特許 7159299 樹状細胞効力アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-14

(45)【発行日】2022-10-24

(54)【発明の名称】樹状細胞効力アッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20221017BHJP

   G01N 33/533 20060101ALI20221017BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221017BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20221017BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 K

G01N33/53 P

G01N33/533

C12Q1/02

C12N5/0784

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2020513569

(86)(22)【出願日】2017-09-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-11-12

(86)【国際出願番号】 EP2017072254

(87)【国際公開番号】W WO2019048026

(87)【国際公開日】2019-03-14

【審査請求日】2020-05-20

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 （１） 公開日： ２０１７年８月３１日 （２） オンラインによる公開：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔａｔｉｃ１．ｓｑｕａｒｅｓｐａｃｅ．ｃｏｍ／ｓｔａｔｉｃ／５６ｄｅｅ７１ｅ５５５９８６ｆｂ３ａｅ５８３ｅ２／ｔ／５９ａ６９２５６４９ｆｃ２ｂ１８４５５ｆ８ｅ５１／１５０４０８８６７４１８２／Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＋Ａｂｓｔｒａｃｔｓ．ｐｄｆ １２３～１２４頁における“Ａ１８１／樹状細胞（ＤＣ）ワクチンの免疫モニタリング：ＤＣ側からのワクチンの可能性の調査” （３） 会議の名前と場所：２０１７年９月６日から９日にドイツで開催された第３回ＣＲＩ－ＣＩＭＴ－ＥＡＴＩ－ＡＡＣＲ国際癌免疫療法会議 （４） 公開者： メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー （５） 公開された発明の内容： メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハーは、第３回ＣＲＩ－ＣＩＭＴ－ＥＡＴＩ－ＡＡＣＲ 国際癌免疫療法会議の小冊子に、ジュディス エクル、イザベル レーマー、クリスティアンヌ ガイガー、及びドロレス シェンデルによって発明された“Ａ１８１／樹状細胞（ＤＣ）ワクチンの免疫モニタリング：ＤＣ側からのワクチンの可能性の調査”を公開した。

(73)【特許権者】

【識別番号】517419917

【氏名又は名称】メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100110663

【弁理士】

【氏名又は名称】杉山 共永

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】シェンデル，ドロレス

(72)【発明者】

【氏名】エクル，ジュディス

(72)【発明者】

【氏名】ガイガー，クリスティアンヌ

(72)【発明者】

【氏名】レーマー，イザベル

【審査官】草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５３６３３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５０４９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Kvistborg P、外４名，Fast generation of dendritic cells，CELLULAR IMMUNOLOGY，2009年01月01日，Vol.260,No.1，Page.56-62

【文献】Veronique Lam Isong，In vitro generation of human monocyte-derived dendritic cells within 48 hours: functional characterisation and optimal activation in view of cellular-based immunotherapy，The degree of Doctor of at the Faculty of Medicine,LMU,Munich,Germany，ドイツ，2012年12月07日，https://d-nb.info/1028737939/34 ( 2018-03-05)

【文献】Kvistborg P、外４名，Fast generation of dendritic cells，CELLULAR IMMUNOLOGY，2009年01月01日，Vol.260,No.1，Page.56-62

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ１２Ｎ ５／０７８４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

樹状細胞の効力を決定する方法であって、
（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによってインビトロで樹状細胞を刺激するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップと、ここで、該測定は、単一細胞レベルにおいて行われる、
（ｃ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌プロファイルに基づく前記樹状細胞の効力の分類のステップと、ここで、１を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される、
を含み、
Ｔ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、Ｔ細胞を、Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型へと極性化する、前記方法。

【請求項2】

前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、４－アミノ－２－エトキシメチル－α，α－ジメチル－１Ｈ－イミダゾール［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール（Ｒ８４８）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、高いＣＤ８０発現レベル、高いＣＤ８６発現レベル、低いＣＤ１４発現レベル、および低いＢ７Ｈ１発現レベルの表現型を有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型が、前記Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌と、全くないかまたは低いＩＬ－４の発現とによって特徴付けられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、ＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

樹状細胞の効力を決定する方法であって、
（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによってインビトロで樹状細胞を刺激するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップと、ここで、該測定は、単一細胞レベルにおいて行われる、
（ｃ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌プロファイルに基づく前記樹状細胞の効力の分類のステップと、ここで、１を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される、
を含み、
ＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、ＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させる、前記方法。

【請求項7】

ステップ（ｂ）が、
ｉ）ＩＬ－１０に対する一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質と共に前記樹状細胞をインキュベートするステップと、
ｉｉ）前記一次結合性タンパク質への前記マーカータンパク質の結合を、二次結合性タンパク質によって検出するステップと
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記刺激が、前記樹状細胞への可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの結合によってのみ生じる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ＣＤ４０Ｌが、細胞株によって前記樹状細胞に提示されない、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記樹状細胞が、異なる細胞株と共培養されない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

放射線照射ステップが適用されない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記一次結合性タンパク質が抗体である、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記二次結合性タンパク質が抗体である、請求項７または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記二次結合性タンパク質が蛍光標識される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記樹状細胞が、成熟させた樹状細胞である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記成熟させた樹状細胞が、成熟化カクテルとのインキュベーションによって得られる、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＣの効力を決定する方法であって、可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、刺激された樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップとを含む方法に関する。それにより、樹状細胞がＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する高い能力を有するかどうかを決定することができる。本発明はまた、樹状細胞を刺激する方法であって、可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストで樹状細胞を刺激するステップを含む方法も包含する。

