特許 7152319 プロテアーゼ変異体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-03

(45)【発行日】2022-10-12

(54)【発明の名称】プロテアーゼ変異体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/57 20060101AFI20221004BHJP

   C12N 9/56 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221004BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221004BHJP

   C11D 3/386 20060101ALI20221004BHJP

【ＦＩ】

C12N15/57 ZNA

C12N9/56

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/15

C12N1/21

C12N5/10

C11D3/386

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2018566295

(86)(22)【出願日】2017-06-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-07-11

(86)【国際出願番号】 US2017038060

(87)【国際公開番号】W WO2017219011

(87)【国際公開日】2017-12-21

【審査請求日】2020-06-08

(31)【優先権主張番号】62/351,649

(32)【優先日】2016-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/437,174

(32)【優先日】2016-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(72)【発明者】

【氏名】ボット、リチャード アール

(72)【発明者】

【氏名】エステル、デイビッド エー

(72)【発明者】

【氏名】ゴードゲブール、フリッツ

(72)【発明者】

【氏名】ムルダー、ハーム

(72)【発明者】

【氏名】プリセリウス、シーナ

【審査官】竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２２２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１３３８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００３２２６７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５１３３８５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／５６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号６のアミノ酸配列を含む親サブチリシン由来のサブチリシン変異体であって、アミノ酸置換Ｐ４０ＥおよびＥ８９Ｄを含み、前記変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされ、前記変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記変異体は、前記親サブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、前記改善された特性は、（ｉ）改善されたプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ－スクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン－ｐ－ニトロアニリド（Ｎ－ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ）またはジメチルカゼイン基質に対して性能指数（ＰＩ）＞１を有する、改善されたプロテアーゼ活性；（ｉｉ）洗剤中での改善された洗浄性能であって、前記変異体は、血液／ミルク／インク（ＢＭＩ）および／または卵の染みの洗浄で性能指数（ＰＩ）＞１を有する、洗剤中での改善された洗浄性能；（ｉｉｉ）洗剤中での改善された熱安定性であって、前記変異体は、安定性性能指数（ＰＩ）＞１を有する、洗剤中での改善された熱安定性；および／または（ｉｖ）改善された生産性であって、前記変異体は、１．０超の生産性性能指数（ＰＩ）を有する、改善された生産性であり、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない組成物である、サブチリシン変異体。

【請求項2】

請求項１に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物。

【請求項3】

洗剤組成物である、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記洗剤組成物は、洗濯用洗剤、布帛柔軟用洗剤、食器洗浄用洗剤および硬質表面洗浄用洗剤から選択される、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

カルシウムおよび亜鉛から選択される１つ以上のイオン；１つ以上の酵素安定剤；約０．００１重量％～約１．０重量％の前記変異体；１つ以上の漂白剤；１つ以上の補助剤；ならびに／またはアシルトランスフェラーゼ、アルファ－アミラーゼ、ベータ－アミラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ、ＤＮａｓｅ、エンド－ベータ－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリエステラーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、追加のセリンプロテアーゼおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の追加の酵素もしくは酵素誘導体をさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項6】

リン酸塩を含有するかもしくはリン酸塩を含まず、かつ／またはホウ素を含有するかもしくはホウ素を含まない、請求項２に記載の組成物。

【請求項7】

粒状、粉末状、固形状、棒状、液状、タブレット状、ゲル状、ペースト状または単位用量の組成物である、請求項２に記載の組成物。

【請求項8】

洗浄の方法であって、洗浄を必要とする表面または物品を請求項１に記載の変異体または請求項２に記載の組成物と接触させる工程を含み、かつ任意選択により、前記表面または物品を前記変異体または組成物と接触させた後に前記表面または物品をリンスする工程をさらに含む方法。

【請求項9】

前記物品は、食器または布帛である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

請求項１に記載の変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択により単離されているポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記核酸配列は、作動可能にプロモーターに連結されている、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ポリヌクレオチドによってコードされる前記変異体は、２４８Ｄ置換を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記変異体は、１．０超の生産性性能指数（ＰＩ）を含み、前記生産性ＰＩは、前記２４８Ｄ置換を含まないサブチリシン変異体ポリペプチドに対するものである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

５’から３’の方向に、上流（５’）に存在し、かつシグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列、下流（３’）に存在し、かつ前記５’シグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロペプチド配列、下流（３’）に存在し、かつ前記５’プロペプチド配列に作動可能に連結されている、前記２４８Ｄ置換を含む前記変異体をコードする核酸配列、および下流（３’）に存在し、かつ前記２４８置換を含む前記変異体をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されている任意選択のターミネーター配列を含む発現コンストラクトである、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項15】

（ｉ）前記シグナルペプチド配列は、配列番号２８を含み；（ｉｉ）前記プロペプチド配列は、配列番号３を含み；（ｉｉｉ）前記変異体をコードする前記核酸配列は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、および／または（ｉｖ）前記任意選択のターミネーター配列は、配列番号３０を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはカセット。

【請求項17】

請求項１６に記載のベクターもしくはカセットまたは請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。

【請求項18】

請求項１に記載の変異体を含む組成物であって、消毒用、医療器具洗浄用、動物飼料用、コンタクトレンズ洗浄用、創傷清拭用または織物、皮革もしくは羽毛加工用組成物である、組成物。

【請求項19】

Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；およびＰ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項１に記載のサブチリシン変異体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１つ以上の参照サブチリシンと比較して改善した安定性および／または汚れ除去性を有する１つ以上のサブチリシン変異体を含む、１つ以上のサブチリシン変異体、それをコードする核酸、ならびにその製造および使用に関連する組成物および方法が本明細書に開示される。

【0002】

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６４９号明細書および２０１６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４３７，１７４号明細書の優先権を主張するものである。

【0003】

配列表の参照
「ＮＢ４１１４６－ＷＯ－ＰＣＴ－ＳＥＱ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１７年６月１４日に作成され、サイズが１０１ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

セリンプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合の加水分解を開始する活性部位セリンを有する酵素（ＥＣ Ｎｏ．３．４．２１）である。セリンプロテアーゼは、広範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含むが、それらの構造に基づき、さらにキモトリプシン様（トリプシン様）およびサブチリシン様に分けられる。原型的なサブチリシン（ＥＣ Ｎｏ．３．４．２１．６２）は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から最初に得られた。サブチリシンおよびそのホモログは、ＭＥＲＯＰＳ分類スキームのＳ８ペプチダーゼファミリーのメンバーである。Ｓ８ファミリーのメンバーは、そのアミノ酸配列中にＡｓｐ、ＨｉｓおよびＳｅｒの順に並ぶ触媒三残基を有する。洗浄用途のために多くの有用な変異体プロテアーゼが開発されてきたが、改善されたプロテアーゼ変異体がこの技術分野で依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

一実施形態は、（ｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８；（ｉｉ）４０、１０１、１２８および１３０；（ｉｉｉ）２２、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４０；（ｉｖ）２２、４０、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４４；（ｖ）２２、４０、４４、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４８；（ｖｉ）２２、４０、４４、４８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた５８；（ｖｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた８９；（ｖｉｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０１；（ｉｘ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１１６；（ｘ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１２８；（ｘｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１３０；（ｘｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２および２４５から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２４８；（ｘｉｉｉ）４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２２；（ｘｉｖ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０３；（ｘｖ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０４；（ｘｖｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２３２；（ｘｖｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２４５から選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0006】

他の実施形態は、グラム陽性菌宿主細胞中においてサブチリシン変異体の産生を増大させる方法に関し、この方法は、（ａ）２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを宿主細胞に導入する工程と、（ｂ）コードされたサブチリシン変異体の産生に適切な条件下で宿主細胞を増殖させる工程とを含み、この宿主細胞は、２４８Ｄ置換を含まないサブチリシン変異体をコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む同じ属、種および遺伝的背景のグラム陽性菌宿主細胞に対して増大した量のサブチリシン変異体を産生し、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0007】

いくつかの他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物に関する。さらなる実施形態は、洗浄の方法であって、洗浄を必要とする表面または物品を、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体または本明細書に記載の１つ以上の組成物と接触させる工程を含む方法に関する

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンＰ２９６００（配列番号６）の成熟アミノ酸配列およびＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）サブチリシンＢＰＮ’（配列番号２６）の成熟アミノ酸配列のアラインメントを示す。

【図2A-2C】Ｐ２９６００（配列番号６）、ＢＰＮ’（配列番号２６）および本明細書に記載のＰ２９６００サブチリシン変異体（配列番号７～配列番号２５）のＣＬＵＳＴＡＬＷ配列アラインメントを示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書において別途指示がない限り、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質およびＤＮＡ配列決定、組換えＤＮＡ分野、ならびに工業的酵素の使用および開発において一般に使用されている従来技術によって作りかつ使用することができる。本明細書で定義されていない用語および略語は、当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味を有するものとする。本明細書において他に特に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。本明細書で示されるいかなる定義も、本明細書全体との関連で解釈されるべきである。本明細書では、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明記されない限り、複数形を含む。別途指示がない限り、核酸は、５‘から３’の方向に左から右へ記載し、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右へ記載する。本明細書で使用される数値範囲の全ては、それより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲に入る全てのより狭い数値範囲を全て含む。

【0010】

本明細書において数値と関連して使用する用語「約」は、その用語が文脈において他に特に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が他に特に定義されていない限り、５．５～６．５のｐＨ値を指す。

【0011】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体のアミノ酸置換の命名は、次の１つ以上を使用する：位置；位置：アミノ酸置換；または開始アミノ酸：位置：アミノ酸置換。「位置」（すなわち５、８、１７、２２など）への言及は、そのような位置に存在し得る任意の開始アミノ酸およびそのような位置に存在し得る任意の置換を包含する。「位置：アミノ酸置換」（すなわち１Ｓ／Ｔ／Ｇ、３Ｇ、１７Ｔなど）への言及は、そのような位置に存在し得る任意の開始アミノ酸およびそのような開始アミノ酸を置換し得る１つ以上のアミノ酸を包含する。開始アミノ酸または置換されたアミノ酸への言及は、スラッシュ（「／」）によって区切られた数個の開始アミノ酸または置換されたアミノ酸としてさらに表わされ得る。例えば、Ｄ２７５Ｓ／Ｋは、２７５位がセリン（Ｓ）またはリシン（Ｋ）で置換され、Ｐ／Ｓ１９７Ｋは、１９７位の開始アミノ酸プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されていることを示す。

【0012】

所与のアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、配列番号２６に対応して番号付けされている。すなわち、配列番号２６で示されるＢＰＮ’のアミノ酸配列が参照配列となる。例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体のアミノ酸配列は、本明細書に記載のアライメントアルゴリズムを使用して配列番号２６のアミノ酸配列とアライメントンされ、配列番号２６のアミノ酸残基とアライメントする（好ましくは、最適にアライメントする）所与のアミノ酸配列中の各アミノ酸残基は、対応するアミノ酸残基の位置番号を参照して便宜的に番号を付される。例えば、本明細書に記載するような配列アライメントアルゴリズムは、クエリー配列と比較して対象配列に挿入または欠失が生じている場所を特定する。

【0013】

「プロテアーゼ」および「プロテイナーゼ」という用語は、タンパク質およびペプチドを分解する能力を有する酵素を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成しているペプチドまたはポリペプチド鎖においてアミノ酸同士を結び付けるペプチド結合を加水分解することによって「タンパク質分解」を行う能力を有する。このタンパク質消化酵素としてのプロテアーゼの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性を測定する多くのよく知られた手順がある。例えば、タンパク質分解活性は、適切な基質を加水分解する各プロテアーゼの能力を分析する比較検定法によって特定され得る。プロテアーゼ活性またはタンパク質分解活性の分析に有用な例示的な基質としては、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ－９８０１）、ウシのコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ－９８７９）、ウシのエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ－１６２５）およびウシのケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの基質を使用する比色分析法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，３７６，４５０号明細書を参照されたい）。ｐＮＡペプチジルアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，９９：３１６－３２０，１９７９を参照されたい）は、活性酵素濃度の決定にも使用することができる。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質、例えばスクシニル－アラニン－アラニン－プロリン－フェニルアラニン－ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ）を加水分解する際のｐ－ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度を分光光度計により４１０ｎｍで測定するが、生成速度は、活性酵素濃度に比例する。さらに、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度の測定も、精製タンパク質試料における総タンパク質濃度の測定に使用することができる。基質に対する活性／タンパク質濃度は、酵素比活性を示す。

【0014】

「ホウ素を実質的に含まない組成物」または「ホウ素を実質的に含まない洗剤」という句は、おそらく他の組成物または洗剤成分からであろうホウ素を微量、例えば約１０００ｐｐｍ未満（１ｍｇ／ｋｇまたはリットルは１ｐｐｍに等しい）、約１００ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、または約５ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満含有する組成物または洗剤をそれぞれ指す。

【0015】

本明細書では、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての菌種、例えば、限定はされないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロドュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的に再編成され続けていることを理解されたい。したがって、この属には、再分類されている種、例えば、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されるＢ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、または現在、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）と称されるＢ．ポリミキサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）などの生物（これらに限定されない）が含まれるものとする。ストレスに満ちた環境条件下での抵抗性内生胞子の生成は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の決定的な特徴であると考えられるが、この特徴は、最近命名されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属にも当てはまる。

【0016】

本明細書では、「変異」という用語は、参照アミノ酸配列または参照核酸配列に対してなされた変化を指す。この用語は、置換、挿入および欠失を包含するものとする。

【0017】

本明細書では、「ベクター」という用語は、核酸を標的細胞または組織に導入または移入させるために使用される核酸コンストラクトを指す。通常、ベクターは、外来ＤＮＡを細胞または組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクターなどが挙げられる。通常、ベクターは、複製起点、マルチクローニングサイトおよび選択マーカーを含む。標的細胞へのベクターの挿入プロセスは、一般に、形質転換と称される。いくつかの実施形態では、本発明は、適切な宿主中でＤＮＡ配列を発現させ、組換えポリペプチド鎖のフォールディングおよび転座を起こすことができる適切なプロ配列（例えば、分泌シグナルペプチド配列など）に作動可能に連結されているセリンプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体または成熟セリンプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを含む。

【0018】

核酸配列の細胞中への導入に関連して本明細書で使用する「導入された」という用語は、核酸配列を細胞中に移入するのに適した任意の方法を指す。そのような導入方法としては、限定されないが、原形質融合、形質移入、形質転換、エレクトロポレーション、接合および形質導入が挙げられる。形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意的なゲノムへの組み込みおよび発現から生じる細胞の遺伝子改変を指す。

【0019】

「発現」という用語は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も意味し得る。したがって、「発現」という用語には、「ポリペプチドの産生」に関与する任意の工程、例えば、限定はされないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などが含まれる。

【0020】

「サブチリシン変異体の増大した発現」、「サブチリシン変異体の増大した生産」および「サブチリシン変異体の増大した生産性」という句は、互換的に使用され、サブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されている組換え宿主細胞（例えば、形質転換によって）から単離または分泌されたサブチリシン（変異体）ポリペプチドの収量の増大を指す。より詳しくは、「サブチリシン変異体の増大した発現」または「サブチリシン変異体の増大した生産」という句は、本明細書では、組換え宿主細胞（すなわちサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞）から単離または分泌された特定のサブチリシン変異体（ポリペプチド）の収量（すなわちタンパク質の生産性）の増大を指し、サブチリシン変異体ポリペプチドの収量のこの「増大」は、類似の組換え宿主細胞（参照（コントロール）サブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞）から単離または分泌された参照（コントロール）サブチリシンポリペプチドと比較した（に対する）ものである。例えば、本開示の変異体サブチリシンポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチドおよび参照（コントロール）サブチリシンをコードする第２のポリヌクレオチドを宿主細胞の集団（すなわち属、種および遺伝的背景が同じ宿主集団）に形質転換することができる。続いて、第１のポリヌクレオチドを含む宿主形質転換細胞および第２のポリヌクレオチドを含む宿主形質転換細胞を同じ条件で増殖／培養し、宿主細胞から発現／産生された変異体サブチリシンポリペプチドの量と、参照（コントロール）サブチリシンポリペプチドの量とを互いに比較する（例えば、タンパク質濃度またはサブチリシン活性の測定により）。

