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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-17
(45)【発行日】2022-10-25
(54)【発明の名称】がんの治療のための組合せ調製物
(51)【国際特許分類】
   A61K 38/16 20060101AFI20221018BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20221018BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20221018BHJP
   A61K 47/68 20170101ALI20221018BHJP
   A61K 31/282 20060101ALI20221018BHJP
   A61K 31/4745 20060101ALI20221018BHJP
【FI】
A61K38/16 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K47/68
A61K31/282
A61K31/4745
【請求項の数】 19
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019163672
(22)【出願日】2019-09-09
(62)【分割の表示】P 2016559686の分割
【原出願日】2014-12-19
(65)【公開番号】P2019203035
(43)【公開日】2019-11-28
【審査請求日】2019-09-09
(31)【優先権主張番号】1322626.1
(32)【優先日】2013-12-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】516182063
【氏名又は名称】イムテップ エス.アー.エス.
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】フレデリック トリエベル
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】特表2010-540616(JP,A)
【文献】国際公開第2009/032256(WO,A1)
【文献】特開平05-009131(JP,A)
【文献】国際公開第2012/075679(WO,A1)
【文献】特開2013-126999(JP,A)
【文献】特許第6691054(JP,B2)
【文献】J Translational Med., 2010, Vol.8 No.71, p.1-11
【文献】Invest New Drugs., 2013 June, Vol.31 No.3, p.707-713
【文献】J Immunol., 2007, Vol.179, p.4202-4211
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
A61K 38/00
A61P 35/00
A61P 43/00
A61K 45/00
A61K 47/68
A61K 31/282
A61K 31/4745
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CAplus/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体を含む、がんを予防する、治療するまたは回復するための組成物であって、LAG-3タンパク質の該誘導体が、ヒトLAG-3タンパク質のドメインD1およびドメインD2と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、該組成物が、抗悪性腫瘍剤の前に、該抗悪性腫瘍剤と共に、該抗悪性腫瘍剤の後に、投与されることを特徴とし、該抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンである白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポテカンであるトポイソメラーゼI阻害剤である、組成物。
【請求項2】
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤の共投与または逐次投与のための、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、前記抗悪性腫瘍剤の後に投与されることを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項4】
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、互いに96時間以内に投与されることを特徴とする、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、LAG-3Ig融合タンパク質IMP321の0.25~30mgのモル当量である用量で存在する、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体の複数の用量を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記抗悪性腫瘍剤が、前記抗悪性腫瘍剤の複数の用量を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記LAG-3タンパク質の誘導体が、免疫グロブリンFc配列に融合されている、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記LAG-3タンパク質の誘導体が、ヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、D2、およびD3と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記LAG-3タンパク質の誘導体が、ヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、D2、D3、およびD4と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記LAG-3タンパク質の誘導体がIMP321である、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記LAG-3タンパク質の誘導体がIMP321であり、前記抗悪性腫瘍剤がオキサリプラチンである、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記LAG-3タンパク質の誘導体がIMP321であり、前記抗悪性腫瘍剤がカルボプラチンである、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