【背景技術】

【0002】

抗原負荷した樹状細胞は、無感作Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をプライミングすることができ、結果として、抗腫瘍免疫療法または慢性ウイルス感染症の治療においてワクチンとして使用することができる。これらの腫瘍ワクチンは、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激することによって、疾患関連の抗原に対するＴ細胞応答の増加を引き起こす（Subkleweら）。臨床試験は、ＤＣベースの免疫療法が安全であること、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾された樹状細胞の投与が特異免疫の増強につながることを示している。

【0003】

過去において、免疫モニタリングは、応答するＴ細胞の面だけに集中しており、免疫応答のＤＣ側はほとんど見落とされていた。これは、一部には、分析のために関連ＤＣの機能を決定することの困難さに起因し得る。癌免疫療法セッティングにおいてＴ細胞を最適に活性化するためには、ＤＣによって３つのシグナルが提供されなければならない。第一に、ＴＣＲを惹起するために、適切な抗原が、ＭＨＣ複合体によって適切な量において提示されなければならず（シグナル１）；第二に、Ｔ細胞に対して促進的共刺激を提供するために、ＣＤ８０／ＣＤ８６のような共刺激分子の活性化が、ＤＣ表面上の負の調節分子より優勢にならなければならず（シグナル２）、第三に、Ｔ細胞をＴｈ１／ＴＣ１方向に極性化するために、ＩＬ－１０の不在下においてサイトカインＩＬ－１２の生物活性型が分泌されるべきである（シグナル３）。シグナル１およびシグナル２は、フローサイトメトリーを使用してモニターすることができる。シグナル３は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合を介したＤＣ－Ｔ細胞相互作用を模倣することによって測定することができる。

【0004】

しかしながら、投与のために作製された樹状細胞の品質は変わり得る。樹状細胞におけるこの変動は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を活性化するそれらの能力に影響を及ぼす。樹状細胞の品質は、その由来、分化および成熟状態に依存する。同じ成熟プロトコルおよび健常なドナーが使用された場合でさえ、Ｔ細胞活性化能力は、個々の間でかなり異なる。したがって、高い効力のワクチンとして使用される樹状細胞の適性をモニターする必要がある。

【0005】

信頼できるワクチン療法を提供するために、樹状細胞の効力を試験する方法が必要であるため、試験は、ロバストであり、費用対効果に優れ、適正製造規格（good manufacturing standard）（ＧＭＰ）に従って実施できることが望ましい。

【0006】

ＤＣワクチンの効力に対する標準的アッセイは、樹状細胞の表面でのＣＤ８０の上方調節である。このアッセイは、規制当局によって承認されるが、樹状細胞の真の機能性を反映はしない。ＣＤ８０試験は、優れたＴ細胞およびＮＫ活性化能力を示す、高ＩＬ－１２分泌および低ＩＬ－１０分泌を有する樹状細胞を、低ＩＬ－１２および高ＩＬ－１０を分泌するＤＣ細胞と区別しない。

【0007】

Ｔ細胞活性化を誘導するために、樹状細胞を活性化しなければならない。樹状細胞の効力を測定する標準的アッセイにおいて、樹状細胞は、放射線照射された、ＣＤ４０Ｌを発現するＬ９２９マウス線維芽細胞と共にインキュベートされる。マウス線維芽細胞上において発現されるＣＤ４０Ｌと樹状細胞のＣＤ４０との相互作用を介して、樹状細胞は活性化される。このアプローチは不利であるが、それは、放射線照射されたマウス線維芽細胞と樹状細胞との共培養は、困難であり、手間がかかり、コストが高く、標準化が難しく、ならびにＧＭＰ規格を適用するのが困難であるからである。その上、放射線照射ユニットが必要である。

【0008】

サイトカインのための標準的な単一細胞アッセイは、細胞内染色およびフローサイトメトリーによる検出である。それは、１つのアッセイでのＩＬ－１２およびＩｌ－１０の検出を可能にする。このアプローチの問題は、細胞内染色は、実際の分泌を示さず、単に刺激の際に誘導された細胞内サイトカインのレベルを測定するということである。したがって、細胞内サイトカインの検出は、これらのサイトカインが細胞によって分泌されることを意味しない。サイトカインが、刺激の前に既に細胞内に貯蔵されている場合、実際の分泌の推論は可能ではない。測定されたレベルが著しく増加する場合にのみ、刺激によるサイトカインの上方調節を、間接的に推論することができる。分泌されたサイトカインの実際のレベルは検出されない。サイトカインのレベルが変化しない場合、サイトカインは増加していないのかもしれないし、または増加しているが、増加が細胞内のサイトカインの分解と同じくらいの速さであるため、増加を検出できないのかもしれない。通常、成熟ＤＣは、長期間にわたってＩＬ－１０を貯蔵することができ、ＩＬ－１０が分泌されても、それは、細胞内染色データ、例えば、フローサイトメトリーデータなどに反映されない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、適正製造規格（ＧＭＰ）に従って実施することができ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌を直接測定する、ロバストで費用対効果に優れるシンプルな方式において、樹状細胞の効力を試験する方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

したがって、本発明の第１の態様は、ＤＣの効力を決定する方法であって、（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、（ｂ）（ａ）の樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップとを含む方法に関する。

【0011】

この方法は、樹状細胞の効力の正確な予測を可能にするマーカーサイトカインＩＬ－１２およびＩＬ－１０の実際の分泌レベルを測定するため、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の免疫応答を誘発する樹状細胞の能力の正確な予測を可能にする。その上、その方法は、ロバストであり、シンプルで、費用対効果に優れる。

