特許 7153140 ３’保護ヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-04

(45)【発行日】2022-10-13

(54)【発明の名称】３’保護ヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C07H 23/00 20060101AFI20221005BHJP

   C07H 19/10 20060101ALI20221005BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20221005BHJP

   C07H 19/20 20060101ALI20221005BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20221005BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20221005BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20221005BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20221005BHJP

【ＦＩ】

C07H23/00

C07H19/10

C07H21/04 Z

C07H19/20

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6806 Z

C12M1/00 A

C12M1/34 Z

C12N15/11 Z

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2021535596

(86)(22)【出願日】2019-12-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-25

(86)【国際出願番号】 US2019066670

(87)【国際公開番号】W WO2020131759

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2021-07-28

(31)【優先権主張番号】62/781,638

(32)【優先日】2018-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】ベルクマン，フランク

(72)【発明者】

【氏名】ハインドル，ディーター

(72)【発明者】

【氏名】クリサリ，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】タイング，メング

(72)【発明者】

【氏名】カクショール，オミド

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１９１７９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１４８４０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１３／１５４９９９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１２／１６２４２９（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｈ ２３／００

Ｃ０７Ｈ １９／１０

Ｃ０７Ｈ ２１／０４

Ｃ０７Ｈ １９／２０

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

Ｃ１２Ｑ １／６８０６

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｎ １５／１１

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＩＩＡ）：

【化1】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、互いに１、３に位置する２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または構造：

【化2】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項2】

Ｒ^５が、

【化3】

である、請求項１に記載のヌクレオチド。

【請求項3】

Ｒ^１が、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である、請求項１から２のいずれか一項に記載のヌクレオチド。

【請求項4】

Ｒ^１が、結合である、請求項１から２のいずれか一項に記載のヌクレオチド。

【請求項5】

Ｒ^１が、－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５が、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である、請求項１から２のいずれか一項に記載のヌクレオチド。

【請求項6】

式（Ｉ）：

【化4】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「保護基」は、構造を有し：

【化5】

（式中：
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。）〕、
のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項7】

「保護基」が、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である、請求項６に記載のヌクレオチド。

【請求項8】

Ｚ^１およびＺ^２が、独立して、Ｈ、メチルおよびエチルからなる群から選択される、請求項６に記載のヌクレオチド。

【請求項9】

「保護基」が、－Ｂ（ＯＨ）_２である、請求項６に記載のヌクレオチド。

【請求項10】

式（ＶＡ）：

【化6】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数である。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項11】

Ｚ^１またはＺ^２のうちの少なくとも一方がＨである、請求項１０に記載のヌクレオチド。

【請求項12】

Ｚ^１およびＺ^２の両方がＨである、請求項１０に記載のヌクレオチド。

【請求項13】

Ｒ^１が、結合である、請求項１０から１１のいずれか一項に記載のヌクレオチド。

【請求項14】

Ｒ^１が－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１およびＺ^２の両方がＨである、請求項１０に記載のヌクレオチド。

【請求項15】

ナノポアを使用して核酸サンプルを配列決定する方法であって：
（ａ）ナノポアに結合した単一のポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、重合反応は、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの１つを組み込み、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの個々の３’保護ヌクレオチドは、構造：

【化7】

（式中：
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。）を有する部分を含むブロッキング基を含む、重合反応を実行することと；
（ｂ）ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への３’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと；
（ｃ）３’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、または、その後のいずれかで、３’保護ヌクレオチドを脱保護して、３’脱保護ヌクレオチドを提供することと、
を含む、方法。

【請求項16】

核酸分子を配列決定するための方法であって：
（ａ）複数の個別にアドレス指定可能なナノポアを含むチップを取得することであって、複数の個別にアドレス指定可能なナノポアのうちの各個別にアドレス指定可能なナノポアは、電極に隣接して配置された膜内のナノポアを含み、ナノポアは酵素に連結されており、各個別にアドレス指定可能なナノポアは、３’保護ヌクレオチドから放出される標識を検出するように適合されており、３’保護ヌクレオチドは、式（ＩＩＩＡ）：

【化8】

〔式中、
Ｘは、標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化9】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であ；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジド基ではない。〕、
によって具体化される、取得することと；
（ｂ）ナノポアに隣接または近接して核酸分子を方向付けることと；
（ｃ）酵素を使用して、核酸分子の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するために、核酸分子に沿って３’保護ヌクレオチドを重合することと；
（ｄ）ポリヌクレオチド鎖に３’保護ヌクレオチドを組み込んだ後、３’保護ヌクレオチドを脱保護することと；
（ｅ）電極を使用して３’保護ヌクレオチドから放出された標識を検出することであって、放出された標識はナノポアを通ってまたはナノポアに近接して流れる、検出することと、
を含み、
ステップ（ｄ）および（ｅ）は、任意の順序で実行することができる、方法。

【請求項17】

ナノポアを使用して核酸サンプルを配列決定する方法であって：（ａ）ナノポアに結合した単一のポリメラーゼを用いて重合反応を実行することであって、重合反応は、請求項１から１４のいずれか一項に記載の保護ヌクレオチドの少なくとも一つを、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に組み込む、実行することと、ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への、少なくとも一つの保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと、保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、またはその後に、保護ヌクレオチドを脱保護して、３’脱保護ヌクレオチドを提供することと、を含む、方法。

【請求項18】

（ａ）
（ｉ）少なくとも約２５０ウェル／ｍｍ２の密度で複数のウェルを有する半導体基板；および
（ｉｉ）複数のウェルのそれぞれに配置された電極、
を含むバイオチップと；
（ｂ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つと、
を含む、キット。

【請求項19】

（ａ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のヌクレオチドの少なくとも一つを含むリザーバと；
（ｂ）
（ｉｉｉ）少なくとも約２５０ウェル／ｍｍ^２の密度で複数のウェルを有する半導体基板；および
（ｉｖ）複数のウェルのそれぞれに配置された電極、
を含むバイオチップと；
（ｃ）リザーバのバイオチップに面する表面上に配置された対電極と、
を含む、アッセンブリ。

【請求項20】

【化10-1】

【化10-2】

〔式中：
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；および
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。〕、
からなる群から選択される、ヌクレオチドまたはその塩。

【請求項21】

【化11】

〔式中：
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；および
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。〕、
からなる群から選択される、ヌクレオチドまたはその塩。

【請求項22】

【化12】

〔式中：
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；および
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。〕、
からなる群から選択される、ヌクレオチドまたはその塩。

【請求項23】

請求項２０から２２のいずれか一項に記載の少なくとも２つの異なるヌクレオチドを含み、該少なくとも２つの異なるヌクレオチドはそれぞれ、異なる標識化核酸塩基を含む、キット。

【請求項24】

式（ＶＩＩＩＡ）または（ＶＩＩＩＤ）：

【化13】

または
〔式中、
Ｒ^１５は核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数であり；
「保護基」は、次の構造を有し：

【化14】

「リンカー」は、１個と５０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基または芳香族基であり；および
「標識－リンカー－Ｒ ^１５ 」は標識化核酸塩基であり、
「スペーサー」は、１個と１６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基または芳香族基であり；
「ブロッキング部分」は、１個と２０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基または芳香族基であり、ただし、「ブロッキング部分」は、アジド基、イソニトリル基、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を有する５－～８－員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の１，４－エポキシ－１，４－ジヒドロナフタレン由来の部分、または構造：

【化15】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。）を含み；
ただし、「ブロッキング部分」が－Ｎ_３である場合、「スペーサー」は－ＣＨ_２－ではない。〕、
のいずれか一つを有するヌクレオチドまたはその塩。

【請求項25】

合成による配列決定を使用して標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって：（ａ）請求項１から１４、２０から２２、および２４のいずれか一項に記載の保護標識化ヌクレオチドを提供することと；（ｂ）保護標識化ヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの補体に組み込むことと；（ｃ）ステップ（ｂ）の保護標識化ヌクレオチドの標識を検出し、それによって組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定する、標識を検出することと；（ｄ）組み込まれた保護標識化ヌクレオチドを脱保護し、ステップ（ｂ）の保護標識化ヌクレオチドの標識を除去することと；（ｅ）任意選択的に、ステップ（ｂ）～（ｄ）を１回または複数回繰り返すこととを含み、それにより、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。

【請求項26】

式（ＩＩＩＡ）：

【化16】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２が、Ｈであり：
Ｒ^３は、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化17】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）；
を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数である。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項27】

式（ＩＩＩＡ）：

【化18】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化19】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基または ヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数である。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項28】

式（ＩＩＩＡ）：

【化20】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化21】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数である。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項29】

式（ＩＩＩＡ）：

【化22】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、

【化23】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。））であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基または ヘテロ芳香族基であり；
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、独立して、ゼロまたは１～３の範囲の整数である。〕のヌクレオチドまたはその塩。

【請求項30】

合成による配列決定を使用して標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって：（ａ）請求項１から１４、２０から２２、２４、および２６から２９のいずれか一項に記載の保護標識化ヌクレオチドを提供することと；（ｂ）保護標識化ヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの補体に組み込むことと；（ｃ）ステップ（ｂ）の保護標識化ヌクレオチドの標識を検出し、それによって、組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定することと；（ｄ）組み込まれた保護標識化ヌクレオチドを脱保護し、ステップ（ｂ）の保護標識化ヌクレオチドの標識を除去することと；（ｅ）任意選択的に、ステップ（ｂ）～（ｄ）を１回または複数回繰り返すこととを含み、それにより、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月４日に出願された米国特許仮出願第６２／７８１，６３８号の利益を主張するものであり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
本開示は、概して、配列決定での使用に適した３’保護ヌクレオチドに関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＮＡの配列決定の重要性は４０年前の開始から劇的に高まっている。これは、生物学と医学のほとんどの分野で重要なテクノロジーとして、またパーソナライズされた精密医療の新しいパラダイムの基盤として認識されている。個人のゲノムとエピゲノムに関する情報は、疾患の傾向、臨床的予後、および治療への反応を明らかにするのに役立つが、医学におけるゲノム配列決定の日常的な適用には、タイムリーで費用効果の高い方法で提供される包括的なデータが必要である。

【0003】

ナノポアベースの核酸配列決定は、広く研究されてきたアプローチである。過去２０年間で、ポリマーの特性評価や低コストで迅速な単一分子の方法でヌクレオチドを区別するためにナノポアを利用することに大きな関心が寄せられてきた。例えば、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ等は、一本鎖ポリヌクレオチドを、脂質二重層に埋め込まれたアルファ溶血素ナノポアを介して電気的に移動するものとして特徴づけた（例えば、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ， Ｊ． （１９９６）， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｈａｎｎｅｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３， １３７７０－３参照）。ポリヌクレオチド転座の間、ナノポア開口の部分的閉塞は、イオン電流の減少として測定できることが実証された。同様に、Ｇｕｎｄｌａｃｈ等は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（「ＭｓｐＡ」）に由来する低ノイズのナノポアを二重中断配列決定と呼ばれるプロセスと組み合わせて使用したＤＮＡの配列決定方法を示した（例えば、Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｉ等の（２０１０）， Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ＭｓｐＡ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １０７（３７）， １６０６０－１６０６５参照）。 ここでは、二本鎖二本鎖を使用して、ＭｓｐＡ狭窄部（ＭｓｐＡ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に核酸の一本鎖部分を一時的に保持させた。Ａｋｅｓｏｎ等（例えば、ＰＣＴ公報、国際公開第２０１５０３４４９４５号パンフレット参照）は、隣接して配置された分子モーターを利用して、ナノポアの開口部を通過する、またはナノポアの開口部に隣接するポリヌクレオチドの移動速度を制御する、ナノポア内のポリヌクレオチドを特徴付けるための方法を開示している。

【0004】

一般に、３つのナノポア配列決定アプローチが追求されてきた：ＤＮＡの塩基がナノポアを順次通過するときに識別されるストランド配列決定、ヌクレオチドが、ＤＮＡ分子から１つずつ酵素的に切断され、ナノポアによって捕捉されて通過するときに監視される、エキソヌクレアーゼベースのナノポア配列決定、および識別可能なポリマー標識がヌクレオチドに付着し、酵素触媒ＤＮＡ合成中にナノポアに登録される合成によるナノポア配列決定（ＳＢＳ）アプローチ。これらすべての方法に共通するのは、各塩基が順番に決定されるように、反応速度を正確に制御する必要があることである。ストランド配列決定には、ナノポアを通るＤＮＡの通過を遅くし、チャネル内の複数の塩基をデコードする方法が必要であり；この目的のために、分子モーターを利用したラチェットアプローチが開発された。エキソヌクレアーゼベースの配列決定では、有効なイオン電流信号を取得するのに十分遅い速度で、その捕捉と細孔を通過することを保証するために、細孔に十分近い各ヌクレオチドの放出が必要である。さらに、これらの方法は両方とも、４つの天然塩基、２つの比較的類似したプリンと２つの類似したピリミジンの違いに依存している。ナノポアＳＢＳアプローチは、配列決定のためのユニークで容易に区別できるイオン電流遮断署名を生成するように特別に設計されたヌクレオチドに取り付けられた合成ポリマー標識を利用する。

【発明の概要】

【0005】

本開示の一態様は、式（ＩＩＩＡ）：

【化1】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または構造：

【化2】

Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立してＨ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない（例えば、Ｒ^５はＮ^３ではない。）である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。

【0006】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化3】

【0007】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１またはＺ^２の少なくとも一方はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、結合であり、Ｚ^１またはＺ^２の少なくとも一方は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１またはＺ^２の少なくとも一方はＨである。いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２はＨである。いくつかの実施形態においてＲ^５は、－Ｂ（ＯＨ）_２である。

【0008】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、結合である。いくつかの実施形態にいて、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^４は結合である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^４は、６－員のアリール基である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^４は、６－員のアリール基であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、Ｒ^４は６－員のアリール基である。いくつかの実施形態において、６－員のアリール基は、少なくとも一つの置換基を含み、該少なくとも一つの置換基は、メチルおよびエチルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり、Ｒ^４は６－員のアリール基であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－である。

【0009】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化4】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^５は、

【化5】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）である。

【0010】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮである。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^５は－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－である。

【0011】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２は－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ（式中、少なくとも一つのＲ^ａは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基である。）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり、Ｒ^５は－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、置換または非置換の１，４－エポキシ－１，４－ジヒドロナフタレンから誘導される。

【0012】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチルおよびエチルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。

【0013】

本開示の別の態様は、式（Ｉ）：

【化6】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「保護基」は、構造：

【化7】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有し；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。

【0014】

いくつかの実施形態において、「保護基」は、－Ｂ（ＯＺ１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基から選択される。）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は、－Ｂ（ＯＭｅ）（ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＥｔ）（ＯＥｔ）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＨ）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_２である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_３ ^－である。

【0015】

本開示の別の態様は、式（ＩＶ）：

【化8】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化9】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１が結合であり、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５はアジドではない（例えば、Ｒ^５はＮ^３ではない。）である。〕、
のヌクレオチドまたはその塩である。

【0016】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基から選択される。）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＭｅ）（ＯＭｅ）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＥｔ）（ＯＥｔ）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＨ）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＨ）_２である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_３ ^－である。

【0017】

本開示の別の態様は、式（ＶＡ）：

【化10】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。〕。
を有する、ヌクレオチドまたはその塩である。

【0018】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、メチルまたはエチルから選択され、Ｒ^１は結合である。いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、メチルまたはエチルから選択され、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３はＨである。

【0019】

いくつかの実施形態において、Ｚ^１はＨであり、Ｚ^２は、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ^１はＨであり、Ｚ^２は、メチルまたはエチルから選択され、Ｒ^１は結合である。いくつかの実施形態において、Ｚ^１はＨであり、Ｚ^２は、独立して、メチルまたはエチルから選択され、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３はＨである。

【0020】

本開示はまた、核酸配列を配列決定する方法を提供し、該方法は、ここに記載のヌクレオチドのいずれか（例えば、式（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかのヌクレオチド）を利用する。いくつかの実施形態において、標的核酸またはそのフラグメントの一部のヌクレオチド配列は、様々な方法およびデバイスを使用して決定され得る。配列決定方法の非限定的な例には、電気泳動配列決定法、合成による配列決定法、ライゲーションによる配列決定法、ハイブリダイゼーションによる配列決定法、単一分子配列決定法、およびリアルタイム配列決定法が含まれる。

