(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-11
(45)【発行日】2022-10-19
(54)【発明の名称】ＩｇＧ抗原エピトープおよび標的としての使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20221012BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20221012BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20221012BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C07K14/705
C12N9/10
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020564988
(86)(22)【出願日】2018-08-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-21
(86)【国際出願番号】 CN2018099279
(87)【国際公開番号】W WO2019153674
(87)【国際公開日】2019-08-15
【審査請求日】2020-10-12
(31)【優先権主張番号】201810330585.1
(32)【優先日】2018-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】201810146884.X
(32)【優先日】2018-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520302833
【氏名又は名称】北京艾賽吉生物医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｉｊｉｎｇ ＳＩＧ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ５１９－２１， ５ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｏ． ５， Ｋａｉｔｕｏ Ｒｄ．， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８５，Ｐ． Ｒ． Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100146374
【弁理士】
【氏名又は名称】有馬 百子
(72)【発明者】
【氏名】邱 暁彦
(72)【発明者】
【氏名】唐 ▲ジン▼▲シュ▼
(72)【発明者】
【氏名】楊 志
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲チォン▼
(72)【発明者】
【氏名】張 ▲ジン▼▲ゼン▼
(72)【発明者】
【氏名】朱 華
(72)【発明者】
【氏名】耿 子涵
(72)【発明者】
【氏名】劉 洋
(72)【発明者】
【氏名】姜 文華
(72)【発明者】
【氏名】黄 晶
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２５０７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】VALLIERE-DOUGLASS, J. F. et al.，Asparagine-linked Oligosaccharides Present on a Non-consensus Amino Acid Sequence in the CH1 Domain of Human Antibodies，Journal of Biological Chemistry，2009年，Vol.284, No.47，P.32493-32506，DOI:https://doi.org/10.1074/jbc.M109.014803
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮性腫瘍である、腫瘍を診断および／または治療する薬物の調製における、薬物作用標的としてのＩｇＧ抗原エピトープの使用であって、前記ＩｇＧ抗原エピトープは、非Ｂ細胞である腫瘍細胞由来のＩｇＧのＣＨ１ドメインであり、かつ、該ＣＨ１ドメインのＡｓｎ１６２部位においてＮ－グリコシル化シアル酸修飾され、
前記ＩｇＧ抗原エピトープのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１であることを特徴とする、ＩｇＧ抗原エピトープの使用。
【請求項2】
前記上皮性腫瘍は非小細胞肺癌、腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、嚢胞腺癌、胃癌、膵臓癌または食道癌であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は免疫学における腫瘍の診断および治療の技術分野に属し、非Ｂ細胞由来のＩｇＧ、具体的にはＩｇＧ抗原エピトープおよび標的としての使用に関する。
【背景技術】
【0002】
以下に、ＲＰ２１５モノクローナル抗体の由来および研究の現状を説明する。卵巣癌を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るために、カナダのコロンビア大学のＬｅｅ課題研究グループは、１９８０年代との早い時期から、卵巣癌細胞株から抽出されたタンパク質で動物に免疫し、約３０００のハイブリドーマ細胞を得た。そして、選別中に、ＲＰ２１５と呼ばれる１つのハイブリドーマ細胞が正常な卵巣細胞ではなく、卵巣癌細胞を十分に認識できることが発見された。しかし、当時、どの抗原が認識されたか不明であったため、認識した抗原を一時的に「ＣＡ２１５」と命名することとした。その後、ＲＰ２１５は卵巣癌を十分に認識できるだけでなく、さらに、他の種類の腫瘍細胞の認識においても高い特異性が示されることが発見されたため、ＣＡ２１５を「ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ－ｍａｒｋｅｒ」と定義した。２０１７年に、Ｌｅｅ課題研究グループはＣＡ２１５の同定を行った。アフィニティークロマトグラフィー法で卵巣癌細胞株の培養上清から「ＣＡ２１５」が多く得られ、質量分析同定したところ、提供した３２のペプチド断片はいずれもＩｇＧの重鎖であった。この結果をさらに確認するために、再度、精製した「ＣＡ２１５」を抗原として使用して、特異的モノクローナル抗体を５つ調製し、試験を経て、５つのモノクローナル抗体はすべてＩｇＧ分子を認識できることを確認した。よって、ＣＡ２１５が癌細胞によって発現されるＩｇＧであることが明らかになった。その後の結果から、癌細胞によって発現されるＩｇＧは、グリコシル化修飾および循環において明らかに異なることが確認された。ＲＰ２１５が認識するエピトープは、このようなＩｇＧ重鎖可変領域に固有のグリコシル関連エピトープである（中国特許公開番号１０２９０１８１７Ａを参照）。
【0003】
つまり、ＲＰ２１５は、形質細胞への分化後にＢリンパ球から分泌されたＩｇＧ（循環ＩｇＧ）を認識できないが、非Ｂ細胞によって発現されるＩｇＧを認識できる。研究によると、ＲＰ２１５が認識するＩｇＧ（以下、ＲＰ２１５－ＩｇＧという）は、様々な系統由来の細胞によって発現できるが、発現レベルが非Ｂ細胞由来の腫瘍細胞より低いため、非Ｂ細胞由来ＩｇＧ（ｎｏｎ Ｂ－ＩｇＧ）と総称される。ｎｏｎ Ｂ－ＩｇＧは構造や機能の面で従来の常識となっているＢ細胞由来ＩｇＧと大きく異なる。
【0004】
腫瘍幹細胞様細胞によって過剰発現されるＲＰ２１５－ＩｇＧは、細胞表面と細胞の間の接合部、特に局所接着構造に局在される傾向がある。また、高レベルのＲＰ２１５－ＩｇＧ細胞は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）への接着性が高く、インビトロでもインビボでも高い遊走や浸潤能力を持っており、腫瘍幹細胞の自己再生および腫瘍形成能力が高まる。しかし、ＲＰ２１５が認識する特有の抗原エピトープの具体的な構造、性質、および、ＲＰ２１５－ＩｇＧによる腫瘍の形成や発達の詳細なメカニズムはまだ不明であるため、ＲＰ２１５以外のＩｇＧを特異的標的とする他の診断または治療薬を調製することはできない。
【0005】
これまでの取り組みの結果、ＲＰ２１５によって特異的に認識可能なＩｇＧは非Ｂ細胞由来のＩｇＧであり、且つ該ＩｇＧにおける認識される部位は高度にシアリル化されており、シアリル化グリコシルがＯ－グリコシル化と無関係であることは明確に意識されている。このような特別なシアリル化ＩｇＧは、マーカーとして幹細胞または前駆細胞を認識し、さらに該糖タンパク質に基づいて関連製剤の調製に用いることができる。
非Ｂ細胞由来のＩｇＧと上皮癌細胞との密接な相関性を考慮して、該ＩｇＧの分子構造をさらに研究すれば、様々な悪性腫瘍への介入の強化にさらに役立てることができる。
非Ｂ細胞由来のＩｇＧと上皮癌細胞との密接な相関性を考慮して、該ＩｇＧの分子構造をさらに研究すれば、様々な悪性腫瘍への介入の強化にさらに役立てることができる。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、非Ｂ細胞由来のＩｇＧの分子構造および機能に関するさらなる研究によって、標的として使用可能な、抗原エピトープを分析し、該抗原エピトープの新しい使用を提供することを目的とする。
【0007】
関連するプロテアーゼ消化によって非Ｂ細胞由来ＩｇＧを分析し、かつ、グリコシル化分析およびタンパク質の機能的部位の分析を経て、最終的に、非Ｂ細胞由来のＩｇＧは、その腫瘍関連機能が主に特定の部位のシアリル化によることが発見された。
【0008】
上記研究結果に基づいて、本発明の第１の態様では、非Ｂ細胞由来のＩｇＧのＣＨ１ドメインであり、かつ、該ドメインのＡｓｎ１６２部位においてＮ－グリコシル化シアル酸修飾されたＩｇＧ抗原エピトープを提供する。
上記ＩｇＧ抗原エピトープのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すとおりであることが好ましい。
上記ＩｇＧ抗原エピトープのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示すとおりであることが好ましい。
【0009】
本発明の第２の態様では、腫瘍を診断および／または治療する薬物の調製における、薬物作用標的としての上記ＩｇＧ抗原エピトープの使用を提供する。ここで、上記腫瘍が上皮性腫瘍である。上記Ａｓｎ１６２の特異的部位のシアリル化抗原エピトープを含むＩｇＧは、腫瘍の増殖、遊走および浸潤能力を促進できることが実証されている。
【0010】
上記使用において、上記腫瘍は非小細胞肺癌、腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、嚢胞腺癌、胃癌、膵臓癌または食道癌であることが好ましい。