【0012】

「樹状細胞の効力」は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する樹状細胞の能力を意味する。したがって、本発明との関連における高い効力を有する樹状細胞は、樹状細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化することができることを意味する。特に、本発明との関連における高い効力の樹状細胞は、Ｔ細胞を、Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌と同細胞の全くないかまたは低いＩＬ－４の発現とによって特徴付けられるＴｈ１／Ｔｃ１表現型へと極性化し得、ならびに／あるいはＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させ得る。

【0013】

好ましい実施形態において、測定は、単一細胞レベルにおいて行われる。先行技術において使用されるアッセイは、バルクの培養物中の細胞マーカーを測定するだけであり、したがって、不均一な細胞集団の正しい分析を提供することができない。結果からは、少数の細胞のみが多量のサイトカインを産生するのか、それとも多数の細胞が少量の所定の分析物質を産生するのかは、不明瞭である。さらに、細胞が同時に両方の分析物質を産生するかどうかを検出することは、可能ではない。

【0014】

不均一な樹状細胞集団の効力の状態を詳細に決定するために、単一細胞測定は有利である。

【0015】

好ましい実施形態において、ＴＬＲ７／８アゴニストは、４－アミノ－２－エトキシメチル－α，α－ジメチル－１Ｈ－イミダゾール［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール（Ｒ８４８）である。

【0016】

可溶性ＣＤ４０ＬおよびＲ８４８の組み合わせを用いた樹状細胞のインキュベーションは、特に有利であるが、それは、成熟化条件が異なる樹状細胞、例えば、異なる成熟化カクテルと共にインキュベートされた樹状細胞に対する、ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＬ９２９細胞による刺激を模倣するからである。したがって、ＣＤ４０ＬおよびＲ８４８の組み合わせは、普遍的な樹状細胞刺激組成物に相当する。

【0017】

方法はさらに、ステップ（ｃ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌プロファイルに基づく樹状細胞の効力の分類を含む。その結果、１を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される。

【0018】

Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、高いＣＤ８０発現レベル、高いＣＤ８６発現レベル、低いＣＤ１４発現レベル、および低いＢ７Ｈ１発現レベルの表現型を有し得る。

【0019】

Ｔ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、Ｔ細胞を、Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型へと極性化し得る。Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌と、全くないかまたは低いＩＬ－４の発現とによって特徴付けられる。

【0020】

ＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、ＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させ得る。

【0021】

特に、方法のステップ（ｂ）は、
ｉ）ＩＬ－１０に対する一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質と共に樹状細胞をインキュベートするステップと、
ｉｉ）一次結合性タンパク質へのマーカータンパク質の結合を、二次結合性タンパク質によって検出するステップと
を含む。

【0022】

典型的には、刺激は、樹状細胞へのＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの結合によってのみ生じる。

【0023】

本発明の方法では、ＣＤ４０Ｌは、細胞株によって樹状細胞に提示されない。樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌの可溶型とのインキュベーションによって活性化されるため、樹状細胞を異なる細胞株、例えば、ＣＤ４０Ｌを発現するＬ９２９マウス線維芽細胞などと共培養する必要はない。したがって、困難で、時間がかかり、標準化することが困難な細胞培養を避けることができる。その上、これは、Ｌ９２９マウス細胞が増殖し続けないことを確実にするために放射線照射ステップを適用する必要のないことを意味し、増殖し続けた場合、実質的に、Ｌ９２９細胞がヒト樹状細胞を過剰増殖することにつながり、アッセイの実施を不可能にする。したがって、本発明の方法の場合、全ての病院に存在するわけではない放射線照射ユニットを必要としない。

【0024】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質は、担体上に固定化される。それにより、担体は、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対する一次結合性タンパク質で一様にコーティングされ得る。これは、単一細胞レベルでのＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定することを可能にする。典型的には、担体は、マルチウェルプレートである。通常、一次結合性タンパク質は、抗体である。二次結合性タンパク質も抗体であり得る。二次結合性タンパク質は、検出ラベルによって標識され得る。典型的には、二次結合性タンパク質は、蛍光官能基またはラベルによって標識される。

【0025】

通常、本発明の方法において使用される樹状細胞は、成熟させた樹状細胞である。成熟させた樹状細胞は、本発明による方法によって刺激される場合、ＩＬ－１０に対するＩＬ－１２の必要な比率においてそれらを発現する。樹状細胞の成熟化は、例えば、成熟化カクテルとのインキュベーションによって行われ得る。

【0026】

好ましくは、本発明の方法において使用される樹状細胞は、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、およびプロスタグランジンＥ２を含む成熟化カクテルによって成熟される。

【0027】

より好ましくは、本発明の方法において使用される樹状細胞は、以下のステップ：ｉ）単球の提供と；ｉｉ）ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーションと；ｉｉｉ）ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、およびプロスタグランジンＥ２を含む成熟化カクテルとの組み合わせにおけるＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーションとによって成熟される。

【0028】

ステップｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも２日間継続し得る。ステップｉｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間継続し得る。

【0029】

本発明の別の態様は、樹状細胞を刺激する方法であって、
ａ）樹状細胞を提供するステップと、
ｂ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストで樹状細胞を刺激するステップと
を含む方法に関する。

【0030】

したがって、本発明は、樹状細胞を刺激するための可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの使用に関する。

【0031】

本発明の別の態様は、
・ＴＬＲ７／８アゴニスト
・可溶性ＣＤ４０Ｌ
・ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質
・ＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質
・ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質、および
・ＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質
を含むキットに関する。

【0032】

例えば、キットは、以下の成分：
（ｉ）ＴＬＲ７／８アゴニストおよびＣＤ４０Ｌを含む組成物、
（ｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質を含む組成物、ならびに
（ｉｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質を含む組成物
を含み得る。