【0021】

本開示の別の態様は、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であり、相補的ヌクレオチドの連続的な取り込みを監視することを含み、相補的ヌクレオチドはそれぞれ、ここに記載されるように、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれかの構造を有し；組み込まれた各相補的ヌクレオチドの同一性は、各相補的ヌクレオチドから放出された、またはそれらに付着した標識（例えば、検出可能な部分）の検出によって決定される。いくつかの実施形態において、標識は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれかの相補的ヌクレオチドの３’保護基を脱保護するために使用されるのと同じ条件下で、各相補的ヌクレオチドから放出される。いくつかの実施形態において、タグは、その検出後に切断によって放出される。いくつかの実施形態において、方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれかの少なくとも４つの異なる相補的ヌクレオチドを利用し、該少なくとも４つの異なる相補的ヌクレオチドはそれぞれ、異なる核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、標識は、相補的ヌクレオチドの核酸塩基に結合される。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの異なる相補的ヌクレオチドのそれぞれは、異なる標識を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの異なる相補的ヌクレオチドのそれぞれは、異なるタグを有するが、少なくとも４つの異なる相補的ヌクレオチドのそれぞれは、同じ保護基、ブロッキング基、またはＲ^５部分（ここにおける式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）で具体化されるようなそれらの基）を含む。

【0022】

本開示の別の態様は、核酸配列を配列決定する方法であって、（ａ）ナノポアに結合した単一のポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはその変形体またはナノポアに結合されたその変異体）を使用して重合反応を実行することであって、重合反応は、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの１つを組み込み、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの個々の３’保護ヌクレオチドは、構造：

【化11】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。〕、
を有する部分を含むブロック基を含む、重合反応を実行することと；
（ｂ）ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への３’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと；（ｃ）３’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、またはその後に、３’保護ヌクレオチドを脱保護して３’脱保護ヌクレオチドを提供することと、を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドはそれぞれが異なる検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する異なる検出可能な部分を検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する検出された標識をヌクレオチドのタイプと相関させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、重合中に検出された標識の評価に基づいて、核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、脱保護は、３’保護ヌクレオチドを酸化剤（例えば、過酸化水素）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、３’保護ヌクレオチドの脱保護の副生成物を検出することをさらに含む。

【0023】

本開示の別の態様は、ナノポアを使用して核酸配列を配列決定する方法であり、該方法は：（ａ）ナノポアに結合した単一のポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはその変形体またはナノポアに結合されたその変異体）を使用して重合反応を実行することであって、重合反応は、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの１つを組み込み、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの個々の３’保護ヌクレオチドは、ここに記載されている式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれかのヌクレオチドから選択される、重合反応を実行することと；（ｂ）ナノポアを使用して、成長するポリヌクレオチド鎖への３’保護ヌクレオチドまたはその副生成物の組み込みを検出することと；（ｃ）３’保護ヌクレオチドまたはそれに由来する副生成物の組み込みを検出するステップと同時に、またはその後に、３’脱保護ヌクレオチドを提供するために、３’保護ヌクレオチドを脱保護することと、を含む。

【0024】

本開示の別の態様は、ナノポアを使用して核酸配列を配列決定する方法であり、該方法は：（ａ）ナノポアに結合した単一の酵素（例えば、ポリメラーゼ）を使用して重合反応を実行することであって、重合反応は、核酸サンプルに由来する一本鎖核酸分子に相補的な成長中のポリヌクレオチド鎖に少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの１つを組み込み、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドの個々の３’保護ヌクレオチドは、構造：

【化12】

〔式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。〕、
を有する部分を含む保護基を含む、重合反応を実行することと；
（ｂ）ナノポアを使用して、成長中のポリヌクレオチド鎖への３’保護ヌクレオチドの取り込みを検出することと；（ｃ）３’保護基を脱保護し、３’保護ヌクレオチドから標識を切断して３’－ＯＨ基を提供する（すなわち、脱保護ヌクレオチドを提供する）ために、酸化剤を導入することと、を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドはそれぞれが異なる標識を含む。いくつかの実施形態において、検出するステップは、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する異なる標識を検出することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも４つの異なる３’保護ヌクレオチドのそれぞれに関連する検出された標識をヌクレオチドのタイプと相関させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、重合中に検出された標識の評価に基づいて、核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態において、脱保護は、３’保護ヌクレオチドを酸化剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、酸化剤は、過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ペルオキシ硝酸塩、または他の適切な酸化剤からなる群から選択される。

【0025】

本開示の別の態様は、ナノポアを使用して核酸配列を配列決定する方法であり、該方法は：（ａ）複数の個別にアドレス指定可能なナノポアを含むチップを取得することであって、複数の個別にアドレス指定可能なナノポアのうちの各個別にアドレス指定可能なナノポアは、電極に隣接して配置された膜内のナノポアを含み、ナノポアは酵素に連結されており、各個別にアドレス指定可能なナノポアは、３’保護ヌクレオチドから放出される標識を検出するように適合されており、３’保護ヌクレオチド（または、任意のその塩）は、式（ＩＩＩＡ）：

【化13】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化14】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基である。）であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない（例えば、Ｒ^５はＮ_３ではない。）である。〕、
によって具体化される、取得することと；
（ｂ）ナノポアに隣接または近接して核酸分子を方向付けることと；（ｃ）核酸分子の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するために、酵素を使用して、核酸分子に沿って３’保護ヌクレオチドを重合することと；（ｄ）３’保護ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に組み込んだ後、３’保護ヌクレオチドの３’保護基を脱保護することと；（ｅ）電極を使用して、３’保護ヌクレオチドから放出された標識を検出することであって、放出された標識は、ナノポアを通過するか、ナノポアに近接して流れる、検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、標識は、３’保護ヌクレオチドの３’保護基の脱保護の前に放出される。いくつかの実施形態において、標識は、３’保護ヌクレオチドの脱保護と同時に放出される。いくつかの実施形態において、標識は、保護基の放出の前に脱保護される。いくつかの実施形態において、３’保護ヌクレオチドの脱保護のステップは、３’保護ヌクレオチドを酸化剤、例えば、過酸化水素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、同じ反応条件および／または試薬が、３’保護基の脱保護および標識の放出に使用される。

【0026】

本開示の別の態様は、キットであり：少なくとも約２５０ウェル／ｍｍ^２の密度の複数のウェルを有する半導体基板を含むバイオチップと；複数のウェルのそれぞれに配置された電極と、ここに開示の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれかの少なくとも一つのヌクレオチドと、を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも１つは、ボロン酸またはその誘導体または類似体に由来する部分を含む。いくつかの実施形態において、ウェルの密度は、少なくとも約５００ウェル／ｍｍ^２である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも１つは、検出可能な部分を含み、検出可能な部分は、切断可能なリンカーを介して核酸塩基に結合される。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、酸化剤を使用して切断され得る。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴホスフェート、ＰＥＧ基、および他の部分を含む。

【0027】

本開示の別の態様は、キットであり：（ａ）ここに開示の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）－（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれか１つのヌクレオチドの少なくとも一つと；（ｂ）酸化剤とを含む。いくつかの実施形態において、キットは塩基をさらに含む。いくつかの実施形態において式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）－（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれか１つのヌクレオチドの少なくとも一つは、第１の容器に提供され；酸化剤は、第２の容器に提供される。

【0028】

本開示の別の態様は、アッセンブリであり：リザーバであって、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）～（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）～（ＶＤ）、または（ＶＩＩＩＡ）～（ＶＩＩＩＦ）のいずれか１つのヌクレオチドの少なくとも１つを含むリザーバと；少なくとも約２５０ウェル／ｍｍ^２の密度の複数のウェルを有する半導体基板を含むバイオチップと；複数のウェルのそれぞれに配置された電極と；リザーバのバイオチップに面する表面に配置された対電極と、を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドの少なくとも１つは、ボロン酸またはその誘導体または類似体に由来する部分を含む。いくつかの実施形態において、リザーバは、ヌクレオチドの脱保護に由来する副生成物さらに含む。いくつかの実施形態において、副生成物は、ホウ酸またはその誘導体または類似体である。

【0029】

本開示の別の態様は、組成物であり：ポリヌクレオチド、ホウ酸またはその誘導体または類似体の少なくとも一つ、キノンメチド、アセタール、アルデヒド、アクリルアルデヒド、および４－メチレン－２，５－シクロヘキサジエン－１－オンを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、式（ＶＩＡ）のヌクレオチド（またはその塩）、または微量の式（ＶＩＡ）のヌクレオチド（またはその塩）をさらに含む。

【0030】

本開示の別の態様は、ヌクレオチドまたはその塩であって、ヌクレオチドは、

【化15-1】

【化15-2】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；および
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である。〕、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｚ^１またはＺ^２の少なくとも一方はＨである。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドまたはその塩は、エチレングリコールまたはエチレングリコールに由来するポリマー、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素（フルオロフォアを含む）、化学発光化合物、ｍａｓｓ標識、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、脂肪族酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数からなる群から選択される標識を含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基またはその塩は、ＰＥＧベースの標識を含む。いくつかの実施形態において、標識化核酸塩基は、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、酸化剤（例えば、過酸化水素）で切断される。

【0031】

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ポリマー－標識化ヌクレオチド（１４０）のナノポアによる単一分子ＤＮＡの配列決定を示す。４つのヌクレオチドはそれぞれ異なる標識を有する。ナノポア配列決定中に、ヌクレオチドの５’の末端リン酸を介して付着したこれらの標識は、一度に１つずつナノポア（１３０）に放出され、そこで固有の電流遮断署名（１５０）が生成される。

【図2】ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１００の実施形態を示す。

【図3A】保護ヌクレオチドを、成長中のポリヌクレオチド、例えば、本開示のいくつかの実施形態に従って配列決定される核酸鎖に相補的な成長中のポリヌクレオチドに酵素的に組み込むステップを示すフローチャートを提供する。

【図3B】保護標識化ヌクレオチドを、成長中のポリヌクレオチド、例えば、本開示のいくつかの実施形態に従って配列決定される核酸鎖に相補的な成長中のポリヌクレオチドに酵素的に組み込むステップを示すフローチャートを提供する。

【図3C】核酸配列決定の方法を示す。

【図4】標識がナノポアを通過することによって生成される信号の例を示す。

【図5】保護ヌクレオチドを脱保護して、遊離の３’－ＯＨ基を有する脱保護ヌクレオチドを提供するためのスキームを示す。

【図6】塩基－標識化ヌクレオチド類似体を使用したＤＮＡ伸長反応を示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

【0034】

ここで使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

【0035】

ここおよび特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数、および必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、ここで使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

【0036】

ここで使用される場合、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープンな用語として解釈され、また、追加の特徴、制限、態様などを除外しないように解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、デバイスが少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。同様に、文言：「ステップａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、その方法が少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、ステップおよびプロセスは、ここにおいて特定の順序で概説され得るが、当業者は、順序付けのステップおよびプロセスが変化し得ることを認識するであろう。

【0037】

本明細書においてここおよび特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）などを指すことができる。

【0038】

この明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態において」または「実施形態において」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すとは限らない。さらにまた、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられることができる。

【0039】

「類縁体」または「誘導体」は、化学および生物学におけるその明白な通常の意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照」化合物）と構造的に類似しているが、例えば、ある原子を異なる元素の原子で置き換える場合、または特定の官能基の存在下で、またはある官能基を別の官能基で置き換える場合、または参照化合物の１つ以上のキラル中心の絶対立体化学において、組成が異なる化合物を指す。したがって、類縁体は、機能および外観が類似または同等であるが、構造または起源が参照化合物と類似していない化合物である。

【0040】

ここで使用される場合、「脂肪族」という用語は、飽和またはモノ－またはポリ不飽和であり得る、直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を意味する。不飽和脂肪族基は、１つまたは複数の二重結合および／または三重結合を含む。炭化水素鎖の分岐は、線状鎖ならびに非芳香族環状元素を含み得る。炭化水素鎖は、特に明記しない限り、任意の長さであり、任意の数の分岐を含み得る。主鎖および分岐の両方は、例えば、Ｂ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、ＳｅまたはＳｉなどのヘテロ原子をさらに含み得る。

【0041】

ここで使用される場合、「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、完全に飽和、モノまたはポリ不飽和であり得て、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ_１～Ｃ_１０は１～１０個の炭素を意味する）を持つジおよび多価ラジカルを含むことができる直鎖（すなわち、非分岐鎖）または分岐鎖、またはそれらの組み合わせを意味する。「アルキル」は環化されていない。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどのホモログ及び異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されるものではないが、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－ブタジエニル、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－および３－プロピニル、３－ブチニル、ならびにより高次のホモログ及び異性体が挙げられる。アルコキシは、酸素原子（－Ｏ－）を介して分子の残りの部分に結合したアルキルである。

【0042】

ここで使用される場合、「アルキレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、-ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２-によって例示されるが、限定されるものではない、アルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１～２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するそれらの基が本開示において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。

【0043】

ここで使用される場合、「アルキレン」という用語は、いくつかの実施形態において、１～３個の炭素原子を有する直鎖状、分岐状または環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、イソプロピレンまたはｃ－プロピレン基であり得る。

【0044】

ここで使用される場合、「芳香族」という用語は、特に明記しない限り、共役二重結合の平面環状炭化水素部分を意味し、これは、単一の環であるか、または複数の縮合または共有結合した環を含み得る。環状炭化水素部分の主鎖は、特に明記しない限り、任意の長さであり得、例えば、Ｎ、ＯおよびＳのような任意の数のヘテロ原子を含み得る。

【0045】

ここで使用される場合、「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語との組み合わせで、特に明記しない限り、少なくとも１個の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなる、安定した直鎖もしくは分岐鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、窒素及び硫黄原子は任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されてもよい。ヘテロ原子（複数の場合がある）Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、またはアルキル基が分子の残部に付加される位置に置かれてもよい。ヘテロアルキルは環化されていない。例として、限定されるものではないが、以下が挙げられる：-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_３、-ＣＨ_２-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＨ_３、-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｎ（ＣＨ_３）-ＣＨ_３、-ＣＨ_２-Ｓ-ＣＨ_２-ＣＨ_３、-ＣＨ_２-Ｏ-ＣＨ_３、-Ｓ（Ｏ）-ＣＨ_３、-ＣＨ_２-ＣＨ_２-Ｓ（Ｏ）_２-ＣＨ_３、-ＣＨ－ＣＨ-Ｏ-ＣＨ_３、-Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、-ＣＨ_２-ＣＨ－Ｎ-ＯＣＨ_３、-ＣＨ－ＣＨ-Ｎ（ＣＨ_３）-ＣＨ_３、-Ｏ-ＣＨ_３、-Ｏ-ＣＨ_２-ＣＨ_３、および-ＣＮ。例えば、-ＣＨ_２-ＮＨ-ＯＣＨ_３などの、最大２個のヘテロ原子が連続している場合がある。

【0046】

ここで使用される婆、「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」、という用語は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを意味する。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは芳香族ではない。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは、例えば、ここに記載の置換基のいずれかでさらに置換することができる。

【0047】

上記の用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「芳香族」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」など）は、示される基の置換形態および非置換形態の両方を含む。その点に関して、基または部分が「置換された」または「任意に置換された」（または「任意に有する」または「任意に含む」）と記載されるときはいつでも、その基は非置換であるか、または示された置換基の１つまたは複数で置換され得る。同様に、基が置換されている場合に「置換または非置換」であると記載される場合、置換基は、示された置換基のうちの１つまたは複数から選択され得る。置換基が示されていない場合、示された「任意に置換された」または「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、シアネート、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、保護されたＣ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、エーテル、アミノ（例えば、一置換アミノ基または二置換アミノ基）、およびそれらの保護誘導体から個別にかつ独立して選択される１つ以上の基で置換され得ることを意味する。上記の基のいずれも、Ｏ、Ｎ、またはＳを含む１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。例えば、部分がアルキル基で置換されている場合、そのアルキル基は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択されるヘテロ原子を含み得る（例えば、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３））。

