦＰＩがＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化を阻害するという原理を基に作り出された。この方法においては、ＴＦＰＩの抗凝固活性は、血漿検体にＴＦ－ＦＶＩＩａ及びＦＸを添加し一定時間反応させた後、形成するＦＸａ量の低下を指標にして定量する。

【0014】

一方でこの検査法は、血漿中に存在する妨害成分の影響を消失させる目的で、検体を希釈して検査するという課題を有していた。それは、希釈した検体を用いる場合、その検出感度が低下する事から微量に存在するＴＦＰＩの抗凝固活性を正確に測定する事が困難であったからである。従って、ＴＦＰＩの検査においてより高感度で抗凝固活性を測定できる新たな検査法が求められた。

【0015】

トロンビン産生試験は、被験検体である血液や血漿にカルシウムを含むトロンビン産生試薬を添加した後、一定時間反応させることで生じるトロンビンを定量する包括的な血液凝固能試験である。この試験はプロトロンビナーゼ複合体がトロンビンを生成させることから、プロトロンビナーゼ複合体の検査法として知られている。

【0016】

これまでトロンビン産生試験に用いる検査試薬や検査法が数多く検討されてきたが、新世代型の抗血栓治療薬である直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）によって引き起こされる出血リスクを評価、判定できる試験は開発されていなかった。本発明者は、トロンビン産生試験に用いる検査試薬と方法を改良することで、ＤＯＡＣ投薬を原因とする止血困難な出血イベントを予測するための高感度トロンビン産生試験を発明した（特許文献１）。この検査はＤＯＡＣ治療における副作用を低減させたより安全な個別化治療の実現に貢献できると期待されている。

【0017】

係る状況下、本願は、従来の検査法に比較して、ＴＦＰＩ活性の検出感度が高い検査方法やその検査方法に用いる検査試薬を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。

【0019】

本発明において、高感度トロンビン産生試験の有用性に着目しつつ、血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性を検査するための新たな試薬と検査方法の確立を目指して鋭意検討した。その結果、ＴＦ試薬、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する物質（例えば抗ＦＶＩＩＩ抗体）、さらにＴＦＰＩの活性を阻害する物質（例えば抗ＴＦＰＩ抗体）を組み合わせた検査試薬と新規のトロンビン産生試験を創出した。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。

【0020】

＜１＞ 生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬セットであり、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第一の混合試薬と、ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第二の混合試薬とを、有する、検査試薬セット。
＜２＞ 前記凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質は、凝固第ＶＩＩＩ因子活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である前記＜１＞に記載の検査試薬セット。
＜３＞ 前記ＴＦＰＩの阻害物質は、ＴＦＰＩ活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、硫酸化多糖類、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である前記＜１＞または＜２＞に記載の検査試薬セット。
＜４＞ 生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査する検査方法であり、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程とを有する、検査方法。
＜５＞ 前記第二のトロンビン産生試験工程によるトロンビン産生量を、前記第一のトロンビン産生試験工程によるトロンビン量産生量との相対比で、前記被験検体中のＴＦＰＩの抗凝固活性を表す、前記＜４＞に記載の検査方法。
＜６＞ ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬。

【発明の効果】

【0021】

本発明により、トロンビン産生試験を行うことで、ＴＦＰＩの抗凝固活性を減弱させる作用を持つＦＶＩＩＩ凝固経路を遮断して実施して、従来の検査よりも、ＴＦＰＩ活性を高い感度で検出することができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＴＦＰＩのトロンビン産生の抑制作用を示す図である。

【図2】ＡＰＴＴ試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。

【図3】ＴＦとＦＸＩａの混合試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。

【図4】ＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ活性の阻害を示す図である。

【図5】ＴＦＰＩ阻害物質のＴＦＰＩ活性への影響を示す図である。

【図6】ＴＦＰＩによるＦＸａ活性阻害に対するＴＦＰＩ阻害物質の影響を示す図である。

【図7】トロンビン産生試験によるＴＦＰＩ抗凝固活性の検出に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。

【図8】トロンビン産生阻害をもとに算出したＴＦＰＩの抗凝固活性とＴＦＰＩ濃度との相関を示す図である。

【図9】ヒト健常者血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性の個人差を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「～」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。また、本願において、濃度の表記について、ｍｏｌ／Ｌを「Ｍ」と、ｍｍｏｌ／Ｌを「ｍＭ」と、μｍｏｌ／Ｌを「μＭ」、ｎｍｏｌ／Ｌを「ｎＭ」と、ｐｍｏｌ／Ｌを「ｐＭ」と、ｆｍｏｌ／Ｌを「ｆＭ」と略記する場合がある。

【0024】

［本発明の検査試薬セット］
本発明の検査薬セットは、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬セットであり、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、第一の混合試薬と、ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、第二の混合試薬とを、有する。

【0025】

［本発明の検査方法］
本発明の検査方法は、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査する検査方法であり、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、第一の混合試薬を被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程とを有する。

【0026】

なお、本願において本発明の検査試薬セットは、本発明の検査方法に利用することができ、本願においてそれぞれに対応する構成は相互に利用することができる。また、本願において本発明の検査試薬セットのそれぞれの混合試薬を、本発明の検査試薬とすることができる。

【0027】

本発明を用いたトロンビン産生試験は、ＴＦＰＩの抗凝固活性を減弱させる作用を持つＦＶＩＩＩ凝固経路を遮断して実施する事ができるため、従来の検査法に比較して、ＴＦＰＩ活性の検出感度が高い（後述する実施例の図等参照）。加えて、ＴＦＰＩ活性を阻害する物質（例えば、抗ＴＦＰＩ抗体や硫酸化多糖類）の存在下（つまり、ＴＦＰＩの欠損と同一条件）の産生量を、阻害物質を含まない条件下のトロンビン産生量と比較し、相対比を算出する事によって、ＴＦＰＩの抗凝固活性が定量化できるという性能を有している。また、本発明による検査はより簡便で、短時間で結果が得られるという利点を持っている事から、自動分析機器及び迅速検査（Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔ）への応用も可能である。