【0033】

一次結合性タンパク質は、好ましくは抗体であり得、および／または二次結合性タンパク質は、抗体である。典型的には、ＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８である。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】ＤＣ刺激を示す図である。図１Ａ：３つのシグナルが、最適なＤＣ刺激のために必要である。ＤＣは、Ｔ細胞の強力なアクチベーターであり、ＤＣとＴ細胞との間の相互作用によってエフェクターＴ細胞の特性に影響を及ぼす。最適な活性化のために、３つのシグナルが、ＤＣによって提供されなければならない。シグナル１：ＭＨＣ／ペプチドおよび対応するＴＣＲによる抗原提示シグナル２：ＣＤ２８に会合する共刺激シグナルＣＤ８０／ＣＤ８６の活性化シグナル３：活性化性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２の分泌、および阻害性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１０の不在；出典Ｄｅ Ｋｏｋｅｒ、２０１１。図１Ｂ：従来のシグナル３アッセイでは、ＤＣを、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するマウス線維芽細胞の細胞株Ｌ９２９と２４時間共培養する。培養上清中へと分泌されたサイトカインＩＬ－１２ｐ７０およびＩＬ－１０は、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡ（例えば、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定される。アッセイは、放射線照射ユニットを必要とし、困難な細胞培養を発展させ、それにより、アッセイをＧＭＰ施設において利用することを困難にするため、不利である。さらに、アッセイは、単一細胞レベルに特有である。

【図2】ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡにおける従来対樹状細胞のＣＤ４０Ｌ刺激の比較を示す図である。従来のシグナル３アッセイと比較した場合の、ＭＤＧカクテルによって成熟され、Ｒ８４８、ＩＦＮ－γ、およびＬＰＳとの様々な組み合わせにおいてＤＣ４０Ｌによって刺激されたＤＣにおけるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の分泌を示す（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡ）。

【図3】ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡにおける従来対樹状細胞のＣＤ４０Ｌ刺激の比較を示す図である。Ｊｏｎｕｌｅｉｔで成熟されたＤＣによる同じ実験を示す。両方のアッセイにおいて、ＣＤ４０Ｌ刺激は、ＩＬ－１２分泌に関しては従来のシグナル２アッセイと同様の結果を示すが、ＣＤ４０Ｌ刺激が単独で使用される場合、ＩＬ－１０に対してはそうではない（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡ）。

【図4】ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡにおける従来対樹状細胞のＣＤ４０Ｌ刺激の比較を示す図である。図４および５は、特に未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）およびＪｏｎｕｌｅｉｔ成熟ＤＣにおける最適なＩＬ－１０分泌のための共刺激試薬としてＲ８４８が必要であることを示している。図４は、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡデータを示す。

【図5】ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡにおける従来対樹状細胞のＣＤ４０Ｌ刺激の比較を示す図である。図４および５は、特に未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）およびＪｏｎｕｌｅｉｔ成熟ＤＣにおける最適なＩＬ－１０分泌のための共刺激試薬としてＲ８４８が必要であることを示している。図５は、本発明の方法によって実施されたデータを示す（ＥＬＩＳＰＯＴ シグナル３ ＣＤ４０Ｌ）。

【図6】図６から８：フローサイトメトリーではなく二色ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＰＯＴがＥＬＩＳＡに匹敵する樹状細胞の効力を示すことを示す図である。ＩＬ－１２およびＩＬ－１０に対する２種類の異なるドナーのＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。刺激は、２００００細胞、およびＲ８４８を伴う１μｌＣＤ４０Ｌ／１００μｌ（［ｖ／ｖ］）の培地によって実施した。ドナー１は、高ＩＬ－１０産生体であり、その一方で、ドナー２は、主にＩＬ－１２を産生する。

【図7】図６から８：フローサイトメトリーではなく二色ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＰＯＴがＥＬＩＳＡに匹敵する樹状細胞の効力を示すことを示す図である。従来のシグナル３アッセイでの同じドナーを示す。両方のアッセイは、非常に匹敵する結果を示している。二色ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＰＯＴとは対照的に、細胞内ＩＬ－１２およびＩＬ－１０のフローサイトメトリー分析は、ＩＬ－１２分泌データのみに匹敵する結果を示しているが、ＩＬ－１０に対してはそうではない。これは、おそらく細胞内ＩＬ－１０貯蔵に起因する。

【図8】図６から８：フローサイトメトリーではなく二色ＩＬ－１０／ＩＬ－１２ＥＬＩＳＰＯＴがＥＬＩＳＡに匹敵する樹状細胞の効力を示すことを示す図である。同じドナーの細胞のＩＬ－１２およびＩＬ－１０のＥＬＩＳＡまたは対応する細胞内フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）染色によって検出される、従来のシグナル３アッセイ後のＩＬ－１２およびＩＬ－１０分泌の比較を表す。ＦＡＣＳによって検出される細胞内染色結果は、特にＩＬ－１０に関して、ＥＬＩＳＡによって検出される分泌に匹敵しない。これは、ＦＡＣＳは、細胞内に貯蔵された総ＩＬ－１０を測定するが、その一方で、ＥＬＩＳＡは、分泌されたＩＬ－１０を検出するという事実によって説明することができる。

【図9】単一細胞ＩＬ－１０／ＩＬ－１２アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を示す図である。上側の列において、第１の画像は、ＩＬ－１２産生成熟樹状細胞（本発明者らのカクテルによって成熟させた）のスポットカウントを示しており、第２の画像は、同じウェルにおけるＩＬ－１０産生細胞のスポット数を示しており、第３の画像は、二重陽性細胞のスポットの数を示している。下側の第２列には、未成熟樹状細胞のそれぞれのデータが示されている（ヒトＩＬ－１０／ＩＬ－１２二色ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＣＴＬ）；細胞数：２０，０００細胞／ウェル、１．１μｌ／１１０μｌのＣＤ４０Ｌ＋Ｒ８４８）。結果は、健康なドナーにおいて、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）がＩＬ－１０の主要な供給源であることを明確に示している。

