特許 7156137 細胞培養器具及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-11

(45)【発行日】2022-10-19

(54)【発明の名称】細胞培養器具及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20221012BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20221012BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12M3/00 Z

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2019065127

(22)【出願日】2019-03-28

(65)【公開番号】P2020162458

(43)【公開日】2020-10-08

【審査請求日】2021-05-28

(73)【特許権者】

【識別番号】000241463

【氏名又は名称】豊田合成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000604

【氏名又は名称】弁理士法人 共立特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】篠田 康彦

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼城 誠太郎

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 真輝

(72)【発明者】

【氏名】大口 慎治

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－０２９０９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－１６７００２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－００６１３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

軸方向に筒状に延びる本体筒部と、前記本体筒部の軸方向中間部に設けられ、培養膜を保持する保持部と、を有する保持具と、
前記保持具に対して軸方向一方側に着脱可能に装着され、軸方向に筒状に延び、前記保持具への装着時に前記保持具の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出する第一筒部材と、
前記保持具に対して軸方向他方側に着脱可能に装着され、軸方向に筒状に延び、前記保持具への装着時に前記保持具の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する第二筒部材と、
を備え、
前記保持具は、
前記培養膜の軸方向一方側の軸方向端面に当接する第一当接部が前記保持部として設けられた筒状の第一保持筒と、
前記第一保持筒に対して係脱可能に取り付けられ、前記培養膜の軸方向他方側の軸方向端面に当接する第二当接部が前記保持部として設けられた筒状の第二保持筒と、
を有する、細胞培養器具。

【請求項2】

前記保持具は、前記本体筒部における前記保持部の軸方向少なくとも一方側を含む所定部位を径方向に貫通するように設けられた側面開口部を有する、請求項１に記載された細胞培養器具。

【請求項3】

前記側面開口部は、
前記保持部の軸方向一方側に軸方向に延びるように形成された第一側面開口部と、
前記保持部の軸方向他方側に軸方向に延びるように形成された第二側面開口部と、
を有する、請求項２に記載された細胞培養器具。

【請求項4】

前記培養膜は、膜体と、前記膜体に接合され、前記膜体よりも硬質な材料により形成された支持枠と、を有する、請求項１乃至３の何れか一項に記載された細胞培養器具。

【請求項5】

請求項１乃至４の何れか一項に記載された細胞培養器具を使用する方法であって、
前記培養膜の一方の軸方向端面に細胞が播種される前に、前記第一保持筒の軸方向一方側に前記第一筒部材を装着する第一装着工程と、
前記培養膜の一方の軸方向端面への細胞の播種が行われた後に、前記第一保持筒から前記第一筒部材を取り外す第一取り外し工程と、
前記培養膜の他方の軸方向端面に細胞が播種される前に、前記第二保持筒の軸方向他方側に前記第二筒部材を装着する第二装着工程と、
を備える、細胞培養器具の使用方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞を培養するために用いられる細胞培養器具及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、培養膜の両面に細胞を培養するための細胞培養器具が知られている（例えば、特許文献１）。特許文献１記載の細胞培養器具は、培養膜と、外筒と、内筒と、を備えている。外筒は、軸方向に筒状に延びる本体筒部を有している。外筒の本体筒部には、軸方向に延びるスリットが設けられている。外筒は、スリットの存在により径方向に弾性変形可能である。外筒は、本体筒部の軸方向中間部に設けられた、培養膜を保持する保持部を有している。

【0003】

内筒は、二つ設けられており、それぞれ軸方向に筒状に延びている。第一の内筒は、外筒の保持部に対向する対向部を有している。第一の内筒は、外筒の軸方向一方側から外筒内に挿入されて隣接配置される。また、第二の内筒は、外筒の軸方向他方側から外筒内に挿入されて隣接配置される。各内筒が外筒内に挿入されて装着された状態では、外筒が径方向外側へ弾性変形することで各内筒と外筒とが互いに径方向で隙間無く接し、第一の内筒の対向部と外筒の保持部とが軸方向で対向することで培養膜が挟持されて保持される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１７－２９０９２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、上記の細胞培養器具では、二つの内筒がそれぞれ、外筒に装着された際にその軸方向先端が外筒の軸方向端面よりも軸方向外側に突出しないように形成されている。そして、外筒は、それら二つの内筒を同時に装着できるようにその軸方向全長が比較的長い状態に形成されており、細胞培養器具における外筒の軸方向下端から培養膜までの寸法距離が長い。このため、培養膜に細胞を培養するためには、ウェル（培養容器）の容量を大きくすることが必要であり、多量の培養液を準備することが必要である。

【0006】

本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、少量の培養液で培養膜に細胞を培養することが可能な細胞培養器具及びその使用方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様である細胞培養器具は、軸方向に筒状に延びる本体筒部と、前記本体筒部の軸方向中間部に設けられ、培養膜を保持する保持部と、を有する保持具と、前記保持具に対して着脱可能に軸方向一方側に装着され、軸方向に筒状に延び、前記保持具への装着時に前記保持具の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出する第一筒部材と、前記保持具に対して着脱可能に軸方向他方側に装着され、軸方向に筒状に延び、前記保持具への装着時に前記保持具の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する第二筒部材と、を備える、細胞培養器具である。

【0008】

この構成によれば、培養膜の両面に二種類の細胞を播種するうえで、細胞培養器具を、保持具に第一筒部材及び第二筒部材の双方を同時に装着して用いる必要はなく、第一筒部材及び第二筒部材のうち何れか下側に位置するものを保持具から取り外した状態で用いることができる。また、第一筒部材は、保持具に係合固定された状態で保持具の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出し、第二筒部材は、保持具に係合固定された状態で保持具の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する。このため、細胞培養器具によれば、細胞培養を行う使用時、軸方向下端から培養膜が保持される保持部までの寸法距離を短縮することができるので、少量の培養液で培養膜に細胞を培養することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】第一実施形態に係る細胞培養器具の分解斜視図である。