【0011】
本発明の第３の態様では、α６β４－ＦＡＫ－ｃ－Ｍｅｔ経路によって媒介される疾患の診断および／または治療薬の調製における、インテグリンα６β４のリガンドとしての上記ＩｇＧ抗原エピトープの使用を提供する。研究により、上記抗原エピトープを含むＩｇＧは、インテグリンα６β４と結合して複合体を形成するのみで、インテグリン－ＦＡＫシグナル伝達経路の活性化を促進できることが示されている。
【0012】
本発明の第４の態様では、さらに腫瘍治療薬の調製における、薬物作用標的としてのシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４の使用を提供する。ここで、上記腫瘍は上皮性腫瘍である。上記抗原エピトープを含む特異的部位のシアリル化は、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４に依存する。
【0013】
本発明は、さらに腫瘍治療薬の調製における、薬物作用標的としての、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４とシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ６との結合の使用を提供する。ここで、上記腫瘍は上皮性腫瘍である。研究により、シアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ６は、上記抗原エピトープの特異的部位のシアリル化過程においても所定の補助的な役割を果たしたことが発見されている。このため、両者を結合すれば、薬物作用標的として抗原エピトープのシアリル化に介入し、さらにその後段の機能の発現に影響を与えることができる。
【0014】
本発明の第５の態様では、さらに上皮性腫瘍の検出を補助する薬物の調製における、マーカーとしてのインテグリンβ４の使用を提供する。上記抗原エピトープを含むＩｇＧとインテグリンβ４は、組織レベルや細胞レベルでは、共発現・共局在するため、インテグリンβ４が検出されることは、ＩｇＧが検出されることに相当し、さらに、上皮性腫瘍の存在が検出されることに相当する。
本発明により提供される上記技術的解決手段は下記有益な効果を有する。
本発明により提供される上記技術的解決手段は下記有益な効果を有する。
【0015】
本発明では非Ｂ細胞由来のＩｇＧの機能的分子構造が明確にされている。それは、ＩｇＧのＣＨ１ドメインにおけるＡｓｎ１６２部位のＮ－グリカンが高度にシアリル化された構造であり、上皮性腫瘍幹細胞において過剰発現され、様々な上皮性悪性腫瘍の発癌性に非常に重要である。さらに、抗体療法、Ｃａｒ－Ｔ細胞療法、および低分子化合物に対して魅力的な標的である。本発明では、後期の関連する癌症治療のために効果的な薬物標的を提供し、抗体薬物の研究のために抗原エピトープを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1-1】実施例１－－ＲＰ２１５アフィニティークロマトグラフィーカラムによる腫瘍由来タンパク質におけるＲＰ２１５－ＩｇＧの濃縮およびグリコシル化の分析の結果である。ＡはＰｒｏｔｅｉｎＧを使用してＲＰ２１５－ＣＮＢｒアフィニティークロマトグラフィーカラムと組み合わせて、肺扁平上皮癌から濃縮されたＲＰ２１５によって認識したＩｇＧの概略図であり、Ｂは各糖鎖の構造図および異なるグリカンの含有量であり、Ｃはシアル酸を認識するＳＮＡおよびＭＡＬ Ｉをそれぞれ使用してアフィニティークロマトグラフィーカラムでの各成分におけるＩｇＧシアル酸の状況を同定するものであり、Ｄはシアリル化ＩｇＧをＮ－グリコシダーゼ、Ｏ－グリコシダーゼおよびシアリダーゼでそれぞれ消化した後のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果であり、ｅｌｕｔｉｏｎは溶出液であり、ｂｕｆｆｅｒ１はＮ－グリコシダーゼおよびＯ－グリコシダーゼの消化緩衝液であり、ｂｕｆｆｅｒ２はシアリダーゼの消化緩衝液である。
【0017】
【図1-2】実施例１－－突然変異部位の配列表示および抗原エピトープの同定結果である。Ａは突然変異していないＲＰ２１５－ＩｇＧ（ＷＴ）および二つの突然変異体（ＣＨ１ｍｕとＣＨ２ｍｕ）のアミノ酸配列であり、枠で囲まれた部分は対応する突然変異部位であり、Ｂは２９３Ｔ細胞内でＲＰ２１５－ＩｇＧ（可変領域配列はＶＨ５－５１／Ｄ３－９／ＪＨ４である）および対応する突然変異体を過剰発現した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでＲＰ２１５認識状況を検出するものであり、ＣはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞内でＲＰ２１５－ＩｇＧ（可変領域配列はＶＨ５－５１／Ｄ３－９／ＪＨ４である）および対応する突然変異体を過剰発現し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでＲＰ２１５認識状況を検出するものであり、そのうち、ｍｏｃｋは陰性対照であり、ｖｅｃｔｏｒは空ベクターである。
【0018】
【図2-1】実施例２－－非小細胞肺癌細胞株でのＲＰ２１５－ＩｇＧの発現である。ＡはＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓで非小細胞肺癌細胞株でのＲＰ２１５－ＩｇＧ発現状況を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、ＢはＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでＮＣＩ－Ｈ５２０細胞およびＳＫ－ＭＥＳ－１細胞培養上清におけるＲＰ２１５－ＩｇＧ分泌結果を検出するものであり、Ｃは免疫蛍光法でＮＣＩ－Ｈ５２０細胞およびＳＫ－ＭＥＳ－１細胞でのＲＰ２１５－ＩｇＧ（緑色）の局在を検出するものであり、細胞核（青色）がＨｏｃｈｅｓｔで標識化され、二次抗体はヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８であり、スケール仕様が２５μｍであり、Ｄはフローサイトメトリーによって非小細胞肺癌細胞株の細胞膜でのＲＰ２１５－ＩｇＧ発現状況（生細胞染色）を検出するものであり、二次抗体はヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８である。
【0019】
【図2-2】実施例２－－ＩｇＧのノックダウンによる肺扁平上皮癌細胞のクローン形成能力への阻害の試験結果である。ＡはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対して、対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでノックダウン結果を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、ＢはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞にｓｉＲＮＡを３６ｈトランスフェクトした後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験を行い、細胞遊走能力を検出するものであり、ＣはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞にｓｉＲＮＡを３６ｈトランスフェクトした後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ－Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験を行い、細胞浸潤能力を検出するものであり、ＤはＩｇＧのｓｉＲＮＡでＳＫ－ＭＥＳ－１におけるＩｇＧをノックダウンし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでノックダウン結果を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、ＥはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞にｓｉＲＮＡを３６ｈトランスフェクトした後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験を行い、細胞遊走能力を検出するものであり、ＦはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞にｓｉＲＮＡを３６ｈトランスフェクトした後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ－Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを行い、浸潤能力を検出する結果である。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；スケール仕様が２００μｍである。
【0020】
【図2-3】実施例２－－ＩｇＧのノックダウンによる肺扁平上皮癌細胞のクローン形成能力への阻害の試験結果である。ＡはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞からＩｇＧをノックダウンした後、クローン形成試験で細胞増殖および自己再生能力を検出するものであり、ＢはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞からＩｇＧをノックダウンした後、クローン形成試験を行って細胞増殖および自己再生能力を検出するものである。＊＊：Ｐ＜０．０１。
【0021】
【図2-4】実施例２－－インビトロ試験でＲＰ２１５－ＩｇＧの腫瘍促進効果とＣＨ１ドメインにおけるシアリル化Ｎ－グリコシル化エピトープとの関係を検出するものである。ＡはＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔでＲＰ２１５認識状況を検出するものであり、市販の抗ヒトＩｇＧは陰性対照であり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、Ｂはクローン形成試験による細胞のクローン形成能力の検出結果であり、ＣはＴｒａｎｓｗｅｌｌ試験による細胞遊走能力の検出結果であり、ＤはＭａｔｒｉｇｅｌ－Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験による細胞浸潤能力の検出結果である。ＷＴは野生型ＩｇＧであり、ＣＨ１ｍｕはＣＨ１突然変異型ＩｇＧであり、Ｖｅｃｔｏｒは空の対照ベクターであり、ｍｏｃｋは陰性対照である。ｎｓ：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（非有意）；＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【0022】