【0048】

ここで使用される場合、「結合」または「結合する」という用語は、ある分子または原子の別の分子または原子への結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（例えば、共有結合）、または連結を指す。

【0049】

ここで使用される場合、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル」という用語は、これらに限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、４－クロロブチル、３－ブロモプロピルなどを含む。

【0050】

ここで使用される場合、「ヘテロ原子」という用語は、ホウ素（Ｂ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。いくつかの実施形態において、「複素環」は、１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る。

【0051】

ここで使用される場合、「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」は、「置換基」について上記のすべての置換基から選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_８アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換の２～８員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ_５～Ｃ_７シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の５～７員ヘテロシクロアルキルである。

【0052】

ここで使用される場合、「ナノポア」という用語は、膜に形成された、またはそうでなければそこに設けられポア、チャネル、または通路を指す。ナノポアは、膜内の分子（タンパク質など）によって定義され得る。膜は、脂質二重層のような有機膜、またはポリマー材料から形成されたような合成膜であり得る。ここで使用される場合、「ポリマー」という用語は、ホモポリマーおよびコポリマーを含むものとして定義される。「ホモポリマー」という用語は、単一種のモノマーに由来するポリマーとして定義される。「コポリマー」という用語は、２つのモノマー種の共重合によって得られるコポリマー、３つのモノマー種から得られるもの（「ターポリマー」）、４つのモノマー種から得られるもの「クォーターポリマー」）などを含む、複数のモノマー種に由来するポリマーとして定義される。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などの検知回路に隣接してまたは近接して配置することができる。ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）～約１０００ｎｍのオーダーの特徴的な幅または直径を有し得る。いくつかのナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素はタンパク質ナノポアの一例である。いくつかの実施形態において、ナノポアは固体型のナノポアである（例えば、固体型のナノポアは、典型的に、合成膜（通常、ＳｉＮｘまたはＳｉＯ２）に形成されたナノメートルサイズの穴である）。

【0053】

ここで使用される場合、「ナノポア配列決定複合体（ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）」という用語は、酵素、例えば、ポリメラーゼに連結または結合されたナノポアを指し、これは、次に、ポリマー、例えば、ポリヌクレオチドテンプレートに関連する。ナノポア配列決定複合体は、脂質二重層などの膜に配置され、ヌクレオチドやアミノ酸などのポリマー成分を識別するように機能する。

【0054】

ここで使用される場合、「ナノポア配列決定」または「ナノポアベースの配列決定」という用語は、ナノポアを使用してポリヌクレオチドの配列を決定する方法を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、テンプレート依存的に決定される。ここに開示される方法は、ナノポア配列決定方法、システム、またはデバイスに限定されない。

【0055】

ここで使用される場合、「核酸」という用語は、１つまたは複数の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数のサブユニット（天然に存在する、合成の、または修飾核酸塩基）を含み得る。これらの塩基の誘導体は、ＰＣＲシステム、試薬、および消耗品に例示されており（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ １９９６－１９９７， Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， Ｎ．Ｊ．， ＵＳＡ）、参照によりここに完全に組み込まれる。いくつかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、あるいはそれらの誘導体である。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドまたは変形体を含むがこれらに限定されない、任意の核酸分子を含むことができる。

【0056】

ここで使用される場合、「核酸塩基」という用語は、別の核酸塩基と非共有結合的に対を形成することができる複素環部分を指す。「天然に存在する核酸塩基」または「非修飾核酸塩基」（交換可能に使用される）は、その天然に存在する形態に対して修飾されていない核酸塩基を指す。同様に、「修飾核酸塩基」は、天然の核酸塩基からの任意の置換および／または変化を意味する。核酸塩基（または塩基）の修飾または置換は、天然に存在するまたは合成の非修飾の核酸塩基とは構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能である。天然の核酸塩基と修飾核酸塩基の両方が水素結合に関与することができる。そのような核酸塩基の修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性、またはアンチセンス化合物に他のいくつかの有益な生物学的特性を与える可能性がある。修飾核酸塩基には、合成および例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）などの天然の核酸塩基が含まれる。５－メチルシトシン置換を含む特定の核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。例えば、５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６－２７８）。追加の修飾核酸塩基には、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、７－メチルグアニン、２－アミノアデニン、２－アミノプリン、ｉｓｏ－Ｃ、ｉｓｏ－Ｇ、ｔｈｉｏＴ、ｔｈｉｏＧ、５，６－ジヒドロウラシル、６－メチルアデニン、２－プロピルグアニンおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン（５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシンなど）、５－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アザウラシル、シトシンおよびチミン、ウラシル－５－イル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンと７－デアザアデニンと３－デアザグアニンと３－デアザアデニン、８－アザ－７－デアザグアニンと８－アザ－７－デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。追加の核酸塩基は、Ｇｒｅｃｏｅｔ等のＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ， Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｖｏｌ．２， ｎｏ．２， ２００７；Ｄｉｅｎ等のＰｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｓｅｍｉ－Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｗｉｔｈ ａｎ Ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｐｈａｂｅｔ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１８， １４０， １６１１５－１６１２３； Ｚｈａｎｇ等のＥｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｘ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＤＮＡ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１５， １３７， ６７３４－６７３７； Ｂｉｏｎｄｉ ｅｔ． ａｌ． Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｎｅｗ Ａｐｔａｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２０１８， ６， ５３； Ｌｉｕ等のＨｅｌｉｘ－Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡ， ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｆｏｕｒ－Ｂａｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｆｏｒｍ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９ Ｖｏｌ． １２７， Ｎｏ． ５， ２００５， １３９６－１４０２；Ｔｏｒ等のＤｅｓｉｇｎｉｎｇ ｎｅｗ ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ： ｔｈｅ ｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｃｏｒｅ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６３ （２００７） ３６０８－３６１４；Ｌａｏｓ等のＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｔｏ Ａｃｃｅｐｔ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎｓｔａｎｄａｒｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄ Ｐａｔｔｅｒｎｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３， ５２， ５２８８－５２９４；Ｋｒｕｅｇｅｒ等のＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｉｚｅ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ：Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ． ２００７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ； ４０（２）： １４１－１５０； Ｓｒｉｖａｔｓａｎ等のＡ ｈｉｇｈｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｉｅｎｏ［３，４－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｓｅｎｓｅｓ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ， Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２００８， ６， １３３４－１３３８； Ｋｉｍ等のＳｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ５－Ｃｙａｎｏ－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ ｗｉｔｈ ａ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｏｎｏｒ－Ａｃｃｅｐｔｏｒ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ－Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｐａｔｔｅｒｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１２， ７７， ３６６４－３６６９； ａｎｄ Ｎｏｅ等のＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉｓｏｍｏｒｐｈｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１３， ７８， ８１２３－８１２８，に開示されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0057】

ここで使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたは２’－デオキシリボースなどの糖に共有結合している核酸塩基を指す。

【0058】

ここで使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、アデノシン５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン５’－二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）アデノシン５’－四リン酸またはその２’－デオキシ誘導体などのリン酸またはポリリン酸に共有結合したヌクレオシドを指す。ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを指し、ここで、オリゴマーは、場合により、非ヌクレオチドモノマー単位、および／またはオリゴマーの内部および／または外部位置に結合した他の化学基を含む。オリゴマーは天然または合成であり得、天然に存在するオリゴヌクレオチド、または天然に存在しない（または修飾された）塩基、糖部分、ホスホジエステル－アナログ結合、および／または代替のモノマー単位キラリティーおよび異性体構造を有するヌクレオシドを含むオリゴマーを含み得る（例えば、５’－～２’－結合、Ｌ－ヌクレオシド、α－アノマーヌクレオシド）。本開示の組成物および方法においてナノポア検出可能な標識として有用な例示的なオリゴヌクレオチドには、表４に示されるオリゴヌクレオチド標識構造が含まれる。

【0059】

ここで使用される場合、「ポリメラーゼ」という用語は、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例には、核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素またはリガーゼが含まれるが、これらに限定されない。ポリメラーゼは重合酵素であり得る。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチドの重合を触媒する。ポリマーには、ＲＮＡテンプレートから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素である逆転写酵素が含まれる場合がある。

【0060】

ここで使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーまたはオリゴマーである。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドおよび／またはＲＮＡポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの１つまたは複数のセクションを含み得る。

【0061】

ここで使用される場合、「反応性基」または「反応性官能基」という用語は、異なる部分の官能基と化学的に会合、相互作用、ハイブリダイズ、水素結合、またはカップリングすることができる官能基を指す。いくつかの実施形態では、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間の「反応」は、２つの反応性基または２つの反応性官能基の間で共有結合が形成されることを意味し得；または、２つの反応性基または２つの反応性官能基が互いに会合し、互いに相互作用し、互いにハイブリダイズし、互いに水素結合するなどを意味し得る。したがって、いくつかの実施形態では、「反応」は、ハプテンと抗ハプテン抗体との結合、または超分子宿主分子と結合するゲスト分子などの結合事象を含む。

【0062】

ここで使用される場合、「配列決定」という用語は、核酸中の塩基の順序および位置の決定を指す。

【0063】

ここで使用される場合、「標識」という用語は、原子または分子、あるいは原子または分子の集合体であり得る検出可能な部分を指す。標識は、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導性、容量性）の署名を提供することができ、これは、ナノポアを使用して検出することができる。

【0064】

ここで提供される見出しは、便宜上のものであり、開示される実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

【0065】

ヌクレオチド
本開示は、糖、例えば、３’の除去可能な保護基を有するリボースまたはデオキシリボースなどを含むヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド（またはその任意の塩）に関する。いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドは、標識化核酸塩基、例えば、検出可能な部分を含む塩基を含む。いくつかの実施形態において、３’除去可能保護基は、以下のような少なくとも１つの基準、例えば、（ｉ）３’除去可能な保護基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドを成長中のオリゴヌクレオチドに正確かつ効率的に組み込む酵素（例えば、ポリメラーゼ）の能力；（ｉｉ）迅速かつ定量的な脱保護のための穏やかな条件の利用可能性、および（ｉｉｉ）脱保護ステップに続いてオリゴマー合成を再開する酵素の能力である。いくつかの実施形態において、３’保護基は、非還元条件下で（例えば、過酸化水素または別の酸化剤を使用して）除去される。

【0066】

いくつかの実施形態において、本開示によるヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（Ｉ）によって具体化される構造を有する：

【化16】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「保護基」は、構造：

【化17】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。）を有する。〕。

【0067】

いくつかの実施形態において、Ｙのオリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して結合される。

【0068】

いくつかの実施形態において、「保護基」は、－Ｂ（ＯＺ１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｚ^１またはＺ^２は、Ｈ、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、両方のＺ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、^１およびＺ^２は、独立して、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_２である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_３ ^－である。

【0069】

いくつかの実施形態において、本開示によるヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＩ）によって具体化される構造を有する：

【化18】

〔式中、Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「スペーサー」は、１個と１６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり；
「ブロッキング部分」は、１個と２０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「ブロッキング部分」は、アジド基、イソニトリル基、シアノ基、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する５－～８員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の１，４－エポキシ－１，４－ジヒドロナフタレン、または構造：

【化19】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；および
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
ただし、「ブロッキング部分」が－Ｎ_３である場合、「スペーサー」は－ＣＨ_２－ではない。〕。
いくつかの実施形態において、「スペーサー」は、１個と１２個との間の炭素原子を有し、任意選択的に、カルボニル基を含む、直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族基である。他の実施形態において、「スペーサー」は、１個と１０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的にケトン、エステルまたはアミドを含む脂肪族基であり；さらに他の実施形態において、「スペーサー」は、１個と６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、カルボニル基、例えばケトン、エステル、炭酸塩、カルバメート、ウレタン、またはアミドを含む脂肪族基である。

【0070】

いくつかの実施形態において、「ブロッキング部分」は、１個と２０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「ブロッキング部分」は、イソニトリル基、シアノ基、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する５－～８員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の１，４－エポキシ－１，４－ジヒドロナフタレンに由来する部分、またはボロン酸またはその誘導体または類似体に由来する部分を含む。いくつかの実施形態において、「ブロッキング部分」は、１個と１６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族または芳香族基である。他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、１個と１２個との間の炭素原子を有する、直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族基または芳香族基である。さらに他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、１個と６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の脂肪族または芳香族基である。

【0071】

いくつかの実施形態において、「ブロッキング部分」は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）基（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。）を含む。他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）基（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、またはエチルから選択される。）を含む。他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）基（式中、Ｚ^１またはＺ^２の一方のみがＨである。）を含む。他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）基（式中、両方のＺ^１およびＺ^２がＨである。）を含む。いくつかの実施形態において、「保護基」は、－Ｂ（ＯＨ）_３ ^－である。

【0072】

他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、少なくとも１つの硫黄原子またはセレン原子を含む５－～８－員のヘテロシクロアルキル基を含む。他の実施形態において、「ブロッキング部分」は、５－～８－員のヘテロシクロアルキル基を含み、これは、２つの硫黄原子または２つのセレン原子を含み、２つの硫黄原子または２つのセレン原子が１つの炭素原子によって互いに分離されている（例えば、－Ｓ－Ｃ－Ｓ－または－Ｓｅ－Ｃ－Ｓｅ－）。いくつかの実施形態において、５－～８－員のヘテロシクロアルキル基は、１，３－ジチアン基である。

【0073】

いくつかの実施形態において、本開示によるヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＩＩＡ）によって具体化される構造を有する：

【化20】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化21】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない。〕。

【0074】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。

【0075】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の一方は－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ－である。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の一方は－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ－であり、Ｒ^ａはメチルまたはエチルである。さらなる実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の一方は、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔｅｒｔブチルから選択される。さらに別の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。またさらに別の実施形態では、両方のＲ^２およびＲ^３がＨであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２の両方がＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は両方Ｈであり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、「保護基」は－Ｂ（ＯＨ）_３ ^－である。

【0076】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は、－Ｏ-Ｒ^６、ハロゲンＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｃ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または、－ＮＯ_２（式中、Ｒ^ｃおよびＲ^ｄは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり、Ｒ^６は、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基である。）、－Ｎ－（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）または－Ｏ（Ｒ^ａ）からなる群から選択される少なくとも一つの部分で置換された、フェニル基または５－または６－員のヘテロシクロアルキル基である。他の実施形態において、Ｒ^６はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である。さらなる実施形態において、Ｒ^６は、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔｅｒｔブチルから選択される。

【0077】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は、置換または非置換のフェニル基である。他の実施形態において、Ｒ^４は、１つまたは複数の電子求引基で置換されたフェニル基（例えば、ニトロ（－ＮＯ_２）、シアノ（－ＣＮ）、カルボキシアミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）、トリフルオロメチル（－ＣＦ_３））である。いくつかの実施形態において、フェニル基は、１つ、２つ、または３つの電子求引基で置換されている。さらに他の実施形態では、Ｒ^４は、電子求引基で置換されたフェニル基である。さらなる実施形態において、Ｒ^４は、非置換のフェニル基である。

【0078】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は、置換されたヘテロシクロアルキル基である。他の実施形態において、Ｒ^４は、１つまたは複数の電子求引基で置換されたヘテロシクロアルキル基（例えば、ニトロ（－ＮＯ_２）、シアノ（－ＣＮ）、カルボキシアミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）、トリフルオロメチル（－ＣＦ_３））である。さらに他の実施形態では、Ｒ^４は、電子求引基で置換されたヘテロシクロアルキル基である。さらなる実施形態において、Ｒ^４は、非置換のヘテロシクロアルキル基である。

【0079】

他の実施形態において、Ｒ^４は、フェニル基または５－または６－員のヘテロシクロアルキル基であり、少なくとも１つのアルキル置換基で置換されており、各アルキル置換基は、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。

【0080】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^５は、－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、両方のＺ^１およびＺ^２はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立してＨ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、両方のＺ^１およびＺ^２はＨである。

【0081】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化22】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）である。いくつかの実施形態において、基

【化23】

は、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される少なくとも一つの置換基を含む。いくつかの態様において、Ｒ^５は