【0028】

本検査は、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の有する凝固阻害活性の量及び質的な変化を評価するための体外血液凝固検査である。実際には、ＴＦＰＩ活性の低下によって起こる血栓性疾患（所謂、心筋梗塞などの血栓症）の発症を予測する検査として、あるいは、ＴＦＰＩ活性の増加を原因として発症した止血困難な出血性疾患（所謂、出血症）患者のスクリーニングを目的として実施することができる。さらに、血友病などの出血性疾患の治療に用いられる抗ＴＦＰＩ阻害薬の投薬後のモニタリングに適用される。

【0029】

本発明の検査技術は組織因子、ＦＶＩＩＩ阻害物質、及びＴＦＰＩ阻害物質を主たる成分として含有する凝固検査試薬とその検査試薬を用いて行う体外凝固検査方法に関するものである。

【0030】

［組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor、ＴＦＰＩ）］
図１は、ＴＦＰＩのトロンビン産生の抑制作用を示す図である。ＴＦＰＩは、前述したように、ＴＦ－ＦＶＩＩａ及びＦＸａの活性を阻害する事によってＴＦ－ＦＶＩＩａ凝固経路によるトロンビンの産生を抑制する。

【0031】

本発明は、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査するための検査試薬やそのセット、検査方法である。

【0032】

［組織因子（tissue factor, ＴＦ）］
本発明の検査試薬セットの第一の混合試薬および第二の混合試薬は、組織因子（ＴＦ）を含む。第一の混合試薬および／または第二の混合試薬における、ＴＦの濃度は、０．１ｐＭから１０ｐＭであることが好ましい。０．１ｐＭ未満の場合、血液凝固試験時に、十分な反応が生じずに、トロンビンの量を測定しようとするとき検出下限以下となり、評価ができない場合がある。検査試薬のＴＦが、１０ｐＭを超えても、試験に必要な量を超えて反応が飽和し、過剰となる場合がある。

【0033】

［凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の阻害物質］
血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は抗血友病因子と呼ばれる血栓形成に不可欠な血液凝固因子である。ＦＶＩＩＩは活性型の血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）の酵素活性を高める補酵素として機能している。

【0034】

活性型のＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）はＦＩＸａに結合し、形成したＦＶＩＩＩａ－ＦＩＸａが血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化を促進させる事によって、トロンビンの産生を飛躍的に高める。このＦＶＩＩＩによるトロンビンの産生の増加が、出血の防止に不可欠な安定な血栓形成に寄与する。

【0035】

本発明の検査試薬セットの第一の混合試薬および第二の混合試薬は、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の阻害物質を含む。本発明において、ＦＶＩＩＩの阻害物質は、こうしたＦＶＩＩＩの活性及び機能を阻害する作用を有するものを指す。例えば、ＦＶＩＩＩの阻害物質は、被験検体中のＦＶＩＩＩ活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質とすることができる。これらは、いずれか１つを含めばその効果を奏するが、複数組み合わせて用いてもよい。

【0036】

ＦＶＩＩＩの阻害物質には、ＦＶＩＩＩに対する中和抗体、あるいは化学薬品などが含まれる。中和抗体には、ヒトあるいは他の動物種の血液から、あるいは遺伝子組換え技術を用いて調製されるＦＶＩＩＩを免疫原として、マウス、ヤギ、あるいはウサギなどの動物に免疫して得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。

【0037】

また、ＦＶＩＩＩを先天的及び後天的に欠損する血友病Ａ患者において頻発する出血を防止する目的で、ＦＶＩＩＩ製剤を投与する補充療法が行われるが、投薬後、約３０％程度の患者にＦＶＩＩＩ活性を中和する抗体が出現する。こうした中和抗体も本発明で規定するＦＶＩＩＩ阻害物質の対象となる。

【0038】

ＦＶＩＩＩの凝固活性は、体外血液凝固検査法によって調べる事が可能である。代表的な検査として活性化部分トロンボプラスチン時間法（ＡＰＴＴ）による検査が知られている。この検査は、ＡＰＴＴ検査試薬を血液（実際は血漿）に添加する事によって、ＦＶＩＩＩの凝固活性に応じて血液が凝固する能力を検査する方法であり、血友病Ａ患者のスクリーニング法として広く用いられている。

【0039】

その他、特許第６８８３８９９号公報に記載した検査試薬を用いたＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生試験によっても凝固活性を検査する事が可能である。従って、ＦＶＩＩＩ阻害物質は、こうした検査においてＦＶＩＩＩの凝固活性をほぼ完全に、例えば９０％以上阻害する物質として規定される。本発明において用いたＦＶＩＩＩ阻害物質の性状の解析例を後述の実施例に示す。

【0040】

［第一の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害）］
第一の混合試薬は、ＴＦと、ＦＶＩＩＩの阻害物質を含む。このため、本願において、第一の混合試薬は、「ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害」と略記する場合がある。

【0041】

第一の混合試薬におけるＦＶＩＩＩの阻害物質の濃度は、その阻害物質の種類に応じて、検査試薬として用いるときにＦＶＩＩＩの活性を十分に抑制できる濃度であればよい。ＦＶＩＩＩの活性を、その阻害物質を用いないときと比べて、９０％以上の活性を抑制することが好ましく、より好ましくは９５％以上や、９８％以上、９９％以上の活性を抑制する濃度とすることが好ましい。

【0042】

これは後述する、図２，図３に示すところの評価のように、トロンビン産生量を指標にする場合、活性を抑制することはトロンビン産生量を低減するものとなるため、その差を活性を抑制した効果とすることができる。すなわち、コントロールの総トロンビン産生量抑制に対して、ＦＶＩＩＩの阻害物質を所定の濃度で加えたときの総トロンビン産生量を測定し、その低減率を、活性を抑制した程度とすることができる。例えば、コントロールの総トロンビン産生量を１００％として、濃度「Ｘ」のときの総トロンビン産生量が５％であれば、濃度「Ｘ」のときの活性を抑制する程度はそれらの差である９５％である。

【0043】

ＦＶＩＩＩの阻害物質の濃度は、前述のように活性で設定してもよいが、その濃度を１ｎＭ～１ｍＭや、５ｎＭ～１０μＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭのように設定してもよい。