【0021】

「発現カセット」または「発現ベクター」という句は、標的細胞における目的の核酸（例えば、外来核酸または導入遺伝子）の発現のために、組換えまたは合成により作製された核酸コンストラクトまたはベクターを指す。目的の核酸は、通常、目的のタンパク質を発現する。発現ベクターまたは発現カセットは、通常、外来核酸の発現を駆動または促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。発現ベクターまたは発現カセットは、通常、標的細胞中で特定の核酸の転写を許容する他の特定の核酸エレメントも含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込むことができる。いくつかの発現ベクターは、宿主細胞または宿主細胞のゲノム中に異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現する能力を有する。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。発現ベクターに組み込まれた核酸配列からタンパク質を発現するための適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

【0022】

本明細書では、核酸は、他の核酸配列と機能的な関係で配置されたときに他の核酸配列に「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターがコード配列の転写に作用する場合、ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結されている。リボソーム結合部位が、コード配列の翻訳を促進するような位置にある場合、それは、コード配列に作動可能に連結され得る。通常、「作動可能に連結されている」ＤＮＡ配列は、隣接している。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、適当な制限酵素認識部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の方法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することができる。

【0023】

本明細書では、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードし、かつコード領域の前および後の領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指す。いくつかの場合、遺伝子は、個々のコードセグメント（エクソン）間に介在配列（イントロン）を含む。

【0024】

本明細書では、「組換え」は、細胞に関連して使用される場合、細胞が外来核酸配列の導入によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを一般に意味する。例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態内に同一の形態で存在しない遺伝子、または改変され、細胞に再導入された天然遺伝子（細胞の天然型に存在する）を含み得る。組換え細胞は、細胞から核酸を除かずに改変された細胞に内在する核酸を含み得る。そのような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異および当業者に知られた関連技術によって得られるものが挙げられる。組換えＤＮＡ技術としては、インビトロで組換えＤＮＡを生成する技術、および組換えＤＮＡが発現または増殖し得る細胞に組換えＤＮＡを導入し、それによって組換えポリペプチドを産生する技術が挙げられる。ポリヌクレオチドまたは核酸の「組換え」および「組換える」は、一般に、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチドの鎖または断片を組み立てるかまたは結合して、新しいポリヌクレオチドまたは核酸を生成することを指す。

【0025】

核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の状態においてまたは当業者に知られている方法によって操作されたとき、転写および／または翻訳されてポリペプチドまたはその断片を産生できる場合にポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸のアンチセンス鎖も配列をコードすると言われる。

【0026】

「宿主株」および「宿主細胞」という用語は、目的のＤＮＡ配列を含む発現ベクター用の適切な宿主を指す。

【0027】

「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用される。アミノ酸に対して、本開示全体を通して、生化学的命名法に関するＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ連合委員会（ＪＣＢＮ）に準拠して定義された１文字また３文字コードを使用する。１文字のＸは、２０種のアミノ酸のいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によってコードできることも理解される。

【0028】

「プロ配列」または「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列と、プロテアーゼの適切な折り畳みおよび分泌に必要な成熟プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指し、これらは、ときに分子内シャペロンと呼ばれる。プロ配列またはプロペプチド配列の開裂により、成熟活性プロテアーゼが生成される。細菌セリンプロテアーゼは、多くの場合、プロ酵素として表される。

【0029】

「シグナル配列」および「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟型または前駆体型の分泌または直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常、前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性または外因性であり得る。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質に存在しない。シグナル配列は、通常、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってそのタンパク質から切除される。

【0030】

タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「成熟」型という用語は、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの機能型を指す。

【0031】

タンパク質またはペプチドの「前駆体」型という用語は、そのタンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に連結されたプロ配列を有するタンパク質の成熟形を指す。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に作動可能に連結されている「シグナル」配列も有し得る。前駆体は、翻訳後活性に関連する追加のポリペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの成熟型を残すためにそれから切除されたポリペプチド）も有し得る。

【0032】

アミノ酸配列または核酸配列に関連した「野生型」という用語は、そのアミノ酸配列または核酸配列が天然または天然に存在する配列であることを示す。本明細書では、「天然型」という用語は、天然に見出されるもの（例えば、タンパク質、アミノ酸または核酸配列）を指す。逆に、「天然に存在しない」という用語は、天然に見出されないもの（例えば、実験室で生成されたまたは野生型配列の改変で生成された組換え核酸およびタンパク質配列）を指す。

【0033】

アミノ酸残基の位置に関連して本明細書で使用する「～に対応している」、または「～に対応する」、または「対応する」は、タンパク質もしくはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基またはタンパク質もしくはペプチド中の列挙された残基と類似の、相同の、または均等なアミノ酸残基を指す。本明細書では、「対応する領域」は、一般に、関連するタンパク質または参照タンパク質における類似の位置を指す。

【0034】

「～に由来する」および「～から得られる」という用語は、対象の生物の株によって生成されるかまたは生成可能なタンパク質だけではなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質およびそのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で生成されるタンパク質も意味する。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、対象のタンパク質の識別特徴を有するタンパク質を指す。例を挙げると、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼ」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって天然に産生される、タンパク質分解活性を有する酵素、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）源によって産生されるが、遺伝子工学技術の使用により、セリンプロテアーゼをコードする核酸で形質転換された他の宿主細胞によって産生されるようなセリンプロテアーゼを指す。

【0035】

２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関連した「同一の」という用語は、当該技術分野で知られている下記の配列比較アルゴリズムまたは配列解析アルゴリズムによる測定で、対応が最大になるように２つの配列をアライメントさせたときに同じとなる、２つの配列中の核酸またはアミノ酸を指す。

【0036】

「％同一性」、「パーセント同一性」または「ＰＩＤ」という句は、タンパク質配列の同一性を指す。パーセント同一性は、当該技術分野で知られている標準技術を使用して決定することができる。目的の配列が共有するパーセントアミノ酸同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥまたはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用し、配列をアライメントして配列情報を直接比較することにより決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７（１９９３）に記載されている。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、適合している同一残基の数を、最適／最大アライメントのためにプログラムによって創出されるギャップを含む「参照」配列の総残基数で除すことによって決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリー」配列と呼ぶ。

【0037】

本明細書では、「相同タンパク質」または「相同プロテアーゼ」は、一次、二次および／または三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質がアラインメントされた場合の線状アミノ酸配列における類似性を指すことができる。相同性は、アミノ酸配列アラインメントにより、例えばＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥまたはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して決定することができる。タンパク質配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して０．００１の閾値（Ｅ値のカットオフ）で実施することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｓｅｔ １；２５（１７）：３３８９－４０２（１９９７））。ＢＬＡＳＴプログラムは、数種の検索パラメーターを使用するが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性に関して最も関連する配列を見出すが、２０個未満の残基のクエリー配列のためには推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９－３４０２，１９９７；およびＳｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２９：２９９４－３００５，２００１）。核酸配列検索用の例示的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターには、次のものが挙げられる：隣接ワード閾値（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ ｗｏｒｄｓ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝－３）；ギャップオープニング（Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝５；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝２。アミノ酸配列検索用の例示的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターには、次のものが挙げられる：ワードサイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング（Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝１１；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１。この情報を用いて、タンパク質配列をグループ化し、かつ／またはそれから系統樹を構築することができる。アミノ酸配列は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅなどのプログラムに入力することができ、樹形図は、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法（Ｓａｉｔｏ ａｎｄ Ｎｅｉ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ，４：４０６－４２５，１９８７）を使用して作成することができる。ツリーの構築は、木村の配列距離補正を使用し、ギャップを含む位置を無視して計算することができる。ＡｌｉｇｎＸなどのプログラムは、系統樹上に示された分子名に続く括弧内に計算距離の値を提示することができる。

【0038】

分子間の相同性についての理解は、分子の進化史および分子の機能に関する情報を明らかにすることができ、新規に配列解析したタンパク質が既に特性解析されたタンパク質と相同であれば、新規なタンパク質の生化学的機能に対する強力な指標である。２つの実体間の最も基本的な関係は、相同性であり、２つの分子は、それらが共通の祖先に由来している場合に相同であると言われる。相同分子またはホモログは、パラログとオルトログとの２つのクラスに分類することができる。パラログは、１つの種内に存在するホモログである。パラログは、多くの場合、それらの詳細な生化学的機能が相違する。オルトログは、異なる種に存在するホモログであり、極めて類似のまたは同一の機能を有する。タンパク質スーパーファミリーは、共通の祖先を推察し得るタンパク質の最大のグループ（クレード）である。通常、この共通の祖先は、配列アライメントおよび機構類似性に基づいている。スーパーファミリーは、一般に、ファミリー内に配列類似性を示すいくつかのタンパク質ファミリーを含んでいる。「タンパク質クラン」という用語は、通常、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼ分類システムに基づくプロテアーゼスーパーファミリーに対して使用される。

【0039】

ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムは、配列アラインメントアルゴリズムのまた別の例である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２：４６７３－４６８０，１９９４を参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターには、次のパラメーターが含まれる：ギャップオープニングペナルティ（Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０；ギャップエクステンションペナルティ（Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５；タンパク質重量マトリックス（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス（ＤＮＡ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ；ディレイ発散数列（％）（Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ％）＝４０；ギャップ分離距離（Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝８；ＤＮＡトランジション重量（ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５０；親水性残基のリスト（Ｌｉｓｔ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ；負のマトリックスの使用（Ｕｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ）＝ＯＦＦ；トグル残基特異的ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）＝ＯＮ；トグル親水性ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ＝ＯＮ；およびトグルエンドギャップ分離ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ ｅｎｄ ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝ＯＦＦ。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、いずれか一方の末端で発生する欠失が含まれる。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドの一方の末端（またはポリペプチド内）で５個のアミノ酸が欠失した変異体は、「参照」ポリペプチドに対して９９％（４９５／５００同一残基×１００）のパーセント配列同一性を有する。そのような変異体は、ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。

【0040】

核酸およびポリヌクレオチドは、少なくとも部分的または完全に他の成分、例えば、限定されないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合に「単離されている」。同様に、ポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、少なくとも部分的にまたは完全に他の成分、例えば、限定されないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合に「単離されている」。モル基準では、単離された種は、組成物中で他の種より豊富である。例えば、単離された種は、存在する全ての高分子種の少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％（モル基準で）を含み得る。目的の種は、実質的に均質に（すなわち組成物中に従来の検出法で汚染種が検出されない）まで精製されていることが好ましい。純度および均質性は、核酸またはタンパク質の試料をそれぞれアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル電気泳動にかけた後、染色によって可視化するなど、当該技術分野でよく知られている多くの手法で決定することができる。必要に応じて、高分解能技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または類似の手段を材料の精製に使用することができる。

【0041】

核酸またはポリペプチドに適用される「精製された」という用語は、一般に、当該技術分野でよく知られている分析技術による測定で他の成分を本質的に含まない核酸またはポリペプチドを意味する（例えば、精製ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液および／または密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせる核酸またはポリペプチドは、「精製されている」。精製された核酸またはポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％（例えば、モルベースでの重量％）以上純粋である。これに関連して、組成物は、精製または濃縮技術の適用後に分子濃度が実質的に増加している場合に分子が濃縮されている。「濃縮された」という用語は、組成物中に、その出発組成物よりより高い相対濃度または絶対濃度で含まれる化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸または他の特定の材料もしくは成分を指す。

【0042】

本明細書では、「機能アッセイ」という用語は、タンパク質の活性の指標を提供するアッセイを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質の通常の能力で機能する能力を分析するアッセイシステムを指す。例えば、プロテアーゼの場合、機能アッセイは、タンパク性基質を分解するプロテアーゼの効果を決定することを含む。

【0043】

「洗浄活性」という用語は、タンパク質分解、加水分解、洗浄または開示されている他のプロセスで使用されている条件下でセリンプロテアーゼポリペプチドもしくは参照サブチリシンによって達成される洗浄性能を指す。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼまたは参照サブチリシンの洗浄性能は、１つ以上の酵素感受性の物品または表面の染み（例えば、食物、草、血液、インク、ミルク油、および／または卵タンパク質から生じる染み）を洗浄する様々なアッセイを用いることによって決定することができる。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体または参照サブチリシンの洗浄性能は、物品または表面上の染みを標準的な洗浄条件に置き、様々なクラマトグラフィ、分光光度法または他の定量法を用いて染みが除去された程度を評価することによって測定することができる。例示的な洗浄アッセイおよび方法は、当該技術分野で知られており、限定されるものではないが、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，６０５，４５８号明細書に記載されているもの、ならびに以下に示す実施例に含まれる洗浄アッセイおよび方法を含む。

【0044】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体または参照サブチリシンの「洗浄有効量」という用語は、特定の洗浄用組成物中で所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。そのような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄の適用、洗浄組成物の具体的な組成および液体または乾燥（例えば、粒状、タブレット状、棒状）組成物が要求されるか否かなどの多くの因子に基づく。

【0045】

「洗浄補助剤」という用語は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体またはその組換えポリペプチドもしくは活性断片以外の、洗浄用組成物中に含まれる任意の液体、固体または気体物質を指す。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄用組成物は、１つ以上の洗浄補助剤を含む。各洗浄補助剤は、通常、洗浄用組成物の具体的なタイプおよび形態（例えば、液状、粒状、粉末状、棒状、ペースト状、スプレー状、タブレット状、ゲル状、泡状または他の組成物）に応じて選択される。各洗浄補助剤は、組成物中の使用プロテアーゼ酵素と親和性のあるものが好ましい。

【0046】

洗浄用組成物および洗浄用調合物は、任意の物体、物品および／または表面の洗浄、漂白、消毒および／または殺菌に適した任意の組成を含む。そのような組成物および調合物としては、限定されないが、例えば液体および／または固体組成物、例えば洗浄用組成物または洗剤組成物（例えば、液状、タブレット状、ゲル状、棒状、粒状および／または固形状の洗濯洗浄用組成物または洗剤組成物および緻密に織られた布帛用洗剤組成物；ガラス、木材、セラミックおよび金属カウンタートップならびに窓などの硬質表面洗浄用組成物および調合物；カーペット洗浄剤；オーブン洗浄剤；布帛消臭剤；布帛柔軟剤；ならびに織物、洗濯促進洗浄用組成物または洗剤組成物、洗濯添加剤洗浄用組成物および洗濯プレ－スポッター洗浄用組成物；食器洗浄用組成物、例えば手洗浄または手作業用の食器洗浄用組成物（例えば、「手洗浄」または「手作業」用の食器洗浄用洗剤）および自動食器洗浄用組成物（例えば、「自動食器洗浄用洗剤」）が挙げられる。本発明では、単一単位剤形、例えば、限定はされないが、丸剤、タブレット、ジェルキャップまたは予め測定した粉末もしくは液体などの他の単一単位剤形も使用される。

【0047】

洗浄用組成物または洗浄調合物は、本明細書では、別途指示がない限り、粒状また粉末状の万能または強力洗剤、特に洗浄用洗剤；液状、粒子状、ゲル状、固形状、タブレット状、ペースト状または単位剤形の万能洗剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）型洗剤または強力粉末（ＨＤＤ）型洗剤；緻密に織られた布帛用液体洗剤；手洗浄または手作業用の食器洗浄用洗剤、例えば高起泡型洗剤；家庭用および業務用の手洗浄もしくは手作業用食器洗浄用、自動食器洗浄用または食器もしくはテーブルウエア用洗浄剤（各種タブレット状、粉末状、固形状、粒状、液状、ゲル状およびリンス助剤型のものを含む）；液体洗浄剤および消毒剤、例えば抗菌性手洗浄型、洗浄棒、口腔洗浄液、義歯洗浄剤、車用洗浄剤、カーペット洗浄剤、浴室洗浄剤；ヒトおよび他の動物用のヘアシャンプーおよび／またはヘアリンス；シャワージェル、フォームバスおよび金属クリーナー；ならびに漂白付加剤および「ステインスティック」または前処理剤などの洗浄補助剤を含む。いくつかの実施形態では、粒状組成物は、「コンパクト」形であり、いくつかの実施形態では、液体組成物は、「濃縮」型である。

