特許 7153652 質量分析用の試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-05

(45)【発行日】2022-10-14

(54)【発明の名称】質量分析用の試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20221006BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20221006BHJP

   G01N 33/58 20060101ALI20221006BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V

G01N33/50 F

G01N33/50 T

G01N33/58 Z

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2019535813

(86)(22)【出願日】2018-01-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-02-20

(86)【国際出願番号】 EP2018052451

(87)【国際公開番号】W WO2018141821

(87)【国際公開日】2018-08-09

【審査請求日】2021-01-15

(31)【優先権主張番号】17153895.2

(32)【優先日】2017-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【氏名又は名称】中西 基晴

(72)【発明者】

【氏名】カレル，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】コボルト，ウーベ

(72)【発明者】

【氏名】ハインドル，ディーター

(72)【発明者】

【氏名】ベハー，ジルビア

(72)【発明者】

【氏名】ライネンバッハ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】レンプト，マルティン

(72)【発明者】

【氏名】プファッフェンエーダー，トニ

(72)【発明者】

【氏名】キルヒナー，アンジー

(72)【発明者】

【氏名】コスマチェフ，オレシア

(72)【発明者】

【氏名】ラヒモフ，ルネ

(72)【発明者】

【氏名】シファーズ，サラ

(72)【発明者】

【氏名】ミューラー，マルクス

【審査官】藤田 都志行

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５２５６３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１４３９５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１２－５２９０１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１３６１６０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６２

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｇ０１Ｎ ３３／５８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

その任意の塩を含めた、一般式（Ｉ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ
［式中
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される、反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それ自身が中性であり、かつ、それによって中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、ここでＹは４員、５員、または６員の複素環部分からなり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、以下を含むかまたは以下からなる荷電ユニットであり：
（ｉ）１０以上のｐＫ_ａを有する少なくとも１つの正荷電部分；もしくは
（ｉｉ）１０以上のｐＫ_ｂを有する少なくとも１つの正荷電部分、
ｒは、１である］
の化合物
または少なくとも１つの化合物（Ｉ）を含む組成物もしくはキットの、
分析物分子の質量分析測定のための使用。

【請求項2】

反応基Ｘが、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基である、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

反応基Ｘが下記（ｉ）～（ｉｖ）から選択されるカルボニル反応基である、請求項１または２に記載の使用：
（ｉ）ヒドラジン基、
（ｉｉ）ヒドラゾン基、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノ基、および
（ｉｖ）ジチオール基。

【請求項4】

反応基Ｘが、チオール反応性ハロアセチル基である、請求項１または２に記載の使用。

【請求項5】

反応基Ｘが、活性エステル基、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、および１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル基から選択されるアミノ反応基である、請求項１または２に記載の使用。

【請求項6】

中性イオン損失ユニットＹが、逆環化付加反応によって、断片化可能であり、中性イオン損失ユニットＹが、相互に隣接する少なくとも２個のヘテロ原子を有する環状アゾ化合物または５員の複素環部分を含むか、または相互に隣接する少なくとも２個のヘテロ原子を有する環状アゾ化合物または５員の複素環部分からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

中性種が、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＮＯ、ＮＯ_２、およびＮ_２から選択される無機分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

荷電ユニットＺが、下記を含む、または下記からなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用：
（ｉ）一級、二級、三級、もしくは四級アンモニウム基およびホスホニウム基から選択される少なくとも１つの正荷電部分、または
（ｉｉ）リン酸基、硫酸基、スルホン酸基、およびカルボキシラート基から選択される少なくとも１つの負電荷部分。

【請求項9】

荷電ユニットＺが、１個の永久正荷電部分を含む、または１個の永久正荷電部分からなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

前記化合物（Ｉ）が、それによって第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離される代替的な断片化が質量分析条件下でさらに可能である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項11】

前記化合物（Ｉ）が一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ），
Ｘ^１－Ｌ_１－Ｙ^１（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ （Ｉｂ）
［式中、
Ｘ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｙ、Ｚ、およびｒが請求項１～１０のいずれか一項に記載の通りであり、
Ｘ^１がカルボニル反応基であり、
Ｙ^１は、
（ｉ）それによって第１の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である４員、５員、または６員の複素環部分、および
（ｉｉ）任意選択で、それによって第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離される代替の断片化が質量分析条件下で可能である部分
を含む中性イオン損失ユニットである］
の化合物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項12】

前記化合物（Ｉ）が一般式（Ｉｃ）

【化1】

［式中、Ｒは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１－４アルキルであり、Ａは、陰イオンである］
の化合物である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

化合物（Ｉ）が、Ｄ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、および／または^１８Ｏから選択される少なくとも１種の同位元素を含むアイソトポログである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項14】

分析物分子の質量分析測定のための方法であって、
（ａ）分析物分子と、請求項１～１３のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物との共有結合形成反応を起こすステップであって、それによって分析物分子と試薬の付加物が形成されるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた付加物を質量分析で解析するステップと
を含み、質量分析による解析ステップ（ｂ）が、
（ｉ）付加物のイオンを、それによって付加物のイオンがその質量／電荷（ｍ／ｚ）比により特徴付けられる質量分析による解析の第１段階で解析するステップと、
（ｉｉ）それによって第１の中性種が遊離され、付加物の娘イオンが生成される付加物イオンの断片化を引き起こすステップであって、付加物の娘イオンのｍ／ｚ比が付加物イオンのｍ／ｚ比と異なるステップと、
（ｉｉｉ）付加物の娘イオンを、それによって付加物の娘イオンがそのｍ／ｚ比により特徴付けられる質量分析による解析の第２段階で解析するステップと
を含み、かつ／または
（ｉｉ）が、それによって第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離され、付加物の第２の娘イオンが生成される代替の付加物イオンの断片化をさらに含むことができ、
（ｉｉｉ）が、付加物の第１および第２の娘イオンを、それによって付加物の第１および第２の娘イオンがそれらのｍ／ｚ比により特徴付けられる質量分析による解析の第２段階で解析するステップをさらに含むことができる、方法。

【請求項15】

その任意の塩を含めた、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ
［式中、
Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基であり、Ｘがアクリルエステルではなく、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それ自身が中性であり、かつ、それによって中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、ここでＹは４員、５員、または６員の複素環部分からなり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、分子全体が１０以上のｐＫ_ａを有し、一級、二級、三級、もしくは四級アンモニウム基およびホスホニウム基から選択される少なくとも１つの永久正荷電部分を含む荷電ユニットである］
の化合物である試薬または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキット。

【請求項16】

その任意の塩を含めた、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ
［式中、
Ｘがカルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、またはヒドロキシル反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それ自身が中性であり、かつ、それによって中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、ここでＹは４員、５員、または６員の複素環部分を含むかまたは４員、５員、または６員の複素環部分からなり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚが、１０以上のｐＫ_ｂを有し、リン酸基、硫酸基、スルホン酸基、およびカルボキシラート基から選択される少なくとも１つの永久負荷電部分を含む荷電ユニットである］
の化合物である試薬または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキット。

【請求項17】

Ｙが、相互に隣接する少なくとも２個のヘテロ原子を有する環状アゾ化合物または５員の複素環部分からなり、かつ、それによって中性種が遊離される逆環化付加反応による断片化が質量分析条件下で可能である、請求項１５に記載の試薬。

【請求項18】

式（Ｉｃ）

【化2】

［式中、Ｒは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１－４アルキルであり、Ａは、陰イオンである］
の化合物である、請求項１５に記載の試薬。

【請求項19】

Ｙが、相互に隣接する少なくとも２個のヘテロ原子を有する環状アゾ化合物または５員の複素環部分からなり、かつ、それによって中性種が遊離される逆環化付加反応による断片化が質量分析条件下で可能である、請求項１６に記載の試薬。

【請求項20】

請求項１５～１９のいずれか一項に記載の異なる同位体を含む複数の試薬を含む組成物またはキット。

【請求項21】

分析物分子の質量分析測定のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物と分析物分子の反応によって形成される共有結合性付加物の使用であって、共有結合性付加物が、一般式（ＩＩ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－（Ｌ_２－Ｚ）_ｒ
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の基Ｘと分析物分子の反応から生じる部分であり、Ｌ_１、Ｙ、Ｌ_２、Ｚ、およびｒは、請求項１～１３のいずれか一項に記載の通りである］
の化合物である、使用。

【請求項22】

キャリブレーターおよび／または標準物質としての請求項２１に記載の使用。

【請求項23】

その任意の塩を含めた一般式（Ｉ）
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ
［式中、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基である
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それ自身が中性であり、かつ、それによって中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、ここでＹは４員、５員、または６員の複素環部分からなり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの永久荷電部分を含む荷電ユニットであり、
ｒは、１である］
の化合物および分析物分子の反応によって形成される共有結合性付加物。

【請求項24】

一般式（ＩＩ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の基Ｘと分析物分子の反応から生じる部分であり、Ｌ_１、Ｙ、Ｌ_２、Ｚ、およびｒは、請求項１～１３のいずれか一項に記載の通りである］
の化合物であり、永久正電荷または負電荷を保有する、請求項２３に記載の付加物。

【請求項25】

分析物分子Ｔが炭水化物部分を有する分子である、請求項２４に記載の付加物。

【請求項26】

その任意の塩を含めた、一般式（ＩＩａ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （ＩＩａ）
［式中、
Ｔが分析物分子であり、
Ｘ’が、化合物（Ｉａ）上の基Ｘと分析物分子の反応によって生じる部分であり、
Ｔ、Ｘ、Ｌ_１、Ｙ、Ｌ_２、およびＺが、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の通りである］
の化合物である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の付加物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析物分子、例えば炭水化物の質量分析測定に適した試薬、ならびにそのような試薬と分析物分子の付加物、ならびに前記試薬および付加物の適用に関する。さらに、本発明は、分析物分子の質量分析測定のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

この１０年間、生物学および医学研究では、生細胞または生物における炭水化物の役割および機能が注目されている。炭水化物には、タンパク質、脂質、または他の有機分子に結合しているものもあり、それによって特徴的な複雑なグリコシル化パターンが生じている。最近、ある種の障害は、グリコシル化パターンの変化と関連するか、そのような変化を伴うか、そのような変化によって引き起こされることが観察されている。特に、腫瘍疾患は、様々なタンパク質のグリコシル化の変化と関連していることが多い。

【0003】

炭水化物は、クロマトグラフィー分離技法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはキャピラリー電気泳動、または質量分析（ＭＳ）を含めた様々な技法を用いて解析することができる。

【0004】

ＭＳは、小分子から巨大分子まで及ぶ化学物質の定性的および定量的解析に広く使用されている技法である。一般に、ＭＳは、感度および特異度が極めて高い方法であり、複雑な生物学試料、例えば、環境または臨床試料の解析さえも可能にする。

【0005】

単糖、オリゴ糖、または多糖の解析には、ＭＳは、クロマトグラフィー技法、特にガスクロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣと併用されている。これによって、炭水化物分子は、クロマトグラフィー手順によって分離され、その後、個々に質量分析で解析される。炭水化物は、等圧（位置異性および／または立体異性）構造で存在することが多いので、クロマトグラフィーによる分離が常に可能とは限らない。したがって、イオン移動度ユニットと組み合わせたＭＳも使用されており、これは、等圧の炭水化物の分離が可能である。

【0006】

しかし、依然として、特に、存在量が少ない炭水化物の解析のため、またはＭＳによって利用可能な材料（生検組織など）がわずかしか無い場合に、ＭＳ解析方法の感度を上げる必要性がある。

【0007】

ＭＳは、シグナル強度が、イオン化特性を反映し、イオンサプレッションと呼ばれるプロセスによる夾雑物に強く影響されるため、定量的ではない。その結果、ＭＳ解析を定量的にする必要性がある。

【0008】

本発明は、生物学的試料中の炭水化物などの分析物分子の極めて高感度な測定を可能にする、ＭＳで使用するための新規な試薬に関する。さらに、同位体改変版の試薬の使用によって、比較研究のための正確な定量的ＭＳデータを得ることが可能となる。この試薬は、ゲノム中の糖鎖構造の直接的かつ超高感度な定量的解析に使用され成功を収めている。塩基除去修復によって生じた希少な無塩基部位（ＡＰ部位）およびβ脱離生成物（βＥ部位）が標的分子として測定される。この試薬は、極めて高い感度を有することが分かった。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、本発明の第１の態様は、その任意の塩を含めた、一般式（Ｉ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの荷電部分、特に永久荷電部分を含む荷電ユニットであり、
ｒは、０または１である］
の化合物
または少なくとも１つの化合物（Ｉ）を含む組成物またはキットの、分析物分子の質量分析測定のための使用である。

【0010】

特定の態様では、化合物（Ｉ）は、アイソトポログ、すなわち、本明細書で当該化合物の同位体として中性の原子とも称される１または複数種の主要同位体、例えば、^１Ｈ、^１２Ｃ、^１４Ｎ、および／または^１６Ｏ原子が、比較的少数の安定同位体、すなわちＤ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、および^１８Ｏなどの安定同位体によって置き換えられている化合物として存在してもよい．
本発明のさらなる態様は、試料中の分析物分子の質量分析測定のための方法であって、
（ａ）分析物分子と、本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物との共有結合形成反応を起こすステップであって、それによって分析物分子と化合物（Ｉ）との共有結合性付加物が形成されるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた付加物の質量分析を行うステップと
を含む方法である。

【0011】

さらに、本発明のさらなる態様は、その任意の塩を含めた、一般式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、Ｘがアクリエステルではないという条件で、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの永久正荷電部分を含む荷電ユニットである］
の化合物または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキットである。

【0012】

さらなる態様では、この発明は、その任意の塩を含めた、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、またはヒドロキシル反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの負電荷部分を含む荷電ユニットである］
の化合物または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキットに関する。

【0013】

この発明は、少なくとも１種の化合物（Ｉａ）、特に、同位体について様々な分子種の複数の化合物（Ｉａ）を含む試薬組成物または試薬キットにも関する。
本発明のさらなる態様によると、式（Ｉ）の化合物と分析物分子、特に炭水化物部分を含む分析物分子の共有結合性付加物は、質量分析測定に使用できる。この付加物は、試料中に存在する分析物分子を化合物（Ｉ）と反応させることによって生成できる。しかし、付加物は、キャリブレーターおよび／または標準物質として用いるための純粋な物質として提供することもできる。

【0014】

さらに、本発明のさらなる態様は、化合物（Ｉ）と分析物分子の反応によって形成された共有結合性付加物である。この付加物は、その任意の塩を含めた一般式（ＩＩ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ （ＩＩ）
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の反応基Ｘと分析物分子の反応から得られる部分である。
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの荷電部分を含む荷電ユニットであり、
ｒは、０または１である］
の化合物であってもよい。

【0015】

特定の実施形態は、化合物（Ｉａ）と分析物分子の反応によって形成される、その任意の塩を含めた式（ＩＩａ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （ＩＩａ）
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉａ）上の反応基Ｘと分析物分子の反応から得られる部分であり、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの荷電部分を含む荷電ユニットである］
で表される共有結合性付加物である。
実施形態
本発明は、ＭＳによる分析物分子の測定に関する。分析物分子は、本発明の化合物（Ｉ）上の反応基Ｘとの共有結合を形成できるいかなる物質でもよい。例えば、分析物は、修飾炭水化物、例えば、アミノ基、Ｎ－アセチル基、硫酸基、および／またはカルボキシラート基を有する炭水化物ならびにデオキシまたはメチル修飾炭水化物を含めた炭水化物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂肪酸、脂質、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、および小分子代謝物およびコファクターを含めた他の生体分子から選択される生体分子でも、薬物、農薬、毒素、またはその代謝物でもよい。そのような分析物分子は、体液、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液など、組織、または細胞抽出物などの生物学的試料、臨床試料、または環境試料中に存在するものでもよい。一部の実施形態では、分析物分子は、精製試料または部分精製試料、例えば精製または部分精製のタンパク質混合物または抽出物である試料中に存在してもよい。

【0016】

本発明によると、炭水化物、ならびにテストステロンおよびエストラジオールなどのステロイド、ケトステロイド、ならびにビタミンＤなどのセコステロイドのようなフェノール基およびケト基を含有する化合物から選択される分析物分子は、特に関連性があり、本明細書に記載の試薬を用いて測定できる。

【0017】

分析物分子は、試料調製ワークフロー内の様々な段階で誘導体化できる。本開示との関連では、用語「誘導体化される」または「誘導体化」は、分析物と、本発明の式（Ｉ）の化合物などの化学化合物との反応を指す。したがって、用語「誘導体化試薬」は、分析物を誘導体化するのに使用される化合物を指す。分析物分子は、試料の前処理の後に、試料の第１の濃縮の後に、または試料の第２の濃縮の後に誘導体化できる。

【0018】

分析物分子を含む試料は、様々な方法で前処理および／または濃縮できる。前処理方法は、血液（新鮮血または乾燥血液）、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、組織、尿、または唾液などの試料のタイプに依存する。

【0019】

特に、試料が全血試料の場合、両方とも内部標準（ＩＳ）および溶血試薬（ＨＲ）の添加と、それに続く、予め定義されたインキュベーション時間（Ｉｎｃ）とを含み、２つのワークフローの間の差が内部標準（ＩＳ）および溶血試薬（ＨＲ）が添加される順序である２つの予め定義された試料前処理（ＰＴ）ワークフローの１つに割り当てられる。追加のステップで、本明細書中の上または下に開示の本発明の化合物などの誘導体化試薬が添加され、それにインキュベーション時間が続く。内部標準（ＩＳ）は、典型的には、既知量の同じ目的の分析物であり、これは、例えば、同位体標識されていてもよい。これによって、相対的な比較が可能となり、分析物が質量分析計に到達したときに、試料中に存在する目的の分析物を明確に同定および定量化することが可能になる。

【0020】

試料が尿試料である場合、両方とも内部標準（ＩＳ）および酵素試薬（Ｅ）の添加と、それに続く予め定義されたインキュベーション時間（Ｉｎｃ）とを含み、２つのワークフローの間の差が内部標準（ＩＳ）および酵素試薬（ＨＲ）が添加される順序である他の２つの予め定義された試料ＰＴワークフローの１つに割り当てられる。酵素試薬は、典型的には、グルクロニド切断もしくはタンパク質切断または任意の分析物もしくはマトリックスのプレプロセシングに使用される試薬である。追加のステップで、本明細書中の上または下に記載の本発明の化合物などの誘導体化試薬が添加され、それにインキュベーション時間が続く。

【0021】

試料が血漿または血清の場合、それは、内部標準（ＩＳ）のみの添加と、それに続く予め定義されたインキュベーション時間（Ｉｎｃ）とを含む別の予め定義されたＰＴワークフローに割り当てられる。追加のステップで本明細書中の上または下に開示の本発明の化合物などの誘導体化試薬が添加され、それにインキュベーション時間が続く。

【0022】

そのような前処理された試料に、さらに分析物濃縮ワークフローを施すことができる。
特に、分析物濃縮ワークフローは、目的の分析物を捕捉するために、分析物選択性の基を保有する磁気ビーズ（ＭＢ）、任意選択でビーズバインダーの、前処理された試料への添加と、それに続く、予め定義されたインキュベーション時間（Ｉｎｃ）とを含んでもよく、磁気ビーズ（ＭＢ）の添加は、撹拌または混合を含んでもよい。磁気ビーズ（ＭＢ）とのインキュベーションの後、ワークフローは、洗浄ステップ（Ｗ１）とを含んでもよく、分析物に応じて、１または複数の追加の洗浄ステップ（Ｗ２）を含むことも可能である。洗浄ステップ（Ｗ１、Ｗ２）は、磁石または電磁石を含む磁気ビーズ操作ユニットによる磁気ビーズ分離（Ｂ ｓｅｐ）、液体の吸引（Ａｓｐ．）、洗浄バッファーの添加（Ｗ． Ｂｕｆｆｅｒ）、磁気ビーズの再懸濁（Ｒｅｓ．）、別の磁気ビーズ分離ステップ（Ｂ Ｓｅｐ）、および液体の別の吸引（Ａｓｐ．）を含む一連のステップを含む。さらに、洗浄ステップは、溶剤の体積以外に、溶剤のタイプ（水／有機／塩／ｐＨ）および洗浄サイクルの数または組合せに関して相違していてもよい。

【0023】

磁気ビーズから目的の分析物を遊離するために、最後の洗浄ステップ（Ｗ１、Ｗ２）に続いて、溶出試薬（ＥＲ）の添加を行い、それに磁気ビーズの再懸濁（Ｒｅｓ．）および予め定義されたインキュベーション時間（Ｉｎｃ．）が続く。次いで、無結合の磁気ビーズを分離し（Ｂ Ｓｅｐ．）誘導体化された目的の分析物を含有する上清をＬＣステーションに直接移すか、希釈液（Ｄｉｌ．）の添加による希釈ステップの後にＬＣステーションに移す。様々な溶出手順／試薬、例えば、溶媒のタイプ（水／有機／塩／ｐＨ）および体積を変えることによっても使用できる。