【0044】

第一の混合試薬は、ＴＦやＦＶＩＩＩ阻害物質以外の成分を含むものとすることができる。検査試薬は、通常、水を主たる成分とする場で反応させる検査に用いられる。このため検査試薬の媒質は水を主たる成分とすることができる。また、タンパク質等の吸着阻害剤や保護剤、ｐＨ調整剤、ミネラル調整剤等を含むものとすることができる。例えば、血清アルブミンや、緩衝液、合成リン脂質、塩化カルシウムなどを含むものとすることができる。なお、第一の混合試薬は、第二の混合試薬との比較のために用いることから、ＴＦＰＩの阻害物質を含まない、またはその影響を十分に抑制できる程度の濃度以下であり、実質的に含まないものとして調製する。

【0045】

［ＴＦＰＩの阻害物質］
ＴＦＰＩは、ＴＦに結合したＦＶＩＩａ及びＦＸａの活性部位に直接結合する事によって、ＴＦ凝固経路、あるいは外因系凝固経路と呼ばれる凝固反応を介したトロンビン産生及び血栓形成を阻害する。

【0046】

本発明において、ＴＦＰＩの阻害物質は、ＴＦ－ＦＶＩＩａ活性、もしくはＦＸａ活性のいずれか、あるいは両方を同時に阻害する作用を有している物質を指す。例えば、ＴＦＰＩの阻害物質は、被験検体中のＴＦＰＩ活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、硫酸化多糖類、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質とすることができる。これらは、いずれか１つを含めばその効果を奏するが、複数組み合わせて用いてもよい。

【0047】

また、ＴＦＰＩの阻害物質には、ＴＦＰＩに対する中和抗体（特公表２０１２－５１３１９３号公報、特開２０１６－０２８０４８号公報、特開２０１８－１０８０８９号公報、特開２０２０－０９６６２７号公報）、ペプチド（特開２０１７－１０５８５１号公報）、硫酸化多糖類（特公表２００８－５００３６７号公報）、核酸アプタマー（特公表２０１３－５０２２１８号公報）、スルホン酸化合成ポリマー（特公表２０１５－５０４９２５号公報）などが含まれる。

【0048】

中和抗体には、ヒトあるいは他の動物種の血液から、あるいは遺伝子組換え技術を用いて調製されるＴＦＰＩを免疫原として、マウス、ヤギ、あるいはウサギなどの動物に免疫して得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。硫酸化多糖類には、天然由来、あるいは化学的に合成された硫酸化多糖類、例えばフコイダン（特公表２００８－５００３６７号公報）など、硫酸基に由来する陰性荷電に富む多糖類が含まれる。

【0049】

ＴＦＰＩの抗凝固活性は、ＴＦに結合したＦＶＩＩａの酵素活性、もしくはＦＸａの酵素活性に対する阻害作用を指標にして評価できる。例えば、ＴＦ－ＦＶＩＩａに対するＴＦＰＩの阻害は、ＴＦ－ＦＶＩＩａによってＦＸが活性化される事から、この活性化に対する阻害作用をもとに定量化できる。また、ＦＸａの酵素活性に対するＴＦＰＩの阻害は、ＦＸａによる発色性の低分子ペプチド基質の加水分解に対する抑制作用をもとに調べる事が可能である。ＴＦＰＩ阻害物質は、こうした試験においてＴＦＰＩの抗凝固活性をほぼ完全に、例えば９０％以上中和する物質として規定される。本発明において用いたＴＦＰＩ阻害物質の性状の解析例を以下に示す。

【0050】

［第二の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害／ＴＦＰＩ阻害）］
第二の混合試薬は、ＴＦＰＩの阻害物質と、第一の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害）とを含む。このため第二の混合試薬は、「ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害／ＴＦＰＩ阻害」と略記する場合がある。

【0051】

［第二の混合試薬の組成］
第二の混合試薬におけるＴＦＰＩの阻害物質の濃度は、その阻害物質の種類に応じて、検査試薬として用いるときにＴＦＰＩによるＦＸａ形成量への影響を十分に抑制できる濃度であればよい。ＴＦＰＩの活性を、その阻害物質を用いないときと比べて、ＴＦＰＩを含まないコントロールと比べて有意差が無い程度に加えることが好ましい。

【0052】

これは後述する、図５，６に示すところの評価のように、ＦＸａ活性を指標にする場合、ＴＦＰＩ活性を抑制することは、ＴＦＰＩを含まないコントロールと同様にＦＸａ形成量や、活性を維持できるものとなるため、その影響を、ＴＦＰＩを阻害した効果とすることができる。すなわち、図５を例にすると、コントロールのＦＸａ形成量に対して、ＴＦＰＩを所定の濃度で加えたときの影響を評価し、さらに、ＴＦＰＩ抗体を添加したときの影響を評価する。そしてＴＦＰＩ阻害により、ＦＸａ形成量がコントロールと比較して有意な差が無く、その結果両者が同等とみなされ、かつコントロールの９０％、望ましくは９５％以上に達する濃度を、ＴＦＰＩの阻害物質の濃度の下限とすることができる。

【0053】

ＴＦＰＩの阻害物質の濃度は、前述のようにその影響（有意差など）で設定してもよいが、その濃度を２ｎＭ～１ｍＭや、５ｎＭ～１０μＭ、１０ｎＭ～１０００ｎＭのように設定してもよい。

【0054】

本発明の検査試薬セットの第二の混合試薬は、その有効成分であるＴＦや、ＦＶＩＩＩの阻害物質、ＴＦＰＩの阻害物質以外の成分を含むものとすることができる。検査試薬は、通常、水を主たる成分とする場で反応させる検査に用いられる。このため検査試薬の媒質は水を主たる成分とすることができる。また、タンパク質等の吸着阻害剤や保護剤、ｐＨ調整剤、ミネラル調整剤等を含むものとすることができる。例えば、血清アルブミンや、緩衝液、合成リン脂質、塩化カルシウムなどを含むものとすることができる。

【0055】

［検査試薬］
ＴＦＰＩ阻害物質を添加した血漿のプロトロンビン（ＰＴ）凝固時間を、阻害物質を含まない血漿の凝固時間と比較する事によって、ＴＦＰＩ活性を決定する試みが行われた（参考文献：Dahm et al. , A novel anticoagulant activity assay of tissue factor pathway inhibitor 1 (TFPI). J Thromb Haemost. 3: 651-658, 2005 ）。