【0048】

本明細書では、「布帛洗浄用組成物」は、洗濯用添加組成物を含む手洗濯用および機械洗濯用洗剤組成物、ならびに染みが付いた布帛（例えば、布、リネンおよび他の織物材料）の浸漬および／または前処理で使用するのに適した組成物を含む。

【0049】

本明細書では、「非布帛洗浄用組成物」は、限定されないが、例えば手洗浄もしくは手作業または自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、コンタクレンズ洗浄用組成物、創傷清拭組成物およびパーソナル洗浄用組成物を含む非織物（すなわち非布帛）表面洗浄用組成物を含む。

【0050】

本明細書では、「洗剤組成物」または「洗剤調合物」という用語は、特定の布帛および／もしくは非布帛物体または物品を含む、汚れたまたは汚れが付いた物体を洗浄する洗浄媒体で使用することを意図した組成物に関連して使用される。いくつかの実施形態では、本開示の洗剤は、本開示の１つ以上のサブチリシン変異体、およびさらに１つ以上の界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光色素、固結防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤および／または可溶化剤を含む。場合により、ビルダー塩は、ケイ酸塩とリン酸塩との混合物であり、好ましくは、ケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）がリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多い混合物である。いくつかの実施形態は、いかなるリン酸塩（例えば、リン酸塩またはリン酸塩ビルダー）も含まない洗浄用組成物または洗剤組成物に関する。

【0051】

本明細書では、「漂白」という用語は、材料を明るくし（すなわち白くし）、かつ／または洗浄するための、十分な期間ならびに／または適切なｐＨおよび／もしくは温度条件での材料（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）または表面の処理を指す。漂白に適した化学物質の例としては、限定されないが、例えばＣｌＯ_２、Ｈ_２Ｏ_２、過酸、ＮＯ_２などが挙げられる。

【0052】

本明細書では、プロテアーゼ（例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体またはその組換えポリペプチドもしくは活性断片）の「洗浄性能」は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の洗浄に対する寄与を指し、これは、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を組成物に添加していない洗剤と比較して追加の洗浄性能を洗剤に加えるものである。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。いくつかの試験システムでは、洗剤組成物、泡濃度、水の硬度、洗浄機構、時間、ｐＨおよび／または温度などの他の関連する因子を、特定の市場区分における家庭用途（例えば、手洗浄または手作業による食器洗浄、自動食器洗浄、食器の洗浄、テーブルウエアの洗浄、布帛の洗浄など）に一般的な条件を模擬するように調節することができる。

【0053】

「関連する洗浄条件」という用語は、本明細書では、手洗浄による食器洗い、自動食器洗浄または洗濯用洗剤の市場区分において、実際に家庭で使用される条件、特に洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度、洗剤のタイプおよび水の硬度を示すために使用される。

【0054】

本明細書では、「消毒」という用語は、汚染物質の表面からの除去および物品表面の微生物の阻害または殺滅を指す。

【0055】

本明細書の洗浄用組成物の「コンパクト」形は、密度により、および組成に関して無機フィラー塩の量により最も良く反映される。無機フィラー塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物では、フィラー塩は、相当の量、通常、組成物全体の約１７～約３５重量％含まれている。対照的に、コンパクト組成物では、フィラー塩は、組成物全体の約１５％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、フィラー塩は、組成物の約１０重量％を超えない量、より好ましくは約５重量％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、無機フィラー塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の硫酸塩および塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、フィラー塩は、硫酸ナトリウムである。

【0056】

洗浄用途および洗浄方法ならびに各種工業用途に有用な１つ以上のサブチリシン変異体を本明細書で開示する。１つ以上の単離された、組換えの、実質的に純粋な、または天然に存在しないサブチリシン変異体を本明細書で開示する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗浄用途に有用であり、洗浄を必要とする物品または表面を洗浄する方法に有用な洗浄用組成物に組み込むことができる。

【0057】

一実施形態は、（ｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８；（ｉｉ）４０、１０１、１２８および１３０；（ｉｉｉ）２２、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４０；（ｉｖ）２２、４０、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４４；（ｖ）２２、４０、４４、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた４８；（ｖｉ）２２、４０、４４、４８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた５８；（ｖｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた８９；（ｖｉｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０１；（ｉｘ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１１６；（ｘ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１２８；（ｘｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１３０；（ｘｉｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２および２４５から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２４８；（ｘｉｉｉ）４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２２；（ｘｉｖ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０３；（ｘｖ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１１６、１２８、１３０、２３２、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた１０４；（ｘｖｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２４５および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２３２；（ｘｖｉ）２２、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１０３、１０４、１１６、１２８、１３０、２３２および２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせた２４５から選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0058】

他の実施形態は、（ｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８；（ｉｉ）Ｐ４０、Ｓ１０１、Ｇ／Ｓ１２８およびＳ１３０；（ｉｉｉ）Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＴ２２；（ｉｖ）Ｔ２２、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＰ４０；（ｖ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＩ／Ｖ４４；（ｖｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ４８；（ｖｉｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＰ／Ｔ５８；（ｖｉｉｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＥ／Ｓ８９；（ｉｘ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１０１；（ｘ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１０３；（ｘｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＶ１０４；（ｘｉｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ／Ｎ１１６；（ｘｉｉｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｓ１３０、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＧ／Ｓ１２８；（ｘｉｖ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ａ２３２、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１３０；（ｘｖ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ｑ２４５およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ２３２；（ｘｖｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２およびＮ／Ｓ２４８から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＱ２４５；および（ｘｖｉｉ）Ｔ２２、Ｐ４０、Ｉ／Ｖ４４、Ａ４８、Ｐ／Ｔ５８、Ｅ／Ｓ８９、Ｓ１０１、Ｓ１０３、Ｖ１０４、Ａ／Ｎ１１６、Ｇ／Ｓ１２８、Ｓ１３０、Ａ２３２およびＱ２４５から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＮ／Ｓ２４８から選択される位置に２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0059】

さらに他の実施形態は、（ｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄ；（ｉｉ）Ｐ４０Ｅ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ／Ｓ１２８ＴおよびＳ１３０Ａ；（ｉｉｉ）Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＴ２２Ｒ；（ｉｖ）Ｔ２２Ｒ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＰ４０Ｅ；（ｖ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＩ４４Ｖ；（ｖｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ４８Ｖ；（ｖｉｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＰ／Ｔ５８Ｙ；（ｖｉｉｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＥ／Ｓ８９Ｄ；（ｉｘ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１０１；（ｘ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１０３Ａ；（ｘｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＶ１０４Ｉ；（ｘｉｉ）Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０ＡおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ／Ｎ１１６Ｑ；（ｘｉｉｉ）Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｓ１３０ＡおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＧ／Ｓ１２８Ｔ；（ｘｉｖ）Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８ＴおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＳ１３０Ａ；（ｘｖ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ｑ２４５ＲおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＡ２３２Ｖ；（ｘｖｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２ＶおよびＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＱ２４５Ｒ；ならびに（ｘｖｉｉｖｉｉ）Ｔ２２Ｒ、Ｐ４０Ｅ、Ｉ４４Ｖ、Ａ４８Ｖ、Ｐ／Ｔ５８Ｙ、Ｅ／Ｓ８９Ｄ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ、Ａ／Ｎ１１６Ｑ、Ｇ／Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１３０Ａ、Ａ２３２ＶおよびＱ２４５Ｒから選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換と組み合わせたＮ／Ｓ２４８Ｄから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0060】

さらなる実施形態は、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；およびこれらの組み合わせから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0061】

なおさらなる実施形態は、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄおよびこれらの組み合わせから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上の単離されたサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0062】

さらに他の実施形態は、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ０４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ０４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔおよびこれらの組み合わせから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上のサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0063】

他の実施形態は、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔおよびこれらの組み合わせから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上の単離されたサブチリシン変異体を提供する。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0064】

他の実施形態は、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ２２Ｒ－Ｓ１０１Ｇ－Ｓ１０３Ａ－Ｖ１０４Ｉ－Ａ－２３２Ｖ－Ｑ２４５Ｒ－Ｎ２４８Ｄから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上の単離されたサブチリシン変異体を提供する。

【0065】

他の実施形態は、２４８Ｄ置換を含むアミノ酸配列を含む１つ以上の単離されたサブチリシン変異体を提供する。

【0066】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。

【0067】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0068】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有し、したがって洗浄用途、例えば、限定されないが、食器製品、テーブルウエア製品、布帛および硬質表面（テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床、天井などの硬質表面）を有する製品の洗浄方法に有用である。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む例示的な洗浄用組成物は、以下に記載される。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性）は、当業者によく知られた手順によって容易に測定することができる。以下に示す実施例は、酵素活性および洗浄性能の評価方法を記載する。本発明のポリペプチド酵素の染み（例えば、血液／ミルク／インク、染料／ミルク／インクまたは卵黄）の除去性能、硬質表面の洗浄性能または洗濯物、食器もしくはテーブル用品の洗浄性能は、当該技術分野でよく知られている手順を用いてかつ／または実施例に記載の手順を用いて容易に測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、単離された、組換えの、実質的に純粋の、または天然に存在しない、サブチリシン活性またはカゼイン加水分解活性（例えば、ジメチルカゼイン加水分解活性）を有するサブチリシンである。

【0069】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、この改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤中での改善された洗浄性能、および洗剤中での改善された熱安定性から選択され、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、この改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤中での改善された洗浄性能、および洗剤中での改善された熱安定性から選択され、前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤であり、参照サブチリシンは、配列番号６または２６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較してより長時間の洗浄を通してより安定である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、参照サブチリシンと比較して短時間の冷水洗浄サイクルまたは長時間の熱水洗浄サイクルを通してより安定である。さらに他の実施形態では、１つ以上の改善された特性は、（ｉ）改善されたプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ－ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有する、改善されたプロテアーゼ活性、（ｉｉ）洗剤中での改善された洗浄性能であって、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄でＰＩ＞１を有する、洗剤中での改善された洗浄性能、および／または（ｉｉｉ）洗剤中での改善された熱安定性であって、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有する、洗剤中での改善された熱安定性である。ここで、この洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、改善されたプロテアーゼ活性を有し、前記変異体は、Ｎ－ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有する。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗剤中で改善された洗浄性能を有し、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄でＰＩ＞１を有する。ここで、この洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗剤中で改善された熱安定性を有し、前記変異体は、安定性でＰＩ＞１を有する。ここで、この洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない洗剤である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、改善されたプロテアーゼ活性を有し、前記変異体は、Ｎ－ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例３のプロテアーゼ活性アッセイに従って測定される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗剤中での改善された洗浄性能を有し、前記変異体は、ＢＭＩおよび／または卵の染みの洗浄でＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例４の洗濯（ＨＤＬ）洗剤およびＡＤＷ用洗剤アッセイにおける洗浄性能に従って測定される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗剤中での改善された熱安定性を有し、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例４の安定性アッセイに従って測定される。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗浄用組成物中で洗浄性能を示す。洗浄用組成物は、酵素の安定性および性能に有害な成分を含むことが多く、洗浄用組成物は、酵素、例えばセリンプロテアーゼが機能を保持するのに過酷な環境をもたらす。したがって、酵素を洗浄用組成物に入れて酵素機能（例えば、洗浄性能によって示されるようなセリンプロテアーゼ活性）を期待することはささいなことではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、自動食器洗浄（ＡＤＷ）用洗剤組成物中で洗浄性能を示す。いくつかの実施形態では、ＡＤＷ用洗剤組成物中での洗浄性能には、卵黄による染みの洗浄が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、洗濯用洗剤組成物中で洗浄性能を示す。いくつかの実施形態では、洗濯用洗剤組成物中での洗浄性能には、血液／ミルク／インク、卵、卵黄および／またはＰＯＭの染みの洗浄が含まれる。洗浄用組成物のそれぞれにおいて、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、漂白成分の有無にかかわらず洗浄性能を示す。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＡＤＷ用または洗濯用洗剤組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含み、前記変異体は、１つ以上の補助剤および／もしくは１つ以上の追加酵素の存在下で安定であり、かつ／または前記変異体は、自己タンパク質分解に対して安定である。

【0071】

本開示のいくつかの他の実施形態は、グラム陽性菌（宿主）細胞中でサブチリシン変異体の産生を増大させる方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、その方法は、（ａ）２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを宿主細胞に導入する工程と、（ｂ）コードされたサブチリシン変異体の産生に適した条件下で宿主細胞を増殖させる工程とを含み、この宿主細胞は、２４８Ｄ置換を含まないサブチリシン変異体をコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む同じ属、種および遺伝的背景のグラム陽性菌宿主細胞に対して、２４８Ｄ置換を含む増大した量のサブチリシン変異体を産生し、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体は、２４８Ｄ置換を含まないサブチリシン変異体に対して生産性性能指数（ＰＩ）＞１．０を有する。

【0072】

さらに他の実施形態では、開示のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）上流（５’）に存在し、かつシグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列、（ｉｉ）下流（３’）に存在し、かつ５’シグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロペプチド配列、（ｉｉｉ）下流（３’）に存在し、かつ５’プロペプチド配列に作動可能に連結されている、２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体をコードする核酸配列、（ｉｖ）下流（３’）に存在し、かつ２４８置換を含む変異体をコードする核酸配列に作動可能に連結されている任意選択のターミネーター配列を含む発現コンストラクトである。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの他の実施形態では、開示のポリヌクレオチドコンストラクト（すなわちグラム陽性菌宿主細胞中でのサブチリシン変異体産生増大用）は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列；（ｉｉ）配列番号２８を含むシグナルペプチド配列；（ｉｉｉ）配列番号３を含むプロペプチド配列；（ｉｖ）配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を含む、サブチリシン変異体ポリペプチドをコードする核酸配列；および／または（ｖ）配列番号３０を含む任意選択のターミネーター配列を含む発現コンストラクトを含む。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0073】

さらに他の実施形態では、グラム陽性菌宿主細胞中でサブチリシン変異体の産生を増大させる方法におけるサブチリシン変異体は、４０、４４、４８、５８、８９、１０１、１１６、１２８および１３０から選択される１つ以上の位置に１つ以上の置換をさらに含む。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおさらなる実施形態では、グラム陽性菌宿主細胞中でサブチリシン変異体の産生を増大させる方法におけるサブチリシン変異体は、Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ、Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ、Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ、Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ、Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ、Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ、Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ、Ｐ４０Ｅ－Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｅ８９Ｄ、Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ、Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ、Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ、Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ、Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ、Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ、Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ、Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｔ５８Ｙ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ１１６Ｑ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ５８Ｙ－Ｓ１０１Ｒ－Ｎ１１６Ｑ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｅ８９Ｄ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ；Ｐ４０Ｅ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１２８Ｔ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｔ５８Ｙ－Ｎ１１６Ｑ－Ｎ２４８Ｄ；Ｐ４０Ｅ－Ｉ４４Ｖ－Ａ４８Ｖ－Ｅ８９Ｄ－Ｎ２４８Ｄ；Ｓ１０１Ｒ－Ｓ１３０Ａ－Ｎ２４８Ｄ；Ｔ２２Ｒ－Ｓ１０１Ｇ－Ｓ１０３Ａ－Ｖ１０４Ｉ－Ａ－２３２Ｖ－Ｑ２４５Ｒ－Ｎ２４８Ｄおよびこれらの組み合わせから選択される１つ以上の置換を含むアミノ酸配列をさらに含む。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおさらなる実施形態では、グラム陽性菌宿主細胞中でサブチリシン変異体の産生を増大させる方法におけるサブチリシン変異体は、配列番号６または２６のアミノ酸配列に対して７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0074】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体には、１つ以上の保存的または非保存的なアミノ酸の挿入、欠失および／または置換などの様々な変化を加えることができる（そのような変化が変異体の酵素活性を実質的に変えない場合を含む）。同様に、本発明の核酸も、特定のコドンが同じまたは異なるアミノ酸をコードし、サイレント変異（例えば、コードされるアミノ酸がヌクレオチドの変異によって変わらない場合など）または非サイレント変異をもたらすような、１つ以上のコドンにおける１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の置換；配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の欠失；配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の付加または挿入；ならびに／あるいは配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の開裂または１つ以上の切断などの様々な変化を加えることができる。核酸配列における多くのそのような変化は、元の核酸配列によってコードされたポリペプチド酵素と比べて、得られるコードされたポリペプチド酵素の酵素活性を実質的に変えないであろう。本明細書に記載の核酸配列はまた、必要に応じて、前記１つ以上のコドンが依然同じアミノ酸をコードしながらも、発現系（例えば、細菌発現系）で最適発現を提供する１つ以上のコドンを含むように改変することもできる。