【図2-5】実施例２－－ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞がＷＴ、ＣＨ１ｍｕおよびＶｅｃｔｏｒをそれぞれ発現した安定株のヌードマウス体内での腫瘍形成状況である。Ａは試験終了時のＷＴ、ＣＨ１ｍｕ、Ｖｅｃｔｏｒとの三群の腫瘍サイズの画像であり、ＢはＷＴ、ＣＨ１ｍｕ、Ｖｅｃｔｏｒとの三群の腫瘍体積の成長曲線であり、Ｃは試験終了時のＷＴ、ＣＨ１ｍｕ、Ｖｅｃｔｏｒとの三群の腫瘍体積のヒストグラムであり、Ｄは試験終了時のＷＴ、ＣＨ１ｍｕ、Ｖｅｃｔｏｒとの三群の腫瘍重量のヒストグラムである。ｎｓ：ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（非有意）；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【0023】
【図3-1】実施例３－－ＲＰ２１５－ＩｇＧシアリル化に対する四種類のシアリルトランスフェラーゼの影響およびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出結果である。Ａは四種類のシアリルトランスフェラーゼのサイレンシング後のＲＰ２１５認識の結果であり、Ｂは四種類のシアリルトランスフェラーゼの過剰発現後のＲＰ２１５認識の結果であり、このうち。ＧＡＰＤＨは内部標準である。
【図3-2】実施例３－－肺腺癌および肺扁平上皮癌組織においてＲＰ２１５、抗ＳＴ３ＧＡＬ４および抗ＳＴ３ＧＡＬ６抗体をそれぞれ使用して免疫組織化学的検出を行った結果である。
【0024】
【図4-1】実施例４－－ＲＰ２１５－ＩｇＧ特異的相互作用タンパク質の同定である。ＡはＧｅｎｅ ＯｎｔｏｌｏｇｙソフトウェアによるＲＰ２１５－ＩｇＧ特異的相互作用タンパク質の分析結果であり、ＢはＧＯ ｔｅｒｍ分析法で質量スペクトルペプチド断片のスコアが高いタンパク質を分析するものである。
【0025】
【図4-2】実施例４－－ＲＰ２１５－ＩｇＧとインテグリンα６β４との相互作用検証試験結果である。ＡはＲＰ２１５とＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液をインキュベートして免疫沈降を行い、インテグリンβ１、インテグリンβ４、インテグリンα６抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出を行った結果であり、Ｂはインテグリンβ４抗体とＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液をインキュベートして免疫沈降を行い、インテグリンβ４抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出を行った結果であり、Ｃはインテグリンα６抗体とＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液をインキュベートして免疫沈降を行い、インテグリンα６抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検出を行った結果である。ｍＩｇＧは対照抗体であり、ｒＩｇＧはｃｏ－ＩＰ対照となるウサギ抗体である。
【図4-3】実施例４－－免疫組織化学的検出による肺扁平上皮癌組織でのＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４の染色の局在結果であり、肺扁平上皮癌組織の隣接する切片において、ＲＰ２１５およびインテグリンβ４の抗体染色パターンが類似することを示している。スケール仕様が５０μｍである。
【0026】
【図4-4】実施例４－－肺扁平上皮癌細胞でのＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４の共分布・共局在の試験結果である。Ａはフローサイトメトリーを使用して、肺扁平上皮癌ＰＤＸモデルの細胞表面でのＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４の発現レベルを分析するものであり、分析ポリシーは、まず細胞サイズや粒度ゲートで細胞破片を除外し、７－ＡＡＤ陰性細胞ゲートで生細胞を得て、次にＲＰ２１５－ＦＩＴＣゲートで、ＲＰ２１５－ＩｇＧ陽性およびＲＰ２１５－ＩｇＧ陰性との二つの細胞集団を得て、さらに、抗インテグリンβ４－ＰＥで上記二つの細胞集団におけるインテグリンβ４の発現レベルを分析する、ということであり、Ｂはフローサイトメトリーを使用して、ＲＰ２１５の強陽性および弱陽性のＮＣＩ－Ｈ５２０細胞を選別し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでＲＰ２１５－ＩｇＧ高発現（ＲＰ２１５－ＩｇＧｈｉｇｈ）およびＲＰ２１５－ＩｇＧ（ＲＰ２１５－ＩｇＧｌｏｗ）低発現細胞におけるインテグリンβ４の発現レベルを検出するものである。
【0027】
【図4-5】実施例４－－免疫蛍光法によるＮＣＩ－Ｈ５２０細胞でのＲＰ２１５－ＣＩｇＧ（左から１列目）およびインテグリンβ４（左から２列目）の局在の分析である。スケール仕様は１０μｍである。
【0028】
【図4-6】実施例４－－二種類の肺扁平上皮癌細胞株におけるＩｇＧのノックダウンによるＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路の阻害への影響である。ＡはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでノックダウン効果およびＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路関連分子を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、ＢはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞に対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでノックダウン効果およびＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路関連分子を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準である。
【図4-7】実施例４－－ＲＰ２１５－ＩｇＧ特異的相互作用タンパク質の一部の質量スペクトルスコア結果である。
【0029】
【図4-8】実施例４－－ＲＴＫリン酸化チップを使用して、ＲＴＫ受容体のリン酸化に対するＩｇＧの効果を検出するものである。ＡはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対して、対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、細胞溶解液とＲＴＫリン酸化チップをインキュベートした後の発色の統計結果であり、ＢはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞に対して、対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、細胞溶解液とＲＴＫリン酸化チップをインキュベートした後の発色の統計結果である。
【図4-9】実施例４－－二種類の肺扁平上皮癌細胞株におけるＩｇＧのノックダウンによるｃ－Ｍｅｔシグナル伝達経路への影響のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ試験結果である。ＡはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対して、対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓでノックダウン効果、ｃ－Ｍｅｔリン酸化レベルおよびその下流のシグナル伝達経路関連分子を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準であり、ＢはＳＫ－ＭＥＳ－１細胞に対して、対照のまたはＩｇＧに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓでノックダウン効果、ｃ－Ｍｅｔリン酸化レベルおよびその下流のシグナル伝達経路関連分子を検出するものであり、ＧＡＰＤＨは内部標準である。
【0030】
【図4-10】実施例４－－インテグリンβ４を介するＲＰ２１５－ＩｇＧとｃ－Ｍｅｔの相互作用である。ＡはＲＰ２１５およびｃ－Ｍｅｔ抗体をそれぞれＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液とインキュベートして免疫沈降を行い、ｃ－Ｍｅｔ抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ検出を行った結果であり、ＢはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対して、対照ｓｉＲＮＡおよびｃ－Ｍｅｔに対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでノックダウン効果を検出し、および、ＲＰ２１５を、対照ｓｉＲＮＡおよびｃ－Ｍｅｔに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液とそれぞれインキュベートし、インテグリンβ４抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ検出を行った結果である。ＣはＮＣＩ－Ｈ５２０細胞に対して、対照ｓｉＲＮＡおよびインテグリンβ４に対するｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでノックダウン効果を検出し、および、抗体ＲＰ２１５を、対照ｓｉＲＮＡおよびインテグリンβ４に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＮＣＩ－Ｈ５２０細胞溶解液とそれぞれインキュベートし、ｃ－Ｍｅｔ抗体およびＲＰ２１５を使用してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ検出を行うものである。
【0031】
【図4-11】実施例４－－抗体ＲＰ２１５の外因的添加によるＮＣＩ－Ｈ５２０細胞のＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路およびクローン形成能力への阻害の試験結果である。ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞培養上清において、対照抗体ｍＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）または異なる濃度の抗体ＲＰ２１５（２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）を加える。Ａは１２ｈ、２４ｈや３６ｈに細胞を収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路を検出するものであり、Ｂはクローン形成試験による細胞クローン形成能力の検出である。ｎｓ：ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【0032】