【0056】

しかし、その検査法は血漿中に存在する微量のＴＦＰＩの抗凝固活性を高感度で定量する事は困難であった。そこで、発明者らは、血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性を定量する新たな検査試薬と検査方法の構築を目指して検討した結果、低濃度のＴＦ試薬の添加によって産生するトロンビン量が、ＴＦＰＩの抗凝固活性の検査において優れた指標である事、さらにＴＦ試薬をＦＶＩＩＩ阻害物質及びＴＦＰＩ阻害物質と組み合わせる事によって、血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性を高感度で、かつ迅速に定量できる事を見出した。実施例をもとに、今回発明したトロンビン産生試験のための検査試薬とその検査方法を以下に示す。

【0057】

［被験検体］
この検査は、血液凝固活性がかかわる様々な疾患の指標の検査に用いることができる。被験検体は、血液、血漿、あるいは尿などの生体から採取した生体試料などを対象とすることができる。本発明の検査方法は、被験検体を検査試薬と反応させることによって生じるトロンビンを定量するトロンビン産生試験工程を行う。

【0058】

［検査方法］
本発明の検査方法は、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査する検査方法に関する。

【0059】

［第一のトロンビン産生工程］
本発明の検査方法は、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する工程である。

【0060】

［第二のトロンビン産生工程］
本発明の検査方法は、ＴＦＰＩの阻害物質、組織因子、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する工程を有する。

【0061】

本発明の検査方法は、第一のトロンビン産生工程で定量されたトロンビンと、第二のトロンビン産生工程で定量されたトロンビンとを比較して、生体試料の組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）の抗凝固活性を検査することができる。

【0062】

具体的には、第二のトロンビン産生試験工程によるトロンビン産生量を、前記第一のトロンビン産生試験工程によるトロンビン量産生量との相対比で、被験検体中のＴＦＰＩの抗凝固活性を表すことができる。

【0063】

これらの工程は、被験検体と、検査試薬とを混合して、一定時間、静置や振蕩することで、反応させる。また、被験検体には、生体試料や検査試薬のほかにも、検査対象や、反応条件の管理等に用いられる成分や試薬等を含むものを用いてもよい。

【0064】

反応時の温度は、これらのタンパク質等による反応が生じる２５～４５℃程度とすることができ、好ましくは３０～４０℃、さらに好ましくは３５～４０℃であり、３７～３８℃とすることが特に好ましい。反応時間は１分～３０分程度とすることができ、１～１５分や、２～５分程度とすることができる。反応を停止させるときは、各種反応停止薬を混合して停止させることができる。例えば、反応停止薬としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）などがあげられる。

【0065】

第一のトロンビン産生工程は、たとえば、以下のように行うことができる。被験試料と、コントロール試料を９６ウエルなどの別々のウェルに加える。そして、それぞれに、組織因子（ＴＦ）、および凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を含む、第一の混合試薬を添加する。そして、反応に適した体温程度の温度に加熱する。その後、塩化カルシウム溶液などの調製液をさらに添加して３７℃で２．５分間インキューベーションする。これにより、トロンビンを産生させる。

【0066】

次に、生じたトロンビンを定量する。トロンビンの定量は、例えば、ＥＤＴＡとトロンビン蛍光基質（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ）から成るトロンビン検出試薬を添加して、３７℃程度で１分間程度インキューベーションする。そして、測定された蛍光強度は、トロンビン標準物を用いて作成した標準曲線をもとにトロンビン濃度へ変換し、最終的に、トロンビン産生量は正常コントロール血漿中のトロンビン濃度に対する標準化比率（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒａｔｉｏ（％）：ｒａｔｉｏ×１００）で表示する。

【0067】

第二のトロンビン産生工程も、第一のトロンビン産生工程に準じて行うことができる。組織因子、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質、及びＴＦＰＩ阻害物質を含む、第二の混合試薬を、被験試料及びコントロール試料に添加する。そして、トロンビン産生量を求める。

【0068】

その後、第二のトロンビン産生工程で得られたトロンビン産生量を、第一のトロンビン産生工程で得られたトロンビン産生量によって除して相対比を算出する。その相対比が被験血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性に相当する。

【0069】

混合試薬を血漿と反応させるときの各試薬濃度は、例えば、ＴＦ（１ｐＭ、あるいは２．５ｐＭ）、リン脂質（２０μＭ）、塩化カルシウム（１６ｍＭ）とすることができる。トロンビン検出試薬の濃度は、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、トロンビン蛍光基質（５０μＭ）となる。凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質及びＴＦＰＩ阻害物質の使用濃度は、被験試料中に存在する第ＶＩＩＩ（０．７ｎＭ）及びＴＦＰＩ（２ｎＭ）の濃度を超え、それらを完全に中和するための高い濃度が必要となる。例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子の阻害物質（４ｎＭ）、ＴＦＰＩ阻害物質（２５０ｎＭ）を用いる。

【0070】

［相対比］
検体中のＴＦＰＩの抗凝固活性は、次の「トロンビン産生量（２）／トロンビン産生量（１）」の相対比（任意単位、ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）で求めることができる。すなわちこの相対比は、ＴＦＰＩの阻害物質の有無によるトロンビン産生量の差を求めるものとなる。
トロンビン産生量（１）：「本発明の第一の混合試薬（ＴＦＰＩ阻害物質を含まないＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害検査試薬）との反応によって生じたトロンビン産生量」
トロンビン産生量（２）：「本発明の第二の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害／ＴＦＰＩ阻害検査試薬）との反応によって生じたトロンビン産生量」

【0071】

ＴＦＰＩは、血栓が係る様々な病気と関連している事から、今回発明した高感度のＴＦＰＩの抗凝固活性の検査法は、従来不可能であった心筋梗塞や脳梗塞などの血栓性疾患だけでなく、出血性の疾患のリスク判定、さらに予測において大いに役立つと考える。

【実施例】

【0072】

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。

【0073】

［実施例１］本検査に用いるＦＶＩＩＩ阻害物質
（方法）
（１）ＦＶＩＩＩ阻害物質
ＦＶＩＩＩ阻害物質として、血友病Ａ患者から調製したＦＶＩＩＩに対するモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔｎｅｒｓから購入）の性状を解析した。

【0074】

（２）性状解析方法
ＦＶＩＩＩ阻害物質は二つの異なる検査試薬と方法を用いたトロンビン産生試験によって解析した。

【0075】

・１ＡＰＴＴ検査試薬を用いたトロンビン産生試験
ＡＰＴＴ検査試薬（アクチン：シスメックス社）は、０．５％ウシ血清アルブミン（富士フィルム和光純薬）と０．１５Ｍ塩化ナトリウム（富士フィルム和光純薬）を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ＢＳＡ／ＴＢＳ、ｐＨ７．４）によって１６倍希釈した。