【化24】

である。いくつかの態様において、Ｒ^５は

【化25】

である。

【0082】

式（ＩＩＩＡ）のヌクレオチド（その任意の塩を含む）の非限定的な例には、以下が含まれる：

【化26】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；および
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。〕。

【0083】

いくつかの実施形態において、上記で特定された例における複素環基は、２、３位または２、５位で置換されている。

【0084】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＩＩＢ）によって具体化される構造を有する：

【化27】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化28】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^７はＯまたはＮＲ^ａであり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。）を有する。〕。

【0085】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。他の実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は両方Ｈである。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の一方は－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ－であり、Ｒ^ａはメチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^２は、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔ－ブチルから選択され、Ｒ^３はＨである。さらに別の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方がＨである。よりさらなる実施形態において、両方のＲ^２およびＲ^３がＨであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方がＨである。さらにより別の実施形態において、両方のＲ^２およびＲ^３がＨであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２の両方がＨである。

【0086】

いくつかの実施形態において、Ｒ^７はＯである。他の実施形態において、Ｒ^７はＯであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。さらに他の実施形態において、Ｒ^７はＯであり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。さらに他の実施形態において、Ｒ^７はＯであり、Ｒ^４はフェニルまたは置換フェニル（例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、またはｔｅｒｔブチル基で置換されたもの）であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。さらなる実施形態において、Ｒ^７はＯであり、Ｒ^４は、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基（例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、またはｔｅｒｔブチル基で置換されたもの）であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。

【0087】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＩＩＣ）によって具体化される構造を有する：

【化29】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^８はＯ、ＮＲ^ａ、またはＳであり；
Ｒ^９はＨ、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ａ、－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、または－ＮＯ_２である。
Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈまたは直鎖状または分岐状のＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり；
Ｒ^１３は結合、－ＣＨ_２－または－ＣＨ_２－ＣＨ_２－であり；
Ｒ^１４は－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、または－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。）であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキルであり；および
ｎは０または１～３の範囲の整数であり；
いくつかの実施形態において、複素環は２，３位または２，５位で置換されており、例えば、－Ｃ（Ｒ^１１）（Ｒ^１２）－Ｒ^１３－Ｒ^１４は、複素環の３位または５位に存在する。

【0088】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１１またはＲ^１２の少なくとも一方はＨである。他の実施形態において、Ｒ^１１は、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択され、Ｒ^１２はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^１１またはＲ^１２の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^１４は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方がＨである。さらなる実施形態において、両方のＲ^１１およびＲ^１２がＨであり、Ｒ^１４は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１はＨであり、Ｚ^２はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である。さらなる実施形態において、Ｒ^９はＨであり、Ｒ^１１またはＲ^１２の一方はＨであり、Ｒ^１４は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１はＨであり、Ｚ^２はＣ_１～Ｃ_４アルキル基である。よりさらなる実施形態において、両方のＲ^１１およびＲ^１２がＨであり、Ｒ^１４は－Ｂ（ＯＨ）_２である。

【0089】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１１またはＲ^１２の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^１４はＮ_３である。他の実施形態において、Ｒ^１１およびＲ^１２は、両方Ｈであり、Ｒ^１４はＮ_３である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１４はＮ_３である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１３は結合であり、Ｒ^１４はＮ_３である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１３は結合であり、Ｒ^１４はＮ_３であり、Ｒ^９はＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ^１３は結合であり、Ｒ^１４はＮ_３であり、Ｒ^８はＯである。他の実施形態において、Ｒ^１３は結合であり、Ｒ^１４はＮ_３であり、Ｒ^８はＮＲ^ｅである。さらに他の実施形態において、Ｒ^１３は結合であり、Ｒ^１４はＮ_３であり、Ｒ^８はＳである。

【0090】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＩＩＤ）によって具体化される構造を有する：

【化30】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；および
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化31】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^２およびＲ^３がＨであり、Ｒ^４が結合である場合、Ｒ^５はアジドではない。）有する基である。〕。

【0091】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は、結合である。他の実施形態において、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。さらに他の実施形態において、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方は、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルである。

【0092】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４はフェニル基であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。他の実施形態において、Ｒ^４はフェニル基であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。他の実施形態において、Ｒ^４は置換フェニル基であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２であり、ここで、フェニル基は、少なくとも一つのＣ_１～Ｃ_４アルキル基で置換されている。さらに他の実施形態において、Ｒ^４は置換フェニル基であり、ここで、フェニル基は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはｔｅｒｔ－ブチル基から選択される単一の置換基で置換されている。

【0093】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨ、メチルまたはエチルである。他の実施形態において、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨ、メチルまたはエチルである。他の実施形態において、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨ、メチルまたはエチルである。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^４は－ＣＨ＝ＣＨ－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＨ）_２である。

【0094】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＩＶ）によって具体化される構造を有する：

【化32】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化33】

（式中、
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１が結合であり、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５はアジドではないである。〕。

【0095】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合である。他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３の一方のみがＨであり、Ｒ^５は－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３である。

【0096】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の一方は、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３はメチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択され、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｚ^１またはＺ^２の一方はＨである。さらに他の実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、両方のＺ^１またはＺ^２がＨである。より一層さらなる実施形態において、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、両方のＺ^１またはＺ^２がＨであり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方がＨである。

【0097】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化34】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）である。いくつかの態様において、Ｒ^５は

【化35】

である。他の実施形態において、Ｒ^５は

【化36】

である。さらに他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^５は

【化37】

である。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨであり、Ｒ^５は

【化38】

である。

【0098】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^５は－Ｂ（ＯＺ^１）（ＯＺ^２）であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。

【0099】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＡ）によって具体化される構造を有する：

【化39】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。〕。

【0100】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。

【0101】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、またはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、またはエチルから選択され、Ｒ^４は結合である。

【0102】

式（ＶＡ）のヌクレオチド（その任意の塩を含む）の非限定的な例には、以下が含まれる：

【化40-1】

【化40-2】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；および
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチルまたはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｚ^１およびＺ^２は両方Ｈである。

【0103】

式（ＶＡ）のヌクレオチド（その任意の塩を含む）の追加の非限定的な例には、以下が含まれる：

【化41】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；および
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。〕。

【0104】

いくつかの実施形態において、複素環は、オルト位およびパラ位で－Ｂ（ＯＨ）_２基で置換されている。

【0105】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＢ）によって具体化される構造を有する：

【化42】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は結合、置換または非置換の５－員または６－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、または置換または非置換の５－員または６－員のヘテロシクロアルキル基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。〕。

【0106】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^４は結合である。

【0107】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。

【0108】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択され、Ｒ^４は少なくとも一つの置換基を有するフェニル基である。他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択され、Ｒ^４は少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、ここで、少なくとも一つの置換基は、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔｅｒｔブチルから選択される。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択され、Ｒ^４は非置換のフェニル基である。

【0109】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＣ）によって具体化される構造を有する：

【化43】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。〕。
いくつかの実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。

【0110】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＤ）によって具体化される構造を有する：

【化44】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数である。〕。

【0111】

いくつかの実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。さらに他の実施形態において、Ｒ^１は結合であり、Ｒ^２およびＲ^３は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、およびｔｅｒｔブチルから選択される。

【0112】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、またはエチルから選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^１は－ＣＨ_２－であり、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、メチル、またはエチルから選択され、Ｒ^４は結合である。

【0113】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＩＡ）によって具体化される構造を有する：

【化45】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換のフェニル基、－ＣＨ＝ＣＨ－、または置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^１０はＯＨ、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｕ－ＯＨ、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｕ－Ｃ（Ｏ）Ｈ、または相互に１，３の位置にある２つの－Ｓ（Ｏ）－基を含む５－～８－員のシクロアルキル基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；および
ｕは、１～３の範囲の整数である。〕。

【0114】

いくつかの実施形態において、本開示のヌクレオチド（その任意の塩を含む）は、式（ＶＩＢ）、（ＶＩＣ）、（ＶＩＤ）、（ＶＩＥ）、および（ＶＩＦ）によって具体化される構造を有する：

【化46】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
Ｒ^１は、結合、－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ^ａ－、または－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^８はＯ、ＮＲ^ａ、またはＳである。
Ｒ^９はＨ、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ａ、－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、または－ＮＯ_２である；
Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、Ｈまたは直鎖状または分岐状のＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり；
Ｒ^１３は結合、－ＣＨ_２－、または－ＣＨ_２－ＣＨ_２－であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ｕは、１～３の範囲の整数である。〕。

【0115】

いくつかの実施形態において、複素環は、オルト位およびパラ位で－Ｂ（ＯＨ）_２基で置換されている。

【0116】

いくつかの実施形態において、式（ＶＩＡ）～（ＶＩＦ）のいずれか１つの化合物は、ホウ酸または他の別の副生成物を含む混合物などの混合物として存在し得る。いくつかの実施形態において、式（ＶＩＡ）～（ＶＩＦ）のいずれか１つの化合物は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）のヌクレオチドとの混合物として存在し得る。

【0117】

核酸塩基および標識化核酸塩基
ここに記載されるように、本開示のヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸塩基またはタグ付き核酸塩基を含み得る。「核酸塩基」とは、天然に存在する塩基および合成塩基を含む、オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）内に含めるのに適した任意の窒素塩基を意味する。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルまたはそれらの誘導体または類似体から選択される。他の実施形態において、核酸塩基は、７－デアザグアニン、７－デアザアデニンまたは５－メチルシトシンである。

【0118】

いくつかの実施形態において、標識化核酸塩基は、式（ＶＩＩＡ）、（ＶＩＩＢ）、（ＶＩＩＣ）のいずれかによって具体化されるような構造を有する：

【化47】

〔式中、
Ｒ^１５は核酸塩基であり；
「リンカー」は、１個と５０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり；
「標識」は、検出可能な種を含む。

【0119】

本発明のヌクレオチドを標識化する方法は、米国特許出願公開第２０１４／０１３４６１６号に開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0120】

いくつかの実施形態において、「リンカー」は、ワトソン－クリック塩基対形成が依然として実行可能であるという条件で、核酸塩基上の任意の位置に付着され得る。いくつかの実施形態において、そしてプリン塩基の文脈において、リンカーは、７－デアザプリンの７位を介して、８－修飾プリンを介して、Ｎ－６修飾アデニンを介して、またはＮ－２修飾グアニンを介して結合される。いくつかの実施形態において、そしてピリミジンの文脈において、付着は、シトシン、チミンまたはウラシル上の５位およびシトシン上のＮ－４位を介する。

【0121】

いくつかの実施形態において、「リンカー」は、１個と５０個との間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、２個と２５個との間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、５個と２０個との間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、１０個と２０個との間の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、「リンカー」は、約１００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、「リンカー」は、約４０ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、「リンカー」は、約５０ｇ／ｍｏｌ～約１５００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、約０．５ｎｍと約８０ｎｍとの間の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態において、「リンカー」は、約０．５ｎｍと約５０ｎｍとの間の範囲の長さを有する。

【0122】

いくつかの実施形態では、「リンカー」は、切断することができる基、例えば、光切断可能な基、酵素的に切断可能な基、化学的に切断可能な基、特定のｐＨで切断可能な基を含む。「切断可能なリンカー」という用語の使用は、リンカー全体を核酸塩基から除去する必要があることを意味するものではない。むしろ、リンカー内の切断部位は、リンカーの一部が切断後に核酸塩基に付着したままであることを保証するリンカー上の位置に位置することができる。切断可能なリンカーを使用することで、必要に応じて、検出後に標識を除去できるようになり、その後に組み込まれる標識化ヌクレオチドとの干渉信号を回避できる。切断可能なリンカーは当技術分野で知られており、従来の化学を適用して、リンカーを核酸塩基および標識に付着させることができる。リンカーは、酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素などへの曝露を含む、任意の適切な方法によって切断することができる。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．に開示されているように、標準的な化学的ブロッキング基から適合させることができる。固相合成で使用されるさらに適切な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ等の（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １００：２０９２－２１５７， ２０００）に開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0123】

いくつかの実施形態では、リンカーは、任意選択で１つまたは複数のスペーサー単位を含み得ると考えられている。スペーサーは、核酸塩基を切断部位、標識、またはリンカーから離間させる。標識がヌクレオチドと酵素、例えばポリメラーゼとの間の相互作用を妨害しないようにヌクレオチドから十分な距離に保持されている限り、リンカーの長さは重要ではない。いくつかの実施形態において、標識化核酸塩基は、構造－［核酸塩基］－［リンカー］－［エクステンダー］_ｙ－［標識］を含み、「エクステンダー」は、１個と６０個との間の炭素原子を有し、任意選択的に、１つまたは複数のヘテロ原子で置換された、直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族基または芳香族基であり；ｙは０、１、または２である。

【0124】

適切なリンカーには、ジスルフィドリンカー、酸に不安定なリンカーが包含され、ジアルコキシベンジルリンカー、Ｓｉｅｂｅｒリンカー、インドールリンカー、ｔ－ブチルＳｉｅｂｅｒリンカー、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元条件下での切断、酸化条件下、安全キャッチリンカーの使用による切断、および脱離機構による切断が含まれる。

【0125】

光切断可能なリンカーは、糖質化学で広く使用されてきた。いくつかの実施形態において、切断を活性化するために必要とされる光は、修飾ヌクレオチドの他の成分に影響を及ぼさない。フルオロフォアは、リンカー分子を切断するために必要な波長とは異なる波長の光を吸収するように選択される。適切なリンカーには、ｏ－ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物に基づくリンカーが含まれる（例として、５－ヒドロキシ－２－ニトロベンジルアルコールを出発物質として使用することができる。）。一実施形態では、光切断可能なリンカーは、２－ニトロベンジル部分である。ベンゾイン化学に基づくリンカーも使用できる（Ｌｅｅ等のＪ． Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ６４：３４５４－３４６０， １９９９）。

【0126】

例えば、基は、約２００ｎｍと約４００ｎｍ（ＵＶ）との間の、または約４００ｎｍと約８００ｎｍ（可視）との間の波長を有する電磁放射源への曝露時に切断され得るリンカー中に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＵＶまたは可視光の光切断可能な基は、アリールカルボニルメチル基（４－アセチル－２－ニトロベンジル、ジメチルフェナシル（ＤＭＰ）、２－（アルコキシメチル）－５－メチル－α－クロロアセトフェノン、２，５－ジメチルベンゾイルオキシラン、およびベンゾイン基：３’，５’－ジメトキシベンゾイン（ＤＭＢ）を含む。）、ｏ－ニトロベンジル基（１－（２－ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、１－（メトキシメチル）－２－ニトロベンゼン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）；１－（２－ニトロフェニル）エチルオキシカルボニルおよび２－ニトロ－２－フェノール誘導体、ならびにアシル化５－ブロモ－７－ニトロインドリンなどのｏ－ニトロアニリド）を含む、α－カルボキシニトロベンジル（α－ＣＮＢ）、ｏ－ニトロ－２－フェネチルオキシカルボニル基；クマリン－４－イル－メチル基（７－メトキシクマリン誘導体を含む）；９－置換キサンテン、およびアリールメチル基（ｏ－ヒドロキシアリールメチル基を含む）、からなる群から選択される。

【0127】

いくつかの実施形態において、約７００ｎｍと約１０００ｎｍとの間の波長を有する電磁放射線源への曝露時に切断され得る基がリンカーに導入され得る。適切な近赤外光切断基には、Ｃ４－ジアルキルアミン置換ヘプタメチンシアニンを含むシアニン基が含まれる。

【0128】

さらに他の実施形態では、「リンカー」は、還元剤を含む異なる化学反応物によって、またはｐＨの誘導された変化によって切断され得る化学的に切断可能な基を含む（例えば約７未満のｐＨでの基の切断。）。適切な化学的に切断可能な基には、ジスルフィドベースの基：ジアゾベンゼン基（亜ジチオン酸ナトリウムに感応性の２－（２－アルコキシ－４－ヒドロキシ－フェニルアゾ）安息香酸骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を含む）；エステル結合ベースのグループ（高ｐＨ）；酸性に感応性のリンカー（ジアルコキシジフェニルシランリンカーやアシルヒドラゾンなど）が含まれる。隣接するジオールで切断可能なリンカーは、“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ， ２０１３ Ｊａｎ；１２（１）：２３７－４４． ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１２．０２１０１４． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ １．に開示されているように、ＮａＩＯ_４によって切断される可能性がある。適切な酵素的に切断可能な基には、トリプシン切断可能基およびＶ８プロテアーゼ切断可能基が含まれる。本開示のヌクレオチドのいずれかで利用され得るさらなるリンカーは、米国特許出願公開第２０１８／００５７８７０号に開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0129】