【図4-12】実施例４－－ＲＰ２１５－ＩｇＧの外因的添加によって抗体ＲＰ２１５を逆転写できることによるＳＫ－ＭＥＳ－１細胞のＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路およびクローン形成能力への阻害作用の試験結果である。ＳＫ－ＭＥＳ－１細胞培養上清において、抗体ＲＰ２１５（１０μｇ／ｍｌ）および異なる濃度のＲＰ２１５－ＣＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）または透過液成分（１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ）を加える。Ａは４８ｈに細胞を収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓでＩｎｔｅｇｒｉｎ－ＦＡＫシグナル伝達経路を検出するものであり、Ｂはクローン形成試験による細胞クローン形成能力の検出の培養結果およびデータ統計結果である。ｎｓ：ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ；＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図5】実施例５－－肺癌組織、肺組織、流入領域リンパ節でのＲＰ２１５－ＩｇＧの発現および
【0033】
それと肺癌予後の相関性である。Ａは２４２例の肺癌組織の免疫組織化学的染色スコア結果であり、Ｂは様々な肺癌患者組織におけるＲＰ２１５－ＩｇＧの免疫組織化学的染色切片であり、Ｃは正常な肺胞組織（Ａｌｖｅｏｌｕｓ）、流入領域リンパ節組織（Ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）および気管支組織（Ｂｒｏｎｃｈｕｓ）のＲＰ２１５免疫組織化学的染色結果であり、ＤはＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線でＲＰ２１５染色スコアリング等級と肺扁平上皮癌患者の５－７年生存率との相関性を分析する曲線グラフである。
【0034】
【図6】実施例７－－ＲＰ２１５のインビボ抗腫瘍試験結果である。Ａは試験手順の概略図であり、ＢはＲＰ２１５（モノクローナル抗体）および対照ｍＩｇＧをそれぞれ注射した腫瘍の変化であり、ＣはＰＤＸ腫瘍モデルにおける腫瘍体積の経時変化であり、Ｄ、Ｅはそれぞれ異なる日数の二つの試験における腫瘍重量変化の散布図および線グラフである。
【図7】実施例７－－腫瘍インビボモデルでの１２４Ｉ－ＰＲ２１５の現像結果である。Ａは１２４Ｉ－ＰＲ２１５の放射性標識の概略図であり、Ｂは精製前後の１２４Ｉ－ＰＲ２１５標識のＲａｄｉｏ－ＴＬＣ分析結果であり、Ｃは異なる時点での１２４Ｉ－ＰＲ２１５のＭｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴ現像である。
【発明を実施するための形態】
【0035】
以下の実施例において、ＲＰ２１５－ＩｇＧとは、モノクローナル抗体ＲＰ２１５によって特異的に認識可能な非Ｂ細胞由来のＩｇＧである。
生体材料の供給源：
モノクローナル抗体ＲＰ２１５：
生体材料の供給源：
モノクローナル抗体ＲＰ２１５：
【0036】
フロイントアジュバントによって感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で、ハイブリドーマクローンを培養してＲＰ２１５を含む腹水を生成し、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して腹水から抗体を精製し、その後、濃縮してＰＢＳを溶媒として使用することにより得られるハイブリドーマ細胞株。
【0037】
癌細胞株：
ＬＳＣＣ細胞株のＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＭＥＳ－１および２９３Ｔは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得られ、かつ北京大学ヒトゲノム研究センターによって保存されている。
実施例１ ＲＰ２１５－ＩｇＧ機能構造の決定
１、癌組織からのＩｇＧの精製
ＬＳＣＣ細胞株のＮＣＩ－Ｈ５２０、ＳＫ－ＭＥＳ－１および２９３Ｔは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得られ、かつ北京大学ヒトゲノム研究センターによって保存されている。
実施例１ ＲＰ２１５－ＩｇＧ機能構造の決定
１、癌組織からのＩｇＧの精製
【0038】
（１）ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して、非小細胞肺癌組織、乳癌若しくは卵巣癌の組織、または肺扁平上皮癌（ＬＳＣＣ）によって確立されたＰＤＸ腫瘍モデルから腫瘍ＩｇＧを事前に精製する。末梢血由来のＩｇＧの影響を排除するためにＰＤＸ腫瘍モデルを使用する。
【0039】
（２）ＲＰ２１５アフィニティーカラムでＲＰ２１５－ＩｇＧを精製する。
ＲＰ２１５アフィニティーカラムの調製方法は、モノクローナル抗体ＲＰ２１５とＣＮＢｒ活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を結合する。その後、図１－１Ａを参照して、（1） ３３０ｍｇのＣＮＢｒ－ｓｅｐｈａｒｅｓｅ ４Ｂを１ｍＭの塩酸で活性化した後、結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を使用して平衡化する。（2） ５ｍｇのＲＰ２１５抗体を結合緩衝液に溶解し、活性化されたＣＮＢｒアガロースゲルフィラーに加えて４℃で一晩インキュベートする。（3） ｐＨ ８．０、０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いて、４℃で、結合したゲルを洗浄して一晩再懸濁させ、非結合活性化部位をブロッキングする。（4） 酸性洗浄液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）およびアルカリ性洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を交互に使用してアフィニティーカラムを少なくとも３回洗浄して、過剰なＲＰ２１５を除去する。
ＲＰ２１５アフィニティーカラムの調製方法は、モノクローナル抗体ＲＰ２１５とＣＮＢｒ活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を結合する。その後、図１－１Ａを参照して、（1） ３３０ｍｇのＣＮＢｒ－ｓｅｐｈａｒｅｓｅ ４Ｂを１ｍＭの塩酸で活性化した後、結合緩衝液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を使用して平衡化する。（2） ５ｍｇのＲＰ２１５抗体を結合緩衝液に溶解し、活性化されたＣＮＢｒアガロースゲルフィラーに加えて４℃で一晩インキュベートする。（3） ｐＨ ８．０、０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを用いて、４℃で、結合したゲルを洗浄して一晩再懸濁させ、非結合活性化部位をブロッキングする。（4） 酸性洗浄液（０．１Ｍ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）およびアルカリ性洗浄液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を交互に使用してアフィニティーカラムを少なくとも３回洗浄して、過剰なＲＰ２１５を除去する。
【0040】
ＲＰ２１５アフィニティーカラムでＲＰ２１５－ＩｇＧを精製する：ＰＢＳ内で１μｇ／μＬに調節した約５ｍｇの腫瘍ＩｇＧを、アフィニティーカラムにて４℃で一晩インキュベートし、アフィニティーカラム中のＲＰ２１５を腫瘍ＩｇＧと結合させる。少なくともカラム容量の５倍のＰＢＳで洗浄した後、０．１ＭのＴｒｉｓ－グリシン（ｐＨ２．４）を使用して溶出を行う。さらに分析するために、溶出液を収集してＰＢＳを用いて限外ろ過して濃縮する。濃縮した溶出液は、分離されたＩｇＧを含み、ＲＰ２１５－ＩｇＧとして標識化する。
２、ＩｇＧグリコシル化の分析
Ｎ－グリカンの放出
２、ＩｇＧグリコシル化の分析
Ｎ－グリカンの放出
【0041】
５０μｇのＲＰ２１５－ＩｇＧ、２．５μＬの２００ｍＭ ＤＴＴおよび１５０μＬの２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を、限外ろ過反応器（ＰＡＬＬ、ＵＳＡ）に加え、５０℃で１時間インキュベートし、さらに、溶液に１０μｌの２００ｍＭ ＩＡＡを加える。光照射なしで、室温で４５分間インキュベートしてタンパク質を変性させる。２００μｌの２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液で変性したタンパク質を二回洗浄する。反応器に１μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆおよび２００μｌの２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液を加える。３７℃で一晩インキュベートして複雑なＮ－グリカン放出を実現する。
放出したＮ－グリカンを含む溶液を遠心分離して収集する。誘導体化する前に、溶液を凍結乾燥する。
Ｎ－グリカンのＵＰＬＣ－ＨＲＭＳ分析
放出したＮ－グリカンを含む溶液を遠心分離して収集する。誘導体化する前に、溶液を凍結乾燥する。
Ｎ－グリカンのＵＰＬＣ－ＨＲＭＳ分析
【0042】
ＵＰＬＣ－ＨＲＭＳ分析を行う前に、１０％酢酸を１μｌ含む１０μｌの水溶液、２，４－ビス（ジエチルアミノ）－６－ヒドラジノ－１，３，５－トリアジンを３０ｍｇ／ｍｌ含む７μｌのイソプロピルアルコール、および２μｌの水からなる誘導体化溶液に、収集したＮ－グリカンを加える。３７℃で誘導体化反応を２時間進行させる。
【0043】
