(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-14
(45)【発行日】2022-10-24
(54)【発明の名称】乳酸菌由来の細胞外ベシクルを含む免疫調節用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20221017BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20221017BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20221017BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20221017BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20221017BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221017BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20221017BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20221017BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20221017BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
A23L33/135
A61K8/99
A61K35/74 G
A61P17/02
A61P29/00
A61P37/06
A61Q19/00
C12N1/20 E
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020521584
(86)(22)【出願日】2018-10-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-01-14
(86)【国際出願番号】 KR2018011787
(87)【国際公開番号】W WO2019088478
(87)【国際公開日】2019-05-09
【審査請求日】2021-08-04
(31)【優先権主張番号】10-2017-0143640
(32)【優先日】2017-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCCM KCCM11179P
(73)【特許権者】
【識別番号】506213681
【氏名又は名称】アモーレパシフィック コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１００， Ｈａｎｇａｎｇ－ｄａｅｒｏ， Ｙｏｎｇｓａｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000556
【氏名又は名称】特許業務法人 有古特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョ， ウン ギョン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ワン イル
(72)【発明者】
【氏名】イ， テ リョン
【審査官】原口 美和
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１４４１３９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１４－５１６５６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】BMC Microbiology，2017年，Vol. 17, No. 66，pp. 1-8
【文献】The FASEB Journal，2015年，Vol. 29，pp. 684-695
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／７４７
Ａ２３Ｌ ３３／１３５
Ａ６１Ｋ ８／９９
Ａ６１Ｋ ３５／７４
Ａ６１Ｐ １７／０２
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ａ６１Ｑ １９／００
Ｃ１２Ｎ １／２０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含み、
Ｍ２型大食細胞への分化を誘導し、
Ｍ１型大食細胞への分化を抑制し、
前記乳酸菌は、寄託番号がＫＣＣＭ１１１７９Ｐであるラクトバチルス・プランタルムＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１である、
免疫調節用組成物。
【請求項2】
前記細胞外ベシクルは、エクソソームである、請求項１に記載の免疫調節用組成物。
【請求項3】
前記細胞外ベシクルは、２０～２００ｎｍの直径を有する、請求項１又は２に記載の免疫調節用組成物。
【請求項4】
当該組成物は、Ｍ２型大食細胞分化マーカーであるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＶＥＧＦＡからなる群より選択される１以上の発現を増加させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項5】
当該組成物は、Ｍ１型大食細胞分化マーカーであるＣＣＲ２、ＳＯＣＳ３、及びＨＬＡ－ＤＲαからなる群より選択される１以上の発現を低減させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項6】
当該組成物は、化粧料組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫調節用組成物。
【請求項7】
当該組成物は、食品組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の免疫調節用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書では乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む免疫調節用組成物が開示される。
【背景技術】
【0002】