【図2】第一実施形態の細胞培養器具の断面図である。

【図3】第一実施形態の細胞培養器具において保持具により培養膜を保持する構造を説明するための断面図である。

【図4】第一実施形態の細胞培養器具における培養膜の一方の軸方向端面への細胞播種時の断面図である。

【図5】第一実施形態の細胞培養器具における培養膜の他方の軸方向端面への細胞播種時の断面図である。

【図6】第一実施形態の細胞培養器具における両面培養時の使用手順を表した一例のフローチャートである。

【図7】第二実施形態に係る細胞培養器具の断面図である。

【図8】第二実施形態の細胞培養器具が備える保持具の分解斜視図である。

【図9】一変形形態に係る細胞培養器具の断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明に係る細胞培養器具及びその使用方法の具体的な実施形態について、図面を用いて説明する。

【0011】

［第一実施形態］
第一実施形態の細胞培養器具１は、足場依存性のある細胞を培養する器具である。細胞培養器具１は、二種類の細胞を膜の両面に培養することが可能である。細胞培養器具１は、図１に示す如く、培養膜１０と、保持具２０と、第一筒部材３０と、第二筒部材４０と、を備えている。

【0012】

培養膜１０は、細胞が培養されるシート状の膜である。培養膜１０は、膜体１１と、支持枠１２と、を有している。膜体１１は、細胞培養時に細胞の足場となる膜本体部である。膜体１１は、両面に細孔が設けられた多孔質膜である。膜体１１は、例えば、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル、ポリイミドなどの熱硬化性樹脂により形成されている。膜体１１の膜厚は、例えば０．１μｍ－１００μｍである。

【0013】

支持枠１２は、膜体１１を支持して補強する基材である。支持枠１２は、中央部に円形の孔１２ａが開いた環状の枠体である。支持枠１２は、膜体１１の周縁に接合されて固定されている。尚、支持枠１２の形状は、少なくとも環状の枠体部を含むものであればよく、更に、その枠体部の周方向一部から径方向外側に向けて突出する突起部を含んでいてもよい。この突起部は、例えば、人がピンセットなどの治具で培養膜１０を把持するときに取り扱い易くするための機能を有している。支持枠１２は、膜体１１よりも硬質な材料により形成されている。支持枠１２の材料は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの熱可塑性樹脂、或いは、シリコーンゴムなどの熱硬化性エラストマーである。支持枠１２の厚みは、例えば、０．０５ｍｍ－０．５ｍｍである。

【0014】

保持具２０は、培養膜１０を保持するための部材である。保持具２０は、樹脂材料やゴムなどにより形成されている。保持具２０は、二つの保持筒からなり、第一保持筒２１と、第二保持筒２２と、を有している。第一保持筒２１と第二保持筒２２とは、互いに軸方向Ｘに隣接して配置される。第一保持筒２１及び第二保持筒２２は、互いに係合して固定された状態で培養膜１０を保持する。保持具２０に保持された培養膜１０は、第一保持筒２１及び第二保持筒２２の軸方向開口を通じて軸方向両側に露出する。

【0015】

第一保持筒２１及び第二保持筒２２は、互いに係脱可能に取り付けられる部材であって、図２に示す如く、互いに係合して固定される構造２３を有している。この係合構造２３は、互いの組付け状態で互いに離間する軸方向Ｘへの相対移動及び径方向への相対移動を規制させる係止構造である。この係合構造２３が設けられる部位は、例えば第一保持筒２１及び第二保持筒２２に周方向二箇所以上（例えば、３箇所～５箇所）に設けられる。また、軸方向Ｘに延びるスリットが保持筒２１，２２に設けられる構造では、そのスリットを周方向に挟んだ分断部位それぞれに係合構造２３が設けられることが好ましい。

【0016】

上記の如く第一保持筒２１と第二保持筒２２とが互いに係合して固定された状態では、第一保持筒２１及び第二保持筒２２それぞれの互いに対向する軸方向端面が軸方向Ｘに離間する距離は、培養膜１０（具体的には、その支持枠１２）における組み付け前の軸方向厚みと同等以下となるように設定されている。これにより、培養膜１０の支持枠１２が第一保持筒２１と第二保持筒２２とに挟持されて固定される。この際、支持枠１２と第一保持筒２１との間及び支持枠１２と第二保持筒２２との間はシールされる。

【0017】

尚、第一保持筒２１と第二保持筒２２との係合構造２３は、例えば、第一保持筒２１及び第二保持筒２２のうちの一方の外面又は内面に設けられた径方向に凹んだ凹部と、他方の内面又は外面に設けられた径方向に突起する凸部と、からなるＬ溝係合構造であってよい。凹部は、例えば径方向から見てＬ字状に形成された溝であってよい。

【0018】

また、第一保持筒２１と第二保持筒２２との係合構造２３は、例えば、第一保持筒２１及び第二保持筒２２のうちの一方に設けられた径方向に弾性変形可能な弾性変形部と、他方に設けられた径方向に凹んだ溝部と、からなるスナップフィット方式の係合構造であってよい。このスナップフィット方式の係合構造では、第一保持筒２１と第二保持筒２２とが組付け時に互いに軸方向に接近された際、弾性変形部の軸方向先端部に設けた径方向に突出する爪部が溝部に嵌って引っ掛かることにより、第一保持筒２１と第二保持筒２２とが互いに係合して固定される。