求電子的に切断されたリンカーは、プロトンによって切断されると考えられており、酸に感応性の切断を含む。適切なリンカーには、トリチル、ｐ－アルコキシベンジルエステルおよびｐ－アルコキシベンジルアミドなどの修飾ベンジル系が含まれる。他の適切なリンカーには、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびアセタール系が含まれる。チオアセタールまたは他の硫黄含有保護基の切断におけるニッケル、銀または水銀などのチオフィリック金属の使用もまた、適切なリンカー分子の調製のために考慮され得る。

【0130】

求核性切断は、リンカー分子の調製においてもよく認識されている方法である。水中で不安定な（すなわち、塩基性ｐＨで単純に切断することができる）エステルおよび非水性求核試薬に対して不安定である基などの基を使用することができる。フッ化物イオンは、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）やｔ－ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）などの基のシリコン－酸素結合を切断するために使用できる。

【0131】

還元的切断を受けやすいことが知られている多くのリンカーがある。パラジウムベースの触媒を使用した接触水素化は、ベンジル基とベンジルオキシカルボニル基を切断するために使用されてきた。ジスルフィド結合の還元も当技術分野で知られている。

【0132】

酸化ベースのアプローチは当技術分野でよく知られている。これらには、ｐ－アルコキシベンジル基の酸化と硫黄およびセレンリンカーの酸化が含まれる。ジスルフィドおよび他の硫黄またはセレンベースのリンカーを切断するための水性ヨウ素の使用もまた、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態において、リンカーは、基－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ［Ｂ（ＯＨ）_２］－ＣＨ_２－－リンカーを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１，２－ジオール（－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－）ベースのリンカーを含む。

【0133】

セーフティ－キャッチリンカーは、２つのステップで切断するリンカーである。いくつかの実施形態において、第１のステップは、反応性求核中心の生成であり、その後、切断をもたらす分子内環化を含む第２のステップが続く。例えば、レブリン酸エステル結合をヒドラジンまたは光化学で処理して活性アミンを放出し、次にこれを環化して分子内の他の場所でエステルを切断することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２：５１６５－５１６８， １９９７）。

【0134】

脱離反応も使用できる。例えば、Ｆｍｏｃおよびシアノエチルなどの塩基触媒による脱離、ならびにパラジウム触媒によるアリル系の還元的脱離を使用できる。

【0135】

標識は、検出可能な任意の化学基または分子であってよい。いくつかの実施形態において、標識は、例えば、その電荷、形状、サイズ、または任意の組み合わせによって、ナノポア内で検出することができる任意の化学基または分子であり得る。いくつかの実施形態において、標識は、エチレングリコールまたはエチレングリコールに由来するポリマー、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素（フルオロフォアを含む）、化学発光化合物、質量標識、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基のうちの１つまたは複数、またはそれらの組み合わせを含む。他の標識はＦｕｌｌｅｒ等の“Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ－ｔａｇｇｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｒｒａｙ，” ＰＮＡＳ Ｍａｙ １０， ２０１６ １１３ （１９） ５２３３－５２３８によって開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。いくつかの実施形態において、標識は、化合物中のリン酸基の数のバランスをとるために、適切な数のリジンまたはアルギニンをさらに含む。他の適切な標識の例には、ＰＣＴ公開番号、国際公開第１９９１／００６６７８号パンフレット、国際公開第２０１８／１９１３８９号パンフレット、および国際公開第２００４／０１８４９７号パンフレットに記載されているラベルが含まれ、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0136】

いくつかの実施形態において、標識は、質量によって識別可能であり、したがって質量分析によって分析することができる１つまたは複数のレポーター基を含む質量標識である。レポーター基は化学的に異なる可能性があり、したがって分子量によって互いに区別される可能性がある。あるいはまた、レポーター基は化学的に同一である可能性があるが、異なる同位体を含むことによって互いに区別される（例えば、^２Ｃ／^１３Ｃおよび^１Ｈ／^２Ｈ^２Ｃ／^１３Ｃおよび^１Ｈ／^２Ｈ）。標識部分は、および／またはレポーター基は、例えば、光化学的または他の適切な手段による切断後、質量分析による分析に適しているか、または適合されている。適切な質量標識の例には、米国特許第７，１３２，５１９号、第９，２９１，５９７号、および第１０，０７８，０８３号に記載されているものが含まれ、これらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。適切な質量標識の追加の例には、Ｘｕ Ｌ等の“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ Ｍａｓｓ Ｔａｇ Ｄｉｄｅｏｘｙ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，” Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７， Ｓｅｐｔ． １；６９（１７）：３５９５－６０２に開示されるようなエレクトロホアラベルが含まれ、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0137】

いくつかの実施形態において、標識はポリマーである。いくつかの実施形態において、標識はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。ポリマーがＰＥＧである実施形態では、任意の数のエチレングリコール単位を有するＰＥＧポリマーを選択することができる。例えば、ＰＥＧポリマー中のエチレングリコール単位の数は、１と１００との間の範囲であってよい。いくつかの場合において、ＰＥＧポリマーのエチレングリコール単位の数はヌクレオチドの種類ごとに異なる。例えば、４つの異なるタイプのヌクレオチドの場合、それぞれが、ＰＥＧポリマー中に１６個、２０個、２４個、または３６個のエチレングリコール単位のいずれかを有する異なる標識を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧベースのポリマーは直鎖状である。他の実施形態において、ＰＥＧベースのポリマーは分岐状、すなわち、ＰＥＧベースのポリマーは、複数のＰＥＧ鎖を含む。いくつかの場合において、標識は、クマリンベースの染料、またはクマリンベースの染料の誘導体または類似体などの追加の識別可能な部分をさらに含む。いくつかの場合において、ポリマーは帯電している。いくつかの場合において、ポリマーは帯電しておらず、標識は高濃度の塩（例えば、３～４Ｍ）で検出される。標識の追加の例は、米国特許出願公開第２０１５／０３６８７１０号、同第２０１８／００７３０７１号、同第２０１５／０１１１７５９号、同第２０１３／０２６４２０７、同第２０１３／０２４４３４０号、同第２０１４／０１３４６１６号、および同第２０１８／０１１２２５７号に開示されており、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。特に、上記の米国出願公開第２０１５／０３６８７１０号および同第２０１５／０１１１７５９号は、ナノポアＳＢＳのための標識化ヌクレオチドの使用を記載しており、分岐ＰＥＧ鎖を含む単一の標識に付着した単一ヌクレオチドの可能な使用を開示している。他のＰＥＧラベル化ヌクレオチドは、Ｓｈｉｖ Ｋｕｍａｒ等の“ＰＥＧ－Ｌａｂｅｌｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２， Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ６８４ （２０１２）；およびＣａｒｌ Ｆｕｌｌｅｒ等の“Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ－ｔａｇｇｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ａ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｒｒａｙ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２０１６； Ｍａｙ １０； １１３（１９）：５２３３－５２３８に開示されている。

【0138】

いくつかの実施形態において、標識はフルオロフォアである。フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類縁体）、ローダミン、オキサジン（レゾルフィンを含む）、ＢＯＤＩＰＹ、発光団およびシアニンを含むいくつかの一般的な化学クラスに属する。蛍光分子の追加の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ-Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＴｈｅｒｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに見ることができる。 他の実施形態では、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、およびテトラピロール誘導体から選択される。他の実施形態では、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、ＡｔｔｏおよびＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹ ａｎｄ ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ ｄｙｅｓ（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ およびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣ、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓから入手可能）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。

【0139】

前述によれば、本開示の標識化ヌクレオチド（その任意の塩を含む）の非限定的な例は、式（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、または（ＶＩＩＩＣ）のいずれかによって具体化されるような構造を有する：

【化48】

〔式中、
Ｒ^１５は、核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「保護基」は、構造：

【化49】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－である。）を有する基であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－員または６－員のアリール基である。）を有する基であり；
「リンカー」は、１個と５０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり；および
「標識」は、ここに記載されている種のいずれかを含む、検出可能な種である。〕。

【0140】

本開示の標識化ヌクレオチド（その任意の塩を含む）の非限定的な他の例は、式（ＶＩＩＩＤ）、（ＶＩＩＩＥ）、または（ＶＩＩＩＦ）のいずれかによって具体化されるような構造を有する：

【化50】

〔式中、
Ｒ^１５は、核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは、０または１～５の範囲の整数である。）であり；
「スペーサー」は、１個と１６個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり；
「ブロッキング部分」は、１個と２０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり、ただし、「Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｍｏｉｅｔｙ」は、アジド基、イソニトリル、シアノ基、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＳｅから選択される少なくとも一つのヘテロ原子を有する５－～８員のヘテロシクロアルキル基、置換または非置換の１，４－エポキシ－１，４－ジヒドロナフタレン、または構造：

【化51】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基である。）を有する基であり；
「リンカー」は、１個と５０個との間の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、任意選択的に１つまたは複数のヘテロ原子で置換される脂肪族基もしく芳香族基であり；および
「標識」は、ここに記載されている種のいずれかを含む、検出可能な種であり、
ただし、「ブロッキング部分」が－Ｎ_３である場合、「スペーサー」は－ＣＨ_２－ではない。〕。

【0141】

保護ヌクレオチドの脱保護
本開示はまた、ここに記載の保護されたヌクレオチドのいずれかを脱保護する方法を提供する。ここに記載のように成長中のオリゴヌクレオチドに保護ヌクレオチドを組み込んだ後、保護ヌクレオチドを脱保護して、脱保護ヌクレオチドを生成することができる。ヌクレオチドが標識またはラベルを含み、脱保護が標識またはラベルの除去の前または後に起こり得る実施形態において。他の実施形態では、脱保護は、存在する場合、標識またはラベルの除去と同時に起こり得る。

【0142】

図５を参照すると、本開示による保護ヌクレオチド５００は、中間体５０１を提供するために脱保護試薬で処理され得る。いくつかの実施形態において、脱保護は、非還元試薬を使用して実施される。他の実施形態において、脱保護は、酸化剤を使用して実施される。さらに他の実施形態において、脱保護は、レドックス中性試薬を使用して実施される。適切な試薬の例には、これらに限定されないが、過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、または過オキシ硝酸塩が包含される。適切な試薬の他の例には、テトラジンまたはその誘導体、またはエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。適切な試薬のさらに別の例には、（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）およびジチオスレイトールが含まれる。

【0143】

いくつかの実施形態において、中間体５０１は、自然発生的な脱離または加水分解を受けて、脱保護されたヌクレオチド５０２を提供する。例えば、中間体は、中間体５０１の構成および中間体５０１が存在する条件に応じて、１，６脱離またはベータ脱離を受ける可能性がある。いくつかの実施形態において、中間体５０１は、次に、任意選択的に塩基で処理されて、脱保護されたヌクレオチド５０２を提供し得る。いくつかの実施形態において、適切な塩基には、ピペリジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、アンモニア、ジイソプロピルエチルアミン、および水酸化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。

【0144】

以下のスキーム１は、脱保護試薬、例えば、過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、またはＮａＯＮＯ_２の存在下で保護ヌクレオチド１００（式（ＩＩＩＡ）を有する保護ヌクレオチドなど）を脱保護して、中間２００（式（ＶＩＡ）を有する中間体など）を提供し、次に、これは、自然発生的な脱離または加水分解を受けて、脱保護されたヌクレオチド３００を提供し得る。ここに記載されるように、ヌクレオチド１００、２００、または３００のそれぞれは、オリゴヌクレオチドに組み込むことができ、標識またはラベルを含み得る。さらに例示的な脱保護戦略を、以下に記載されるスキーム２～９に示す。

【0145】

【化52】

スキーム 1：保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^１０、Ｙ、およびＸは、ここに記載されている通りである。

【化53】

スキーム 2：本開示のいくつかの実施形態による、ボロネート部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化54】

スキーム 3：本開示のいくつかの実施形態による、ボロネート部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化55】

スキーム 4：本開示のいくつかの実施形態による、ボロネート部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化56】

スキーム 5：本開示のいくつかの実施形態による、ボロネート部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化57】

スキーム６：本開示のいくつかの実施形態による、ボロネート部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化58】

スキーム ７：本開示のいくつかの実施形態による、アジド部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化59】

スキーム８：本開示のいくつかの実施形態による、イソニトリル部分を含む保護ヌクレオチドの脱保護を示し、式中、ＹおよびＸは、ここに記載される通りである。

【化60】

スキーム９：本開示のいくつかの実施形態による、マロン酸部分を含む保護されたヌクレオチドの脱保護を例示する。

【0146】

ナノポア配列決定
本開示はまた、ナノポア配列決定方法を提供し、それにより、この方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）、（ＶＢ）、（ＶＣ）、（ＶＤ）、（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）、（ＶＩＩＩＤ）、（ＶＩＩＩＥ）、および（ＶＩＩＩＦ）のヌクレオチド（またはその塩）のいずれかを含む、ここに記載のヌクレオチドまたは標識化ヌクレオチドのいずれかを利用する。

【0147】

概要
例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドのナノポア配列決定は、ポリヌクレオチド配列の鎖配列決定および／またはエキソ配列決定によって達成することができる。いくつかの実施形態において、鎖配列決定は、ポリヌクレオチドテンプレートのヌクレオチドがナノポアを通るときに、サンプルポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド塩基が直接決定される方法を含む。いくつかの実施形態において、ナノポアベースのヌクレオチド酸配列決定は、酵素によって成長中の鎖に組み込むことができる４つのヌクレオチド類似体の混合物を使用する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、それを膜の微細な細孔に通すことによって配列決定され得る。いくつかの実施形態において、塩基は、それらが膜の一方の側から他方の側に細孔を通って流れるイオンに影響を与える方法によって識別され得る。いくつかの実施形態において、１つのタンパク質分子は、ＤＮＡヘリックスを２つの鎖に「解凍（ｕｎｚｉｐ）」することができる。２番目のタンパク質は、膜に細孔を作り、「アダプター」分子を保持することができる。細孔を通るイオンの流れは電流を生成することでき、それによって各塩基はイオンの流れを異なる程度に遮断し、電流を変化させることができる。アダプター分子は、塩基を電子的に識別するのに十分な時間、塩基を所定の位置に保つことができる（ＰＣＴ公開番号、国際公開第２０１８／０３４７４５号パンフレット、および米国特許出願公開番号第２０１８／００４４７２５号および同第２０１８／０２０１９９２号を参照されたい。これらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。）。

【0148】

いくつかの実施形態において、ナノポアは、核酸分子を間接的に配列決定するために使用され得る、すなわち、間接配列決定は、重合された核酸分子が配列決定中にナノポアを通過しない任意の方法を含み得る。これらの実施形態において、核酸分子は、ナノポアの前庭に少なくとも部分的に位置し得るが、ナノポアのポア（すなわち、最も狭い部分）には位置し得ない。ヌクレオチド組み込みイベントから放出される副生成物、例えば少なくとも式（Ｉ）および（ＩＩ）に記載されているものを含む、標識化ヌクレオチドから切断された標識がナノポアで検出されるように、核酸分子は、ナノポアから任意の適切な距離内および／またはナノポアに近接して、および任意選択的に、ある距離内を通過することができる。