【0075】

本明細書では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体またはその組換えポリペプチドもしくは活性断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の単離された、天然に存在しない、または組換えポリヌクレオチドについて記載する。本明細書に記載の１つ以上の核酸配列は、通常、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体またはその断片をコードする配列を含むプラスミド発現ベクター（例えば、発現カセット）の発現により、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を組換え産生（例えば、発現）するのに有用である。一実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、この変異体は、タンパク質分解活性を有する成熟形である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、組換え技術により、相同のプロペプチド配列により発現される。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、組換え技術により、非相同のプロペプチド配列（例えば、ＧＧ３６プロペプチド配列）により発現される。

【0076】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体をコードする。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、２４８Ｄ置換を含むサブチリシン変異体をコードし、前記サブチリシン変異体は、１．０超の生産性性能指数（ＰＩ）を有し、この生産性ＰＩは、２４８Ｄ置換を含まないサブチリシン変異体ポリペプチドに対するものである。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、上流（５’）に存在し、かつシグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列、下流（３’）に存在し、かつ５’シグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロペプチド配列、下流（３’）に存在し、かつ５’プロペプチド配列に作動可能に連結されている、２４８Ｄ置換を含む変異体をコードする核酸配列、および下流（３’）に存在し、かつ２４８置換を含む変異体をコードする核酸配列に作動可能に連結されている任意選択のターミネーター配列を含む発現コンストラクトである。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、上流（５’）に存在し、かつシグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロモーター配列、下流（３’）に存在し、かつ５’シグナルペプチド配列に作動可能に連結されているプロペプチド配列、下流（３’）に存在し、かつ５’プロペプチド配列に作動可能に連結されている、２４８Ｄ置換を含む変異体をコードする核酸配列、および下流（３’）に存在し、かつ２４８置換を含む変異体をコードする核酸配列に作動可能に連結されている任意選択のターミネーター配列を含む発現コンストラクトであり、シグナルペプチド配列は、配列番号２８を含み、プロペプチド配列は、配列番号３を含み、サブチリシン変異体ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１から選択されるアミノ酸配列を含み、および／または任意選択のターミネーター配列は、配列番号３０を含む。ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２６のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。

【0077】

本明細書に記載の１つ以上の核酸配列は、任意の適切な合成、操作および／もしくは単離技術またはそれらの組み合わせを使用して作製することができる。例えば、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、当業者によく知られている固相合成技術などの標準的な核酸合成技術によって生成することができる。そのような技術では、通常、最大５０個以上のヌクレオチド塩基からなる断片を合成し、その後、連結して（例えば、酵素または化学的ライゲーションにより）、実質的に必要な連続核酸配列を形成する。本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、限定されないが、典型的には自動合成法で実施されるように、古典的なホスホロアミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９－６９（１９８１）を参照されたい）、またはＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１－８０５（１９８４）に記載の方法を用いる化学合成を含む、当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって容易に合成することもできる。本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって生成することもできる。特注の核酸を様々な商業的供給源（例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、およびＤＮＡ２．０）に注文することができる。核酸を合成するための他の技術および関連する原理は、例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）およびＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６（１９８４）に記載されている。

【0078】

核酸の改変に有用な組換えＤＮＡ技術、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写およびｃＤＮＡ産生ならびにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）は、当該技術分野でよく知られている。本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、あるいは本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体またはその組換えポリペプチドもしくは活性断片をコードするＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ｃＤＮＡクローンをスクリーニングし単離する手順およびＰＣＲ増幅の手順は、当業者によく知られており、当業者に知られた標準的な文献に記載されている。本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチドは、例えば、既知の変異誘発手順（例えば、部位特異的変異誘発法、部位飽和変異誘発法およびインビトロ組換え法）により、天然に存在するポリヌクレオチド骨格（例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体または参照サブチリシンをコードする）を改変することによって得ることができる。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする、本明細書に記載の改変ポリヌクレオチドを生成するのに適した様々な方法が当該技術分野で知られており、例えば、限定されないが、部位飽和変異誘発法、系統的変異導入法、挿入変異誘発法、欠失変異誘発法、ランダム変異誘発法、部位特異的変異誘発法および指向性向進化法ならびに各種の他の配列改変方法が挙げられる。

【0079】

さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む１つ以上のベクター（例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド）；本明細書に記載の１つ以上の核酸またはポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現カセット；本明細書に記載の１つ以上の核酸またはポリヌクレオチド配列を含む単離された、実質的に純粋な、または組換えられたＤＮＡコンストラクト；本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは組換えられた細胞；ならびに１つ以上のそのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、細胞、細胞培養物またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物を含む組成物に関する。

【0080】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のベクター（例えば、発現ベクターまたはＤＮＡコンストラクト）を含む１つ以上の組換え細胞に関し、そのベクターは、本明細書に記載の１つ以上の核酸またはポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組換え細胞は、そのような少なくとも１つのベクターで形質転換または形質移入されるが、他の方法も利用可能であり、当該技術分野で知られている。そのような細胞は、通常、宿主細胞と呼ばれる。いくつかのそのような細胞は、細菌細胞、例えば、限定されないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の細胞を含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシンを含む組換え細胞（例えば、組換え宿主細胞）に関する。

【0081】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターは、効率の良い遺伝子発現に必要な１つ以上の追加の核酸セグメント（例えば、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列に作動可能に結合されたプロモーター）に作動可能に結合されている、本明細書に記載の１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現カセットである。ベクターは、転写ターミネーターおよび／または選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含み得、それは、抗菌剤含有培地での増殖によってプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養維持を可能にする。

【0082】

発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来し得、または代替の実施形態では両方の要素を含む。例示的なベクターとしては、限定されないが、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９０）を参照されたい；Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用の適切な複製プラスミドとしてはｐ．９２に列挙したプラスミドが挙げられる）。（また、Ｐｅｒｅｇｏ，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ”；Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，［ｅｄｓ．］；“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３），ｐｐ．６１５－６２４を参照されたい）、およびｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩが挙げられる）。

【0083】

細胞中の目的タンパク質（例えば、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体）の発現および産生のために、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを含む（場合により、複数のコピーを含む）１つ以上の発現ベクターは、変異体の発現に適した条件下で細胞に形質転換される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列（およびベクターに含まれる他の配列）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは、自立染色体外エレメントとして細胞中に残留する。いくつかの実施形態は、染色体外核酸エレメントおよび宿主細胞ゲノムに組み込まれた入来ヌクレオチド配列のいずれも提供する。本明細書に記載のベクターは、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、組み込みを可能にし、任意選択により宿主染色体に変異体をコードするポリヌクレオチドの増幅を可能にする組み込みベクター上に存在する。組み込み部位の例は、当業者によく知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドの転写は、親サブチリシンの野生型プロモーターであるプロモーターによって達成される。いくつかの他の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体に対して異種であるが、宿主細胞内で機能的である。細菌宿主細胞での使用に例示的なプロモーターとしては、限定されないが、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子；Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子；Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）キシロシダーゼ遺伝子；Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ；およびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ－アミラーゼ遺伝子が挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定されないが、Ａ４プロモーター、ならびにファージラムダのＰＲまたはＰＬプロモーターおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられる。

【0084】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、細菌および真菌などの適切な微生物の宿主細胞で産生することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、グラム陽性菌によって産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌種、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の菌種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌種、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌種、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌種、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌種またはピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）の菌種である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞によって産生される。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の生成に利用されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞の例としては、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）およびＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）内の他の微生物が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、本明細書に記載の変異体を産生するために使用される。米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）明細書には、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に使用することができる種々のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株が記載されているが、他の適切な株も使用することができる。

【0085】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生に使用することができるいくつかの細菌株を挙げると、非組換え（すなわち野生型）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌種の株、ならびに種々の天然に存在する菌株の変異体および／または組換え株がある。いくつかの実施形態では、宿主株は、組換え株であり、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主に導入されている。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株、特に組換えＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。多くのＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が知られており、限定されないが、例えば１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３～ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９，０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０、およびＰＥＰ ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７３：２１５－２２８（１９７３）を参照されたい；また、米国特許第４，４５０，２３５号明細書、同４，３０２，５４４号明細書および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照されたい）。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発現宿主細胞としての使用は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９：８１－８７（１９８２）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６－８０４（１９８６）；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６９：３９－４７（１９８８）を参照されたい）。

【0086】

いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の宿主細胞は、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲおよびｄｅｇＱの少なくとも１つに変異または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種である。いくつかの実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ遺伝子にあり、いくつかの実施形態では、変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４－８３４（１９９０）；およびＯｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２－５６７（１９９７）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９－７３４０，２００１を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１４０７－１４１５，１９９９を参照されたい）；および／またはｏｐｐＡもしくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３－１８５，１９９１を参照されたい）に変異もしくは欠失を含む。実際、ｏｐｐＡ遺伝子の変異と同じ表現型を生じさせるｏｐｐオペロンの変異のいずれも、本明細書に記載の改変されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株のいくつかの実施形態で使用されると考えられる。いくつかの実施形態では、これらの変異は、単独で発生するが、他の実施形態では変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を産生させるために使用することができる改変されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、上記遺伝子の１つ以上に既に変異を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株である。さらに、内因性プロテアーゼ遺伝子の変異および／または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞も使用される。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞は、５つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含み、他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞は、９つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号明細書を参照されたい）。

【0087】

宿主細胞は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする１つ以上の核酸配列により形質転換される。プラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターを用いて核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に導入し、そのようなプラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターをそのような細胞に形質転換する方法がよく知られている。いくつかの実施形態では、プラスミドは、その後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離され、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へ形質転換される。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの介在微生物を使用することは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主に直接導入される。

【0088】

本明細書に記載の１つ以上の核酸配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入するための例示的な方法は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（１９８９），ｐｐ．５７－７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８－７２６（１９８４）；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５－１９３７（１９６７）；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１－１３５（１９８６）；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７（１９８５）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１－１１５（１９７９）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１－２６３（１９８０）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４（１９８６）；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３－２１７（１９８１）；およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３（１９８４）に記載されている）。実際、プロトプラスト形質転換および形質移入などの形質転換、形質導入ならびにプロトプラスト融合などの方法がよく知られており、本明細書で使用するのに適している。当該技術分野で知られているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換方法としては、プラスミドマーカーレスキュー形質転換などの方法があり、これは、部分的に相同の内在プラスミドを運ぶコンピテント細胞によってドナープラスミドを取り込むことを含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５－５７１（１９７９）；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５－１９１（１９９０）；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７－１０８７（１９８３）；およびＷｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５－１２１１（１９８７）を参照されたい）。この方法では、入来ドナープラスミドが、染色体の形質転換に類似した方法で、内在する「ヘルパー」プラスミドの相同領域に再結合する。

【0089】

一般的に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクトまたはベクターで直接形質転換される（すなわち宿主細胞に導入する前にＤＮＡコンストラクトまたはベクターを増幅するためまたは他の処理をするために中間細胞が使用されない）。本明細書に記載のＤＮＡコンストラクトまたはベクターの宿主細胞への導入には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を宿主ゲノムに挿入せずに宿主細胞に導入するための、当該技術分野で知られている物理的および化学的方法が含まれる。そのような方法としては、限定されないが、塩化カルシウム沈澱法、エレクトロポレーション法、裸ＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターをプラスミドに挿入せずにプラスミドと共に同時形質転換する。さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野で知られている方法により、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から欠失される（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１－４１８（１９８４）およびＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２４７：２５５－２６４（２０００）を参照されたい）。

【0090】

いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、従来の栄養培地中で培養される。温度、ｐＨなどの適切な具体的培養条件は、当業者に知られており、また科学文献に十分に記載されている。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体または核酸配列を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。

【0091】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、変異体の発現を可能にする条件下において、適切な栄養培地中で培養され、その後、得られた変異体は、培養物から回収される。いくつかの実施形態では、細胞によって産生された変異体を培養培地から従来の手順で回収する。手順としては、限定されないが、例えば遠心分離またはろ過によって宿主細胞を培地から分離し、上清またはろ液のタンパク質成分を塩（例えば、硫酸アンモニウム）で沈澱させ、クロマトグラフィーによる精製（例えば、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティなど）を行うことが挙げられる。

【0092】

いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞によって産生される１つ以上のサブチリシン変異体は、培養培地中に分泌される。精製促進ドメインをコードする核酸配列を変異体の精製促進に使用することができる。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはＤＮＡコンストラクトは、変異体の精製を容易にするために精製促進ドメインをコードする核酸配列をさらに含み得る（例えば、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１－５３（１９９３）を参照されたい）。そのような精製促進ドメインとしては、限定されないが、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン－トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３－２８１［１９９２］を参照されたい）、固定化免疫グロブリンによる精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、ＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システムにおいて使用されるドメインが挙げられる。精製ドメインと異種タンパク質との間への、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能な配列）の組込みも精製の促進に使用される。

【0093】

本明細書に記載の、１つ以上の成熟サブチリシン変異体の宿主細胞中での産生レベルを測定するために様々な方法を使用することができる。そのような方法としては、限定されないが、例えばプロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定されないが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよび他のアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１（１９８３））を参照されたい）。

【0094】

いくつかの他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の成熟サブチリシン変異体の生成または産生方法を提供する。成熟サブチリシン変異体は、シグナルペプチドまたはプロペプチド配列を含まない。いくつかの方法は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の細胞（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞）などの組換え細菌宿主細胞中で生成または産生することを含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、変異体の産生を促す条件下で培養することを含む、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の産生方法を提供する。いくつかのそのような方法は、培養物から変異体を回収することをさらに含む。

【0095】

さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を産生する方法を提供し、その方法は、（ａ）変異体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを細胞（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などの細菌細胞）の集団に導入する工程と、（ｂ）発現ベクターによってコードされた変異体の産生を促す条件下で培養培地中の細胞を培養する工程とを含む。いくつかのそのような方法は、（ｃ）細胞または培養培地から変異体を単離する工程をさらに含む。

【0096】

特段の記載がない限り、本明細書で提供される全ての成分または組成物のレベルは、その成分または組成物の活性レベルを基準に調整され、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば残存溶媒または副産物を含まない。酵素成分の重量は、全活性タンパク質量を基準とする。別途指示がない限り、パーセンテージおよび比率は、重量によって計算される。別途指示がない限り、パーセンテージおよび比率は、全組成物に基づいて計算される。本明細書に記載の組成物は、洗剤組成物などの洗浄用組成物を含む。例示した洗剤組成物において、酵素レベルは、全組成物の重量による純粋な酵素で表され、別段の規定がなければ、洗剤成分は、全組成物の重量によって表される。

【0097】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、限定されないが、例えば食器またはテーブルウエア製品、布帛、医療器具および硬質表面を有する製品（例えば、テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床および天井の硬質表面）の洗浄などの洗浄用途に有用である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、限定されないが、例えば自動食器洗浄機または洗濯機の消毒などの消毒用途に有用である。