【発明を実施するための形態】

【0035】

いくつかの好ましい実施形態に関して本発明を詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。

【0036】

以下において例示的に説明される本発明は、本明細書において具体的に開示されていない任意の要素、制限の不在下において、適切に実施され得る。

【0037】

本発明は、特定の実施形態に関して、およびある特定の図を参照しながら説明されるであろうが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0038】

用語「を含む（comprising）」が、本説明および特許請求の範囲において使用される場合、それは、他の要素を排除しない。本発明の目的のために、用語「からなる（consisting of）」は、用語「を含む（comprising of）」の好ましい実施形態であるとみなされる。以下において、群が、少なくともある特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を開示するとも理解される。

【0039】

本発明の目的のために、用語「得られる（obtained）」は、用語「得ることができる（obtainable）」の好ましい実施形態であるとみなされる。以下において、例えば、抗体が、特定の供給源から得ることができると定義される場合、これは、この供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。

【0040】

単数名詞を示すときに不定冠詞または定冠詞、例えば、「a」、「an」、または「the」が使用される場合、これは、特に明記されない限り、複数のその名詞を包含する。本発明の文脈における用語「約（about）」または「およそ（approximately）」は、関心対象の特徴の技術的効果をさらに確実にすると当業者が理解するであろう正確さの区間を意味する。その用語は、典型的には、示された数値からの±１０％、好ましくは±５％の偏位を示す。

【0041】

技術用語は、それらの常識によって使用される。ある特定の用語に、特定の意味が込められる場合、以下において、その用語が使用される文脈における用語の定義が与えられるであろう。

【0042】

概して、本発明は、ＤＣの効力を決定する方法であって、（ａ）可溶性ＣＤ４０Ｌおよび場合によりＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、（ｂ）（ａ）の樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップとを含む方法に関する。

【0043】

特に、本発明は、ＤＣの効力を決定する方法であって、（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、（ｂ）（ａ）の樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップとを含む方法に関する。

【0044】

樹状細胞は、細胞表面においてＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０－ＣＤ－４０Ｌ相互作用は、樹状細胞を刺激する。「可溶性ＣＤ４０Ｌ」は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４またはＣＤ４０リガンドとも命名される）と会合する膜の修飾型を意味する。用語「可溶性ＣＤ４０Ｌ」は、その膜貫通ドメインを含まない、ＣＤ４０Ｌの切除型を包含する。用語「可溶性ＣＤ４０Ｌ」は、ＣＤ４０Ｌオリゴマー、特に修飾されたＣＤ４０Ｌオリゴマー、例えば、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ／ＡＣＲＰ３０／ＡｄｉｐｏＱのコラーゲンドメインによって人工的に結合された三量体ＣＤ４０リガンド分子、例えば、ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、Ｌｏｒｒａｃｈ、ドイツ）なども包含する。可溶性ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌの自然な膜支援凝集を刺激することができ得る。ＣＤ４０Ｌは、１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、例えば、１μｇ／ｍｌなどの濃度において使用され得る。ＣＤ４０Ｌを用いたインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは１２時間から４８時間、より好ましくは約２４時間継続し得る。

【0045】

ＴＬＲ７／８は、Ｔｏｌｌ様受容体７／８とも命名される。好ましくは、ＴＬＲ７／８アゴニストは、４－アミノ－２－エトキシメチル－α，α－ジメチル－１Ｈ－イミダゾール［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール（Ｒ８４８）であり、これは、国際公開第００／４７７１９号パンフレットに記載されており、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（サンディエゴ、ＵＳＡ）から入手可能である。ＴＬＲ７／８アゴニスト、好ましくはＲ８４８は、０．２μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌの間、好ましくは０．５μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌ、より好ましくは１μｇ／ｍｌの濃度において使用され得る。ＴＬＲ７／８アゴニスト、好ましくはＲ８４８を用いたインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは１２時間から４８時間、より好ましくは約２４時間継続され得る。

【0046】

ＴＬＲ７／８アゴニストおよびＣＤ４０Ｌは、一緒に、または連続して、樹状細胞に加えられ得る。

【0047】

ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの組み合わせとのインキュベーションは特に有利であるが、それは、成熟化条件が異なる樹状細胞、例えば、異なる成熟化カクテルと共にインキュベートされた樹状細胞に対する、ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＬ９２９細胞による刺激を模倣するからである。したがって、ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストは、普遍的な樹状細胞刺激組成物に相当する。

【0048】

重要なことに、本発明は、樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定する。これは、培地中へと分泌されるＩＬ－１２およびＩＬ－１０分子を測定しており、それらは細胞内ＩＬ－１２およびＩＬ－１０内容物ではないことを意味する。上記において細胞内内容物について既に説明したように、インターロイキンは、分泌されたレベルに必ずしも一致するわけではない。これは特に、ＩＬ－１０に当てはまる。

【0049】

典型的には、樹状細胞は、ＩＬ－１０一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２一次結合性タンパク質でコーティングされた担体プレート上に播種され得る。ＣＤ４０Ｌと場合によりＴＬＲ７／８アゴニストとを含有する刺激溶液は、樹状細胞を播種した後または播種する前に加えられ得る。インキュベーション時間の後、二次結合性タンパク質が加えられる。インキュベーション時間は、６時間から４８時間、好ましくは１２時間から３６時間、最も好ましくは２４時間であり得る。

