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特許7153562筋ジストロフィーを治療するためのマイクロＲＮＡ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-05
(45)【発行日】2022-10-14
(54)【発明の名称】筋ジストロフィーを治療するためのマイクロＲＮＡ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20221006BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221006BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221006BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221006BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20221006BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221006BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20221006BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
A61K48/00 ZNA
A61P21/00
A61K35/76
C12N15/113 Z
C12N15/11 Z
C12P19/34 A
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2018553882
(86)(22)【出願日】2017-04-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-05-30
(86)【国際出願番号】 US2017027630
(87)【国際公開番号】W WO2017181011
(87)【国際公開日】2017-10-19
【審査請求日】2020-04-14
(31)【優先権主張番号】62/323,163
(32)【優先日】2016-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/473,253
(32)【優先日】2017-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ロディノ－カラパック， ルイーズ
(72)【発明者】
【氏名】メンデル， ジェリー アール．
(72)【発明者】
【氏名】ヘラー， クリスティン エヌ．
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３６８６４７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１０７３４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１９８７２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１９７８６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表平１１－５１２２９７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列を含む、組換えＡＡＶｒｈ７４ベクター。
【請求項2】
ａ）配列番号２のヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列、または
ｃ）配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクター。
【請求項3】
前記ポリヌクレオチド配列が、筋特異的制御要素に作動可能に連結される、請求項１または２に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクター。
【請求項4】
前記筋特異的制御要素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）である、請求項３に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクター。
【請求項5】
前記筋特異的制御要素が、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項３または４に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクター。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクターを含む、組成物。
【請求項7】
筋ジストロフィーの治療のための、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクターを含む組成物。
【請求項8】
筋ジストロフィーに罹患している対象における、線維症を低減または予防するための、あるいは、筋力を増加させるための、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクターを含む組成物。
【請求項9】
静脈内注射、全身投与、あるいは注射、注入または移植による非経口投与用に製剤化される、請求項７～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記組成物が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、請求項７～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクターまたは請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項12】
必要がある対象における線維症の低減または予防用の薬剤の調製のための、あるいは、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量の増加用の薬剤の調製のための、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶｒｈ７４ベクターまたは請求項６に記載の組成物の使用。
【請求項13】
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項14】
前記薬剤が、筋肉内投与、全身投与、注射、注入または移植用に製剤化される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項15】
前記薬剤が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項16】
宿主細胞を請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターで感染させることと、前記宿主細胞において成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチド配列の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，１６３号および２０１７年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７３，２５３号の優先権を主張するものであり、その両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ－２９を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療ベクター、ならびにこれらのベクターを使用して、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減および予防する方法、ならびに筋線維を損傷から保護し、筋肉強度を増加させる方法を提供する。
本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ－２９を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療ベクター、ならびにこれらのベクターを使用して、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減および予防する方法、ならびに筋線維を損傷から保護し、筋肉強度を増加させる方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
背景
運動および呼吸等の日常活動、ならびに全身代謝のための筋肉量および強度の重要性は疑う余地がない。筋機能の障害は、筋肉の衰弱および消耗を特徴とし、生活の質に重大な影響を与える筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じる。最もよく特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異から生じる。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格テザリングの喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生男児に影響を与える最も壊滅的な筋肉疾患の１つである。
運動および呼吸等の日常活動、ならびに全身代謝のための筋肉量および強度の重要性は疑う余地がない。筋機能の障害は、筋肉の衰弱および消耗を特徴とし、生活の質に重大な影響を与える筋ジストロフィー（ＭＤ）を生じる。最もよく特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異から生じる。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格テザリングの喪失に関連する膜の脆弱性に起因する。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生男児に影響を与える最も壊滅的な筋肉疾患の１つである。
【0004】
本出願には、ＤＭＤの治療を開発するための２つの変換アプローチが含まれる。線維浸潤はＤＭＤには深刻であり、潜在的な治療法にとって重大な障害である。ＤＭＤを有する非常に若い小児に既に存在する線維症の重篤度によって遺伝子置換のみが妨げられることも考慮することが重要である。実際、診断の通常の年齢（４～５歳）での筋肉生検は、非常に有意なレベルの線維症を示す。
【0005】
ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされ、ジストロフィン関連タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７ｋＤの筋細胞タンパク質であるジストロフィン（ｍＲＮＡ）の減少をもたらす（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８、１９８７）。ＤＡＰＣは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と、アクチン結合タンパク質であるジストロフィンと、ラミニン結合タンパク質であるα－ジストログリカンを介した細胞骨格との間の構造的な連結を形成する筋肉筋鞘における複数のタンパク質からなる。これらの構造的リンクは、収縮中に筋肉細胞膜を安定化させる働きをし、収縮に起因する損傷から保護する。ジストロフィン喪失と共に、膜の脆弱性は、筋鞘断裂およびカルシウムの流入をもたらし、カルシウム活性化プロテアーゼおよび分節状線維壊死を誘発する（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ。１０（２）：１６８－７５，１９９７）。筋肉変性および再生のこの制御されていないサイクルは、最終的に筋幹細胞集団を枯渇させる（Ｓａｃｃｏら、Ｃｅｌｌ、２０１０。１４３（７）：ｐ．１０５９－７１、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７）、進行性筋力低下、内膜炎症および線維性瘢痕を生じる。
【0006】
ＤＭＤは、ジストロフィンまたはマイクロジストロフィンからの膜安定化がなければ、制御不能な組織傷害および修復サイクルを現し、最終的に失われた筋繊維を結合組織増殖によって線維性瘢痕組織に置換する。線維症は、コラーゲンおよびエラスチンを含むＥＣＭマトリックスタンパク質の過剰沈着を特徴とする。ＥＣＭタンパク質は主に、ストレスおよび炎症に応答する活性化線維芽細胞によって放出されるＴＧＦβ等のサイトカインから産生される。ＤＭＤの主要な病理学的特徴は、筋線維の変性および壊死であるが、病理学的結果としての線維症は、同等の影響を有する。線維性組織の過剰生産は筋再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性筋衰弱に寄与する。一研究では、初期ＤＭＤ筋生検での線維症の存在は、１０年間の追跡調査での運動転帰不良と非常に相関していた（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７）。これらの結果は、線維症がＤＭＤ筋機能不全の主な原因であることを指摘し、線維性組織を減少させる治療法を開発する必要性を強調する。ｍｄｘマウスで試験されたほとんどの抗線維症療法は、ＴＧＦβ経路の阻害によって線維症サイトカインシグナル伝達をブロックするように作用する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基と対合し、翻訳の阻害またはｍＲＮＡ分解を促進することにより転写後レベルで遺伝子サイレンシングを媒介する約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの５’末端の７ｂｐのシード配列は、ｍｉＲＮＡを標的とする。付加的な認識は、標的配列の残り、ならびにその二次構造によって提供されます。ｍｉＲＮＡは、筋疾患病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーのタイプに一意的に依存する発現プロファイルを示す（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。ｍｉＲＮＡが心臓、肝臓、腎臓、および肺を含む多くの器官における線維症プロセスに関与していることを示唆する証拠が増えている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。最近、ｍｉＲ－２９の下方制御が心臓線維症に寄与することが示され（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ， ２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１）、ｍｉＲ－２９の発現低減が、ヒトＤＭＤ患者の筋肉と遺伝的に関連付けられた（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２）。ｍｉＲ－２９ファミリーは、２つのバイシストロン性ｍｉＲＮＡクラスターから発現される３つのファミリーメンバーからなる。ＭｉＲ－２９ａはｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１）と同時発現する。ｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－２）の第２のコピーと共にｍｉＲ－２９ｃを発現させる。ｍｉＲ－２９ファミリーは保存されたシード配列を共有し、ｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－２９ｂはそれぞれｍｉＲ－２９ｃから１塩基だけ異なる。さらに、ｍｄｘマウス筋肉へのｍｉＲ－２９プラスミド（ｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－２９ｂ－１のクラスター）のエレクトロポレーションは、ＥＣＭ成分、コラーゲンおよびエラスチンの発現レベルを低下させ、筋肉切片におけるコラーゲン沈着を２５日以内に強く減少させた（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ、２０１０）。１２（４）：ｐ．３４１－５１）。
【0007】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例としては、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており（ＡＡＶ－８に関して米国特許第７，２８２，１９９号および同第７，７９０，４４９号も参照）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ７４血清型は、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５：４５（２００７）に記載される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一ＡＡＶイントロンの差異的スプライシングにより（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７および２２２７において）連結された２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の生成をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連カプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）においてレビューされる。
【0008】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、サイレントかつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド形成および組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造キャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを置換することができるプロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと接触させる。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
ＤＭＤおよび他の筋ジストロフィーに苦しむ患者の機能改善には、遺伝子修復および線維症の減少の両方が必要である。ＤＭＤおよび他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を低減する方法が必要とされている。ｍｉＲ２９は、筋線維症を低減するための潜在的な遺伝子調節因子であり、理想的な候補である。
複数の研究は、筋肉内での長期（１．５年超）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉が高度に血管新生されるため、組換えＡＡＶ形質導入により、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるように、筋肉内注射後に体循環に導入遺伝子産物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞因子を有することを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現することができることを示す。
ＤＭＤおよび他の筋ジストロフィーに苦しむ患者の機能改善には、遺伝子修復および線維症の減少の両方が必要である。ＤＭＤおよび他の筋ジストロフィーのより効果的な治療のための遺伝子回復法で修復され得る線維症を低減する方法が必要とされている。ｍｉＲ２９は、筋線維症を低減するための潜在的な遺伝子調節因子であり、理想的な候補である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第７，２８２，１９９号明細書
【文献】米国特許第７，７９０，４４９号明細書
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８、１９８７
【文献】Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ。１０（２）：１６８－７５，１９９７
【文献】Ｓａｃｃｏら、Ｃｅｌｌ、２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１
【文献】Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７
【文献】Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７
【文献】Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１
【文献】Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１
【文献】Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ， ２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１
【文献】Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）
【文献】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）
【文献】Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４
【文献】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）
【発明の概要】
【0011】