【0098】

他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、洗浄用組成物である。他の実施形態では、組成物は、洗剤組成物である。さらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組成物、自動食器洗浄（ＡＤＷ）用組成物、手洗浄（手作業）による食器洗浄用洗剤組成物、硬質表面洗浄用組成物、眼鏡洗浄用組成物、医療器具洗浄用組成物、消毒（例えば、悪臭または微生物）用組成物およびパーソナルケア洗浄用組成物から選択される。さらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組成物、ＡＤＷ用組成物または手洗浄（手作業）による食器洗浄用洗剤組成物である。なおさらなる実施形態は、布帛洗浄用組成物に関する一方、他の実施形態は、布帛以外の洗浄用組成物に関する。いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、ホウ素を含まない。他の実施形態では、洗浄用組成物は、リン酸塩を含まない。さらに他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、賦形剤、補助剤および／または追加の酵素の１つ以上とを含む。

【0099】

なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、リン酸塩を含有するか、リン酸塩を含まないか、ホウ素を含むか、ホウ素を含まないか、またはこれらの組み合わせである。他の実施形態では、組成物は、ホウ素を含まない組成物である。いくつかの実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ酸塩安定化剤が添加されていない組成物である。他の実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が５．５％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が４．５％未満の組成物である。さらに他の実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が３．５％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が２．５％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が１．５％未満の組成物である。他の実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が１．０％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素含有量が０．５％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素を含まない組成物は、ホウ素を実質的に含まない組成物である。

【0100】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、ゲル、タブレット、粉末、粒状、固体、液体、単位用量およびこれらの組み合わせの形態を有する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、低水量コンパクト処方、低水量ＨＤＬもしくはＵＤまたは高水量処方もしくはＨＤＬから選択される形態を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の洗浄用組成物は、単位用量形態を有する。他の実施形態では、単位用量形態は、丸剤、タブレット、カプセル、ジェルキャップ、小袋、袋、多区画袋および予め定量された粉末または液体から選択される。いくつかの実施形態では、単位用量製剤は、多区画袋（または他の単位用量製剤）内の成分の放出が制御されるように設計されている。適切な単位用量製剤および放出制御製剤は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書；国際公開第０２／１０２９５５号パンフレット；米国特許第４，７６５，９１６号明細書；米国特許第４，９７２，０１７号明細書および国際公開第０４／１１１１７８号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、単位用量形態は、水溶性のフィルムまたは袋に含有されたタブレットまたは粉末である。

【0101】

例示的な洗濯用洗剤組成物としては、限定されないが、例えば液体および粉末の洗濯用洗剤組成物が挙げられる。例示的な硬質表面洗浄用組成物としては、限定されないが、例えば非食器製品、非テーブルウエア製品、テーブル、テーブルトップ、家具製品、壁、床および天井の硬質表面を洗浄するために使用される組成物が挙げられる。例示的な硬質表面洗浄用組成物は、例えば、米国特許第６，６１０，６４２号明細書、同第６，３７６，４５０号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されている。例示的なパーソナルケア組成物としては、限定されないが、義歯、歯、毛髪、コンタクトレンズおよび皮膚を洗浄するために使用される組成物が挙げられる。そうした口腔ケア組成物の例示的な成分としては、例えば、米国特許第６，３７６，４５０号明細書に記載されているものが挙げられる。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、タンパク質性の染みの除去が必要な表面の洗浄に有用または有効なものとして、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の有効量を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、補助剤は、例えば、洗浄性能を補助または増大させるため、洗浄する基材の処理のため、または香料、着色剤、染料などによる場合がそうであるが、洗浄用組成物の美観を変えるために組み込まれる。一実施形態は、１つ以上の補助剤と、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体とを含む組成物に関する。他の実施形態は、１つ以上の補助剤と、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体とを含む組成物であって、補助剤は、漂白触媒、追加の酵素、酵素安定剤（例えば、酵素安定化システムを含む）、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、染料移動剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、フィラー、光活性化剤、蛍光剤、布帛コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存剤、酸化防止剤、収縮防止剤、皺防止剤、殺菌剤、防カビ剤、着色スペックル、銀ケア剤、変色防止剤、腐食防止剤、アルカリ度源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、ｐＨ制御剤、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料移行抑止剤、沈着助剤、分散剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白ブースター、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、ポリマー分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、構造弾性化剤、布帛柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤、顔料およびこれらの組み合わせから選択される、組成物に関する。例示的な補助剤および使用濃度は、米国特許第５，５７６，２８２号明細書、同第６，３０６，８１２号明細書；同第６，３２６，３４８号明細書、同第６，６１０，６４２号明細書、同第６，６０５，４５８号明細書、同第５，７０５，４６４号明細書、同第５，７１０，１１５号明細書、同第５，６９８，５０４号明細書、同第５，６９５，６７９号明細書、同第５，６８６，０１４号明細書および同第５，６４６，１０１号明細書に記載されている。１つ以上の洗浄補助剤と、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体との混合性が悪い実施形態では、それらの２つの成分の混合が適切になるまで、補助剤と変異体を分離させておく（すなわち互いに接触させないでおく）方法を使用することができる。そのような分離方法として、当該技術分野で知られているあらゆる適切な方法（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、タブレット、物理的分離など）が挙げられる。

【0104】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む洗浄添加製品に関する。いくつかの実施形態では、添加剤は、洗浄工程で添加するための剤形にパッケージされている。いくつかの実施形態では、添加剤は、ペルオキシジェン源が利用され、高い漂白効果が望まれる洗浄工程に添加するために剤形にパッケージングされる。

【0105】

粒状組成物用の例示的なフィラーまたはキャリアとしては、限定されないが、例えば各種の硫酸塩、炭酸塩およびケイ酸塩；タルクならびにクレーが挙げられる。液体組成物用の例示的なフィラーまたはキャリアとしては、限定されないが、例えば水またはポリオールおよびジオールを含む低分子量の第１級および第２級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、そのようなフィラーまたはキャリアを約５％～約９０％含有する。そのような組成物に酸性フィラーを含有させ、洗浄方法または洗浄用途で生じる溶液のｐＨを低下させることができる。

【0106】

一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体の有効量を単独でまたは１つ以上の追加の酵素と組み合わせて含む。典型的には、洗浄用組成物は、少なくとも約０．０００１～約２０重量％、約０．０００１～約１０重量％、約０．０００１～約１重量％、約０．００１～約１重量％または約０．０１～約０．１重量％の１つ以上のプロテアーゼを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の洗浄用組成物は、１つ以上のプロテアーゼを組成物１グラム当たり、約０．０１～約１０ｍｇ、約０．０１～約５ｍｇ、約０．０１～約２ｍｇ、約０．０１～約１ｍｇ、約０．０５～約１ｍｇ、約０．５～約１０ｍｇ、約０．５～約５ｍｇ、約０．５～約４ｍｇ、約０．５～約４ｍｇ、約０．５～約３ｍｇ、約０．５～約２ｍｇ、約０．５～約１ｍｇ、約０．１～約１０ｍｇ、約０．１～約５ｍｇ、約０．１～約４ｍｇ、約０．１～約３ｍｇ、約０．１～約２ｍｇ、約０．１～約２ｍｇ、約０．１～約１ｍｇまたは約０．１～約０．５ｍｇ含む。

【0107】

本明細書に記載の洗浄用組成物は、典型的には、水性洗浄作業での使用中、洗浄水のｐＨが約４．０～約１１．５、さらには約５．０～約１１．５、さらには約５．０～約８．０、またはさらには約７．５～約１０．５となるように調合される。液体製品調合物は、通常、約３．０～約９．０または約３～約５のｐＨを有するように調合される。粒状の洗濯用製品は、通常、約９～約１１のｐＨを有するように調合される。いくつかの実施形態では、本発明の洗浄用組成物は、洗浄条件下でアルカリｐＨ、例えば約８．０～約１２．０、または約８．５～約１１．０、または約９．０～約１１．０のｐＨを有するように調合することができる。いくつかの実施形態では、本発明の洗浄用組成物は、洗浄条件下で中性ｐＨ、例えば約５．０～約８．０、または約５．５～約８．０、または約６．０～約８．０、または約６．０～約７．５のｐＨを有するように調合することができる。いくつかの実施形態では、中性ｐＨ条件は、洗浄用組成物を２０℃において脱イオン水に１：１００（重量：重量）で溶解させ、従来のｐＨ計を使用して測定した場合に測定することができる。推奨される使用レベルにｐＨを調整する手法としては、緩衝液、アルカリ、酸などの使用が挙げられるが、手法は、当業者によく知られている。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、保存時に組成物中の他の成分から保護するために、かつ／または洗浄時に変異体の利用を制御するためにカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル化は、変異体および／または追加酵素の性能を増大させる。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、通常、本明細書に記載の変異体の少なくとも一部をカプセル化する。通常、カプセル化材は、水溶性および／または水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、ガラス転移温度（Ｔｇ）が０℃以上である。例示的なカプセル化材料としては、限定されないが、炭水化物、天然または合成ガム、キチン、キトサン、セルロースおよびセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックスおよびこれらの組み合わせが挙げられる。カプセル化材が炭水化物である場合、カプセル化材は、通常、単糖類、オリゴ糖類、多糖類およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、デンプンである（例えば、欧州特許第０９２２４９９号明細書、米国特許第４，９７７，２５２号明細書、米国特許第５，３５４，５５９号明細書および米国特許第５，９３５，８２６号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリルおよびそれらの混合物などのプラスチックから作製されるマイクロスフィアである。例示的な市販のマイクロスフィアとしては、限定されないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ、Ｓｗｅｄｅｎ）；ならびにＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ－ＣＥＬ（登録商標）およびＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ Ｃｏｒｐ．、Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ、ＰＡ）が挙げられる。

【0109】

様々な洗剤調合物、洗浄水量、洗浄水温度および本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体が曝露さ得る洗浄時間の長さを含む様々な洗浄条件が存在する。低洗剤濃度のシステムは、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分を含有する洗浄水に関する。中程度の洗剤濃度システムは、約８００ｐｐｍ～２０００ｐｐｍの洗剤成分を含有する洗浄に関する。高洗剤濃度のシステムは、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分を含有する洗浄水に関する。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃～約４０℃、約２０℃～約３０℃、または約１５℃～約２５℃および約１５℃～約３５℃、または１０℃～４０℃の範囲内の他の全てを組み合わせた温度での洗浄に適した「冷水用洗剤」を使用する。

【0110】

異なる地理は、異なる水硬度を有する。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ^２＋）およびマグネシウム（Ｍｇ^２＋）の量の計測値である。水の硬度は、通常、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋を混合した１ガロン当たりのグレイン（ｇｐｇ）を単位として記載される。米国における水のほとんどは、硬質であるが、硬度が異なっている。中硬水（６０～１２０ｐｐｍ）～硬水（１２１～１８１ｐｐｍ）の水は、６０～１８１ｐｐｍ（ｐｐｍを１７．１で割ることによってｐｐｍを１米ガロン当たりのグレインに変換することができる）の硬度のミネラルを有する。

【0111】

【表1】

【0112】

他の実施形態は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％の本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９重量％～約９０．０重量％の１つ以上の補助剤とを含む１つ以上の洗浄用組成物に関する。他の実施形態では、洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％の１つ以上のサブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９９重量％～約９０．０重量％、約９９．９９９重量％～約９８重量％、約９９．９９５重量％～約９９．５重量％の１つ以上の補助剤とを含む。

【0113】

他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上の追加の酵素とを含む。１つ以上の追加の酵素は、アシルトランスフェラーゼ、アルファ－アミラーゼ、ベータ－アミラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ＤＮａｓｅ、エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ、エンド－ベータ－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マラナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリエアウテラーゼ、追加のプロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼおよびそれらのあらゆる組合せまたは混合物から選択される。いくつかの実施形態は、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼおよび／またはセルラーゼのような従来の酵素と、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体および／または１つ以上の追加プロテアーゼとを含む酵素の組み合わせ（すなわち「カクテル」）に関する。

【0114】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上の追加のプロテアーゼとを含む。一実施形態では、追加のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。他の実施形態では、追加のプロテアーゼは、アルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。適切な追加のプロテアーゼとしては、動物、野菜または微生物起源のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、微生物プロテアーゼである。他の実施形態では、追加のプロテアーゼは、化学的にまたは遺伝子的に改変された変異体である。他の実施形態では、追加のプロテアーゼは、アルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。例示的なアルカリプロテアーゼとして、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来するサブチリシン（例えば、サブチリシン、レンツス、アミロリケファシエンス、ギブソニイ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７およびサブチリシン１６８）が挙げられる。例示的な追加のプロテアーゼとしては、限定されないが、国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、同第９５／２３２２１号パンフレット、同第２００８／０１０９２５号パンフレット、同第０９／１４９２００号パンフレット、同第０９／１４９１４４号パンフレット、同第０９／１４９１４５号パンフレット、同第１０／０５６６４０号パンフレット、同第１０／０５６６５３号パンフレット、同第２０１０／０５６６３５６号パンフレット、同第１１／０７２０９９号パンフレット、同第２０１１／１３０２２号パンフレット、同第１１／１４０３６４号パンフレット、同第１２／１５１５３４号パンフレット、同第２０１５／０３８７９２号パンフレット、同第２０１５／０８９４４７号パンフレット、同第２０１５／０８９４４１、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号明細書、米国特許第５，８０１，０３９号明細書、同第５，３４０，７３５号明細書、同第５，５００，３６４号明細書、同第５，８５５，６２５号明細書、再発行特許第３４，６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、同第５，７００，６７６号明細書、同第６，３１２，９３６号明細書、同第６，４８２，６２８号明細書、同第８，５３０，２１９号明細書、米国仮特許出願第６２／１８０６７３号明細書および同第６２／１６１０７７号明細書、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０２１８１３号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５５９００号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７４９７号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７４９２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５１２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５２６号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５２０号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５７５０２号明細書、同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２２２８２号明細書および同第ＰＣＴ／米国特許出願公開第１６／３２５１４号明細書に記載のもの、さらに国際公開第１９９９０１４３４１号パンフレット、同第１９９９０３３９６０号パンフレット、同第１９９９０１４３４２号パンフレット、同第１９９９０３４００３号パンフレット、同第２００７０４４９９３号パンフレット、同第２００９０５８３０３号パンフレット、同第２００９０５８６６１号パンフレット、同第２０１４０７１４１０号パンフレット、同第２０１４１９４０３２号パンフレット、同第２０１４１９４０３４号パンフレット、同第２０１４１９４０５４および同第２０１４／１９４１１７号パンフレットに記載のメタロプロテアーゼが挙げられる。例示的な追加のプロテアーゼとして、限定されないが、トリプシン（例えば、ブタまたはウシ起源）および国際公開第８９／０６２７０号パンフレットに記載されたフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属プロテアーゼが挙げられるが、それらに限定されない。例示的な市販のプロテアーゼとしては、限定されないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）およびＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）１６Ｌ、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）およびＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）およびＢＬＡＰ（商標）バリアント（Ｈｅｎｋｅｌ）；ならびにＫＡＰ（Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）サブチリシン（花王株式会社）が挙げられる。例示的なメタロプロテアーゼとしては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中で発現する中性メタロプロテアーゼの組換え形態（例えば、国際公開０７／０４４９９３号パンフレットを参照されたい）であるｎｐｒＥおよびＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｔｓ）由来の精製された中性メタロプロテアーゼであるＰＭＮを含む。

【0115】

他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のリパーゼとを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％、約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％のリパーゼを含む。例示的なリパーゼとしては、化学的にまたは遺伝子的に改変された変異体であり得る。例示的なリパーゼとしては、限定されないが、例えばＨ．ラグニノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８０６８号明細書および同第３０５２１６号明細書を参照されたい）、Ｔ．ラグニノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第２０１４／０５９３６０号パンフレットおよび同第２０１５／０１０００９号パンフレットを参照されたい）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８０２３号明細書を参照されたい）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、例えばＣ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡまたはＢ）（例えば、欧州特許第２１４７６１号明細書を参照されたい）、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）およびＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２１８２７２号明細書を参照されたい）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１３７６号明細書を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号明細書を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ）（例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３－２６０（１９９３））、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば、特開昭６４－７４４９９２号公報を参照されたい）およびＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第９１／１６４２２号パンフレットを参照されたい）などの例えば細菌または真菌起源のものが挙げられる。例示的なクローニングされたリパーゼとして、限定されないが、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１－６７（１９９１）を参照されたい）、ゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３－３８８（１９８９）を参照されたい）および種々のリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）リパーゼ、例えばＲ．デレマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７－１１３（１９９１）を参照されたい）、Ｒ．ニベアス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６－７１９（１９９２））およびＲ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼが挙げられる。クチナーゼなどの他の脂肪分解酵素も本明細書に記載の１つ以上の組成物に用いることができ、限定されないが、例えばシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号パンフレットを参照されたい）および／またはフザリウム・ソラニピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ）に由来するクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。例示的な市販のリパーゼとしては、限定されないが、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡＦＡＳＴ（商標）およびＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ならびにＬＩＰＡＳＥＰ（商標）（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ）が挙げられる。