前記LAG-3タンパク質の誘導体がIMP321であり、前記抗悪性腫瘍剤がトポテカンである、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
医薬としての使用のための、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
がんを予防する、治療するまたは回復させることにおける使用のための、請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項18】
LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体を含む、がんを予防する、治療するまたは回復させることにおける使用のための組成物であって、該組成物が、抗悪性腫瘍剤と組み合わせて投与されることを特徴とし、LAG-3タンパク質の該誘導体が、ヒトLAG-3タンパク質のドメインD1およびドメインD2と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンである白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポテカンであるトポイソメラーゼI阻害剤である、組成物。
【請求項19】
がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における、LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体の使用であって、該医薬が、抗悪性腫瘍剤と組み合わせて投与されることを特徴とし、LAG-3タンパク質の該誘導体が、ヒトLAG-3タンパク質のドメインD1およびドメインD2と少なくとも90%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、該抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンである白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポテカンであるトポイソメラーゼI阻害剤である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組合せ調製物および医薬組成物、ならびに医薬としての、特にがんの治療のためのそれらの使用、ならびにがんの治療のための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは、標準化されたレジメンの一部として1つまたは複数の細胞傷害性抗悪性腫瘍薬(「化学療法剤」)で治療され得る。化学療法は、患者を治癒すること、または延命することまたは症状を軽減することを目的とし得る。
【0003】
従来の化学療法剤は、大部分のがん細胞の特性の1つを利用して、急速に分割している細胞を殺すことによって作用する。しかし化学療法は、通常の環境下で急速に分割する細胞、例えば骨髄、消化管および毛包の細胞にも害を与える。これは、化学療法の最も一般的な副作用:骨髄抑制(血液細胞の産生の減少、それにより免疫抑制も)、粘膜炎(消化管の内膜の炎症)および脱毛症(毛髪喪失)を生じさせる。
【0004】
より有効ながん治療を提供すること、および副作用が低減した有効ながん治療を提供することが必要である。
【0005】
リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)は、4個の細胞外Igスーパーファミリードメインを有するCD4ホモログI型膜タンパク質である。CD4と同様に、LAG-3はT細胞の表面でオリゴマー形成し、抗原提示細胞(APC)上のMHCクラスII分子に結合するがCD4よりも顕著に高い親和性を有する。LAG-3は、細胞表面でCD3-TCR複合体と会合する活性化CD4陽性およびCD8陽性Tリンパ球上に発現され、シグナル伝達を負に調節する。結果としてそれは、T細胞増殖、機能および恒常性を負に調節する。
【0006】
LAG-3由来可溶性融合タンパク質はCD4よりもはるかに高いアビディティーでMHCクラスII分子に結合し、MHCクラスII陽性マクロファージおよび未成熟樹状細胞がin vitroでT細胞応答を誘導する能力を増加させ、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞および腫瘍特異的細胞傷害性T細胞のin vitro誘導を増強することが示されている。したがってLAG-3融合タンパク質は、全身性免疫賦活薬としておよびがんワクチンのためのアジュバントとして使用される。
【0007】
WO 2009/044273は単球媒介免疫応答をブーストするため、特にがんの治療のための血液中の単球の数の増加を誘導するための組換えLAG-3タンパク質またはその誘導体の使用を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】国際公開第2009/044273号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
LAG-3タンパク質、またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体、および白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤の投与が、腫瘍成長を低減することに相乗効果を有することが、いまや驚くべきことに見出された。
【0010】
本発明により(a)LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体;および(b)白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である抗悪性腫瘍剤を含む、組合せ調製物が提供される。
【0011】
本明細書において使用される用語「組合せ調製物」は、上に規定される組合せ構成成分(a)および(b)が独立にまたは組合せ構成成分(a)および(b)の区別される量のさまざまな固定された組合せの使用によって投与され得るという意味で「キットオブパーツ」を指す。構成成分は、同時にまたは順々に投与されてよい。構成成分が順々に投与される場合、好ましくは投与間の時間間隔は、構成成分の併用の治療効果が組合せ構成成分(a)および(b)のいずれか1つだけの使用によって得られる効果よりも大きいように選択される。