【0050】

したがって、マーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌の測定は、マーカータンパク質の検出を媒介する、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対する特異的結合性タンパク質とのインキュベーションによるマーカータンパク質の検出を意味する。したがって、結合性タンパク質は、ラベル、例えば、蛍光ラベルなどによって、または特異的基質、例えば、ＩＬ－１０に対する西洋ワサビペルオキシダーゼおよびＩＬ－１２に対するアルカリ性ホスファターゼなど）を使用するマーカータンパク質の検出を可能にする反応を促進する酵素によって修飾され得る。

【0051】

好ましい実施形態において、測定は、単一細胞レベルにおいて行われる。単一細胞レベルにおいてインターロイキン分泌を測定することが可能な任意の方法を適用することができる。したがって、この方法は、バルク培養物中のインターロイキン分泌、すなわち、細胞集団のインターロイキンの合計を測定するのではなく、細胞ごとに個別にインターロイキン分泌を測定する。上記において既に指摘しているように、これは有利であるが、それは、異なるインターロイキン分泌を示す複数の細胞を含む不均一な細胞集団のインターロイキン状況を、より詳細に分析することができるからである。

【0052】

したがって、好ましい実施形態は、ＤＣの効力を決定する方法であって、（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＲ８４８とのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、（ｂ）（ａ）の樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップとを含み、
アッセイが単一細胞レベルにおいて行われる、方法に関する。

【0053】

方法はさらに、ステップ（ｃ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌プロファイルに基づく樹状細胞の効力の分類を含む。換言すると、方法は、ステップ（ｃ）樹状細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する高い能力を有するかどうかの分類を含む。その結果、１を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される。好ましくは、５を超える、例えば、１０を超える、２０を超える、３０を超える、４０を超える、５０を超える、６０を超える、７０を超える、８０を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される。ＩＬ－１０に対するＩＬ－１２の比率は、典型的には、１０，０００未満、例えば、５，０００未満、１，０００未満、または５００未満である。

【0054】

逆の場合も同様に、１を超える、ＩＬ－１２分泌に対するＩＬ－１０分泌の比率を示す樹状細胞は、免疫応答を抑制する樹状細胞として分類される。

【0055】

好ましい実施形態は、ＤＣの効力を決定する方法であって、（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＲ８４８とのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、（ｂ）（ａ）の樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップと、（ｃ）樹状細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する高い能力を有するかどうかの分類ステップとを含み、１を超えるＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類され；
アッセイが単一細胞レベルにおいて行われる、方法に関する。

【0056】

Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、高いＣＤ８０発現レベル、高いＣＤ８６発現レベル、低いＣＤ１４発現レベル、および低いＢ７Ｈ１発現レベルの表現型を有し得る（Lichteneggerら; Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeway's Immunobiology）。

【0057】

Ｔ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、Ｔ細胞を、Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型へと極性化し得る。Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型は、Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌と、全くないかまたは低いＩＬ－４の発現とによって特徴付けられる。ＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞は、ＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させ得る（Kenneth Murphy & Casey Weaver: Janeway's Immunobiology）。

【0058】

典型的には、刺激は、樹状細胞への可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの結合によってのみ生じる。これは、樹状細胞を刺激するために、他の刺激、例えば、他の分子とのインキュベーションが必要ないことを意味する。特に、膜貫通タンパク質ＣＤ４０Ｌが、細胞の膜に固定された膜貫通型、例えば、ＣＤ４０Ｌを発現する放射線照射されたＬ９２９マウス線維芽細胞などにおいて、樹状細胞に提示されることは、必要ではない。したがって、方法が放射線照射ステップを含む必要はない。

【0059】

特に、方法のステップ（ｂ）は、
ｉ）ＩＬ－１０に対する一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質と共に樹状細胞をインキュベートするステップと、
ｉｉ）一次結合性タンパク質へのマーカータンパク質の結合を、二次結合性タンパク質によって検出するステップと
を含む。

【0060】

ステップｉｉ）の検出は、マーカータンパク質と一次結合性タンパク質との複合体への二次結合性タンパク質の結合によって行われ得る。あるいは、二次結合性タンパク質は、単独で、一次結合性タンパク質に結合し得る（一次結合性タンパク質との相互作用なしに）。この場合、ステップｉｉ）の前の洗浄ステップにより、一次結合性タンパク質に結合されていないマーカータンパク質が除去される。

【0061】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質は、担体上に固定化される。それにより、担体は、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対する一次結合性タンパク質で一様にコーティングされ得る。これは、単一細胞レベルでのＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定することを可能にする。典型的には、担体は、マルチウェルプレートである。通常、一次結合性タンパク質は、抗体である。二次結合性タンパク質も抗体であり得る。

【0062】

二次結合性タンパク質は、検出ラベルによって標識され得る。典型的には、二次結合性タンパク質は、蛍光標識されるか、またはマーカータンパク質の検出を可能にする反応を促進する酵素によって修飾される。

【0063】

通常、本発明の方法において使用される樹状細胞は、成熟させた樹状細胞である。成熟させた樹状細胞は、ＣＤ４０Ｌ（およびＴＬＲ７／８アゴニスト）によって刺激される場合、ＩＬ－１０に対するＩＬ－１２の必要な比率においてそれらを発現する。樹状細胞の成熟化は、例えば、成熟化カクテルとのインキュベーションによって行われ得る。

【0064】

典型的には、成熟樹状細胞は、以下のステップ：ｉ）単球の提供と；ｉｉ）ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーションと；ｉｉｉ）成熟化カクテルとの組み合わせにおけるＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーションとを含む方法によって作製され得る。

【0065】

成熟化カクテルは、ＩＬ－β、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニスト、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される成分の少なくとも１つを含み得る。ＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８またはＣＬ０７５であり得る。ＴＬＲ３アゴニストは、ポリ（Ｉ：Ｃ）であり得る。特定の実施形態において、成熟化カクテルは、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、およびプロスタグランジンＥ２の組み合わせを含み得る。ＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８またはＣＬ０７５であり得る。好ましくは、ＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８である。