本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ２９を送達することによって結合組織（コラーゲン１、コラーゲン３およびフィブロネクチン）の３つの主要成分を直接減少させる遺伝子治療法に関する。この系において、ｍｉＲ２９はコラーゲンおよびフィブロネクチン遺伝子の３’ＵＴＲに結合して発現をダウンレギュレーションする。本発明は、マイクロＲＮＡ ｍｉＲ２９のガイド鎖を発現する遺伝子治療ベクター、例えばＡＡＶ、および筋肉にｍｉＲ２９を送達して線維症を低減および／または予防する方法に関する。
【0012】
さらに、本発明は、ＤＭＤで観察される遺伝子欠損に対処するために、マイクロジストロフィンと共に線維症を抑制するためにｍｉＲ－２９を送達する遺伝子治療ベクターを用いて線維症を低減および予防する併用療法およびアプローチを提供する。実施例５～７に示されるように、併用治療は、線維症のより大きな減少、筋肉のサイズの増大および筋力の増加をもたらした。
【0013】
一実施形態において、本発明は、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３のｍｉＲ－２９ｃ標的ガイド鎖、配列番号４のｍｉＲ－２９ｃガイド鎖および天然ｍｉＲ－３０を含むヌクレオチド配列などのｍｉＲ２９ｃを発現するポリヌクレオチド配列を含むバックボーンおよびステムループ（配列番号５）。ｍｉＲ－３０バックボーン中のｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡを含む例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２（図１）として示される。
【0014】
本発明の例示的なｒＡＡＶは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｍｉｒ２９Ｃであり、ＣＭＶプロモーターはヌクレオチド１２０～５２６におよび、ＥＦ１ａイントロンはヌクレオチド９２７～１０８７およびヌクレオチド１３８０～１８５４におよび、ｍｉＲ－２９ｃのガイドスタンドはヌクレオチド１２５７～１２８４におよび、一次シード配列を有するｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ２９－ｃはヌクレオチド１０８８～１３７５におよび、ポリＡ配列はヌクレオチド１８９６～２０９１に及ぶ。一態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３である。
【0015】
本発明の別の例示的なｒＡＡＶは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むｐＡＡＶ．ＭＣＫ．Ｍｉｒ２９Ｃであり；ＭＣＫエンハンサーはヌクレオチド１９０－３９５に、ＭＨＣプロモーターはヌクレオチド３９６－７５３に、ＥＦ１ａイントロンはヌクレオチド１１５５－１３１５に、ヌクレオチド１６０９－２０８３に、ｍｉＲ－２９ｃのガイドスタンドはヌクレオチド１４８７－１５１２に、そしてｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ２９一次シード配列を有する－ｃはヌクレオチド１３１６－１６０８におよびポリＡ配列はヌクレオチド２０９４－２１４６にまたがる。一態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３である。
【0016】
別の態様では、本発明のｒＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのユビキタスプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、筋特異的制御要素は、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（短縮ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７（ＭＨＣ及びＭＣＫのハイブリッドバージョン）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。
【0017】
例えば、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかは、配列番号１０のＭＨＣエンハンサーヌクレオチド配列および／または配列番号１１のＭＨＣプロモーター配列を含む筋特異的制御要素に作動可能に連結される。さらに、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかは、配列番号１３のＭＨＣＫ７エンハンサーヌクレオチド配列を含む筋特異的制御要素に作動可能に連結される。
【0018】
本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（または、本明細書では単に「組成物」と称する）を提供する。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、本発明の任意のｒＡＡＶベクターでトランスフェクトされた細胞を培養し、トランスフェクトされた細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することを含む、ｒＡＡＶベクター粒子を産生する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子を提供する。
【0020】
本発明はまた、宿主細胞を本発明のｍｉＲ－２９を発現する組換えＡＡＶベクターで感染させることと、宿主細胞中に成熟ｍｉＲ－２９を発現させることとを含む、成熟ｍｉＲ－２９ヌクレオチド配列の産生方法を提供する。
【0021】
別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ－２９を発現する本発明の任意のｒＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、必要とする被験体の線維症を低減する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーに罹患している線維症を低減するために投与され、特に、骨格筋または心筋の線維症を低減する。これらの方法は、ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンを投与する工程をさらに含み得る。
【0022】
本発明の方法、組成物および使用のいずれに関しても、「筋ジストロフィー」という用語は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、ジスフェリン関連筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー型２Ｌまたは三好型ミオパチー３型を含む肢帯型筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、カルパイノパチー、デスミンミオパチー、ディスファーリノパシー、ジストロフィン異常症、筋原線維性ミオパチー、サルコグリカン異常症、先天性筋ジストロフィー、前脛骨筋ミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、またはＺＡＳＰ関連筋ジストロフィーであり得る。
【0023】
「線維症」とは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過剰または未制御沈着ならびに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、および膵臓を含む損傷後の組織における異常な修復プロセスを指す。寄託されるＥＣＭ成分には、フィブロネクチンおよびコラーゲン、例えばコラーゲン１、コラーゲン２またはコラーゲン３が含まれる。
【0024】
別の実施形態では、本発明は、ｍｉＲ－２９を発現する本発明の任意の組換えＡＡＶベクターの治療上有効な量を投与することを含む、必要とする対象における線維症を予防する方法を提供する。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかは、筋ジストロフィーに罹患している線維症を予防するために投与され、例えば、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶは、線維症が対象において観察される前に投与される。さらに、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶは、ジストロフィン異常症または筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーに罹患しているかまたは診断されたもののような線維症を発症するリスクのある対象に投与される。本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィーに罹患している被験体に、これら被験体における新たな線維症を予防するために投与される。これらの方法は、ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンを投与する工程をさらに含み得る。
【0025】
本発明はまた、筋ジストロフィーに罹患している被験体の筋力および／または筋肉量を増加させる方法であって、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む方法を提供する。これらの方法は、ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンを投与する工程をさらに含み得る。
【0026】
「併用療法」および「併用療法」という用語は、ｍｉＲ－２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターおよびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターの投与を指す。
【0027】
本発明の方法のいずれにおいても、対象は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している可能性がある。
【0028】
本発明のｍｉＲ－２９ｃを発現するｒＡＡＶを投与する工程をさらに含む、本発明の前述の方法のいずれかは、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを投与するさらなる工程を含み得る。マイクロジストロフィンタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。この方法は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを投与する工程を含み得る。
【0029】
本発明の例示的なｒＡＡＶ発現微小ジストロフィンは、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、図１０および１１に示されるｐＡＡＶ．ｍｃｋ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンである。このｒＡＡＶベクターは、ＭＣＫプロモーター、キメライントロン配列、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、アンピシリン耐性およびｐＢＲ３２２起点または複製を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。一態様では、本発明の組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２またはＡＡＶ１３である。
【0030】
本方法は、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％のマイクロジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターにより実施され、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、タンパク質はミクロジストロフィン活性を保持する。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋肉収縮中に筋膜に安定性を提供し、例えば、マイクロジストロフィンは、筋肉収縮中にショックアブソーバーとして働く。
【0031】
本方法は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターにより実施され、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにより典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、機能的マイクロジストロフィンをコードする。
【0032】
本発明の方法は、ストリンジェントな条件下で配列番号７の核酸配列またはその相補体にハイブリダイズし、機能性マイクロジストロフィンをコードするヌクレオチド配列を含むマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターにより実施される。
【0033】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、及びホルムアミド等の変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤等）も使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度に影響が及ぼされるであろう。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが懸念される例では、追加の例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴ）、４８℃（１７塩基オリゴ）、５５℃（２０塩基オリゴ）、及び６０℃（２３塩基オリゴ）での６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【0034】
非特異的及び／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減する目的のために、他の薬剤がハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に含まれ得る。例には、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル－ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランがあるが、他の好適な薬剤を使用することもできる。これらの添加物の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとほぼ無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい。ハイブリダイゼーション条件は、これらの可変物を適応し、かつ異なる配列関連性を有するＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために、当業者によって調整され得る。
【0035】
別の態様では、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターは、筋特異的制御要素に作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む。例えば、筋特異的制御エレメントは、ヒト骨格アクチン遺伝子エレメント、心臓アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ｔＭＣＫ（トランケートＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、ネズミクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格ファーストツイッチトロポニンＣ遺伝子エレメント、スローツイッチ心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、スローツイッチトロポニンＩ遺伝子エレメント、ｈｙｐｏｚｉａ誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメントまたはグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）である。
【0036】
ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターおよびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを投与する方法において、これらのｒＡＡＶベクターは、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶの直前に投与されたｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターと同時に投与され得るか、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶの直後に、ｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを連続して投与され得る。あるいは、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後の約１～５時間もしくは５～１２時間もしくは１２～１５時間もしくは１５～２４時間以内に投与される本発明の方法が実施され、またはマイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与前の約１～５時間もしくは５～１２時間もしくは１２～１５時間もしくは１５～２４時間以内に投与される本発明の方法が実施される。あるいは、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与後の約１もしくは６もしくは１２もしくは２４時間以内に投与される本発明の方法が実施され、またはマイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターがｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶの投与前の約１もしくは６もしくは１２もしくは２４時間以内に投与される本発明の方法が実施される。
【0037】
本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかを、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーと診断された患者に、対象において線維症が観察される前に、または対象において筋力が低下する前に、または対象において筋肉量が減少する前に投与することを企図する。
【0038】
本発明はまた、本発明のｒＡＡＶのいずれかを、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患し、既に線維症を発症している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために投与することも企図する。本発明はまた、既に筋力が低下している筋ジストロフィーに罹患している患者に、またはさらなる損傷から筋肉を保護するために筋肉量を減少させた患者に、本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与することを提供する。
【0039】
本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶベクターは、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される。
【0040】
さらに、本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は全身投与される。例えば、ｒＡＡＶベクターまたは組成物は、注射、注入または移植による非経口投与である。
【0041】
別の実施形態では、本発明は、必要とする対象において線維症を低減するための、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターも含む。例えば、この組成物は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む。
【0042】
さらに、本発明は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患した患者における線維症を予防するためのｍｉＲ２９を発現する組換えＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターも含む。例えば、この組成物は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むｒＡＡＶを含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。
【0043】
本発明はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象において筋力および／または筋肉量を増加させるための、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターも含む。例えば、この組成物は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む。
【0044】
さらなる実施形態では、本発明は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーの治療のための、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのうちのいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターも含む。例えば、この組成物は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む。
【0045】