ほとんどの動物細胞は、多様な大きさと成分を有する細胞内起源の細胞外ベシクル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌できる能力を持っており、このような細胞外ベシクルは、血液、小便、唾液、及び細胞培養液を含むすべての生物学的流体（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ）から発見される。原核細胞または真核細胞も細胞外ベシクルを分泌するものと知られている。
【0003】
細胞外ベシクルは、小さくは直径約２０ｎｍから大きくは直径約５μｍの大きさを有する膜構造小胞体であって、その大きさと構成において異質性があり、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ、約２０～１００ｎｍ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）、マイクロ小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ、約１００～１,０００ｎｍ）、マイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、アポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ、約１～５μｍ）などの多数の相違する種を含む。
【0004】
前記細胞外ベシクルの相違する類型は、その起源、直径、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）での密度、形状、沈降速度、脂質組成物、タンパク質マーカー又は分泌方式（すなわち、シグナル（誘導性）によるものか、自発的（構成的）なものであるのか）などに基づいて区別される。例えば、マイクロ小胞は、約１００～１,０００ｎｍの不規則な形状を有する膜小胞であって円形質膜の外方に向けて出芽（円形質膜から起源）され、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０リガンドなどを含むマーカー、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を有するものと知られている。一方、エクソソームは、約２０～１００ｎｍ（＜２００ｎｍ）のカップ形状を有する最も小さい膜小胞であって、後期エンドソームの内方から出芽（エンドソームから起源）され、一般的に、ＣＤ６３、ＣＤ９のテトラスパニン、ＴＳＧ１０１、ＥＳＣＲＴを含むマーカー、コレステロール、スフィンゴミエリン、セラマイド、ホスファチジルセリンを含む脂質を有するものと知られている。
【0005】
このような細胞外ベシクルは、分泌する起源細胞（ドナー細胞）の状態を反映し、どのような細胞から分泌したものであるかに応じて種々の生物学的活性を示し、細胞間で遺伝物質やタンパク質を移しながら細胞間コミュニケーション（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）に重要な役割を果たす。
【0006】
一方、人体に有益な代表的な微生物である乳酸菌は、ブドウ糖又は乳糖のような糖を分解して乳酸や酢酸のような有機酸を生成する菌である。乳酸菌は、糖から有機酸を作り出す発酵過程を経て発酵乳、チーズ、バターのような発酵食品を製造するのに用いられているが、乳酸菌由来の複合生理活性物質である細胞外ベシクルの免疫調節効能については開示されたことがない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１７－０１０９８２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
一側面において、本明細書は、乳酸菌由来の複合生理活性物質である細胞外ベシクルを有効成分として含む免疫調節用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
一側面において、本明細書は、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む免疫調節用組成物を提供する。
【0010】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株であってよい。
【0011】
例示的な一具現例において、前記ラクトバチルス属の菌株は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であってよい。
【0012】
例示的な一具現例において、前記ラクトバチルス・プランタルムは、寄託番号がＫＣＣＭ１１１７９Ｐであるラクトバチルス・プランタルムＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１であってよい。
【0013】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、エクソソームであってよい。
【0014】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、２０～２００ｎｍの直径を有するものであってよい。
【0015】
例示的な一具現例において、当該組成物は、Ｍ２類型大食細胞への分化を誘導するものであってよい。
【0016】
例示的な一具現例において、当該組成物は、Ｍ２型大食細胞分化マーカーであるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＶＥＧＦＡからなる群より選択される１以上の発現を増加させるものであってよい。
【0017】
例示的な一具現例において、当該組成物は、Ｍ１型大食細胞分化マーカーであるＣＣＲ２、ＳＯＣＳ３、及びＨＬＡ－ＤＲαからなる群より選択される１以上の発現を低減させるものであってよい。
【0018】
例示的な一具現例において、当該組成物は、化粧料組成物であってよい。
【0019】
例示的な一具現例において、当該組成物は、食品組成物であってよい。
【発明の効果】
【0020】
一側面において、本明細書に開示された技術は、乳酸菌由来の複合生理活性物質である細胞外ベシクルを有効成分として含む免疫調節用組成物を提供する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】本明細書の一実施例で乳酸菌から細胞外ベシクルを分離する過程を段階毎に示した図である。
【図2a】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルの透過電子顕微鏡の撮像結果を示した図である。