【0012】
組合せ調製物の構成成分は、1つの組合せ単位剤形中に、または構成成分(a)の第1の単位剤形および構成成分(b)の別の第2の単位剤形として存在してよい。組合せ調製物中で投与される組合せ構成成分(a)と組合せ構成成分(b)との総量の比は、例えば、患者の特定の疾患、年齢、性別または体重に起因するものであり得る、治療される患者亜集団の要求または患者個人の要求に対処するために変えることができる。
【0013】
好ましくは少なくとも1つの有益な効果、例えば、抗悪性腫瘍剤の効果の増強、あるいは組合せ構成成分(a)および(b)の効果の相互増強、例えば、相加効果を上回る効果、追加的な有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、または組合せ構成成分(a)および(b)の1つもしくは両方の有効投与量と比較した併用治療効果、ならびに非常に好ましくは組合せ構成成分(a)および(b)の相乗作用がある。
【0014】
本発明の組合せ調製物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与のための医薬用組合せ調製物として提供され得る。LAG-3タンパク質またはその誘導体は、任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に提供されてよく、および/または抗悪性腫瘍剤は任意選択で薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に提供されてよい。
【0015】
LAG-3またはその誘導体は、LAG-3誘導体LAG-3Ig融合タンパク質IMP321の0.25~30mg、1~30mgまたは6~30mgのモル当量である用量で存在してよい。IMP321の皮下(s.c.)注射1回あたり6~30mgの用量は、安全であることが示されており、転移性腎細胞がん患者において得られた薬物動態データの結果に基づいて許容可能な全身性曝露を提供する。s.c.注射後少なくとも24時間1ng/mlを上回るIMP321の血液濃度が、6mgを超えるIMP321用量を注射された患者において得られる。
【0016】
本発明の組合せ調製物は、LAG-3タンパク質またはその誘導体の複数の用量を含む場合がある。
【0017】
抗悪性腫瘍剤の用量は、使用される特定の抗悪性腫瘍剤に依存する。
【0018】
白金ベースの抗悪性腫瘍剤は、がん化学療法において使用される白金の配位錯体である。それらはDNA修復および/またはDNA合成を阻害し、細胞死を生じさせるDNA中の架橋結合を形成すると考えられている。白金化合物を使用するがん治療の主な用量制限副作用は、抹消神経毒性である。白金ベースの抗悪性腫瘍剤の例は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチンおよびトリプラチンを含む。
【0019】
カルボプラチンまたはcis-ジアンミン(シクロブタン-1,1-ジカルボキシレート-O,O’)白金(II)(商品名ParaplatinおよびParaplatin-AQ)は、一部の形態のがんに対して使用される(主に卵巣癌、肺がん、頭頸部がんおよび子宮内膜、食道、膀胱、乳房および子宮頸部;中枢神経系腫瘍または生殖細胞腫瘍;骨肉腫、ならびに幹細胞移植または骨髄移植のための準備として)。それは、その親化合物シスプラチンと比較して大きく低減した副作用を有する。カルボプラチン投薬についての指針は、米国食品医薬品局(FDA)から利用可能である。
【0020】
オキサリプラチンまたは[(1R,2R)-シクロヘキサン-1,2-ジアミン](エタンジオエート-O,O’)白金(II)(商品名Eloxatin)は、平面正方形(square planar)白金(II)中心を含む。シスプラチンおよびカルボプラチンとは対照的に、オキサリプラチンは、2つの単座アミンリガンドの位置に二座リガンド1,2-ジアミノシクロヘキサンを含む。それは二座オキサレート基も有する。オキサリプラチンは、結腸癌に対する抗腫瘍活性を有する。オキサリプラチンは、DNA中に鎖間および鎖内の両方の架橋結合を形成することによって機能する。DNA中の架橋結合はDNA複製および転写を妨げ、細胞死を生じさせる。アジュバント設定におけるオキサリプラチンの推奨用量は、2週間ごとに12サイクル静脈内で反復される85mg/mである。転移性結腸直腸がんの治療におけるオキサリプラチンについての推奨用量は、疾患進行または容認できない毒性まで2週間ごとに静脈内で反復される85mg/mである。
【0021】
トポイソメラーゼ阻害剤は、通常の細胞周期の際にDNA鎖のリン酸ジエステル骨格の切断および再結合を触媒することによってDNA構造における変化を制御する酵素である、トポイソメラーゼ酵素(トポイソメラーゼIおよびII)の作用を妨害するように設計された薬剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、細胞周期のライゲーションステップを遮断し、ゲノムの完全性を害する1本鎖および2本鎖切断を生成すると考えられている。これらの切断の導入は続いてアポトーシスおよび細胞死を導く。
【0022】
ヒトDNAトポイソメラーゼI(Top1)は、複製および転写の際にDNA高次コイル構造をほどく不可欠な酵素である。Top1は、二重ヘリックス軸周囲での切断された鎖の回転を可能にするDNA1本鎖切断を生成する。Top1は、無傷の二重鎖DNAを再構築するために切断された鎖を再ライゲーションもする。切断複合体として知られているTop1-DNA中間体は、一過性であり、通常の環境下では低レベルで存在する。しかし、カンプトテシンなどのTop1阻害剤での治療は、切断可能な複合体を安定化し、DNA再ライゲーションを妨げ、致死性DNA鎖切断を誘導する。がん細胞は、これらのDNA損傷の生成に選択的に感受性である。
【0023】