【0024】

目的の分析物の誘導体化が前処理方法の後に行われなかった場合、試料中の分析物の誘導体化を、磁気ビーズを用いた第１の濃縮ワークフローの後に行ってもよい。本明細書では、本明細書中の上または下に開示の本発明の化合物などの誘導体化試薬が、洗浄ステップ（Ｗ１、Ｗ２）が行われた後、溶出試薬の前に、同時に、後に目的の試料に添加され、それにインキュベーション時間（定義された時間および温度）が続く。次いで、無結合の磁気ビーズを分離し（Ｂ Ｓｅｐ．）、誘導体化された目的の分析物を含有する上清をＬＣステーションに直接、または希釈液（Ｄｉｌ．）の添加による希釈ステップの後に移す。様々な溶出手順／試薬も、例えば、溶媒のタイプ（水／有機／塩／ｐＨ）および体積を変えることによって使用できる。

【0025】

さらなるオプションには、本明細書中の上または下に開示の本発明の化合物などの誘導体化試薬のポストカラムインフュージョンを用いた、クロマトグラフィー分離（限定されるものではないが、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーが含まれる）、特に液体クロマトグラフィーを含めた第２の分析物濃縮ワークフローの後の、分析物の誘導体化が含まれる。

【0026】

特定の実施形態では、分析物分子は、炭水化物または炭水化物部分を有する物質、例えば糖タンパク質またはヌクレオシドである。例えば、分析物分子は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、リブロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸などの単糖、またはオリゴ糖、例えばショ糖、マルトース、もしくはラクトースなどの二糖、または三糖もしくは四糖でもよく、あるいは多糖、またはそのような単糖、オリゴ糖、もしくは多糖部分を含む物質でもよい。

【0027】

好ましくは、分析物分子は、化合物（Ｉ）の反応基Ｘと共有結合を形成できるカルボニル基、例えば、アルデヒドもしくはケト基またはマスクされたアルデヒドもしくはケト基、例えば、ヘミアセタール基、特に環状ヘミアセタール基を含む。分析物分子は、化合物（Ｉ）との反応の前にアルデヒド基、ケト基、またはヘミアセタール基に変えることができるアセタール基を含むものでもよい。

【0028】

他の実施形態では、分析物分子は、化合物（Ｉ）の反応基Ｘと共有結合を形成できる、アミノ、チオール、ヒドロキシ、隣接ジオール、共役ジエン、フェノール、核酸塩基、カルボキシル、末端システイン、および末端セリンから選択される基を含んでもよい。さらに、分析物分子上にある基が、まず、化合物（Ｉ）の反応基Ｘとの反応への利用がより容易である別の基に変えられることも、本発明の範囲内にあると意図されている。

【0029】

１または複数個のフェノール基を含有する分析物は、特に興味深い。例えば、分析物は、ステロイド、ステロイド様化合物、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｐ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、および１６，１７－エピエストリオール、および／またはその代謝物から選択されるものでもよい。様々な実施形態で、代謝物は、例えば、エストリオール、１６－エピエストリオール（１６－エピＥ３）、１７－エピエストリオール（１７－エピＥ３）、１６，１７－エピエストリオール（１６，１７－エピＥ３）、１６－ケトエストラジオール（１６－ケトＥ２）、１６ａ－ヒドロキシエストロン（１６ａ－ＯＨＥ１）、２－メトキシエストロン（２－ＭｅＯＥ１）、４－メトキシエストロン（４－ＭｅＯＥ１）、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル（３－ＭｅＯＥ１）、２－メトキシエストラジオール（２－ＭｅＯＥ２）、４－メトキシエストラジオール（４－ＭｅＯＥ２）、２－ヒドロキシエストロン（２０ＨＥ１）、４－ヒドロキシエストロン（４－ＯＨＥ１）、２－ヒドロキシエストラジオール（２－ＯＨＥ２）、エストロン（Ｅ１）、硫酸エストロン（Ｅ１ｓ）、１７ａ－エストラジオール（Ｅ２ａ）、１７ｐ－エストラジオール（Ｅ２ｂ）、硫酸エストラジオール（Ｅ２ｓ）、エキリン（ＥＱ）、１７ａ－ジヒドロエキリン（ＥＱａ）、１７ｐ－ジヒドロエキリン（ＥＱｂ）、エキレニン（ＥＮ）、１７－ジヒドロエキレニン（ＥＮａ）１７β－ジヒドロエキレニン（ＥＮｂ）、Ａ８，９－デヒドロエストロン（ｄＥ１）、硫酸Ａ８，９－デヒドロエストロン（ｄＥ１ｓ）であってもよい。一部の実施形態では、フェノール性分析物が、ｓｐ^２混成であるＡ環を有し、Ａ環の３位にＯＨ基を有するステロイドまたはステロイド様の化合物であってもよい。

【0030】

１または複数個のケト基を含有する分析物は、さらに興味深い。好ましい例は、限定されるものではないが、ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デスオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６－ケトエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７ＯＨプレグネノロン、１７ＯＨプロゲステロン、１７ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、およびデルタ４アンドロステンジオン）１１－デスオキシコルチゾールコルチコステロン、２１デオキシコルチゾール、１１デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロン、およびアルドステロンを含めたケトステロイドである。

【0031】

分析物のＭＳ測定を容易にし、改善するため、第１の態様において、本発明は、その任意の塩を含めた、一般式（Ｉ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ （Ｉ）
［式中、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの荷電部分、特に永久荷電部分を含む荷電ユニットであり、
ｒは、０または１である］
の化合物
または少なくとも１つの化合物（Ｉ）を含む組成物もしくはキットの、分析物分子の質量分析測定のための使用に関する。

【0032】

本発明によるＭＳで使用するための化合物（Ｉ）は、分析物分子と反応することができ、それによって分析物分子との共有結合が形成される反応基Ｘを含む。
複数の実施形態で、化合物（Ｉ）の反応基Ｘは、分析物分子上の様々な官能基と反応するように選択することができる。どの反応基Ｘが、目的の分析物の官能基への結合に適格でるかを決めることは、周知のことの範囲内である。分析物分子上の官能基は、隣接ジオール、フェノール基、核酸塩基、アミノ、メルカプト、ヒドロキシ、１－ヒドロキシ２－アミノアルキル、１－アミノ２－メルカプトアルキル、ケト、１，３－ジエニル、エニル、アリル、ホルミル、およびカルボキシラート基である。反応基については、標準的な教科書「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第３版：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８２２３９－０．０００２５－Ｘ；および「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、第１１版、Ｉａｉｎ Ｄ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２０１０、ならびに総説（例えばＸ． Ｃｈｅｎら、Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０１６，１４，５４１７－５４３９；およびＴ． Ｈｉｇａｓｈｉ Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１６ Ｓｅｐ；１６２：５７－６９）に概説されている。

【0033】

特に、反応基Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基である。特に、反応基Ｘは、アミン反応基、チオール反応基、カルボニル反応基、親ジエン反応基、１，２ジオール反応基、カルボン酸反応基、ヒドロキシル反応基、１－アミノ２－ヒドロキシアルキル反応基、１－アミノ２－メルカプト反応基、およびフェノールのオルト位で反応する基からなる群から選択される。

【0034】

好ましい一実施形態では、基Ｘは、カルボニル基を有する任意のタイプの分子、例えば、炭水化物分子と反応することができるカルボニル反応基である。特に、炭水化物－化合物（Ｉ）の反応基Ｘは、グルコース、マンノース、ガラクトース、リボース、またはフコースなどのアルドース、およびリブロースまたはフルクトースなどのケトースを含めたあらゆるタイプの糖と反応することができ、また、到達可能なアルデヒドもしくはケト基またはヘミアセタールマスクされたアルデヒドもしくはケト基を有する二糖、三糖、または四糖などのオリゴ糖および多糖と反応することができる。カルボニル反応基は、隣接するＯもしくはＮ原子ＮＨ_２－Ｎ／Ｏを通したα効果によって強化された超求核性のＮ原子またはジチオール分子のいずれかを有しうる。これは、下記から選択されるものでもよい：
（ｉ）ヒドラジン基、例えばＨ_２Ｎ－ＮＨ－またはＨ_２Ｎ－ＮＲ^１－基、
［式中、Ｒ^１は、置換されていてもよい、例えばハロで置換されていてもよいアリールまたはＣ_１－４アルキル、特に、Ｃ_１もしくはＣ_２アルキル、ヒドロキシル、および／またはＣ_１－３アルコキシである］
（ｉｉ）ヒドラゾン基、例えばＨ_２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ_２Ｎ－ＮＲ^２－Ｃ（Ｏ）－基、
［式中、Ｒ^２は、置換されていてもよい、例えばハロで置換されていてもよいアリールまたはＣ_１－４アルキル、特に、Ｃ_１もしくはＣ_２アルキル、ヒドロキシル、および／またはＣ_１－３アルコキシである］
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノ基、例えばＨ_２Ｎ－Ｏ－基、および
（ｉｖ）ジチオール基、特に１，２－ジチオールまたは１，３－ジチオール基。

【0035】

好ましい一実施形態では、反応基Ｘが、ケト基を含む分析物と反応することができるケト反応基であり、例えば、ケトステロイド様ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デスオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６－ケトエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７ＯＨプレグネノロン、１７ＯＨプロゲステロン、１７ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、およびデルタ４－アンドロステンジオン）１１－デオキシコルチゾールコルチコステロン、２１デオキシコルチゾール、１１デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロン、およびアルドステロンである。

【0036】

例えば、Ｂｒ／Ｉ－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－、アクリルアミド／エステル基、マレイミドもしくはメチルスルホニルフェニルオキサジアゾールなどのイミドなどの反応性ハロアセチル基は、分析物分子上のチオール基などの求核性の基と反応できる。アミノ反応基、例えば、Ｎ－ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）エステルもしくはスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、四角酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、または１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル、または塩化スルホニル基などの活性エステル基は、分析物分子上のアミノ基と反応できる。上記のヒドラジンまたはヒドロキシルアミノ基も、分析物分子上に存在する他の求電子性の基と反応させるのに使用できる。

【0037】

ジオールへの結合には、反応基Ｘは、ボロン酸を含んでもよい。あるいは、ジオールは、それぞれのケトンまたはアルデヒドに酸化し、次いで、ケトン／アルデヒド反応基Ｘと反応させることができる。ジエンに結合させるための反応基Ｘとして、トリアゾールジオンなどの求ジエン体を選択することができる。分析物分子上にあるフェノール基は、ｅｎ反応（Ｈ． Ｂａｎ ｅｔ ａｌ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，２０１０，１３２（５），ｐｐ １５２３－１５２５）を介して、またはジアゾ化によって、あるいはｏｒｔｈｏ－ニトロ化し、それに続きアミンに還元し、これを次いでアミン反応性試薬と反応させることによって、トリアゾールジオンと反応させることができる。

【0038】

核酸塩基は、反応基Ｘとして、２－クロロアセチルまたはＰｔ錯体と反応させることができる。末端システインは、反応基Ｘとして、シアン化ヘテロアリール／アリールと反応させることができる。末端セリンは、酸化させてアルデヒド基を生じさせ、次いで知られているアルデヒド反応基Ｘと反応させることができる。

【0039】

当業者ならば、測定する分析物分子上にある官能基に応じて、化合物（Ｉ）に適した反応基Ｘを選択するであろう。
さらなる実施形態では、反応基が、プロスタグランジンの誘導体化に使用することができるカルボン酸反応基、例えば、ジアゾ化合物（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ２０１２，７５，８７５－８８１）である。他のよく知られているカルボン酸反応基はハロゲン化アルキルである。カルボン酸の活性化およびそれに続くアミンまたはヒドラジンなどの求核剤との反応もよく知られている（Ａ． Ｋｒｅｔｓｃｈｍｎｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ Ｖｏｌｕｍｅ ８７９，１７－１８，Ｍａｙ ２０１１，Ｐａｇｅｓ １３９３－１４０１）。

【0040】

ヒドロキシル反応基（Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１６ Ｓｅｐ；１６２：５７－６９）は、塩化スルホニル、活性化カルボキシルエステル（ＮＨＳまたはイミダゾリド）、およびフッ素の求核置換が可能なフルオロアロマート／ヘテロアロマートである。

【0041】

好ましい一実施形態では、反応基Ｘは、フェノール基を有する任意のタイプの分子と反応することができるフェノール反応基、例えばステロイド、ステロイド様化合物、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｐ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、および１６，１７－エピエストリオール、ならびに／またはその代謝物である。例えば、フェノール反応基は、１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン基でもよく、１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンは、求ジエン体として作用することもでき、したがって、ビタミンＤである１α，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_３、１α，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_２、２５（ＯＨ）ＶｉｔＤ_２、２５（ＯＨ）ＶｉｔＤ_３および２４Ｒ，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_３の検出に有用である。

【0042】

化合物（Ｉ）は、さらに中性イオン損失ユニットＹを含む。本願との関連では、用語「中性イオン損失ユニット」は、電荷を有しない部分を失うことができるユニットを指す。前記部分は、限定されるものではないが、イオン、原子、および複数の原子を含む。ユニットＹは、中性であり、すなわち、正電荷も負電荷も帯びず、本明細書中下記に定義されているリンカーＬ_１を介して反応基Ｘに連結されている。中性ユニットＹは、ＭＳの条件下で、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）を、例えば三連四重極型ＭＳ内で受けた場合、それによって中性種が遊離される断片化が可能である。第１の中性種の遊離の後、ユニットＹの残部は、依然として中性のままである。必須ではないが、典型的には、１種の中性種の遊離、すなわち第１の中性種の遊離が起こる。特定の実施形態では、２種の中性種が遊離される。

【0043】

第１の中性種は、低分子量中性種、例えば分子量が１００未満である、さらに特定すると８０未満である中性分子でもよい。さらに、第１の中性種は、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＮＯ、ＮＯ_２、またはＮ_２などの無機分子でもよい。特に、中性種は、Ｎ_２またはＳＯ_２である。さらに特定すると、第１の中性種はＮ_２である。中性分子の損失を引き起こす反応は、好ましくは逆環化反応、特に１，３－双極子逆環化でもよい。本開示との関連では、用語「逆環化」は、任意の環化付加反応の逆転を指す。

【0044】

特定の実施形態では、中性イオン損失ユニットＹが環状部分（例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタジエン－７－オンのような環状ケトンはＣＯを失うことが知られている）、特に複素環部分、さらに特定すると、それによって上記の第１の中性種が遊離される断片化が可能である６員、５員、または４員の複素環部分を含むまたはからなる。そのような（複素）環状基は、それによって中性種が遊離される逆（複素）環化付加反応による断片化を容易に示す。

【0045】

好ましくは、中性イオン損失ユニットＹは、トリアゾール、特に１，２，３－トリアゾール、テトラゾール、テトラジン、１，２，３オキサもしくはチアジアゾール、またはその水素化誘導体から選択される環状アゾ化合物および５員環など、相互に隣接する，例えば１，２位にＮ、Ｏ、および／またはＳ原子、特にＮ原子などの少なくとも２個のヘテロ原子を有する５員または６員の複素環部分を含むまたはからなる。上記の複素環に、さらなる環、例えばベンゾチアジアゾールまたはベンゾトリアゾールをアニールさせることができる。複素環は、例えば、２，５－ジヒドロピロールおよび２，５－ジヒドロチオフェン－１，１－ジオキシドに部分的に水素化することができる。

【0046】

特に好ましい実施形態では、５員の複素環部分は、トリアゾール部分であり、これは、アルキンおよびアジドの環化付加またはクリック反応を介して、必須ではないが、触媒としてＣｕ（Ｉ）が存在してもよい状態で、合成されたものでもよい。ＭＳの条件下で、トリアゾール部分の断片化が、１，３双極子逆環化反応を介したＮ_２の遊離を引き起こし、それによって質量分析計における質量／電荷比（ｍ／ｚ）が２８に低下する。

【0047】

当業者ならば、市販のソフトウェア、例えばＡＣＤ／ＭＳ Ｆｒａｇｍｅｎｔｅｒ（ＡＣＤ Ｌａｂｓ）を用いて中性イオン損失ユニットを同定できることを十分に認識している。さらに中性損失を引き起こす反応および分子種は次の参考文献に記載されている。
Ｃａｒｅｙ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ： Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｅｉｎ ｗｅｉｔｅｒｆｕｈｒｅｎｄｅｓ Ｌｅｈｒｂｕｃｈ Ｋｏｒｒｉｇｉｅｒｔｅｒ Ｎａｃｈｄｒｕｃｋ ＶＣＨ １９９５； ＩＳＢＮ： ３－５２７－２９２１７－９、およびＦｒｅｄ Ｗ． ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ，Ｆｒａｎｔｉｓｅｋ Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｖｏｎ Ｍａｓｓｅｎｓｐｅｋｔｒｅｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ １９９５，Ｓｏｆｔｃｏｖｅｒ： ＩＳＢＮ９７８－３－６４２－３９８４８－３）。

【0048】

特定の実施形態では、必須ではないが、化合物（Ｉ）が少なくとも１個の荷電部分、すなわち実質的に中性の条件下で主に荷電状態で存在する部分を含む荷電ユニットＺを有する。例えば、荷電ユニットＺは、下記を含む。
（ｉ）一級、二級、三級、もしくは四級アンモニウム基もしくはホスホニウム基などの少なくとも１つの正荷電部分、特にｐＫ_ａが１０以上である、さらに特定するとｐＫ_ａが１２以上である正荷電部分、または
（ｉｉ）リン酸基、硫酸基、スルホン酸基、またはカルボキシラート基などの少なくとも１つの負電荷部分、特にｐＫ_ｂが１０以上であり、さらに特定するとｐＫ_ｂが１２以上である負電荷部分。

【0049】

本願との関連では、用語「ｐＫ_ａが～である」とは、当該荷電部分が無い分子のｐＫ_ａ値とは異なる特定のｐＫ_ａ値を荷電部分が分子全体に与えているという事実を指す。例えば、用語「少なくとも１個のｐＫ_ａが１０以上である正荷電部分」は、前記少なくとも１つの正荷電部分を含む分子全体が１０以上のｐＫ_ａを示すことを指定する。ｐＫ_ｂ値にも同じことが類似してあてはまる。

【0050】

荷電ユニットＺは、最も好ましくは、１個の荷電部分からなる。
荷電ユニットＺが存在する場合、それが、本明細書に定義されているリンカーＬ２を介して、中性イオン損失ユニットＹに連結される。したがって、電荷および中性損失を行う能力が、様々なユニットによって提供される。中性イオン損失ユニットＹが断片化されて（低分子量）中性種の遊離が起こる条件下でさえ、荷電ユニットＺは無変化のままである。これは、残部の荷電状態が変わらないことを意味する。化合物が、荷電ユニットＺ内の正電荷により以前に正荷電であった場合、それは、低分子量中性種を遊離した後でも正荷電のままである。

【0051】

好ましくは、化合物（Ｉ）は、少なくとも１個の正荷電部分を含む荷電ユニットＺを有する。最も好ましくは、荷電ユニットＺが、１個の正荷電部分からなり、代替の断片化を行うことができるいかなる基も有しない。

【0052】

試薬化合物（Ｉ）は、荷電ユニットＺの存在から生じる荷電部分を有してもよい。荷電は、例えば四級アンモニウム基を使用する場合、永久荷電でもよく、またはプロトン化（正電荷）または脱プロトン（負電荷）によって生成されたものでもよい。本発明によると、永久荷電が好ましい。化合物（Ｉ）内に荷電部分があることが好ましいが、必ずしも必要ではない。好ましい永久正荷電ユニットは、テトラアルキルアンモニウム、１－アルキルピリジニウム、および１，３－ジアルキルイミダゾリウムユニットである。

【0053】

第１の中性種の遊離に加えて、化合物（Ｉ）は、質量分析条件下で、代替の断片化、例えばＣＩＤを介した断片化が可能なものでもよい。それによって、第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離される。例えば、第２の中性種は、アリールラジカル、例えば、フェニルラジカルもしくは置換フェニルラジカル、またはハロゲンラジカル（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を含むことができる。第２の中性種の遊離を起こす代替の断片化は、中性イオン損失ユニットＹからの第１の中性種の遊離に必要なものより高いエネルギ－の条件下でのみ起こることが好ましい。

【0054】

特定の実施形態では、当該化合物は、その任意の塩を含めた、一般式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基であり、ただしＸはアクリエステルではなく、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１個の永久正荷電部分を含む荷電ユニットである］
で表される。
特定の実施形態では、当該化合物は、その任意の塩を含めた、一般式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、またはヒドロキシル反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの負電荷部分を含む荷電ユニットである］
で表される、または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキットである。
好ましい一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、炭水化物およびケトステロイドの測定のための試薬に適しており、一般式（Ｉｂ）の化合物でもよい：
Ｘ^１－Ｌ_１－Ｙ^１（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ
［式中、
Ｘ^１は、上記のカルボニル反応基であり、
Ｙ^１は、
（ｉ）それによって第１の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である複素環部分、および
（ｉｉ）任意選択で、それによって第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離される代替の断片化が質量分析条件下で可能である部分
を含む中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの荷電部分、特に永久荷電部分を含む荷電ユニットであり、
ｒは、０または１である。