【0019】

第一保持筒２１は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の第一筒部２１ａと、培養膜１０を保持する第一保持部２１ｂと、第一筒部２１ａを径方向に貫通するように設けられた第一側面開口部２１ｃと、を有している。第二保持筒２２は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の第二筒部２２ａと、培養膜１０を保持する第二保持部２２ｂと、第二筒部２２ａを径方向に貫通するように設けられた第二側面開口部２２ｃと、を有している。

【0020】

第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａはそれぞれ、軸方向Ｘに所定長さＬａ１，Ｌａ２を有している。尚、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａの軸方向長さ同士は、略一致していてよい。第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａは、保持具２０における軸方向Ｘに筒状に延びる本体筒部を構成している。

【0021】

第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａはそれぞれ、径方向に所定厚さを有している。図３に示す如く、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａの外径同士は、略一致していると共に、それらの内径同士は、略一致している。培養膜１０の外径（すなわち、支持枠１２の外径）は、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａの内径を超えている。尚、培養膜１０の外径は、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａの外径よりも小さくてよい。第一保持筒２１及び第二保持筒２２は、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａの軸方向Ｘに向いた軸方向端面同士が対向した状態で互いに係合することにより、培養膜１０を挟持して保持する。

【0022】

第一保持部２１ｂ及び第二保持部２２ｂは、第一筒部２１ａ及び第二筒部２２ａそれぞれにおける互いに対向する軸方向端面である。この第一保持部２１ｂ及び第二保持部２２ｂとしての軸方向端面は、培養膜１０の支持枠１２に当接可能な当接部である。第一保持部２１ｂは、培養膜１０の軸方向一方側の軸方向端面に当接している。第二保持部２２ｂは、培養膜１０の軸方向他方側の軸方向端面に当接している。第一保持部２１ｂ及び第二保持部２２ｂはそれぞれ、環状に形成されている。第一保持部２１ｂ及び第二保持部２２ｂは、保持具２０全体での本体筒部の軸方向中間部に位置して設けられている。

【0023】

第一側面開口部２１ｃは、第一筒部２１ａの所定部位を径方向に貫通するように設けられた、その第一筒部２１ａの内部を外部に連通させるスリット孔部である。第一側面開口部２１ｃは、周方向に一箇所設けられている。第一側面開口部２１ｃが設けられる所定部位は、第一筒部２１ａが第二筒部２２ａの下方に位置する状態での細胞培養時に少なくとも第一保持部２１ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含んでおり、その第一保持部２１ｂから軸方向一方側に延びるように形成されている。第一側面開口部２１ｃは、第一筒部２１ａの軸方向全体に亘って延びている。第一側面開口部２１ｃは、第一保持部２１ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0024】

第二側面開口部２２ｃは、第二筒部２２ａの所定部位を径方向に貫通するように設けられた、その第二筒部２２ａの内部を外部に連通させるスリット孔部である。第二側面開口部２２ｃは、周方向に一箇所設けられている。第二側面開口部２２ｃが設けられる所定部位は、第二筒部２２ａが第一筒部２１ａの下方に位置する状態での細胞培養時に少なくとも第二保持部２２ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含んでおり、その第二保持部２２ｂから軸方向他方側に延びるように形成されている。第二側面開口部２２ｃは、第二筒部２２ａの軸方向全体に亘って延びている。第二側面開口部２２ｃは、第二保持部２２ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0025】

第一筒部材３０及び第二筒部材４０はそれぞれ、保持具２０に取り付けられる筒状の部材である。第一筒部材３０及び第二筒部材４０はそれぞれ、樹脂材料やゴムなどにより形成されている。第一筒部材３０及び第二筒部材４０は、培養膜１０への細胞培養時において選択的に保持具２０に取り付けられる。すなわち、培養膜１０の一方の軸方向端面に一種目の細胞が播種されるときは、第一筒部材３０が保持具２０に取り付けられ、一方、培養膜１０の他方の軸方向端面に二種目の細胞が播種されるときは、第二筒部材４０が保持具２０に取り付けられる。

【0026】

第一筒部材３０は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の筒部３１を有している。第一筒部材３０は、保持具２０（具体的には、第一保持筒２１）に対して軸方向一方側に装着される。第一筒部材３０は、保持具２０（具体的には、第一保持筒２１）に対して着脱可能である。すなわち、第一筒部材３０及び第一保持筒２１は、互いに係脱可能に取り付けられる。第一筒部材３０及び第一保持筒２１は、上記した保持具２０の第一保持筒２１及び第二保持筒２２の係合構造２３の如き、互いに係合して固定される構造Ａを有している。保持具２０に保持された培養膜１０は、第一筒部材３０の軸方向開口を通じて軸方向一方側に露出する。

【0027】

第一筒部材３０は、保持具２０の第一保持筒２１に挿入可能に形成されている。第一筒部材３０は、第一保持筒２１の第一筒部２１ａ内に挿入された状態に取り付けられる。第一筒部材３０は、第一保持筒２１の内径に一致する外径を有している。第一筒部材３０の筒部３１は、第一保持筒２１に係合固定された状態で第一保持筒２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出する第一突出部３２を有している。

【0028】

具体的には、第一筒部材３０は、第一保持筒２１に係合固定された状態で、筒部３１における挿入側の軸方向端面が、第一保持筒２１と第二保持筒２２とに挟持固定される培養膜１０の一方の軸方向端面に当接するように、かつ、筒部３１におけるその挿入側とは反対側の軸方向端面が、第一保持筒２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出した位置に配置されるように形成されている。すなわち、第一筒部材３０の軸方向Ｘの長さＬｂ１は、第一保持筒２１の第一筒部２１ａの軸方向Ｘの長さＬａ１に比して大きくなるように設定されている。