本発明の組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に製剤化される。本発明の組成物はまた、注射、注入または移植による非経口投与などの全身投与のために製剤化される。さらに、組成物のいずれかは、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象への投与のために製剤化される。
【0046】
さらなる実施形態では、本発明は、必要とする対象において線維症を低減するための薬の調製のための、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの使用を提供する。例えば、対象は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患し、治療を必要としている。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターをさらに含む。例えば、この薬剤は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む。
【0047】
別の実施形態では、本発明は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象において線維症を予防するための、ｍｉＲ２９を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの使用の提供を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターをさらに含む。例えば、この薬剤は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを含む。
【0048】
さらに、本発明は、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力および／または筋肉量を増加させるための薬の調製のための、ｍｉＲ２９を発現する本発明の組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターをさらに含む。例えば、この薬剤は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む。
【0049】
本発明は、本発明のＡＡＶベクターのいずれかの、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーと診断された患者への、対象において線維症が観察される前、または対象において筋力が低下する前、または対象において筋肉量が減少する前の投与用の薬剤の調製のための使用を企図する。
【0050】
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターのいずれかの、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患し、既に線維症を発症している対象に、これらの対象において新たな線維症を予防するために本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与する投与用の薬剤の調製のための使用を企図する。本発明はまた、既に筋力が低下している筋ジストロフィーに罹患している患者に、またはさらなる損傷から筋肉を保護するために筋肉量を減少させた患者に、本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与することを提供する。
【0051】
本発明はまた、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーの治療用の薬の調製のための、ｍｉＲ２９６を発現する本発明のｒＡＡＶベクターの使用も提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターをさらに含む。例えば、この薬剤は、マイクロジストロフィン遺伝子のコード配列（配列番号７）を含むか、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶを含む。
【0052】
本発明の用途のいずれかにおいて、薬剤は、筋肉内注射のために製剤化される。さらに、薬剤のうちのいずれも、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、または任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなどのジストロフィン異常症または筋ジストロフィーに罹患している対象への投与のために調製され得る。
【0053】
さらに、本発明のいずれの薬剤も、ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶベクターおよびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶベクターを同時に投与するか、またはｒＡＡＶ発現の直前にｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターを連続して投与する併用療法であってもよいｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンの直後に投与されたｍｉＲ２９を発現するｒＡＡＶベクターで連続して投与される。あるいは、医薬は、ｒＡＡＶを発現するｍｉＲ－２９を投与してから約１－５時間以内に投与されたＡＡＶベクターを発現するＡＡＶベクターの投与を含むか、または約１～５時間以内に投与されるＡＡＶベクター発現マイクロジストロフィンを含む。ｍｉＲ－２９を発現するｒＡＡＶ。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクター。
（項目２）
ａ）配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列、または
ｄ）配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目３）
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である、項目１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目４）
前記ポリヌクレオチド配列が、筋特異的制御要素に作動可能に連結される、項目１～３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目５）
前記筋特異的制御要素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）である、項目４に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目６）
前記筋特異的制御要素が、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、項目４または５に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目７）
項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目８）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法。
（項目９）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減または予防する方法。
（項目１０）
治療有効量の項目１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している患者における線維症を予防する方法。
（項目１１）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量を増加させる方法。
（項目１２）
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは肢帯型筋ジストロフィーである、項目８～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射により投与される、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、全身投与される、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、注射、注入、または移植によって非経口投与される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物の組換えＡＡＶベクターが、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目８～１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
筋ジストロフィーの治療のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目１８）
筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減または予防するための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目１９）
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力を増加させるための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目２０）
静脈内注射用に製剤化される、項目１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２１）
全身投与用に製剤化される、項目１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２２）
注射、注入または移植による非経口投与のために製剤される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記組成物が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目１７～２２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２４）
筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２５）
必要がある対象における線維症の低減または予防用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２６）
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量の増加用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２７）
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、２４～２６のいずれか１項に記載の使用。
（項目２８）
前記薬剤が、筋肉内投与用に製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の使用。
（項目２９）
前記薬剤が、全身投与用に製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の使用。
（項目３０）
前記薬剤が、注射、注入または移植用に製剤化される、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
前記薬剤が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目２４～３０のいずれか１項に記載の使用。
（項目３２）
宿主細胞を項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターで感染させることと、前記宿主細胞において成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチド配列の産生方法。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクター。
（項目２）
ａ）配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列、または
ｄ）配列番号１２のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目３）
前記ベクターが、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはＡＡＶ１３である、項目１または２に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目４）
前記ポリヌクレオチド配列が、筋特異的制御要素に作動可能に連結される、項目１～３のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目５）
前記筋特異的制御要素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、短縮ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＭＨＣＫ７、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子要素、遅筋トロポニンＩ遺伝子要素、低酸素誘発性核因子、ステロイド誘発性要素、またはグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）である、項目４に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目６）
前記筋特異的制御要素が、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、項目４または５に記載の組換えＡＡＶベクター。
（項目７）
項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む、組成物。
（項目８）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法。
（項目９）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減または予防する方法。
（項目１０）
治療有効量の項目１～５のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目６に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している患者における線維症を予防する方法。
（項目１１）
治療有効量の項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物を投与することを含む、筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量を増加させる方法。
（項目１２）
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは肢帯型筋ジストロフィーである、項目８～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、筋肉内注射により投与される、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、全身投与される、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記組換えＡＡＶベクターまたは前記組成物が、注射、注入、または移植によって非経口投与される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物の組換えＡＡＶベクターが、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目８～１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
筋ジストロフィーの治療のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目１８）
筋ジストロフィーに罹患している対象における線維症を低減または予防するための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目１９）
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力を増加させるための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
（項目２０）
静脈内注射用に製剤化される、項目１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２１）
全身投与用に製剤化される、項目１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２２）
注射、注入または移植による非経口投与のために製剤される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）
前記組成物が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目１７～２２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２４）
筋ジストロフィーの治療用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２５）
必要がある対象における線維症の低減または予防用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２６）
筋ジストロフィーに罹患している対象における筋力または筋肉量の増加用の薬剤の調製のための、項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターまたは項目７に記載の組成物の使用。
（項目２７）
筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、２４～２６のいずれか１項に記載の使用。
（項目２８）
前記薬剤が、筋肉内投与用に製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の使用。
（項目２９）
前記薬剤が、全身投与用に製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の使用。
（項目３０）
前記薬剤が、注射、注入または移植用に製剤化される、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
前記薬剤が、前記対象において線維症が観察される前に、または前記対象において筋力が減少する前に、または前記対象において筋肉量が減少する前に投与される、項目２４～３０のいずれか１項に記載の使用。
（項目３２）
宿主細胞を項目１～６のいずれか１項に記載の組換えＡＡＶベクターで感染させることと、前記宿主細胞において成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、成熟ｍｉＲ－２９ポリヌクレオチド配列の産生方法。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】図１は、ｒＡＡＶベクターｓｃＡＡＶＣｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃならびに天然ｍｉＲ－３０骨格におけるｍｉＲ－２９ｃのヌクレオチド配列および予測ヘアピン構造のヌクレオチド配列の概略図を提供する。
【図6A】図６Ａ～６Ｄは、コラーゲン１アルファ（パネルＡ）、コラーゲン３アルファ（パネルＢ）、フィブロネクチン（パネルＣ）、およびＴＧＦ－β（パネルＤ）によって測定されるように、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの筋肉内注射がｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて細胞外マトリックス（ＥＣＮ）を阻害することを示す。
【図6B】図６Ａ～６Ｄは、コラーゲン１アルファ（パネルＡ）、コラーゲン３アルファ（パネルＢ）、フィブロネクチン（パネルＣ）、およびＴＧＦ－β（パネルＤ）によって測定されるように、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの筋肉内注射がｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて細胞外マトリックス（ＥＣＮ）を阻害することを示す。
【図6C】図６Ａ～６Ｄは、コラーゲン１アルファ（パネルＡ）、コラーゲン３アルファ（パネルＢ）、フィブロネクチン（パネルＣ）、およびＴＧＦ－β（パネルＤ）によって測定されるように、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの筋肉内注射がｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて細胞外マトリックス（ＥＣＮ）を阻害することを示す。
【図6D】図６Ａ～６Ｄは、コラーゲン１アルファ（パネルＡ）、コラーゲン３アルファ（パネルＢ）、フィブロネクチン（パネルＣ）、およびＴＧＦ－β（パネルＤ）によって測定されるように、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの筋肉内注射がｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて細胞外マトリックス（ＥＣＮ）を阻害することを示す。
【図8】図８は、ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用が３ヶ月齢で治療されたマウスにおいて筋肉サイズを増加させることを示す。コラーゲンを染色するためにｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色された処理および未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－腓腹筋の切片を示す。線維性領域はピンク色で無傷の筋肉は緑色である。巨視的なレベルでは、ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用は線維症を減少させ、総断面積を増加させる。