【0055】

一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、または（Ｉｂ）における基Ｌ_１およびＬ_２は、独立に、結合、すなわち共有結合、またはスペーサー、すなわち鎖長が１から通常、４、６、８、もしくは１０原子、もしくはそれより長い、例えばＣ原子であり、任意選択で少なくとも１個のヘテロ原子を含む直鎖もしくは分枝のスペーサーを表す。好ましくは、基Ｌ_１およびＬ_２は、長さが１、２、または３原子の短いスペーサーであって、最も好ましくは代替の断片化を受ける可能性のあるいかなる部分も無いスペーサーである。さらに、基Ｌ_１およびＬ_２がいかなる立体中心も含まないことが好ましい。立体異性体が存在する場合、１種のみの立体異性体が存在し、２種以上の立体異性体の混合物は存在しない。ＭＳで使用するには、化合物（Ｉ）は、立体異性について純粋な形で用意することが好ましい。

【0056】

特定の実施形態では、Ｌ_１またはＬ_２は、相互に独立に、少なくとも１個のヘテロ原子を任意選択で含む、Ｃ１－Ｃ４アルキルスペーサーである。さらなる実施形態では、Ｌ_１およびＬ_２の一方は、上記の代替の断片化の対象となりうる、フェニル基などのアリール基を含む。

【0057】

特定の実施形態では、本発明の化合物と所与の分析物の反応によって形成される付加物は、質量分析で測定された際に．質量遷移を１つしか示さない。
本発明による化合物の特定の例は、式（Ｉｃ）：

【0058】

【化1】

【0059】

［式中、Ｒは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１－４アルキル、特にメチルであり、Ａは、陰イオン、例えばギ酸イオンである］の化合物である。
本発明のさらなる実施形態は、アイソトポログである式（Ｉ）の化合物に関する。用語「アイソトポログ」は、主要同位体の少なくとも１つが、分子質量がその対応する主要同位体の分子質量とは異なる、その対応する元素の比較的少量の安定同位体で置き換えられている化合物（Ｉ）に関する。したがって、得られる（Ｉ）のアイソトポログは、ここで同位体について中性と呼ばれる主要同位体からなるその対応する化合物の分子質量とは、分子質量が異なる。この分子質量の相違により、同位体について中性な化合物とそのアイソトポログとを質量分析で区別することが可能となる。好ましい一実施形態では、アイソトポログは、Ｄ（Ｈの置換物として）、^１３Ｃ（^１２Ｃの置換物として）、^１５Ｎ（^１４Ｎの置換物として）、および^１８Ｏ（^１６Ｏの置換物として）から選択される少なくとも１種の同位体を含む。

【0060】

アイソトポログでは、同位体について中性の原子それぞれのうち１または複数種、最多では全てが同位体で置き換えられていてもよい。それによって、１つの化合物について極めて多数の様々なアイソトポログが用意できる。

【0061】

例えば、上に示した式（Ｉｃ）の化合物において、芳香族ユニットまたはグリシンユニットにおける１もしくは複数種または全てのＨ、^１４Ｎ、および^１２Ｃ原子をＤ、^１５Ｎ、または^１３Ｃで置き換えることができる。トリアゾール環の２位および３位のＮ原子は、^１５Ｎで置き換えると、中性種Ｎ_２として切り離されるので、それらは^１５Ｎで置き換えられない。

【0062】

Ｒ＝メチルである式（Ｉｃ）の化合物の特定の実施形態では、３個のＣＨ_３基がすべてＣＤ_３基で置き換えられる。このアイソトポログは、９質量ユニット分重く、したがって、３個のＣＨ_３基を有する同位体について中性なその対応する化合物とＭＳ識別可能である。

【0063】

化合物（Ｉ）は、同位体について中性な化合物としても、同位体について中性なその対応する化合物とＭＳ識別可能であるアイソトポログとしても、同じ化合物の複数の異なるＭＳ識別可能なアイソトポログを含む組成物としても、同じ化合物の分離形態の複数の異なるＭＳ識別可能なアイソトポログを含むキットとしても用意できる。試薬の複数の異なるＭＳ識別可能なアイソトポログを含む組成物またはキットは、下に記載するマルチプレックス適用に特に適している。

【0064】

そのアイソトポログを含めた式（Ｉ）の好ましい化合物の合成については、下の実施例の項に記載されている。
さらに、本発明のさらなる態様は、分析物分子の質量分析測定のため、特に上記の炭水化物分析物分子の測定のための、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。この使用では、後でＭＳによって解析される共有結合性付加物がそれによって形成される化合物（Ｉ）との反応による分析物分子の誘導体化が行われる。

【0065】

化合物（Ｉ）を、ＭＳによる分析物分子の測定のための試薬として使用する一般スキームは、次のステップを含む。
（ｉ）分析物の誘導体化
試薬化合物（Ｉ）＋分析物→付加物
（ｉｉ）ＭＳ解析
→付加物イオンの検出
｜
付加物→
｜
→中性種の断片化によって生じる娘イオンの検出
付加物イオンから生じた中性種の断片化、すなわち中性イオン損失は、全体の電荷を変化させない。したがって、娘イオンは、分子イオンと同じ電荷を有する。

【0066】

付加物が正電荷を含む場合、ＭＳ検出は、ポジティブモードで行われる。付加物が負電荷を有する場合、検出は、ネガティブＭＳモードで行われる。
質量分析測定は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、迅速ＬＣ、もしくはマイクロＬＣ（μＬＣ）などのクロマトグラフィー方法および／またはイオンモビリティベースの分離技法を含めた追加の解析方法と組み合わせることができる。

【0067】

本発明のさらなる態様は、上記の一般式（Ｉ）の化合物と分析物分子の反応によって形成された付加物の、分析物分子の質量分析測定のための使用である。この反応によって、化合物（Ｉ）と分析物分子の間の共有結合が形成される。特定の好ましい実施形態では、質量分析測定は、タンデム質量分析測定、さらに特定すると三連四重極型装置におけるタンデム質量分析測定を含み、その際、分析物付加物の分子イオンが、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）による、断片化を受け，娘イオンが分子イオンから生成される。付加物分子イオンおよび娘イオンを平行して検出することによって、分析物の極めて高感度な測定が可能である。

【0068】

好ましい一実施形態では、ＭＳ測定に使用される付加物が一般式（ＩＩ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ（－Ｌ_２－Ｚ）_ｒ （ＩＩ）
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の反応基Ｘと分析物分子の反応から得られる部分であり、Ｌ_１、Ｙ、Ｌ_２、Ｚおよびｒ上に定義されている通りである］の化合物である。

【0069】

式（ＩＩ）の付加物化合物は、正電荷または負電荷を帯び、これが、質量分析検出を可能にする。この電荷は、化合物（Ｉ）の荷電ユニットＺが与える。化合物（Ｉ）に荷電ユニットが存在していることが好ましいが、例えば、分析物分子それ自体が電荷を帯びている場合、および／またはプロトン化または脱プロトンによって付加物に電荷を与えることができる場合、他の手段によって電荷を与えることができるので必要ではない。

【0070】

一実施形態では、付加物化合物（ＩＩ）は、試料中に存在する解析される分析物分子と試料に添加されている化合物（Ｉ）の反応によって生成できる。
さらに、本発明のさらなる態様は、その任意の塩または少なくとも１種の式（ＩＩａ）の付加物を含む組成物もしくはキットを含めた、付加物化合物（ＩＩａ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （ＩＩａ）
［式中、
Ｔ、Ｘ’、Ｌ_１、Ｙ、Ｌ_２、およびＺは、本明細書中の上に定義されている通りである］である。

【0071】

特に、付加物は、その任意の塩を含めた、式（ＩＩａ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （ＩＩａ）
［式中、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の反応基Ｘの反応から得られる部分であり、Ｘは、Ｘがアクリエステルではないという条件で、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、上に定義されている、少なくとも１つの永久正荷電部分を含む荷電ユニット、好ましくは、テトラアルキルアンモニウム、１－アルキルピリジニウム、または１，３－ジアルキルイミダゾリウムユニットである］
の化合物、または少なくとも１種の式（ＩＩａ）の付加物を含む組成物もしくはキットである。

【0072】

特に、付加物は、その任意の塩を含めた、式（ＩＩａ）：
Ｔ－Ｘ’－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （ＩＩａ）
［式中、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）上の反応基Ｘの反応から得られる部分であり、Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、またはヒドロキシル反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの負電荷部分を含む荷電ユニットである］
の化合物、または少なくとも１種の式（ＩＩａ）の付加物を含む組成物もしくはキットである。

【0073】

付加物化合物は、キャリブレーターおよび／または標準物質として使用するための純粋な物質として提供することもできる。キャリブレーターとしての、付加物化合物（ＩＩ）または（ＩＩａ）の使用では、特定の分析物分子のための較正曲線の作成を行うことができ、その際、試料中に存在する未知量の分析物分子の正確な定量的測定を可能にするために、様々な既知量の付加物化合物（ＩＩ）または（ＩＩａ）がＭＳ解析を受け、それぞれのシグナル強度が測定される。

【0074】

標準物質としての付加物化合物（ＩＩ）の使用では、試料の個々の部分、例えばアリコートに、例えばアイソトポログの形態の既知量の試薬－分析物付加物を添加し、これらの個々の試料部分の別個の質量分析を行うことができる。これにより得られた、これらの試料部分中の分析物－試薬付加物の様々なシグナル強度は、試料中に存在する未知量の分析物分子の正確な定量的測定を可能にする。

【0075】

さらに、既知分析物を、例えばアイソトポログの形態で、試料または試料の個々の部分、例えばアリコートに既知量で添加することができる標準物質として用意することができる。式（Ｉ）または（Ｉａ）の試薬で試料を処理することによって、次いで、標準付加物と式（Ｉ）または（Ｉａ）の試薬および測定するべき分析物から形成される付加物との混合物が生じる。

【0076】

好ましい実施形態によると、標準物質の既知分析物、式（Ｉ）もしくは（Ｉａ）の試薬、またはその両方をアイソトポログの形態で用いることができる。
標準付加物と、式（Ｉ）の試薬と測定するべき分析物の反応によって形成された付加物との混合物は、次いで、質量分析を用いて解析することができる。一部の実施形態では、分析物の相対濃度を得ることができる。他の実施形態では、既知量の標準物質を用いることによって分析物の絶対定量を得ることができる。

【0077】

試料中の分析物分子と試薬化合物（Ｉ）の間の付加物が形成される前、最中、または後に標準物質を試料に添加することができる。好ましくは、試料中の分析物分子と試薬化合物（Ｉ）または（Ｉａ）の間の付加物が形成される前に、内部標準が添加される。

【0078】

好ましくは、標準付加物は、試薬化合物（Ｉ）または（Ｉａ）と試料中に存在する分析物分子の反応によって生成される付加物とＭＳ識別可能である。この目的で、標準付加物は、試薬化合物（Ｉ）または（Ｉａ）のアイソトポログから生成することができ、一方、試料中の分析物分子の付加物は、同位体について中性、すなわち標識されていない試薬化合物（Ｉ）もしくは（Ｉａ）または標準物質とは異なるアイソトポログを用いることによって生成できる。代わりに、または加えて、標準物質の分析物がアイソトポログであってもよい。

【0079】

ガスまたは液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによる分離中、アイソトポログ標準付加物は、試料由来の分析物付加物と同じ保持時間を有する。したがって、分析物付加物とアイソトポログ標準付加物の両方が同時に質量分析計に入る。

【0080】

しかし、アイソトポログ標準付加物は、試料由来の分析物付加物とは異なる分子質量を示す。これにより、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比の相違による、添加した標準付加物由来のイオンと分析物付加物由来のイオンとの間の質量分析による識別が可能となる。両方の付加物とも、上記の第１の中性種の遊離による断片化を受け、娘イオンを生ずる。これらの娘イオンは、それらのｍ／ｚ比により相互に、そしてそれぞれの付加物イオンから識別することができる。したがって、アイソトポログ標準付加物および分析物付加物からのシグナルの別個の測定および定量化を行うことができる。アイソトポログ標準付加物は既知量で添加されているので、試料由来の分析物付加物のシグナル強度を分析物の特定の定量値に割り当てることができる。

【0081】

さらに、本発明のさらなる態様は、分析物分子の質量分析測定のための方法であって、
（ａ）分析物分子と、上記の式（Ｉ）の試薬化合物との共有結合形成反応を起こすステップであって、それによって分析物分子と試薬化合物の付加物が形成されるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた付加物の質量分析を行うステップと
を含む方法に関する。

【0082】

特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物とステップａ）の分析物分子の反応は、分析物分子のいずれかの濃縮プロセスの前に行われるか、第１の濃縮プロセスの後に行われるか、第２の濃縮プロセスの後に行われる。本開示との関連では、用語「第１の濃縮プロセス」または「第１の濃縮ワークフロー」は、試料の前処理の後に行われ、初めの試料と比較して濃縮されている分析物を含む試料をもたらす濃縮プロセスを指す。本開示との関連では用語「第２の濃縮プロセス」または「第２の濃縮ワークフロー」は、試料の前処理および第１の濃縮プロセスの後に行われ、初めの試料および第１の濃縮プロセスの後の試料と比較して濃縮された分析物を含む試料をもたらす濃縮プロセスを指す。特定の実施形態では、第１の濃縮プロセスは、分析物選択性の磁気ビーズの使用を含む。特定の実施形態では、第２の濃縮プロセスは、クロマトグラフィーによる分離の使用、特に液体クロマトグラフィーの使用を含む。

【0083】

式（Ｉ）の化合物とステップａ）の分析物分子の反応がいずれかの濃縮プロセスの前にも行われる特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物が、前処理された目的の試料に添加される。用語「前処理された試料」は、内部標準（ＩＳ）および上に詳細に記載されている溶血試薬（ＨＲ）による血液試料の処理または内部標準（ＩＳ）および上に詳細に記載されている酵素試薬（Ｅ）による尿試料の処理を指す。したがって、分析物分子と式（Ｉ）の試薬化合物の付加物が、前処理の後かつ第１の濃縮プロセスの前に形成される。したがって、付加物は、ステップｂ）の質量分析を受ける前に、第１の濃縮プロセスおよび第２の濃縮プロセスを受ける。

【0084】

式（Ｉ）の化合物とステップａ）の分析物分子の反応が第１の濃縮プロセスの後に行われる特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物が、磁気ビーズを使用する第１の濃縮プロセスが行われた後に、目的の試料に添加される。したがって、この場合、最初に本明細書中の上に記載の通り試料が前処理され、次いで、本明細書中の上に記載の分析物選択性の基を担持する磁気ビーズで処理され、ビーズからの溶出の前、最中、または後に、式（Ｉ）の化合物が添加される。したがって、第１の濃縮プロセスの後、かつ第２の濃縮プロセスの前に、分析物分子と式（Ｉ）の試薬化合物の付加物が形成される。したがって、付加物は、ステップｂ）の質量分析を受ける前に、第２の濃縮プロセスを受ける。

【0085】

式（Ｉ）の化合物とステップａ）の分析物分子の反応が第２の濃縮プロセスの後に行われる特定の実施形態では、クロマトグラフィー、特に液体クロマトグラフィーを用いた第２の濃縮プロセスが行われた後に、目的の試料に式（Ｉ）の化合物が添加される。したがって、この場合、最初に本明細書中の上に記載の通り試料が前処理され、次いで本明細書中の上に記載の磁気ビーズワークフローを受け、続いてクロマトグラフィーによる分離、特に液体クロマトグラフィー、特にＨＰＬＣ、迅速ＬＣ、またはマイクロＬＣ（μＬＣ）を用いた分離が行われ、クロマトグラフィーによる分離の後に、式（Ｉ）の化合物が添加される。したがって、第２の濃縮プロセスの後に、分析物分子と式（Ｉ）の試薬化合物の付加物が形成される。したがって、付加物は、ステップｂ）の質量分析を受ける前に濃縮プロセスを受けない。

【0086】

好ましくは、質量分析ステップ（ｂ）は、
（ｉ）付加物のイオンを、それによって付加物のイオンがその質量／電荷（ｍ／ｚ）比により特徴付けられる質量分析の第１段階で解析するステップと、
（ｉｉ）それによって第１の中性種、特に低分子量中性種が遊離され、付加物の娘イオンが生成される、付加物イオンの断片化を引き起こすステップであって、付加物の娘イオンのｍ／ｚ比が付加物イオンのｍ／ｚ比と異なるステップと、
（ｉｉｉ）付加物の娘イオンを、それによって付加物の娘イオンがそのｍ／ｚ比により特徴付けられる質量分析による解析の第２段階で解析するステップと
を含む。

【0087】

任意選択で、付加物イオンが、それによって第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離され、第２の代替の付加物の娘イオンが生成される代替の断片化を受ける。この場合、付加物の第１および第２の娘イオンが両方とも、それによって付加物の第１および第２の娘イオンが両方ともそれらのｍ／ｚ比により特徴付けられる質量分析による解析の第２段階を受けることができる。例えばアリールまたはハロゲンラジカルの遊離による、第２の代替の中性イオン損失を可能にする試薬化合物（Ｉ）の使用により、試料中の分析物分子の存在および／または量についての追加の情報が得られる。これは、特に、複雑な生物学的試料の解析に関連する。

【0088】

本発明は、試料中の単一分析物または複数の異なる分析物分子の測定を可能にする。しかし、本発明は、マルチプレックス、すなわち複数の試料中の複数の異なる分析物分子の測定も可能にする。

【0089】

特定の化合物は、質量分析で使用される場合、有利であると考えられる。したがって、さらなる態様では、本発明は、以下に開示される化合物に関する。
さらなる態様では、本発明は、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｌ_１、およびＬ_２は、上に定義されている通りである］の化合物である、質量分析で使用するための試薬を提供する。

【0090】

特に、本発明は、その任意の塩を含めた、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、Ｘがアクリエステルではないという条件で、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量の中性種が遊離される断片化が質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、上に定義されている、少なくとも１個の永久正荷電部分を含む荷電ユニットであり、好ましくはテトラアルキルアンモニウム、１－アルキルピリジニウム、または１，３－ジアルキルイミダゾリウムユニットである］
の化合物である試薬または少なくとも１つの化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキットに関する。
特に、本発明は、その任意の塩を含めた、式（Ｉａ）：
Ｘ－Ｌ_１－Ｙ－Ｌ_２－Ｚ （Ｉａ）
［式中、
Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、またはヒドロキシル反応基であり、
Ｌ_１は、結合またはスペーサーであり、
Ｙは、それによって中性種、特に低分子量中性種が遊離される断片化が、質量分析条件下で可能である中性イオン損失ユニットであり、
Ｌ_２は、結合またはスペーサーであり、
Ｚは、少なくとも１つの負電荷部分を含む荷電ユニットである］
の化合物である試薬または少なくとも１種の化合物（Ｉａ）を含む組成物もしくはキットに関する。

【0091】

複数の実施形態で、上に特定されている化合物（Ｉａ）の反応基Ｘは、本明細書中の上に記載の分析物分子上の様々な官能基と反応するように選択することができる。どの反応基Ｘが、目的の分析物の官能基への結合に適格であるかを決めることは、周知のことの範囲内である。分析物分子上の官能基は、隣接ジオール、フェノール基、核酸塩基、アミノ、メルカプト、ヒドロキシ、１－ヒドロキシ－２－アミノアルキル、１－アミノ－２－メルカプトアルキル、ケト、１，３－ジエニル、エニル、アリル、ホルミル、およびカルボキシラート基である。反応基については、標準的な教科書「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」第３版：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８２２３９－０．０００２５－Ｘ；および「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」、第１１版。Ｉａｉｎ Ｄ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，２０１０；および総説（例えばＸ． Ｃｈｅｎら、Ｏｒｇ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２０１６，１４，５４１７－５４３９；およびＴ． Ｈｉｇａｓｈｉ Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１６ Ｓｅｐ；１６２：５７－６９）に概説されている。

【0092】

特に、反応基Ｘは、カルボニル反応基、親ジエン反応基、カルボン酸反応基、フェノール反応基、アミノ反応基、ヒドロキシル反応基、またはチオール反応基である。特に、反応基Ｘは、アミン反応基、チオール反応基、カルボニル反応基、親ジエン反応基、１，２ジオール反応基、カルボン酸反応基、ヒドロキシル反応基、１－アミノ２－ヒドロキシアルキル反応基、１－アミノ２－メルカプト反応基、およびフェノールのオルト位で反応する基からなる群から選択される。