【0029】

また、第二筒部材４０は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の筒部４１を有している。第二筒部材４０は、保持具２０（具体的には、第二保持筒２２）に対して軸方向他方側に装着される。第二筒部材４０は、保持具２０（具体的には、第二保持筒２２）に対して着脱可能である。すなわち、第二筒部材４０及び第二保持筒２２は、互いに係脱可能に取り付けられる。第二筒部材４０及び第二保持筒２２は、上記した保持具２０の第一保持筒２１及び第二保持筒２２の係合構造２３の如き、互いに係合して固定される構造Ｂを有している。保持具２０に保持された培養膜１０は、第二筒部材４０の軸方向開口を通じて軸方向他方側に露出する。

【0030】

第二筒部材４０は、保持具２０の第二保持筒２２に挿入可能に形成されている。第二筒部材４０は、第二保持筒２２の第二筒部２２ａ内に挿入された状態に取り付けられる。第二筒部材４０は、第二保持筒２２の内径に一致する外径を有している。第二筒部材４０の筒部４１は、第二保持筒２２に係合固定された状態で第二保持筒２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する第二突出部４２を有している。

【0031】

具体的には、第二筒部材４０は、第二保持筒２２に係合固定された状態で、筒部４１における挿入側の軸方向端面が、第一保持筒２１と第二保持筒２２とに挟持固定される培養膜１０の他方の軸方向端面に当接するように、かつ、筒部４１におけるその挿入側とは反対側の軸方向端面が、第二保持筒２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出した位置に配置されるように形成されている。すなわち、第二筒部材４０の軸方向Ｘの長さＬｂ２は、第二保持筒２２の第二筒部２２ａの軸方向Ｘの長さＬａ２に比して大きくなるように設定されている。

【0032】

次に、図４、図５、及び図６を参照して、細胞培養器具１の組み立て方法及びその使用方法について説明する。

【0033】

細胞培養器具１の構成部品である培養膜１０、保持具２０、第一筒部材３０、及び第二筒部材４０を用意する。尚、培養膜１０及び保持具２０は、保持具２０の第一保持筒２１及び第二保持筒２２が互いに係合して固定されることで培養膜１０が保持された状態にあるものを用いるものとすればよい。

【0034】

細胞培養器具１の組み立ては、ピンセットなどの治具を用いた人の手作業により行われる。この組み立て手順としては、まず、培養膜１０が保持された保持具２０への第一筒部材３０の組み付けが行われる。この組み付けは、まず、保持具２０を、第一筒部材３０を挿入する軸方向端部側が上方に位置するようにセットした状態で、治具で第一筒部材３０を把持したうえで、その第一筒部材３０を保持具２０に対して上方から軸方向Ｘの互いに近づく方向へ移動させて挿入し、その後、保持具２０と第一筒部材３０とを構造Ａで互いに係合固定することにより実現される。

【0035】

かかる組み付けが行われると、第一筒部材３０が保持具２０に装着されて、その第一突出部３２が保持具２０の第一保持筒２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側の外方に突出した状態になる（図４に示す状態；図６に示すステップＳ１００）。この状態の細胞培養器具１に対して培養膜１０への細胞培養が行われる。この細胞培養は、細胞培養器具１を細胞培養用プレートのウェル内に入れて培養液で満たし、培養膜１０（具体的には、膜体１１）の一方の軸方向端面（図４に示す上面）に細胞αを播種させることとすればよい。この細胞αの播種は、まず、培養膜１０の一方の軸方向端面が鉛直上方を向くように細胞培養器具１を培養液中に浸漬し、その状態でその一方の軸方向端面側の空間に対して細胞αを供給することにより行われる（ステップＳ１１０）。

【0036】

上記の如く細胞αの播種が完了すると、次に、治具を用いて、保持具２０から第一筒部材３０が取り外され（ステップＳ１２０）、その後、保持具２０が、培養膜１０を保持したまま上下反転される（ステップＳ１３０）。

【0037】

保持具２０が上下反転されると、次に、その保持具２０への第二筒部材４０の組み付けが行われる。この組み付けは、まず、保持具２０を、第一筒部材３０を挿入する軸方向端部側とは反対側である第二筒部材４０を挿入する軸方向端部側が上方に位置するようにセットした状態で、治具で第二筒部材４０を把持したうえで、その第二筒部材４０を保持具２０に対して上方から軸方向Ｘの互いに近づく方向へ移動させて挿入し、その後、保持具２０と第二筒部材４０とを構造Ｂで互いに係合固定することにより実現される。

【0038】

かかる組み付けが行われると、第二筒部材４０が保持具２０に装着されて、その第二突出部４２が保持具２０の第二保持筒２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側の外方に突出した状態になる（図５に示す状態；ステップＳ１４０）。この状態の細胞培養器具１に対して培養膜１０への細胞培養が行われる。この細胞培養は、細胞培養器具１を細胞培養用プレートのウェル内に入れて培養液で満たし、培養膜１０（具体的には、膜体１１）の他方の軸方向端面（図５に示す上面）に細胞βを播種させることとすればよい。この細胞β得の播種は、まず、培養膜１０の他方の軸方向端面が鉛直上方を向くように細胞培養器具１を培養液中に浸漬し、その状態でその他方の軸方向端面側の空間に対して細胞βを供給することにより行われる（ステップＳ１５０）。

【0039】

上記の如く細胞βの播種が完了すると、次に、治具を用いて、保持具２０から第二筒部材４０が取り外される（ステップＳ１６０）。そして、保持具２０から細胞培養が行われた培養膜１０が取り外されて、その培養膜１０の膜体１１の顕微鏡観察などが行われる。