【図2b】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルの大きさの測定結果を示した図である。
【図3】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルを皮膚線維芽細胞に処理した後に細胞増殖及び細胞毒性に及ぼす影響を測定した結果を示した図である（**；ｐ＜０．０１）。
【図4】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルが未分化大食細胞に及ぼす影響を確認した結果を示した図である。
【図5】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルが未分化大食細胞に及ぼす影響を確認した結果を示した図である。
【図6】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルがＭ１型大食細胞マーカーの発現量に及ぼす影響を確認した結果を示した図である。
【図7】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルと乳酸菌細胞が兔疫細胞に及ぼす影響を比較した結果を示した図である。
【図8】本明細書の一試験例による乳酸菌由来の細胞外ベシクルと乳酸菌細胞が細胞毒性に及ぼす影響を比較した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、本発明について詳しく説明する。
【0023】
一側面において、本明細書は、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む免疫調節用組成物を提供する。
【0024】
他の側面において、本明細書は、免疫調節に有効な量の乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、これを必要とする対象に適用することを含む免疫調節方法を提供する。
【0025】
他の側面において、本明細書は、対象の免疫調節のための乳酸菌由来の細胞外ベシクルを提供する。
【0026】
他の側面において、本明細書は、対象の免疫調節のための乳酸菌由来の細胞外ベシクルの非治療的用途を提供する。
【0027】
他の側面において、本明細書は、免疫調節用組成物を製造するための乳酸菌由来の細胞外ベシクルの用途を提供する。
【0028】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、組成物、例えば、化粧料組成物、薬学組成物又は食品組成物の形態で対象に適用し、又は投与し、又は塗布するものであってよい。
【0029】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、対象の皮膚に適用するものであってよい。
【0030】
例示的な一具現例において、前記免疫調節は、Ｍ２型大食細胞の数を増加させ、且つＭ１型大食細胞の数を低減させることであってよい。
【0031】
本明細書において「有効成分」とは、単独で目的とする活性を示す、又はそれ自体は活性のない担体などと共に用いられて目的とする活性を示し得る、成分のことを意味する。
【0032】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌は、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株であってよい。
【0033】
例示的な一具現例において、前記ラクトバチルス属の菌株は、免疫調節効能及びエクソソームを含む細胞外ベシクルの収率増加の面から、好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）であってよい。ラクトバチルス・プランタルムは、優れた免疫調節効能及びエクソソーム収得効率を提供する効果がある。
【0034】
例示的な一具現例において、前記ラクトバチルス・プランタルムは、寄託番号がＫＣＣＭ１１１７９Ｐであるラクトバチルス・プランタルムＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１であってよい。
【0035】
本明細書において「細胞外ベシクル」とは、細胞から分泌して細胞外の空間に放出されたベジクルのことを意味し、脂質二重膜によって内部と外部とが仕切られた膜構造小胞体を意味する。細胞外ベシクルは、細胞膜脂質（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ）と細胞膜タンパク質（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、細胞質成分などを有していて細胞の性質や状態を間接的に把握できるようにし、他の細胞又は組織に結合して膜構成要素、ｍＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓ、タンパク質（成長ホルモン、サイトカインなど）などを伝達し、これらの伝達物質を受容細胞に伝達することで細胞間コミュニケーションを媒介する細胞外伝達体として作用する。
【0036】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、乳酸菌培養液から分離したものであってよい。
【0037】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、乳酸菌培養液の１００,０００ｘｇ以上、具体的に、１００,０００～２００,０００ｘｇ、又は１００,０００～１５０,０００ｘｇ、又は１５０,０００～２００,０００ｘｇの超遠心分離で沈降するものであってよい。
【0038】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、２０～５００ｎｍの直径を有するものであってよい。他の側面において、前記細胞外ベシクルは、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、又は１００ｎｍ以上、且つ、５００ｎｍ以下、４５０ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３５０ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、又は１００ｎｍ以下の直径を有するものであってよい。