ＵＰＬＣ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、ドイツ）によって、さらなる精製を経ず、直接誘導体化した生成物をさらに分析する。流動相Ａは１０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液である。流動相Ｂはアセトニトリルである。流動相Ａを１５分間以内に２０％から５０％に増加し、５分間保持する。続いて流動相Ａを５分以内に２０％に低減し、さらに５分間保持する。ここで、流速は０．４ｍｌ／ｍｉｎで、カラム温度は１０℃で、注入量は３μｌとする。品質データを収集するために、ＥＳＩ電圧を３．２ｋＶに設定し、ＥＳＩを安定化するために、３５のａｒｂシースガスおよび１０のａｒｂアシストガスを使用する。誘導体化したオリゴ糖をポジティブモードで検出する。フルスキャン質量範囲は８００から３０００ｍ／ｚである。
【0044】
上記の結果、循環ＩｇＧに一般的に見られないフコースおよびシアル酸を含むＮ－グリカンが２８種類検出された。Ｎ５Ｍ３ＦＧ２とＮ５Ｍ３ＦＧ１（両方ともシアル酸を含まない）、および、Ｎ４Ｍ３ＦＧ１Ｓ１とＮ５Ｍ３ＦＧ１Ｓ１（両方とも一つの末端シアル酸残基を含む）の四種類のグリカンはＲＰ２１５非結合成分において多い。Ｎ５Ｍ３ＦＧ２Ｓ２（シアリル化バイアンテナ状構造を持つ）の比率は該ＲＰ２１５非結合成分中で明らかに低下した（図１－１Ｂ）。対照的に、Ｎ５Ｍ３ＦＧ２Ｓ２はＲＰ２１５結合成分中の存在量がより高い（図１－１Ｂ）。
３、ＩｇＧエピトープ部位の分析
認識部位のグリコシル化分析：
精製したＲＰ２１５－ＩｇＧを脱グリコシル化する。
３、ＩｇＧエピトープ部位の分析
認識部位のグリコシル化分析：
精製したＲＰ２１５－ＩｇＧを脱グリコシル化する。
【0045】
上記１の溶出液（ＲＰ２１５－ＩｇＧを含み、ｅｌｕｔｉｏｎとして標識化する）をサンプルとし、Ｎ－結合型およびＯ－結合型のグリカンを消化するために、サンプルを変性緩衝液に加えて１００℃で１０分間変性させる。続いて、ＮＰ－４０および適量のグリコシダーゼを含むＧ７反応緩衝液において、３７℃で２時間インキュベートしてタンパク質を消化する。
【0046】
グリコシダーゼは、ほとんどすべてのＮ－糖鎖を加水分解可能なＮ－グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）であり、Ｏ－グリコシダーゼ（Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）はＯ－糖鎖を加水分解する。
【0047】
シアル酸を消化するために、ノイラミニダーゼ（Ｎｕｅｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、即ちシアリダーゼ）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）を含むＧ１反応緩衝液中において、サンプルを３７℃で２時間消化する。
【0048】
試験結果を図１－１Ｄに示す。ＰＮＧａｓｅＦおよびノイラミニダーゼを使用して処理した場合、ＲＰ２１５により認識するバンドが消え、Ｏ－グリコシダーゼを使用して消化した場合、ＲＰ２１５の認識に影響がない。また、ＲＰ２１５－ＩｇＧの最も内側のＧｌｃＮＡｃとＡｓｎ残基の間の全てのＮ－結合炭水化物間の分子量は５５ｋＤから５０ｋＤに減少するが、Ｏ－グリコシダーゼ処理後のＩｇＧは変化しないことが確認されている。上記結果から、ＲＰ２１５が認識するエピトープとＩｇＧ上のＮ－グリカンのシアル酸残基は関連していることが明らかになった。
【0049】
図１－１Ａの電気泳動図から、精製して溶出された生成物ｅｌｕｔｉｏｎ（対象ＩｇＧを含む）はＲＰ２１５により認識可能であり、カラムを通過していないサンプル溶液はｉｎｐｕｔバンドがわずかに示されており、通過液（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）はＲＰ２１５によって認識できないことが示されている。
【0050】
図１－１Ｃは、主にα２，６結合シアル酸を認識するニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＳＮＡ）、主にα２，３結合シアル酸を認識するイヌエンジュレクチンＩ（ＭａａｃｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎＩ、ＭＡＬ Ｉ）というシアル酸を特異的に認識可能なレクチンを使用して、ＲＰ２１５アフィニティーカラムがシアリル化ＩｇＧを濃縮できるかを同定する試験の結果である。溶出液は、α２，６、α２，３の二種類の結合形態で結合されているシアル酸を含むことが示されている。
４、ＲＰ２１５－ＩｇＧのシアリル化認識部位の分析
４、ＲＰ２１５－ＩｇＧのシアリル化認識部位の分析
【0051】
ＩｇＧのＦａｂフラグメントは、ＣＨ１および幅広い多様性を示す可変領域からなる。ＲＰ２１５により認識可能なＮ－グリカン部位はＣＨ１にあると仮定すれば、従来の研究に基づき、ＲＰ２１５は異なる組織の上皮癌由来のＩｇＧを認識可能である。様々なＶＤＪ組換えパターンがあるため、ＲＰ２１５が認識するエピトープは可変領域ではなく、ＣＨ１上にあるはずだと推測される。よって、ＣＨ１ドメインで発見された非定型グリコシル化モチーフＴＶＳＷＮ１６２ＳＧＡＬ（Ｓ１６０ＡおよびＮ１６２Ｃ）において、初期探索のために、部位指定突然変異を導入するとともに、対照のために、さらに、ＣＨ２ドメインにおける古典的なグリコシル化部位アスパラギン（Ｎ）２９７を導入したグルタミン（Ｑ）として置き換えられる。
【0052】
図１－２Ａを参照すれば、突然変異部位は、ＷＴは野生型であり、ＣＨ１ｍｕは１６２部位突然変異のＳ１６０ＡおよびＮ１６２Ｃであり、ＣＨ２ｍｕは２９７部位突然変異のＮ ２９７ Ｑである。
【0053】
突然変異部位を含む二つの定常領域を、それぞれ可変領域ＶＨ５－５１／Ｄ３－９／ＪＨ４（肺扁平上皮癌細胞で検出される優先発現配列）と融合し、それぞれＣＨ１ｍｕおよびＣＨ２ｍｕと名付ける。同時に、野生型ＣＨ１およびＣＨ２ドメインを持つＩｇＧ（ＷＴ）を対照として構築する。まず、これらの組換えＩｇＧプラスミド（ＷＴ、ＣＨ１ｍｕおよびＣＨ２ｍｕ）を２９３Ｔ細胞で過剰発現し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを使用して野生型および突然変異型ＩｇＧに対するＲＰ２１５の認識状況を検出した。この結果、ＲＰ２１５はＷＴおよびＣＨ２ｍｕを認識できるが、ＣＨ１ｍｕを認識できないことが確認された（図１－２Ｂを参照）。
【0054】
次に、肺扁平上皮癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ５２０により、ＲＰ２１５が認識するエピトープを検証する。これにより、内因性ＲＰ２１５－ＩｇＧの影響を排除し、ｆｌａｇタグ付きの組換えＩｇＧプラスミドを構築する。続いてａｎｔｉ－ｆｌａｇ ｂｅａｄｓを使用してＩＰを行い、外因的に発現された野生型または突然変異型ＩｇＧを得る。２９３Ｔの結果と同様に、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞において、ＲＰ２１５は、ＷＴまたはＣＨ２ｍｕをよく認識できるが、ＣＨ１ｍｕへの認識性が非常に低いことが確認された（図１－２Ｃを参照）。
【0055】
ＲＰ２１５によって認識されるＲＰ２１５－ＩｇＧにおけるエピトープは、古典的なＮ－グリコシル化部位Ａｓｎ２９７ではなく、ＣＨ１ドメインの非古典的なＮ－グリコシル化部位Ａｓｎ１６２である。
【0056】
したがって、該Ａｓｎ１６２部位にＮ－グリコシル化シアル酸修飾されたＣＨ１ドメインは、非Ｂ細胞由来ＩｇＧの特有の抗原エピトープとすることができる。
実施例２ ＩｇＧ抗原エピトープを標的として、非Ｂ細胞由来の腫瘍細胞の増殖、遊走および浸潤を促進する能力を持つＩｇＧを識別する
実施例２ ＩｇＧ抗原エピトープを標的として、非Ｂ細胞由来の腫瘍細胞の増殖、遊走および浸潤を促進する能力を持つＩｇＧを識別する
【0057】
実施例１では非Ｂ細胞由来ＩｇＧの特有の抗原エピトープが確認された。該抗原エピトープはＲＰ２１５によって特異的に認識可能であるため、該抗原エピトープを特異的認識部位として、ＲＰ２１５を用いて非Ｂ細胞由来ＩｇＧ（ＲＰ２１５－ＩｇＧ）の機能を検出する。
【0058】
ＬＳＣＣ細胞株は、Ａ５４９（腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞）、Ｃａｌｕ－３（ヒト肺腺癌細胞）、ＮＣＩ－Ｈ１２９９（ヒト肺癌細胞）、ＮＣＩ－Ｈ５２０（ヒト肺癌細胞）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（ヒト肺扁平上皮癌細胞）である。
【0059】
まず、上記複数のＬＳＣＣ細胞株からＲＰ２１５－ＩｇＧの発現を検出し、ＬＳＣＣ細胞株によって発現や分泌可能なＲＰ２１５－ＩｇＧが細胞表面およびＥＣＭに局在していることを発見した（図２－１を参照）。
【0060】
ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞およびＳＫ－ＭＥＳ－１細胞における重鎖定常領域のｓｉＲＮＡを標的としてＩｇＧを低減することにより、これらの細胞によって形成されたクローンのサイズが小さくなり、クローン形成数も明らかに減少した。また、細胞の遊走および浸潤能力は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌおよびマトリゲルで被覆されたＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイにおいて明らかに低下することが確認された（図２－２、図２－３）。同様の試験結果であることから、シアリル化ＩｇＧは肺ＡＤＣ、乳癌および腎臓癌における細胞遊走、浸潤および転移に関連していることが示されている。
【0061】
インビトロ試験において、野生型ＩｇＧ（ＷＴ）の過剰発現は細胞の遊走能力、浸潤能力、およびクローン形成能力を明らかに促進することができた。ＣＨ１ドメイン上のグリコシル化部位を突然変異させると、ＷＴと比較して、細胞遊走、浸潤、およびクローン形成を促進するＣＨ１突然変異型ＩｇＧ（ＣＨ１ｍｕ）の能力はいずれも顕著に低下した。その活性は空ベクター群と比較して一定の遊走促進効果を有するが、浸潤能力には有意差がなかった（図２－４）。
【0062】
さらに、野生型ＩｇＧ、ＣＨ１突然変異型ＩｇＧおよび空ベクターを安定的に発現するＮＣＩ－Ｈ５２０細胞を、それぞれヌードマウスにおいて皮下腫瘍形成モデルを確立し、野生型ＩｇＧ、ＣＨ１突然変異型ＩｇＧの腫瘍成長促進能力を観察した。その結果、野生型ＩｇＧの過剰発現は、腫瘍の成長を大幅に促進するが、ＣＨ１ｍｕ群の細胞成長が相対的に遅く、その腫瘍形成数、腫瘍体積および腫瘍重量は、いずれもＷＴ群よりも顕著に低く、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）群と有意差がないことが確認された（図２－５）。
【0063】
以上により、インビボ・インビトロの試験を通じて、ＲＰ２１５－ＩｇＧは肺扁平上皮癌の生存、遊走および浸潤を促進し、その生物学的活性はＣＨ１ドメインの非古典的なグリコシル化部位に依存することが確認された。
【0064】