【0040】

このように、細胞培養器具１の構造によれば、培養膜１０の両面に二種類の細胞を播種して細胞培養を行うことができる。また、培養膜１０の両面に二種類の細胞を播種するうえで、培養膜１０の一方の軸方向端面への細胞播種の際及び他方の軸方向端面への細胞播種の際の何れのときにも、培養膜１０を保持する保持具２０の上側に第一筒部材３０及び第二筒部材４０のうち何れか一方を装着することは必要であるが、その保持具２０の下側に何れか他方を装着することは不要である。すなわち、培養膜１０の両面に二種類の細胞を播種するうえで、細胞培養器具１を、保持具２０に第一筒部材３０及び第二筒部材４０の双方を同時に装着して用いる必要はなく、第一筒部材３０及び第二筒部材４０のうち何れか下側に位置するものを保持具２０から取り外した状態で用いることができる。

【0041】

第一筒部材３０の軸方向Ｘの長さＬｂ１は、第一保持筒２１の第一筒部２１ａの軸方向Ｘの長さＬａ１に比して大きく、第一筒部材３０は、第一保持筒２１に係合固定された状態で、第一突出部３２にて第一保持筒２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出する。また、第二筒部材４０の軸方向Ｘの長さＬｂ２は、第二保持筒２２の第二筒部２２ａの軸方向Ｘの長さＬａ２に比して大きく、第二筒部材４０は、第二保持筒２２に係合固定された状態で、第二突出部４２にて第二保持筒２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する。このため、細胞培養器具１によれば、細胞培養を行う使用時、軸方向下端から培養膜１０が保持される保持部２１ｂ，２２ｂまでの寸法距離を短縮することができるので、ウェルの小容量化を図ることができ、少量の培養液で培養膜に細胞を培養することが可能となる。

【0042】

また、細胞培養器具１において、保持具２０の第一保持筒２１は、第一筒部２１ａを径方向に貫通する第一側面開口部２１ｃを有している。保持具２０の第二保持筒２２は、第二筒部２２ａを径方向に貫通する第二側面開口部２２ｃを有している。側面開口部２１ｃ，２２ｃはそれぞれ、保持部２１ｂ，２２ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含む所定部位に設けられている。このため、培養膜１０の両面に溜まるエアを側面開口部２１ｃ，２２ｃを介して保持具２０の外部へ放出することができる。

【0043】

特に、保持具２０に保持される培養膜１０の一方の軸方向端面への細胞播種後、その保持具２０を上下反転させて培養膜１０の他方の軸方向端面への細胞播種を行う際に、培養膜１０における既に細胞播種がなされている一方の軸方向端面に溜まるエアを側面開口部２１ｃを介して保持具２０の外部へ放出することができる。従って、最初に播種される細胞の培養面上にエアが残留するのを防止することができ、そのエア残留に起因する不都合（例えば、最初に播種された細胞が培養液に接触しないことなど）を回避することができる。

【0044】

また、細胞培養器具１において、培養膜１０は、細胞が播種される膜体１１と、その膜体１１に接合され、その膜体１１よりも硬質な材料により形成された支持枠１２と、を有している。培養膜１０は、支持枠１２にて保持具２０の第一保持筒２１と第二保持筒２２とに挟持されて固定される。このため、培養膜１０を治具で取り扱ううえで比較的硬質な支持枠１２を用いればよいので、培養膜１０の取り扱いを容易化することができる。また、支持枠１２は、膜体１１の周縁に接合されて環状に形成されている。このため、培養膜１０の膜体１１の顕微鏡観察などの評価を、支持枠１２を膜体１１に接合させたまま行うことができる。

【0045】

更に、保持具２０は、第一保持筒２１と第二保持筒２２とが互いに係合して固定されることによりそれらの第一保持筒２１と第二保持筒２２とにより培養膜１０を挟持して保持する。このため、培養膜１０を保持した状態で保持具２０を簡単に組み立てることができると共に、組み立て後の保持具２０を第一保持筒２１と第二保持筒２２とに簡単に分離させることができ、培養膜１０を保持具２０から簡単に取り出すことができる。これにより、細胞培養後の培養膜１０に対して単独で顕微鏡観察などの評価を行うことができ、培養膜と保持具とが一体となった構造に比べて、その評価を容易かつ適切に行うことができる。

【0046】

尚、上記の第一実施形態においては、第一保持筒２１の第一保持部２１ｂ及び第二保持筒２２の第二保持部２２ｂがそれぞれ、特許請求の範囲に記載した「保持部」に相当している。

【0047】

また、上記の第一実施形態においては、二種類の細胞を培養膜１０の両面に播種することとしている。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、三種類以上の細胞を培養膜１０の両面に播種することとしてもよい。例えば、三種類の細胞を用意して、二種類の細胞を培養膜１０の一方の面に播種し、その後、培養膜１０を裏返して、一種類の細胞を培養膜１０の他方の面に播種することとしてもよい。

【0048】

［第二実施形態］
第二実施形態の細胞培養器具１００は、第一実施形態の細胞培養器具１と同様に、二種類の細胞を膜の両面に培養することが可能である。細胞培養器具１００は、図７に示す如く、培養膜１０と、保持具１２０と、第一筒部材１３０と、第二筒部材１４０と、を備えている。尚、第二実施形態において、上記第一実施形態における細胞培養器具１の構成と同一の構成部分については、同一の符号を付してその説明を省略又は簡略する。

【0049】

保持具１２０は、培養膜１０を保持するための部材である。保持具１２０は、樹脂材料やゴムなどにより形成されている。保持具１２０は、図８に示す如く、二つの保持筒からなり、第一保持筒１２１と、第二保持筒１２２と、を有している。第一保持筒１２１と第二保持筒１２２とは、互いに軸方向Ｘに隣接して配置される。第一保持筒１２１及び第二保持筒１２２は、互いに係合して固定された状態で培養膜１０を保持する。保持具１２０に保持された培養膜１０は、第一保持筒１２１及び第二保持筒１２２の軸方向開口を通じて軸方向両側に露出する。