【0039】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、２０～２００ｎｍの直径を有するものであってよい。
【0040】
例示的な一具現例において、前記直径は平均直径を意味することであってよい。
【0041】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、エクソソームであってよい。
【0042】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、例えば、標的細胞で所望の機能を効率的に遂行できるように膜成分が化学的又は物理的に変形されたものであってよい。例えば、細胞外ベシクルの膜成分がチオール基（－ＳＨ）又はアミン基（－ＮＨ２）を用いて化学的な方法にて変形され、又は細胞外ベシクルに標的誘導物質、細胞膜融合物質、ポリエチレングリコールを化学的に結合させて膜成分が化学的に変形されたものであってよい。
【0043】
例示的な一具現例において、前記細胞外ベシクルは、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、分画遠心分離（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、等密度遠心分離（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）、密度勾配（ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、ろ過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）、及びフリーフロー電気泳動（ｆｒｅｅ－ｆｌｏｗ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）からなる群より選択される一つ以上の方法を用いて分離することができるが、細胞外ベシクルの分離方法がこれらに制限されるものではない。
【0044】
密度勾配は、密度の異なる物質を分離するときに最も多用される方法であって、該方法の具体的な例としては、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、塩化セシウム（ｃｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）などの密度勾配分離材料を用いて実施することができるが、これらに制限されるものではない。一側面において、密度勾配は、超遠心分離などとともに用いられてよい。他の側面において、細胞外ベシクルを選別するためにゲルろ過（ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いることができる。また他の側面において、サイズの小さい分子を除去するために、ろ過に代えて透析を用いることができる。また他の側面において、フリーフロー電気泳動を用いることができる。
【0045】
例示的な一具現例において、（１）乳酸菌培養液を遠心分離して上澄液を収得する段階；（２）前記収得された上澄液をろ過する段階；及び（３）前記収得されたろ過物を超遠心分離して沈殿物を収得する段階;を含んで有効な活性を示す前記乳酸菌由来の細胞外ベシクルを製造することができる。
【0046】
例示的な一具現例において、前記段階（１）における遠心分離は、１,０００～２０,０００ｘｇ、又は１,５００～２０,０００ｘｇ、又は１,５００～１５,０００ｘｇ、又は１,５００～１０,０００ｘｇで３０～６０分間実施してよい。このとき、前記遠心分離は、速度又は時間を変化させて段階的に実施してもよい。例えば、１,５００～２,０００ｘｇで低速にて遠心分離して培養液から乳酸菌の菌株を分離及び除去し、細胞と上澄培養液とを分離した後、１０,０００～２０,０００ｘｇで高速にて遠心分離して、さらに細胞又は細胞関連残骸及び残余物などを除去してよい。
【0047】
例示的な一具現例において、前記段階（２）におけるろ過は、０．３～０．５μｍの大きさのフィルタで行なってよい。前記ろ過工程を通じて遠心分離された培養液の純度を高めることができる。
【0048】
例示的な一具現例において、前記段階（３）における超遠心分離は、１００,０００ｘｇ以上、具体的に、１００,０００～２００,０００ｘｇ、又は１００,０００～１５０,０００ｘｇ、又は１５０,０００～２００,０００ｘｇで１～５時間実施してよい。
【0049】
例示的な一具現例において、前記段階（３）の後、（４）前記収得された沈殿物を懸濁する段階をさらに含んでよい。
【0050】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクル、又はこれを含む組成物は、Ｍ２型大食細胞への分化を誘導するものであってよい。Ｍ２型大食細胞は、新しい血管を作って傷を復旧し且つ組織を再構成する役割を果たす。よって、本明細書に係る乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含む組成物は、皮膚再生効果を有するものであってよい。
【0051】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクル、又はこれを含む組成物は、対象体においてＭ２型大食細胞の数を増加させるものであってよい。
【0052】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクル、又はこれを含む組成物は、対象体においてＭ１型大食細胞の数を低減させるものであってよい。
【0053】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクル、又はこれを含む組成物は、Ｍ２型大食細胞分化マーカーであるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、及びＶＥＧＦＡからなる群より選択される１以上の発現を増加させるものであってよい。
【0054】
例示的な一具現例において、前記乳酸菌由来の細胞外ベシクル、又はこれを含む組成物は、Ｍ１型大食細胞分化マーカーであるＣＣＲ２、ＳＯＣＳ３、及びＨＬＡ－ＤＲαからなる群より選択される１以上の発現を低減させるものであってよい。
【0055】
例示的な一具現例において、当該組成物は、凍結乾燥された剤形であってよい。前記組成物は、すぐに使える（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ように封止された包装材又は包装容器に入れられた凍結乾燥された剤形であってよい。