【0116】

なおさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のアミラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％、約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％のアミラーゼを含む。アルカリ性溶液中での使用に適したアミラーゼ（例えば、アルファおよび／またはベータ）は、そのような組成物に含めるのに有用であり得る。例示的なアミラーゼとしては、化学的にまたは遺伝子的に改変された変異体であり得る。例示的なアミラーゼとしては、限定されないが、細菌または真菌起源のもの、例えば英国特許第１，２９６，８３９号明細書、国際公開第９１００３５３号パンフレット、同第９４０２５９７号パンフレット、同第９４１８３３１４号パンフレット、同第９５１０６０３号パンフレット、同第９５２６３９７号パンフレット、同第９５３５３８２号パンフレット、同第９６０５２９５号パンフレット、同第９６２３８７３号パンフレット、同第９６２３８７４号パンフレット、同第９６３０４８１号パンフレット、同第９７１０３４２号パンフレット、同第９７４１２１３号パンフレット、同第９７４３４２４号パンフレット、同第９８１３４８１号パンフレット、同第９８２６０７８号パンフレット、同第９９０２７０２号パンフレット、同第９９０９１８３号パンフレット、同第９９１９４６７号パンフレット、同第９９２３２１１号パンフレット、同第９９２９８７６号パンフレット、同第９９４２５６７号パンフレット、同第９９４３７９３号パンフレット、同第９９４３７９４号パンフレット、同第９９４６３９９号パンフレット、同第００２９５６０号パンフレット、同第００６００５８号パンフレット、同第００６００５９号パンフレット、同第００６００６０号パンフレット、同第０１１４５３２号パンフレット、同第０１３４７８４号パンフレット、同第０１６４８５２号パンフレット、同第０１６６７１２号パンフレット、同第０１８８１０７号パンフレット、同第０１９６５３７号パンフレット、同第０２０９２７９７号パンフレット、同第０２１０３５５号パンフレット、同第０２３１１２４号パンフレット、同第２００４０５５１７８号パンフレット、同第２００４１１３５５１号パンフレット、同第２００５００１０６４号パンフレット、同第２００５００３３１１号パンフレット、同第２００５０１８３３６号パンフレット、同第２００５０１９４４３号パンフレット、同第２００５０６６３３８号パンフレット、同第２００６００２６４３号パンフレット、同第２００６０１２８９９号パンフレット、同第２００６０１２９０２号パンフレット、同第２００６０３１５５４号パンフレット、同第２００６０６３５９４号パンフレット、同第２００６０６６５９４号パンフレット、同第２００６０６６５９６号パンフレット、同第２００６１３６１６１号パンフレット、同第２００８０００８２５号パンフレット、同第２００８０８８４９３号パンフレット、同第２００８０９２９１９号パンフレット、同第２００８１０１８９４号パンフレット、同第２００８／１１２４５９号パンフレット、同第２００９０６１３８０号パンフレット、同第２００９０６１３８１号パンフレット、同第２００９１００１０２号パンフレット、同第２００９１４０５０４号パンフレット、同第２００９１４９４１９号パンフレット、同第２０１０／０５９４１３号パンフレット、同第２０１００８８４４７号パンフレット、同第２０１００９１２２１号パンフレット、同第２０１０１０４６７５号パンフレット、同第２０１０１１５０２１号パンフレット、同第１０１１５０２８号パンフレット、同第２０１０１１７５１１号パンフレット、同第２０１１０７６１２３号パンフレット、同第２０１１０７６８９７号パンフレット、同第２０１１０８０３５２号パンフレット、同第２０１１０８０３５３号パンフレット、同第２０１１０８０３５４号パンフレット、同第２０１１０８２４２５号パンフレット、同第２０１１０８２４２９号パンフレット、同第２０１１０８７８３６号パンフレット、同第２０１１０９８５３１号パンフレット、同第２０１３０６３４６０号パンフレット、同第２０１３１８４５７７号パンフレット、同第２０１４０９９５２３号パンフレット、同第２０１４１６４７７７号パンフレットおよび同第２０１５０７７１２６号パンフレットに記載されているアミラーゼなどが挙げられる。例示的な市販アミラーゼとしては、限定されないが、ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥＵＬＴＲＡ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）およびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）Ｓ１０００、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１１０、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）Ｓ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）およびＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。

【0117】

なおさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のセルラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％、約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％のセルラーゼを含む。適切なセルラーゼは、本明細書に記載の組成物に使用することができる。例示的なセルラーゼとしては、化学的にまたは遺伝子的に改変された変異体であり得る。例示的なセルラーゼとしては、限定されないが、細菌または真菌起源のもの、例えば国際公開第２００５０５４４７５号明細書、同第２００５０５６７８７号明細書、米国特許第７，４４９，３１８号明細書、同第７，８３３，７７３号明細書、同第４，４３５，３０７号明細書；欧州特許第０４９５２５７号明細書および米国仮特許出願第６２／２９６，６７８号明細書に記載されているような細菌または真菌起源のものが挙げられる。市販のセルラーゼの例としては、限定されないが、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＮＯＺＹＭＥ（登録商標）およびＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＰＲＥＭＩＵＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（商標）１００、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（商標）２００／２２０およびＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２０００（ＤｕＰｏｎｔ）；ならびにＫＡＣ－５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、成熟野生型または変異体セルラーゼの一部または断片として組み込まれ、Ｎ末端の一部が除去されている（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号明細書を参照されたい）。

【0118】

なおさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のマンナナーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％、約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％のマンナナーゼを含む。例示的なマンナナーゼとしては、化学的にまたは遺伝子的に改変された変異体であり得る。例示的なマンナナーゼは、限定されないが、例えば国際公開第２０１６／００７９２９号明細書；米国特許第６，５６６，１１４号明細書、同第６，６０２，８４２号明細書および同第６，４４０，９９１号明細書：ならびに米国仮特許出願第６２／２５１５１６号明細書、同第６２／２７８３８３号明細書および同第６２／２７８３８７号明細書に記載されているような細菌または真菌起源のものが挙げられる。例示的な市販マンナナーゼとしては、限定されないが、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ならびにＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）Ｍ１０００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（登録商標）Ｍ１００、ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録商標）およびＰＵＲＡＢＲＩＴＥ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。

【0119】

なおさらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼ酵素とを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％～約１０重量％、約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．００１重量％～約５重量％、約０．００１重量％～約２重量％または約０．００５重量％～約０．５重量％のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼを含む。ペルオキシダーゼは、過酸化水素またはその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩）と組み合わせて使用され得、またオキシダーゼは、酸素と組み合わせて使用され得る。ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼは、「漂白液」用に（すなわち洗浄液中で布帛を一緒に洗った際に１つの染色した布帛から他の布帛に織物染料が移行するのを防止するために）、単独でまたは増強剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号パンフレットおよび同第９５／０１４２６号パンフレットを参照されたい）。例示的なペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼは、化学的または遺伝子的に改変された変異体であり得る。例示的なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定されないが、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。

【0120】

他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、例えば国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、同第２００７／１０６２９３号パンフレット、同第２００８／０６３４００号パンフレット、同第２００８／１０６２１４号パンフレットおよび同第２００８／１０６２１５号パンフレットに記載されている１つ以上のペルヒドロラーゼとを含む組成物に関する。

【0121】

さらに他の一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物に含有される、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体および１つ以上の追加の酵素は、それぞれ独立して約１０％までの範囲で変化することができ、洗浄用組成物の残りは、１つ以上の補助剤である。

【0122】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、洗剤添加剤として使用され、前記添加剤は、固体または液体形態である。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補い、かつ／または増進することを目的としており、洗浄工程の任意の段階で添加することができる。いくつかの実施形態では、洗濯用洗剤組成物の密度は、約４００～約１２００ｇ／リットルの範囲である一方、他の実施形態では、２０℃の測定で約５００～約９５０ｇ／リットルの範囲である。

【0123】

いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、界面活性剤、酵素安定剤、ビルダー化合物、ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石けん分散剤、汚れ懸濁剤、再付着防止剤、腐食防止剤およびそれらの組み合わせから選択される１つ以上の補助剤とを含む洗濯用洗剤組成物に関する。いくつかの実施形態では、洗濯組成物は、柔軟剤も含む。

【0124】

さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、界面活性剤、有機ポリマー化合物、泡増強剤、ＩＩ族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープおよび追加の酵素から選択される１つ以上の補助剤とを含む手作業用食器洗浄用組成物に関する。

【0125】

他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の組成物に関し、前記組成物は、着色布帛の洗濯に使用されるかもしくは洗浄能力を通じて柔軟性を提供するコンパクトな粒状布帛洗浄用組成物であるか、または強力液体（ＨＤＬ）布帛洗浄用組成物である。例示的な布帛洗浄用組成物および／または製造方法は、米国特許第６，６１０，６４２号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されている。他の例示的な洗浄用組成物は、例えば、米国特許第６，６０５，４５８号明細書；同第６，２９４，５１４号明細書；同第５，９２９，０２２号明細書；同第５，８７９，５８４号明細書；同第５，６９１，２９７号明細書；同第５，５６５，１４５号明細書；同第５，５７４，００５号明細書；同第５，５６９，６４５号明細書；同第５，５６５，４２２号明細書；同第５，５１６，４４８号明細書；同第５，４８９，３９２号明細書；および同第５，４８６，３０３号明細書；同第４，９６８，４５１号明細書；同第４，５９７，８９８号明細書；同第４，５６１，９９８号明細書；同第４，５５０，８６２号明細書；同第４，５３７，７０６号明細書；同第４，５１５，７０７号明細書；ならびに同第４，５１５，７０５号明細書に記載されている。

【0126】

いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、酸性化粒子またはアミノカルボン酸ビルダーを含む。アミノカルボン酸ビルダーの例としては、アミノカルボン酸、その塩および誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、グリシン－Ｎ，Ｎ－二酢酸または一般式ＭＯＯＣ－ＣＨＲ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＭ）_２（式中、Ｒは、Ｃ_１～１２アルキル基であり、Ｍは、アルカリ金属である）で表される誘導体などのアミノポリカルボン酸ビルダーである。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ＧＬＤＡ（グルタミン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシルメチルイヌリンおよびその塩と誘導体、アスパラギン酸－Ｎ－一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸－Ｎ－一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ－（２－スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ－（２－スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ－（２－スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ－（２－スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、ＩＤＳ（イミノ二酢酸）およびその塩と誘導体（Ｎ－メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）など）、アルファ－アラニン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（アルファ－ＡＬＤＡ）、セリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン－Ｎ，Ｎ二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン－Ｎ、Ｎ－二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＴＵＤＡ）、ならびにスルホメチル－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＳＭＤＡ）ならびにそのアルカリ金属塩および誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、約４００μ～約１２００μの重量幾何平均粒径および少なくとも５５０ｇ／Ｌのかさ密度を有する。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、少なくとも約５％のビルダーを含む。

【0127】

いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、有機酸および鉱酸を含む任意の酸を含むことができる。有機酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、カプリン酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、セバシン酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸およびグリオキシル酸などのように１または２個のカルボキシル基を有し、場合により最大１５個の炭素原子、特に最大１０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、酸は、クエン酸である。鉱酸としては、塩酸および硫酸が挙げられる。場合により、酸性化粒子は、アミノカルボン酸ビルダーを高濃度で含む高活性粒子である。硫酸は、最終粒子の安定性に寄与することも分かっている。

【0128】

さらなる実施形態は、１つ以上のサブチリシン変異体ならびに１つ以上の界面活性剤および／または界面活性剤システムを含む洗浄用組成物に関し、この界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤およびこれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄用組成物の約０．１重量％～約６０重量％の濃度で存在するが、代わりの実施形態では、濃度は、約１重量％～約５０重量％であり、なおさらなる実施形態では、濃度は、約５重量％～約４０重量％である。

【0129】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の洗剤ビルダーまたはビルダーシステムを含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約１％から、約０．１重量％～約８０重量％、約３重量％～約６０重量％、約５重量％～約４０重量％または約１０重量％～約５０重量％のビルダーを含む。例示的なビルダーとしては、限定されないが、アルカリ金属；ポリリン酸のアンモニウム塩およびアルカノールアンモニウム塩；アルカリ金属ケイ酸塩；アルカリ土類およびアルカリ金属炭酸塩；アルミノケイ酸塩；ポリカルボン酸塩化合物；エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩；マレイン酸無水物とエチレンもしくはビニルメチルエーテル、１，３，５－トリヒドロキシベンゼン－２，４，６－トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキシコハク酸とのコポリマー；ポリ酢酸のアンモニウムおよび置換アンモニウム塩、例えばエチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸；ポリカルボン酸塩、例えばメリット酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５－トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸；ならびにこれらの可溶塩が含まれる。いくつかのそうした組成物中で、ビルダーは、水溶性硬度イオン錯体（例えば、封鎖性ビルダー）、例えばクエン酸塩およびポリリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウムならびにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物）を形成する。例示的なビルダーは、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ビルダーは、リン酸塩ビルダーおよび非リン酸塩ビルダーを含む。いくつかの実施形態では、ビルダーは、リン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは、非リン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは、リン酸塩ビルダーと非リン酸塩ビルダーとの混合物を含む。例示的なリン酸塩ビルダーとしては、限定されないが、一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩またはオリゴマーポリリン酸塩が挙げられ、これらの化合物のナトリウム塩を含むアルカリ金属塩が含まれる。いくつかの実施形態では、ビルダーは、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）であり得る。さらに、組成物は、炭酸塩および／またはクエン酸塩を含むことができる。他の適切な非リン酸塩ビルダーとしては、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸ならびにそれらの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記の化合物の塩としては、アンモニウムおよび／またはアルカリ金属塩、すなわちナトリウム塩を含むリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩が含まれる。適切なポリカルボン酸には、非環式、脂環式、複素環式および芳香族カルボン酸が含まれるが、いくつかの実施形態では、それらは、少なくとも２つのカルボキシル基を含有することができ、少なくとも２つのカルボキシル基は、それぞれの場合、一部の例では２個以下の炭素原子によって互いに分離される。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上のキレート剤を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．１重量％～約１５重量％または約３重量％～約１０重量％のキレート剤を含む。例示的なキレート剤としては、限定されないが、例えば銅、鉄、マンガンおよびこれらの混合物が挙げられる。

【0131】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の沈殿助剤を含む。例示的な沈澱助剤としては、限定されないが、例えばポリエチレングリコール；ポリプロピレングリコール；ポリカルボン酸塩；ポリテレフタル酸などの汚れ放出ポリマー；カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイトおよびハロイサイトなどのクレー；ならびにこれらの混合物が挙げられる。

【0132】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の再付着防止剤または非イオン性界面活性剤を含む（これらは、汚れの再付着を防止することができる）（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。例えば、ＡＤＷ用組成物では、表面を改質する目的で、特にシーティングの目的で膜および染みの形成を避け、光沢をよくするため、非イオン性界面活性剤が使用される。これらの非イオン性界面活性剤は、汚れの再付着防止にも使用される。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、エトキシ化非イオン性界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコールおよびアミンオキシド界面活性剤であり得る。