【0076】

最初に、１５μＬの希釈したＡＰＴＴ検査試薬溶液、及び５３μＬの正常コントロール血漿（Ｓｉｍｅｎｓ血液凝固試験用コントロール血漿Ｎ：シスメックス社）を、９６ウエルのマイクロタイタープレート添加し、３７℃で１０分間インキューベーションした。

【0077】

インキューベーション後、１５μＬの塩化カルシウム溶液（１００ｍＭ）とトロンビン検出用蛍光基質（グリシル－グリシル－アルギニル－アミノメチルクマリン、４０６μＭ）の混合溶液をＡＰＴＴ検査試薬を含むコントロール血漿に添加し、産生するトロンビン活性を４０分間連続してモニターした（参考：Yuichi Kamikubo,Selective factor VIII activation by the tissue factor-factor VIIa-fac tor Xa complex,BLOOD,2017年10月 5日,Vol.130 No.14,Page.1661-1670）。

【0078】

トロンビン量は、産生したトロンビンが蛍光基質を分解する事で蛍光が発せられるので、その強度を蛍光プレートリーダー（励起波長：３５５ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ）を用いて測定し、最終的にその蛍光強度をトロンビン標準物（Ｔｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ＴＧＡ ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、コスモバイオ社）による標準曲線をもとに、トロンビン濃度へ変換した。

【0079】

２）組織因子（ＴＦ）と活性型血液凝固第ＸＩ（ＦＸＩａ）の混合試薬を用いたトロンビン産生試験（参考：特許第６８８３８９９号公報に記載した方法）
混合試薬は、ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したＴＦ（Ｄａｄｅ Ｉｎｎｏｖｉｎ：シスメックス社）溶液、ＦＸＩａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）溶液、さらに合成リン脂質（Ｈａｅｍａｔｅｘ社）溶液を混合して調製した。

【0080】

実際の試験は、先ず、３５μＬのコントロール血漿（Ｓｉｍｅｎｓ血液凝固試験用コントロール血漿Ｎ）及び１０μＬの検査混合試薬（終濃度：１５０ｆＭＴＦ、２５ｐＭＦＸＩａ、２０μＭリン脂質）を９６ウエルのマイクロタイタープレートに加え３７℃で２分間加温した。その後、１０μＬの塩化カルシウム溶液（８８ｍＭ）を血漿検体に添加して３７℃で２．５分間インキューベーションする事によってトロンビンを産生させた。

【0081】

最後に、生じたトロンビンを定量するために、５０μＬのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、東京化成、１０ｍＭ）及びトロンビン蛍光基質（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ：Ｄ－シクロへキシルアラニル－アラニル－アルギニル－アミノメチルクマリン、ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、５０μＭ）から成るトロンビン検出試薬を血漿に添加して、３７℃で１分間インキューベーションした。

【0082】

インキューベーションの間にトロンビンが、トロンビン蛍光基質を加水分解することによって蛍光が発せられるので、蛍光プレートリーダー（励起波長：３５５ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ）を用いてその蛍光の強度を測定した。測定された蛍光強度は、トロンビン標準物を用いて作成した標準曲線をもとに、トロンビン濃度へ変換した。

【0083】

（結果）
１）ＡＰＴＴ試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響
コントロール血漿に抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２を０．６μｇ／ｍＬ、もしくは２．４μｇ／ｍＬの濃度で加えた後、ＡＰＴＴ試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生量への影響を調べた。その結果トロンビン産生は前記抗体によってほぼ完全に抑制された（図２のパネルＡとＢ）。

【0084】

図２は、ＡＰＴＴ試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。

【0085】

ＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生は、正常コントロール血漿にＦＶＩＩＩ阻害物質の抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２（０．６μｇ／ｍＬ、もしくは２．４μｇ／ｍＬ）を加えた後、希釈したＡＰＴＴ試薬（アクチン）及び塩化カルシウムを添加し、３７℃で反応させる事によって生じさせ、トロンビン検出用の蛍光試薬を用いて４０分間連続してモニターした。

【0086】

・パネルＡ．トロンビン産生図。トロンビン産生の経時変化と抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体による阻害を示している。
・パネルＢ．総トロンビン産生量。総トロンビン産生量はトロンビン産生図中の曲線のＡｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅを計算する事で算出した。各バーは平均値と標準偏差値は示す（ｎ＝２－３）。

【0087】

２）ＴＦとＦＸＩａの混合試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響
コントロール血漿に抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２を０．３μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、あるいは５μｇ／ｍＬの濃度で加えた後、ＴＦとＦＸＩａの混合試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生量に対する阻害効果を調べた。その結果、トロンビン産生は前記抗体によって濃度依存的に抑制され、１．３μｇ／ｍＬ以上の濃度で９５％以上のトロンビン産生が抑制された（図３）。

【0088】

図３は、ＴＦとＦＸＩａの混合試薬添加によって生じるＦＶＩＩＩ依存性のトロンビン産生に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。ＦＶＩＩＩ依存性に生じるトロンビンは、ＴＦとＦＸＩａの混合試薬（１５０ｆＭヒトＴＦ、２５ｐＭヒトＦＸＩａ、２０μＭリン脂質）及び塩化カルシウムを、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２（０．３μｇ／ｍＬ、１．３μｇ／ｍＬ、あるいは５μｇ／ｍＬ）を含む正常コントール血漿に添加し、３７℃で２．５分間インキューベーションする事によって産生させた後、トロンビン蛍光基質を用いて定量した。各バーは平均値と標準偏差値は示す（ｎ＝３）。

【0089】

［実施例２］本検査に用いるＴＦＰＩ阻害物質
（方法）
（１）ＴＦＰＩ阻害物質
ＴＦＰＩ阻害物質として、抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体の性状を解析した。抗体は精製したヒトＴＦＰＩをウサギに免疫する事で作成した抗ヒトＴＦＰＩ抗血清からｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて精製した。