【図9A】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図9B】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図9C】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図9D】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図9E】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図9F】図９Ａ～Ｆは、マイクロジストロフィンと共に同時送達されたｍｉＲ－２９ｃでの治療が、単独で注射されたいずれか一方と比較して、注射された腓腹筋の全重量の増加（パネルＡ）、平均線維サイズの増加の増加（パネルＢ）、筋肉の断面積の増加（パネルＤ、未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）、および筋線維数の増加（パネルＥ）によって示されるように、筋肥大および過形成を増加させたが、単位面積当たりの筋線維の数は影響を受けなかった（パネルＦ）ことを実証する。パネルＣは、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した
【図10A】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10B】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10C】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10D】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10E】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10F】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図10G】図１０Ａ～Ｇは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは、１２匹から取り出した４～５週齢で注射したマウスの野生型、非注射、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ、ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン、およびＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を示す注入後数週間。パネルＢは、同時処置された筋肉を示すピクロシラス・レッド染色の定量化を提供し、注射されていないＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンが５１．１％減少した。パネルＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲが、処置されたコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認することを実証する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理したコラーゲンＩおよびＩＩＩ（パネルｄ、ｅ）、ｆｂｎ（パネルｆ）およびＴＧＦ－β１（パネルｇ）レベルの有意な減少を示す対側肢および各治療法と比較して、筋肉は、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝５（ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｓｓＡＡＶｒｈ．７４。ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝６（ｓｓＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝９（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図11】図１１は、早期併用療法が力を回復させ、収縮誘発性損傷に対して保護することを実証する。３つの処置注入ＧＡＳ筋肉のすべてにおける強縮後の絶対値（パネルＡ）および正規化比力（パネルｂ）の測定値は、未処置のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉（パネルＣ）と比較して有意に増加した。次いで、筋肉を、繰返し遠心性収縮後の力の損失について評価した。ｍｉＲ－２９ｃ ／マイクロジストロフィンおよびマイクロジストロフィン単独で同時処置したマウスのみが、未処置のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－筋肉（青色）と比較して力の損失からの保護を示した。分散の二元分析は、減衰曲線における有意性を実証する。エラーバー、ｎ＝５（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ）、ｎ＝６（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫマイクロジストロフィン）、ｎ＝５（ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン）、ｎ＝１５（ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス）。一元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図12】図１２は、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療が１ヶ月齢で治療されたマウスにおいて筋肉サイズを増加させることを示す。処理および未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋肉を切片化し、ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色してコラーゲンを染色した。線維性領域はピンク色で無傷の筋肉は緑色である。巨視的レベルでは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンの組合せは線維症を減少させ、総断面積を増加させる。
【図13A】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13B】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13C】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13D】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13E】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13F】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図13G】図１３Ａ～１３Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療（４～５週）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのにより有効であることを示す。パネルＡは注射後１２週間に取り出した４～５週齢で注射したマウスの非注射およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。元の倍率、２０倍パネルＢは、併用治療された筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示す、ピクロシリウスレッド染色の定量化を提供する。パネルＣは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）およびコラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎで処理した筋肉を、対側四肢治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14A】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14B】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14C】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14D】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14E】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14F】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図14G】図１４Ａ～１４Ｇは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法による後期治療（１２週での治療）が線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効であることを示す。パネルＡは、注射１２週間後の未処置のＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンのピクロシラス・レッド染色を提供する。オリジナルの倍率ｘ２０。パネルＢは、共処理された筋肉が未処理ＧＡＳ筋肉と比較してコラーゲンの３０．３％の減少を有することを示すピクロシラス・レッド染色の定量を提供する。パネルＣは、処置したコホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認するｑＲＴ－ＰＣＲを提供する。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃにおけるコラーゲン１Ａ（Ｃｏｌ１Ａ；パネルＤ）、コラーゲン３Ａ（Ｃｏｌ３Ａ；パネルＥ）、フィブロネクチン（Ｆｂｎ；パネルＦ）およびＴｇｆβ１（パネルＧ）／ＡＡＶ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン処理した筋肉を対側肢と比較した。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図15A】図１５Ａ～１５Ｃは、早期併用療法（４～５週での治療）が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対値（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定は、ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。（Ｃ）その後、筋肉は反復的な遠心性収縮の後に力の損失について評価された。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療およびマイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉（赤色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図15B】図１５Ａ～１５Ｃは、早期併用療法（４～５週での治療）が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対値（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定は、ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。（Ｃ）その後、筋肉は反復的な遠心性収縮の後に力の損失について評価された。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療およびマイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉（赤色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図15C】図１５Ａ～１５Ｃは、早期併用療法（４～５週での治療）が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対値（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定は、ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。（Ｃ）その後、筋肉は反復的な遠心性収縮の後に力の損失について評価された。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療およびマイクロジストロフィンで単剤治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉（赤色）と比較して力の喪失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。すべてのデータは平均±ＳＥＭ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図16A】図１６Ａ～１６Ｃは、後期併用療法が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶ発現微小ジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。パネルＣでは、反復的な遠心性収縮後の力の損失について筋肉を評価した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンで共処理したマウスは、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－筋肉（赤色）と比較して力の損失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。全てのデータは、平均±ＳＥＭ（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図16B】図１６Ａ～１６Ｃは、後期併用療法が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶ発現微小ジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。パネルＣでは、反復的な遠心性収縮後の力の損失について筋肉を評価した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンで共処理したマウスは、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－筋肉（赤色）と比較して力の損失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。全てのデータは、平均±ＳＥＭ（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図16C】図１６Ａ～１６Ｃは、後期併用療法が力を回復し、収縮誘発性損傷に対して保護したことを実証する。強縮後の絶対（パネルＡ）および正規化比力（パネルＢ）の測定ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶ発現微小ジストロフィン注入ＧＡＳ筋肉は、未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。パネルＣでは、反復的な遠心性収縮後の力の損失について筋肉を評価した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンで共処理したマウスは、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－筋肉（赤色）と比較して力の損失からの保護を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ。全てのデータは、平均±ＳＥＭ（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を表す。
【図17A】図１７Ａ～１７Ｄは、併用治療が注射の３ヶ月後に筋肥大を増加させることを示す。パネルＡはｒＡＡＶを示す。ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンと同時送達されたＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃは、注入されたＧＡＳの全重量を増加させることができなかった。パネルＢは、マイクロジストロフィン組合せ処理を発現するｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶが平均繊維サイズの増加を誘導したことを示す。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２８．９６～３６．０３μｍに増加した。パネルＣは、同時送達が野生型繊維サイズ分布にシフトしたことを示している。パネルＤは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数が、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかったことを提供した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図17B】図１７Ａ～１７Ｄは、併用治療が注射の３ヶ月後に筋肥大を増加させることを示す。パネルＡはｒＡＡＶを示す。ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンと同時送達されたＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃは、注入されたＧＡＳの全重量を増加させることができなかった。パネルＢは、マイクロジストロフィン組合せ処理を発現するｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶが平均繊維サイズの増加を誘導したことを示す。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２８．９６～３６．０３μｍに増加した。パネルＣは、同時送達が野生型繊維サイズ分布にシフトしたことを示している。パネルＤは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数が、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかったことを提供した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図17C】図１７Ａ～１７Ｄは、併用治療が注射の３ヶ月後に筋肥大を増加させることを示す。パネルＡはｒＡＡＶを示す。ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンと同時送達されたＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃは、注入されたＧＡＳの全重量を増加させることができなかった。パネルＢは、マイクロジストロフィン組合せ処理を発現するｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶが平均繊維サイズの増加を誘導したことを示す。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２８．９６～３６．０３μｍに増加した。パネルＣは、同時送達が野生型繊維サイズ分布にシフトしたことを示している。パネルＤは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数が、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかったことを提供した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図17D】図１７Ａ～１７Ｄは、併用治療が注射の３ヶ月後に筋肥大を増加させることを示す。パネルＡはｒＡＡＶを示す。ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンと同時送達されたＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃは、注入されたＧＡＳの全重量を増加させることができなかった。パネルＢは、マイクロジストロフィン組合せ処理を発現するｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶが平均繊維サイズの増加を誘導したことを示す。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較し、平均直径は２８．９６～３６．０３μｍに増加した。パネルＣは、同時送達が野生型繊維サイズ分布にシフトしたことを示している。パネルＤは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数が、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかったことを提供した（＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図18A】図１８Ａ～１８Ｂは、ｍｉＲ－２９ｃの成熟ガイド鎖（ヌクレオチド１２５７～１２８４）および天然ｍｉ－３０骨格（ヌクレオチド１０８８～１３７５）を含む例示的なｒＡＡＶベクターの核酸配列（配列番号１ ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｍｉｒ２９Ｃ）を提供する。構築物はまた、ＣＭＶプロモーター（ヌクレオチド１２０－５２６）、ヌクレオチド９２７－１０８７および１３８０－１８５４に２つのＥＦ１ａイントロン、およびヌクレオチド１８９６－２０９１にｐｏｌＡを含む。