【0133】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の染料移行抑止剤を含む。例示的なポリマー性染料移行抑止剤としては、限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ－オキシドポリマー、Ｎ－ビニルピロリドンとＮ－ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルイミダゾールおよびこれらの混合物が挙げられる。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．０００１重量％～約１０重量％、約０．０１重量％～約５重量％または約０．１重量％～約３重量％の染料移行抑止剤を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上のケイ酸塩を含む。例示的なケイ酸塩としては、限定されないが、ケイ酸ナトリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウムおよび結晶性フィロケイ酸塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約１重量％～約２０重量％または約５重量％～約１５重量％の濃度で存在する。

【0135】

いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の分散剤を含む。例示的な水溶性有機物質としては、限定されないが、ホモポリマー酸もしくはコポリマー酸またはそれらの塩が挙げられ、その中で、ポリカルボン酸は、２個以下の炭素原子で相互に分離された少なくとも２つのカルボキシル基を含む。

【0136】

いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の酵素安定剤を含む。いくつかの実施形態では、酵素安定剤は、カルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの水溶性の供給源である。いくつかの実施形態では、酵素安定剤は、オリゴ糖、多糖およびカルシウム塩などのアルカリ土類金属を含む無機二価金属塩を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）および／またはマグネシウム（ＩＩ）イオン、ならびに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）およびオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性イオン源（これらが酵素にそうしたイオンを与える）が存在することによって安定化される。塩化物および硫酸塩もいくつかの実施形態で使用される。例示的なオリゴ糖および多糖（例えば、デキストリン）は、例えば、国際公開第０７／１４５９６４号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えばホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４－ホルミルフェニルボロン酸およびフェニルボロン酸誘導体（例えば、国際公開第９６／４１８５９号パンフレットに記載のものなど）ならびに／またはペプチドアルデヒド、例えば国際公開第２００９／１１８３７５号パンフレットおよび国際公開第２０１３００４６３６号パンフレットにさらに記載されているものも使用される。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の漂白剤、漂白活性化剤および／または漂白触媒を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、無機および／または有機漂白化合物を含む。例示的な無機漂白剤としては、限定されないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は、アルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は、追加の保護なしに結晶性の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、塩は、被覆される。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度の洗浄過程で漂白作用を増大させる有機過酸前駆体である。例示的な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下において、約１～約１０個の炭素原子もしくは約２～約４個の炭素原子を有する脂肪族過カルボン酸および／または場合により置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。例示的な漂白活性化剤は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。例示的な漂白触媒としては、限定されないが、マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、ならびにコバルト、銅、マンガンおよび鉄錯体が挙げられる。追加の例示的な漂白触媒は、例えば、米国特許第４，２４６，６１２号明細書；同第５，２２７，０８４号明細書；同第４，８１０，４１０号明細書；国際公開第９９／０６５２１号パンフレット；および欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。

【0138】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が使われる。いくつかの実施形態では、金属漂白触媒は、指定された漂白触媒活性の遷移金属陽イオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガンの陽イオン）、漂白触媒活性をほとんどまたは全く有しない補助金属陽イオン（例えば、亜鉛またはアルミニウム陽イオン）、ならびに触媒および補助金属陽イオンに対して指定された安定性定数を有する封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）およびこれらの水溶性の塩を含む触媒システムを含む（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、マンガン化合物によって触媒される。そうした化合物および使用濃度については、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号明細書に記載されている。さらなる実施形態では、コバルト漂白触媒が使用され、これは、本明細書に記載の１つ以上の組成物に含まれる。種々のコバルト漂白触媒が例えば米国特許第５，５９７，９３６号明細書および同第５，５９５，９６７号明細書に記載されている。

【0139】

いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、大多環状剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実際問題として、限定としてではなく、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および洗浄工程は、洗浄液中に少なくとも１億分の１のオーダーで、すなわち約０．００５ｐｐｍ～約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍまたは約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍの活性ＭＲＬを提供するように調整される。例示的なＭＲＬとしては、限定されないが、架橋した特殊な超剛性配位子、例えば５，１２－ジエチル－１，５，８，１２－テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカンが挙げられる。例示的な金属ＭＲＬについては、例えば、国際公開第２０００／３２６０１号パンフレットおよび米国特許第６，２２５，４６４号明細書に記載されている。

【0140】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の組成物は、１つ以上の金属ケア剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約０．１重量％～約５重量％の金属ケア剤を含む。例示的な金属ケア剤としては、例えば、アルミニウム、ステンレス鋼および非鉄金属（例えば、銀および銅）が挙げられる。さらなる例示的な金属ケア剤については、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書、国際公開第９４／２６８６０号パンフレットおよび同第９４／２６８５９号パンフレットに記載されている。いくつかの組成物では、金属ケア剤は、亜鉛塩である。

【0141】

いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ液体洗濯用洗剤は、洗浄用界面活性剤（１０％～４０％）を含むことができ、この洗浄用界面活性剤は、陰イオン性洗浄用界面活性剤（直鎖または分岐鎖またはランダム鎖の置換されたまたは置換されていないアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩および／またはこれらの混合物の群から選択される）；および任意選択の非イオン性界面活性剤（直鎖または分岐鎖またはランダム鎖の、置換されたまたは置換されていないアルキルアルコキシル化アルコール、例えばＣ_８～Ｃ_１８アルキルエトキシ化アルコールおよび／またはＣ_６～Ｃ_１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含み、任意選択により、陰イオン性洗浄用界面活性剤（６．０～９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）の非イオン性洗浄用界面活性剤に対する重量比は、１：１よりも大きい。適切な洗浄用界面活性剤としては、陽イオン性洗浄用界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルキル第４級ホスホニウム化合物、アルキル第３級スルホニウム化合物および／またはこれらの混合物から選択される）；両性イオン性および／または両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインから選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤；ならびにこれらの混合物も挙げられる。

【0142】

本組成物は、任意選択により、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（分岐した親水性および疎水性を有するアルコキシル化ポリマー、例えば０．０５重量％～１０重量％の範囲のアルコキシル化ポリアルキレンイミンの群から選択される）および／またはランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ_１～Ｃ_６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、グリセロールなどの飽和ポリアルコール、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性骨格と、Ｃ_４～Ｃ_２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ_２～Ｃ_６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリルもしくはメタクリル酸のＣ_１～Ｃ_６アルキルエステルおよびこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖とからなる）からなる界面活性強化ポリマーを含むことができる。

【0143】

本組成物は、例えば、汚れ放出ポリマー（例えば、陰イオン性末端キャップ化ポリエステル、例えばＳＲＰ１；ランダムもしくはブロック構造にある糖、ジカルボン酸、ポリオールおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー；ランダムまたはブロック構造にあるエチレンテレフタレート系ポリマーおよびそれらのコポリマー、例えばＲｅｐｅｌ－ｏ－ｔｅｘＳＦ、ＳＦ－２およびＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００およびＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬを含む）；再付着防止ポリマー（０．１重量％～１０重量％、例えばカルボン酸ポリマー、例えばアクリル酸、マレイン酸（またはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸から選択される少なくとも１つのモノマーおよびそれらの任意の混合物を含むポリマー；ビニルピロリドンホモポリマー；ならびに／または分子量が５００～１００，０００Ｄａの範囲内のポリエチレングリコールを含む）；セルロースポリマー（例えば、アルキルセルロース；アルキルアルコキシアルキルセルロース；カルボキシアルキルセルロース；アルキルカルボキシアルキルセルロース（その例には、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロースが含まれる）およびこれらの混合物を含む）；ならびにポリマー性カルボキシレート（例えば、マレエート／アクリレートランダムコポリマーまたはポリアクリレートホモポリマー）などの追加のポリマーを含むことができる。

【0144】

本組成物は、飽和または不飽和脂肪酸、好ましくは飽和または不飽和Ｃ_１２～Ｃ_２４脂肪酸（０重量％～１０重量％）；沈着助剤（例えば、多糖、セルロースポリマー、ポリジアリルジメチルハロゲン化アンモニウム（ＤＡＤＭＡＣ）、およびＤＡＤＭＡＣとビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、およびこれらの混合物とのランダムまたはブロック構成のコポリマー；陽イオン性グァーガム；陽イオン性セルロース、例えば陽イオン性ヒドロキシエチルセルロース；陽イオン性デンプン；陽イオン性ポリアクリルアミド；およびこれらの混合物をさらに含むことができる。

【0145】

本組成物は、染料移行抑止剤をさらに含むことができ、その例としては、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ－オキシドポリマー、Ｎ－ビニルピロリドンとＮ－ビニルイミダゾール、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、ならびに／またはこれらの混合物とのコポリマー、；例としてエチレン－ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むキレート剤；ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）；ヒドロキシ－エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）；エチレンジアミンＮ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）；２－ヒドロキシピリジン－Ｎ－オキシド（ＨＰＮＯ）；またはメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；グルタミン酸Ｎ、Ｎ－二酢酸（Ｎ，Ｎ－ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）；ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）；４，５－ジヒドロキシ－ｍ－ベンゼンジスルホン酸；クエン酸およびその任意の塩；Ｎ－ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミン四プロピオン酸（ＥＤＴＰ）およびこれらの誘導体が挙げられる。

【0146】

本組成物は、シリコーンまたは脂肪酸系の泡抑制剤；酵素安定剤；着色染料、カルシウムおよびマグネシウム陽イオン、視覚信号成分、消泡剤（０．００１重量％～約４．０重量％）および／または構造化剤／増粘剤（０．０１重量％～５重量％）（ジグリセリド、トリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロース系材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガムおよびこれらの混合物からなる群から選択される）をさらに含むことができる。

【0147】

いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯用洗剤は、陰イオン性洗浄用界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の、置換または非置換の、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩および／またはそれらの混合物から選択される）、非イオン性洗浄用界面活性剤（直鎖、分岐鎖またはランダム鎖の、置換もしくは非置換の、Ｃ_８～Ｃ_１８アルキルエトキシレートおよび／またはＣ_６～Ｃ_１２アルキルフェノールアルコキシレートから選択される）、陽イオン性洗浄用界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物およびそれらの混合物から選択される）；両性イオン性および／もしくは両性の洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインから選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤およびそれらの混合物を含む洗浄用界面活性剤；ビルダー（リン酸塩不含有ビルダー（例えば、ゼオライトビルダー［その例として、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰおよびゼオライトＭＡＰが挙げられる（０重量％～１０重量％未満の範囲）］；リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％～１０重量％未満の範囲のトリポリリン酸ナトリウム）；１５重量％未満の範囲のクエン酸、クエン酸塩およびニトリロ三酢酸またはその塩；ケイ酸塩（０重量％～１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウムもしくはケイ酸カリウムまたはメタケイ酸ナトリウム、あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ－６））；炭酸塩（０重量％～１０重量％未満の範囲の炭酸ナトリウムおよび／または重炭酸ナトリウム；ならびに漂白剤（フォトブリーチ、例えばスルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料およびこれらの混合物）；疎水性もしくは親水性漂白活性化剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸もしくはその塩、３，５，５－トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン－ＴＡＥＤおよびノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩－ＮＯＢＳ、ニトリル第四級物およびこれらの混合物）；過酸化水素；過酸化水素源（無機過水和物塩、例えば過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸または過ケイ酸のナトリウム塩の一水和物もしくは四水和物）；疎水性および／もしくは親水性予形成過酸（過カルボン酸およびその塩、過炭酸およびその塩、過イミド酸およびその塩、ペルオキシ一硫酸およびその塩、ならびにこれらの混合物から選択される）；ならびに／または漂白触媒（例えば、イミン漂白促進剤、例えばイミニウム陽イオンおよびポリイオンなど；イミニウム両性イオン；変性アミン；変性アミンオキシド；Ｎ－スルホニルイミン；Ｎ－ホスホニルイミン；Ｎ－アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；ペルフオロイミン；環状糖ケトンおよびそれらの混合物）、金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガン陽イオンと、亜鉛またはアルミニウムなどの補助的金属陽イオン、およびエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性の塩などの封鎖剤との併用）を含むことができる。

【0148】

本組成物は、追加の洗剤成分、例えば香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、酵素安定剤、着色剤、布帛の完全性および陽イオンポリマーを含む追加のポリマー、ダイロック成分、布帛柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布用沈澱助剤および／またはシクロデキストリンをさらに含むことができる。

【0149】

いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含むＡＤＷ用洗剤組成物である。ＡＤＷ用洗剤組成物は、０～１０重量％の量で含まれる、エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコキシル化アルコール界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコールまたはアミンオキシド界面活性剤から選択される２つ以上の非イオン性界面活性剤；リン酸塩（一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩もしくはオリゴマーポリリン酸塩）、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム－ＳＴＰＰまたはリン酸塩不含有ビルダー（アミノ酸をベースとした化合物、例えばＭＧＤＡ（メチル－グリシン－二酢酸）およびその塩と誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン酸－Ｎ、Ｎ二酢酸）ならびにその塩および誘導体、ＩＤＳ（イミノジコハク酸）ならびにその塩および誘導体、カルボキシメチルイヌリンならびにその塩および誘導体、ならびにそれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ならびにＢ－アラニン二酢酸（Ｂ－ＡＤＡ）およびそれらの塩）、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸モノマーならびにそれらの塩（０．５重量％～５０重量％の範囲で）を含む５～６０％の範囲のビルダー；約０．１重量％～約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を付与する）；約０．１重量％～約１０重量％の範囲の乾燥助剤（ポリエステル、特に陰イオン性ポリエステル（任意選択により、さらに縮重合に資する３～６官能性のモノマー、特に官能性の酸、アルコールまたはエステルと共に）、ポリカーボネート－、ポリウレタン－および／またはポリウレア－ポリオルガノシロキサン化合物もしくは反応性環状炭酸塩およびウレア型のその前駆体化合物から選択される）；約１重量％～約２０重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウムまたはケイ酸カリウム、例えば二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウムおよび結晶性フィロケイ酸塩）；無機漂白剤（例えば、過水和物塩、例えば過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）および有機漂白剤（例えば、有機ペルオキシ酸、例えばジアシルおよびテトラアシルペルオキシド、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸およびジペルオキシヘキサデカン二酸）；漂白活性化剤－約０．１重量％～約１０重量％の範囲の有機過酸前駆体；漂白触媒（マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、ＭｎおよびＦｅビスピリジルアミンおよび関連錯体、ならびにペンタアミンアセテートコバルト（ＩＩＩ）および関連錯体から選択される）；約０．１重量％～５重量％の範囲の金属ケア剤（ベンゾトリアゾール、金属塩および錯体ならびにケイ酸塩から選択される）；ＡＤＷ用洗剤組成物１ｇ当たり活性酵素が約０．０１～５．０ｍｇの範囲の酵素（アシルトランスフェラーゼ、アルファ－アミラーゼ、ベータ－アミラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ、エンド－ベータ－マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ－マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ－グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル－エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼおよびこれらの混合物）；ならびに酵素安定化成分（オリゴ糖、多糖および無機の二価金属塩から選択される）を含むことができる。

【0150】

さらなる実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を用いて布帛を処理する（例えば、織物の糊抜きをするため）組成物および方法に関する。布帛処理方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照されたい）。例えば、布帛の感触および外観は、溶液中で布帛と本明細書に記載の変異体とを接触させる工程を含む方法によって改善することができる。布帛は、加圧下で溶液を用いて処理することができる。

【0151】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、織物を織っている間もしくは織りあげた後、糊抜き段階または１つ以上の追加の布帛加工工程で適用することができる。織物を織っている間、糸は、相当に強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、それらの引張強度を増加させるためおよび破壊を防止するために糊付けデンプンまたはデンプン誘導体でコーティングされることが多い。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシンは、ウールまたは絹などの天然繊維の機織り中または機織り後に適用することができる。機織り後、布帛の着色性および柔軟性を促進するために本変異体を使用することができる。本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、綿含有布帛を含む布帛の糊抜きのために、単独でまたは他の糊抜き用薬剤および／または糊抜き用酵素と共に、例えば水性組成物中の洗剤添加剤として使用することができる。セルラーゼは、インジゴ染色デニム布帛および衣服にストーンウォッシュ外観を作り出すための組成物および方法に使用することもできる。アミラーゼも織物の糊抜きのための組成物および方法で使用することができる。衣類を製造するために布帛を裁断して衣類または衣服に縫製することができ、それらは、後に仕上げ処理される。特にデニムのジーンズを製造するために、様々な酵素による仕上げ法が開発されている。