【0090】

（２）解析方法
ＴＦＰＩはＴＦに結合したＦＶＩＩａ（ＴＦ－ＦＶＩＩａ）の活性及びＦＸａの活性を阻害する。本発明においては、これらのＴＦＰＩの阻害作用に対する抑制効果を指標にしてＴＦＰＩ阻害物質の活性を解析した。

【0091】

１）ＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ活性阻害の解析方法
先ずＴＦ－ＦＶＩＩａの活性は、１０μＬのヒトＦＸ（１００ｎＭ）を９６ウエルのマイクロタイタープレートに加えた後、４５μＬのＴＦ－ＦＶＩＩａの混合試薬（５０ｐＭのヒトＴＦ、２００ｐＭのヒトＦＶＩＩａ、２．５ｍＭの塩化カルシウム溶液を含む）を添加し、３７℃での２分間の反応によって形成する活性型ＦＸ（ＦＸａ）の量を定量する事によって算出した。

【0092】

実際には、２分間の反応後、３５μＬのＥＤＴＡ溶液（１０ｍＭ）の添加によりＦＸａの形成を停止させ、さらに形成したＦＸａ量を定量するために、ＦＸａを含む反応液に２５μＬの発色性のＦＸａ基質（ＣＳ－１１：Ｂｉｏｐｈｅｎ社、１９０μＭ）を添加し、３７℃で反応させる事で生じる発色強度をプレートリーダー（４０５ｎｍにおいて）によって３分間連続して測定し、時間あたりの発色強度（ｍＯＤ／分）を求める事で定量した。

【0093】

なお、分析に用いるヒトＴＦ試薬はシスメックス社、ヒトＦＸ及びヒトＦＶＩＩａはＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、反応はＢＳＡ／ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で行った。ＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ活性阻害は、０．２ｎＭから２ｎＭの濃度範囲の遺伝子組換え型ヒトＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入）の存在下におけるＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化率の低下を指標にして調べた。

【0094】

２）ＴＦＰＩによるＦＸａ活性阻害の解析方法
ＦＸａ活性は、９０μＬのヒトＦＸａ（１．２５ｎＭ）を２５μＬのＦＸａ基質（ＣＳ－１１、１９０μＭ）と３７℃で反応させる事で生じる発色強度をプレートリーダー（４０５ｎｍにおいて）によって３分間連続して測定し、時間あたりの発色強度（ｍＯＤ／分）を求める事で定量化した。ＴＦＰＩによるＦＸａ阻害活性は、ＦＸａを２．５ｎＭの遺伝子組換え型ヒトＴＦＰＩと３７℃で１０分間反応させた後、残存のＦＸａ活性を測定する事で求めた。

【0095】

（結果）
１）ＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ活性阻害に対するＴＦＰＩ阻害物質の影響
先ず、ＴＦＰＩはＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化を濃度依存的に阻害した（図４）。そして、一定濃度のＴＦＰＩ（０．５ｎＭ）に抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）を添加すると、ＴＦＰＩによる阻害が全く見られなくなり、ＴＦＰＩ非存在下のコントロールと同様なレベルまでＦＸの活性化、つまりＦＸａの形成量が回復した（図４のパネルＢ）。この事は、抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体がＴＦＰＩのＴＦ－ＦＶＩＩａ阻害活性を完全に中和した事を示していた。

【0096】

図４は、ＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ活性に対する影響を示す図である。ＴＦ－ＦＶＩＩａの活性は、ＴＦ－ＦＶＩＩａの混合試薬（５０ｐＭのヒトＴＦ、２００ｐＭのヒトＦＶＩＩａ、２．５ｍＭの塩化カルシウム溶液を含む）をヒトＦＸ（１００ｎＭ）に添加し、３７℃での２分間の反応によって形成する活性型ＦＸ（ＦＸａ）の量を定量する事によって算出した。ＴＦＰＩはＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化を濃度依存的に抑制した。各ポイントは、平均値と標準偏差値は示している（ｎ＝３）。

【0097】

図５は、ＴＦＰＩ阻害物質のＴＦＰＩ活性への影響を示す図である。ＴＦＰＩ（０．５ｎＭ）にＴＦＰＩ阻害物質として抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）を添加すると、ＴＦＰＩによる阻害が全く見られなくなり、ＴＦＰＩ非存在下のコントロールと同じレベルまでＦＸａの形成量が回復した。各バーは平均値と標準偏差値は示す（ｎ＝３－７）。３群間の有意差は、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって検定した。

【0098】

２）ＴＦＰＩによるＦＸａ活性阻害に対するＴＦＰＩ阻害物質の影響
ＴＦＰＩをＦＸａと反応させるとＦＸａによる基質の加水分解が低下した。しかし、この低下は抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）の存在下で完全に抑制され、ＦＸａの活性はＴＦＰＩ非存在下のコントロールと同様なレベルまで回復した（図６）。

【0099】

図６は、ＴＦＰＩによるＦＸａ活性阻害に対するＴＦＰＩ阻害物質の影響を示す図である。ＦＸａ活性はヒトＦＸａ（１．２５ｎＭ）による発色性のＦＸａ基質（ＣＳ－１１、１９０μＭ）の加水分解能を指標にして定量化した。ＴＦＰＩ（２．５ｎＭ）はＦＸａによる基質の分解を阻害したが、この阻害は抗ＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）の存在下で完全に抑制され、ＦＸａの活性はＴＦＰＩ非存在下のコントロールと同様なレベルまで回復した。各バーは平均値と標準偏差値は示す（ｎ＝３－４）。３群間の有意差はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって検定した。

【0100】

以上の結果から、今回用いた抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体はＴＦＰＩによるＴＦ－ＦＶＩＩａ及びＦＸａ活性の阻害を完全に中和できる事が明らかとなった。

【0101】

［実施例３］血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性の検査のための検査試薬と検査方法
（方法）
（１）トロンビン産生試験に用いるＴＦ検査試薬と検出試薬の調製方法
１）ＴＦを含む検査試薬の調製法
ＴＦを含む検査試薬は、ＢＳＡ／ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）によって希釈したヒトＴＦ試薬（１ｐＭ、あるいは２．５ｐＭ）を合成リン脂質溶液（２０μＭ）と混合して調製した。

【0102】

２）ＦＶＩＩＩ阻害物質のみを含む第一のＴＦ検査試薬の調製法
１）で作成した検査試薬に抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体ＢＯＩＩＢ２（０．６３μｇ／ｍＬ）を添加する事で調製した。