【0066】

成熟化カクテルは、１～５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、１～５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β、５００～１０，０００Ｕ／ｍｌのＩＮＦγ、０．２～５μｇ／ｍｌのＴＬＲ７／８アゴニスト、および５０～５，０００ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２ＰＧ、ならびに場合により１０～５０ｎｇ／ｍｌのＴＬＲ３アゴニストを含み得；より好ましくは、カクテルは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β、５，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ、１ｕｇ／ｍｌのＲ８４８、および２５０ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２を含み得る。

【0067】

ステップｉｉ）のインキュベーションは、３日間継続し得る。ステップｉｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも２４時間継続し得る。

【0068】

あるいは、Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテルも使用することができる。Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテルは、Jonuleitらに記載されており、ＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、およびプロスタグランジンＥ２を含む。特に、Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテルは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β、１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、および１０００ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２を含む。

【0069】

樹状細胞は、ドナー由来抗原提示細胞、例えば、樹状細胞へと成熟された単離された単球であり得る。成熟樹状細胞は、本発明の方法によって最適に刺激することができる。

【0070】

典型的には、樹状細胞は、自己細胞、すなわち、本発明の教示に従って治療される患者から得られ、同じ患者に再投与される、細胞である。例えば、単球は、患者から単離され、樹状細胞へと成熟され、所望の抗原を発現するように、本明細書において説明されるように処理され、次いで、同じ患者に投与される。

【0071】

当業者は、樹状細胞のための成熟化プロトコルを承知している。急性骨髄性白血病の免疫療法のために使用される樹状細胞の成熟化は、Subkleweらに開示されており、Burdekらには、樹状細胞のための３日成熟化プロトコルについて記載されている。

【0072】

単球は、例えば、末梢血単核細胞であり得る。

【0073】

本発明の別の態様は、樹状細胞を刺激する方法であって、
ａ）樹状細胞を提供するステップと、
ｂ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストで樹状細胞を刺激するステップと
を含む方法に関する。

【0074】

本発明の別の態様は、
・ＴＬＲ７／８アゴニスト、
・可溶性ＣＤ４０Ｌ、
・ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質、
・ＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質、
・ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質、および
・ＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質
を含むキットに関する。

【0075】

マーカータンパク質（ＩＬ－１２またはＩＬ－１０のどちらか）に対して特異的な二次結合性タンパク質は、マーカータンパク質と一次結合性タンパク質との複合体に結合し得るか、または（一次結合性タンパク質との相互作用なしに）一次結合性タンパク質に単独で結合し得る。

【0076】

例えば、キットは、以下の成分：
（ｉ）ＴＬＲ７／８アゴニストおよびＣＤ４０Ｌを含む組成物、
（ｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質を含む組成物、ならびに
（ｉｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質を含む組成物
を含み得る。

【0077】

一次結合性タンパク質は、好ましくは抗体であり得、および／または二次結合性タンパク質は、抗体である。典型的には、ＴＬＲ７／８アゴニストは、Ｒ８４８である。

【0078】

用語「結合性タンパク質」は、抗体だけでなく、それらの結合性断片も包含するが、他の分子、例えば、非抗体タンパク質骨格タンパク質（non-antibody protein scaffold protein）およびアプタマーなども包含する。

【0079】

抗体は、それらの重鎖に基づいて５つの主要なクラス、ＩｇＭ（μ）抗体、ＩｇＤ（δ）抗体、ＩｇＧ（ｙ）抗体、ＩｇＡ（α）抗体、およびＩｇＥ（ε）抗体に分類することができ、ＩｇＧ抗体は、最も大きな割合を構成する。その上、免疫グロブリンは、それらの軽鎖に基づいて、アイソタイプκおよびλに分類することができる。

【0080】

実験
ＭＤＧカクテルまたはＪｏｎｕｌｅｉｔカクテルを用いて成熟化され、ＣＤ４０Ｌ単独で、ならびにＲ８４８／ＩＦＮγおよびＬＰＳと組み合わせて刺激された樹状細胞
単球を、付着性単離によって単離した後、ＩＬ－４およびＧＭＳＣＦを使用して３日間かけて樹状細胞を発生させた。その後、樹状細胞を、ＭＤＧカクテルとＩＬ－４およびＧＭＣＳＦとを用いて、２４時間かけて成熟させた。Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテルの場合は、細胞を、ＩＬ－４およびＧＭＳＣＦを使用して、６日間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテル（ならびにＩＬ－４およびＧＭＣＳＦ）を使用して、２４時間インキュベートした。全てのアッセイに対して、凍結した樹状細胞を、アッセイの前日に解凍して、アッセイを開始するまでＤＣ培地においてインキュベートして使用した。刺激は、９６ウェルプレートにおいて２４時間行われる。したがって、ウェルあたり１１，０００の樹状細胞を播種した。１１０μｌのＤＣ培地（１．５％ヒト血清を伴うＶＬＥＲＰＭＩ１６４０）中における１．１μｌのＣＤ４０Ｌ、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、およびＲ８４８を加えた。

【0081】

Ｅｌｉｓａアッセイを、それぞれ、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ－Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ミネアポリス、ＵＳＡ）のヒトＩＬ－１０、ＩＬ１２ｐ７０のプロトコルに従って実施した。

【0082】

ＩＬ－１０／ＩＬ－１２Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
ＩＬ－１０／ＩＬ－１２Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを、（Ｃ．Ｔ．Ｌ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、クリーブランド、ＵＳＡ）のヒトＩＬ－１０／ＩＬ－１２Ｄｏｕｂｌｅ－Ｃｏｌｏｒ ＥＬＩＳＰＯＴキットのプロトコルに従って実施した。