【0149】

いくつかの実施形態において、各ヌクレオチド類似体は、ナノポアで検出されたときに識別可能で、区別可能な署名を提供する共有結合した標識部分を有する。鎖伸長酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、その活性部位で成長中の核酸鎖にハイブリダイズするテンプレート核酸鎖に相補的な標識化ヌクレオチド化合物に特異的に結合する。次に、鎖伸長酵素は、標識化ヌクレオチド化合物の相補的ヌクレオチド部分を、成長中の核酸鎖の末端に触媒的に結合する（すなわち、組み込む）。触媒的組み込みイベントの完了の結果、標識部分とオリゴリン酸部分（成長中の鎖に組み込まれた１つのリン酸を除く）が放出され、それらは次いで隣接するナノポアを通過する。しかしながら、それが組み込まれたヌクレオチドからそれを放出する触媒プロセスを受ける前でさえ、標識化ヌクレオチド化合物の標識部分は、印加された電位の下でナノポアのポアに入り、それによってナノポアを通るバックグラウンド正イオンの流れを変える。一般に、ナノポアに標識部分が存在すると、ナノポアを通る陽イオンの流れが減少（または遮断）する。この「ブロッキング電流」は、標識部分が存在しないナノポアを通る正イオンの流れから生じる「オープチャンネル」（または「Ｏ．Ｃ．」）電流のパーセンテージ（またはそれ以下）である信号として検出される。

【0150】

いくつかの実施形態において、ナノポアベースの配列決定は、保護ヌクレオチド、例えば、ここの少なくとも式（Ｉ）または（ＩＩ）のものを、成長中の（新生）ポリヌクレオチド鎖に組み込む、ナノポアの近くに位置するものなどの酵素が利用され、ここで、成長中のポリヌクレオチド鎖は、対応するテンプレート核酸鎖に相補的である。ヌクレオチド組み込みイベントは、ＤＮＡポリメラーゼまたはその変形体または変異体などの酵素によって触媒され、テンプレート分子との塩基対相互作用を使用して、各位置での組み込みに利用可能なヌクレオチドの中から選択される。「ヌクレオチド組み込みイベント」は、その用語がここで使用される場合、保護ヌクレオチド（式（Ｉ）または（ＩＩ）のもののいずれかを含む）の成長中のポリヌクレオチド鎖への組み込みを意味する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド組み込みイベントの副生成物は、ナノポアによって検出され得る。いくつかの実施形態において、副生成物は、所与のタイプのヌクレオチドの組み込みと相関し得る。いくつかの実施形態において、副生成物は、ナノポアを通過し、および／またはナノポアで検出可能な信号を生成する（例えば、図４を参照）。上記で特定された標識のいずれかなどの放出された標識分子は、ヌクレオチド組み込みイベントの副生成物の例である。例として、図１は、ナノポア（１３０）に近接して結合したＤＮＡポリメラーゼ（１２０）を示している。配列決定されるポリヌクレオチドテンプレート（１７０）は、プライマーと共に加えられる（テンプレートは酵素に関連している）。このナノポア配列決定複合体（プライマーを含む）に、４つの異なる標識化ヌクレオチド（１４０）がバルク水相に追加される。ポリメラーゼが触媒する正しいヌクレオチドの組み込み後、標識は放出され、ナノポア（１３０）を通過して、固有のイオン電流遮断信号（１５０）が生成され、それにより、各標識が異なる化学構造を有するために、追加された塩基を電子的に識別することができる。そのようなナノポアベースの配列決定システムおよび方法に関する追加の詳細は、米国特許第９，６０５，３０９号および同第９，５５７，２９４号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0151】

いくつかの実施形態において、核酸分子を配列決定するための方法は、（ａ）保護標識化ヌクレオチドを重合すること例えば、テンプレートとして第１の核酸分子を使用して一度に１つの標識化ヌクレオチドを組み込む酵素を使用する）であって、ここで、個々のヌクレオチドに関連する標識は、重合時に放出され、保護標識化ヌクレオチドは、式（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかを有する、重合することと；および（ｂ）ナノポアを使用して放出された標識を検出することを含む。いくつかの実施形態において、任意の３’保護ヌクレオチドのブロッキング基が除去され、次いで、プロセスが反復して繰り返される。いくつかの実施形態において、酵素は、保護標識化ヌクレオチドのプールから引き出す。ここに記載されるように、保護ヌクレオチドの各タイプは、標識が放出されてナノポアの近くまたはナノポアを通過するときに、生成される信号に基づいて互いに区別され得るように、異なる標識分子に結合される（例えば、図１）。いくつかの実施形態において、各標識は、異なる検出可能な信号、例えば、異なる信号強度、異なる信号振幅などを有し得、これらは、ベース呼び出しアルゴリズムなどによって解釈され得る。

【0152】

いくつかの実施形態において、放出された標識は、ナノポアを通過するか、またはナノポアの近くを通過するときに、感知回路が標識に関連する電気信号を検出するように、ナノポアを通ってまたはナノポアに近接して流れる。検出された信号（すなわち、配列決定データ）は、収集され、メモリ位置に格納され、後で核酸の配列を構築するために使用され得る。収集された信号は、エラーなど、検出された信号の異常を説明するために処理される場合がある。適切なナノポア検出器は、米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号および同第２０１８／００７３０７１号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。同様に、米国特許第９，３７７，４３７号および同第８，３２４，９１４号は、ナノポアベースの配列決定システムからの電気信号の収集および分析を記載しており、その開示もまた、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0153】

いくつかの実施形態において、ナノポアに結合または他の方法で結合される酵素は、ポリヌクレオチドプロセシング酵素、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、エキソヌクレアーゼ、およびアンフォールダーゼを含む。いくつかの実施形態において、酵素はヘリカーゼである。いくつかの実施形態において、酵素は、野生型酵素であり得るか、または、野生型酵素の変形型であり得る。いくつかの実施形態において、酵素はポリメラーゼ変形体である。例えば、ポリメラーゼ変形体は、Ｈ２２３、Ｎ２２４、Ｙ２２５、Ｈ２２７、Ｉ２９５、Ｙ３４２、Ｔ３４３、Ｉ３５７、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｉ３６３、Ｓ３６５Ｑ、Ｓ３６６、Ｙ３６７、Ｐ３６８、Ｄ４１７、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｆ４７８、Ｋ５１８、Ｈ５２７、Ｔ５２９、Ｍ５３１、Ｎ５３５、Ｇ５３９、Ｐ５４２、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｉ５５０、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ｆ５５８、Ａ５９６、Ｇ６０３、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｙ６２２、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｒ６３２、Ｎ６３５、Ｍ６４１、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｉ６４８、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｋ６５５、Ｗ６５６、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｈ６６０、Ｆ６６２、およびＬ６９０に対応する位置に少なくとも一つの変化を含み得る。他の適切なポリメラーゼ変形体は、米国特許出願公開第２０１６／０２２２３６３号に開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。さらに他の適切な酵素は、米国特許第９，７９７，００９号に開示されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。より一層さらに適切な酵素は、米国特許出願公開第２０１６／０２５７９４２号に開示されている。

【0154】

いくつかの実施形態において、ナノポア配列決定複合体のナノポアは、限定されることなく、生物学的ナノポア、固体ナノポア、およびハイブリッド生物学的固体ナノポアを含む。ナノポア配列決定複合体の生物学的ナノポアには、Ｅ． ｃｏｌｉ， ｓｐ．，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．，Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ （ＣｌｙＡ）由来のＯｍｐＧ、およびＳ． ａｕｒｅｕｓ ｓｐ．，ＭｓｐＡ ｆｒｏｍ Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ｓｐ由来のアルファ溶血素が含まれる。例えば、米国特許出願公開第２０１７／００８８５８８号を参照されたい。その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ナノポアシーケンシング複合体のバリアントナノポアは、それが由来するナノポアのイオン電流ノイズを低減するように操作される。さらに他のナノポアは、米国特許出願公開第２０１７／０２６８０５２号、同第２０１７／０３５６０３７号、および同第２０１８／０２０１９９３号に記載されており、これらの開示は参照によりその全体がここに組み込まれる。現在知られている、または後に発見された任意のナノポア変形体は、１つまたは複数の酵素変形体のスクリーニングと同時に（例えば、望ましい特性を提供するナノポア変形体および酵素変形体のペアを同定するために）、ここに記載の方法に従ってスクリーニングされ得る。

【0155】

ナノポアは、集積回路などの感知回路の感知電極に隣接して配置された膜に形成されるか、さもなければ埋め込まれ得る。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であり得る。いくつかの例では、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。感知回路は、ナノポアを有するチップまたは他のデバイス内に、またはオフチップ構成などのチップまたはデバイスの外に配置することができる。半導体は、第ＩＶ族（例えば、ケイ素）および第ＩＩＩ～第Ｖ族の半導体（例えば、ガリウムヒ素、二硫化モリブデン）を含むがこれらに限定されない任意の半導体であり得る。ナノポア配列決定複合体を組み立てるための方法は、米国特許出願公開第２０１７／０２６８０５２号に記載されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。異なるテンプレートのそれぞれをナノポア酵素コンジュゲートに複合体化するための他の適切な方法には、ＰＣＴ公開番号、国際公開第２０１４／０７４７２７号パンフレット、同第２００６／０２８５０８号パンフレット、および同第２０１２／０８３２４９号パンフレットに記載されている方法が含まれ、それぞれの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0156】

図２は、ナノポアベースの配列決定チップ内のセル１６０の実施形態を示す。いくつかの実施形態において、膜１０２は細胞の表面上に形成される。いくつかの実施形態において、膜１０２は脂質二重層である。タンパク質ナノポア膜貫通分子複合体（ＰＮＴＭＣ）および目的の分析物を含むバルク電解質１１４は、細胞の表面に直接配置される。いくつかの実施形態において、単一のＰＮＴＭＣ１０４は、エレクトロポレーションによって膜１０２に挿入される。いくつかの実施形態において、アレイ内の個々の膜は、互いに化学的にも電気的にも接続されていない。したがって、アレイ内の各セルは独立した配列決定マシンであり、ＰＮＴＭＣに関連付けられた単一のポリマー分子に固有のデータを生成する。いくつかの実施形態において、ＰＮＴＭＣ１０４は、分析物に作用し、そうでなければ不浸透性の二重層を通るイオン電流を変調する。

【0157】

図２を引き続き参照すると、図２に示されるように、アナログ測定回路１１２は、電解質１０８の薄膜で覆われた金属電極１７０（例えば、ルテニウム、酸素、チタン、または窒素からなる電極）に接続されている。いくつかの実施形態において、電解質１０８の薄膜は、イオン不透過性膜１０２によってバルク電解質１１４から分離されている。ＰＮＴＭＣ１０４は、膜１０２を通過し、イオン電流がバルク液体から作用電極１７０に流れるための唯一の経路を提供する。いくつかの実施形態において、セルはまた、電気化学ポテンシャルセンサーである対極（ＣＥ）１１６を含む。いくつかの実施形態において、セルはまた、参照電極１１７を含む。

【0158】

核酸サンプルを配列決定するためのチップは、複数の個別にアドレス指定可能なナノポアを含み得る。複数の個別にアドレス指定可能なナノポアは、集積回路に隣接して配置された膜に形成された少なくとも１つのナノポアを含むことができる。いくつかの実施形態において、個々にアドレス指定可能な各ナノポアは、個々のヌクレオチドに関連する標識を検出することができる可能性がある。

【0159】

複数のナノポアセンサーは、チップまたはバイオチップ上に存在するアレイなどのアレイとして提供され得る。ナノポアのアレイは、任意の適切な数のナノポアを有し得る。いくつかの場合において、アレイは、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、約２０００００、約４０００００、約６０００００、約８０００００、約１００００００などのナノポアを含む。バイオチップおよびバイオチップを製造するための方法は、ＰＣＴ公開番号、国際公開第２０１５／０６１５１１号に記載されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。複数のナノポアを含むさらに適切なバイオチップは、米国特許出願公開第２０１７／０２６８０５２号に記載されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。さらに適切なナノポアアレイは、米国特許第８，９８６，９２８号に記載されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【0160】

保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドのオリゴマーへの組み込み
本開示は、ナノポア配列決定に使用されるオリゴヌクレオチドなどのオリゴマーを合成する方法を提供し、オリゴマーは、ここに開示される保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドに由来する。

【0161】

図３Ａは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）、（ＶＢ）、（ＶＣ）、（ＶＤ）、（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）、（ＶＩＩＩＤ）、（ＶＩＩＩＥ）、および（ＶＩＩＩＦ）のいずれかのヌクレオチドを使用してオリゴヌクレオチドを合成する一般的な方法を示すフローチャートを示す。ステップ３２０で、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドが、ナノポア配列決定複合体などに導入される。いくつかの実施形態において、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドは、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドの「プール」として導入され、ここで、プールは、異なる保護ヌクレオチドまたは保護されたタグ付きヌクレオチドを含み得、それぞれは、少なくともそれに結合された核酸塩基または標識化核酸塩基において異なる。いくつかの実施形態において、プールは、配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣヌクレオチド（または、ＲＮＡ配列決定の場合、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）とハイブリダイズすることができる保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも４つの異なる保護ヌクレオチドがプールに導入される。

【0162】

ステップ３２１において、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドは、成長中のオリゴヌクレオチド鎖に酵素的に組み込まれる。例として、ポリメラーゼ酵素は、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドのプールから引き出し、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドを成長中のオリゴヌクレオチド鎖に酵素的に組み込むことができる。ステップ３２２で、保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドは、ここに記載されるように、脱保護される。保護標識化ヌクレオチドが組み込まれる実施形態では、この方法は、標識を放出すること、および放出された標識を検出することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、標識は、脱保護の前（ステップ３２２）であるが、酵素的取り込みの後に（ステップ３２１）放出される。あるいはまた、および他の実施形態にいて、標識は、脱保護後（ステップ３２２）であるが、第２の保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドの酵素的組み込み（ステップ３２３）の前に放出される。さらに他の実施形態において、標識の放出および脱保護は、同じステップで起こり得る（例えば、保護基に作用して脱保護を促進すると同時に、切断可能な類似体に作用してそれに結合した標識の放出を可能にする試薬を選択することができる）。ステップ３２３は、配列全体の核酸配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列がナノポアで配列決定されるまで、このプロセスが反復して繰り返されることを示している。当業者は、ヌクレオチドのプールがステップ３２０で導入される場合、ポリヌクレオチドが本開示に従って配列決定され得るように、必要に応じてステップ３２１および３２２が繰り返され得る（ステップ３２３）ことを理解するであろう。

【0163】

図３Ｂは、ここに記載の切断可能な部分を含むものなど、保護標識化ヌクレオチドの酵素的組み込みのステップ（ステップ３３１）、続いて、保護されたタグ付きヌクレオチドからタグを除去し（３３２）、続く、組み込まれたヌクレオチド（今や脱標識された保護ヌクレオチド）を脱保護する（ステップ３３３）を示すフローチャートを示している。いくつかの実施形態において、異なる保護標識化ヌクレオチドのそれぞれは、それが鎖伸長酵素によって新しい相補的鎖に組み込まれるときに標識が生成する特有の検出可能な信号によって区別される。いくつかの実施形態において、放出された標識は、それらがヌクレオチドから放出された後、ナノポアを通って流れることができる。いくつかの実施形態において、電圧を印加して、ナノポアを通して標識を引っ張る。当業者は、ポリヌクレオチドが本開示に従って配列決定され得るように、必要に応じて、酵素的組み込み、標識除去、および脱保護のステップが繰り返され得る（ステップ３３４）ことを理解するであろう。

【0164】

この方法は、図３Ｃにさらに示されている。示されるように、核酸鎖３００は、ナノポア３０２を横切って、またはナノポア３０２に近接して（しかし、３０２の矢印によって示されるように通過しない）通過する。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、テンプレート３００として第１の核酸分子を使用して一度に１つの保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドを組み込むことによって成長中の核酸鎖３０４を伸長する（すなわち、酵素はヌクレオチド組み込みイベントを触媒する）。