トポテカン、または(S)-10-[(ジメチルアミノ)メチル]-4-エチル-4,9-ジヒドロキシ-1H-ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-3,14(4H,12H)-ジオンモノハイドロクロライド(商品名Hycamtin)は、トポイソメラーゼI阻害剤である化学療法剤である。それはカンプトテシンの水溶性誘導体である。それは、卵巣がんおよび肺がんならびに他のがんの種類を治療するために塩酸塩の形態で使用される。トポテカンはカンプトテシンの半合成誘導体である。カンプトテシンは、Camptotheca acuminataの木の樹皮から抽出される天然産生物である。トポイソメラーゼ-Iは、1本鎖切断を開くことによってDNA中のねじれひずみを解放する核酵素である。トポイソメラーゼ-Iが1本鎖切断を作り出すと、DNAは前進している複製フォークの前で回転できる。トポテカンはDNA塩基の間にインターカレートする。DNA複製機構が、トポテカンがインターカレートされている部位に達すると、このインターカレーションはDNA複製機構を破壊する。この破壊は、DNA複製を妨げ、最終的には細胞死を導く。哺乳動物細胞は、これらの二本鎖切断を効率的に修復できない。この工程は、DNA鎖中に切断をもたらし、アポトーシスを生じさせる。
【0024】
Hycamtinカプセル剤の推奨用量は、各コースの開始の間に3週間の間隔を含んで5日間連続で投与される2.3mg/m体表面積/日である。
【0025】
別のカンプトテシン誘導体イリノテカン(CPT11)は、結腸がんの治療のために承認されている。
【0026】
本発明の組合せ調製物は、抗悪性腫瘍剤の複数の用量を含んでよい。
【0027】
LAG-3タンパク質は、単離された天然または組換えLAG-3タンパク質であってよい。LAG-3タンパク質は、霊長類またはマウスLAG-3タンパク質などの任意の好適な種由来のLAG-3タンパク質のアミノ配列を含んでもよいが、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のアミノ配列である。ヒトおよびマウスLAG-3タンパク質のアミノ酸配列は、Huardら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、11巻:5744~5749頁、1997年)の図1に提供されている。ヒトLAG-3タンパク質の配列は、下の図13に反復されている(配列番号1)。ヒトLAG-3の4個の細胞外Igスーパーファミリードメイン(D1、D2、D3およびD4)のアミノ酸配列も、Huardらの図1のアミノ酸残基:1~149(D1);150~239(D2);240~330(D3);および331~412(D4)に同定されている。
【0028】
LAG-3タンパク質の誘導体は、MHCクラスII分子に結合できるLAG-3タンパク質の断片、バリアントまたは変異体を含む。LAG-3タンパク質のいくつかの誘導体は、MHCクラスII分子に結合できることが知られている。そのような誘導体の多数の例はHuardら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、11巻:5744~5749頁、1997年)に記載されている。この文書は、LAG-3タンパク質上のMHCクラスII結合部位の特徴付けを記載している。LAG-3の変異体を作るための方法ならびにクラスII陽性Daudi細胞に結合するLAG-3変異体の能力を決定するための定量的細胞接着アッセイが記載されている。LAG-3の一部の異なる変異体のMHCクラスII分子への結合が決定された。いくつかの変異は、クラスII結合を低減することができる一方で、他の変異はクラスII分子に対するLAG-3の親和性を増加させた。MHCクラスIIタンパク質に結合するために不可欠な残基の多くは、LAG-3 D1ドメイン中の大きな30アミノ酸エクストラループ(extra-loop)構造の塩基にクラスター化されている。ヒトLAG-3タンパク質のD1ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列は、図13中の下線付き配列であるGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY(配列番号2)である。
【0029】
LAG-3タンパク質誘導体は、ヒトLAG-3 D1ドメインの30アミノ酸エクストラループ配列、または1つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を含むそのような配列のバリアントを含んでよい。バリアントは、ヒトLAG-3 D1ドメインの30アミノ酸エクストラループ配列と少なくとも70%、80%、90%または95%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【0030】
LAG-3タンパク質の誘導体は、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1および任意選択でドメインD2のアミノ酸配列を含んでよい。
【0031】
LAG-3タンパク質の誘導体は、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1と、またはドメインD1およびD2と少なくとも70%、80%、90%または95%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【0032】
LAG-3タンパク質の誘導体は、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、D2、D3および任意選択でD4のアミノ酸配列を含んでよい。
【0033】
LAG-3タンパク質の誘導体は、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3のドメインD1、D2およびD3と、またはドメインD1、D2、D3およびD4と少なくとも70%、80%、90%または95%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。
【0034】
アミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアライメントを比較することによって決定され得る。比較される配列中の相当する位置が同じアミノ酸によって占められている場合、それにより分子はその位置で同一である。同一性の百分率としてのアライメントをスコアリングは、比較される配列によって共有される位置での同一のアミノ酸の数の関数である。配列を比較するときに、最適なアライメントは、配列中の可能性がある挿入および欠失を考慮に入れるために1つまたは複数の配列に導入されるギャップを必要とする場合がある。配列比較方法は、比較される配列中の同じ数の同一分子についてギャップペナルティーを用いる場合があり、可能な限り少ないギャップを含む配列アライメントは、2つの比較される配列間のより高い関連性を反映しており、多数のギャップを含むものよりも高いスコアを達成する。最大同一性パーセントの算出は、ギャップペナルティーを考慮に入れる最適なアライメントの作成を含む。