実施例３ シアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４のＲＰ２１５－ＩｇＧのシアリル化への関与
【0065】
シアリル化オリゴ糖配列の生合成は、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素ファミリーによって触媒される。各シアリルトランスフェラーゼはいずれもその特異的基質を持つ。
【0066】
従来の研究により、Ｎ－グリカンと結合する古典的なＮ－グリコシル化部位（Ａｓｎ２９７）上のシアル酸は、シアリルトランスフェラーゼＳＴ６ＧＡＬ－１によって媒介され、シアル酸とＮ－グリカンβ－Ｄ－ガラクトピラノシル（Ｇａｌ）残基はα２，６－形態で結合していることが明らかになった。
【0067】
Ｎ－グリカンと結合する非古典的なＮ－グリコシル化部位（Ａｓｎ１６２）上のシアル酸は、ＭＡＬＩを介してβ－Ｄ－ガラクトピラノシル（Ｇａｌ）残基に結合することが確認されている。このため、三つのシアリルトランスフェラーゼであるＳＴ３ＧＡＬ３、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＳＴ３ＧＡＬ６（ＳＴ３β－ガラクトシドα－２，３－結合に関与する）、およびＳＴ６ＧＡＬ１（対照とする）はさらに選別のための候補となる。
【0068】
いずれのシアリルトランスフェラーゼがＲＰ２１５－ＩｇＧグリカン合成に関与するかを確定するために、ＲＰ２１５を四種類のシアリルトランスフェラーゼがそれぞれサイレンシングしたＷｅｓｔｅｒｎブロットに用いた。その結果、ＳＴ３ＧＡＬ４およびＳＴ３ＧＡＬ６のノックダウンはいずれもＲＰ２１５－ＩｇＧの発現を低下させ、ＳＴ３ＧＡＬ４およびＳＴ３ＧＡＬ６の過剰発現によって、ＲＰ２１５が認識するＩｇＧが増加した。市販の抗－ＩｇＧ抗体のＷｅｓｔｅｒｎブロットが変化していないため、ＲＰ２１５が認識するＩｇＧはシアル酸の影響を大きく受けることが明らかになった（実施例３－１）。
【0069】
シアリル化ＩｇＧ（即ちＲＰ２１５－ＩｇＧ）とＳＴ３ＧＡＬ４／ＳＴ３ＧＡＬ６の関係を調べるために、ＮＳＣＬＣでの発現プロファイルおよび分布を分析した。免疫組織化学の結果によると、肺腺癌組織における気管支上皮細胞基底細胞および肺扁平上皮癌組織において、いずれもＲＰ２１５－ＩｇＧおよびＳＴ３ＧＡＬ４染色があり、ＳＴ３ＧＡＬ６陽性染色は制限されていない。ＩＨＣ結果によると、ＳＴ３ＧＡＬ４はＲＰ２１５－ＩｇＧのシアリル化に関連していることがわかった（実施例３－２）。
【0070】
したがって、ＳＴ３ＧＡＬ４酵素の活性をブロッキングすれば、ＩｇＧのシアリル化を止め、腫瘍細胞の遊走および浸潤の機能を阻害し、腫瘍細胞の成長、遊走および浸潤を止めることができる。
【0071】
実施例４ ＲＰ２１５－ＩｇＧのインテグリンα６β４との相互作用とｃ－Ｍｅｔとの架橋
肺扁平上皮癌の増殖、遊走および浸潤の進行におけるＲＰ２１５－ＩｇＧのメカニズムを検討するために、まず、ＲＰ２１５－ＩｇＧと相互作用するタンパク質を探した。肺扁平上皮癌細胞株のＮＣＩ－Ｈ５２０タンパク質を抽出し、ＲＰ２１５を使用して共免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＩＰ）を行い、次に、抗体ＲＰ２１５および対照抗体ｍＩｇＧのＩＰによって得られたタンパク質を全てそれぞれＬＣ－ＭＳ／ＭＳを通過させて質量スペクトル分析を行った。
肺扁平上皮癌の増殖、遊走および浸潤の進行におけるＲＰ２１５－ＩｇＧのメカニズムを検討するために、まず、ＲＰ２１５－ＩｇＧと相互作用するタンパク質を探した。肺扁平上皮癌細胞株のＮＣＩ－Ｈ５２０タンパク質を抽出し、ＲＰ２１５を使用して共免疫沈降（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＩＰ）を行い、次に、抗体ＲＰ２１５および対照抗体ｍＩｇＧのＩＰによって得られたタンパク質を全てそれぞれＬＣ－ＭＳ／ＭＳを通過させて質量スペクトル分析を行った。
【0072】
質量スペクトルを利用して潜在的な相互作用タンパク質を分析すると共に、ラベルフリー定量的なプロテオミクス（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＦＱ）の手法を使用してこれらのタンパク質の相対存在量を定量化した。ＲＰ２１５のＩＰによって得られたタンパク質と陰性対照抗体ｍＩｇＧのＩＰによって得られたタンパク質を比較すると、ＬＦＱ値がゼロのｍＩｇＧ群におけるタンパク質のみがＲＰ２１５－ＣＩｇＧと特異的に相互作用可能なタンパク質であると考えられる。続いて、データベースｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／を使用して選別された全てのタンパク質に対して、細胞成分のＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析、即ちＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓを行った。その結果から、ＲＰ２１５－ＩｇＧと特異的に相互作用するタンパク質成分は主に細胞膜関連タンパク質であり、細胞－細胞間の接着結合、局所接着および半接着斑の形成等に関与することが示された（図４－１Ａ）。上記複数のＧＯ ｔｅｒｍ中のタンパク質成分をさらに分析し、その質量スペクトルスコアを比較した（結果は図４－１Ｂを参照）。最後に、腫瘍の形成および転移の促進に重要な役割を果たすという近年のいくつかの文献で報告されたインテグリンファミリーに焦点を当てることとした。
【0073】
ＭＳの発見を実証するために、ＲＰ２１５を使用してＩＰ（免疫沈降）を行うと、シアリル化ＩｇＧ（即ちＲＰ２１５－ＩｇＧ）がインテグリンβ４またはインテグリンα６と相互作用するが、インテグリンβ１とは相互作用しないことが確認された。なお、インテグリンβ４またはインテグリンα６を使用して免疫沈降を行うと、両方の親和性溶出画分においてもＲＰ２１５－ＩｇＧが検出され、シアリル化ＩｇＧとインテグリンα６β４複合体の特異的相互作用が示されている（図４－２を参照）。
【0074】
シアリル化ＩｇＧの発現がインテグリンβ４の発現に関連するか否かを明確にするために、まず、臨床肺扁平上皮癌組織を使用して、免疫組織化学の手法で隣接するパラフィン切片上において、シアリル化ＩｇＧおよびインテグリンβ４の組織分布パターンをそれぞれ検出した。肺扁平上皮癌では、ＲＰ２１５および抗インテグリンβ４抗体が細胞膜でいずれも強陽性の染色性を示しており、且つ両者の分布パターンが非常に類似することが確認された（図４－３）。
【0075】
また、細胞レベルでＲＰ２１５－ＩｇＧとインテグリンβ４の発現レベルの相関性を検討した。コラゲナーゼＩＶおよびＤＮＡ酵素Ｉで肺扁平上皮癌ＰＤＸモデルの腫瘍組織を消化し、単細胞懸濁液を得、続いてフローサイトメトリーで細胞膜上での両者の発現状況を分析した。７－ＡＡＤ陰性ゲートで生細胞を得た後、ＲＰ２１５－ＩｇＧは肺扁平上皮癌ＰＤＸ腫瘍においていずれも高レベルで発現した。さらにフローサイトメトリーを行ったところ、ＲＰ２１５－ＩｇＧ陽性細胞集団におけるインテグリンβ４の陽性率（７９．３％－９２．６％）がＲＰ２１５－ＩｇＧ陰性細胞集団におけるインテグリンβ４の陽性率（１４．１％－５７．２％）よりも明らかに高いことが示された（図４－４ Ａ）。
【0076】
また、肺扁平上皮癌細胞株において、ＲＰ２１５－ＩｇＧ陽性細胞におけるインテグリンβ４の発現をさらに評価した。フローサイトメトリー細胞選別技術を使用し、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞株から濃縮してシアリル化ＩｇＧの高発現（ＲＰ２１５－ＩｇＧｈｉｇｈ）および低発現（ＲＰ２１５－ＩｇＧｌｏｗ）の二つの細胞集団を得た。その後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓにより二つの細胞集団におけるインテグリンβ４の発現状況を検出した。検出結果から、ＬＳＣＣ細胞株では、ＲＰ２１５－ＩｇＧとインテグリンβ４のタンパク質発現レベルが正の相関関係にあることが示された（図４－４ Ｂ）。
【0077】
最後に、免疫蛍光法を使用して、細胞中のＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４の局在を検出した。検出結果から、ＲＰ２１５－ＩｇＧは細胞膜および細胞質のいずれにおいても発現し、インテグリンβ４は主に細胞膜で発現し、かつ、両者は細胞膜で明らかに共局在することが示された（図４－５）。
【0078】
以上の結果、ＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４は、組織レベルおよび細胞レベルで共発現・共局在することが確認された。これにより、自然条件下での両者の相互作用に関する物質的基礎が提供された。
【0079】
ＲＰ２１５－ＩｇＧおよびインテグリンβ４の共発現および共局在により、インテグリンβ４がＲＰ２１５－ＩｇＧの分布や発現を特徴づけるマーカーとしてＲＰ２１５－ＩｇＧの検出に用いられることが証明された。そして、ＲＰ２１５－ＩｇＧが上皮性腫瘍の増殖、遊走および浸潤を進行させるため、インテグリンβ４はマーカーとして上皮性腫瘍の検出を補助する薬物の調製に用いることができる。
【0080】
悪性腫瘍細胞において、インテグリンα６β４は、様々な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に関連し、かつ腫瘍細胞の浸潤および転移を進行させるためにシグナルが増幅することが実証されている。抗体ＲＰ２１５を使用してＮＣＩ－Ｈ５２０細胞で免疫沈降を行い、質量スペクトルを使用してＲＰ２１５－ＩｇＧ相互作用タンパク質を見つける時、ＲＰ２１５と結合する成分として、ＲＴＫファミリーのｃ－ＭｅｔおよびＥＧＦＲが検出され、かつ、そのスコアが相対的に高く、ＲＰ２１５－ＩｇＧとＲＴＫファミリーが相互作用することが示されている（図４－７）。
【0081】
シアリル化ＩｇＧによって活性化される特異的ＲＴＫを研究するために、ＮＣＩ－Ｈ５２０およびＳＫ－ＭＥＳ－１においてＩｇＧをノックダウンした後、リン酸化チップを使用して、ＲＴＫファミリーにおけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ｃ－ＭｅｔおよびこれらのＲＴＫ下流シグナル伝達の主要分子のリン酸化レベルを検出した。その結果、二つの細胞株でＩｇＧをノックダウンすると、ｃ－ＭｅｔのＴｙｒ１２３４／１２３５部位のリン酸化レベルは大幅に低下するが、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のリン酸化レベルは変化していないことが明らかになった（図４－８）。同時に、ＲＴＫ下流Ｒａｓ－ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路の主要分子のＭＥＫ、Ｅｒｋ１／２、Ａｋｔのリン酸化レベルはすべて大幅に低下した。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓを使用してリン酸化チップの結果をさらに確認した（図４－９）。