【0056】
他の側面において、本明細書は、乳酸菌由来の細胞外ベシクルを有効成分として含み、凍結乾燥された剤形を有する組成物；及び滅菌水又は精製水を含む免疫調節用キットを提供する。前記キットは、すぐに使える（ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ように封止された包装材又は包装容器に入れられたものであってよい。
【0057】
例示的な一具現例において、当該組成物は、化粧料組成物であってよい。
【0058】
前記化粧料組成物には、有効成分の他、機能性添加物及び一般的な化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質及び海草エキスからなる群より選択された成分を含んでいてよい。その他含まれる配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【0059】
前記化粧料組成物は、その剤形が特に限定されず、目的とするところに応じて適宜選択すればよい。例えば、粉体、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、シャンプ、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、及びボディークレンザーからなる群より選択されたいずれか一つ以上の剤形で製造されてよいが、これらに制限されるものではない。
【0060】
本発明の剤形がペースト、クリーム、又はゲルの場合は、担体成分として、動物繊維、植物繊維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛などが用いられてよい。
【0061】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドパウダーが用いられてよく、特にスプレーである場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルのような推進剤を含んでいてよい。
【0062】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶媒和剤、又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１,３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【0063】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、又はプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、又はトラガカントなどが用いられてよい。
【0064】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシネートモノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられてよい。
【0065】
本発明の剤形が石鹸の場合は、担体成分として、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオネート、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖などが用いられてよい。
【0066】
例示的な一具現例によると、当該組成物は、薬学組成物であってよい。
【0067】
前記薬学組成物は、有効成分の他、防腐剤、安定化剤、水和剤又は乳化促進剤、浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、並びにその他治療的に有用な物質をさらに含有していてよく、通常的な方法に従い多様な経口投与剤又は非経口投与剤の形態で剤形化してよい。
【0068】
前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質及び軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがあり、これらの剤形は、有効成分の他、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及びグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、並びにポリエチレングリコール）を含有していてよい。錠剤は、さらに、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びポリビニルピロリジンといった結合剤を含有していてよく、場合に応じて、澱粉、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤などの薬剤学的添加剤を含有していてよい。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化又はコーティング方法によって製造されてよい。
【0069】
また、前記非経口投与の形態としては、経皮投与型剤形であってよく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってよいが、これらに制限されるものではない。
【0070】
前記有効成分の投与量の決定は、通常の技術者の水準内にあり、薬物の１日投与量は、投与しようとする対象の進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因に応じて異なり得るが、成人を基準としたとき、一側面において、前記組成物１μｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、他の一側面において、５０μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇを１日に１回～３回分けて投与してよく、前記投与量は、如何なる方法であっても本発明の範囲を限定するものではない。
【0071】
前記薬学組成物は皮膚外用剤であってよく、前記皮膚外用剤は、外皮に塗布されるものであればいずれも含み得る組成物の総称であって、多様な剤形の医薬品がこれに含まれ得る。
【0072】
例示的な一具現例によると、当該組成物は、食品組成物であってよい。
【0073】