【0050】

第一保持筒１２１及び第二保持筒１２２は、互いに係脱可能に取り付けられる部材であって、互いに係合して固定される構造を有している。この係合構造は、第一実施形態における保持具２０の係合構造２３と同様のＬ溝係合構造やスナップフィット方式の係合構造であってよい。第一保持筒１２１と第二保持筒１２２とが互いに係合して固定された状態では、第一保持筒１２１及び第二保持筒１２２それぞれの互いに対向する保持部が軸方向Ｘに離間する距離は、培養膜１０（具体的には、その支持枠１２）における組み付け前の軸方向厚みよりも小さくなるように設定されている。これにより、培養膜１０の支持枠１２が第一保持筒１２１と第二保持筒１２２とに挟持されて固定される。この際、支持枠１２と第一保持筒１２１との間及び支持枠１２と第二保持筒１２２との間はシールされる。

【0051】

第一保持筒１２１は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の第一筒部１２１ａと、培養膜１０を保持する第一保持部１２１ｂと、第一筒部１２１ａを径方向に貫通するように設けられた第一側面開口部１２１ｃと、を有している。第二保持筒１２２は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の第二筒部１２２ａと、培養膜１０を保持する第二保持部１２２ｂと、それぞれ第二筒部１２２ａを径方向に貫通するように設けられた第二側面開口部１２２ｃ及び第三側面開口部１２２ｄと、第二保持部１２２ｂを軸方向Ｘに貫通するように設けられた保持開口部１２２ｅと、を有している。

【0052】

第一筒部１２１ａは、軸方向Ｘに所定長さを有していると共に、径方向に所定厚さを有している。第二筒部１２２ａは、軸方向Ｘに所定長さを有していると共に、径方向に所定厚さを有している。第一筒部１２１ａの外径と第二筒部１２２ａの内径とは、略一致している。培養膜１０の外径（すなわち、支持枠１２の外径）は、第一筒部１２１ａの内径を超えかつその外径以下であると共に、第二筒部１２２ａの内径以下である。

【0053】

第一保持部１２１ｂは、第一筒部１２１ａにおける第二保持筒１２２に対向する軸方向端面である。第二保持部１２２ｂは、第二筒部１２２ａから径方向内側へ突出するフランジ部である。培養膜１０の外径（すなわち、支持枠１２の外径）は、第二保持部１２２ｂの径方向内端の内径よりも大きい。第二保持部１２２ｂは、第二筒部１２２ａの軸方向中間部に位置して設けられている。第一保持筒１２１は、第一筒部１２１ａが第二保持筒１２２の第二筒部１２２ａの内側に挿入されると共に第一保持部１２１ｂが第二保持部１２２ｂに対向した状態で、第二保持筒１２２に対して係合固定される。これにより、第一保持筒１２１と第二保持筒１２２は、培養膜１０を挟持して保持する。

【0054】

第一側面開口部１２１ｃは、第一筒部１２１ａの所定部位を径方向に貫通するように設けられた、その第一筒部１２１ａの内部を外部に連通させるスリット孔部である。第一側面開口部１２１ｃは、周方向に一箇所設けられている。第一側面開口部１２１ｃが設けられる所定部位は、第一筒部１２１ａが第二筒部１２２ａの下方に位置する状態での細胞培養時に少なくとも第一保持部１２１ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含んでおり、その第一保持部１２１ｂから軸方向一方側に延びるように形成されている。第一側面開口部１２１ｃは、第一筒部１２１ａが第二筒部１２２ａの下方に位置する状態で第一保持部１２１ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0055】

第二側面開口部１２２ｃ及び第三側面開口部１２２ｄはそれぞれ、第二筒部１２２ａの所定部位を径方向に貫通するように設けられた、その第二筒部１２２ａの内部を外部に連通させるスリット孔部である。第二側面開口部１２２ｃと第三側面開口部１２２ｄとは、第二筒部１２２ａの周方向異なる位置に設けられている。これにより、第二保持筒１２２の捩じれ剛性を向上させると共にシール性を向上させることができる。

【0056】

第二側面開口部１２２ｃが設けられる所定部位は、第二筒部１２２ａが第一筒部１２１ａの下方に位置する状態での細胞培養時に少なくとも第二保持部１２２ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含んでおり、その第二保持部１２２ｂから軸方向他方側に延びるように形成されている。第二側面開口部１２２ｃは、第二筒部１２２ａが第一筒部１２１ａの下方に位置する状態で第二保持部１２２ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0057】

第三側面開口部１２２ｄが設けられる所定部位は、第一筒部１２１ａが第二筒部１２２ａの下方に位置する状態での細胞培養時に少なくとも第一保持筒１２１の第一側面開口部１２１ｃに径方向で連通すると共に第二保持部１２２ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含んでおり、その第二保持部１２２ｂから軸方向一方側に延びるように形成されている。第三側面開口部１２２ｄは、第一筒部１２１ａが第二筒部１２２ａの下方に位置する状態で、第一側面開口部１２１ｃに連通して、第二保持部１２２ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0058】

保持開口部１２２ｅは、第二保持部１２２ｂを軸方向Ｘに貫通するように設けられており、第二側面開口部１２２ｃに径方向で連通する。この保持開口部１２２ｅは、第二筒部１２２ａが第一筒部１２１ａの下方に位置する状態で、第二側面開口部１２２ｃに連通して、第二保持部１２２ｂに保持された培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出するエア抜き機能を有している。