【図18B】図１８Ａ～１８Ｂは、ｍｉＲ－２９ｃの成熟ガイド鎖（ヌクレオチド１２５７～１２８４）および天然ｍｉ－３０骨格（ヌクレオチド１０８８～１３７５）を含む例示的なｒＡＡＶベクターの核酸配列（配列番号１ ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．Ｍｉｒ２９Ｃ）を提供する。構築物はまた、ＣＭＶプロモーター（ヌクレオチド１２０－５２６）、ヌクレオチド９２７－１０８７および１３８０－１８５４に２つのＥＦ１ａイントロン、およびヌクレオチド１８９６－２０９１にｐｏｌＡを含む。
【図22A】図２２は、ｍｉＲ－２９ｃの成熟ガイド鎖（ヌクレオチド１４８７～１５１２）および天然ｍｉ－３０骨格（ヌクレオチド１０８８～１３７５）を含む例示的なｒＡＡＶベクターのヌクレオチド配列（配列番号１２ ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．Ｍｉｒ２９Ｃ）を提供する。構築物はまた、ＭＣＫエンハンサー（ヌクレオチド１９０－３９５）、ＭＣＫプロモーター（ヌクレオチド３９６－７５３）、ヌクレオチド１１５５－１３１５および１６０９－２０８３における２つのＥＦ１ａイントロン、およびヌクレオチド２０９４－２１４８でのｐｏｌＡを含む。
【発明を実施するための形態】
【0055】
本発明は、遺伝子治療ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、ｍｉＲ－２９マイクロＲＮＡを過剰発現する方法、および筋ジストロフィー患者の線維症を低減および予防する方法を提供する。本発明はまた、ＤＭＤ患者において欠失されたマイクロジストロフィンを発現する遺伝子治療ベクターと組み合わせて、ｍｉＲ－２９を発現する遺伝子治療ベクターを投与することを含む、組み合わせ遺伝子治療法を提供する。
【0056】
ＤＭＤの初期診断時に採取された筋肉生検では、顕著な結合組織の増殖が認められる。筋線維症は複数の点で有害である。これは、結合組織の障壁を介してｅｎｄｏｍｙｓｉａｌ栄養素の正常な通過を減少させ、血流を減少させ、血管由来の栄養成分の筋肉を奪い、機能的に四肢の拘縮による歩行の早期消失に寄与する。時間の経過とともに、筋肉の著しい線維化の結果として治療上の挑戦が増えます。これは、連続した時点での結合組織増殖を比較する筋肉生検で観察することができる。このプロセスは、特に車椅子に依存している患者の場合、歩行の喪失および制御不能の加速をもたらす悪化を続けている。
【0057】
線維症を減少させるための平行したアプローチがなければ、エキソンスキッピング、ストップコドンリードスルー、または遺伝子置換療法の利点が完全に達成されることはまずありません。小分子またはタンパク質置換戦略でさえ、筋線維症を減少させるアプローチなしでは失敗する可能性が高い。ＡＡＶマイクロジストロフィンで治療された既存の線維症を有する老齢のｍｄｘマウスにおける以前の研究は、完全な機能回復を達成できなかったことを示した（Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２， ４９２９－４９３７（２０１３））。ＤＭＤ心筋症の進行には、心室壁の瘢痕化および線維化が伴うことも知られている。マイクロＲＮＡ送達は、免疫障壁の欠如および比較的容易な送達のために特に革新的である。マイクロＲＮＡは小さく（約２００ｂｐ）、遺伝子欠損を修正またはバイパスする治療用カセットと共にＡＡＶにパッケージングすることができます。
【0058】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型が１３存在する。ＡＡＶの一般的な情報及び概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的及び機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った遺伝子型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
【0059】
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（またはトランス遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染ウイルス粒子に複製及びパッケージングされ得る。
【0060】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達されるトランス遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
【0061】
ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶを含むがこれらに限定されない組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－偽型ｒＡＡＶの産生は、例えばＷＯ ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景部分に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶを含むがこれらに限定されない組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２およびＡＡＶ－偽型ｒＡＡＶの産生は、例えばＷＯ ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景部分に記載されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
【0062】
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＤＮＡプラスミドをＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）での感染が許容される細胞に移す。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型であり得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が挙げられるが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、国際公開第０１／８３６９２号に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0063】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）等の手法によって細菌プラスミドに導入されている。その後、パッケージング細胞株は、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【0064】
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【0065】
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）等の安定して形質転換された癌細胞であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低通路２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【0066】
本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く、すなわち、ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡは存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築されてもよいｒＡＡＶの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0067】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準の方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている方法が含まれる。
【0068】
別の実施形態では、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む。組成物はまた、希釈剤およびアジュバントなどの他の成分を含んでもよい。許容される担体、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、使用される用量および濃度で不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩または他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、プルロニックまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【0069】
本発明の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的される個体、及び細胞型（複数可）に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。
【0070】
インビボまたはインビトロでのｒＡＡＶで標的細胞を形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数回用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する用量であり、疾患／疾病状態への進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患／疾病状態の進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的または完全な）をもたらす用量であり、及び／または生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防または治療のために企図される疾患の例は、ＦＳＨＤである。
【0071】
併用療法も本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせには、同時治療及び逐次治療の両方が含まれる。新規の療法との併用等の本発明の方法と標準の医療処置（例えば、コルチコステロイド）との併用が特に企図される。
【0072】
本組成物の有効用量の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣内を含むが、これらに限定されない当該技術分野で標準の経路により得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特にＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、感染および感染を考慮して当業者により選択および／または適合され得るまたはｍｉＲ－２９ ｍｉＲＮＡおよび／またはマイクロジストロフィンを発現する標的細胞／組織（単数または複数）を処置するための方法を提供する。
【0073】
本発明は、有効量のｒＡＡＶおよび本発明の併用療法を含む本発明の組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与は、体全体が影響を受けるように循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を通した吸収のような経腸投与及び注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。
【0074】
具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。
【0075】
本明細書に開示される方法において投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、治療目標、個体、および標的とされる細胞のタイプに依存して変化し、当技術分野で標準的な方法である。投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、または約１×１０１５以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。用量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）（すなわち、１ｘ１０７ｖｇ、１ｘ１０８ｖｇ、１ｘ１０９ｖｇ、１ｘ１０１０ｖｇ、１ｘ１０１１ｖｇ、１ｘ１０１２ｖｇ、１ｘ１０１３ｖｇ、１ｘ１０１４ｖｇ、１ｘ１０１５それぞれ）。用量はまた、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）（すなわち、１ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶを滴定する方法は、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。
【0076】
具体的には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本発明による投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、及び／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体または他の成分に対する既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物がｒＡＡＶとの通常の方法で避けられるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉等の目的とする特定の標的組織を標的とするように修飾され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製され得る。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が以前に開発されており、本発明を実施する際に使用され得る。ｒＡＡＶは、投与及び取扱い易くするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用され得る。
【0077】
筋肉内注射の目的のために、例えば、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る。かかる水溶液は、所望の場合、緩衝され、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースで等張性にする。遊離酸としてのｒＡＡＶ溶液（ＤＮＡが酸性リン酸基を含有する）または薬理学的に許容される塩は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合された水中で調製され得る。ｒＡＡＶ分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中でも調製され得る。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止するために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準の技法によって容易に得ることが可能である。
【0078】
注射用に適した医薬担体、希釈剤または賦形剤としては、滅菌水性溶液または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の保護は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【0079】
注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、必要量のｒＡＡＶを、上に列挙される様々な他の成分を有する適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、滅菌活性成分を、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を産生する、真空乾燥及びフリーズドライ技法である。
【0080】
ｒＡＡＶでの形質導入もインビトロで行われ得る。一実施形態では、所望の標的筋細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種筋細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種筋細胞が使用され得る。
【0081】
対象への形質導入細胞の形質導入及び再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地中でｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技法を使用して目的とするＤＮＡを持つ細胞についてスクリーニングすることによって、または選択可能なマーカーを使用することによってインビトロで形質導入され得る。その後、形質導入された細胞は、薬学的組成物に製剤化され得、この組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射等の様々な技法によって、または例えばカテーテルを使用して、平滑心筋に注射することによって対象に導入される。
【0082】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ｍｉＲ－２９またはマイクロジストロフィンの持続的な発現をもたらす。したがって、本発明は、ｍｉＲ－２９および／またはマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本発明の１つまたは複数のｒＡＡＶと組織（筋肉などの組織、肝臓および脳などの組織、唾液腺などの腺を含むが、これに限定されない）を形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、本発明の一実施形態は、これらに限定されないが、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリー、例えばｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格筋アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］、及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素に由来する制御要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心臓トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘発性核内因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘発性要素、及びグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい）、ならびに他の制御要素を含む、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供する。
【0083】
筋組織は、重要な器官ではなく、アクセスが容易であるため、インビボＤＮＡ送達のための魅力的な標的である。本発明は、形質導入筋原線維由来のｍｉＲＮＡの持続発現を企図する。
【0084】
「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織由来の、例えば、骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。かかる筋細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の分化または未分化のものであり得る。
【0085】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるｍｉＲ２９またはマイクロジストロフィンの発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介するインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのｍｉｉＲ２９ガイド鎖またはマイクロジストロフィンのコード領域の投与／送達を指すために使用される。
【0086】
したがって、本発明は、ｍｉＲ２９および／または微小ジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（または用量、本質的に同時に投与するか、または間隔をあけて投与する用量）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【実施例】
【0087】
実施例１
デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルの確認