【0035】
配列比較を実行するために好適なコンピュータープログラムは、商業的におよび公共部門において広く入手可能である。例はMatGat(Campanellaら、2003年、BMC Bioinformatics 4巻:29頁;プログラムはhttp://bitincka.com/ledion/matgatから入手可能)、Gap(NeedlemanおよびWunsch、1970年、J. Mol. Biol. 48巻:443~453頁)、FASTA(Altschulら、1990年、J. Mol. Biol. 215巻:403~410頁;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/fastaから入手可能)、Clustal W 2.0およびX 2.0(Larkinら、2007年、Bioinformatics 23巻:
2947~2948頁;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2から入手可能)およびEMBOSS Pairwise Alignment Algorithms(NeedlemanおよびWunsch、1970年、上記; Kruskal、1983年、Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison、SankoffおよびKruskal(編)、1~44頁、Addison Wesley;プログラムはhttp://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/alignから入手可能)を含む。すべてのプログラムは初期パラメーターを使用して実行できる。
【0036】
例えば配列比較は、それらの長さ全体を考慮して百分率同一性スコアを提供する場合に、2つの配列の最適なアライメント(ギャップを含む)を決定するEMBOSS Pairwise Alignment Algorithmsの「ニードル」法を使用して行われてよい。アミノ酸配列比較についての初期パラメーター(「タンパク質分子」選択肢)は、ギャップ伸長ペナルティー:0.5、ギャップオープンペナルティー:10.0、マトリクス:Blosum 62であってよい。
【0037】
配列比較は、参照配列の全長にわたって実施されてよい。
【0038】
LAG-3タンパク質誘導体は、免疫グロブリンFcアミノ酸配列、好ましくはヒトIgG1 Fcアミノ酸配列に、任意選択でリンカーアミノ酸配列によって融合されてよい。
【0039】
MHCクラスII分子に結合するLAG-3タンパク質の誘導体の能力は、Huardら(上記)に記載の定量的細胞接着アッセイを使用して決定され得る。LAG-3タンパク質の誘導体のMHCクラスII分子への親和性は、ヒトLAG-3タンパク質のクラスII分子への親和性の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%であってよい。好ましくはLAG-3タンパク質の誘導体のMHCクラスII分子への親和性は、ヒトLAG-3タンパク質のクラスII分子への親和性の少なくとも50%である。
【0040】
MHCクラスII分子に結合できるLAG-3タンパク質の好適な誘導体の例は:
ヒトLAG-3配列のアミノ酸残基23から448;
LAG-3のドメインD1およびD2のアミノ酸配列;
次の位置:ARGがGLUで置換されている73位;ARGがALAまたはGLUで置換されている75位;ARGがGLUで置換されている76位;ASPがALAで置換されている30位;HISがALAで置換されている56位;TYRがPHEで置換されている77位;ARGがALAで置換されている88位;ARGがALAで置換されている103位;ASPがGLUで置換されている109位;ARGがALAで置換されている115位、の1つまたは複数にアミノ酸置換を有するLAG-3のドメインD1およびD2のアミノ酸配列;
アミノ酸残基54から66の欠失を有するLAG-3のドメインD1のアミノ酸配列;
ヒトIgG1 Fcに融合されたhLAG-3の細胞外ドメインをコードするプラスミドでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生された組換え可溶性ヒトLAG-3Ig融合タンパク質(IMP321)-200kDa二量体
を含む誘導体を含む。
【0041】
本発明により(a)LAG-3タンパク質、またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体;(b)白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である抗悪性腫瘍剤;および(c)薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物も提供される。
【0042】
本発明により医薬としての使用のための本発明の組合せ調製物または医薬組成物がさらに提供される。
【0043】
本発明は、がんを予防する、治療するまたは回復させるための本発明の組合せ調製物または医薬組成物も提供する。
【0044】
本発明により、がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における本発明の組合せ調製物または医薬組成物の使用がさらに提供される。
【0045】
本発明によりがんを予防する、治療するまたは回復させる方法であって、LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体および抗悪性腫瘍剤をそのような予防、治療または回復を必要とする対象に投与することを含み、抗悪性腫瘍剤が白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である、方法も提供される。
【0046】
LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、対象に逐次投与されてよい、すなわちLAG-3タンパク質またはその誘導体は、抗悪性腫瘍剤より前に、共にまたは後に投与されてよい。
【0047】
LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、対象に互いに96時間、72時間、48時間、24時間または12時間以内に投与されてよい。
【0048】