【0093】

好ましい一実施形態では、基Ｘは、カルボニル基を有する任意のタイプの分子、例えば、炭水化物分子と反応することができるカルボニル反応基である。特に、炭水化物－化合物の反応基Ｘは、グルコース、マンノース、ガラクトース、リボース、またはフコースなどのアルドース、およびリブロースまたはフルクトースなどのケトースを含めたあらゆるタイプの糖と反応することができ、また、到達可能なアルデヒドもしくはケト基またはヘミアセタールマスクされたアルデヒドもしくはケト基を有する二糖、三糖、または四糖などのオリゴ糖および多糖と反応することができる。カルボニル反応基は、隣接するＯもしくはＮ原子ＮＨ_２－Ｎ／Ｏを通したα効果によって強化された超求核性のＮ原子またはジチオール分子のいずれかを有しうる。これは、下記から選択されるものでもよい：
（ｉ）ヒドラジン基、例えばＨ_２Ｎ－ＮＨ－またはＨ_２Ｎ－ＮＲ^１－基、
［式中、Ｒ^１は、置換されていてもよい、例えばハロで置換されていてもよいアリール、またはＣ_１－４アルキル、特に、Ｃ_１もしくはＣ_２アルキル、ヒドロキシル、および／またはＣ_１－３アルコキシである］
（ｉｉ）ヒドラゾン基、例えばＨ_２Ｎ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－またはＨ_２Ｎ－ＮＲ^２－Ｃ（Ｏ）－基、
［式中、Ｒ^２は、置換されていてもよい、例えばハロで置換されていてもよいアリールまたはＣ_１－４アルキル、特に、Ｃ_１もしくはＣ_２アルキル、ヒドロキシル、および／またはＣ_１－３アルコキシである］
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノ基、例えばＨ_２Ｎ－Ｏ－基、および
（ｉｖ）ジチオール基、特に１，２－ジチオールまたは１，３－ジチオール基。

【0094】

好ましい一実施形態では、反応基Ｘは、ケト基を含む各分析物と反応することができるケト反応基、例えば、ケトステロイド様ＤＨＴ、テストステロン、エピテストステロン、デスオキシメチルテストステロン（ＤＭＴ）、テトラヒドロゲストリノン（ＴＨＧ）、アルドステロン、エストロン、４－ヒドロキシエストロン、２－メトキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン、１６－ケトエストラジオール、１６アルファ－ヒドロキシエストロン、２－ヒドロキシエストロン－３－メチルエーテル、プレドニゾン、プレドニゾロン、プレグネノロン、プロゲステロン、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、１７ＯＨプレグネノロン、１７ＯＨプロゲステロン、１７ＯＨプロゲステロン、アンドロステロン、エピアンドロステロン、およびデルタ４－アンドロステンジオン）１１－デスオキシコルチゾールコルチコステロン、２１デオキシコルチゾール、１１デオキシコルチコステロン、アロプレグナノロン、およびアルドステロンである。

【0095】

例えば、Ｂｒ／Ｉ－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－などの反応性ハロアセチル基、アクリルアミド／エステル基、マレイミドなどのイミド、またはメチルスルホニルフェニルオキサジアゾール（Ｎ． Ｔｏｄａら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ． ２０１３ Ｎｏｖ ２５； ５２（４８））は、分析物分子上のチオール基などの求核性の基と反応できる。アミノ反応基、例えば、Ｎ－ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）もしくはスルホ－ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、四角酸エステル、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）エステル、または１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）エステル基などの活性エステル基、塩化スルホニル、またはイソチオシアナトもしくはイソシアナト基は、分析物分子上のアミノ基と反応できる。上記のヒドラジンまたはヒドロキシルアミノ基も、分析物分子上に存在する他の求電子性の基と反応させるのに使用できる。

【0096】

隣接ジオールへと結合するために、反応基Ｘは、ボロン酸を含んでもよい。あるいは、ジオールは、酸化させて、それぞれのケトンまたはアルデヒドにし、次いでケトン／アルデヒド反応基Ｘと反応させることができる。ジエンに結合させるための反応基Ｘとして、トリアゾールジオンなどのジエノフィルを選択することができる．分析物分子上にあるフェノール基は、ｅｎ反応を介して（Ｈ． Ｂａｎ ｅｔ ａｌ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，２０１０，１３２（５），ｐｐ １５２３－１５２５）またはジアゾ化によって、あるいはｏｒｔｈｏ－ニトロ化し、続いて、次いでアミン反応性試薬と反応させることができるアミンに還元することによって、トリアゾールジオンと反応させることができる。核酸塩基は、反応基ＸとしてのクロロアセチルまたはＰｔ錯体と反応させることができる。末端システインは、反応基Ｘとしてのシアン化ヘテロアリール／アリールと反応させることができる。末端セリンは、酸化させてアルデヒド基を産生させ、次いで既知のアルデヒド反応基Ｘと反応させることができる。当業者は、測定する分析物分子上にある官能基に応じて、化合物（Ｉａ）に適した反応基Ｘを選択する。

【0097】

さらなる実施形態では、反応基は、プロスタグランジンの誘導体化に使用することができるカルボン酸反応基、例えばジアゾ化合物（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ２０１２，７５，８７５－８８１）である。他のよく知られているカルボキシレート反応基は、ハロゲン化アルキルである。カルボン酸の活性化と、それに続くアミンまたはヒドラジンなどの求核剤との反応（Ａ． Ｋｒｅｔｓｃｈｍｎｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ｖｏｌｕｍｅ ８７９，１７－１８，Ｍａｙ ２０１１，Ｐａｇｅｓ １３９３－１４０１）もよく知られている。

【0098】

ヒドロキシル反応基（Ｔ． Ｈｉｇａｓｈｉ Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１６ Ｓｅｐ；１６２：５７－６９）は、塩化スルホニル、活性化カルボキシルエステル（ＮＨＳまたはイミダゾリド）、およびフッ素の求核置換が可能なフルオロアロマート／ヘテロアロマートである。

【0099】

好ましい一実施形態では、反応基Ｘは、フェノール基を有する任意のタイプの分子と反応することができるフェノール反応基、例えばステロイド、ステロイド様化合物、エストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、１７ａ－エストラジオール、１７ｐ－エストラジオール、エストリオール（Ｅ３）、１６－エピエストリオール、１７－エピエストリオール、および１６，１７－エピエストリオール、ならびに／またはその代謝物である。例えば、フェノール反応基は、１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン基でもよい。１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオンは、求ジエン体として作用することもでき、したがって、ビタミンＤである１α，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_３、１α，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_２、２５（ＯＨ）ＶｉｔＤ_２、２５（ＯＨ）ＶｉｔＤ_３および２４Ｒ，２５（ＯＨ）_２ＶｉｔＤ_３の検出に有用である。

【0100】

化合物（Ｉａ）は、さらに中性イオン損失ユニットＹを含む。本願との関連では、用語「中性イオン損失ユニット」は、電荷を有しない部分を失うことができるユニットを指す。前記部分は、限定されるものではないが、イオン、原子、および複数の原子を含む。ユニットＹは、中性であり、すなわち、正電荷も負電荷も帯びず、本明細書中下記に定義されているリンカーＬ_１を介して反応基Ｘに連結されている。中性ユニットＹは、ＭＳの条件下で、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）を、例えば三連四重極型ＭＳ内で受けた場合、それによって中性種が遊離される断片化が可能である。第１の中性種の遊離の後、ユニットＹの残部は、依然として中性のままである。必須ではないが、典型的には、１種の中性種の遊離、すなわち第１の中性種の遊離が起こる。特定の実施形態では、２種の中性種が遊離される。

【0101】

第１の中性種は、低分子量中性種、例えば分子量が１００未満である、さらに特定すると８０未満である中性分子でもよい。さらに、第１の中性種は、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、ＮＯ、ＮＯ_２、またはＮ_２などの無機分子でもよい。特に、中性種は、Ｎ_２またはＳＯ_２である。さらに特定すると、第１の中性種はＮ_２である。中性分子の損失を引き起こす反応は、好ましくは逆環化反応、特に１，３－双極子逆環化でもよい。本開示との関連では、用語「逆環化」は、任意の環化付加反応の逆転を指す。

【0102】

特定の実施形態では、中性イオン損失ユニットＹが環状部分（例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプタジエン－７－オンのような環状ケトンはＣＯを失うことが知られている）、特に複素環部分、さらに特定すると、それによって上記の第１の中性種が遊離される断片化が可能である６員、５員、または４員の複素環部分を含むまたはからなる。そのような（複素）環状基は、それによって中性種が遊離される逆（複素）環化付加反応による断片化を容易に示す。

【0103】

好ましくは、中性イオン損失ユニットＹは、トリアゾール、特に１，２，３－トリアゾール、テトラゾール、テトラジン、１，２，３オキサもしくはチアジアゾール、またはその水素化誘導体から選択される環状アゾ化合物および５員環など、相互に隣接する，例えば１，２位にＮ、Ｏ、および／またはＳ原子、特にＮ原子などの少なくとも２個のヘテロ原子を有する５員または６員の複素環部分を含むまたはからなる。上記の複素環に、さらなる環、例えばベンゾチアジアゾールまたはベンゾトリアゾールをアニールさせることができる。複素環は、例えば、２，５－ジヒドロピロール、２，５－ジヒドロチオフェン－１，１－ジオキシドに部分的に水素化することができる。

【0104】

特に好ましい実施形態では、５員の複素環部分は、トリアゾール部分であり、これは、アルキンおよびアジドの環化付加またはクリック反応を介して、必須ではないが、触媒としてＣｕ（Ｉ）が存在してもよい状態で、合成されたものでもよい。ＭＳの条件下で、トリアゾール部分の断片化が、１，３双極子逆環化反応を介したＮ_２の遊離を引き起こし、それによって質量分析計における質量／電荷比（ｍ／ｚ）が２８に低下する。

【0105】

当業者ならば、市販のソフトウェア、例えばＡＣＤ／ＭＳ Ｆｒａｇｍｅｎｔｅｒ（ＡＣＤ Ｌａｂｓ）を用いて中性イオン損失ユニットを同定できることを十分に認識している。さらに中性損失を引き起こす反応および分子種は次の参考文献に記載されている。
Ｃａｒｅｙ，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ： Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｅｉｎ ｗｅｉｔｅｒｆｕｈｒｅｎｄｅｓ Ｌｅｈｒｂｕｃｈ Ｋｏｒｒｉｇｉｅｒｔｅｒ Ｎａｃｈｄｒｕｃｋ ＶＣＨ １９９５； ＩＳＢＮ： ３－５２７－２９２１７－９、Ｆｒｅｄ Ｗ． ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ，Ｆｒａｎｔｉｓｅｋ Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｖｏｎ Ｍａｓｓｅｎｓｐｅｋｔｒｅｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｐｅｋｔｒｕｍ １９９５，Ｓｏｆｔｃｏｖｅｒ： ＩＳＢＮ９７８－３－６４２－３９８４８－３。

【0106】

特定の実施形態では、式（Ｉａ）の化合物は、少なくとも１つの荷電部分、すなわち実質的に中性の条件下で主に荷電状態で存在する部分を含む荷電ユニットＺを有する。例えば、荷電ユニットＺは、以下を含む
（ｉ）一級、二級、三級、もしくは四級アンモニウム基またはホスホニウム基などの少なくとも１個の永久正荷電部分、特にｐＫ_ａが１０以上である、さらに特定するとｐＫ_ａが１２以上である永久正荷電部分、または
（ｉｉ）リン酸基、硫酸基、スルホン酸基、またはカルボキシラート基などの少なくとも１つの負電荷部分、特にｐＫ_ｂが１０以上であり、さらに特定するとｐＫ_ｂが１２以上である負電荷部分。

【0107】

本願との関連では、用語「ｐＫ_ａが～である」とは、当該荷電部分が無い分子のｐＫ_ａ値とは異なる特定のｐＫ_ａ値を荷電部分が分子全体に与えているという事実を指す。例えば、用語「少なくとも１個のｐＫ_ａが１０以上である正荷電部分」は、前記少なくとも１つの正荷電部分を含む分子全体が１０以上のｐＫ_ａを示すことを指定する。ｐＫ_ｂ値にも同じことが類似してあてはまる。

【0108】

荷電ユニットＺは、本明細書に定義されているリンカーＬ_２を介して中性イオン損失ユニットＹに連結されている。したがって、電荷および中性損失を行う能力が、様々なユニットによって提供される。中性イオン損失ユニットＹが断片化されて（低分子量）中性種の遊離が起こる条件下でさえ、荷電ユニットＺは無荷電のままである。これは、残部の荷電状態が変わらないことを意味する。化合物が、荷電ユニットＺ内の正電荷により以前に正荷電であった場合、それは、低分子量中性種を遊離した後でも正荷電のままである。

【0109】

好ましくは、化合物（Ｉ）は、少なくとも１個の正荷電部分を含む荷電ユニットＺを有する。最も好ましくは、荷電ユニットＺが、１個の正荷電部分からなり、代替の断片化を行うことができるいかなる基も有しない。

【0110】

電荷は、例えば四級アンモニウム基を使用する場合、永久電荷であるか、またはプロトン化（正電荷）もしくは脱プロトン（負電荷）によって生成できる。好ましい永久正荷電ユニットは、テトラアルキルアンモニウム、１アルキルピリジニウム、および１，３－ジアルキルイミダゾリウムユニットである。

【0111】

第１の中性種の遊離に加えて、化合物（Ｉａ）は、質量分析条件下で、代替の断片化、例えばＣＩＤを介した断片化が可能なものでもよい。それによって、第１の中性種とは異なる第２の中性種が遊離される。例えば、第２の中性種は、アリールラジカル、例えば、フェニルラジカルもしくは置換フェニルラジカル、またはハロゲンラジカル（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）を含むことができる。第２の中性種の遊離を起こす代替の断片化は、中性イオン損失ユニットＹからの第１の中性種の遊離に必要なものより高いエネルギ－の条件下でのみ起こることが好ましい。

【0112】

一般式（Ｉａ）における基Ｌ_１およびＬ_２は、独立に、結合、すなわち共有結合、またはスペーサー、すなわち鎖長が１から通常、４、６、８、もしくは１０原子、もしくはそれより長い、例えばＣ原子であり、任意選択で少なくとも１個のヘテロ原子を含む直鎖もしくは分枝のスペーサーを表す。好ましくは、基Ｌ_１およびＬ_２は、長さが１、２、または３原子の短いスペーサーであって、最も好ましくは代替の断片化を受ける可能性のあるいかなる部分も無いスペーサーである。さらに、基Ｌ_１およびＬ_２がいかなる立体中心も含まないことが好ましい。立体異性体が存在する場合、１種のみの立体異性体が存在し、２種以上の立体異性体の混合物は存在しない。ＭＳで使用するには、化合物（Ｉ）は、立体異性について純粋な形で用意することが好ましい。特定の実施形態では、Ｌ_１およびＬ_２は、相互に独立に、少なくとも１個のヘテロ原子を任意選択で含む、Ｃ１－Ｃ４アルキルスペーサーである。さらなる実施形態では、Ｌ_１またはＬ_２の一方は、上記の代替の断片化の対象となりうる、フェニル基などのアリール基を含む。

【0113】

式（Ｉａ）の試薬は、質量分析条件下、その結果生じる付加物（ＩＩ）、すなわち中性イオン損失ユニットＹにおける１つの位置のみで単独の中性損失が１回起こるように設計すると有利である。付加物が代替の断片化の対象となりうる任意のさらなる基を、例えばスペーサーＬ_１および／またはＬ_２内に含む場合、前記代替の断片化は、中性イオン損失ユニットＹからの第１の中性種の遊離に要求されるよりも高いエネルギ－の条件下で起こることが好ましい。代替の断片化の例には、アリールまたはハロゲンラジカルなど、第１の中性種とは異なる第２の中性種の遊離が含まれる。

【0114】

式（Ｉａ）の第１の実施形態では、荷電ユニットＺが、一級、二級、三級、もしくは四級アンモニウム基またはホスホニウム基などの正荷電部分を含むまたはからなる。電荷は原則として永久電荷であるか、またはプロトン化によって生成できるが、永久電荷、特に化合物全体のｐＫ_ａが１０以上であり、さらに特定するとｐＫ_ａが１２以上である永久電荷が好ましい。この実施形態による特に好ましい試薬式（Ｉｃ）：

【0115】

【化2】

【0116】

［式中、Ｒは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ_１－４アルキル、特にメチルであり、Ａは、陰イオン、例えばギ酸イオンである］で表される。
別の実施形態では、荷電ユニットＺが、リン酸基、硫酸基、スルホン酸基、またはカルボキシラート基などの負荷電部分を含むまたはからなる．特に、ｐＫ_ｂが１０以上である、さらに特定するとｐＫ_ｂが１２以上であるユニットＺが好ましい。

【0117】

図１は、６種の異なる分析物分子を含む試料中の単一分析物分子の定量的測定の例示的なプロトコールを示す。試料中の分析物分子を試薬化合物（Ｒ）と反応させ、それによって６種の異なる分析物－試薬付加物が得られる。試料中の分析物分子の１つを定量的に測定するため、試薬アイソトポログ化合物（Ｒ^＊）と、その対応する分析物分子の反応によって調製された標準物質が添加される。例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による試料のクロマトグラフィーによる分離の後、目的の分析物と標識されていない試薬（Ｒ）の付加物と、そのアイソトポログ（Ｒ^＊）とは識別できない。したがって、異なる分析物のそれぞれに由来する６種シグナルがクロマトグラフィーの後に観察される。しかし、質量分析は、標識されていない試薬（Ｒ）とアイソトポログ（Ｒ^＊）の間の質量差により、両試薬とは異なるシグナルをもたらす。中性種（ここではＮ_２）の損失によって、生じるシグナルも異なる２種の娘イオンが生成される。添加されるアイソトポログ付加物の量は既知であるので、標識されていない試薬のシグナル強度からの分析物の正確な定量化が較正により可能である。同様に、試料中の他の分析物の正確な定量的測定が可能である。

【0118】

複数の異なるアイソトポログの使用により、マルチプレックスが可能となる。したがって、複数の異なる試料または異なる量の分析物の直接比較が可能である。その対応する例示的なプロトコールを図２に示す．各試料は、６種の異なる分析物分子を含む。３種の異なる試料における６種の分析物分子の定量的値を比較するために、異なるアイソトポログ試薬化合物（Ｒ、Ｒ^＊、およびＲ^＊＊）が、各試料に添加される。これから、異なる３セットの分析物－試薬付加物（Ｒ、Ｒ^＊およびＲ^＊＊）が得られる。次いで、標準物質、例えばそれぞれの分析物の付加物およびさらに同位体により識別可能な試薬Ｒ^＊＊＊が添加される。例えばＬＣによる、クロマトグラフィーによる分離の後に、６種のシグナル、すなわち各分析物につき１種のシグナルが得られる。ＭＳ解析の後に、６ｘ４シグナルが得られる。分析物と試薬Ｒ^＊＊＊の付加物の正確な量が既知であるので、全てのシグナルの定量的測定が可能である。

【0119】

本発明の特に好ましい実施形態は、試薬または試薬のアイソトポログと分析物分子、好ましくは少なくとも１個の反応性アルデヒド基、ケトン基、またはセミアセタール基を含む炭水化物の反応と、形成された付加物の、ＭＳと組み合わせたＧＣまたはＬＣによる、特にＨＰＬＣ－三連四重極型質量分析による解析を含む。

【0120】

本発明の手順は、通常の手順と比較して２つの主な利点を有する。質量分析計における中性イオン損失により、最小限の試料物質での診断を可能にする前例のない感度での分析物分子の検出が可能である。合成された同位体について改変された付加物を内部標準として添加することにより、分析物分子についての定量情報を得ることができる。これにより、２種以上の試料、例えば組織試料の直接比較およびマルチプレックス化が可能となる。

【0121】

本発明は対象、特にヒト対象についての診断および／または予後診断情報の提供など．、臨床適用に適している。具体的な適用は、生体分子、特に糖タンパク質の糖鎖構造の変化と関連する、を伴う、または、によって引き起こされる疾患の診断、例えばがんなどの過剰増殖性疾患の診断、例えば腫瘍の攻撃性および侵襲性の決定、血小板の特徴付け、および肝線維症レベルの測定、抗体の特徴およびＴ細胞などの免疫細胞の特徴の検査である。一般に、試薬（Ｉ）およびそのアイソトポログは、グリコメディシンの分野における特定の糖鎖バイオマーカーの存在およびレベルについての定量情報を得るのに用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】本発明の実施形態の模式図。分析物分子の定量的測定のプロトコールは、試料中の分析物分子を試薬（Ｒ）と反応させ、それによって共有結合性分析物付加物を形成させることを含む。アイソトポログ試薬（Ｒ^＊）を含む標準付加物の添加は、ＬＣと、それに続くＭＳによる分析物分子の定量的測定を可能にする。