ｍｄｘマウスは、ＤＭＤ病因を研究するための便利であるがまだ不完全な動物モデルを提供する。このモデルは、ｍｄｘマウスとユートロフィン遺伝子のヘテロ接合型ノックアウトとの交配（ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－）であり、増加した線維症を呈し、ヒトＤＭＤの病理をより忠実に再現する。Ｍｄｘマウスは、比較的軽度の表現型およびほぼ正常な寿命をもたらすＤＭＤのエクソン２３にナンセンス変異を有する。３週齢までに、ｍｄｘマウスの横隔膜および四肢筋肉は、内腔内炎症の徴候を発現する。これらの症状は、マウスが成人期に達した後に四肢筋肉に陥り、一方、横隔膜筋肉の炎症は徐々に悪化し続ける。テロメラーゼを欠くｍｄｘマウスでは、筋ジストロフィーは年齢と共に次第に悪化する。ユートロフィン（ＤＫＯ）を欠くｍｄｘマウスは、早期発症筋力低下、重度の線維症および早期死を伴うヒトＤＭＤのより特徴的な表現型を有する。ジストロフィンの常染色体パラログであるウトロフィンは、二重ＫＯ（ジストロフィン＋ユートロフィン）のｍｄｘマウスにおけるジストロフィンの欠如を補う高度の配列相同性を共有する。早期死亡を伴う重度の表現型が観察される。ＤＫＯマウスの早すぎる死は炎症および線維症の進行を妨げるが、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－マウスは線維症の顕著な程度を示すヒト疾患と類似のモデルを提示し、ＤＫＯよりも生存期間が長く、より良い我々の提案する翻訳研究のためのモデル。最近の報告では、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－マウスの使用がＤＭＤとの関連で線維症を研究する理想的なモデルであることが確認されています。本研究では、シリウスレッド染色で測定した線維化の増加は、コラーゲン転写産物レベルの増加およびｍｉｒ２９ｃレベルの減少を伴う。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルの確認
ｍｄｘマウスは、ＤＭＤ病因を研究するための便利であるがまだ不完全な動物モデルを提供する。このモデルは、ｍｄｘマウスとユートロフィン遺伝子のヘテロ接合型ノックアウトとの交配（ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－）であり、増加した線維症を呈し、ヒトＤＭＤの病理をより忠実に再現する。Ｍｄｘマウスは、比較的軽度の表現型およびほぼ正常な寿命をもたらすＤＭＤのエクソン２３にナンセンス変異を有する。３週齢までに、ｍｄｘマウスの横隔膜および四肢筋肉は、内腔内炎症の徴候を発現する。これらの症状は、マウスが成人期に達した後に四肢筋肉に陥り、一方、横隔膜筋肉の炎症は徐々に悪化し続ける。テロメラーゼを欠くｍｄｘマウスでは、筋ジストロフィーは年齢と共に次第に悪化する。ユートロフィン（ＤＫＯ）を欠くｍｄｘマウスは、早期発症筋力低下、重度の線維症および早期死を伴うヒトＤＭＤのより特徴的な表現型を有する。ジストロフィンの常染色体パラログであるウトロフィンは、二重ＫＯ（ジストロフィン＋ユートロフィン）のｍｄｘマウスにおけるジストロフィンの欠如を補う高度の配列相同性を共有する。早期死亡を伴う重度の表現型が観察される。ＤＫＯマウスの早すぎる死は炎症および線維症の進行を妨げるが、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－マウスは線維症の顕著な程度を示すヒト疾患と類似のモデルを提示し、ＤＫＯよりも生存期間が長く、より良い我々の提案する翻訳研究のためのモデル。最近の報告では、ｍｄｘ：ｕｔｒｎ＋／－マウスの使用がＤＭＤとの関連で線維症を研究する理想的なモデルであることが確認されています。本研究では、シリウスレッド染色で測定した線維化の増加は、コラーゲン転写産物レベルの増加およびｍｉｒ２９ｃレベルの減少を伴う。
【0088】
実施例２
ＤＭＤマウスへのｍｉＲ２９の送達は線維症を低減する
予備研究は、ヒトＤＭＤ患者およびｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、コラーゲンについてのシリウスレッド染色の有意な増加およびｍｉＲ－２９ｃレベルの減少があることを実証している。筋肉特異的ＡＡＶベクターを用いたｍｉＲ－２９の遺伝子送達は、潜在的に安全かつ効率的である。本明細書においてｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃと称するｒＡＡＶベクターを生成するために、２２ヌクレオチドのｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３およびガイド鎖配列番号４）を、ｍｉＲ－３０スカフォールドにクローニングした。ＣＭＶプロモーター。発現カセット（配列番号２）を自己相補的ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ．７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループおよびｍｉＲ－３０ｃガイド（アンチセンス）鎖をｍｉＲ－３０骨格に含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基が改変された。次いで、この配列を、ＣＭＶプロモーターおよびポリＡ配列によって駆動される自己相補的ＡＡＶ ＩＴＲ含有プラスミドにクローニングした。
ＤＭＤマウスへのｍｉＲ２９の送達は線維症を低減する
予備研究は、ヒトＤＭＤ患者およびｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、コラーゲンについてのシリウスレッド染色の有意な増加およびｍｉＲ－２９ｃレベルの減少があることを実証している。筋肉特異的ＡＡＶベクターを用いたｍｉＲ－２９の遺伝子送達は、潜在的に安全かつ効率的である。本明細書においてｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃと称するｒＡＡＶベクターを生成するために、２２ヌクレオチドのｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３およびガイド鎖配列番号４）を、ｍｉＲ－３０スカフォールドにクローニングした。ＣＭＶプロモーター。発現カセット（配列番号２）を自己相補的ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ．７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループおよびｍｉＲ－３０ｃガイド（アンチセンス）鎖をｍｉＲ－３０骨格に含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基が改変された。次いで、この配列を、ＣＭＶプロモーターおよびポリＡ配列によって駆動される自己相補的ＡＡＶ ＩＴＲ含有プラスミドにクローニングした。
【0089】
図１に示すように、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するｍｉＲ－３０ステムループバックボーンにｍｉｒ２９ｃ ｃＤＮＡを含む。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにキャプシドされたのはこの配列である。さらに、ｍｉＲ－２９ｃ標的配列を有するいくつかのヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ（ｌｕｃ）におけるように、この部位でワトソン－クリル対合を模倣するように変更された。ＳｈＲＮＡ－ｌｕｃデザインによれば、ヘアピンはその長さ全体にわたって完全に相補的でなければならない。さらに、パッセンジャー鎖の変化が増えるほど、ｍｉＲ－２９プロセシングを制御する内在性機構がなくなり、ｍｉＲＮＡを幹細胞から認識することが可能になります。ガイド鎖の１９番目の塩基をシトシンに改変し、天然ｍｉ－２９ｃ配列の切断部位に先行するヌクレオチドを模倣し、他方の鎖上の対応する塩基を変更して対形成を維持した。
【0090】
遺伝子療法ベクターｓｃｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃ（１×１０１１ｖｇ）を３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスの四頭筋に注射した。四頭筋をシリウスレッド染色により注射の３ヶ月後に分析し、Ｎｅｖｏ ｅｔ ａｌ．（ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，６：ｅ１８０４９（２０１１））に記載されているようにＮＩＨ ＩｍａｇｅＪフトウェアにより分析した。ＭｉＲ２９ｃ、コラーゲンおよびエラスチンレベルをＲＴ－ＰＣＲによって定量した。若齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスへのｍｉＲ－２９ｃの送達は、６ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス（注射の３ヶ月後）の四頭筋において、ｍｉｒ－２９ｃレベルを有意に増加させ、シリウスレッド染色を有意に減少させる。ＲＴ－ＰＣＲによって評価した場合、処置された筋肉におけるコラーゲンおよびエラスチンレベルの減少があった。
【0091】
ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスおよびジストロフィン欠損患者において、線維症の増加およびｍｉＲ２９発現の減少の実証は、マウスモデルがヒト疾患を代表するものであることを立証する。抗線維化療法としてＡＡＶで送達されたｍｉＲ２９を使用した初期の結果は、線維症の重要な要因である、シリウスレッド染色およびコラーゲンおよびエラスチンレベルの減少に有意な有益な効果があることを示唆している。
【0092】
実施例３
ＭｉＲ－２９ｃの注射はコラーゲンを減少させ、ｍｉＲ－２９ｃを回復させる
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃが線維症を減少させることができるかどうかを判定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－マウスに、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃを左腓腹筋に５×１０１１ｖｇｓで筋肉内注射した（ＧＡＳ）筋肉。注射後１２週目にマウスを分析した。ピクロシリウスレッド染色は、未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較して、ＧＡＳ筋（図２ａ）全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少を明らかにした。ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ赤色染色の定量化は、治療された筋肉が未処理の筋肉（処置－２３．３％±１．３対未処置－２９．５％±０．７）と比較して、コラーゲンの１８．３％の減少を有することを示す（図２ｂ）。被治療筋肉におけるｍｉＲ－２９ｃの過剰発現を確認するために、２４週齢のＷＴ、ｍｉＲ－２９ｃ治療マウス、およびｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスからのＧＡＳ筋から全ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ－２９ｃ発現についての定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析に供した。結果は、未治療マウスと比較して、被治療マウスのＧＡＳ筋においてｍｉＲ－２９ｃが有意に増加したことを示した（図２ｄ）。
ＭｉＲ－２９ｃの注射はコラーゲンを減少させ、ｍｉＲ－２９ｃを回復させる
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃが線維症を減少させることができるかどうかを判定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－マウスに、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃを左腓腹筋に５×１０１１ｖｇｓで筋肉内注射した（ＧＡＳ）筋肉。注射後１２週目にマウスを分析した。ピクロシリウスレッド染色は、未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較して、ＧＡＳ筋（図２ａ）全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少を明らかにした。ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ赤色染色の定量化は、治療された筋肉が未処理の筋肉（処置－２３．３％±１．３対未処置－２９．５％±０．７）と比較して、コラーゲンの１８．３％の減少を有することを示す（図２ｂ）。被治療筋肉におけるｍｉＲ－２９ｃの過剰発現を確認するために、２４週齢のＷＴ、ｍｉＲ－２９ｃ治療マウス、およびｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスからのＧＡＳ筋から全ＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ－２９ｃ発現についての定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析に供した。結果は、未治療マウスと比較して、被治療マウスのＧＡＳ筋においてｍｉＲ－２９ｃが有意に増加したことを示した（図２ｄ）。
【0093】
実施例４
ＭｉＲ－２９ｃは絶対および比筋力を改善するが、収縮誘発性損傷に対して保護しない
線維化が筋肉機能に影響を与えることが分かっているので、我々は、ＭｉＲ－２９ｃの発現を増加させることによって線維化を減少させることにより、収縮誘発性損傷からｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉を保護し、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃで処置したｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスからの腓腹筋の機能特性を評価した。注射の１２週間後、ＧＡＳを単離してインビボ力測定を行った。
ＭｉＲ－２９ｃは絶対および比筋力を改善するが、収縮誘発性損傷に対して保護しない
線維化が筋肉機能に影響を与えることが分かっているので、我々は、ＭｉＲ－２９ｃの発現を増加させることによって線維化を減少させることにより、収縮誘発性損傷からｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉を保護し、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃで処置したｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスからの腓腹筋の機能特性を評価した。注射の１２週間後、ＧＡＳを単離してインビボ力測定を行った。
【0094】
ＧＡＳ手順は、横腹筋生理を分析するためにＨａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．７０９：７５－８９、２０１１）に列挙されたプロトコルに従うが、ＧＡＳに適合させる。簡潔には、ケタミン／キシラジン混合物を用いてマウスを麻酔した。後肢の皮膚を除去して、ＧＡＳ筋肉およびアキレス腱を露出させた。遠位の腱を解剖し、二重の正方形の結び目をできるだけ筋肉に近いところで４－０の縫合で腱の周りに結び付け、別の第２の二重正方形の結び目を第１の結び目のすぐ隣に結びつけ、腱を切断した。露出した筋肉は常に生理食塩水で湿らせた。次いで、マウスを熱制御プラットフォームに移し、３７℃に維持した。膝を膝蓋腱に針で固定し、腱の縫合を力変換器（Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）の水平アームに固定し、足をテープで固定した。双極性白金電極を介して坐骨神経を刺激することにより、ＧＡＳ筋肉収縮が誘発された。筋肉が安定化したら、最大の攣縮力が達成されるまで筋肉を徐々に伸ばして最適な長さを決定した。３分間の休止期間の後、ＧＡＳを５０，１００，１５０、および２００Ｈｚで刺激し、各刺激間に１分間の休止期間を設けて最大破傷風力を決定した。筋長を測定した。５分間の休息の後、収縮誘発損傷に対するＧＡＳ筋肉の感受性を評価した。刺激の５００ｍｓ後、筋肉は最適長さの１０％長くなった。これは１５０Ｈｚで７００ｍｓの筋肉を刺激することから成っていた。刺激の後、筋肉は最適な長さに戻された。このサイクルを１分毎に合計５サイクル繰り返した。特定の力は、最大破壊力をＧＡＳ筋断面積で割ることによって計算した。遠心性収縮後、マウスを安楽死させ、ＧＡＳ筋肉を切開し、秤量し、分析のために凍結させた。
【0095】
各ＧＡＳは一連の反復遠心性収縮を受けた。各収縮の力比対第一の収縮を比較することにより、第五の収縮後の未処理筋肉は０．５６±０．０５対処理０．５０±０．０４（ｐ≦０．０００１）に減衰することが明らかになった。被注射群は、０．９２±０．０２に減衰したＷＴ対照と比較して保護の程度のわずかな減少を示した（図３ｃ）。このデータは、ｍｉＲ－２９ｃの発現を増加させることによる線維化の減少は、絶対的および特定の力の両方を増加させるが、筋肉を収縮誘発損傷から有意に保護しないことを示す。
【0096】
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃ治療ＧＡＳ筋は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較した場合に絶対力の有意な改善を示し（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２２７７±１６１．７対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－未治療－１７２２±１４５．７、図３ａ）、また未治療ＧＡＳ筋と比較した場合にｒＡＡＶｒｈ．７４．ｍｉＲ－２９ｃ治療ＧＡＳ筋特異的改善において比力を正常化した（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２０４．７±１１．７対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－未治療－１５１．６±１４．５、図３ｂ）。野生型対照と比較した場合、力は依然として有意に低下した（ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ－２０４．７±１１．７対野生型－３１２．０±３４．１）。
【0097】
実施例５
マイクロジストロフィンとの同時送達は線維症をさらに低減する
ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用遺伝子治療アプローチが線維症を減少させる上でより有益であるかどうかを決定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスは、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃを５ｘ１０１１で筋肉内注射した左腓腹筋のＶＧＳ。以下の遺伝子治療ベクターを、３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス、ＤＭＤマウスモデル：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独の左腓腹筋（ＧＡＳ）筋肉への筋肉内注射（ＩＭ）によって投与したｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンおよびｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン単独で送達される。
マイクロジストロフィンとの同時送達は線維症をさらに低減する
ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用遺伝子治療アプローチが線維症を減少させる上でより有益であるかどうかを決定するために、１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスは、ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ＭｉＲ－２９ｃを５ｘ１０１１で筋肉内注射した左腓腹筋のＶＧＳ。以下の遺伝子治療ベクターを、３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウス、ＤＭＤマウスモデル：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独の左腓腹筋（ＧＡＳ）筋肉への筋肉内注射（ＩＭ）によって投与したｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンおよびｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン単独で送達される。
【0098】
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、図１０に示すように、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含む。ＡＡＶ ｒｈ．７４ビリオンにキャプシドされたのはこの配列である。Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：１０９－１７）に記載されているように、コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列を駆動するＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターに挿入することにより、ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドを構築した。ＭＣＫプロモーター／エンハンサー配列を用いて筋肉特異的遺伝子発現を誘導し、３５１ｂｐのＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）からなる。コアプロモーターの後、５３ｂｐの内在性マウスＭＣＫ Ｅｘｏｎ１（非翻訳）がＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）および小さな５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）に続いて効率的な転写開始のために存在する。イントロンおよび５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットは、ＡＴＧ開始の直前にコンセンサスＫｏｚａｋを有し、ｍＲＮＡ終結のために小さい５３ｂｐの合成ポリＡシグナルを有する。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、（Ｒ４－Ｒ２３／Δ７１－７８）ドメインを含む。相補的ＤＮＡは、ヒト使用のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成された。