代替的に、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、例えばLAG-3タンパク質もしくはその誘導体および抗悪性腫瘍剤を含む組成物として、またはLAG-3タンパク質もしくはその誘導体および抗悪性腫瘍剤の別々の用量の同時投与によって対象に共投与されてよい。
【0049】
一部の実施形態によれば、LAG-3タンパク質もしくはその誘導体の複数の用量および/または抗悪性腫瘍剤の複数の用量が、対象に投与される。
【0050】
一部の実施形態によれば、LAG-3タンパク質またはその誘導体の用量は、抗悪性腫瘍剤の2またはそれを超える用量の各投与の前に、それと共にまたはその後に投与される。
【0051】
例えば、LAG-3タンパク質またはその誘導体の用量は、抗悪性腫瘍剤の2またはそれを超える用量の各投与の96時間、72時間、48時間、24時間または12時間以内に投与されてよい。
【0052】
本発明による併用療法において使用される構成成分の適切な投与量の選択は、例えば、患者の健康全般および併用療法への応答を含む患者の所見によって、当業者によって決定および最適化され得る。最適化は、例えば、患者が望ましい治療効果を示さないことが決定された場合に、または反対に数が多すぎるもしくは困難な重症度である望ましくないもしくは有害な副作用を患者が経験している場合に必要である場合がある。
【0053】
本発明による併用療法において使用される構成成分の用量は、組合せにおける構成成分の治療有効量を提供するために選択されるべきである。併用療法の「有効量」は、がんに関連する少なくとも1つの病理学的パラメーターの低減をもたらす量である。例えば、一部の実施形態では、併用療法の有効量は、併用療法を伴わずにがんに関連するパラメーターにおいて期待される低減と比較して少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%のパラメーターにおける低減を達成するために有効な量である。例えば、パラメーターは腫瘍成長であってよい。
【0054】
本発明により併用治療は、単剤療法としての抗悪性腫瘍剤またはLAG-3タンパク質もしくはその誘導体の効果と比較して抗悪性腫瘍剤またはLAG-3タンパク質もしくはその誘導体の治療効果を増加させるために、あるいは個々の構成成分の望まれないまたは有害な副作用の危険性を予防するまたはさらに低減すると同時に、得られる組合せ中での個々の構成成分の用量を減少させるために用いられ得る。
【0055】
一実施形態では、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、単剤療法としての各化合物についての典型的な規定用量範囲内である用量にそれぞれ規定される。化合物は、別々の投与量としてまたは組合せ投与量として規定されてよい。そのような組合せは、単剤療法としてのいずれかの化合物の効果と比較して有効性の増加を提供する。
【0056】
別の実施形態では、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、単剤療法としての各構成成分についての典型的な規定用量より低い用量だが、組合せで治療有効性を有する用量でそれぞれ規定される。構成成分は、別々の投与量としてまたは組合せ投与量として規定されてよい。組合せにおける構成成分の投与量は、単剤療法としてのLAG-3タンパク質もしくはその誘導体または抗悪性腫瘍剤と同様のレベルの治療有効性を提供するが、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤のより低い用量が、単剤療法としての各化合物の規定投与量と比較して有害な副作用の危険性を低減する有利点を伴うように選択され得る。
【0057】
別の実施形態では、抗悪性腫瘍剤の規定投与量は、単剤療法のための典型的な規定用量範囲内であり、LAG-3タンパク質またはその誘導体は、単剤療法のための典型的な規定用量より低い投与量に規定される。
【0058】
さらなる実施形態では、抗悪性腫瘍剤の規定投与量は、単剤療法のための典型的な規定用量より低く、LAG-3タンパク質またはその誘導体は、単剤療法のための典型的な規定用量範囲内である投与量に規定される。
【0059】
単剤療法のための典型的な規定用量より低い好ましい投与量は、典型的な規定用量の50%までまたは25%までである用量である。
【0060】
別々の投与量で投与される場合、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤は、実質的に同時に(例えば、互いに約60分間、約50分間、約40分間、約30分間、約20分間、約10分間、約5分間または約1分間以内)、あるいは約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約10時間、約12時間、約24時間、約36時間、約72時間もしくは約96時間またはそれを超えるだけ時間を離して投与されてよい。
【0061】
当業者は、LAG-3タンパク質またはその誘導体および抗悪性腫瘍剤の特定の組合せに応じて逐次投与のために好適な時間経過を決定および最適化できる。時間経過の選択は好ましくは、少なくとも1つの有益な効果、例えば、LAG-3タンパク質もしくはその誘導体または抗悪性腫瘍剤の効果の増強、または組合せ構成成分の効果の相互増強、例えば、相加効果を上回る効果、追加的な有利な効果、より少ない副作用、より少ない毒性、もしくは組合せ構成成分の1つもしくは両方の非有効投与量と比較した併用治療効果、および非常に好ましくは組合せ構成成分の相乗作用が認められるように行われる。
【0062】
最適な時間経過が、投与後に化合物のピーク血漿濃度に達するまでにかかる時間、各化合物の排出半減期などの要因に依存することが理解される。好ましくは時間の差異は、投与される第1の構成成分の半減期未満である。
【0063】
当業者は、また、投与のための適切な時期を決定できる。ある特定の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は朝に投与されてよく、LAG-3タンパク質またはその誘導体は、少なくとも1度その日の内に投与されてよい。他の実施形態では、抗悪性腫瘍剤およびLAG-3タンパク質またはその誘導体は、実質的に同じ時に投与されてよい。
【0064】
一部の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は、例えば、医師によって対象に投与されてよく、対象は、LAG-3タンパク質またはその誘導体の用量を、後に(例えばその日の内にまたは翌日に)投与するための、例えば予め充填されたシリンジ中で提供されてよい。
【0065】