【図2】本発明のさらなる実施形態の模式図。複数の分析物の平行定量的測定のプロトコールは、複数試料における分析物分子を、各試料中の同位体について異なる試薬（Ｒ、Ｒ^＊、Ｒ^＊＊）と反応させ、それによって共有結合性分析物付加物を形成させることを含む。さらなるアイソトポログ試薬（Ｒ^＊＊＊）を含む標準付加物の添加は、ＬＣと、それに続くＭＳによる各試料中の各分析物分子の平行定量的測定を可能にする。

【図3】塩基除去修復プロセスの機構。ａ ＡＰ部位およびβＥ部位の形成を伴う塩基除去修復（ＢＥＲ）の化学。ｂ ｄＣにおけるエピジェネティック修飾および可能性のあるＢＥＲによるｆｄＣおよびｃａｄＣの除去の概要。ｃ 試薬１および１がＡＰ部位およびβＥ部位と反応したときに形成される反応生成物の図。

【図4】軽量形態（ａ）および重量形態（ｂ）の試薬１ならびに内部標準９ａ／ｂおよび１０ａ／ｂの合成。（ｉ）ＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、ｒｔ、１６時間、９０％；（ｉｉ）Ｔｒｔ－Ｃｌ、ＮＥｔ_３、ピリジン、ｒｔ、２２時間、７４％；（ｉｉｉ）プロパルギルアミン、ＴＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、ｒｔ、１５時間、９２％；（ｉｖ）７＋４ａ／ｂ、ＣｕＢｒ・ＳＭｅ_２、Ｈ_２Ｏ／ＤＣＭ（１：１）、ｒｔ、１６時間、７７％；（ｖ）６Ｍ ＨＣｌ、ＤＣＭ／Ｈ_２Ｏ（１：１）、ｒｔ、１時間、定量的；（ｖｉ）Ｈ_２Ｏ、３０℃、１６時間、ＨＰＬＣ、１５％；（ｖｉｉ）１）ＤＩＢＡＬ－Ｈ、ＤＣＭ、－７８℃からｒｔ、（２）ＤＭＰ、ＤＣＭ、０℃からｒｔ、ｏ／ｎ、２ステップで４７％；（ｖｉｉｉ）（１）１ａ／ｂ、ＣＨＣｌ_３／Ｈ_２Ｏ（１：１）、ｒｔ、１６時間、６８％、（２）ｐＴＳＡ・Ｈ_２Ｏ、Ｈ_２Ｏ、２５℃、ｏ／ｎ、ＨＰＬＣ（２ｘ）、１４％。

【図5-1】ＡＰ部位およびβＥ部位を定量化するためのＭＳ／ＭＳベースの方法。極めて高感度なシグナルを生ずるＭＳ／ＭＳ実験におけるＡＰ部位（９）およびβＥ部位（１０）標準物質の断片化パターン。

【図5-2】ＡＰ部位およびβＥ部位を定量化するためのＭＳ／ＭＳベースの方法。極めて高感度なシグナルを生ずるＭＳ／ＭＳ実験におけるＡＰ部位（９）およびβＥ部位（１０）標準物質の断片化パターン。

【図6a】ＢＥＲ中間体の定量化および同位体追跡研究。ＡＰ部位およびβＥ部位の誘導体化および解析のための一般ワークフロー。

【図6b】ＢＥＲ中間体の定量化および同位体追跡研究。ｍＥＳＣ培養物への標識化ヌクレオシドのフィーディングにより、標識されていない生成物よりも５質量単位重いリボース標識されたＡＰ部位およびβＥ部位生成物９および１０が形成される。

【図6c】ＢＥＲ中間体の定量化および同位体追跡研究。様々な標識化された付加物およびＤＮＡ修飾の定量的データ。

【図7a】ＡＰ部位（９）の較正曲線。

【図7b】βＥ部位（１０）の較正曲線。

【図8a】規定の脱塩基部位を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の反応速度論。１ａで誘導体化する前（黒い線）および後に得られた脱塩基部位を有するＯＤＮおよび逆方向鎖のＵＶシグナル。

【図8b】規定の脱塩基部位を有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の反応速度論。特定の時点の後におけるＯＤＮ＋１の規準化ＵＶシグナル。

【図9】１によるｇＤＮＡの誘導体化は誘導体化反応が迅速であり、脱塩基部位を人為的に生成しないことを示す。

【図10】グルタチオン（ＧＳＨ）などのチオールとアクリルアミド試薬の反応のスキームおよびＭＳ解析におけるＮ_２損失。

【図11】アクリルアミドプローブを用いたＧＳＨ付加物のＭＳ解析。ａ 単一荷電種のモルピークを、◆で示す。Ｎ_２損失後に形成された断片は、検出可能ではない。ｂ 前駆イオン走査Ｎ_２の損失を示している。ｃ 二重荷電種は、Ｎ_２損失を直接的に示している。

【図12】テストステロンとヒドロキシルアミン試薬の反応のスキーム。

【図13】ヒドロキシルアミンプローブを用いたテストステロン付加物のＭＳ解析。ＭＳ実験は、６３２．５における分子ピーク、６０４．４におけるＮ_２損失後断片、および１９２．１における第２の断片を示している。

【図14】Ｎ_２の損失によるテストステロン付加物の断片化を示すＭＲＭ走査。

【図15】ヒドロキシルアミン試薬を用いたテストステロンの質量分析以下のピークを示している。ａ テストステロン（１１０ａｍｏｌ）ｂ テストステロン（２２ａｍｏｌ）ｃ 付加物Ｎ_２損失（０．１２ａｍｏｌ）ｄ 付加物 フェニル損失 クォリファイアー （０．１２ａｍｏｌ）ｅ 付加物 Ｎ_２損失 （３．６ａｍｏｌ）ｆ 付加物 フェニル損失 クォリファイアー （３．６ａｍｏｌ）ｇ テストステロン （１１ｆｍｏｌ）

【図16】反応性エステル試薬を用いたドパミンのＭＳ解析。ドパミン付加物のＵＨＰＬＣ－三連／四重極ＭＳスペクトル。はっきりと見えるのは、ｍ／ｚ＝５５３における分子ピークおよびｍ／ｚ＝５２５におけるＮ_２損失シグナルである。

【発明を実施するための形態】

【0123】

以下の実施例により本発明をより詳細に記載する。

【実施例】

【0124】

１．緒言
塩基除去修復（ＢＥＲ）は、損傷した塩基を細胞がゲノムから除去するのを可能にする主要なＤＮＡ維持プロセスである（１，２）。このプロセスは、非標準の塩基を認識する特定のＤＮＡグリコシラーゼの作用を必要とする（図３ａ）（３）。２種の異なるタイプのＤＮＡグリコシラーゼが知られている。それらは両方とも、最初に脱塩基（ＡＰ）部位中間体を生成するグリコシド結合の切断を触媒する（ステップａ、図３ａ）。単機能グリコシラーゼは、その後、ホスホジエステル結合を加水分解して一本鎖切断を生じさせるのに、ＡＰＥ－１などのエンドヌクレアーゼを必要とする（ステップｂ、図３ａ）。二機能性グリコシラーゼは、対照的に、β脱離（βＥ）反応を触媒し（ステップｃ、図３ａ）、その結果、規定のβＥ中間体が生成する。このβＥ中間体は、次いで、その後のβ脱離反応によって１ヌクレオチドギャップに変わる可能性がある（ステップｄ、図３ａ）（２，３）。ＢＥＲは、結果として一本鎖切断の形成と共に、修復された塩基が反対の鎖にある場合には、二本鎖切断と共に起こる。

【0125】

市販のアルデヒド反応性プローブなどのＢＥＲ中間体を測定するための現在のアプローチは、鎖式アルデヒド型のＡＰ部位と反応する、ヒドロキシルアミンを含有する化学プローブであり（図３ａ）、ほとんどが濃縮および検出用の親和性基を用いる。これらアプローチの主要な欠点は、原則としてこれらのプローブがあらゆるアルデヒドおよびケトンと非選択的に反応すること、ならびに誘導体化された生成物のアイデンティティーが特徴付けされないまま残り、ＡＰ部位とβＥ部位の間の識別が妨げられることである。

【0126】

最近、ＢＥＲがゲノムから、損傷した塩基だけでなく、後成的に関連性のある塩基である５－ホルミル－シトシン（ｆｄＣ）（４）および５－カルボキシシトシン（ｃａｄＣ）もチミンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｔｄｇ）で切断できる（５）ことが発見された。両方とも、β－ケトグルタル酸依存性Ｔｅｔオキシゲナーゼの助けにより、５－ヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍｄＣ）を介した５－メチル－シトシン（ｍｄＣ）の酸化によって形成される（図３ｂ）（５，６）。新しい塩基の正確な機能は知られていないが、ｆｄＣおよびｃａｄＣの除去は、長きにわたり探されてきた活性脱メチル反応の一部のようである（図３ｂ）。

【0127】

ここでは、極めて高感度なＵＨＰＬＣ－三連四重極型質量分析および同位体補給と組み合わせて、ＡＰ部位およびβＥ部位の正確な定量化を可能にし、検出限界がゲノムあたり１００中間体にまで達する新しい試薬の開発を報告する。この新しい技術によって、本発明者らは、両方のタイプの中間体ともピリミジンに蓄積しないことを明らかにすることができた。これは、エピジェネティック部位のＢＥＲが、幹細胞ゲノムにおける予測されたような有害な事象ではないことを示す。
２．結果および考察
この新しい技術の基礎は、反応性ヒドロキシルアミンユニットを含有し、ＡＰ部位およびβＥ中間体の両方と安定的かつ規定の反応生成物を形成できる（７）試薬１である（図３ｃ）。本発明者らは、形成された付加物（図３ｃ）は加水分解酵素の作用を妨げず（下記参照）、それによって、高感度な質量分析検出および定量化のために、反応生成物をゲノムから切り出すことができることを示した。重要なことに、試薬１は、三連四重極型ＭＳ内で、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介して容易に断片になり、Ｎ_２の損失によって集中的な娘イオンを生じるトリアゾールユニットを含有する。これにより、迅速かつ信頼できる検出が可能となる。１の四級アンモニウム中心にある永久正電荷が、さらに可能な限り最も高い感度および規定の荷電状態を確実にしている。それは、負荷電のＤＮＡ二本鎖に包埋されたＡＰ部位およびβＥ部位との反応も加速する。

【0128】

この試薬の合成を図４に示す。合成は、ｐ－アジドアニリン２から始まり、これを、カップリング試薬としてＴＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（ベンゾ－トリアゾール－１－イル）ウロニウムテトラフルオロ－エロレート）を用いて、トリメチルアミノグリシン３と反応させ、アジド－アミド４を生成する。目的とする正確なＭＳベースの定量化（下記参照）に必要な試薬１の安定アイソトポログは、（ＣＤ_３）_３－グリシン誘導体を介して、このステップで得られ、これにより９個のＤ原子が導入できる。

【0129】

平行して、Ｏ－（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミン５が、ＴＢＴＵをカップリング試薬として用いて、６^８にＴｒｔ（トリチル）保護され、６がプロパルギルアミンと反応して、アルキン７を生成する。Ｃｕ（Ｉ）で触媒されたアジド－アルキンクリック反応を介した、７と４の反応により、トリアゾール８が生じた。厳しい酸性条件下でのＴｒｔ基の開裂により、軽量バージョン（ＣＨ_３、ａ）および重量バージョン（ＣＤ_３、ｂ）Δｍ／ｚ＝９）の試薬１が全収率４７％でわずか５ステップで得られる。この試薬を逆相ＨＰＬＣで２回精製し、この研究に必要とされる純度＞９９．９％を確保する。

【0130】

計画されている正確な質量分析定量のため、予期されているＡＰ部位およびβＥ部位反応生成物を、較正曲線作成用および内部標準用の通常（ａ）および重同位体（ｂ）標識された化合物として調製した。そのため、本発明者らは、試薬１ａ／ｂをリボースと反応させて、予期されているＡＰ部位反応生成物９ａ／ｂを得た。必要とされるβ脱離生成物１０ａ／ｂを調製するために、アセトニド保護されたメチルエステル１１をＤＩＢＡＬ－Ｈでアリルアルコールに還元し、これを、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ試薬を用いて選択的にアルデヒド１２に酸化した。試薬１ａ／ｂと１２の反応および最終的なアセタール保護基の開裂により、再度、それぞれ軽量型および重量型の所望の化合物１０ａ／ｂを得た。化合物９ａ／ｂおよび１０ａ／ｂを、最後に逆相ＨＰＬＣにより純度＞９９．９％に精製した。

【0131】

本発明者らは、次に、ＵＨＰＬＣ－ＥＳＩ－三連四重極型（ＱＱＱ）機械を用いた質量分析ベースのＡＰ部位およびβＥ部位検出手順を開発した（図５）。ＡＰ部位反応生成物９ａの解析は、アリールラジカルの形成の下に、予期されたＮ_２損失および第２の断片化の後に形成される２種の分子断片によって引き起こされるＭＳ遷移ｍ／ｚ＝４７８．２→４５０．２（クオンティファイアー）およびｍ／ｚ＝４７８．２→１９２．１（クォリファイアー）のきれいな対称的なシグナル（ｔ＝９．５分、勾配については、を参照ＳＩ）を示した。第１のＭＳ遷移（クオンティファイアー）は、付加物の正確な定量化に用い、第２のＭＳ遷移（クォリファイアー）は、構造評価に用いた。アイソトポログ９ｂは、同じ保持時間に、予期された質量移行遷移ｍ／ｚ＝４８７．３→４５９．２およびｍ／ｚ＝４８７．３→２０１．２を示した。同様に、βＥ反応生成物１０ａおよびそのアイソトポログ１０ｂの高品質データを得た（図５）。

【0132】

次いで、本発明者らは、合成ＡＰ部位反応生成物９ａを用いた希釈実験を行い、ＭＳ－シグナルをモニターした。本発明者らは、ＡＰ部位９ａ／ｂをアトモル（ＡＰ部位のＬＯＤ＝１１０ａｍｏｌ）範囲で検出することができた。全体のＡＰおよびβＥレベルを定量化するのに必要されたゲノムＤＮＡは、１試料あたり若干５ｍｇであったが、これは、以前に発表されている方法（９）と比較して３桁高い感度である。試薬１で得られた感度は、二機能性グリコシラーゼによって形成されたβＥ中間体の検出も可能にした。ここでもまた、検出性が、アトモル範囲（ＬＯＤのβＥ部位＝１１０ａｍｏｌ）にまで広がった。

【0133】

次いで、本発明者らは、ＢＥＲの中間体の定量化を始めた。単機能ＤＮＡグリコシラーゼＴｄｇによるｆｄＣおよびｃａｄＣの除去と組み合わせたＢＥＲは、胚発生中の主要なプロセスであることが報告された（４，５，１０，１１）。この研究では、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣｓ）のナイーブ培養物をプライミング条件（ＦＢＳ／ＬＩＦ）条件下で５日間培養した。その後、本発明者らは、標準プロトコール（下記参照）を用いてゲノムＤＮＡを単離し、これを試薬１ａとインキュベートした。

【0134】

本発明者らは、１ａとのゲノムＤＮＡの誘導体化反応は脱塩基部位を人為的に導入しないこと、および定量化されたレベルが内因性レベルであることを示すために、本発明者らが確立したプロトコール（下記参照）を用いて、幹細胞ＤＮＡに１ａを添加し、いくつかの時点で反応を停止させた。混合物中の得られたＡＰ部位の定量化は、若干１分後には反応が既に完了したことを示し、インキュベーション時間を６０分まで延長しても、脱塩基部位の量の増加が無かったことが示された。その後、脱塩基部位の完全な誘導体化を確実にするためのさらなる研究のため、この試薬を３７℃で４０分間反応させた。このＤＮＡを、後で、ヌクレアーゼＳ１、南極ホスファターゼ、およびヘビ毒ホスホジエステラーゼの混合物で、１ヌクレオシドレベルまで消化した（下記参照）。この酵素が確実に反応生成物を完全に切り出すことができるように、本発明者らは、１つのｄＵ塩基でＤＮＡを調製し、このＤＮＡにｄＵ開裂グリコシラーゼＵｄｇを添加して規定の脱塩基部位を導入し、続いて試薬１ａとインキュベーションし、生成されたＡＰ部位の量を定量化した（下記参照）。本発明者らは、予期されたレベルのＡＰ部位を正確に測定した。これは、この試薬が穏やかな条件で定量的に反応すること、およびこの酵素消化プロトコールによって反応生成物が完全に単離されることを示す。

【0135】

本発明者らは、幹細胞ＤＮＡ中のＢＥＲ中間体の正確な定量化のために、ＤＮＡ消化後に再度９ｂおよび１０ｂを内部標準として添加し、得られた混合物をＵＨＰＬＣ－ＱＱＱシステムに注入した。標準塩基からの予期されたシグナルに加えて、２種の追加のシグナルが、天然のＡＰ部位およびβＥ部位反応生成物９ａおよび１０ａで観測された．これは、この試薬およびＭＳ方法によって、これらの重要ＢＥＲ中間体をゲノムＤＮＡ中で直接的に検出および定量化できることを示す。

【0136】

同位体標準物質９ｂおよび１０ｂを用いた正確な定量化により、本発明者らは、ＡＰ部位およびβＥ部位の全体定常状態レベルをそれぞれｄＮあたり８．８×１０^－７および１．７×１０^－６に決定することができた。これは、極めて低いレベルであるが、この方法は感度が高いので、十分に定量化限度の範囲内である（下記参照）。

【0137】

これらのＢＥＲ付加物が確かに内因的に存在する定常状態レベルであるかどうか、付加物が例えばＤＮＡ単離中および試料調製中に形成されるかどうか（これは、βＥ付加物ではほとんど不可能である）を検討するために、本発明者らは、この試薬とのインキュベーション時間を体系的に１時間まで増加させた。しかし、正確な定量化は、この可能性を否定するような値の増加は示さなかった（下記参照）。本発明者らは、ｄＵ含有ＤＮＡを用いた研究も繰り返し、Ｕｄｇとのインキュベーション時間とその後の処理時間を両方とも増加させた。ＡＰレベルの増加は観察されなかった。これは、ＤＮＡ単離および操作によって、ＢＥＲ中間体のレベルが増加しないことを示す。

【0138】

ゲノムＤＮＡで得られた正確な定量化データは、したがって、βＥ部位およびＡＰ部位が両方とも低い定常状態レベルで存在することを示す（図６ｃ）。これは、単機能性および二機能性グリコシラーゼの両方によるゲノムの定常的修復を確認するものである。興味深いことに、より高いレベルのβＥ部位が観察される。これは、二機能性グリコシラーゼによる修復が優勢であるか、これらの中間体は代謝回転が低く、それゆえ、より高い定常状態レベルまで蓄積されることを示す。

【0139】

次いで、本発明者らは、個々のＤＮＡ塩基の修復プロセスを読み解くことを望んだ。このため本発明者らは、３種の異なるｍＥＳＣ培養物を調製し、図６ｂに示すように、リボースの全てのＣ原子が^１３Ｃに交換され、環内Ｎ原子が^１５Ｎに交換されている同位体標識されたｄＣ^＊、ｄＧ^＊、またはｄＴ^＊ヌクレオシドのいずれかを添加した。これらの組み込まれた塩基およびそれらの誘導体におけるＢＥＲは、標識されていないＡＰまたはβＥ部位で形成される反応生成物９ａおよび１０ａと比較して５質量単位重く、内部標準９ｂおよび１０ｂより４質量単位軽いＡＰおよびβＥ反応生成物９^＊および１０^＊を生じるはずである。まず、本発明者らは、組み込みの効率をモニターした。^１３Ｃ_１０－ｄＧ（ｄＧ^＊）については９３％の組み込みがみられた。^１３Ｃ_９－ｄＣ（ｄＣ^＊）は、４０％まで組み込まれ、^１３Ｃ_１０－ｄＴ（ｄＴ^＊）は、ｄＴをほとんど全て置き換えた（９７％組み込み）。同位体標識されたｄＡは、後の調査に十分に高いレベルで組み込むことができなかった。次いで、本発明者らは、ｄＣ^＊、ｄＧ^＊、およびｄＴ^＊で生成されたＡＰ部位およびβＥ部位の正確な定量化を行い、比較データを得るために、得られた値を組み込み１００％に規準化した。ｄＧ塩基は、酸化的損傷を受けやすいことが知られており、形成された損傷部位は、ＢＥＲによって修復されることが知られている（１２，１３）。ｄＧ^＊実験では、実際、ＡＰ部位およびβＥ部位（～２．７×１０^－７）は両方ともほぼ同じレベルであることが観察される。これは、ｄＧ由来の塩基損傷部位がＢＥＲによって確かに修復されることを示している。重要なことに、ここでは、全体データとは対称的に、より多くのＡＰ部位がみられた。これは、主要なＤＮＡグリコシラーゼＯｇｇ１が、二機能性グリコシラーゼであるが、遅いβ脱離効率しかなく、それゆえ、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ほとんどＡＰＥ１と組み合わせて機能するというアイデアと完全に一致している（１４，１５）。