【0099】
注射後１２および２４週にマウスを分析した。第１に、マイクロジストロフィンを発現する筋線維の数を用いて、導入遺伝子送達の有効性を評価し、各群で発現したマイクロジストロフィンのレベルが同程度であることを確認した。我々は、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法（７５．０３±１．９１％）と比較して、マイクロジストロフィン単独（７１．８５±２．２５％）で処置したコホート間では差異がないことを見出した（図４）。
【0100】
ＧＡＳ筋肉を注射後１２ヶ月間分析して、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色およびその後のＩｍａｇｅＪによるコラーゲン蓄積を評価した。さらなる結果には、ｍｉＲ－２９ｃおよびコラーゲン転写レベル、ＧＡＳ筋肉における力測定、筋肉再生に関与するタンパク質（ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）の繊維直径測定およびウェスタンブロット分析が含まれた。線維症の量はピクロシリウスレッド染色によって分析され、未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋またはマイクロジストロフィン単独と比較して、すべての治療群においてＧＡＳ筋全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少を明らかにした（図５ａ）。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、併用治療筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの４０．８％減少を有したことを示す（被治療－１７．４７％±０．７５対未治療－２９．５％±０．７）（図５ｂ）。ｍｉＲ－２９ｃの発現を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲをＧＡＳ筋で行い、すべての治療群は、未治療筋肉と比較してｍｉＲ－２９ｃの増加を有した（図５ｃ）。
【0101】
ＤＭＤ組織と同様に、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋におけるｍｉＲ－２９ｃレベルの有意な減少が観察され、これはピクロシラス・レッド染色によって測定された線維症の増加と相関した。ｓｃＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独で３ヶ月間処置した後、ＧＡＳ筋肉における線維症（処置－２３．５％±１．３対未処置－２７．８％±０．６）の有意な減少があった。マイクロジストロフィンと一緒に送達された場合、ピクロシリウスレッド染色（組み合わせ処置：１７．４７％±０．７５対未処置：２９．５％±０．７）により、コラーゲンのさらなる減少（４１％）が観察された（ｐ＜０．０００１）（図５ｂ）。ｍｉＲ－２９ｃの発現を確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲをＧＡＳ筋で行い、すべての治療群は、未治療筋肉と比較してｍｉＲ－２９ｃの増加を有した（図５ｂ）。
【0102】
注射後２４週で、注射１２週間後に観察された結果と類似していた。未処理の筋肉（併用療法：未処置：３１．０７±０．９３；ｐ＜０．０００１）とｍｉＲ－２９ｃ転写レベルの同時増加との比較において、ピクロシリウスレッド染色によるコラーゲンの４７％の減少があった。
【0103】
ピクロシリウスレッド染色により観察されたコラーゲンの減少をさらに検証するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを筋肉で行い、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、およびまた別のＥＣＭ成分であるフィブロネクチン（Ｆｂｎ）の転写物レベルを定量化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、各治療後のＣｏｌ１ＡおよびＣｏｌ３Ａの減少を検出したが、マイクロジストロフィンおよびｍｉＲ－２９ｃの両方で治療されたコホートのみが有意な減少を示した（図６ａおよび６ｂ）。分析は、併用治療コホートにおいてのみＦｂｎが有意に減少したことを明らかにした（図６ｃ）。
【0104】
ＴＧＦ－β１は、ジストロフィー筋において上方制御されることが以前に示されており、線維性カスケードの開始に関与する可能性が高い。ＴＧＦ－β１は、ｍｉＲ－２９ｃを下方調節し、コラーゲンおよび筋線維形成の増加を伴う筋芽細胞の筋線維芽細胞への変換を担う、既知の線維症促進性サイトカインである。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、併用治療された筋肉が、未注射筋肉およびいずれかの単剤治療と比較して有意に低いレベルのＴＧＦ－β１を有したことを示す（図６ｄ）。注射の６ヵ月後、併用治療された筋肉は、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、Ｆｂｎ、およびＴＧＦ－β１レベルの低下を示し続けたが、ｍｉＲ－２９およびマイクロジストロフィンのみの群ではＣｏｌ１Ａ ｍＲＮＡレベルのごくわずかな減少が観察された。
【0105】
ｍｉＲ－２９ｃ単独で処置した筋肉では、マイクロジストロフィンと組み合わせた場合、野生型と有意に異ならない絶対力および比力につながった未処置の四肢と比較して、特異的および絶対的な力の増加が観察された。我々はまた、共処理した筋肉における胃重量の有意な増加を観察した。
【0106】
ｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃを抗線維化療法として使用した初期の結果は、線維症の主要な原因であるコラーゲンレベルの低下に有益な効果があることを示唆している。さらに、膜安定性を改善するためにマイクロジストロフィンと組み合わせると、ｍｉＲ２９アップレギュレーションは筋力を正常化した。
【0107】
実施例６
絶対力のさらなる増加および収縮誘発性損傷からの保護の追加
ｍｉＲ－２９で処理された筋肉が絶対力および比重の中程度ではあるが有意な増加を有することを知って、ｍｉＲ－２９ｃの過剰発現および筋ジストロフィン遺伝子置換の筋肉機能への影響を調べた。注射から１２週間後、インビボでの力測定を行ったＧＡＳを単離した。実施例２で上記したｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃベクターとｒＡＡＶ
絶対力のさらなる増加および収縮誘発性損傷からの保護の追加
ｍｉＲ－２９で処理された筋肉が絶対力および比重の中程度ではあるが有意な増加を有することを知って、ｍｉＲ－２９ｃの過剰発現および筋ジストロフィン遺伝子置換の筋肉機能への影響を調べた。注射から１２週間後、インビボでの力測定を行ったＧＡＳを単離した。実施例２で上記したｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃベクターとｒＡＡＶ
【0108】
共処理ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶ発現Ｍｉｃｒｏ－Ｄｙｓ処理ＧＡＳ筋肉は、未処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋肉と比較した場合に絶対力において有意な改善を示した（同時処置－３５８２．４±７９．４ｎＭ対ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ｕｎｔｒｅａｔｅｄ－１７２２±１４５．７ ｎＭの対ｒＡＡＶｒｈ．７４．ｍｉＲ－２９Ｃ／マイクロＤＹＳ被処理ガス筋特異的改善における野生タイプ－３００５±１６７．３ ｎＭで）（図７）、また正規特定力未処置のＧＡＳ筋肉と比較して（共処理マウス－２４４．２±６．６ｎＭ／ｍｍ２対ｍｄｘ／未処置＋／－未処置－１５１．６±１４．５ｎＭ／ｍｍ２対３１２．０±３４．１ｎＭ／ｍｍ ）（図７）。絶対力および比力の両方は野生型対照と有意な差がなかった。
【0109】
各ＧＡＳは一連の反復遠心性収縮を受けた。第１の収縮に対する各収縮の力比を比較することにより、第５の収縮後、未治療筋肉は、併用治療０．６６±０．０４に対して０．５４±０．０６に減衰したことが明らかになり（Ｐ≦０．０００１）、マイクロジストロフィン単独でも０．６６±０．０４に減衰したので、これはマイクロジストロフィンに起因し得る。被治療群は、０．９２±０．０２に減衰した野生型よりも依然として有意に低かった（図７ｃ）。注射後２４週間で同様の所見が見られた。このデータは、線維化および遺伝子置換の減少が、絶対および特異的両方の力を増加させ、筋肉を収縮誘発傷害から有意に保護することを示している。
【0110】
実施例７
併用療法は筋肥大および過形成を増加させる
マイクロジストロフィンと同時送達されたＭｉＲ－２９ｃは、３ヶ月齢で単独で注射されたいずれか一方と比較して、被注射腓腹筋の全重量を増加させた（図８、図９ａ）。筋肉量の増加の原因を調べるために、筋線維直径を測定する。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較して、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した（図９ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図９ｃ）。平均繊維サイズが増加しても、総筋肉重量の約３０％の増加は説明されない。筋肉の全断面積も測定した。すべての群からのガストロム筋肉をフルスライドスキャンし、総面積を測定した。マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉は、未治療およびいずれかの単剤治療と比較して断面積の有意な増加を有した（未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）（図８、図９ｄ）。
併用療法は筋肥大および過形成を増加させる
マイクロジストロフィンと同時送達されたＭｉＲ－２９ｃは、３ヶ月齢で単独で注射されたいずれか一方と比較して、被注射腓腹筋の全重量を増加させた（図８、図９ａ）。筋肉量の増加の原因を調べるために、筋線維直径を測定する。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－と比較して、平均直径は２５．９６～３０．９７μｍに増加した（図９ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図９ｃ）。平均繊維サイズが増加しても、総筋肉重量の約３０％の増加は説明されない。筋肉の全断面積も測定した。すべての群からのガストロム筋肉をフルスライドスキャンし、総面積を測定した。マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉は、未治療およびいずれかの単剤治療と比較して断面積の有意な増加を有した（未注射：２４．６対ｍｉＲ－２９ｃ：２６．３対マイクロジス：２６．６対マイクロジス／ｍｉＲ－２９ｃ：３３．１）（図８、図９ｄ）。
【0111】
ｍｉＲ－２９ｃは、ｍｙｏＤ／Ｐａｘ７／ｍｙｏｇｅｎｉｎ経路において役割を果たすことが報告されており、ｍｉＲ－２９ｃは筋細胞系統において分化する衛星細胞（筋幹細胞）の再生および活性化に影響を与えている可能性があるという仮説が立てられた。これを試験するために、全スライドスキャン画像からの筋肉繊維の総数を数えた。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療後の筋線維の数の増加（図９ｅ）。最後に、ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおける筋線維直径が多くの小径線維およびいくつかの肥大線維とは異なることを考慮して、単位面積当たりの線維数（細胞／ｍｍ２）が治療によって影響を受けるかが決定された。ｍｉＲ－２９ｃ／μ－ｄｙｓ併用治療は野生型と変わらなかった（図９ｆ）。
【0112】
実施例８
早期併用治療は線維症を予防する
ＤＭＤの予防的治療としてのコンビナトリアルｍｉＲ－２９ｃおよびマイクロジストロフィンの潜在的重要性を考慮して、より若いｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスのコホートを４週齢で処置した。本明細書に記載の他の群と同じパラダイムを用いて、以下の処置をＧＡＳの筋肉内注射による線維症予防の有効性について比較した：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独、ｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン＋ ｓｃＡＡＶｒｈ。同じ用量で７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ併用療法、またはｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン単独で投与した。注射の１２週間後にマウスを剖検した。未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較して、すべての被治療群においてＧＡＳ筋全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少が観察された（図１０Ａ）。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、マイクロジストロフィン／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの５１％減少を有したことを示し（被治療－１１．３２％±１．１８対未治療－２３．１５％±０．９０）（ｐ＜０．０００１）（図１０）、ｐＲＴ－ＰＣＲは、コンビナトリアル療法後にＣｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、Ｆｂｎ、およびＴＧＦ－β１の減少を確認した（図１０ＤおよびＥ）。
早期併用治療は線維症を予防する
ＤＭＤの予防的治療としてのコンビナトリアルｍｉＲ－２９ｃおよびマイクロジストロフィンの潜在的重要性を考慮して、より若いｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスのコホートを４週齢で処置した。本明細書に記載の他の群と同じパラダイムを用いて、以下の処置をＧＡＳの筋肉内注射による線維症予防の有効性について比較した：ｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ単独、ｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン＋ ｓｃＡＡＶｒｈ。同じ用量で７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ併用療法、またはｓｓＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン単独で投与した。注射の１２週間後にマウスを剖検した。未治療反対側ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ＧＡＳ筋と比較して、すべての被治療群においてＧＡＳ筋全体にわたるコラーゲン染色の有意な減少が観察された（図１０Ａ）。ピクロシリウスレッド染色の定量化は、マイクロジストロフィン／ｍｉＲ－２９ｃで併用治療された筋肉が未治療筋肉と比較してコラーゲンの５１％減少を有したことを示し（被治療－１１．３２％±１．１８対未治療－２３．１５％±０．９０）（ｐ＜０．０００１）（図１０）、ｐＲＴ－ＰＣＲは、コンビナトリアル療法後にＣｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ、Ｆｂｎ、およびＴＧＦ－β１の減少を確認した（図１０ＤおよびＥ）。
【0113】
実施例９
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８に記載されているように併用療法で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、ｍｉＲ－２９ｃ ／マイクロジストロフィンを用いた併用療法は、未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスと比較した場合、絶対的な力において有意な改善を示し、野生型との差はなかった（共処理：２９０８±１２９．５ｍＮ対未処理：１６３９．４±１１６．９ｍＮ対野生型：３３６９．７３±１５４．１ｍＮ）。比力もまた、コンビナトリアル療法後に野生型レベルまで正常化した（併用治療３３８．９±２２．３４ｍＮ／ｍｍ２対未治療１８４．３±１３．４２ｍＮ／ｍｍ２対ＷＴ３６４．３±７．７９ｍＮ／ｍｍ２）（図１１ＡおよびＢならびに１２）。
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８に記載されているように併用療法で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、ｍｉＲ－２９ｃ ／マイクロジストロフィンを用いた併用療法は、未処理のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスと比較した場合、絶対的な力において有意な改善を示し、野生型との差はなかった（共処理：２９０８±１２９．５ｍＮ対未処理：１６３９．４±１１６．９ｍＮ対野生型：３３６９．７３±１５４．１ｍＮ）。比力もまた、コンビナトリアル療法後に野生型レベルまで正常化した（併用治療３３８．９±２２．３４ｍＮ／ｍｍ２対未治療１８４．３±１３．４２ｍＮ／ｍｍ２対ＷＴ３６４．３±７．７９ｍＮ／ｍｍ２）（図１１ＡおよびＢならびに１２）。
【0114】
次に、各ＧＡＳに一連の反復遠心性収縮を施した。各収縮の力比を第５収縮と比較することにより、未治療の筋肉は０．５３±０．０４に減少し、同時に処置された筋肉は０．８２±０．０４（ｐ≦０．０００１）であった。コンビナトリアル治療群は、０．９３±０．０１に減衰した野生型よりもわずかに低かったが、有意な差はなかった（図１１Ｃ）。これらのデータは、線維化および遺伝子置換の減少が、絶対的な力および比的な力の両方を増加させ、収縮によって誘発される損傷から筋肉を有意に保護することを示す。
【0115】
これらの実験は、新生児期に遺伝子置換を開始すべきであることを示唆している。新生児期のＤＭＤやその他の筋ジストロフィーを特定する方向に取り組んでいることは明らかです。オハイオ新生児スクリーニング研究は、ＣＫ ７ Ｎｅｕｒｏｌを用いた新生児におけるＤＭＤの同定の可能性を示している。同じ乾燥した血液スポット上でのＤＮＡ確認を伴うバイオマーカー（＞２０００Ｕ／Ｌ）として（Ｍｅｎｄｅｌｌら、Ａｎｎ。Ｎｅｕｒｏｌ。７１：３０４－３１３、２０１２）。この方法論は現在、米国（ＰＰＭＤ、２０１６年５月１６日：新生児スクリーニングとの次のステップ）および他の国、特に英国（英国国家審査委員会）と中国（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（商標）は中国でスクリーニングを開始）。
【0116】
ｍｉＲ－２９はまた、心臓、肺、および肝臓線維症のための治療法として有望であることが示されています。マウスおよびヒトにおける心筋梗塞は、ｍｉＲ－２９ダウンレギュレーションに関連する。Ｒｏｏｉｊ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ １０５：１３０２７－１３０３２，２００８）は、線維芽細胞をｍｉＲ－２９ｂ模倣体に曝露することが、コラーゲン転写物を減少させ、心臓線維症の臨床的変換のための経路を提供することを実証した。その後の研究では、ブレオマイシン誘発肺線維症マウスモデルにおいて、ｍｉＲ－２９ｂ．１４のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムに基づく送達を用いて線維症の減弱を達成できることが示された。現在、ｍｉＲ－２９ｂ模倣体は、健康なボランティア（ｍｉＲａｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＴＭ ＭＲＧ－２０１）において臨床第１相安全耐容性局所皮内試験中にある。オリゴヌクレオチドの半減期に関連する反復投与を必要とするであろうｍｉＲ－２９オリゴヌクレオチド送達と比較して、ＡＡＶ遺伝子治療は、単一送達遺伝子伝達のための経路を潜在的に提供することができる。
【0117】
実施例１０
ｍｉＲ－２９およびマイクロジストロフィンの筋特異的発現による治療は線維症およびＥＣＭ発現を減少させた
ｍｉＲ２９ｃ配列および筋肉特異的プロモーターＭＣＫを含むＡＡＶベクターも生成し、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターとの併用療法として試験した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ２９ｃと呼ばれるｒＡＡＶベクターを作製するために、２２ヌクレオチドのｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３およびガイド鎖配列番号４）を、ＭＣＫによって駆動されるｍｉＲ－３０足場にクローニングしたプロモーター（配列番号１１）。発現カセット（配列番号１２）を一本鎖ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループおよびｍｉＲ－３０ｃガイド（アンチセンス）鎖をｍｉＲ－３０骨格に含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基が改変された。次いで、この配列を、ＭＣＫプロモーターおよびポリＡ配列によって駆動されるプラスミドを含む一本鎖ＡＡＶ ＩＴＲにクローニングした。