【0165】

いくつかの実施形態において、そして図３Ｃを引き続き参照すると、酵素は、標識分子（符号３０５の黒塗りの丸）に付着した保護標識化ヌクレオチド（符号３０５の白抜きの丸）のプールから引き出される。保護標識化ヌクレオチドの各タイプは、異なる標識分子に付着しているため、標識が放出されてナノポア３０６を通過するとき、それらは、ナノポアで生成される信号に基づいて互いに区別され得る。いくつかの実施形態において、標識がナノポアの中および／または通過するときに、標識は電子的変化を生成し得る。いくつかの実施形態において、電子的変化は、電流振幅の変化、ナノポアのコンダクタンスの変化、またはそれらの任意の組み合わせである。ナノポア検出法で保護標識化ヌクレオチドを区別するために使用できる、単独または組み合わせでの検出可能な信号特性の中には、ナノポア内の標識の存在によって引き起こされるイオンフローの変化があり、これにより、ナノポア検出システムの電極全体の電流レベル測定値が変化する（ＤＣまたはＡＣ電位のいずれかで）。「イオン流」とは、ここで用いる場合、アノードとカソードとの間の電位などの起電力に起因する、典型的には溶液中でのイオンの移動を指す。イオン流は、典型的には、電流または静電ポテンシャルの減衰として測定することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、それぞれが異なる標識を有する保護標識化ヌクレオチドのセットを提供し、ここで、それぞれの異なる標識は、細孔を通る異なるイオンの流れを引き起こし、それがナノ細孔に位置するとき、電極を横切る異なる検出可能な標識電流レベルをもたらす。

【0166】

図４は、それらがナノポアによって検出されるときに、異なる標識によって生成される異なる信号の例を提供する。４つの異なる信号強度（４０１、４０２、４０３、４０４）が検出される。これらは、ここに開示される保護標識化ヌクレオチドのいずれかに含まれる標識などの４つの異なる標識に対応し得る。例えば、ナノポアに提示される、および／またはアデノシン（Ａ）の組み込みによって放出される標識は、振幅４０１の信号を生成することができる。ナノポアに提示された、および／またはシトシン（Ｃ）の組み込みによって放出された標識は、より高い振幅４０３を有する信号を生成し得；ナノポアに提示される、および／またはグアニン（Ｇ）の組み込みによって放出される標識は、さらに高い振幅４０４を有する信号を生成し得；ナノポアに提示される、および／またはチミン（Ｔ）の組み込みによって放出される標識は、さらに高い振幅４０２を有する信号を生成し得る。いくつかの場合において、検出の間に信号がベースラインレベル４０５に戻ることがある。

【0167】

図６は、保護標識化ヌクレオチドの成長中のポリヌクレオチド鎖への組み込みをさらに示す。図示のように、各保護標識化ヌクレオチドは、本開示による保護基を表すＲ基を含む（例えば、Ｒは、式（Ｉ）および（ＩＩ）の「保護基」または－スペーサー－ブロッキング部分をそれぞれ表すことができる。）。この特定の実施形態では、標識（すなわち、標識１、２、３、および４）の切断はまた、Ｒ基、すなわち保護部分の除去をもたらし、その結果、追加の標識化保護標識化ヌクレオチドを反復して導入することができる。

【0168】

合成による配列決定
本開示はまた、合成による配列決定の方法（ＳＢＳ）を提供し、それにより、この方法は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）、（ＶＢ）、（ＶＣ）、（ＶＤ）、（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）、（ＶＩＩＩＤ）、（ＶＩＩＩＥ）、および（ＶＩＩＩＦ）のヌクレオチド（またはその塩）のいずれかを含む、ここに記載のヌクレオチドまたは標識化ヌクレオチドのいずれかを利用する。ＳＢＳ技術は一般に、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの反復的付加による新生核酸鎖の酵素的伸長を伴う。各ヌクレオチドの追加は、テンプレート鎖の１つまたは数塩基を照会する。ＳＢＳの１つの例示的なタイプでは、サイクル配列決定は、例えば、切断可能または光退色性の染料ラベルを含む可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的添加によって達成される（例えば、ＰＣＴ出願公開番号、国際公開第９１／０６６７８号パンフレットを参照。その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。）。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の保護標識化ヌクレオチドは、５’～３’方向に伸長するポリヌクレオチド鎖に連続的に付加されて、配列決定されるテンプレート核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチドを形成する。付加された保護標識化ヌクレオチドの１つまたは複数に存在する塩基の同一性は、各ヌクレオチドの取り込み後などの検出または画像化ステップで決定することができる。

【0169】

例えば、合成による配列決定を使用して標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって：（ａ）保護標識化ヌクレオチド（式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、（ＩＩＩＤ）、（ＩＶ）、（ＶＡ）、（ＶＢ）、（ＶＣ）、（ＶＤ）、（ＶＩＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＢ）、（ＶＩＩＩＣ）、（ＶＩＩＩＤ）、（ＶＩＩＩＥ）、および（ＶＩＩＩＦ）の保護標識化ヌクレオチドのいずれかなど）を提供することと；（ｂ）保護標識化ヌクレオチドを標的一本鎖ポリヌクレオチドの補体に組み込むことと；（ｃ）ステップ（ｂ）の保護標識化ヌクレオチドの標識を検出し、それによって組み込まれたヌクレオチドのタイプを決定することと；（ｄ）ステップ（ｂ）の３’保護基および保護標識化ヌクレオチドの標識を除去することと；（ｅ）オプションでステップ（ｂ）－（ｄ）を１回以上繰り返し；それにより、標的の一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定すると、を含む。いくつかの実施形態において、方法は、標識を放出させること、および放出された標識を検出することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、保護標識化ヌクレオチドは、ここに記載されるように、脱保護される。いくつかの実施形態において、標識は、３’保護基の脱保護の前であるが、酵素的取り込みの後に放出される。他の実施形態において、標識は、３’保護基の脱保護後、第２の保護ヌクレオチドまたは保護標識化ヌクレオチドの酵素的取り込みの前に放出される。いくつかの実施形態において、標識の切断および３’保護基の脱保護は、実質的に同時に起こる。いくつかの実施形態において、提供される保護標識化ヌクレオチドは、少なくとも４つの異なる保護標識化ヌクレオチド（保護標識化ヌクレオチドのプールなど）を含み、それぞれの異なる保護標識化ヌクレオチドは、異なる保護標識化ヌクレオチドのそれぞれが互いに区別可能であるような異なる標識を含む。

【0170】

いくつかの実施形態において、合成による配列決定を使用して標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法は、標的ポリヌクレオチドを異なる保護標識化ヌクレオチドと別々に接触させて、標的ポリヌクレオチドの相補体を形成し、保護標識化ヌクレオチドの組み込みを検出することによって実施することができる。ここに記載されるように、そのような方法は重合を利用し、それにより、ポリメラーゼ酵素は、標的上のヌクレオチドに相補的な正しい保護標識化ヌクレオチドを組み込むことによって相補鎖を伸長する。重合反応には、重合を開始するための特定のプライマーも必要である。各サイクルについて、標識化ヌクレオチドの組み込みは、ポリメラーゼ酵素（ここに記載されているものなど）によって実行され、その後、組み込みイベントが決定される。

【0171】

いくつかの実施形態において、配列決定法は、固体支持体上に配列された標的ポリヌクレオチドを用いて実施される。複数の標的ポリヌクレオチドは、リンカー分子を介して固体支持体上に固定化することができるか、あるいは粒子、例えば、固体支持体材料に付着することもできるミクロスフェアに付着させることができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ビオチン－アビジン相互作用の使用を含む、いくつかの手段によって固体支持体に付着させることができる。適切な固体支持体には、スライドガラスおよびビーズ、セラミックおよびケイ素表面、ならびにプラスチック材料が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、支持体は平坦な表面である。他の実施形態において、微視的ビーズ（ミクロスフェア）も使用することができ、次に、既知の手段によって別の固体支持体に取り付けることができる。ミクロスフェアは、任意の適切なサイズ、典型的には直径約１０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、平面表面、例えば、平面ガラス表面に直接付着される。いくつかの実施形態において、付着は、共有結合を介する。適切なアレイの非限定的な例は、ＰＣＴ出願公開番号、国際公開第００／０６７７０号パンフレットに記載されており、その開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。配列決定法は、単一のポリヌクレオチド分子およびマルチポリヌクレオチド分子アレイ、すなわち、別個の個々のポリヌクレオチド分子のアレイ、および１つの個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む別個の領域のアレイの両方で実施することができる。いくつかの実施形態において、単一分子アレイは、個々のポリヌクレオチドを別々に分解することを可能にする。いくつかの実施形態におい、単一分子アレイを非破壊的に配列決定することにより、空間的にアドレス可能なアレイを形成することができると考えられている。

【0172】

ポリメラーゼ反応を実施するために、いくつかの実施形態において、プライマー配列は、標的ポリヌクレオチドにアニールされ、プライマー配列は、ポリメラーゼ酵素によって認識され、相補鎖のその後の伸長のための開始部位として作用する。プライマー配列は、標的ポリヌクレオチドに関して別個の成分として付加され得る。あるいはまた、プライマーおよび標的ポリヌクレオチドはそれぞれ、一本鎖分子の一部であり得、プライマー部分は、標的の一部、すなわちヘアピンループ構造と分子内二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、この構造は、分子上の任意の点で固体支持体に固定化され得る。いくつかの実施形態において、次に、本開示の保護標識化ヌクレオチドを、重合が起こることを可能にするために、標的ポリヌクレオチドと接触させる。いくつかの実施形態において、保護標識化ヌクレオチドは、順次、すなわち、各ヌクレオチドタイプの別々の添加（例えば、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣなどの核酸塩基を組み込んだ保護標識化ヌクレオチド）、または一緒に添加され得る。いくつかの実施形態において、保護標識化ヌクレオチドが一緒に添加される場合、異なる核酸塩基を有するそれぞれの異なるタイプの保護標識化ヌクレオチドは、異なる標識で標識される。いくつかの実施形態において、重合ステップは、保護標識化ヌクレオチドの組み込みを可能にするのに十分な時間進行させることが可能である。いくつかの実施形態において、次に、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドは、例えば、アレイを洗浄ステップに供することによって除去され、次いで、組み込まれた標識の検出を実施することができる。いくつかの実施形態において、この方法は、ここに記載されるように、脱保護ステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、検出後、リンカーを切断する適切な条件を使用して標識を除去することができる。

【0173】

いくつかの実施形態において、保護標識化ヌクレオチドのそれぞれは、次の保護標識化ヌクレオチドの添加の前に、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドを除去して、標的と連続的に接触させることができ、その再、標識の検出および除去は、保護標識化ヌクレオチドをそれぞれ添加した後、または保護標識化ヌクレオチドの４つすべてを添加した後に実行される。他の実施形態において、保護標識化ヌクレオチドの異なるタイプのすべてが同時に標的と接触させられる、すなわち、異なる保護標識化ヌクレオチドのすべてを含む組成物が標的と接触させられ、組み込まれていないヌクレオチドは、検出前および標識の除去後に除去される。

【0174】

いくつかの実施形態において、方法は、第１のステップおよび第２のステップを含むことができ、第１のステップにおいて、４つのヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物が標的と接触させられ、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドは、検出前および標識の除去後に除去され、第２のステップにおいて、第１の組成物に含まれない２つの保護標識化ヌクレオチドを含む第２の組成物は、標的と接触させられ、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドは、検出前および標識の除去後に除去され、ここで、ここで、第１のステップおよび第２のステップは、組み込まれたヌクレオチドの３’保護基の脱保護後に、任意選択的に、１回または複数回繰り返すことができる。

【0175】

いくつかの実施形態において、方法は、第１のステップおよび第２のステップを含むことができ、第１のステップにおいて、４つのヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物が標的と接触させられ、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドは、検出前および標識の除去後に除去され、第２のステップにおいて、第１の組成物に含まれない２つの保護標識化ヌクレオチドを含む第２の組成物は、標的と接触させられ、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドは、検出前および標識の除去後に除去され、ここで、ここで、第１のステップおよび第２のステップは、組み込まれたヌクレオチドの３’保護基の脱保護後に、任意選択的に、１回または複数回繰り返すことができる。

【0176】

いくつかの実施形態において、方法は、第１のステップおよび第２のステップを含むことができ、第１のステップにおいて、４つの異なる保護標識化ヌクレオチドのうちの３つを含む第１の組成物を標的と接触させ、組み込まれていないヌクレオチドを、検出前および標識の除去後に除去し、第２のステップにおいて、第１の組成物に含まれない保護標識化ヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させ、組み込まれていない保護標識化ヌクレオチドを、検出前および標識の除去後に除去し、ここで、第１のステップおよび第２のステップは、組み込まれたヌクレオチドの３’保護基の脱保護後に、任意選択的に、１回または複数回繰り返すことができる。

【0177】

いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法は、相補的な保護標識化ヌクレオチドの連続的な組み込みを監視することを含み、ここで、保護標識化ヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して保護標識化ヌクレオチドに連結された検出可能な標識を含み、これにより、標識を監視することによって組み込みが検出され、方法は、さらに保護標識化ヌクレオチドの組み込みが起こることを可能にするための脱保護ステップをさらに含む。

【0178】

合成による配列決定のための追加の構成要素および方法は、米国特許第９，６０５，３１０号および同第９，４４１，２７２号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体がここに組み込まれる。

【実施例】

【0179】

保護ＤＭＴ－ｄＴの調製：

【化61】

【0180】

２５５ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）の４－（ヒドロキシメチル）ベンゼンボロン酸ピナコールエステルおよび３４０ｍｇのＣＤＩ（２．１ｍｍｏｌ）を１５ｍＬ管に仕込んだ。１．５ｍＬの乾燥ジクロロメタンを加え、溶液を３０分間振とうした。次に、酢酸エチルで１０ｍＬに希釈し、５ｍＬの水（ｘ２）で洗浄した。次に、それを無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して、３００ｍｇの白色固体（８０％収率）を得た。

【0181】

４４０ｍｇのＤＭＴ－ｄＴ（０．８１ｍｍｏｌ）を１ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解した。１２２ｍｇのＤＭＡＰ（１．０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌して溶解させた。次に、それを上記の３００ｍｇの白色固体（０．９１ｍｍｏｌ）に加え、窒素下で一晩撹拌した。次に、それを１００ｍＬの酢酸エチルに溶解し、１００ｍＬの水（×３）およびブラインで洗浄した。それを無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で蒸発させて、８００ｍｇの粘稠な油を得た。それを、溶媒ヘキサン／酢酸エチル（１％トリエチルアミン）５０：５０～０：１００を用いて４０ｇのシリカゲルコンビフラッシュで１５分かけて精製した。質量８０３（ネガティブモード）の純粋な画分を真空下で濃縮して、３０ｍｇのボロネート－カーボネート－ＤＭＴ－ｄＴを粘稠なフィルムとして得た。

【0182】

ボロネート－カルボネート－ＤＭＴ－ｄＴの調製

【化62】

【0183】

保護ＤＭＴ－ｄＴの脱保護：

【化63】

【0184】

マスキング解除反応
上記の３０ｍｇのボロネート－カーボネート－ＤＭＴ－ｄＴ生成物を、３ｍＬのアセトニトリルに溶解して、１０ｍｇ／ｍＬ（約１２．５ｍＭ）の溶液を作った。次に、以下の反応を調製した：
１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬボロネート－カーボネート－ＤＭＴ－ｄＴを、９０μＬの２０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ～８．５に添加した。ボロネート－カーボネート－ＤＭＴ－ｄＴの水への溶解度が低いため、溶液は濁った。２μＬの１％ａｑＨ_２Ｏ_２を加え、反応物を１分間ボルテックスした。溶液は再び透明になった。１０μＬを１ｍＬの水に希釈し、ＬＣ－ＭＳ（ネガティブモード）で分析した。５４３の主要な質量ピークは、化合物のマスキング解除の、ＤＭＴ－ｄＴに戻るまでを示している。出発物質は観察されなかった。

【0185】

対照反応：
１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬボロネート－カーボネート－ＤＭＴ－ｄＴを、９０μＬの２０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ～８．５に添加した。溶液が濁った。２μＬの水を加え、反応液を１０分間ボルテックスした。溶液は依然として濁っていたが、程度は低かった。１０μＬを１ｍＬの水に希釈し、ＬＣ－ＭＳ（ネガティブモード）で分析した。２つの主要な質量ピークが観察された：出発物質からの８０３およびピナコールエステルの加水分解からの７２１。

【0186】

次いで、対照反応物を、室温で４０時間振とうした。１０μＬを１ｍＬの水に希釈し、ＬＣ－ＭＳ（ネガティブモード）で分析した。ピナコールエステルの加水分解による唯一の主要な質量ピーク７２１が観察された。