【0140】

やや安定な塩基であることが知られているｄＴでは、両方ともＡＰ部位およびβＥ部位のレベルが、ｄＮあたり１０^－８未満である。これは、ゲノムあたり１００未満のＢＥＲ中間体に相当する。このレベルは、定量下限（ＬＬＯＱ）より少し低い（図６ｃ）。

【0141】

次いで、本発明者らは、ｄＣおよび後成的にｄＣから派生した塩基におけるＢＥＲプロセスについて研究した。ｄＣ塩基は、ゲノム中である程度まで脱アミノ化することが知られており、これがｄＵ：ｄＧミスマッチを生み出している（１６）。加えて、ｄＣは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔｓ）によってｍｄＣにメチル化され、これも脱アミノ化して、ｄＴ：ｄＧミスマッチを生じる（１７）。これらミスマッチの両方が、単機能グリコシラーゼＵｎｇ２、Ｓｍｕｇ１、ＴｄｇおよびＭｂｄ４によって修復されることが知られており、これによって、検出可能なＡＰ部位が生じるはずである（１８，１９）。さらに、ｄＣ誘導体であるｆｄＣおよびｃａｄＣは単機能グリコシラーゼＴｄｇによって開裂する、ことが見いだされた（４，５）。これら全てのＢＥＲ事象を研究するため、本発明者らは、ＦＢＳ／ＬＩＦ条件下で培養したｍＥＳＣｓに１００μＭ ｄＣ^＊を５日間与えた。ＤＮＡ単離後、本発明者らは、試薬１ａを添加し、このＤＮＡを消化し、再度、標識されたＡＰ部位およびβＥ部位のレベルを測定した。実際、ｄＴを用いた実験とは対照的に、中間体が検出された。これは、ｄＣ塩基は、脱アミノ化により安定性が低下しているというアイデアと一致している。しかし、驚いたことに、二機能性修復グリコシラーゼによって生成される標識化βＥ中間体のみが測定され、標識化ＡＰ部位の形成は、ＬＬＯＱ未満であった（図６ｃ）。

【0142】

この結果は、最近の研究から得られたデータと完全に一致する。これは、Ｔｄｇが、酵素Ｎｅｉｌ１－２との密着した複合体で作用している可能性があることを示している（２０）。Ｎｅｉｌタンパク質は、ＡＰ部位の定常状態を低位レベル、したがって、耐えられるレベルに維持するために、生成したＡＰ部位に結合して迅速なβおよびδ脱離反応を触媒するとされている。

【0143】

さらに、定量化により、ｄＣ^＊におけるβＥ部位のレベルがｄＮあたり１．３×１０^－７であることが明らかになった．この数を原則として修復可能なｆｄＣおよびｃａｄＣのレベルに関連づけるために、本発明者らは、これらの塩基も定量化した。ｆｄＣのレベルは２．１×１０^－６と測定され、１．０×１０^－７のｃａｄＣが検出された。したがって、定常状態ｆｄＣレベルはβＥ部位レベルより１桁高い。これは、ｆｄＣの高いレベルが相当量のＢＥＲ中間体に結びつかないことを示しており、これは、ｆｄＣの報告されている安定性と整合する。

【0144】

エピジェネティックなｄＣ部位における修復へのさらなる洞察を得るために、本発明者らは、ＴｄｇかＮｅｉｌ１タンパク質とＮｅｉｌ２タンパク質の両方のいずれかを欠失しているｍＥＳＣを研究し、両細胞株にｄＣ^＊を与えた。得られたデータを図６ｃに示す。Ｔｄｇの除去は、ｆｄＣおよびｃａｄＣのレベルを明らかに増加させ、これは、このタンパク質がＢＥＲベースの除去に関連しているというアイデアと整合する。ｆｄＣのレベルは、１０倍に増加する。ｃａｄＣレベルは、５倍上昇する。このｆｄＣおよびｃａｄＣの増加は、標識されたβＥ部位または標識されたＡＰ部位を有意に変化させない。驚いたことに、Ｎｅｉｌ１／２タンパク質を欠失したｍＥＳＣを用いた実験においてさえ、ＢＥＲ中間体の増加は観察されない。これは、この状況では、Ｎｅｉｌタンパク質がβ／δ脱離に貢献しないことを示唆する。最後に、本発明者らは、触媒活性がある全てのＤｎｍｔタンパク質を欠失しており、その結果、ｍｄＣ、ｈｍｄＣ、ｆｄＣおよびｃａｄＣを欠いているｍＥＳＣを研究した。これによっても、標識化βＥ部位のレベルは影響されなかったし、標識化ＡＰ部位の出現も観察されなかった。これは、ｄＣ^＊を用いて定量化されたβＥ部位は全てｄＣ由来の損傷部位から直接的に形成されることを示している。このデータは、ｘｄＣ部位におけるＢＥＲが予期したほど重要ではないか、有害なＢＥＲ中間体が有意な量まで蓄積しないことを保証するために、ＢＥＲ中間体の量を制御し、それらを極めて低い定常状態レベルに維持する複数の経路を細胞が有することを示唆する。
３．結論
結論として、試薬１は、新しい質量分析ベースの技術（ＵＨＰＬＣ－ＭＳ）および同位体補給と組み合わせて、１ゲノムあたり１００のＢＥＲ中間体という前例のない精度および感度を有する、様々な標準塩基における中心ＢＥＲ中間体の定量化を可能にする。活性な脱メチル経路を骨格としたＢＥＲによるｆｄＣおよびｃａｄＣ除去の証拠は得られなかった。ほとんどのＢＥＲ修復プロセスは、ｄＧ部位で検出された。これはおそらく、ｄＧにおける酸化的損傷のためである。
４．方法
４．１ 化学合成手順
別段の記載が無い限り、全ての反応は、窒素雰囲気下でオーブン乾燥させたガラス器具を用いて行った。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＭｏｌｓｉｅｖｅ乾燥させた溶媒を使用し、化学物質は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＴＣＩ、ＣａｒｂｏｌｕｔｉｏｎおよびＣａｒｂｏｓｙｎｔｈから購入した。同位体標識されたトリメチルアミノグリシンは、Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから得た。抽出およびクロマトグラフィーを目的とする場合、工業用の溶媒は、それらを使用する前に蒸留した。反応の制御はＭｅｒｃｋ製のＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４）を用いて行い、フラッシュカラムクロマトグラフィー精製は、Ｍｅｒｃｋ Ｇｅｄｕｒａｎ Ｓｉ ６０（４０－６３μＭ）で行った。ＴＬＣプレートの可視化は、ＵＶ吸収またはＨａｎｅｓｓｉａｎ染料による染色を介して行った。ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ ＶＸＲ４００Ｓ、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ４００、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ ６００、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ ４００およびＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤにおいて、重水素化された溶媒中で記録した。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳスペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ ＦＴ－ＩＣＲから得た。ＩＲ測定は、ダイアモンド－ＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）ユニット付きのＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒスペクトルＢＸ ＦＴ－ＩＲ分光計で行った。ＨＰＬＣ精製は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ製のＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ＶＰ ２５０／１０ Ｃ１８カラムを用いたＷａｔｅｒｓ Ｂｒｅｅｚｅシステム（２４８７デュアルアレイ検出器、１５２５バイナリＨＰＬＣポンプ）で行い、ＨＰＬＣ用ＭｅＣＮは、ＶＷＲから購入した。化合物１ａ／ｂ、９ａ／ｂおよび１０ａ／ｂのＨＰＬＣ精製には、０．２５ｍＭギ酸アンモニウム水溶液（バッファーＡと称する）および０．２５ｍＭギ酸アンモニウムの８０％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ溶液（バッファーＢと称する）の緩衝系を用いた。
４．２ ヒドロキシルアミン１および内部標準９ａ／ｂおよび１０ａ／ｂの合成
４．２．１ （Ｎ－トリチルアミノオキシ）酢酸（６）

【0145】

【化3】

【0146】

（Ｎ－トリチルアミノオキシ）酢酸は、Ｋｏｊｉｍａらに従って合成した（８）。
４．２．２ Ｎ－（プロパ－２－エン－１－イル）－２－（（トリチルアミノ）オキシ）アセトアミド（７）

【0147】

【化4】

【0148】

Ｎ－トリチル保護されたアミノオキシ酢酸６（２．５０ｇ、７．５０ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に懸濁し、その後、ＴＢＴＵ（２．８９ｇ、９．００ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＩＰＥＡ（１．６０ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ、１．２当量）およびプロパルギルアミン（１．４０ｍＬ、２２．６ｍｍｏｌ、３．０当量）を充填した。懸濁液をｒｔ（室温）で撹拌し、一方１５時間後、清澄な黄色がかった色の溶液が形成された。混合物をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、有機相をＮＨ_４Ｃｌ（３００ｍＬ）およびＮａＨＣＯ_３（３００ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。揮発物を最後にｉｎ ｖａｃｕｏで除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィー（１０％ＥｔＯＡｃ→４０％ＥｔＯＡｃ／ｉＨｅｘ）によって精製した。７（２．５７ｇ、６．９３ｍｍｏｌ、９２％）を無色固体として得た。
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ/ppm = 7.37-7.22 (m, 15H, (C₆H₅)₃C), 6.59 (s, 1H, (C₆H₅)₃C-NH-O), 5.81 (bs, 1H, O=C-NH), 4.25 (s, 2H, O-CH₂C=O), 3.85 (dd, ³J = 5.5 Hz, ⁴J = 2.6 Hz, 2H, HN-CH₂), 2.15 (t, ⁴J = 2.6 Hz, 1H, C≡C-H). ¹³C-NMR (75 MHz, CDCl₃): δ /ppm = 169.1 (C=O), 143.9 (3C, 3 ×O-NH-C-C), 129.0 (6C, C_Ar-H), 128.2 (6C, C_Ar-H), 127.4 (3C, C_tert-H), 79.3 (C≡C-H), 74.6 (C(C₆H₅)₃), 73.4 (O-CH₂), 71.7 (C≡C- H), 28.8 (NH-CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２４Ｈ_２２Ｎ_２ＮａＯ_２［Ｍ＋Ｎａ］^＋の理論値：３９３．１５７３；実測値：３９３．１５７１．ＩＲ（ＡＴＲ）：ν^～（ｃｍ^－１）＝３２８８（ｗ）、３２２２（ｗ）、３０５６（ｗ）、２９１３（ｗ）、２３５９（ｗ）、２３３９（ｗ）、１６３５（ｍ）、１５４２（ｍ）、１４８９（ｍ）、１０６５（ｍ）、９９６（ｍ）、７６３（ｍ）、７４７（ｍ）、７０７（ｓ）、６９７（ｓ）、６８５（ｓ）、６２７（ｓ）．溶融範囲：１５７～１５８℃。
４．２．３ ２－（（４－アジドフェニル）アミノ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－オキソエタンアミニウム・クロリド（４ａ）

【0149】

【化5】

【0150】

ベタイン３ａ（０．３０ｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）をまず、高真空、１８０℃で２０分間乾燥させた。ｒｔに冷却後、無色固体を、ＤＭＦ（２５ｍＬ）に懸濁した。４－アジドアニリン塩酸塩２（０．５４ｇ、３．１７ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＴＢＴＵ（０．９９ｇ、３．０７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＰＥＡ（１．１０ｍＬ、６．３２ｍｍｏｌ、２．４当量）を添加し、茶色がかった黄色の溶液が緩徐に形成された。ｒｔで１時間の撹拌後、全ての固体が溶解した。この反応物をｒｔで終夜さらに撹拌した。次いでＤＭＦをｉｎ ｖａｃｕｏで除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ／７Ｎ ＮＨ_３のメタノール溶液＝９０：１０：０．６：０．６）によって精製し、４ａが対応するトリアゾラート塩として得られた。次いで、この塩をＨ_２Ｏ（５０ｍＬ）に再溶解させ、ｐＨ＝１に酸性化させた。次いで、有機相画分のＴＬＣ解析がＵＶ吸収を示さなくなるまで、水相をＥｔ_２Ｏで抽出した。次いで、水層を濃ＮＨ_３で中和し、４ａの塩化物塩（０．６２ｇ、２．３０ｍｍｏｌ、９０％）が茶色がかった色の粉末、として得られた。
¹H-NMR (300 MHz, DMSO d⁶): δ/ppm = 11.22 (s, 1H, NH), 7.69 (d, ³J = 8.9 Hz, 2H, CH=C-NH), 7.12 (d, ³J = 8.4 Hz, 2H, CH=C-N₃), 4.42 (s, 2H, CH₂), 3.30 (s, 9H, N(CH₃)₃). ¹³C-NMR (101 MHz, dmso d⁶): δ/ppm = 162.0 (C=O), 135.0 (NH-C=CH), 134.9 (N₃-C=CH), 121.2 (2C, NH-C=CH), 119.5 (2C, N₃-C=CH), 64.3 (CH₂), 53.4 (3C, N(CH₃)₃).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_１１Ｈ_１６Ｎ_５Ｏ^＋［Ｍ^＋］の理論値：２３４．１３４９；実測値：２３４．１３４８．ＩＲ（ＡＴＲ）：ν^～（ｃｍ^－１）＝３３４８（ｗ）、２９８３（ｗ）、２１１８（ｓ）、２０８３（ｍ）、１６９２（ｓ）、１６７６（ｍ）、１６１５（ｍ）、１５４９（ｍ）、１５０８（ｓ）、１２８７（ｓ）、１２５６（ｍ）、１０５０（ｓ）、１０３８（ｓ）、９２２（ｓ）、８３３（ｓ）．溶融範囲：１４４～１４６℃。
４．２．４ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－オキソ－２－（（４－（４－（（２－（（トリチルアミノ）オキシ）アセトアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）アミノ）エタンアミニウム・クロリド／ブロミド（８ａ）

【0151】

【化6】

【0152】

まず、ＤＣＭおよびＨ２Ｏの混合物（ａ ５ｍＬ）を凍結脱気し（３×）、次いでアジド４ａ（０．１８ｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１．０当量）、アルキン７（０．２４ｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＣｕＢｒ・ＳＭｅ_２（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、０．３当量）を添加した．この懸濁液をｒｔで終夜激しく撹拌し、無色のエマルションが形成された。次いで、この混合物を減圧下で濃縮し、シリカのショートプラグを用いたカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ／７Ｎ ＮＨ_３のメタノール溶液＝８０：２０：０．６：０．６）により精製した。８ａが少し茶色がかった黄色の固体（０．３２ｇ、０．５０ｍｍｏｌ、７７％）として得られた。
¹H-NMR (300 MHz, DMSO d⁶): δ/ppm = 11.67 (s, 1H, NH-C₆H₄), 8.55 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 8.34 (s, 1H, Ph₃C-NH), 8.32 (t, ³J = 5.8 Hz, 1H, O=C-NH-CH₂), 7.91-7.84 (m, 4H, C₆H₄), 7.34-7.19 (m, 15H, C(C₆H₅)₃), 4.53 (s, 2H, (CH₂-N(CH₃)₃), 4.45 (d, ₃J = 5.8, 2H, NH-CH₂), 3.85 (s, 2H, N-O-CH₂), 3.33 (s, 9H, N(CH₃)₃). ¹³C-NMR (101 MHz, dmso d⁶): δ/ppm = 169.7 (O=C-NH-CH₂), 162.4 (O=C-CH₂-N), 146.0 (CH₂-C=C), 144.1 (3C, O-NH-C-C), 138.1 (N-C=CH-CH), 132.6 (N-C=CH-CH), 128.9 (6C, C_Ar-H), 127.6 (6C, C_Ar-H), 126.7 (3C, C-H), 121.0 (CH₂-C=CH-N), 120.5 (4C, N-C=CH-CH=C-N), 73.7 (C(C₆H₆)₃), 73.2 (O-CH₂), 64.4 (CH₂-N(CH₃)₃), 53.4 (N(CH₃)₃), 33.8 (NH-CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_３５Ｈ_３８Ｎ_７Ｏ_３ ^＋［Ｍ^＋］の理論値：６０４．３０３１；実測値：６０４．３０２６．ＩＲ（ＡＴＲ）：ν^～（ｃｍ^－１）＝３３８７（ｗ）、３０５４（ｗ）、２９２３（ｗ）、１６８５（ｍ）、１６１３（ｍ）、１５５８（ｍ）、１５１９（ｓ）、１４９０（ｍ）、１４４６（ｍ）、１４１３（ｍ）、１３１２（ｍ）、１２６５（ｍ）、１２２４（ｍ）、１１９２（ｍ）、１０８５（ｍ）、１０４５（ｍ）、１００２（ｍ）、９９０（ｍ）、９４８（ｍ）、９２２（ｍ）、８７６（ｍ）、８３８（ｍ）、７５７（ｓ）、６９８（ｓ）、６２７（ｓ）．溶融範囲：１４２～１５２℃。
４．２．５ ２－（（４－（４－（（２－（アミノオキシ）アセトアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル－アミノ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－オキソエタンアミニウム・ギ酸塩（１ａ）

【0153】

【化7】

【0154】

トリチル保護された化合物８ａ（０．２４ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解させ、６Ｍ ＨＣｌ（６ｍＬ）を添加した。この混合物を、相分離が目に見えるようになるまで、ｒｔで１時間激しく撹拌した。次いで、水相を、有機相画分のＴＬＣ解析がＵＶ吸収をこれ以上示さなくなるまで、ＤＣＭ（５×５ｍＬ）で抽出した。２Ｍ ＮＨ_３を用いてｐＨを９～１０に調整し、水相をｉｎ ｖａｃｕｏで除去した。次いで、７５ｍｇの１ａを調製用のＨＰＬＣ（０％→２０％バッファーＢ）によってさらに精製し、２３ｍｇ（０．０５ｍｍｏｌ、２６％）のＸを無色のギ酸塩として得た。
¹H-NMR (400 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.40 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 8.21 (s, 1H, HCOO), 7.58 (d, ³J = 9.2 Hz, 2H, CH-CH=C-N₃), 7.52 (d, ³J = 9.2 Hz, 2H, CH-CH=C-NH), 4.53 (s, 2H, N-O-CH₂), 4.27 (s, 2H, NH-CH₂), 4.22 (s, 2H, CH₂-N(CH₃)₃), 3.36 (s, 9H, N(CH₃)₃). ¹³C-NMR (101 MHz, D₂O): δ/ppm = 169.7 (O=C-NH-CH₂), 162.4 (O=C-CH₂-N), 146.0 (CH₂-C=C), 144.1 (3C, O-NH-C-C), 138.1 (N-C=CH-CH), 132.6 (N-C=CH-CH), 128.9 (6C, C_Ar-H), 127.6 (6C, C_Ar-H), 126.7 (3C, C-H), 121.0 (CH₂-C=CH-N), 120.5 (4C, N-C=CH-CH=C-N), 73.7 (C(C₆H₆)₃), 73.2 (O-CH₂), 64.4 (CH₂-N(CH₃)₃), 53.4 (N(CH₃)₃), 33.8 (NH-CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_１６Ｈ_２４Ｎ_７Ｏ_３ ^＋［Ｍ^＋］の理論値：３６２．１９３５；実測値：３６２．１９３５．ＩＲ（ＡＴＲ）：ν^～（ｃｍ^－１）＝３１３０（ｍ）、３０３７（ｓ）、２８０７（ｍ）、２６４９（ｍ）、２３６３（ｗ）、１６８４（ｓ）、１６１０（ｍ）、１５５６（ｓ）、１５１７（ｓ）、１４８７（ｍ）、１４７５（ｍ）、１４４２（ｍ）、１４０３（ｓ）、１３１２（ｍ）、１２６２（ｍ）、１１９３（ｍ）、１１２８（ｗ）、１０８３（ｗ）、１０４８（ｍ）、９９１（ｍ）、９６７（ｗ）、９２１（ｓ）、８３７（ｓ）。
４．２．６ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－オキソ－２－（（４－（４－（（２－（（（（３Ｓ，４Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－ペンチリデン）アミノ）オキシ）アセトアミド）－メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）－アミノ）エタンアミニウム・ギ酸塩（９ａ）