ｍｉＲ－２９およびマイクロジストロフィンの筋特異的発現による治療は線維症およびＥＣＭ発現を減少させた
ｍｉＲ２９ｃ配列および筋肉特異的プロモーターＭＣＫを含むＡＡＶベクターも生成し、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターとの併用療法として試験した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ２９ｃと呼ばれるｒＡＡＶベクターを作製するために、２２ヌクレオチドのｍｉＲ２９ｃ配列（標的鎖配列番号３およびガイド鎖配列番号４）を、ＭＣＫによって駆動されるｍｉＲ－３０足場にクローニングしたプロモーター（配列番号１１）。発現カセット（配列番号１２）を一本鎖ＡＡＶプラスミドにクローニングし、筋肉でよく発現することが知られている血清型ＡＡＶｒｈ７４を用いてパッケージングした。ｍｉＲ－２９ｃ ｃＤＮＡは、ｍｉＲ－３０ｃ標的（センス）鎖、ｍｉＲ－３０ステムループおよびｍｉＲ－３０ｃガイド（アンチセンス）鎖をｍｉＲ－３０骨格に含むカスタムプライマーを用いて合成した。ｍｉＲ－２９ｃ配列の３つの塩基が改変された。次いで、この配列を、ＭＣＫプロモーターおよびポリＡ配列によって駆動されるプラスミドを含む一本鎖ＡＡＶ ＩＴＲにクローニングした。
【0118】
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ２９Ｃプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接するｍｉＲ－３０ステムループバックボーンにｍｉｒ２９ｃ ｃＤＮＡを含む。ＡＡＶｒｈ７４ビリオンにキャプシドされたのはこの配列である。さらに、ｍｉＲ－２９ｃ標的配列を有するいくつかのヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ（ｌｕｃ）におけるように、この部位でワトソン－クリル対合を模倣するように変更された。ＳｈＲＮＡ－ｌｕｃデザインによれば、ヘアピンはその長さ全体にわたって完全に相補的でなければならない。さらに、パッセンジャー鎖の変化が増えるほど、ｍｉＲ－２９プロセシングを制御する内在性機構がなくなり、ｍｉＲＮＡを幹細胞から認識することが可能になります。ガイド鎖の１９番目の塩基をシトシンに改変し、天然ｍｉ－２９ｃ配列の切断部位に先行するヌクレオチドを模倣し、他方の鎖上の対応する塩基を変更して対形成を維持した。
【0119】
ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の早期治療は、線維症およびＥＣＭ発現を低下させる上でより有効であった。４～５週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－マウスに、実施例５に記載したように、左腓腹筋に５ｘ１０１１ｖｇｓのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ＭｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンを筋肉内注射した。筋肉を注射１２週間後に収穫した。未注射およびｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの併用療法で注射されたマウスから採取した筋肉のピクロシリウスレッド染色は、併用治療筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの５０．９％減少を有したことを示し（図１３ａおよび１３ｂ参照）、ｑＲＴ－ＰＣＲは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認した（図１３ｃ）。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶにおけるコラーゲンＡ１およびコラーゲン３Ａ（図１３ｄ、ｅ）、フィブロネクチン（図１３ｆ）およびＴｇｆβ１（図１３ｇ）レベルの有意な減少を示した。マイクロジストロフィン処理した筋肉を対側肢帯型治療と比較して示した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用療法の治療は、線維症およびＥＣＭ発現を減少させるのに有効である。３ヶ月齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋￥－マウスは、実施例５に記載されているように、左腓腹筋に５ｘ１０１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．ＭｉＲ－２９ｃおよびｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの筋肉内注射を受けた。筋肉を注射１２週間後に収穫した。未治療、ＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ、およびＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉のピクロシリウスレッド染色は、併用治療筋肉が未治療ＧＡＳ筋と比較してコラーゲンの３０．３％減少を有したことを示し（図１４ａおよび１４ｂ参照）、ｑＲＴ－ＰＣＲは、被治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加を確認した（図１４ｃ）。半定量ｑＲＴ－ＰＣＲは、反対側の肢と比較したＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるコラーゲン１Ａおよびコラーゲン３Ａ（図１４ｄ、ｅ）、フィブロネクチン（図１４ｆ）、ならびにＴｇｆβ１（図１４ｇ）レベルの有意な減少を示す。一方向ＡＮＯＶＡ。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【0120】
実施例１１
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８および９に記載されているように、ｍｉＲ－２９およびマイクロジストロフィンの筋特異的発現で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／およびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを用いた併用療法は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスと比較した場合、絶対力の有意な改善を示し、野生型との差はなかった（図１５ａ）。比力もまた、併用療法後に野生型レベルまで正常化した（図１５ｂ）。
早期併用療法は後期治療よりも良好に力を回復し、収縮誘発性損傷から保護する
インビボ力測定を、実施例８および９に記載されているように、ｍｉＲ－２９およびマイクロジストロフィンの筋特異的発現で早期に治療されたマウスのＧＡＳについて行った。４週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスにおいて、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／およびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを用いた併用療法は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスと比較した場合、絶対力の有意な改善を示し、野生型との差はなかった（図１５ａ）。比力もまた、併用療法後に野生型レベルまで正常化した（図１５ｂ）。
【0121】
次いで、実施例９に記載されているように、繰り返しの遠心性収縮後の力の損失について筋肉を評価した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィンおよびｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉｃｒｏ－ジストロフィン単独で共処置したマウスは、未処置ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋－筋肉と比較して力の損失からの保護を示した（図１５ｃ ）。
【0122】
１２週齢のｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－マウスでは、ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／およびｒＡＡＶ発現マイクロジストロフィンを用いた併用療法は力を回復させ、収縮誘発損傷から保護した。ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃおよびマイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶが注射されたＧＡＳ筋の強縮性収縮後の絶対力（図１６ａ）および正常化比力（図１６ｂ）の測定は、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－筋肉と比較して有意に増加した。続いて、筋肉を、実施例９に記載したように繰り返して遠心性収縮させた後の力の損失について評価した。ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで併用治療されたマウスは、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋￥－筋肉と比較して力の喪失からの保護を示した（図１６ｃ）。これらのデータは、線維化および遺伝子置換の減少が、絶対的な力および比的な力の両方を増加させ、収縮によって誘発される損傷から筋肉を有意に保護することを示す。
【0123】
実施例１２
早期併用治療は筋肥大および過形成を増加させる
ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンとｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９との同時送達は、注射後３ヶ月で単独で注射されたもの（図１７ａ）と比較して、注射されたガストグの全体重量を増加させなかった。筋線維直径も測定した。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照とｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－を比較すると、平均直径は２８．９６から３６．０３μｍに増加した（図１７ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図１７ｃ）。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数は、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかった（図１７ｄ、＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
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３４．Ｎｅｖｏ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ （ＦＴＳ）， ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｄｙ／ｄｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６， ｅ１８０４９ （２０１１）．
３５．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５， ４５ （２００７）．
３６．Ｍｕｌｉｅｒｉ， Ｌ．Ａ．， Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ， Ｇ．， Ｉｔｔｌｅｍａｎ， Ｆ．， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｅ．Ｍ．＆ Ａｌｐｅｒｔ， Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ６５， １４４１－１４４９ （１９８９）．
３７．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ ｍｉｃｒｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８， １０９－１１７ （２０１０）．
３８．Ｇｒｏｓｅ， Ｗ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ５ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７， ｅ３９２３３ （２０１２）．
３９．Ｌｉｕ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｙｏｕｎｇ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１， ２４５－２５６ （２００５）．
早期併用治療は筋肥大および過形成を増加させる
ｒＡＡＶを発現するマイクロジストロフィンとｒＡＡＶ．ＭＣＫ．ｍｉＲ－２９との同時送達は、注射後３ヶ月で単独で注射されたもの（図１７ａ）と比較して、注射されたガストグの全体重量を増加させなかった。筋線維直径も測定した。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療は、平均線維サイズの増加を示した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－対照とｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン処理ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－を比較すると、平均直径は２８．９６から３６．０３μｍに増加した（図１７ｂ）。同時送達は野生型線維サイズ分布へのシフトをもたらした（図１７ｃ）。ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ２当たりの筋線維の数は、未治療マウスおよび野生型より有意に少なかった（図１７ｄ、＊＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
参考文献
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１４．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ， ｔｙｐｅ ２Ｄ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６８， ６２９－６３８ （２０１０）．
１５．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｌｉｍｂ－ｇｉｒｄｌｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２Ｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ａｌｐｈａ－ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６， ２９０－２９７ （２００９）．
１６．Ｍｅｎｄｅｌｌ， Ｊ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｈａｓｅ １／２ａ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｉａｌ ｆｏｒ ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ： ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３， １９２－２０１ （２０１５）．
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２０．Ｄｕｐｏｎｔ－Ｖｅｒｓｔｅｅｇｄｅｎ， Ｅ．Ｅ．＆ ＭｃＣａｒｔｅｒ， Ｒ．Ｊ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｄｉａｐｈｒａｇｍ ｖｅｒｓｕｓ ｈｉｎｄｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５， １１０５－１１１０ （１９９２）．
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２２．Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ， Ａ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．Ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｃｅｌｌ ９０， ７１７－７２７ （１９９７）．
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２４．Ｌｏｖｅ， Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３３９， ５５－５８ （１９８９）．
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２８．Ｒａｆａｅｌ， Ｊ．Ａ．， Ｔｉｎｓｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｐｏｔｔｅｒ， Ａ．Ｃ．， Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ， Ａ．Ｅ．＆ Ｄａｖｉｅｓ， Ｋ．Ｅ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｒｅｓｃｕｅｓ ｕｔｒｏｐｈｉｎ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９， ７９－８２ （１９９８）．
２９．Ｚｈｏｕ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｕｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｏｒｓｅｎｓ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｄｘ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ ２６４， １０６－１１１ （２００８）．
３０．Ｇｕｔｐｅｌｌ， Ｋ．Ｍ．， Ｈｒｉｎｉｖｉｃｈ， Ｗ．Ｔ．＆ Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｌ．Ｍ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ／ｕｔｒｎ＋／－ Ｍｏｕｓｅ Ｖａｌｉｄａｔｅｓ Ｉｔｓ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ １０， ｅ０１１７３０６ （２０１５）．
３１．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ａｎｄ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ＤＭＤ ｍｏｄｅｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２， ４９２９－４９３７ （２０１３）．
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３３．Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｍｉＲ－２９ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｕｒｉｎｅ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３， ２０９－２１８ （２０１１）．
３４．Ｎｅｖｏ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ， ｆａｒｎｅｓｙｌｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ （ＦＴＳ）， ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｄｙ／ｄｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６， ｅ１８０４９ （２０１１）．
３５．Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ， Ｌ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５， ４５ （２００７）．
３６．Ｍｕｌｉｅｒｉ， Ｌ．Ａ．， Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ， Ｇ．， Ｉｔｔｌｅｍａｎ， Ｆ．， Ｂｌａｎｃｈａｒｄ， Ｅ．Ｍ．＆ Ａｌｐｅｒｔ， Ｎ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｆｒｏｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈ ２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｎｅ ｍｏｎｏｘｉｍｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ６５， １４４１－１４４９ （１９８９）．
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【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【配列表】