前記食品組成物は、液状又は固体状態の剤形であってよく、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、又は飲料の形態で用いられてよい。各剤形の食品組成物は、有効成分の他、当該分野において通常的に用いられる成分を剤形又は使用目的に応じて当業者が困難なく適宜選定して配合してよく、他の原料と同時に適用した場合に相乗効果が奏されることがある。
【0074】
本明細書に開示された有効成分の他に含有し得る液体成分には特に制限点がなく、通常の飲料と同様、種々の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含んでいてよい。前記天然炭水化物の例としては、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類及びデキストリン、シクロデキストリンなどの通常的な糖及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールなどがある。前記香味剤としては、天然香味剤(例えば、ソーマチン、ステビア抽出物、レバウディオサイドＡ、グリチルリチンなど)及び合成香味剤(例えば、サッカリン、アスパルテームなど)を有利に使用してよい。前記天然炭水化物の割合は、本明細書に開示された組成物１００ｍｌ当たり一般的に約１～２０ｇ、一側面において、約５～１２ｇであってよい。
【0075】
前記食品組成物は、一側面において、種々の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含んでいてよい。他の側面において、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでいてよい。これらの成分は、独立して又は組み合わせて用いられてよい。前記添加剤の割合は種々であってよいが、本明細書に開示された組成物１００重量部当たり０．００１～約２０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【0076】
以下、実施例を通じて見た発明をより詳しく説明することにする。なお、これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【0077】
実施例１．乳酸菌由来の細胞外ベシクルの分離
本実施例では、乳酸菌としてラクトバチルス属の菌株を用い、これよりエクソソームを含む細胞外ベシクルを分離した。より具体的に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）ｓｔｒａｉｎを用いて乳酸菌由来の細胞外ベシクルを製造した。
本実施例では、乳酸菌としてラクトバチルス属の菌株を用い、これよりエクソソームを含む細胞外ベシクルを分離した。より具体的に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）ｓｔｒａｉｎを用いて乳酸菌由来の細胞外ベシクルを製造した。
【0078】
（段階１）培養したラクトバチルス属の菌株の培養液を、４℃、１,８００ｘｇで２０分間遠心分離して、培養液からラクトバチルス属の菌株を分離及び除去した。すなわち、低速の遠心分離工程を通じて細胞と培養上澄液とを分離した。
【0079】
（段階２）前記段階１で遠心分離された培養液を、高速遠心分離機を用いて４℃、１０,０００ｘｇで２０分間遠心分離して、更に細胞又は細胞関連の残骸及び残余物などを除去した。
【0080】
（段階３）前記段階２で遠心分離された培養液を、０．４５μｍのボトルトップフィルタに通してろ過することで、培養液の純度を増加させた。
【0081】
（段階４）前記段階３でろ過した培養液を、４℃、１５０,０００ｘｇで３時間超高速遠心分離して、エクソソームを含む細胞外ベシクルを分離した。
【0082】
（段階５）前記段階４で超高速遠心分離にて上澄液を除去して残ったエクソソームを含む細胞外ベシクルペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を、緩衝溶液（ＨＥＰＥＳバッファ）に再懸濁させた。
【0083】
（段階６）前記段階５で緩衝溶液に再懸濁させたエクソソームを含む細胞外ベシクル（ＥＶｓ）を－７０℃で保存し、それを下記の試験に用いた（図１参照）。
【0084】
比較例１．乳酸菌細胞の準備
前記実施例１で用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）ｓｔｒａｉｎを用いて乳酸菌細胞を準備し、下記の試験に用いた。すなわち、本比較例に係る乳酸菌細胞は、細胞外ベシクルの分離工程を経らない本来のままの細胞全体を意味する。
前記実施例１で用いたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＰｓｕｌｌｏｃ ３３１２６１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＣＣＭ１１１７９Ｐ）ｓｔｒａｉｎを用いて乳酸菌細胞を準備し、下記の試験に用いた。すなわち、本比較例に係る乳酸菌細胞は、細胞外ベシクルの分離工程を経らない本来のままの細胞全体を意味する。
【0085】
試験例１．乳酸菌由来の細胞外ベシクル（ＬＥＶｓ）の確認
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）とＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）でその形態や大きさを分析した結果、略球形をなし、直径が約２０～２００ｎｍであることを確認した（図２ａ及び２ｂ参照）。ＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）値は異質性指数を示すものであって、分離された細胞外ベシクルは比較的に安定しており且つ同質の分散状態を有することを確認した。分離された細胞外ベシクルの平均直径は、約５０～６０ｎｍ、より具体的に、５５．４６ｎｍであると示された。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、透過電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）とＤＬＳ（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）でその形態や大きさを分析した結果、略球形をなし、直径が約２０～２００ｎｍであることを確認した（図２ａ及び２ｂ参照）。ＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）値は異質性指数を示すものであって、分離された細胞外ベシクルは比較的に安定しており且つ同質の分散状態を有することを確認した。分離された細胞外ベシクルの平均直径は、約５０～６０ｎｍ、より具体的に、５５．４６ｎｍであると示された。