【0083】

Ｊｏｎｕｌｅｉｔカクテル
１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１γ、１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、および１，０００ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２（＝ＰＧＥ２）

【0084】

ＭＤＧカクテル
１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－α、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β、５，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ、１μｇ／ｍｌのＲ８４８、および２５０ｎｇ／ｍｌプロスタグランジンＥ２
なお、本発明は、以下の態様をも含むものである。
＜１＞ 樹状細胞の効力を決定する方法であって、
（ａ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストとのインキュベーションによって樹状細胞を刺激するステップと、
（ｂ）（ａ）の前記樹状細胞からのマーカータンパク質ＩＬ－１０およびＩＬ－１２の分泌を測定するステップと
を含む方法。
＜２＞ 前記測定が、単一細胞レベルにおいて行われる、上記１に記載の方法。
＜３＞ 前記ＴＬＲ７／８アゴニストが、４－アミノ－２－エトキシメチル－α，α－ジメチル－１Ｈ－イミダゾール［４，５－ｃ］キノリン－１－エタノール（Ｒ８４８）である、上記１または２に記載の方法。
＜４＞ さらに、
（ｃ）ＩＬ－１２およびＩＬ－１０の分泌プロファイルに基づく前記樹状細胞の効力の分類のステップを含む、上記１から３のいずれかに記載の方法。
＜５＞ １を超える、ＩＬ－１０分泌に対するＩＬ－１２分泌の比率を示す樹状細胞が、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する高い能力を有する樹状細胞として分類される、上記１から４のいずれかに記載の方法。
＜６＞ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、高いＣＤ８０発現レベル、高いＣＤ８６発現レベル、低いＣＤ１４発現レベル、および低いＢ７Ｈ１発現レベルの表現型を有する、上記５に記載の方法。
＜７＞ Ｔ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、Ｔ細胞を、Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型へと極性化する、上記５または６に記載の方法。
＜８＞ 前記Ｔｈ１／Ｔｃ１表現型が、前記Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌と、全くないかまたは低いＩＬ－４の発現とによって特徴付けられる、上記７に記載の方法。
＜９＞ ＮＫ細胞を活性化する高い能力を有する前記樹状細胞が、ＮＫ細胞を活性化して、高レベルのＣＤ６９を発現させ、ＩＦＮγを分泌させる、上記５から８に記載の方法。
＜１０＞ ステップ（ｂ）が、
ｉ）ＩＬ－１０に対する一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質と共に前記樹状細胞をインキュベートするステップと、
ｉｉ）前記一次結合性タンパク質への前記マーカータンパク質の結合を、二次結合性タンパク質によって検出するステップと
を含む、上記１から９のいずれかに記載の方法。
＜１１＞ 前記刺激が、前記樹状細胞への可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの結合によってのみ生じる、上記１から１０のいずれかに記載の方法。
＜１２＞ ＣＤ４０Ｌが、細胞株によって前記樹状細胞に提示されない、上記１から１１のいずれかに記載の方法。
＜１３＞ 前記樹状細胞が、異なる細胞株と共培養されない、上記１から１２のいずれかに記載の方法。
＜１４＞ 放射線照射ステップが適用されない、上記１から１３のいずれかに記載の方法。
＜１５＞ ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対して特異的な前記一次結合性タンパク質が、担体上に固定化される、上記１０から１４に記載の方法。
＜１６＞ 前記担体が、ＩＬ－１０およびＩＬ－１２に対する前記一次結合性タンパク質で一様にコーティングされる、上記１５に記載の方法。
＜１７＞ 前記担体が、マルチウェルプレートである、上記１５または１６に記載の方法。
＜１８＞ 前記一次結合性タンパク質が抗体である、上記１０から１７のいずれかに記載の方法。
＜１９＞ 前記二次結合性タンパク質が抗体である、上記１０から１８のいずれかに記載の方法。
＜２０＞ 前記二次結合性タンパク質が蛍光標識される、上記１０から１９に記載の方法。
＜２１＞ 前記樹状細胞が、成熟させた樹状細胞である、上記１から２０のいずれかに記載の方法。
＜２２＞ 前記樹状細胞の前記成熟化が、成熟化カクテルとのインキュベーションによって行われる、上記２１に記載の方法。
＜２３＞ 樹状細胞を刺激する方法であって、
ａ）樹状細胞を提供するステップと、
ｂ）可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストで前記樹状細胞を刺激するステップとを含む方法。
＜２４＞ 樹状細胞を刺激するための可溶性ＣＤ４０ＬおよびＴＬＲ７／８アゴニストの使用。
＜２５＞ ＴＬＲ７／８アゴニスト、
可溶性ＣＤ４０Ｌ、
ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質、
ＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質、
ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質、および
ＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質
を含むキット。
＜２６＞ （ｉ）ＴＬＲ７／８アゴニストおよびＣＤ４０Ｌを含む組成物、
（ｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な一次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な一次結合性タンパク質を含む組成物、ならびに
（ｉｉｉ）ＩＬ－１０に対して特異的な二次結合性タンパク質およびＩＬ－１２に対して特異的な二次結合性タンパク質を含む組成物
を含む、上記２５に記載のキット。
＜２７＞ 前記一次結合性タンパク質が抗体であり、および／または前記二次結合性タンパク質が抗体である、上記２５または２６に記載のキット。
＜２８＞ 前記ＴＬＲ７／８アゴニストがＲ８４８である、上記２３に記載の方法、上記２４に記載の使用、上記２５から２７に記載のキット。

【0085】

参考文献

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】