【化64】

【0187】

マロニル基を有する保護ヌクレオチドの調製
１０ｍｍｏｌのビス（ヒドロキシメチル）化合物１を８ｍＬの乾燥ピリジンに溶解する。２ｍＬの乾燥ピリジンに溶解した９ｍｍｏｌのｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリドをゆっくりと加え、反応物を３日間撹拌する。混合物を真空下で蒸発乾固し、５０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解する。それを５０ｍＬの水で洗浄し、水溶液を５０ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出する。すべての有機画分を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。生成物２を、溶媒としてヘキサン／酢酸エチルを使用するシリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製する。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化65】

【0188】

１０ｍｍｏｌの化合物２を、２０ｍＬの無水酢酸、６ｍＬの酢酸、および３０ｍＬのＤＭＳＯの予混合溶液に溶解する。反応物を一晩撹拌し、次に１５０ｍＬの冷１０％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で注意深く希釈する。生成物をジエチルエーテル（５ｘ５０ｍＬ）で抽出する。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。生成物３を、溶媒としてＣＨ_２Ｃｌ_２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製する。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化66】

【0189】

１０ｍｍｏｌの化合物を５０ｍＬの乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解し、溶液をアルゴン下で撹拌する。ＣＨ_２Ｃｌ_２中の塩化スルフリルの１Ｍ溶液１２ｍＬ（１２ｍｍｏｌ）を３つのアリコートに加え、反応物をアルゴン下で１時間撹拌する。溶媒を真空下で除去し、残留物を３０ｍＬの乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解する。１７ｍｍｏｌの酢酸カリウムの溶液および３０ｍＬの乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２中の７．５ｍｍｏｌのジベンゾ－１８－クラウン－６を加え、反応物を１．５時間撹拌する。８０ｍＬの酢酸エチルを加え、有機相を１００ｍＬの水で洗浄する。それを硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮する。生成物４を、溶媒としてＣＨ_２Ｃｌ_２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによってさらに精製する。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化67】

【0190】

１０ｍｍｏｌの化合物４を３０ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解し、２ｍＬ（１２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミントリヒドロフルオリドを加える。反応物を１週間撹拌する。１８ｍＬの２Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を加え、混合物を真空下で蒸発乾固させる。化合物５を含む残留物を、溶媒としてＣＨ_２Ｃｌ_２およびメタノールを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化68】

【0191】

１０ｍｍｏｌの化合物５を２０ｍＬの１，２－ジクロロエタンに溶解し、２０ｍｍｏｌのピリジンを加え、溶液を－１０℃で撹拌する。１０ｍＬの１，２－ジクロロエタン中の１２ｍｍｏｌの予冷したトリフルオロメタンスルホン酸無水物を加え、混合物を－１０℃で３０分間撹拌する。次に、それを２００ｍＬの５％ＮａＨＣＯ_３水溶液で急冷し、混合物を室温で３０分間撹拌する。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下にて濃縮する。化合物６を含む残留物は、さらに精製することなく次のステップで直接使用される。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化69】

【0192】

２ｍｍｏｌの化合物６を１ｍＬのＤＭＦに溶解し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中の１ｍＬの１ＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰの溶液に添加する。その反応物を３７℃で２４時間撹拌する。次に、溶媒を真空下で除去し、残留物を、溶媒として５０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウムｐＨ７．５およびアセトニトリルを使用する逆相ＨＰＬＣによって精製する。溶媒を除去し、アセトン中の過塩素酸ナトリウムを使用して生成物をナトリウム塩として沈殿させる。生成物７の同一性および純度は、ＬＣ－ＭＳ分析法によって分析される。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【化70】

【0193】

代替的な調製方法を以下に示す：

【化71】

【0194】

５’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ－）保護デオキシヌクレオチドを乾燥ＴＨＦに溶解し、１．２当量のジミルナトリウムでゆっくりと処理する。反応物を３０分間撹拌した後、１．２当量のトリフラート（化合物６）を混合物にゆっくりと加える。反応終了後、溶媒を蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製する。ＤＭＴｒ保護基は酢酸で処理することにより除去され、三リン酸（化合物７）は典型的な三リン酸調製法によって得られ、イオン交換および逆相ＨＰＬＣ精製法によって精製される。この例では、Ｒは－ＣＮまたは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｅｔであり得る。

【0195】

５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン９

【化72】

【0196】

乾燥ＭｅＣＮ（１００ｍＬ）中の５’－Ｏ－ＤＭＴ－チミジン８（５．０８ｇ、９．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｏ－ビス－トリメチルシリル－アセトアミド（４．６０ｍＬ、３．８３ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間還流し、続いて室温に冷却した。次に、４－メトキシベンゾイルクロリド（１．６５ｍＬ、２．０８ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ_３（２．６０ｍＬ、１．８９ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、２８．５ｍＬ、２８．５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で撹拌した。２時間後、混合物を真空で濃縮し、粗生成物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解した。有機相を洗浄し（２ｘ１００ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ_３；１００ｍＬ塩水）、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン９（１．９５ｇ、２．７８ｍｍｏｌ、３ステップで３１％）が、移動相としてｎ－ヘキサン／酢酸エチル（２／１→１／２）を使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによる精製後、黄色の固体として単離された。

【0197】

ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝６７７．９（Ｃ_３９Ｈ_３７Ｎ_２Ｏ_９（Ｍ－Ｈ^－）；計算６７７．２（Ｍ－Ｈ^－））。

【0198】

３’－Ｏ－メチルボロン酸－５’Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン１０
５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン９（６４８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、活性化モレキュラーシーブ（４A）の存在下で乾燥ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）に溶解した。Ｋ_２ＣＯ_３（４１５ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液を室温で３０分間撹拌した。２－（クロロメチル）－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン（３５１μＬ、４４２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で撹拌した。２４時間後、追加のＫ_２ＣＯ_３（１３８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）およびアルキルクロリド（１７６μｌ、２２２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた。６０℃での撹拌をさらに１６時間続けた。混合物を室温に冷却し、ろ過し、真空中で濃縮した。粗生成物をｎ－ヘキサン／酢酸エチル（１／２→１／４）およびジクロロメタン／メタノール（２／１）を移動相として使用するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで生成した。ＲＰ－ＨＰＬＣによる最終精製により、凍結乾燥後、所望の３’－Ｏ－メチルボロン酸－５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン１０（１６７ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、２３％）を白色固体として得た。

【0199】

ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝７３５．４（Ｃ_４０Ｈ_４０ＢＮ_２Ｏ_１１（Ｍ－Ｈ^－）；計算７３５．３（Ｍ－Ｈ^－））。

【0200】

３’－Ｏ－メチルボロン酸－Ｎ３－アニソイル－チミジン１１

【化73】

【0201】

３’－Ｏ－メチルボロン酸－Ｎ３－アニソイル－チミジン１１は、３’－Ｏ－メチルボロン酸－５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン１０の合成中に、５’－ＤＭＴ保護基により形成され、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製の過程で分離された。３’－Ｏ－メチルボロン酸－Ｎ３－アニソイル－チミジン１１（５ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）は、凍結乾燥後に白色固体として単離された。

【0202】

ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４３３．２（Ｃ_１９Ｈ_２２ＢＮ_２Ｏ_９（Ｍ－Ｈ^－）；計算４３３．１（Ｍ－Ｈ^－））。

【0203】

脱保護
３’－Ｏ－メチルボロン酸－５’Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン１０→５’Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ３－アニソイル－チミジン９

【化74】

【0204】

メチルボロン酸保護ヌクレオシド１０（１．２３ｍｇ、１．６７μｍｏｌ）を１３４μＬのＭｅＣＮ（ｃ（ヌクレオシド）＝１２．５ｍＭ）に溶解した。この溶液２０μＬをＭｅＣＮ８０μＬで希釈し、４０ｍＭのＮａＨＣＯ_３水溶液（ｃ（ヌクレオシド）＝１．２５ｍＭ）１００μＬを添加した。５０μＬの溶液を１μＬの１％Ｈ_２Ｏ_２水溶液に加え、反応混合物を室温で撹拌した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析で示されるように、出発物質の定量的変換１０（ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝７３５．４（Ｃ_４０Ｈ_４０ＢＮ_２Ｏ_１１（Ｍ－Ｈ^－）；計算所望のアルコール９中への７３５．３（Ｍ－Ｈ^－））（ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝６７７．５（Ｃ_３９Ｈ_３７Ｎ_２Ｏ_９（Ｍ－Ｈ^－）；計算６７７．２（Ｍ－Ｈ^－））は５分以内に進行した。

【0205】

３’－Ｏ－メチルボロン酸－Ｎ３－アニソイル－チミジン１１→Ｎ３－アニソイル－チミジン１２

【化75】

【0206】

メチルボロン酸保護ヌクレオシド１１（０．７５ｍｇ、１．７３μｍｏｌ）を１３８μＬのＭｅＣＮ（ｃ（ヌクレオシド）＝１２．５ｍＭ）に溶解した。２０μＬのこの溶液を１６０μＬの２０ｍＭのＮａＨＣＯ_３水溶液（ｃ（ヌクレオシド）＝１．２５ｍＭ）で希釈した。５０μＬの溶液を１μＬの１％Ｈ_２Ｏ_２に加えた。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析で示されるように、出発物質の定量的変換１１（ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝４３３．３（Ｃ_１９Ｈ_２２ＢＮ_２Ｏ_９（Ｍ－Ｈ^－）；計算所望のアルコール１２中への４３３．１（Ｍ－Ｈ^－））（ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝３７５．３（Ｃ_１８Ｈ_１９Ｎ_２Ｏ_７（Ｍ－Ｈ^－）；計算３７５．１（Ｍ－Ｈ^－））は５分以内に進行した。

【0207】

アリール（アジドメチル）ブロックヌクレオチド三リン酸の合成

【化76】

上記で特定された構造、ＹおよびＸは、ここに記載されている通りである。

【0208】

１．２２グラムの２－（アジドメチル）安息香酸１３を８．１ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、透明な溶液を室温で撹拌した。１．１１グラムのＮ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール１４を撹拌しながら部分的に加えた（１当量）。ＣＤＩが溶解したら、反応物を室温で２時間撹拌し、得られた混合物（生成物：イミダゾール、１：１）を、活性化アシルイミダゾリド１５の０．８５Ｍストック溶液として使用した。

【0209】

５５ｍｇのｄＡＴＰ１６（二ナトリウム塩）を反応管に入れた。１８２μＬの活性化アシルイミダゾール１５溶液（ＤＭＳＯ中０．８５Ｍ）を添加し、続いて５００μＬの無水ＤＭＳＯと５００μＬの水を添加した。得られた透明な溶液を５５℃で一晩インキュベートし、次に室温に冷却した。分析ＬＣＭＳにより、生成物１７（ＭＷ ｏｂｓ ６４９．０４、ＭＷ ｃａｌｃ ６４９）および二リン酸副生成物（ＭＷ ｏｂｓ ５６９．０７）の形成が確認された。この物質を、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．５中のアセトニトリルの勾配を使用するＣ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物の画分を収集し、凍結乾燥して、白色の固体を得た。

【0210】

ブロックアジドのＴＣＥＰ還元
３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中のｄＡＴＰブロック（アジドメチル）安息香酸エステル１７の１ｍＭ溶液を、１５ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）で処理し、室温でインキュベートした。ＬＣＭＳ分析では、水中の反応混合物の１０倍希釈液を、１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム勾配中のアセトニトリルを使用して分析し、２６０ｎＭでネガティブモードＥＳＩ－ＭＳで検出する。切断前に、ブロックｄＡＴＰは、分子量６４９．０３（ネガティブモード）のＬＣ勾配で４分で溶出する。アジドが還元され、分子内の環化と脱保護が行われると、放出されたｄＡＴＰは、分子量４８９．９９（ネガティブモード）のＬＣＭＳ勾配において１．８分で溶出する。

【0211】

単一の塩基の組み込み：
ポリメラーゼによる三リン酸７の組み込みの効率は、挿入部位に相補的塩基を含む１５－ｍｅｒのプライマーと２５－ｍｅｒのテンプレートを使用した単一ヌクレオチド挿入実験で調べることができる。挿入の成功は、ＬＣ－ＭＳ分析メソッドを使用して分析される。

【0212】

マスキング基の切断：
単一塩基の挿入実験混合物は、不特定の量のエステラーゼに約１分と約３０分との間供される。完全なマスキング解除の成功は、ＬＣ－ＭＳ分析法によって検証された。

【0213】

本明細書中で及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように修正することができる。

【0214】

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

【0215】

追加の実施形態
本開示の別の態様では、式（ＩＩＩＡ）のヌクレオチドまたはその塩である：

【化77】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。
Ｒ^１は、結合であり；
・ Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化78】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり、
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；。
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない。〕。
いくつかの実施形態において、Ｒ^４は、結合である。いくつかの実施形態において、Ｒ^４は結合であり、Ｒ^２またはＲ^３はＨである。
いくつかの実施形態において、Ｒ^４は６員のアリール基である。いくつかの実施形態において、Ｒ^４は６員のアリール基であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。

【0216】

いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、－ＣＨ＝ＣＨ－である。

【0217】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化79】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、

【化80】

（式中、Ｃ_２～Ｃ_６は、置換または非置換であることができる、２～６個の炭素の飽和アルキル鎖を表す。）であり、Ｒ^２は、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ－であり、少なくとも一つのＲ^ａは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基である。

【0218】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮまたは－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮまたは－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－であり、Ｒ^２は、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）または－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ－であり、少なくとも一つのＲ^ａは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基である。

【0219】

本開示の別の態様では、式（ＩＩＩＡ）のヌクレオチドまたはその塩である：

【化81】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。
Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化82】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない。〕。

【0220】

いくつかの実施形態において、Ｒ^４は６員のアリール基である。いくつかの実施形態において、６－員のアリール基は、少なくとも一つの置換基を含み、該少なくとも一つの置換基は、メチルおよびエチルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ^４は６員のアリール基であり、Ｒ^２またはＲ^３の少なくとも一方はＨである。

【0221】

本開示の別の態様では、式（ＩＩＩＡ）のヌクレオチドまたはその塩である：

【化83】

〔式中、
Ｘは、核酸塩基または標識化核酸塩基であり；
Ｙは、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－ＯＨまたは－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－［Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）］_ｚ－Ｏ－オリゴヌクレオチド（式中、ｚは０または１～５の範囲の整数である。）である。
Ｒ^１は－Ｃ（Ｏ）－Ｒ^ｘ－であり；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、Ｈ、飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_５～Ｃ_６アリール基またはヘテロアリール基、ハロゲン、－［（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｐ－Ｏ］_ｑ－－（Ｒ^ａ）、－Ｃ（Ｏ）－ＯＲ^ａ、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ）、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－ＣＮ、または－ＮＯ_２であり；
Ｒ^４は、結合、置換または非置換の５－～７－員のアリール基、－ＣＨ＝ＣＨ－、置換または非置換の５－または６－員のヘテロシクロアルキル基、または－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－アリール－であり；
Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ^＋Ｃ^－、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－ＣＮ、互いに１、３の位置にある２つの硫黄原子を含む５－～８－員のシクロアルキル基、または、構造：

【化84】

（式中、Ｚ^１およびＺ^２は、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、または任意選択的に１つまたは複数のヒドロキシル基で置換された５－～６－員のアリール基であり；
Ｑ^１およびＱ^３は、それぞれ独立して、結合、－Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）－、または－Ｃ（Ｏ）－であり；
Ｑ^２は、結合、ｏ－フェニレン、または－［Ｃ（Ｒ^ｅ）（Ｒ^ｆ）］_ｗ－（式中、ｗは、１または２である。）である。）を有する基であり；
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは飽和Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基であり；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、独立して、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、または置換または非置換の５－または６－員のアリール基であり；
Ｒ^ｘは、置換または非置換の５－員または６－員の芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；
ｎは、０または１～３の範囲の整数であり；および
ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１～３の範囲の整数であり；
ただし、Ｒ^１およびＲ^４がいずれも結合であり、かつ、Ｒ^２およびＲ^３がいずれもＨである場合、Ｒ^５は、アジドではない。〕。

【0222】

いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、－（Ｃ（Ｒ^ａ）（Ｒ^ｂ））_ｎ－Ｎ_３である。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】