【0086】
試験例２．細胞増殖及び細胞毒性に及ぼす影響
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクル（０．１～１０μｇ／ｍｌ）をヒト線維芽細胞（Ｈｓ６８）に処理して、細胞増殖及び細胞毒性に及ぼす影響を確認した。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクル（０．１～１０μｇ／ｍｌ）をヒト線維芽細胞（Ｈｓ６８）に処理して、細胞増殖及び細胞毒性に及ぼす影響を確認した。
【0087】
具体的に、ヒト線維芽細胞Ｈｓ６８をＣＯ２培養器で培養し、前記実施例１で乳酸菌から分離された細胞外ベシクル０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌを処理した後、４８時間ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ条件で培養した。陽性対照群には、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－βを処理した。次いで、５％ ＣＣＫ－８溶液が入っている培地に取り替えた後、２時間更に培養し、最終的に４５０ｎｍ波長における吸光度を測定し、細胞増殖及び細胞毒性を対照群と比較して算定した。
【0088】
その結果、図３に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、細胞増殖に影響を及ぼさず且つ細胞毒性がなくて安全であることを確認した。
【0089】
試験例３．未分化大食細胞に及ぼす影響１
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、未分化ヒト大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ１）に処理し、また、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）で分化を誘導して、大食細胞分化マーカーの発現を確認した。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、未分化ヒト大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ１）に処理し、また、ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）で分化を誘導して、大食細胞分化マーカーの発現を確認した。
【0090】
具体的に、ＴＨＰ１細胞に４８時間にかけて１０μｇ／ｍｌ ＥＶと２０ｎＭ ＰＭＡとを同時に或いは個別処理した後、細胞を回収してＲＮＡを精製しｃＤＮＡを合成した。１００ｎｇのＲＮＡから由来のｃＤＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ分析に用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子で結果値を補正した。
【0091】
その結果、図４に示すように、分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、強力な分化誘導剤であるＰＭＡのない状態でも大食細胞分化マーカーであるＣＤ１４、ＩＣＡＭ－１の発現をＰＭＡ処理条件と類似の程度に誘導し、且つＭ１のマーカーであるＣＣＲ２の発現を低減させ、ＰＭＡとの同時処理時にシナジー効果を奏した。すなわち、分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、ＰＭＡを代替し得る程度に効果的に大食細胞の分化を誘導した。
【0092】
試験例４．未分化大食細胞に及ぼす影響２
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、未分化ヒト大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ１）に処理して、大食細胞の分化様相を確認した。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを、未分化ヒト大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ１）に処理して、大食細胞の分化様相を確認した。
【0093】
具体的に、先ず、未分化ヒト大食細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ＴＨＰ１）に２０ｎＭ ＰＭＡを４８時間にかけて前処理した。１０μｇ／ｍｌ ＥＶ或いはＭ１、Ｍ２のそれぞれの分化誘導のためのサイトカイン類を更に４８時間にかけて処理した後、Ｍ１とＭ２のそれぞれの代表的な遺伝子発現を比較した。Ｍ１分化誘導のためには、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ－ｇａｍｍａと１０ｐｇ／ｍｌ ＬＰＳを処理し、Ｍ２分化誘導のためには、２０ｎｇ／ｍｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、#２０４－ＩＬ）と２０ｎｇ／ｍｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １３（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、#２１３－ＩＬＢ）を用いた。次いで、各細胞を回収してＲＮＡを精製した後、ｃＤＮＡを合成した。１００ｎｇのＲＮＡから由来のｃＤＮＡがｑＲＴ－ＰＣＲ分析に用いられ、ＧＡＰＤＨ遺伝子で結果値を補正した。
【0094】
その結果、図５に示すように、分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを未分化ヒト大食細胞に処理すると、組織損傷回復及び再構成能力のあるＭ２型のマーカーであるＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＶＥＧＦＡの発現を誘導する反面、Ｍ１のマーカーであるＳＯＣＳ３、ＨＬＡ－ＤＲαの発現は低減させた。このことから、分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルはＭ２分化誘導効果を奏することが分かった。