【0152】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を使用して、動物およびそれらのその後の解体物または処理物、例えば羽毛、皮膚、毛および皮などからタンパク質を除去することができる。いくつかの場合、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む溶液に動物の死骸を浸漬することにより、従来の熱湯への浸漬または羽毛の除去プロセスと比べて皮膚の損傷を防止することができる。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を羽毛の消化または羽毛の分解開始に適した条件下で羽毛に噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本変異体は、酸化剤と組み合わせて使用することができる。

【0153】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、生の羽毛に関連する油または脂肪の除去を促進することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、羽毛を洗浄するための組成物中で使用され、また繊維を消毒し、部分的に脱水するために使用される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、羽毛からのタンパク質の回収に使用される。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、約０．５％（体積／体積）において、９５％のエタノールまたは他の極性有機溶媒と組み合わせて、界面活性剤を含むかまたは含まない洗浄液に適用される。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６２号明細書、同第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６３号明細書および同第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１３／０６５３６４号明細書に開示されているものなど、適切な羽毛処理法およびタンパク質分解方法において単独でまたは組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、回収したタンパク質は、その後、動物または魚の餌料に使用することができる。

【0154】

さらに他の実施形態では、１つ以上の動物飼料組成物、動物飼料添加物および／またはペットフードは、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体を含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と、１つ以上の動物用飼料成分および／または動物用飼料添加成分および／またはペットフード成分とを混合する工程を含む、そのような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物および／またはペットフードの調製方法に関する。

【0155】

「動物」という用語には、全ての非反芻動物および反芻動物が含まれる。特定の実施形態では、動物は、例えば、ウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、限定されないが、子ブタ、成長中のブタ、雌ブタなどのブタ；シチメンチョウ、アヒル、ニワトリ、ブロイラー、ヒヨコ、産卵ニワトリなどの家禽類；サケ、マス、テラピア、ナマズ、コイなどの魚類；ならびにエビおよびクルマエビなどの甲殻類が挙げられる。さらなる実施形態では、動物は、限定されないが、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーンおよびニルガイを含む反芻動物である。

【0156】

本明細書に関連して、「ペットフード」という用語は、家族のような動物、限定されないが、例えばイヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；鳥類ペット、例えばカナリア、インコおよびオウム；爬虫類ペット、例えばカメ、トカゲおよびヘビ；水生動物ペット、例えば熱帯魚およびカエルなどの餌を意味すると理解されることが意図されている。

【0157】

「動物飼料組成物」、「飼料」および「飼い葉」という用語は、互換的に使用され、ａ）穀草類、例えば小穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、カラス麦およびそれらの組み合わせ）および／または大穀物、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀草類からの副産物、例えばコーングルテンミール、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にトウモロコシをベースとした穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、ふすま、小麦ミドリング、小麦ショーツ（ｗｈｅａｔ ｓｈｏｒｔｓ）、米ヌカ、籾殻、カラス麦の殻、パーム核、およびシトラスパルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ハウチワマメ、エンドウマメ、ソラマメ、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマなどの供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物起源および動物起源から得られる油脂類；ならびにｅ）ミネラル類およびビタミン類から選択される１つ以上の飼料材料を含むことができる。

【0158】

本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、化学パルプ、半化学パルプ、クラフトパルプ、メカニカルパルプ、亜硫酸塩法により製造されたパルプなどの紙パルプの酵素による漂白にも使用される。一般的には、紙パルプは、紙パルプの漂白に適切な条件下において、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体と共にインキュベートされる。

【0159】

いくつかの実施形態では、パルプは、酸素、オゾン、過酸化物またはペルオキシ酸で漂白された、塩素を含まないパルプである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、改良または連続蒸解法によって製造された、低リグニン量を示すパルプの酵素による漂白に使用される。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、単独で、または好ましくはキシラナーゼ、および／もしくはエンドグルカナーゼ、および／もしくはアルファ－ガラクトシダーゼ、および／もしくはセロビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて使用される。

【0160】

他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、組織の酵素支援創傷清拭にさらに使用される。これは、壊死または損傷した組織の除去、例えば回復を促進するための創傷からの除去を含む。

【0161】

さらなる実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、組織培養にさらに使用される。特に、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、細胞を採集する工程などにおいて、細胞培養壁に付着した細胞を懸濁または再懸濁させるために使用することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、培養細胞と皿との間のタンパク質結合を切断して細胞を溶液中へ懸濁させるために使用することができる。

【0162】

さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、食品添加剤、消化剤および／または食品加工助剤としてさらに使用される。

【0163】

さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のサブチリシン変異体は、動物の皮からの毛の除去、浸漬、脱脂または脱灰による皮革加工（これは、皮革作製中に非構造タンパク質の分解を伴う工程である）にさらに使用される。

【実施例】

【0164】

本発明の菌株、組成物および方法の態様は、下記の実施例を考慮に入れると、より明確に理解することができる。ただし、この実施例は、限定するものと解釈されるべきでない。材料および方法の修正形態は、当業者に明白であろう。

【0165】

実施例１
Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン変異体の構築
従来の分子生物学的手法を用いてＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシンを生成するＤＮＡ操作を行った（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。後の実施例に記載のように、全てのサブチリシンを発現させ、回収した。成熟Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）サブチリシン配列をコードし、かつＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００プロテアーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＳＵＢＳ＿ＢＡＣＬ）の配列（配列番号６）に複数の改変を導入する一連の人工ＤＮＡ配列を作製した。

【0166】

ＰＣＲ増幅により、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号１）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号２）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）のプロペプチド（配列番号４）およびＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン遺伝子に対応する配列を含むＤＮＡカセットを合成した。産生したＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の一覧を、Ｐ２９６００に対してＢＰＮ’による番号付けを用いて記載した変異と共に本明細書の下記の表２に示す。

【0167】

ＰＣＲ断片を使用し、適切な菌株のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）コンピテント細胞２００μＬを形質転換した。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換混合物からの細胞を、１．６％スキムミルクおよび５ｐｐｍクロラムフェニコール（ＣＭＰ）を含有するＬＡプレートに播き、３７℃で終夜インキュベートした。各形質転換物から１つのコロニーを採取し、ルリア培地＋５ｐｐｍのＣＭＰ中、３７℃で増殖させた。各菌株試料は、２０％グリセロールと共に－８０℃で冷凍した。

【0168】

実施例２
バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の異種発現
表２に示したＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体を生成させるために、尿素を主な窒素源とし、グルコースを主な炭素源とし、頑健な細胞増殖のために１％ソイトンを追加したＭＯＰｓ緩衝液ベースの強化半合成培地中において、各種ＰＣＲ断片で形質転換したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株を培養した。インキュベーション後、遠心分離およびろ過により、分泌されたプロテアーゼを培地から分離した。後述のように、清澄化した培養物上清をアッセイに使用した。

【0169】

実施例３
バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体のプロテアーゼ活性
Ｎ－ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡの加水分解を測定することにより、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシンおよびその変異体のプロテアーゼ活性を試験した。ＡＡＰＦの加水分解アッセイに使用した試薬溶液は、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０を含有する、１００ｍＭのトリス／ＨＣｌｐＨ８．６、（トリス希釈緩衝液）；１０ｍＭのＣａＣｌ_２および０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０を含有する１００ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．６（トリス／Ｃａ緩衝液）；ならびにＤＭＳＯ中１６０ｍＭのｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ（ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡストック溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ－７３８８）であった。試験用基質溶液の調製のために、１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に１ｍＬのｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡストック溶液を加え、十分に混合した。１ｍｇ／ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ試験用溶液を含有するマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ７８１１０１）に酵素試料を加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動力学モードで使用し、４０５ｎｍで３分間、室温（ＲＴ）で活性をアッセイした。各試料の読み取り値から、プロテアーゼを含有しないブランクの吸収を減じた。プロテアーゼ活性は、ｍＯＤ・ｍｉｎ^－１で表した。

【0170】

実施例４
バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の洗浄性能および安定性の測定
Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ３カラムを用いたＵＨＰＬＣにより、培養物上清中のプロテアーゼ濃度を決定した。培養物上清を希釈緩衝液（トリス２５ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｍＭのＣａＣｌ_２）により適度に希釈した。緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）および緩衝液Ｂ（０．０７％アセトニトリル）の勾配を有するカラムにより、試料を溶離させた。精製親酵素の標準曲線に基づき、試料のタンパク質濃度を計算した。

【0171】

各Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の洗浄性能を、ＧＳＭ－Ｂ処方（表１参照）、ｐＨ１０．５および卵黄マイクロスウォッチ（ＰＡＳ－３８、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用し、食器に適用（ＡＤＷ）して測定した。予めパンチし、ＡＤＷ性能アッセイに使用したＰＡＳ－３８スウォッチは、リンスしたものもあればしなかったものもある。リンスしたＰＡＳ３８スウォッチを調製するには、１０ｍＭのＣＡＰＳ緩衝液１８０μＬ、ｐＨ１１を、ＰＡＳ３８マイクロスウォッチを含有するＭＴＰに加えた。ＭＴＰに封をし、ｉＥＭＳインキュベータ内において６０℃、振盪速度１１００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、緩衝液を除去し、スウォッチを脱イオン水でリンスして残留緩衝液を除去した。ＭＴＰを空気乾燥させ、性能アッセイに供した。酵素を添加する前に、硬度３７４ｐｐｍの水に溶解した３ｇ／ｌのＧＳＭ－Ｂ溶液をマイクロスウォッチプレートに満たした。

【0172】

ＢＭＩマイクロスォッチ（コットンへの血液／ミルク／インク）（ＥＭＰＡ－１１６、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用い、各Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の洗濯（ＨＤＬ）洗浄性能を試験した。予めパンチし（ＭＴＰに合わせるために）、浸漬したマイクロスウォッチ含有プレートを使用した。酵素を加える前に、マイクロスウォッチプレートを硬度２５０ｐｐｍの水に溶解した２．７ｇ／ｌのＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ－Ｂｉｏ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）液体洗剤で満たした（この洗剤は、ホウ素または酵素を含有しない市販の液体洗剤であり、この試験で使用するために購入した）。

【0173】

インキュベーション後（ＰＡＳ－３８スウォッチは、４０℃で３０分間インキュベートし、ＥＭＰＡ１１６スウォッチは、２５℃で１５分間インキュベートした）、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用い、ＥＭＰＡ－１１６およびＰＡＳ－３８スウォッチの４０５ｎｍにおける吸収を読み取った。各試料の値からブランクコントロール（無酵素）の値を減じて吸収結果（以下、「ブランク減算吸収」）を得た。各条件および各Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体について、ブランク減算吸収を同一条件の親プロテアーゼのそれで除すことにより性能指数（ＰＩ）を計算した。この試験に含められ、かつラングミュアフィットまたはＨｉｌｌシグモイドフィットにフィッティングした親プロテアーゼの標準曲線から親プロテアーゼの値を決定した。

【0174】

【表2】

【0175】

安定性を測定するために、ストレス緩衝液中で適度に希釈したＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体を調製した。続いて、実施例３に記載したＡＡＰＦアッセイを用い、熱インキュベーション工程の前後でプロテアーゼのタンパク質分解活性を測定した。熱インキュベーション工程の温度および時間は、参照用プロテアーゼの残留活性が約３０％になるように選択した。トリス－ＥＤＴＡ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ９；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．００５％Ｔｗｅｅｎ）緩衝条件で安定性を測定した。ストレス無負荷活性に対するストレス負荷活性の比を取り、１００を乗じることにより％残留活性を計算した。Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の残留活性を、親プロテアーゼのそれで除すことにより安定性ＰＩを得た。

【0176】

Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシンは、表３Ａおよび３Ｂに示す、洗浄性能および安定性結果の計算に使用した親プロテアーゼである。産生したＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の一覧を、Ｐ２９６００に対してＢＰＮ’による番号付けを用いて記載した変異と共に本明細書の下記表２に示す。

【0177】

【表3】

【0178】

【表4】

【0179】

【表5】

【0180】

実施例５
追加のＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の発現
Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親サブチリシン（ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢ＿ＳＵＢＳ＿ＢＡＣＬ）（ＧＧ３６）（配列番号６）およびその変異体を生成するために、従来の分子生物学的手法を使用してＤＮＡ操作を行った（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。親サブチリシンにアミノ酸改変を導入した、成熟サブチリシン変異体配列をコードする一連の人工ＤＮＡ配列を作製した。本明細書において後に記載するように全てのサブチリシンを発現させ、回収した。９６ウエルＭＴＰ中、３１℃で６８時間、細胞を選択成長培地で培養することにより、本明細書に記載の研究用プロテアーゼ試料を作成した。遠心分離およびろ過により、培養物上清を調製した。

【0181】

配列番号２７のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター配列を含む５’ＡｐｒＥ隣接領域（米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に記載されている）、ａｐｒＥシグナルペプチド配列（配列番号２８）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）からのプロ配列（配列番号３）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン遺伝子に対応する配列（配列番号２９）およびその変異体配列、ＢＰＮ’ターミネーター（配列番号３０）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子発現カセット（配列番号３１）、ならびに３’ＡｐｒＥ隣接配列（配列番号３２）を連続した順序で含むＤＮＡ断片を使用することにより、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親サブチリシン（配列番号６）およびその変異体を発現させ、標準的な分子技術を使用して構築した。配列番号２８によりコードされるＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３３で表される。配列番号３によりコードされるプロ配列のアミノ酸配列は、配列番号４で表される。Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６で表される。適切な菌株のコンピテントＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞２００μＬを形質転換するために、この線状のＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００発現カセットを使用した。形質転換細胞は、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。形質転換混合物を、１．６％スキムミルクおよび５ｐｐｍクロラムフェニコール（ＣＭＰ）を含有するＬＡプレートに播き、３７℃で終夜インキュベートした。１つのコロニーを採取し、ルリア培地＋５ｐｐｍのＣＭＰ中、３７℃で増殖させた。菌株試料は、貯蔵のため２０％グリセロールと共に－８０℃で冷凍した。

【0182】

Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親サブチリシンを発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のゲノムＤＮＡを単離し、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００成熟プロテアーゼ領域の変異体を生成するためのテンプレートとして使用した。適切なプライマー対、ＤＮＡテンプレートおよびＱ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応により、特定のアミノ酸置換を含む変異体のライブラリーを作成した。構築されたこれらのフラグメントを使用し、コンピテントなＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を形質転換し、上記のように形質転換体を取り扱った。

【0183】

ＢＰＮ’野生型およびＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親の両方に対して記載されたアミノ酸置換の位置と共に、生成したＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体を表４に示す。表４に示された各サブチリシン変異体の配列は、ＤＮＡ配列分析により確認された。

【0184】

実施例６
各種Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００サブチリシン変異体の生産性
下記表４に示すＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親サブチリシン（配列番号６）およびその追加の変異体は、実施例５に記載のようにして生成した。

【0185】

培養物上清中のＢ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）Ｐ２９６００親サブチリシン（配列番号６）およびその変異体の濃度は、Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ３カラムならびに０．１％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）およびアセトニトリル中の０．０７％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）の直線勾配を用い、２２０ｎｍでの検出によりＵＨＰＬＣで決定した。カラムに送入するために、培養物上清を１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ_２、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０で希釈した。精製親酵素（Ｐ２９６００野生型）（配列番号６）の標準曲線に基づき、試料のタンパク質濃度を計算した。

【0186】

Ｎ２４２Ｄ変異を含む各変異体のタンパク質濃度をＰＩ値で表して表４に示す。性能指数（ＰＩ）値は、Ｎ２４２Ｄ変異を含む変異体のタンパク質濃度を、Ｎ２４２Ｄ変異を含まない変異体のタンパク質濃度で除すことにより計算した。

【0187】

【表6】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【配列表】

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