【0155】

【化8】

【0156】

１ａ（５０．０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１－０当量）および２’－デオキシリボース（１８２ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ、１１．８当量）をＨ_２Ｏ（２．７ｍＬ）に溶解させ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ適合のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ中、３０℃、１４００ｒｐｍで終夜インキュベートした。この混合物を０．２μｍのシリンジフィルターで濾過し、その後、２回のＨＰＬＣ（０→１５％バッファーＢ）によって精製した。純粋な生成物９ａ（９．１ｍｇ、１７μｍｏｌ、１５％）を、無色の泡状物質として得た。この化合物は、異性体が指定されていない水溶液中のＥ／Ｚ異性体の混合物として存在した。
¹H-NMR (600 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.46 (s, 1H, HCOO), 8.34 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 7.79 (d, J=9.0 Hz, 2H, CH-CH=C-N₃), 7.74 - 7.71 (m, 8H, CH-CH=C-NH, C1'-H^A), 7.08 (t, ³J = 5.4 Hz, 1H, C1'-H^B), 4.67 (s, 2H, N-O-CH₂ ^B), 4.63 (s, 2H, NH-CH₂), 4.62 (s, 2H, N-O- CH₂ ^A), 4.35 (s, 2H, CH₂-N(CH₃)₃), 3.92-3.87 (m, 1H, C3'-H^B), 3.85 - 3.80 (m, 1H, C3'-H^A), 3.78-3.69 (m, 1H, C5'-H), 3.66-3.53 (m, 2H, C5'-H, C4'-H), 3.42 (s, 9H, N(CH₃)₃), 2.79-2.69 (m, 2H, C2'-H^B), 2.58 - 2.54 (m, 1H, C2'-H^A), 2.41 - 2.35 (m, 1H, C2'-H^A). ¹³C-NMR (150 MHz, D₂O): δ/ppm = 172.4 (O=C-NH-CH₂), 170.9 (HCOO), 162.7 (O=C-CH₂-N), 153.5 (C1'^A), 153.1 (C1'^B), 145.1 (CH₂-C=C), 136.8 (N- C=CH-CH), 133.5 (N-C=CH-CH), 122.5 (2C, CH=C-NH), 122.3 (CH₂-C=CH-N), 121.9 (2C, CH=C-N₃), 74.2 (C4'), 74.0 (C4'), 71.7 (N-O-CH₂ ^B), 71.5 (N-O-CH₂ ^A), 69.0 (C3'^A), 68.8 (C3'^B), 65.1 (CH₂-N(CH₃)₃), 62.3 (C5'), 54.3 (N(CH₃)₃), 34.1 (NH-CH₂), 32.4 (C2'^A), 29.2 (C2'^B).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２１Ｈ_３２Ｎ_７Ｏ_６ ^＋［Ｍ］^＋の理論値：４７８．２４０９；実測値：４７８．２４０４。
４．２．７ （Ｓ，Ｅ）－３－（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）アクリルアルデヒド（１２）

【0157】

【化9】

【0158】

メチル（２Ｅ）－３－［（４Ｓ）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル］プロパ－２－エノアート１１（０．２０ｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（２．０ｍＬ）に溶解させ、－７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ－Ｈ（ジイソブチルアルミニウム・水素化物）（２．２０ｍＬ、２Ｍトルエン溶液、２．１当量）を添加し、黄色がかった色の混合物をｒｔまで緩徐に暖めた。９０分後、ＤＣＭ（５．０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（４．０ｍＬ）およびＮａＯＨ（２Ｍ、２．０ｍＬ）を添加した。ｒｔでさらに１時間撹拌した後、有機相を、水相から分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。揮発物を減圧下で除去し、アリルアルコールを定量的収率で得、これをさらに精製せずに使用した。
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃):δ/ppm = 5.88 (dt, ³J = 15.4 Hz, ⁴J = 5.0 Hz, 1H, 5'-H) 5.65 (dd, ³J = 15.6 Hz, ⁴J = 7.6 Hz, 1H, 5'-H), 4.47 (q, ³J = 7.3 Hz, 1H, 4'-H), 4.08 (d, ³J = 5.1 Hz, 2H, 1'-H), 4.30 (dd, ³J = 8.2 Hz, ⁴J = 6.1 Hz, 1H, 3'-H), 3.53 (t, ³J = 7.9 Hz, 1H, 2'-H), 2.34 (br s, 1H, CH₂-OH), 1.36 (s, 3H, O-C(CH₃)(CH₃)-O), 1.32 (s, 3H, O-C(CH₃)(CH₃)-O).
アリルアルコールをＤＣＭ（２．０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却し、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．４５ｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．０当量）を充填した。乳白色の懸濁液をｒｔまで緩徐に暖め、終夜撹拌した。飽和Ｎａ_２ＳＯ_４（１０ｍＬ）およびＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３の溶液（１７１ｍｇ、１０ｍＬ Ｈ_２Ｏに溶解させた）の添加後、混合物をＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させた。有機溶媒をｉｎ ｖａｃｕｏで除去し、粗混合物をカラムクロマトグラフィー（２．５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製した。アルデヒド１２（８０ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、４７％）を無色のオイルとして単離した。
¹H-NMR (400 MHz, CD₂Cl₂): δ/ppm = 9.50 (d, ³J = 7.6 Hz, 1H, 1'-CHO), 6.70 (dd, ³J = 15.6 Hz, ⁴J = 5.3 Hz, 1H, 3'-H), 6.23 (dt, ³J = 15.6 Hz, ⁴J = 5.8 Hz, 1H, 2'-H), 4.73 (q, ³J = 6.8 Hz, 1H, 4'-H), 4.18 (dd, ³J = 8.4Hz, ⁴J = 6.8Hz, 1H, 5'-H), 3.67 (dd, ³J = 8.4Hz, ⁴J = 6.8Hz, 1H, 5'-H), 1.39 (s, 3H, O-C(CH₃)(CH₃)-O), 1.35 O-C(CH₃)(CH₃)-O). ¹³C-NMR (101 MHz, CD₂Cl₂): δ/ppm = 193.0 (-CHO), 153.4 (3'-C), 132.1 (2'-C), 110.3 (C_quart), 74.9 (4'-C), 68.7 (5'-C), 26.2 (O-C(CH₃)(CH₃)-O), 25.4 (O-C(CH₃)(CH₃)-O).ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ_８Ｈ_１１Ｏ_３・［Ｍ－Ｈ］^・の理論値：１５５．０７０８；実測値：１５５．０７０７。
４．２．８ ２－（（４－（４－（（２－（（（（１Ｅ，２Ｅ）－３－（（Ｓ）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラｅ－４－イル）－アリリデン）－アミノ）オキシ）アセトアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）－アミノ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチル－２－オキソエタン－１－アミニウム・ギ酸塩（１０ａ）

【0159】

【化10】

【0160】

アルデヒド１２（２０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、９．０当量）を、ヒドロキシルアミン１ａと共にＨ_２ＯとＣＨＣｌ_３の１：１混合物（ａ ２．５ｍＬ）に溶解させ、ｒｔで撹拌した。反応過程をＨＰＬＣ（０→３０％バッファーＢ）によってモニターし、１時間後反応が終了したことを決定した。次いで、水相をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、ｉｎ ｖａｃｕｏで濃縮した。１３ａ（５．１０ｍｇ、９．５０μｍｏｌ、６８％）が茶色がかった色の粘稠なオイルとして得られた。これをさらに精製せずに用いた。
¹H-NMR (400 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.31 (s, 1H, HCOO), 8.12 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 7.84 (d, 1H, 1'-H), 7.59 - 7.53 (m, 4H, CH-CH=C-N₃, CH-CH=C-NH), 6.20 - 6.03 (m, 2H, 2' + 3'-H’s), 4.54 - 4.52 (m, 1H, 4'-H), 4.50 (s, 2H, N-O-CH₂), 4.47 (s, 2H, NH-CH₂), 4.20 (s, 2H, CH₂-N(CH₃)₃), 4.02 - 3.98 (m, 1H, 5'-H), 3.45 - 3.50 (m, 1H, 5'-H), 3.27 (s, 9H, CH₂-N(CH₃)₃), 1.26 (s, 3H, O-C(CH₃)(CH₃)-O), 1.24 (s, 3H, O-C(CH₃)(CH₃)-O).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２４Ｈ_３４Ｎ_７Ｏ_５ ^＋［Ｍ^＋］の理論値：５００．２６１６；実測値：５００．２６１７。

【0161】

アセトニド１３ａ（４．００ｍｇ、７．５０μｍｏｌ、１．０当量）の脱保護をＭｅＯＨに溶解させ、ＰＴＳＡ・Ｈ２Ｏ（１．４０ｍｇ、７．５０μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。この混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ適合のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（１３００ｒｐｍ、２５℃）中で終夜インキュベートし、溶剤をｉｎ ｖａｃｕｏで凍結乾燥によって除去した。最後に、この粗生成物を調製用のＨＰＬＣ（０→３５％バッファーＢ、４５分以内）によって精製し、純粋な１０ａが、無色の泡状物質として得られた。
¹H-NMR (400 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.53 (s, 1H, HCOO), 8.30 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 8.01 (s, d, ³J = 8.9 Hz, 1H, 1'-H), 7.78 - 7.70 (m, 4H, CH-CH=C-N₃, CH-CH=C-NH), 6.31 - 6.32 (m, 2H, 2' + 3'-H’s), 4.63 (s, 2H, N-O-CH₂), 4.62 (s, 2H, NH-CH₂), 4.35 - 4.32 (m, 3H, CH₂-N(CH₃)₃ + 4'-H), 3.61 (dd, ¹J = 11.7 Hz, ³J = 4.4, 1H, 5'-H), 3.51 (dd, ¹J = 11.7 Hz, ³J = 6.5, 1H, 5'-H), 3.22 (s, 9H, CH₂-N(CH₃)₃). ¹³C-NMR (101 MHz, D₂O): δ/ppm = 172.3 (O=C-NH-CH₂), 170.9 (HCOO), 162.7 (O=C-CH₂-N), 153.7 (1'-C), 144.5 (CH₂-C=C), 142.8 (3'-C), 136.9 (N-C=CH-CH), 133.6 (N-C=CH-CH), 123.0 (2'-C), 122.5 (2C, CH=C-NH), 122.3 (CH₂-C=CH-N), 122.0 (2C, CH=C-N₃), 72.0 (N-O-CH₂) 71.6 (4'-C), 64.4 (5'-C), 65.1 (CH₂-N(CH₃)₃), 54.3 (N(CH₃)₃), 34.1 (NH-CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２１Ｈ_３０Ｎ_７Ｏ_５ ^＋［Ｍ］^＋の理論値：４６０．２３０３；実測値：４６０．２３０５。
４．２．９ ２－（（４－アジドフェニル）アミノ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉ（メチル－ｄ３）－２－オキソエタンアミニウム・クロリド（４ｂ）

【0162】

【化11】

【0163】

４ｂを４ａと同様に合成し、［ｄ_１１］－ベタイン（９８％重水素、Ｅｕｒｉｓｏ－Ｔｏｐ ＧｍｂＨ）を用いて同位体標識を導入した。メチレン基の重水素標識は、反応条件下では安定ではなく、完全なＤ／Ｈ交換が観察された．したがって、［ｄ_９］標識された生成物が得られた。
¹H-NMR (600 MHz, D₂O): δ/ppm = 7.39 (d, ³J=8.6, 2H, CH-CH=C-NH), 7.04 (d, ³J=8.5, 2H, CH-CH=C-N₃), 4.18 (s, 2H, CH₂). ¹³C-NMR (150 MHz, D₂O, ppm): δ/ppm = 162.7 (C=O), 137.5 (NH-C=CH), 132.5 (N₃-C=CH), 123.5 (2C, NH-C=CH), 119.6 (2C, N₃-C=CH), 65.0 (CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_１１Ｈ_７Ｄ_９Ｎ_５Ｏ^＋［Ｍ］^＋の理論値：２４３．１９１４；実測値：２４３．１９１６。
４．２．１０ ２－（（４－（４－（（２－（アミノオキシ）アセトアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル－アミノ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉ（メチル－ｄ３）－２－オキソエタンアミニウム・ギ酸塩（１ｂ）

【0164】

【化12】

【0165】

アイソトポログ１ｂは、トリチル保護された中間体８ｂが単離されず、さらに精製せずに脱保護されるというわずかな改変以外は１ａに従って合成した。
４．２．１１ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ（メチル－ｄ３）－２－オキソ－２－（（４－（４－（（２－（（（（３Ｓ，４Ｒ）－３，４，５－トリヒドロキシ－ペンチリデン）アミノ）オキシ）アセトアミド）－メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）－アミノ）エタンアミニウム・ギ酸塩（９ｂ）

【0166】

【化13】

【0167】

内部標準９ｂは、９ａと同様に合成し、（Ｅ）／（Ｚ）異性体の混合物が得られた（ＡおよびＢで表す）。
¹H-NMR (600 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.46 (s, 2H, HCOO), 8.35 (s, 1H, CH₂-C=CH-N), 7.81 (d, ³J = 7.5 Hz, 2H, CH-CH=C-N₃), 7.75 - 7.73 (m, 8H, CH-CH=C-NH, C1'-H^A), 7.08 (t, ³J = 5.4 Hz, 0.1H, C1'-H^B), 4.67 (s, 2H, N-O-CH₂ ^B), 4.64 (s, 2H, NH-CH₂), 4.62 (s, 2H, N-O-CH₂ ^A), 4.34 (s, 2H, CH₂-N(CH₃)₃), 3.93-3.87 (m, 1H, C3'-H^B), 3.86-3.79 (m, 1H, C3'-H^A), 3.78-3.69 (m, 1H, 1x C5'-H₂), 3.67-3.53 (m, 2H, 1x C5'-H₂, C4'-H), 2.80-2.68 (m, 2H, C2'-H₂ ^B), 2.59 - 2.54 (m, 1H, C2'-H^A), 2.43-2.34 (m, 1H, C2'-H^A). ¹³C-NMR (150 MHz, D₂O, ppm): δ/ppm = 172.4 (O=C-NH-CH₂), 170.9 (HCOO), 162.8 (O=C-CH₂-N), 153.5 (C1'^A), 153.1 (C1'^B), 145.1 (CH₂-C=C), 136.8 (N-C=CH-CH), 133.6 (N-C=CH-CH), 122.6 (2C, CH=C-NH), 122.4 (CH₂-C=CH-N), 122.0 (2C, CH=C-N₃), 74.2 (C4'), 74.0 (C4'), 71.7 (N-O-CH₂ ^B), 71.5 (N-O-CH₂ ^A), 69.0 (C3'^A), 68.8 (C3'^B), 64.9 (CH₂-N(CD₃)₃), 62.3 (C5'), 53.3 (N(CD₃)₃), 34.1 (NH-CH₂), 32.4 (C2'^A), 29.2 (C2'^B).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２１Ｈ_２３Ｄ_９Ｎ_７Ｏ_６ ^＋［Ｍ］^＋の理論値：４８７．２９７３；実測値：４８７．２９６７。
４．２．１２ ２－（（４－（４－（（２－（（（（１Ｅ，２Ｅ）－３－（（Ｓ）－２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）－アリリデン）－アミノ）オキシ）アセトアミド）メチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）フェニル）－アミノ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ（メチル－ｄ３）－２－オキソエタン－１－アミニウム・ギ酸塩（１０ｂ）

【0168】

【化14】

【0169】

１０ｂは、１０ａに従って合成した。
¹H-NMR (800 MHz, D₂O): δ/ppm = 8.47 (s, 1H, HCOO), 8.32 (s, 2H, CH₂-C=CH-N), 8.02 (d, ³J = 9.4 Hz, 1H, 1'-H), 7.80 - 7.71 (m, 4H, CH-CH=C-N₃, CH-CH=C-NH), 6.34 - 6.26 (m, 2H, 2' + 3'-H’s), 4.65 (s, 2H, N-O-CH₂), 4.63 (s, 2H, NH-CH₂), 4.35 - 4.32 (m, 3H, CH₂-N(CH₃)₃ + 4'-H), 3.63 (dd, ¹J = 11.7 Hz, ³J = 4.4, 1H, 5'-H), 3.53 (dd, ¹J = 11.7 Hz, ³J = 6.5, 1H, 5'-H). ¹³C-NMR (150 MHz, D₂O): δ/ppm = 172.3 (O=C-NH-CH₂), 170.9 (HCOO), 162.8 (O=C-CH₂-N), 153.7 (1'-C), 145.2 (CH₂-C=C), 142.8 (3'-C), 136.9 (N-C=CH-CH), 133.6 (N-C=CH-CH), 123.0 (2'-C), 122.5 (2C, CH=C-NH), 122.3 (CH₂-C=CH-N), 122.0 (2C, CH=C-N₃), 72.1 (N-O-CH₂) 71.6 (4'-C), 64.4 (5'-C), 65.1 (CH₂-N(CH₃)₃), 53.3 (N(CD₃)₃), 34.1 (NH-CH₂).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）：Ｃ_２１Ｈ_２１Ｄ_９Ｎ_７Ｏ_５ ^＋［Ｍ］^＋の理論値：４６９．２８６８；実測値：４６９．２８７４。
４．３ 細胞培養
１０％ＦＢＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２ｍＭＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液および０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＤＭＥＭ高グルコースをｍＥＳＣ（マウス胚性幹細胞）培養物用の基本培地として用いた。基本培地を１０００Ｕ／ｍＬ ＬＩＦ（ＯＲＦ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、３．０μＭ ＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１および１．０μＭ Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（２ｉ；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）で補足することによって、ゼラチンコートされたプレート上で、ｍＥＳＣ株をナイーブ状態に維持した。１０００Ｕ／ｍＬ ＬＩＦで補足した基本ｍＥＳＣ培地からなるプライミング条件にｍＥＳＣを播種することによって、同位体標識化ヌクレオシドを用いた代謝標識実験を行った。標識化ヌクレオシド（Ｂ．Ａ．Ｃ．Ｈ．ＵＧ）を下記の濃度で培地に添加した：ｄＧ［^１５Ｎ_５；^１３Ｃ_１０］、１００μＭ３日間、続いて２００μＭ標識化ｄＧによる処置２日間；ｄＣ［^１５Ｎ_３；^１３Ｃ_９］およびｄＴ［^１５Ｎ_２；^１３Ｃ_１０］は両方とも濃度１００μＭの総量で５日間使用した。Ｄｎｍｔ ＴＫＯ Ｊ１ ｍＥＳＣｓは、Ｔｓｕｍｕｒａら（２１）に記載され、Ｊ１野生型ｍＥＳＣは、１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ株から得た（２２）。Ｃｏｒｔａｚａｒら（１１）に報告されているＴｄｇ＋／－およびＴｄｇ－／－細胞株を用いた。
４．４ 細胞溶解およびＤＮＡ単離
ゲノムＤＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキットを用いて行った。全てのｍＥＳＣ試料ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、４００ μＭ２，６－ジ－テルト－ブチル－４－メチルフェノール（ＢＨＴ）およびメシル酸デフェロオキサミン（ＤＭ）を含有するＧ２バッファーを添加することによりプレート中で直接溶解させた。ミクロチューブ内で、直径５ｍｍのステンレス鋼ビーズを１チューブあたり１個およびＭＭ４００ビーズミル（Ｒｅｔｓｃｈ）を用いて、３０Ｈｚで１分間、ビーズミリングによりＤＮＡを剪断し、その後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。単離するゲノムＤＮＡの量に応じて、細胞可溶化物を、プロテイナーゼＫ（Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ ２０Ｇ用には２５μＬまたはＧｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐ １００Ｇ用には１００μＬ）およびＲＮａｓｅ Ａ（２．０μＬ／２０Ｇ、１０μＬ／１００Ｇ）で、５０℃、１時間処理した。３０分後、追加のＲＮａｓｅ Ａ（それぞれ、２．０μＬまたは１０μＬ）を混合物に添加した。次いで、Ｇｅｎｏｍｉｃ－ｔｉｐカラムをローディングバッファーＱＢＴ（１．０ｍＬ／２０Ｇまたは４．０ｍＬ／１００Ｇ）で平衡化し、１分間ボルテックスした可溶化液をカラムにアプライした。全液がカラムに入った後、バッファーＱＣ（２．０ｍＬ／２０Ｇまたは２×７．５ｍＬ／１００Ｇ）を用いて洗浄ステップを行い、最後に、４００μＭ ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）で補足したＱＦバッファー（２．０ｍＬ／２０Ｇまたは５．０ｍＬ／１００Ｇ）でゲノムＤＮＡを溶出した。次いで、ｉ－ＰｒＯＨ（１．４ｍＬ／２０Ｇまたは３．５ｍＬ／１００Ｇ、７０％容積）の添加によって沈殿を行い、得られたゲノムＤＮＡペレットを遠心分離した（１５分、６０００ｇ、４℃）。上清を捨て、洗浄ステップを、７０％ＥｔＯＨ（５．０ｍＬ、１５分、６０００ｇ、４℃）を用いて行った。最後に、純粋なＤＮＡペレットを、１．０ｍＬ７０％ＥｔＯＨに再懸濁し、遠心処理した（１０分、１５０００ｒｐｍ、４℃）。次に、上清を除去し、２０μＭＢＨＴを含むｄｄＨ_２Ｏ（５０～１００μＬ）にペレットを再溶解させた。濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ１０００、Ｐｅｑｌａｂ）で決定した。
４．５ １ａを用いたゲノムＤＮＡの誘導体化
総容積２０μＬで１で脱塩基部位（標識化されていないｇＤＮＡは５．０μｇ、標識化ｇＤＮＡは２０μｇ）の誘導体化を行い、溶液の緩衝化をＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）およびＮａ_２ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）で行った。１のＨ_２Ｏ溶液ストック（２３．８ｍＭ）を緩衝液（１の最終濃度＝１．５ｍＭ）に添加し、混合物を５秒間ボルテックスすることによって反応を開始させた。ｇＤＮＡを３７℃／１４００ｒｐｍで４０分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ適合のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ内でインキュベートした。反応を、１－ナフチルアルデヒド（６６．７μＬ、２Ｍ ｉ－ＰｒＯＨ溶液）の添加によって停止させて過剰の１をクエンチし、３７℃／１４００ｒｐｍで１０分間、再度インキュベートした。次いで、ＮａＯＡｃ（３．３μＬ、３Ｍ）を添加し、ボルテックスし、３７℃／１４００ｒｐｍでさらに５分間インキュベートすることによって、誘導体化されたＤＮＡをプレインキュベートした。無水ｉ－ＰｒＯＨ（６６．７μＬ）を添加し、管を数回反転させ、次いで遠心処理した（６０分、１０℃、１５０００ｒｐｍ）。上清を除去し、洗浄ステップ（１ｘ７５％ｉ－ＰｒＯＨ、１０℃、１５０００ｒｐｍ、３０分；２ｘ７５％冷ＥｔＯＨ、４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分）を行い、各洗浄ステップ後、上清を注意深く除去した。最後に、得られたＤＮＡペレットを、３５μＬのｄｄＨ_２Ｏに再溶解させ、次いで、ヌクレオシドレベルまで酵素により消化させた。
４．６ 誘導体化されたゲノムＤＮＡの酵素消化
本発明者らは、ゲノムＤＮＡ（３５μＬ Ｈ_２Ｏ中で、標識化されていないｇＤＮＡは５．０μｇ、または標識化ｇＤＮＡは２０μｇ）の酵素消化のために、４８０μＭ ＺｎＳＯ_４の水溶液を用い、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。この溶液は、５Ｕ南極ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、４２ＵヌクレアーゼＳ１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ならびにＤＮＡ修飾および誘導体化された脱塩基部位の正確な定量化のための特定の量の標識化された内部標準からなった。第２の消化ラウンドでは、本発明者らは、０．２Ｕヘビ毒ホスホジエステラーゼ Ｉ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ、ＵＳＢ社）の５２０μＭ［Ｎａ］_２－ＥＤＴＡ溶液７．５μｌを添加し、混合物を３７℃でさらに３時間または終夜インキュベートした。消化後、試料を－２０℃に貯蔵し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析（４℃での注入体積：３９μｇ）の前に、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６フィルタープレート０．２μｍ（０．２０μｍ Ｓｕｐｏｒ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いることによって濾過した。
４．７ ＤＮＡ試料のＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ解析
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ研究のために、本発明者らは、ＵＶ検出器付きの三連四重極質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ６４９０およびＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ＵＨＰＬＣシステムを用いた。先に発表された研究（２３－２７）に基づいて、本発明者らは、新しい方法を開発し、それを同位体希釈技法と結びつけた。これにより、１回の単独の解析実施で、誘導体化された脱塩基部位、全ての標準ヌクレオシド、およびシトシン修飾の正確な定量化を行うことが可能となった。