【0059】

第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０はそれぞれ、保持具１２０に取り付けられる筒状の部材である。第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０はそれぞれ、樹脂材料やゴムなどにより形成されている。第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０は、培養膜１０への細胞培養時、保持具２０に選択的に取り付けられる。すなわち、培養膜１０の一方の軸方向端面に一種目の細胞が播種されるときは、第一筒部材１３０が保持具１２０に取り付けられ、一方、培養膜１０の他方の軸方向端面に二種目の細胞が播種されるときは、第二筒部材１４０が保持具１２０に取り付けられる。

【0060】

第一筒部材１３０は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の筒部１３１を有している。第一筒部材１３０は、保持具１２０（具体的には、第一保持筒１２１）に対して軸方向一方側に装着される。第一筒部材１３０は、第一保持筒１２１に対して係脱可能に取り付けられて着脱可能である。第一筒部材１３０と第一保持筒１２１とは、互いに係合して固定される構造を有している。保持具１２０に保持された培養膜１０は、第一筒部材１３０の軸方向開口を通じて軸方向一方側に露出する。

【0061】

第一筒部材１３０は、保持具１２０の第一保持筒１２１に挿入可能に形成されている。第一筒部材１３０は、第一保持筒１２１の第一筒部１２１ａ内に挿入された状態に取り付けられる。第一筒部材１３０は、その内径が軸方向Ｘ全域に亘って不変であるが、その軸方向他方側の外径が軸方向一方側の外径に比して小さくなるように形成されている。その軸方向他方側の外径は、第一保持筒１２１の内径に一致している。第一筒部材１３０の筒部１３１は、第一保持筒１２１の軸方向他方側に係合固定された状態で第一保持筒１２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出する第一突出部１３２を有している。

【0062】

第一筒部材１３０は、第一保持筒１２１に係合固定された状態で、筒部１３１における挿入側の軸方向端面が、第一保持筒１２１と第二保持筒１２２とに挟持固定される培養膜１０の一方の軸方向端面に当接するように、かつ、筒部１３１におけるその挿入側とは反対側の軸方向端面が、第一保持筒１２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側に突出した位置に配置されるように形成されている。すなわち、第一筒部材１３０の軸方向Ｘの長さは、第一保持筒１２１の第一筒部１２１ａの軸方向Ｘの長さに比して大きくなるように設定されている。

【0063】

また、第二筒部材１４０は、軸方向Ｘに筒状に延びる中空の筒部１４１を有している。第二筒部材１４０は、保持具１２０（具体的には、第二保持筒１２２）に対して軸方向他方側に装着される。第二筒部材１４０は、第二保持筒１２２に対して互いに係脱可能に取り付けて着脱可能である。第二筒部材１４０と第二保持筒１２２とは、互いに係合して固定される構造を有している。保持具１２０に保持された培養膜１０は、第二筒部材１４０の軸方向開口を通じて軸方向他方側に露出する。

【0064】

第二筒部材１４０は、保持具１２０の第二保持筒１２２に挿入可能に形成されている。第二筒部材１４０は、第二保持筒１２２の第二筒部１２２ａ内に挿入された状態に取り付けられる。第二筒部材１４０は、第二保持筒１２２の第二筒部１２２ａの内径に一致する外径を有している。第二筒部材１４０の筒部１４１は、第二保持筒１２２に係合固定された状態で第二保持筒１２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出する第二突出部１４２を有している。

【0065】

第二筒部材１４０は、第二保持筒１２２に係合固定された状態で、筒部１４１における挿入側の軸方向端面が、第一保持筒１２１と第二保持筒１２２とに挟持固定される培養膜１０の他方の軸方向端面に当接しつつフランジ状の第二保持部１２２ｂに当接するように、かつ、筒部１４１におけるその挿入側とは反対側の軸方向端面が、第二保持筒１２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側に突出した位置に配置されるように形成されている。すなわち、第二筒部材１４０の軸方向Ｘの長さは、第二保持筒１２２の第二筒部１２２ａの軸方向Ｘの長さに比して大きくなるように設定されている。

【0066】

上記構造を有する細胞培養器具１００の組み立て手順としては、上記第一実施形態の細胞培養器具１の場合と同様に、まず、培養膜１０が保持された保持具１２０への第一筒部材１３０の組み付けが行われる。そして、第一突出部１３２が保持具１２０の第一保持筒１２１の軸方向一方端よりも軸方向一方側の外方に突出した状態で、培養膜１０の一方の軸方向端面への細胞播種が行われる。その細胞播種が完了すると、保持具１２０から第一筒部材１３０が取り外され、その後、保持具１２０が、培養膜１０を保持したまま上下反転される。

【0067】

次に、保持具１２０への第二筒部材１４０の組み付けが行われる。そして、第二突出部４２が保持具２０の第二保持筒２２の軸方向他方端よりも軸方向他方側の外方に突出した状態で、培養膜１０の他方の軸方向端面への細胞播種が行われる。その細胞播種が完了すると、保持具１２０から第二筒部材１４０が取り外され、その後、培養膜１０の膜体１１の顕微鏡観察などが行われる。

【0068】

このように、細胞培養器具１００の構造においても、培養膜１０の両面に二種類の細胞を播種して細胞培養を行うことができる。また、培養膜１０の両面に二種類の細胞を播種するうえで、細胞培養器具１００を、第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０の双方を同時に装着して用いる必要はなく、第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０のうち何れか下側に位置するものを取り外した状態で用いることができる。第一筒部材１３０及び第二筒部材１４０はそれぞれ、保持具２０に係合固定された状態で、突出部３２，４２にて保持具２０の軸方向端よりも軸方向Ｘ外側に突出する。このため、細胞培養器具１００によれば、細胞培養を行う使用時、軸方向下端から培養膜１０が保持される保持部１２１ｂ，１２２ｂまでの寸法距離を短縮することができ、これにより、ウェルの小容量化を図ることができ、少量の培養液で培養膜に細胞を培養することが可能となる。