対象は、抗悪性腫瘍剤およびLAG-3タンパク質またはその誘導体の用量を週、月または年の期間にわたって受ける場合がある。例えば、1週間、2週間、3週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、1年、2年、3年、4年、5年またはそれを超える。
【0066】
好ましくは、対象は、哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象である。
【0067】
本発明により治療され得るがんの例は、乳房、卵巣、肺、頭部、首、子宮内膜、食道、膀胱、子宮頸部、骨肉腫、結腸、結腸直腸がん、リンパ腫および中枢神経系または生殖細胞腫瘍を含む。
【0068】
一般に、本発明の組合せの構成成分または本発明の組成物は、公知の手段によって、任意の好適な製剤中で、任意の好適な経路によって投与されてよい。一部の実施形態では、LAG-3タンパク質またはその誘導体は、非経口的に(例えば、皮下、静脈内または筋肉内注射によって)投与される。一部の実施形態では、抗悪性腫瘍剤は、静脈内に投与される。特定の実施形態では、LAG-3タンパク質またはその誘導体は皮下に投与され、抗悪性腫瘍剤は静脈内に投与される。
【0069】
好適な医薬組成物および剤形は、医薬用製剤の分野の当業者に公知のならびに関連テキストおよび文献、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (Easton, Pa.: Mack Publishing Co.、1995年)に記載されている従来の方法を使用して調製されてよい。
【0070】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために本発明の組合せまたは組成物を単位剤形に製剤化することは特に有利である。本明細書において使用される用語「単位剤形」は、治療される個体のための単位の投与量として適する物理的に別個の単位を指す。すなわち、組成物は、必要とされる医薬用担体と関連して所望の治療効果を産生するように算出された活性剤の予め決定された「単位投与量」の分量をそれぞれ含有する別個の投与量単位に製剤化される。本発明の単位剤形の規格は、送達される活性剤の固有の特徴に依存する。投与量は、常用量および成分の投与の様式を参照してさらに決定されてよい。一部の場合では、組合わせにおける2つまたはそれを超える個々の投与単位が活性剤の治療有効量を提供する、例えば一緒に摂取される2個の錠剤またはカプセル剤が、各錠剤またはカプセル剤中の単位投与量が治療有効量のおよそ50%であるように、治療有効投与量を提供できることは留意されるべきである。
【0071】
非経口投与のための本発明による調製物は、滅菌水溶液および非水溶液、懸濁液ならびにエマルションを含む。注射用水溶液は、活性剤を水溶性形態で含有する。非水性溶媒またはビヒクルの例は、オリーブ油およびコーン油などの脂肪油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコールなどの合成親水性ポリマー、リポソームなどを含む。非経口製剤は、可溶化剤、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤および安定化剤などのアジュバントも含有する場合があり、水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、およびデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有する場合がある。注射用製剤は、滅菌剤の組み込み、細菌保持フィルターを通じた濾過、照射または加熱によって滅菌状態にされてよい。それらは、滅菌注射用媒体を使用して製造されてもよい。活性剤は、注射を介する投与の直前に好適なビヒクルで再水和され得る乾燥形態、例えば凍結乾燥形態であってもよい。
【0072】
既に記載の製剤に加えて、活性剤は、活性剤の制御放出、好ましくは長期間にわたる徐放のためのデポー調製物として製剤化されてよい。これらの徐放剤形は、インプラント術(例えば、皮下もしくは筋肉内にまたは筋肉内注射によって)によって一般に投与される。
【0073】
本発明の組合せ調製物は、組合せでの構成成分の投与のための説明書と共に包装されてよい。説明書は、好適な記録媒体または基板上に記録されてよい。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷されてよい。説明書は、添付文書として、容器またはその構成成分のラベル(すなわち、包装または小分け包装に付随する)に存在してよい。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読保存媒体上に存在する電子的保存データファイル、例えばCD-ROM、ディスケットとして存在する。組合せ調製物の構成成分の一部またはすべては、滅菌性を維持するために好適な包装中に包装されてよい。
【0074】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して下の実施例に記載される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
(a)LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体;および(b)白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である抗悪性腫瘍剤を含む、組合せ調製物。
(項目2)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤の共投与または逐次投与のための、項目1に記載の組合せ調製物。
(項目3)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、前記抗悪性腫瘍剤から分離されている、項目1または2に記載の組合せ調製物。
(項目4)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、LAG-3Ig融合タンパク質IMP321の0.25~30mgのモル当量である用量で存在する、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目5)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体の複数の用量を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目6)