【0170】

クロマトグラフィー分離を、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＳＢ－Ｃ８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、２．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）で行った。溶出バッファーは、それぞれ０．００８５％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する水およびＭｅＣＮであり、流速は、３０℃で０．３５ｍｌ／分であった。勾配は次の通りであった：０→５分；０→３．５％（ｖ／ｖ）ＭｅＣＮ；５→６．９分；３．５→５％ＭｅＣＮ；６．９→１３．２分；５→８０％ＭｅＣＮ；１３．２→１４．８分；８０％ＭｅＣＮ；１４．８→１５．３分；８０→０％ＭｅＣＮ；１５．３→１７分；０％ＭｅＣＮ。１．５分までおよび１２．２分後の溶離液は、Ｖａｌｃｏバルブによって廃棄物へと方向転換させた。

【0171】

合成内部標準の直接注入により本発明者らは、ソース依存性パラメータを最適化させた。パラメータは以下の通りであった。気体温度５０℃、気流１５ｌ／分（Ｎ_２）、噴霧器３０ｐｓｉ、シースガスヒーター２７５℃、シースガス流１１ｌ／分（Ｎ_２）、キャピラリー電位２５００Ｖ（ポジティブモード）および－２２５０Ｖ（陰イオンモード）、ノズル電位５００Ｖ、フラグメンター電位３８０Ｖ、ΔＥＭＶ５００（ポジティブモード）および８００（ネガティブモード）。方法の開発中に最も高い強度を与えた化合物依存性パラメータを表１に要約した。

【0172】

【表1-1】

【0173】

【表1-2】

【0174】

４．８方法の評価およびデータ処理
方法の評価およびデータ処理は、先に発表された研究に記載の通り行った（２４）。較正曲線を得るために、各標準物質（５－８標準物質濃度）を技術的トリプリケートとして解析し、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）６．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ（商標））を用いて線形回帰を適用した。したがって、内部標準（^＊）に対する標識化されていない誘導体化脱塩基部位９ａおよび１０ａの曲線下面積（Ａ／Ａ^＊）の比を、内部標準（^＊）に対する標識化されていない誘導体化脱塩基部位９ａおよび１０ａの物質量（ｎ／ｎ^＊）の比に対してそれぞれプロットした（図７参照）。較正関数を重み付け無しで計算した。許容可能な精度（＜２０％相対的な標準偏差）および正確度（８０～１２４％）が得られた。この精度は、各較正標準について技術的トリプリケートで測定したＡ／Ａ^＊比の標準偏差が＜２０％である場合に得られた。正確度には、パーセントで表した各濃度についての物質量の理論値に対する使用量の比を用いた。この正確度を証明するために、本発明者らは、各較正標準についてのＡ／Ａ^＊比から物質量ｎを計算するためのそれぞれの較正関数を用いた。

【0175】

検出下限（ＬＯＤ）は、ブランクで得られたそれぞれの化合物のＭＳシグナルの応答の３倍と定義された。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は、正確度および精度の要件を満たし、かつＬＯＤより高い応答を実現する最低濃度と定義された。ＬＬＯＱおよびＬＯＤの集計を表２に示す。

【0176】

【表2】

【0177】

４．９ 規定の脱塩基部位を有する合成１３マーオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド（５’－ＧＴＡ ＡＴＧ ＵＧＣ ＴＡＧ Ｇ－３’および３’－ＣＡＴ ＴＡＣ ＡＣＧ ＡＴＣ Ｃ－５’、ａ １５ ｎｍｏｌ、Ｍｅｔａｂｉｏｎ）を、ＵＤＧ－バッファー（１５０μＬ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で９５℃で５分間インキュベートし、次いでｒｔまで緩徐に冷却した。ＵＤＧ（５．０μＬ、２５ユニット、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、注意深く混合し、この混合物を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、下の段落に記載のクロロホルム／フェノール抽出によってオリゴヌクレオチドを単離した。ＣＨＣｌ_３／フェノール溶液（２００μＬ、Ｒｏｔｉフェノール）を添加し、３０秒間ボルテックスし、ｒｔおよび１３４００ｒｐｍで３分間遠心処理した。水相を注意深く除去し、ＣＨＣｌ_３／フェノール処理を２回繰り返した。ＮａＯＡｃ（２０μＬ、３Ｍ）を添加した後、オリゴヌクレオチドをｉ－ＰｒＯＨ（６００μＬ）で沈殿させた。得られたＤＮＡペレットをｒｔで３０分間（１５０００ｒｐｍ）遠心処理し、冷ＥｔＯＨ（３００μＬ）で洗浄し、４℃、１５０００ｒｐｍで、さらに３０分間遠心処理した．洗浄ステップをもう１回繰り返し、上清を除去し、ペレットを空気で５分間乾燥させ、その後、オリゴヌクレオチドをｄｄＨ_２Ｏ（１５０μＬ）に再溶解させた。識別を、最後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ解析で確認した。
４．１０ 規定の脱塩基部位を有する合成オリゴについての反応速度論
総反応体積２０μＬにおいて、オリゴヌクレオチド（３００ｐｍｏｌ）をＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）およびＮａ_２ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）で緩衝化し、１（２３．８ｍＭストック１．２６μＬ）を添加した。反応（３７℃、８００ｒｐｍ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ適合のＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ）を、混合物を５秒間ボルテックスした後、開始させ、特定の時点（ｔ＝１５ｓ、３０ｓ、４５ｓ、９０ｓ、１２０ｓ、１５０ｓ、１８０ｓ、４分、６分、８分、１５分、２０分）の後、アセトン（２００μＬ）を添加し、液体窒素中でアリコートを凍結させることによって停止させた。過剰のアセトンをｓｐｅｅｄ ｖａｃ（ＲＶＣ－２－３３ ＩＲ、Ｃｈｒｉｓｔ）で除去し、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６フィルタープレート（０．２０ｍｍ Ｓｕｐｏｒ、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過した。７５ｐｍｏｌのＤＮＡを、その後、Ｄｉｏｎｅｘ ｍｉｃｒｏＨＰＬＣシステムに注入し、反応生成物をＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ_１８カラム（０．５５×２５０ｍｍ、５．０ｍｍ孔径）を用いて、流速３５０μＬ／分で分離した。カラム温度６０℃、４５分以内の勾配０％－＞２０％バッファーＢ（バッファーＡ＝１０ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ＝７．５のＨ_２Ｏ溶液およびバッファーＢ＝１０ｍＭ ＴＥＡＢ、ｐＨ＝７．５の８０％ＭｅＣＮ／Ｈ_２Ｏ溶液）で解析を行った。最後に、得られたＵＶシグナルの統合（図８）は、ＯＤＮ上の脱塩基部位と１の反応は２０分後には完了し、生理条件下では他の断片が生成しなかったことを示した。
４．１１ 酵素消化の効率
誘導体化された嵩高い脱塩基部位を、上記の酵素カクテルによって切り出すことができるかどうかを検証するために、本発明者らは、上のセクションで述べたオリゴで形成された脱塩基部位の量を定量化した。試薬１ａと４０分間反応させたオリゴのアリコートを１／４０００に希釈し、ある量の標識化内部標準を添加し、混合物をヌクレオシドレベルまで消化した。脱塩基部位の総量を１３６ｐｍｏｌと測定した。同じオリゴのｄＧの量をそのＵＶ痕跡によって定量化し、７６２ｐｍｏｌと計算した。この二本鎖コンストラクトには６個のｄＧ塩基があるため、脱塩基部位の量はｄＧの量の１／６にあたる量（１２７ｐｍｏｌ）と予測される。これは、消化が完全であり、脱塩基部位付加物によって加水分解酵素が妨げられなかったことを示している．
４．１２ ゲノムＤＮＡ中の脱塩基部位についての反応速度論
上述の条件（１によるゲノムＤＮＡの誘導体化）と同じ条件を用いて５μｇのｇＤＮＡを１で誘導体化することによって反応を行った。１－ナフチルアルデヒド（６６．７μＬ、２Ｍ、ｉ－ＰｒＯＨ溶液）の添加によって、特定の時点（ｔ＝１分、２．５分、５分、１０分、２０分、３０分、６０分）で反応を停止させた。最後に、反応アリコートをヌクレオシドレベルまで消化し、定量化した（図９）。５分間の反応時間の後，全ての脱塩基部位が誘導体化され、インキュベーションを６０分間まで延長しても、使用された条件下では、脱塩基部位が人為的に生成されないことが示されている。
５． チオール反応性プローブの合成およびグルタチオン（ＧＳＨ）のＭＳ解析における使用
分析物分子上のチオール官能基と反応できるプローブの一例として、アクリルアミド試薬を合成し、グルタチオン（ＧＳＨ）のＭＳ解析において試験した。反応スキームを図１０に示す。
５．１ アクリルアミドプローブの合成

【0178】

【化15】

【0179】

まず、ヒドロキシルアミンプローブ（２０ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＥｔＯＡｃ／Ｈ_２Ｏ（２：１、３．０ｍＬ）の混合物に溶解させ、Ｎａ_２ＣＯ_３（１９ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ、４．０当量）を添加し、０℃まで冷却した。塩化アクリロイル（１２０μＬ、１．４７ｍｍｏｌ、３３当量）を激しく撹拌しながら添加し、反応混合物を０℃に３０分間維持した。揮発物を凍結乾燥によって除去し、粗混合物を、Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ製のＮｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｃ１８ｅｃカラムを用いた準調製用のＨＰＬＣ（０％→４０％バッファーＢ（４０分以内）、バッファーＡ：２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯＯ、ｐＨ＝４．３のＨ_２Ｏ溶液、バッファーＢ：２０％バッファーＡのＭｅＣＮ溶液）で精製した。最後に、所望の化合物を含有する画分を凍結乾燥させ、生成物（６．０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、３０％）の茶色がかった色のオイルを得た。
¹H-NMR (400 MHz, D₂O), δ (ppm): 8.42 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.69 (d, 9.0 Hz), 6.16 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 6.10 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 5.76 (d, J = 10.7 Hz), 4.61 (s, 2H), 4.50 (s, 2H), 4.31 (s, 2H), 3.37 (s, 9H).
¹³C-NMR (121 MHz, D₂O), δ(ppm): 170.8, 170.4, 162.8, 144.8, 136.8, 128.9, 125.8, 122.5, 121.9, 74.5, 65.1, 54.3, 34.0.
５．２ ＧＳＨ付加物の合成

【0180】

【化16】

【0181】

アクリルアミドプローブ（３．０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ＮａＨＣＯ_３／Ｎａ_２ＣＯ_３バッファー（２．０ｍＬ、６０ｍＭ、ｐＨ＝１０）に溶解させた。グルタチオン（２．０ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、この混合物を５０℃で３時間インキュベートした。凍結乾燥により揮発物を除去し、Ｍａｃｈｅｒｙ ＆ Ｎａｇｅｌ製のＮｕｃｌｅｏｄｕｒ Ｃ１８ｅｃカラムを用いた準調製用のＨＰＬＣ（０％→３０％バッファーＢ（４０分以内）、バッファーＡ：２５ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯＯ、ｐＨ＝４．３のＨ_２Ｏ溶液、バッファーＢ：２０％バッファーＡのＭｅＣＮ）で粗残渣を精製し、ＧＳＨ－付加物を無色固体として得た（４ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ、７４％）。
¹H-NMR (400 MHz, D₂O), δ(ppm): 8.42 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 7.76 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.67 (d, 9.0 Hz), 4.60 (s, 2H), 4.47 (s, 2H), 4.39 (dd, J = 8.9 Hz, 4.9 Hz, 1H), 4.31 (s, 2H), 3.72 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 3.67 - 3.66 (m, 2H), 3.37 (s, 9H), 2.84 (dd, J = 14.1 Hz, 5.0 Hz, 1H), 2.67 - 2.64 (m, 3H), 2.44 (dd, J = 8.6 Hz, 6.7 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.12 - 2.05 (m, 2H).
¹³C-NMR (121 MHz, D₂O), δ(ppm): 176.0, 174.7, 173.8, 171.6, 171.2, 170.9, 179.4, 162.7, 144.8, 136.9, 133.4, 122.4, 122.4, 121.7, 74.5, 65.1, 54.3, 54.0, 52.9, 43.2, 34.0, 32.5, 32.0, 31.3, 26.9, 26.1.
ＨＲＭＳ：Ｃ_２９Ｈ_４３Ｎ_１０Ｏ_１０Ｓ^＋、［Ｍ］^＋の理論値＝７２３．２８７９、実測値：７２３．２８７３．
５．３ ＧＳＨ付加物のＭＳ解析
ＭＳ解析は、質量分析計における単一荷電種のＮ_２損失を、前駆イオン走査で示す。二重荷電種は、Ｎ_２損失を直接的に示す。結果を図１１に示す。
６．テストステロンのＭＳ解析におけるケトン反応性プローブの使用
分析物分子上のケトン官能基と反応できるプローブとして、ヒドロキシルアミン試薬を用い、テストステロンのＭＳ解析において試験した。反応スキームを図１２に示す。
６．１ 合成手順
テストステロン（２０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ、１．０当量）を、Ｈ_２Ｏ／ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ（１：１：１、１．０ｍＬ、０．０５％ギ酸を含有する）の混合物に溶解させた。ヒドロキシルアミン試薬（２８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、この混合物を４０℃で終夜インキュベートした。揮発物をｉｎ ｖａｃｕｏで除去し、最後に、粗生成物を準調製用のＨＰＬＣ（５０％ＭｅＣＮから８０％ＭｅＣＮのＨ_２Ｏ溶液＋０．０５％ギ酸（４０分以内）、０．５ｍＬ／分）で精製した．付加物を無色固体として得た（５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ、１３％）。
注意：付加物を、指定されていないＥ／Ｚ異性体の５３／４６混合物として得た。
¹H-NMR (400 MHz, CD₃CN): δ(ppm) = 8.67 (s, 2H), 8.11 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.96 - 7.94 (m, 4H), 7.76 - 7.73 (m, 4H), 7.10 (s_t, J = 5.55 Hz, 1H), 7.00 (s_t, J = 5.68 Hz, 1H), 6.39 (s, 1H), 5.69 (s, 1H), 4.57 (s, 4H), 4.46 (s, 4h), 4.44 (s, 4H), 3.32 (s, 18H), 1.79 -1.20 (m, 30 H), 1.07 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.03 - 0.73 (m, 10H), 0.71 (s, 3H), 0.68 (s, 3H).
¹³C-NMR (121 MHz, CD₃CN): δ(ppm) = 170.5, 170.4, 168.3, 163.0 (2xC), 162.4, 158.8, 158.2, 156.0, 146.7, 146.3, 139.7 (2xC), 133.6, 121.7, 121.6, 121.4, 121.3, 121.1, 116.6, 110.5, 81.3, 81.0, 73.2, 72.9, 65.9, 54.7, 54.5, 51.0, 50.9, 43.1, 43.0, 39.4, 38.4, 37.1, 36.9, 36.6, 36.1, 36.0, 35.0, 34.7, 34.6, 33.1, 32.6, 32.5, 32.2, 30.3, 30.2, 24.8, 23.6, 21.3, 21.1, 19.9, 17.9, 17.7, 11.1, 11.0.
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３５Ｈ_５０Ｎ_７Ｏ_４ ^＋［Ｍ^＋］の理論値：６３２．３９１９、実測値：６３２．３９１５．
６．２ 質量分析の詳細
テストステロン付加物を、ストック濃度２．１ｍＭのアセトニトリル／水（１：１）に溶解させた。同じ溶剤混合物の系列希釈により、最後に、濃度０．１２ｐＭの溶液を得た。付加物を流速０．３５ｍＬ／分、５０％バッファーＢ（０．００７５％ギ酸を含むアセトニトリル）開始の勾配を用いたＵＨＰＬＣ－ＱＱＱ－ＭＳで解析した。この溶液１．０μＬの注入は０．１２ａｍｏｌに相当する。この量はまだ質量分析計で検出可能であり、質量遷移が６３２．４→６０４．４であり、クォリファイアー遷移が６３２．４→１９２．１であった。

【0182】

比較に、純粋なテストステロンを、ストック濃度１１．０４ｍＭのアセトニトリル／ＥｔＯＨ（１：１）に溶解させた。同じ溶剤混合物で系列希釈を行い、最終濃度１１ｐＭを得た。この溶液を再び、流速０．３５ｍＬ／分、５０％バッファーＢ（０．００７５％ギ酸を含むアセトニトリル）で開始する勾配を用いたＵＨＰＬＣ－ＱＱＱ－ＭＳで解析した。このストックの注入体積２．０μＬは、２２ａｍｏｌに相当する。この量はまだ質量分析計で検出可能であり、質量遷移が２８９．２→１０９．２であった。１．０μＬのみの注入では、バックグラウンドノイズより大きなシグナルはみられなかった。

【0183】

まとめると、付加物は、誘導体化されていないテストステロンの感度より、１８５倍高い感度で検出できる。
結果を図１３～１５に示す。
７． ドパミンのＭＳ解析における反応性エステルプローブの使用
以下のドパミンの付加物および反応性エステル化合物を調製し、

【0184】

【化17】

【0185】

ＨＲ－ＭＳおよびＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって特徴付けた。
ＨＲ－ＭＳ：Ｃ_２６Ｈ_３３Ｎ_８Ｏ_６ ^＋の理論値：５５３．２５１８、実測値：５５３．２５１８．
付加物を溶解させ、ＭｅＯＨ／アセトニトリル（１：１）中に希釈し、ＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳで解析した。生成物イオン走査の実施によって、ｍ／ｚ ５５３．４の分子イオンの断片化によって起こる、５２５．２にピークを有する窒素損失が特定された。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】