【0103】

３）ＴＦＰＩ阻害物質とＦＶＩＩＩ阻害物質を組み合わせた第二のＴＦ検査試薬の調製法
この試薬は、２）で作成した検査試薬に抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）をさらに添加、混合して調製した。

【0104】

４）トロンビン検出試薬の調製法
トロンビン検出試薬は、５０μＭのトロンビン蛍光基質（Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨ）と１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液を混合して調製した。

【0105】

（２）血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性を定量するためのトロンビン産生試験の方法
先ず、３５μＬの血漿検体、あるいは正常コントロール血漿（Ｓｉｍｅｎｓ血液凝固試験用コントロール血漿Ｎ）、１０μＬのＴＦ検査試薬（１ｐＭ、もしくは２．５ｐＭ ＴＦと２０μＭリン脂質を含む）を９６ウエルのマイクロタイタープレートに加え３７℃で２分間加温した。その後、１０μＬの塩化カルシウム溶液（８８ｍＭ）を血漿検体に添加して３７℃で２．５分間インキューベーションする事によってトロンビンを産生させた。

【0106】

最後に、生じたトロンビンを定量するために、５０μＬのトロンビン検出試薬（１０ｍＭ ＥＤＴＡと５０μＭトロンビン蛍光基質Ｐｅｆａｆｌｕｏｒ ＴＨから成る）を血漿に添加して、３７℃で１分間インキューベーションした。インキューベーションの間にトロンビンが蛍光基質を加水分解することによって蛍光が発せられるので、蛍光プレートリーダー（励起波長：３５５ｎｍ、蛍光波長：４６０ｎｍ）を用いてその蛍光の強度を測定した。

【0107】

測定された蛍光強度は、トロンビン標準物を用いて作成した標準曲線をもとにトロンビン濃度へ変換した。なお、血漿検体中のトロンビン産生量は正常コントロール血漿（Ｓｉｍｅｎｓ血液凝固試験用コントロール血漿Ｎ）中のトロンビン濃度に対する標準化比率（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｒａｔｉｏ（％）：ｒａｔｉｏ×１００）で表示した。

【0108】

血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性は、ＴＦＰＩ阻害物質の存在下においてＴＦ検査試薬によって産生したトロンビン産生量を、阻害物質非存在下でのトロンビン産生量を比較することで決定した。前者の検査値は、ＴＦＰＩが影響していない、あるいは欠損した状態でのトロンビン産生量を示しており、一方後者はＴＦＰＩの抗凝固活性の強さや濃度を反映して低下したトロンビン産生量を表す。さらに今回の検査において最も重要な点は、両トロンビン産生試験をＦＶＩＩＩ阻害物質の存在下で実施することであった。ＦＶＩＩＩ阻害物質の存在は、ＴＦＰＩによる凝固阻害作用を高め、その結果ＴＦＰＩ活性を検出する検査の感度が高くなった。この発見が、新規性及び進歩性を有する新たなＴＦＰＩ検査法を生み出す事につながった。

【0109】

最終的に、ＴＦＰＩの抗凝固活性は、ＴＦＰＩ阻害物質存在下で得られたトロンビン産生量を非存在下の産生量で除した相対比をＴＦＰＩの抗凝固活性（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ）と定義した。例えば、ＴＦＰＩ阻害物質存在下のトロンビン産生量が９０％、一方非存在下でのトロンビン産生量が１００％となった場合には、相対比が９０％÷１００％の式によって０．９となる事から、血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性は０．９ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓと算出される。以下に、今回発明した検査試薬と検査方法の特長について解説する。

【0110】

（３）統計解析
対象群間の有意差検定は統計解析ソフトのＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。なお、危険率５％以下を有意差ありと判定した。

【0111】

（結果）
（１）ＴＦＰＩ抗凝固活性の検出感度に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響
近年、ＦＶＩＩＩを欠損した血友病患者で頻発する出血症状をＴＦＰＩ阻害薬の投与によって予防、あるいは治療する試みが行われてきた（参考文献：Peterson et al. Targeting TFPI for hemophilia treatment. Thromb. Res. 141 Suppl 2: S28-30, 2016）。この事はトロンビン産生においてＴＦＰＩの抗凝固作用がＦＶＩＩＩを介した凝固反応と競合している可能性を示唆していた。発明者らはこの点に着目し、トロンビン産生試験を用いたＴＦＰＩ活性の検出へのＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を調べた。

【0112】

トロンビン産生は、ＴＦ（２．５ｐＭ）を含む検査試薬を正常コントロール血漿へ添加し、反応させる事で試験した。反応後、約４，０００ｐＭのトロンビンが産生されたが、その濃度はＴＦＰＩ 阻害物質である抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）を添加しても全く変化しなかった（図７のパネルＡ）。この事から、高濃度のＴＦを用いたトロンビン産生試験によってＴＦＰＩの凝固阻害活性を決定する事は困難であると考えられた。

【0113】

しかし一方で、ＦＶＩＩＩ阻害物質である抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（０．６３μｇ／ｍＬ）の添加はトロンビン産生を低下させただけでなく、抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体と組み合わせる事によって、トロンビン産生を有意に増加させた（図７のパネルＡ）。

【0114】

ＴＦによるトロンビン産生は、ＦＶＩＩＩ凝固経路による促進とＴＦＰＩによる抑制の二つの相反する作用のバランスによって決定されると考えられる。今回の結果は、ＴＦＰＩ抗凝固活性の検出感度を高めるためにはＦＶＩＩＩ凝固経路を遮断する事が有用である事を明確に示した。

【0115】

同様な結果は、低濃度のＴＦ試薬（１ｐＭ）を用いたトロンビン産生試験においても得られた。１ｐＭのＴＦによるトロンビン産生量は、２．５ｐＭのＴＦを使用した結果と異なり、抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体の添加によって増加した（図７のパネルＢ）。
この抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体によるトロンビン産生の増加率を、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体の有無で比較した結果、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体の添加がトロンビン産生をより増加させる事が明らかとなった（図７のパネルＣ）。
この結果も、ＴＦＰＩ抗凝固活性の検出感度を高めるためには、ＦＶＩＩＩ阻害物質によってＦＶＩＩＩ凝固経路を遮断する事が有用である事を示した。