【0095】
試験例５．Ｍ１型大食細胞に及ぼす影響
ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を用いてＭ１型に分化させた大食細胞に、前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを処理して、Ｍ１型大食細胞マーカーの発現量を確認した。
ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を用いてＭ１型に分化させた大食細胞に、前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルを処理して、Ｍ１型大食細胞マーカーの発現量を確認した。
【0096】
具体的に、先ず、未分化ヒト大食細胞に２０ｎＭ ＰＭＡを４８時間にかけて前処里した後、ＰＭＡがある条件（図６の左側グラフ）とない条件（図６の右側グラフ）で次の実験を行った。１０μｇ／ｍｌ ＥＶ或いはＭ１誘導性サイトカイン（２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ、１０ｐｇ／ｍｌ ＬＰＳ）を選択的に４８時間にかけて先に処理した後、次いで、それぞれＭ１分化誘導性サイトカイン或いはＥＶを４８時間にかけて処理してからサンプルを確保した。細胞を回収してＲＮＡを精製した後にｃＤＮＡを合成し、１００ｎｇのＲＮＡから由来のｃＤＮＡがｑＲＴ－ＰＣＲ分析に用いられ、ＧＡＰＤＨ遺伝子で結果値を補正した。ＥＶそれ自体の効果、Ｍ１分化誘導抑制効果、Ｍ１に分化された細胞の逆方向分化効果を分析した。図６の右側グラフは最初に処理したＰＭＡを除去し同じ実験を行った結果である。
【0097】
その結果、図６に示すように、二つの条件ともＭ１大食細胞のマーカーであるＨＬＡ－ＤＲ ａｌｐｈａの発現がＥＶの事前／事後処理によって低減することが確認できた。このことから、乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）を大食細胞に分化させることができ、それらのうち組織再生に寄与するＭ２型への分化を誘導し、分化済みのＭ１型も脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）させ得ることを確認した。
【0098】
試験例６．兔疫細胞に及ぼす影響の比較
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルと比較例１で準備した乳酸菌細胞とが兔疫細胞に及ぼす影響を比較した。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルと比較例１で準備した乳酸菌細胞とが兔疫細胞に及ぼす影響を比較した。
【0099】
具体的に、ＴＨＰ１細胞の活性に及ぼす影響を分析するために、同じ量の乳酸菌由来の細胞外ベシクルと乳酸菌を処理した。細胞を回収してＲＮＡを精製した後にｃＤＮＡを合成した。１００ｎｇのＲＮＡから由来のｃＤＮＡがｑＲＴ－ＰＣＲ分析に用いられ、ＧＡＰＤＨ遺伝子で結果値を補正した。
【0100】
その結果、図７に示すように、同じ量の乳酸菌由来の細胞外ベシクルが、乳酸菌細胞自体に比べ、兔疫細胞の分化関連遺伝子の発現を誘導し又は抑制する能力に優れ又は類似した結果を示した。
【0101】
試験例７．細胞毒性の比較
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルと比較例１で準備した乳酸菌細胞とが細胞毒性に及ぼす影響を比較した。
前記実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルと比較例１で準備した乳酸菌細胞とが細胞毒性に及ぼす影響を比較した。
【0102】
具体的に、ヒト線維芽細胞Ｈｓ６８を５％ ＣＯ２培養器で３７℃で培養し、実施例１で分離した乳酸菌由来の細胞外ベシクルと比較例１で準備した乳酸菌細胞とをそれぞれ１～２０μｇ／ｍｌで７２時間処理した。次いで、上澄液を回収してＬＤＨ活性を測定した。細胞毒性はＰｉｅｒｃｅ ＴＭ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてメーカの指示に従い測定した。
【0103】
その結果、図８に示すように、乳酸菌由来の細胞外ベシクルは、高い濃度で処理したときに、乳酸菌細胞だけを用いる場合に比べて細胞毒性を顕著に緩和させており、所定の濃度以上で処理したときに細胞毒性から細胞を保護する効果に優れることを確認した。
【0104】
以下、本明細書の一側面に係る組成物の剤形例について説明するが、他の種々の剤形への応用も可能であり、これは、本発明を限定するためのものではなく単に具体的に説明するためのものである。
【0105】
［剤形例１］軟膏
下記の表１に記載の組成に従い通常の方法にて軟膏を製造した。
下記の表１に記載の組成に従い通常の方法にて軟膏を製造した。
【0106】
【表1】
【0107】
［剤形例２］美容液型製剤
下記の表２に記載の組成に従い通常の方法にて美容液型製剤を製造した。
下記の表２に記載の組成に従い通常の方法にて美容液型製剤を製造した。
【0108】
【表2】
【0109】
［剤形例３］ローション
下記の表３に記載の組成に従い通常の方法にてローションを製造した。
下記の表３に記載の組成に従い通常の方法にてローションを製造した。
【0110】
【表3】
【0111】
［剤形例４］クリーム
下記の表４に記載の組成に従い通常の方法にてクリームを製造した。
下記の表４に記載の組成に従い通常の方法にてクリームを製造した。
【0112】
【表4】
【0113】
［剤形例５］パック
下記の表５に記載の組成に従い通常の方法にてパックを製造した。
下記の表５に記載の組成に従い通常の方法にてパックを製造した。
【0114】
【表5】
【0115】
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したがが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施態様であるに過ぎず、これらによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】