【0082】
ＩｇＧのノックダウンにより、Ｍｅｔのチロシンリン酸化が大幅に低減するため、ＬＳＣＣにおいてシアリル化ＩｇＧがどのようにインテグリンβ４またはＭｅｔと複合体を形成するかさらに検討する。
【0083】
まず、ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞において、内因性共免疫沈降によって、ＲＰ２１５－ＩｇＧとｃ－Ｍｅｔの相互作用が実証されている。次に、同様に共免疫沈降法を使用してＲＰ２１５－ＩｇＧ、インテグリンα６β４、ｃ－Ｍｅｔの三者の相互作用を検討する。ＮＣＩ－Ｈ５２０細胞において、ｃ－Ｍｅｔおよびインテグリンβ４をそれぞれノックダウンし、その後、ＲＰ２１５を用いて免疫沈降を行った。その結果、ノックダウンしていないＮＣ群と比較して、ｃ－ＭｅｔのノックダウンはＲＰ２１５－ＩｇＧとインテグリンβ４の相互作用に影響を及ぼさないが、インテグリンβ４をノックダウンした後、ＲＰ２１５－ＩｇＧとｃ－Ｍｅｔの相互作用が消えることが確認された（図４－１０Ｂ、Ｃを参照）。このことから、シアリル化ＩｇＧはインテグリンβ４と複合体を形成しなければＭｅｔと相互作用しない可能性が考えられる。
【0084】
インテグリン－ＦＡＫおよびＭｅｔシグナル伝達経路はシアリル化ＩｇＧの調節による細胞の増殖および遊走に関与する。
【0085】
続いて、シアリル化ＩｇＧがＬＳＣＣ細胞株の増殖および遊走を促進する分子メカニズムを研究する。インテグリンファミリーは、細胞外マトリクスタンパク質受容体として、それ自体は内在的なチロシンキナーゼ活性を持たないが、主に非受容体チロシンキナーゼを動員や活性化することによりシグナル伝達を行う。インテグリンβ４は、対応するリガンドと結合した後、その細胞質領域のドメインを介して局所接着キナーゼ（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ，ＦＡＫ）を動員し、ＦＡＫのＴｙｒ３９７部位をリン酸化し、さらにＳｒｃのＳＨ２ドメインと結合してＳｒｃのＴｙｒ４１６部位のリン酸化を促進できる。Ｓｒｃのリン酸化後に、フィードバック調節によってＦＡＫのＴｙｒ９２５部位をリン酸化し、最終的に下流のＲａｓ－ＭＡＰＫまたはＰＩ３Ｋ－Ａｋｔのカスケード反応を引き起こすことができる。
【0086】
シアリル化ＩｇＧがＦＡＫまたはＭｅｔシグナル伝導に関与するか否かを把握するために、ｓｉＲＮＡによりＬＳＣＣ細胞株でＩｇＧをサイレンシングする。当然ながら、二つの異なるｓｉＲＮＡによってＩｇＧをノックダウンすると、ＦＡＫおよびＳｒｃ関連部位のリン酸化レベルを大幅に低下させることができ、ＲＰ２１５－ＩｇＧ発現レベルのダウンレギュレーションがＦＡＫ－Ｓｒｃシグナル伝導の不活性化を引き起こすことを示している。また、ｐａｘｉｌｉｎは局所接着複合体のメンバーとして、ＦＡＫが直接活性化する標的である。そのＴｙｒ１１８部位のリン酸化レベルのアップレギュレーションにより、ｐａｘｉｌｉｎを活性化して、細胞骨格リンカータンパク質としての機能を発揮し、細胞の運動または細胞分裂に関連するシグナル伝達経路を活性化することができる。同様に、ＩｇＧがノックダウンされると、パキシリン（ｐａｘｉｌｉｎ）のＴｙｒ１１８部位のリン酸化レベルも明らかに抑えられることが確認されている（図４－６を参照）。
【0087】
シアリル化ＩｇＧは上清に分泌され、ＬＳＣＣ細胞膜上のインテグリンβ４と共局在する。このため、ＩｇＧがサイレンシングされたＬＳＣＣ細胞におけるＦＡＫシグナルの観察された変化が分泌したＩｇＧによって誘導されるか否かを研究するために、モノクローナル抗体ＲＰ２１５を使用してＩｇＧおよびインテグリンβ４からなる複合体をブロッキングおよび破壊した。アイソタイプ対照と比較すると、ＲＰ２１５処理後にＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐａｘｉｌｉｎおよびＡｋｔのリン酸化の濃度は時間に依存して大幅に低下し、また、Ｍｅｔシグナル伝導を媒介したＥｒｋ１／２の活性が大幅に低下した（試験結果が図４－１０を参照）。
【0088】
分泌型ＩｇＧの機能と作用をさらに検証するために、ＲＰ２１５アフィニティークロマトグラフィー法を使用して、ＬＳＣＣ ＰＤＸ腫瘍から精製された外因性シアリル化ＩｇＧ（ＲＰ２１５－ＩｇＧ）をＮＣＩ－Ｈ５２０細胞の培地に加え、ＲＰ２１５の外因的添加またはＩｇＧのノックダウンによるＦＡＫシグナル伝導を媒介した。投与量を増やしたＲＰ２１５－ＩｇＧと共にインキュベートすると、ＦＡＫシグナル伝導への阻害が徐々に逆転することが確認されている。また、ＲＰ２１５－ＩｇＧの外因的添加によって、ＩｇＧのノックダウンによるクローン形成能力および遊走能力の低下も顕著に救済することができるが、ＲＰ２１５アフィニティークロマトグラフィーにおける通過液のＩｇＧ成分はこのような機能を実現できない（図４－１１および図４－１２を参照）。
【0089】
シアリル化ＩｇＧによって中和したＦＡＫシグナルの活性化がシアリル化Ｎ－グリカン修飾に依存するか否かをさらに研究するために、ＲＰ２１５－ＩｇＧをノイラミニダーゼで消化した。１０μｇ／ｍｌのＲＰ２１５と３６時間インキュベートした後、ノイラミニダーゼ消化後のＦＡＫ活性に対するＲＰ２１５－ＩｇＧの効果が認められないため、シアリル化ＩｇＧの機能活性はシアル酸構造に依存することが明らかになった。
以上により、インテグリン－ＦＡＫシグナル伝導は、シアリル化ＩｇＧが癌細胞の増殖および遊走を促進する重要な分子メカニズムであることが確認された。
以上により、インテグリン－ＦＡＫシグナル伝導は、シアリル化ＩｇＧが癌細胞の増殖および遊走を促進する重要な分子メカニズムであることが確認された。
【0090】
従来の研究から、シアリル化ＩｇＧとインテグリンα６β４を結合して複合体を形成しなければ、インテグリン－ＦＡＫシグナル伝達経路の活性化を促進できないことも示されている。シアリル化ＩｇＧはインテグリンα６β４のリガンドとしてα６β４－ＦＡＫ経路によって媒介される疾患の診断または治療薬の調製に用いることができ、当然ながら、該ＩｇＧのＣＨ１ドメインのＡｓｎ１６２部位はＮ－グリコシル化シアル酸によって修飾されている。
【0091】
実施例５ ＲＰ２１５－ＩｇＧが非小細胞肺癌を特異的に標識化する
患者検体：
患者検体：
【0092】
ハルビン医科大学付属腫瘍病院（ハルビン市黒竜江省）の２４２人の患者の手術からホルマリン固定・パラフィン包埋の肺癌組織切片が得られた。臨床病理学的特徴は医療レポートにより得られた。腫瘍標本の診断および組織学的分類は世界保健機関（ＷＨＯ）の分類に準拠して行われた。腫瘍－リンパ節転移（ＴＮＭ）の病期分類は米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）のガイドラインに従って決定された。
【0093】
患者は２５～８２（５６．６±１０．６）歳の年齢範囲にあり、このうち、１２１例はＳＣＣ（扁平上皮癌）、７６例はＡＤＣ（肺腺癌）、２１例はＳＣＬＣ（小細胞肺癌）、５例は大細胞肺癌、５例は気管支肺胞癌、１４例は未分化癌である。女性患者は６２名（２５．６％）である。組織病理学的等級付けでは、２６．８％のサンプル（ｎ＝６５）が十分に分化し（グレードＩ）、４９．２％（１１９例）が中程度に分化し（グレードＩＩ）、２４．０％（５８例）があまり分化していない（グレード３）。ＴＮＭ病期分類標準によると、１３４例（５５．４％）がＩ期、５０人（２０．７％）がII期、５６人（２３．１％）がIII期、２人（０．８％）がIV期である。
モノクローナル抗体ＲＰ２１５を使用して様々なタイプの肺癌患者の２４２個の癌症組織においてシアリル化ＩｇＧを測定した。
モノクローナル抗体ＲＰ２１５を使用して様々なタイプの肺癌患者の２４２個の癌症組織においてシアリル化ＩｇＧを測定した。
【0094】
まず、ＳＣＬＣ（０／２１）ではなく、ＮＳＣＬＣにおいてシアリル化ＩｇＧの高発現（１４０／２２１、６３％）が確認された。また、ＮＳＣＬＣ症例では、シアリル化ＩｇＧはＳＣＣにおいて高頻度で発現され（１０２／１２１、８４．３％）、ＡＤＣ（２８／７６、３６．８％）、小細胞肺癌（２、５、４０．０％）および未分化癌（８／１４、５７．１％）では、低頻度で発現され、気管支肺胞癌（０／５）では染色が見られなかった。
【0095】
さらに、シアリル化ＩｇＧの発現パターンおよび病理学的スコアを比較すると、ＳＣＣのシアリル化ＩｇＧ陽性組織では、全ての癌細胞、特に細胞表面において非常に強い染色性（スコア：１１０．９）を示した。しかし、非ＳＣＣ組織では、わずかな癌細胞のみが弱いまたは中程度の染色性（スコア：２１．１）を示すことが確認された。このことから、シアリル化ＩｇＧはＮＳＣＬＣの進行を促進し、かつ、ＳＣＣの細胞表面におけるシアリル化ＩｇＧが肺ＳＣＣ治療のための標的として使用可能であることが明らかになった。
【0096】
次に、シアリル化ＩｇＧが正常な肺組織に発現するか否かを検討した。剖検（６例）または隣接する癌組織（２３例）の流入領域リンパ節では、偽重層円柱状繊毛様上皮細胞、正常な肺胞上皮細胞および流入領域リンパ節のリンパ球が染色されていないことが確認された。しかし、気管支上皮細胞の基底細胞では末梢染色が観察された。これまでのところ、ＬＳＣＣは、この細胞集団、特に癌組織に隣接する気管過形成性基底細胞に由来するものであると考えられている（図５Ａ－Ｃを参照）。
【0097】
実施例６ ＲＰ２１５－ＩｇＧが同様に他の上皮性腫瘍を特異的に標識化する
患者検体：
患者検体：
【0098】
癌組織切片には、１００例の大腸癌、２００例の乳癌、８７例の前立腺癌、７０例の腎臓癌、４５例の膀胱癌、８０例の嚢胞腺癌、７０例の胃癌、２０例の膵臓癌、５０例の食道癌が含まれている。それぞれ陝西超英バイオテクノロジーおよび上海芯超バイオテクノロジー社から購入した。臨床病理学的特徴は医療レポートから得られる。腫瘍標本の診断および組織学的分類は世界保健機関（ＷＨＯ）の分類に準拠して行われる。腫瘍－リンパ節転移（ＴＮＭ）の病期分類は米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）のガイドラインに従って決定される。
モノクローナル抗体ＲＰ２１５を使用して、様々なタイプの上皮性腫瘍組織においてＲＰ２１５－ＩｇＧを測定した。
モノクローナル抗体ＲＰ２１５を使用して、様々なタイプの上皮性腫瘍組織においてＲＰ２１５－ＩｇＧを測定した。
【0099】
大腸癌組織での発現頻度は７４％（７４／１００）で、乳癌での発現頻度は９４．５％（１８９／２００）で、前立腺癌組織での発現頻度は８５％（７４／８７）で、腎臓癌組織での発現頻度は７７％（５４／７０）で、膀胱癌組織での発現頻度は１００％（５４／５４）で、嚢胞腺癌組織での発現頻度は９４％（７５／８０）で、胃癌組織での発現頻度は８６％（６０／７０）で、膵臓癌組織での発現頻度は１００％（２０／２０）で、食道癌組織での発現頻度は１００％（５０／５０）であることが確認された。ＲＰ２１５－ＩｇＧは様々な上皮由来の腫瘍で高頻度に発現することが明らかになった。