【0116】

図７は、トロンビン産生試験によるＴＦＰＩ抗凝固活性の検出に対するＦＶＩＩＩ阻害物質の影響を示す図である。トロンビン産生は、血漿検体をＴＦ試薬（１ｐＭ、もしくは２．５ｐＭ ＴＦと２０μＭリン脂質を含む）及び塩化カルシウムを３７℃で２．５分間インキューベーションした後、トロンビン検出試薬を用いて定量した。

【0117】

・パネルＡ．ＴＦ（２．５ｐＭ）によるトロンビン産生は、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（０．６３μｇ／ｍＬ）を抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）と組み合わせて反応させる事によって、産生するトロンビン濃度を有意に高めた。

【0118】

・パネルＢ．ＴＦ（１ｐＭ）を用いたトロンビン産生試験の結果。トロンビン濃度（ｎ＝４－６）はｂｏｘ／ｗｈｉｓｋｅｒを用いて中央値、最大値、最小値を示し、３群間の有意差はＯｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって検定した。

【0119】

・パネルＣ．抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体によるトロンビン産生の増加率（ｎ＝４）を、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体の有無で比較した。増加率はｂｏｘ／ｗｈｉｓｋｅｒを用いて中央値、最大値、最小値を示し、２群間の有意差はｔ－ｔｅｓｔによって検定した。

【0120】

（２）ＴＦＰＩの抗凝固活性とトロンビン産生阻害との相関
ＴＦＰＩの抗凝固活性とトロンビン産生阻害との相関を調べる目的で、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体を含む正常コントロール血漿に全長型のＴＦＰＩ（Ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＴＦＰＩ， ＦＬ－ＴＦＰＩ、参考特許：特開平０７－０７９７７４）を添加し、ＴＦ試薬（１ｐＭ）によるトロンビン産生に対するＦＬ－ＴＦＰＩの影響を検討した。ＦＬ－ＴＦＰＩは濃度依存的にトロンビン産生を阻害し、２ｎＭのＴＦＰＩはトロンビン産生をほぼ完全に抑制した（図８のパネルＡ）。

【0121】

一方で抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体の添加は、ＴＦＰＩの阻害活性を完全に中和した。抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体存在下で得られたトロンビン産生量を非存在下の産生量で除した相対比から算出したＴＦＰＩの抗凝固活性（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ）は、０．１２５ｎＭから２ｎＭの濃度範囲のＴＦＰＩと良好な直線関係を与え、正相関を示した（図８のパネルＢ）。

【0122】

図８は、トロンビン産生阻害をもとに算出したＴＦＰＩの抗凝固活性とＴＦＰＩ濃度との相関を示す図である。抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（０．６３μｇ／ｍＬ）を含むコントロール血漿に全長型のＴＦＰＩを添加し、ＴＦ試薬（１ｐＭ）によるトロンビン産生に対するＴＦＰＩの阻害効果を検討した。

【0123】

・パネルＡ．ＴＦＰＩは濃度依存的にトロンビン産生を阻害したが、抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体（４０μｇ／ｍＬ）によって完全にその阻害は中和された。各ポイントは平均値と標準偏差値は示す（ｎ＝２）。

【0124】

・パネルＢ．パネルＡで示したトロンビン産生阻害をもとに算出したＴＦＰＩの抗凝固活性（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ）は、ＴＦＰＩ濃度と良好な正相関を示した。

【0125】

（３）ヒト健常者血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性の決定
ヒト健常者血漿検体は、国立大学法人金沢大学の倫理審査委員会の承認を得た後、健常者のドナーから採取した血液から調製した。血液検体を採取する際には、担当医から患者に口頭及び文書による説明を行い、その上で同意書への署名を得て採取した。試験に用いる血漿検体は、抗凝固剤であるクエン酸を用いて採血した血液を室温で遠心分離（２，０００ｇで１０分間）する事によって調製した。なお血漿検体は試験開始まで－８０℃において凍結保存し、試験直前に３７℃で解凍して使用した。

【0126】

ＴＦ試薬（１ｐＭ）によるトロンビン産生は、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体及び抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体を被験血漿に添加して試験した。トロンビン産生濃度には明らかな個人差が見られたが、全ての健常者において、抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体の添加はトロンビン産生を増加させた（図９のパネルＡ）。

【0127】

そして、各ドナーのトロンビン産生量の増加の程度をもとに、健常者のＴＦＰＩの抗凝固活性を求めた結果、健常者血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性は、１．５８±０．４６ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ（平均値±標準偏差値、ｎ＝１５）と算出された。健常者血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性には、顕著な個人差が確認された（図９のパネルＢ）。

【0128】

図９は、ヒト健常者血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性の個人差を示す図である。１５名の健常者から調製した血漿中のＴＦＰＩの抗凝固活性をＴＦ試薬（１ｐＭ）を用いたトロンビン産生試験によって決定した。試験に際し、抗ヒトＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（０．６３μｇ／ｍＬ）及び抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗（４０μｇ／ｍＬ）を添加した。

【0129】

・パネルＡ．全ての健常者において抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体の添加はトロンビン産生を増加させた。
・パネルＢ．抗ヒトＴＦＰＩポリクローナル抗体による増加率をもとに算出されたＴＦＰＩの抗凝固活性値は１．５８±０．４６ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ（平均値±標準偏差値）であったが、顕著な個人差が確認された。図は活性値の平均値と９５％の信頼区間を示す。

【産業上の利用可能性】

【0130】

本発明検査試薬は、組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査に利用することができる物であり、産業上の利用可能性を有する。また、本発明の検査方法は、人間から採取したものを分析して各種データを収集する方法であり、医師が人間に対して行う医療行為ではなく、人間を手術、治療又は診断する方法に該当せず、産業上の利用可能性を有する。

【要約】

【課題】組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor、ＴＦＰＩ）活性の検出感度が高い検査方法やその検査方法に用いる検査試薬を提供する。
【解決手段】生体試料のＴＦＰＩの抗凝固活性を検査するための検査試薬であり、組織因子（ＴＦ）、および凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の阻害物質を含む、第一の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害）と、ＴＦＰＩの阻害物質と、前記ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害試薬とを含む、第二の混合試薬（ＴＦ／ＦＶＩＩＩ阻害／ＴＦＰＩ阻害）とを、含む、検査試薬。また、前記検査試薬を用いる検査方法。
【選択図】図８

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】