【0069】

また、細胞培養器具１００において、保持具１２０の第一保持筒１２１は、第一筒部１２１ａを径方向に貫通する第一側面開口部１２１ｃを有している。保持具１２０の第二保持筒１２２は、第二筒部１２２ａを径方向に貫通する第二側面開口部１２２ｃ及び第三側面開口部１２２ｄを有すると共に、第二保持部１２２ｂを軸方向Ｘに貫通する保持開口部１２２ｅを有している。各側面開口部１２１ｃ，１２２ｃ，１２２ｄはそれぞれ、培養膜１０の両面培養時に保持部１２１ｂ，１２２ｂに保持される培養膜１０よりも軸方向Ｘの下方側の箇所を含む所定部位に設けられている。特に、第三側面開口部１２２ｄは、培養膜１０の他方の軸方向端面への細胞播種時に、保持部１２１ｂ，１２２ｂに保持される培養膜１０の下面を第一側面開口部１２１ｃを介して第二保持筒１２２の外部に露出させるように設けられている。また、保持開口部１２２ｅは、培養膜１０の一方の軸方向端面への細胞播種時に、保持部１２１ｂ，１２２ｂに保持される培養膜１０の下面を第二側面開口部１２２ｃを介して第二保持筒１２２の外部に露出させるように設けられている。このため、培養膜１０の両面に溜まるエアを側面開口部１２１ｃ，１２２ｃを介して保持具１２０の外部へ放出することができる。

【0070】

尚、上記の第二実施形態においては、第一保持筒１２１の第一保持部１２１ｂ及び第二保持筒１２２の第二保持部１２２ｂがそれぞれ、特許請求の範囲に記載した「保持部」に相当している。

【0071】

ところで、上記の第一及び第二実施形態においては、保持具２０，１２０の筒内に筒部材３０，４０，１３０，１４０が挿入されて配置される細胞培養器具１，１００が用いられている。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、図９に示す如く、保持具２２０の筒外に筒部材２３０，２４０が挿入されて配置される細胞培養器具２００に適用することとしてもよい。

【0072】

また、上記の第一及び第二実施形態においては、保持具２０を構成する二つの保持筒２１，２２の双方又は保持具１２０を構成する二つの保持筒１２１，１２２の双方に、培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出する開口部２１ｃ，２２ｃ，１２１ｃ，１２２ｃ，１２２ｄ，１２２ｅが設けられている。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、保持具２０，１２０の上下反転後、培養膜１０の他方の軸方向端面への細胞播種を行う際に培養膜１０の一方の軸方向端面に溜まるエアを保持具２０の外部へ放出することだけを目的とする場合は、図９に示す如く、二つの保持筒２２１，２２２のうち培養膜１０の他方の軸方向端面への細胞播種を行う際に下方に位置する保持筒２２１に、培養膜１０の下面に溜まるエアを外部に放出する開口部２２１ｃが設けられていればよい。

【0073】

また、上記の第一及び第二実施形態においては、培養膜１０が、膜体１１と、その膜体１１の周縁に接合される環状の支持枠１２と、を有するものとした。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、支持枠１２は、膜体１１に接合される枠状の構造を有すれば、例えば軸方向Ｘから見て十字状や網状に形成されていてもよい。

【0074】

また、上記の第一及び第二実施形態においては、培養膜１０が、膜体１１と、その膜体１１の周縁に接合された支持枠１２と、を有するものとした。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、図９に示す如く、培養膜２１０が、支持枠を有さない膜体のみからなるものとしてもよい。この変形形態において、培養膜２１０は、保持具２２０の第一保持筒２２１及び第二保持筒２２２のうち何れか一方に接合して固定されていてよい。この変形形態において、培養膜２１０の外径は、第一保持筒２２１及び第二保持筒２２２の内径よりも大きくかつその外径以下であればよい。また、この変形形態においては、細胞培養時に第一保持筒２２１における培養膜２１０を保持する付近の内外シール性及び第二保持筒２２２における培養膜２１０を保持する付近の内外シール性を確保するため、保持筒２２１，２２２と筒部材２３０，２４０との間の周面がシールされていることが好ましい。

【0075】

更に、上記の第一及び第二実施形態においては、筒部材３０，４０，１３０，１４０が、保持具２０，１２０への装着時にその挿入側の軸方向端面が培養膜１０の支持枠１２に当接するように形成される。しかしながら、本発明は、これに限定されるものではなく、筒部材３０，４０，１３０，１４０が、保持具２０，１２０への装着時にその挿入側の軸方向端面が培養膜１０の支持枠１２に当接していなくてもよい。

【0076】

尚、本発明は、上述した実施形態や変形形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の変更を施すことが可能である。

【符号の説明】

【0077】

１，１００，２００：細胞培養器具、１０，２１０：培養膜、１１：膜体、１２：支持枠、２０，１２０，２２０：保持具、２１，１２１，２２１：第一保持筒、２１ａ，１２１ａ：第一筒部、２１ｂ，１２１ｂ：第一保持部、２１ｃ，１２１ｃ，２２１ｃ：第一側面開口部、２２，１２２，２２２：第二保持筒、２２ａ，１２２ａ：第二筒部、２２ｂ，１２２ｂ：第二保持部、２２ｃ，１２２ｃ：第二側面開口部、３０，１３０，２３０：第一筒部材、３２：第一突出部、４０，１４０，２４０：第二筒部材、４２：第二突出部、１２２ｄ：第三側面開口部、１２２ｅ：保持開口部。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】