【0100】
剖検（６例）または隣接する癌組織（２３例）の流入領域リンパ節では、偽重層円柱状繊毛様上皮細胞、正常な肺胞上皮細胞（図５Ｃの左上の画像）および流入領域リンパ節のリンパ球（図５Ｃの右上の画像）が染色されていないことが確認された。しかし、気管支上皮細胞の基底細胞において、末梢染色（図５Ｃの下の二つの画像）が観察された。これまでのところ、ＬＳＣＣは、細胞集団、特に癌組織に隣接する気管過形成性基底細胞に由来するものであると考えられている。
【0101】
また、発現頻度と腫瘍転移および予後不良の関係を比較すると、ＲＰ２１５－ＩｇＧの発現レベルおよび頻度はいずれも腫瘍の転移および予後不良と正の相関関係を示していることが確認された。よって、ＲＰ２１５－ＩｇＧは上記上皮性腫瘍の形成および転移に関与し、上皮性腫瘍に対する様々な治療標的があり、かつ腫瘍の転移および予後不良の予測に使用可能であることが示唆されている（図５Ｄ）。
【0102】
実施例７ ＲＰ２１５－ＩｇＧのブロッキングによって、癌を治療することができる
抗体ＲＰ２１５の機能的ブロッキングは、ＬＳＣＣ ＰＤＸモデルに対してインビボで治療効果を示している。
抗体ＲＰ２１５の機能的ブロッキングは、ＬＳＣＣ ＰＤＸモデルに対してインビボで治療効果を示している。
【0103】
従来の試験結果から、ＲＰ２１５－ＩｇＧのＣＨ１ドメインのＡｓｎ１６２部位のＮ－グリコシルは、シアル酸で修飾されるとＲＰ２１５により認識可能になり、且つ該機能構造を持つＩｇＧは、そのグリコシル化修飾がシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４によって媒介されることが実証されている。以下では、この特有の構造を認識するモノクローナル抗体ＲＰ２１５をＲＰ２１５－ＩｇＧと結合することによりその機能をブロッキングする。
腫瘍細胞の遊走および浸潤の関与
ＰＤＸ腫瘍モデルの確立および抗体療法：
腫瘍細胞の遊走および浸潤の関与
ＰＤＸ腫瘍モデルの確立および抗体療法：
【0104】
６週齢の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）－ＢｅｉｇｅマウスはＶｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓテクノロジー有限公司（中国北京）から入手した。全ての動物の管理および使用は、いずれも北京大学医学部の動物投薬と管理に関するガイドラインに従って行われた。
【0105】
北京大学腫瘍病院で外科的切除を受けた肺扁平上皮癌患者から、腫瘍組織を３つ得た。第４世代のＰＤＸを抗体療法に用いた。ＲＰＭＩ １６４０を含む滅菌ペトリ皿に、転移した腫瘍を入れ、その後、２×２×２ｍｍ３の組織ブロックに切った。通常、各フラグメントを右側および左側の皮下領域に埋め込んだ。腫瘍が～１００ｍｍ３になってから、抗体療法を開始した。マウスをそれぞれの治療群にランダムで割り当てた。ｍＩｇＧまたはＲＰ２１５（ＰＢＳに溶解したもの）を、５ｍｇ／ｋｇで、週に二回で６週間尾静脈注射した。一日おきに腫瘍の成長状況を監視した。
ＬＳＣＣにおけるＲＰ２１５－ＩｇＧの発癌性を把握した場合、ＲＰ２１５が静脈注射によってＰＤＸモデルの治療効果を達成できるか否かを検出した。
ＬＳＣＣにおけるＲＰ２１５－ＩｇＧの発癌性を把握した場合、ＲＰ２１５が静脈注射によってＰＤＸモデルの治療効果を達成できるか否かを検出した。
【0106】
ＰＤＸ腫瘍は、原発性腫瘍で発現する主要な遺伝子の大部分を保持しており、最初に確立された細胞株よりも元の臨床腫瘍に近い。研究では、ＬＳＣＣ患者由来の腫瘍が３つ使用されており、移植腫瘍の組織学的分析により、異種移植片がＬＳＣＣの表現型を維持していることが確認された。
【0107】
図６に示すように、マウスごとに５ｍｇ／ｋｇのＲＰ２１５処理を行うと、事前に確認された腫瘍の成長率が、ｍＩｇＧ対照と比較して、６０％低下した。試験終了時ＲＰ２１５処理群の腫瘍の平均重量は０．３１±０．１４ｇであり、対照群（０．８１±０．２９ｇ）よりも大幅に低かった。別の二つのケースでも同様の効果があった。
実施例８ １２４Ｉ－ＰＲ２１５の製造、品質管理およびＭｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴ初期研究
実施例８ １２４Ｉ－ＰＲ２１５の製造、品質管理およびＭｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴ初期研究
【0108】
１２４ＴｅＯ２（９９．０％）はロシアのＣｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ会社から、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ ＨＭ－２０サイクロトロンおよび１２４Ｉ精製システム（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）は日本住友会社から、放射能測定放射能計は米国Ｃａｐｉｎｔｅｃ会社から、Ｍｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴはハンガリーＭｅｄｉｓｏ会社から購入した。放射性標識の概略図は図７Ａを参照する。
【0109】
標識化と品質管理：
１．標識抗体：ＰＲ２１５、投与量：０．２ｍｇ、抗体濃度は２．０ｍｇ／ｍｌである。
２．放射性１２４Ｉ：本機関のサイクロトロンによって製造され、バッチ番号：２０１８－Ｉ－１２４－００３、放射能濃度は５×３７ＭＢｑ／ｍＬである。
３．精製カラム：米国Ｓｉｇｍａ社製 ＰＤ－１０カラム。
４．酸化剤：ブロモコハク酸イミド（以下、ＮＢＳという）、米国Ｓｉｇｍａ社製。
５．リン酸緩衝溶液（以下、ＰＢという）：ｐＨ７．２およびｐＨ７．４の０．１および０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液、自社製。
６．ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという）：含有量は１０％であり（２０％のＨＡＳで希釈される）、華北製薬製。
１．標識抗体：ＰＲ２１５、投与量：０．２ｍｇ、抗体濃度は２．０ｍｇ／ｍｌである。
２．放射性１２４Ｉ：本機関のサイクロトロンによって製造され、バッチ番号：２０１８－Ｉ－１２４－００３、放射能濃度は５×３７ＭＢｑ／ｍＬである。
３．精製カラム：米国Ｓｉｇｍａ社製 ＰＤ－１０カラム。
４．酸化剤：ブロモコハク酸イミド（以下、ＮＢＳという）、米国Ｓｉｇｍａ社製。
５．リン酸緩衝溶液（以下、ＰＢという）：ｐＨ７．２およびｐＨ７．４の０．１および０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液、自社製。
６．ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡという）：含有量は１０％であり（２０％のＨＡＳで希釈される）、華北製薬製。
【0110】
試験機器：放射能計：（中国計量科学研究院）、表面汚染測定機器（スウェーデン）、放射性ヨウ素標識用グローブボックス（上海同普会社）。
抗体溶液の標識化：
７．０．２ｍｇのＰＲ２１５（容量２００μＬ）を、０．３ｍｌ ０．１ＭのＰＨ７．４のＰＢに加えた。
抗体溶液の標識化：
７．０．２ｍｇのＰＲ２１５（容量２００μＬ）を、０．３ｍｌ ０．１ＭのＰＨ７．４のＰＢに加えた。
【0111】
８．必要な放射性Ｎａ１２４Ｉ溶液を０．５ｍｌ抽出した。放射能は２．５×３７ＭＢｑであり、標識化する抗体溶液において該放射性溶液を加えると、直ちに１０μｇのＮＢＳ（１ｍｇあたりの抗体に５０μｇのＮＢＳを加え，０．０１Ｍ ＰＢＳで調製することに相当する）を加え、６０ｓ反応させた後、１０％のＨＳＡを０．３ｍｌ加えて反応を終了させた。続いてサンプリングして標識率を測定し、ＰＤ－１０カラムを通過して精製分離した。カラム注入量は１．５ｍＣｉであり、収率は２．０ｍＣｉであり、比放射能は１０ｍＣｉ／ｍｇであり、放射能濃度は１ｍＣｉ／ｍＬであった。
【0112】
９．標識率の測定：アセトン展開剤を使用した。ＩＴＬＣ－ＳＧを固定相としてアップリンク展開を行った。標識物は原点にあり、遊離１２４Ｉはフロントにある。Ｒａｄｉｏ－ＴＬＣを使用して放射能カウントを測定し、かつ標識率を算出した。
放射性標識の精製前後のＲａｄｉｏ－ＴＬＣ分析は図７Ｂを参照する。
２４Ｉ－ＰＲ２１５のＭｉｃｒｏ－ＰＥＴ現像
放射性標識の精製前後のＲａｄｉｏ－ＴＬＣ分析は図７Ｂを参照する。
２４Ｉ－ＰＲ２１５のＭｉｃｒｏ－ＰＥＴ現像
【0113】
１８．５ＭＢｑの１２４Ｉ－ＰＲ２１５生理食塩水溶液を、ヒト肺扁平上皮癌ＰＤＸモデル動物に尾部静脈注射した。薬物注射後２０時間、６０時間、８０時間、１２０時間に、Ｍａｔｒｘ ＶＩＰ ３０００動物用麻酔器を使用して、３００ｍＬ／ｍｉｎの酸素で３．０％イソフルランを吹き付けてマウスに麻酔をかけ、マウスを腹臥位でスキャンベッドに固定した。１５０ｍＬ／ｍｉの酸素で１．０－１．５％イソフルランを吹き付けて麻酔状態を維持し、Ｍｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った。スキャンエネルギーウィンドウは３５０－７００ＫｅＶで、断面視野は８０ｍｍで、３Ｄモードで１５ｍｉｎ収集し、収集後に、ランダムおよび散乱減衰補正を使用してＯｓｅｍアルゴリズムで３Ｄ画像を再構築し、再構築後、ＭＭＷＫＳ ＳＵＰＥＲＡＲＧＵＳソフトウェアを使用して画像を処理した。
【0114】
調製した１２４Ｉ－ＰＲ２１５溶液を正常なマウスに尾静脈注射した後、Ｍｉｃｒｏ－ＰＥＴ／ＣＴを使用して結像試験を行った。結果を図７Ｃに示しており、１２４Ｉ－ＰＲ２１５溶液の尾静脈注射後２０時間、６０時間、８０時間、１２０時間に、心血液プールから腫瘍までの範囲で、放射能濃縮が明らかに認められ、他の正常な組織器官では放射能濃度が低かった。また、１２４Ｉは主に膀胱で代謝される。Ｍｉｃｒｏ－ＰＥＴ現像に基づき、本研究で調製した１２４Ｉ－ＰＲ２１５はヨウ素シリーズのモノクローナル抗体の生体内での代謝挙動に適合し、かつ、モデル動物腫瘍で放射能の取り込みが良好であることが証明された。
【0115】
本明細書では、具体的な個別例を用いて発明の概念を詳しく説明したが、以上の実施例の説明は本発明の中心的な思想に対する理解を助けるためのものに過ぎない。当業者であれば、該発明の概念から逸脱せずになされる修正、同等置換または他の改善はいずれも本発明の保護範囲内に含まれることは明らかである。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図4-8】
【図4-9】
【図4-10】
【図4-11】
【図4-12】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】