前記抗悪性腫瘍剤の複数の用量を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目7)
前記白金ベースの抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンまたはカルボプラチンを含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目8)
前記トポイソメラーゼI阻害剤が、トポテカンを含む、項目1から6のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目9)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1および任意選択でドメインD2と少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目10)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、D2、D3および任意選択でD4と少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目11)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、免疫グロブリンFc配列に融合されている、先行する項目のいずれかに記載の組合せ調製物。
(項目12)
(a)LAG-3タンパク質、またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体;(b)白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である抗悪性腫瘍剤;および(c)薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
(項目13)
医薬としての使用のための、項目1から11のいずれかに記載の組合せ調製物または項目12に記載の医薬組成物。
(項目14)
がんを予防する、治療するまたは回復させるための、項目1から11のいずれかに記載の組合せ調製物または項目12に記載の医薬組成物。
(項目15)
がんを予防する、治療するまたは回復させるための医薬の製造における、項目1から11のいずれかに記載の組合せ調製物または項目12に記載の医薬組成物の使用。
(項目16)
がんを予防する、治療するまたは回復させる方法であって、LAG-3タンパク質またはMHCクラスII分子に結合できるその誘導体および抗悪性腫瘍剤を、そのような予防、治療または回復を必要とする対象に投与することを含み、該抗悪性腫瘍剤が白金ベースの抗悪性腫瘍剤またはトポイソメラーゼI阻害剤である、方法。
(項目17)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、前記対象に逐次投与される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、前記抗悪性腫瘍剤の後に投与される、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、互いに96時間以内に前記対象に投与される、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体および前記抗悪性腫瘍剤が、前記対象に共投与される、項目16に記載の方法。
(項目21)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体が、LAG-3Ig融合タンパク質IMP321の0.25~30mgのモル当量である用量で前記対象に投与される、項目16から20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体の複数の用量が、前記対象に投与される、項目16から21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記抗悪性腫瘍剤の複数の用量が、前記対象に投与される、項目16から22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記LAG-3タンパク質またはその誘導体の用量が、2またはそれを超える用量の前記抗悪性腫瘍剤の各投与の前に、それと共にまたはその後に投与される、項目22または23に記載の方法。
(項目25)
前記白金ベースの抗悪性腫瘍剤が、オキサリプラチンまたはカルボプラチンを含む、項目16から24のいずれかに記載の方法。
(項目26)
前記トポイソメラーゼI阻害剤が、トポテカンを含む、項目16から25のいずれかに記載の方法。
(項目27)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、および任意選択でD2と少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目16から26のいずれかに記載の方法。
(項目28)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、LAG-3タンパク質、好ましくはヒトLAG-3タンパク質のドメインD1、D2、D3および任意選択でD4と少なくとも70%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目16から27のいずれかに記載の方法。
(項目29)
LAG-3タンパク質の前記誘導体が、免疫グロブリンFc配列に融合されている、項目16から28のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0075】
図1図1は、がんの治療でのLAG-3誘導体およびトポテカンの投与の効果を示す。
【0076】
図2図2は、がんの治療でのLAG-3誘導体およびカルボプラチンの投与の効果を示す。
【0077】
図3図3は、がんの治療での(A)LAG-3誘導体およびカルボプラチン、または(B)LAG-3誘導体およびオキサリプラチンの投与の効果を示す。
【0078】
図4図4は、がんの治療でのLAG-3誘導体およびオキサリプラチンの投与の効果を示す。(A)は腫瘍サイズへの効果を示し、(B)は生存への効果を示す。
【0079】
図5図5は、免疫グロブリンFc(IgFc)配列に融合されたLAG-3タンパク質の誘導体を示す説明図である。
【0080】
図6図6は、LAG-3誘導体のMHCクラスII陽性細胞への結合を示す。
【0081】
図7図7は、LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断する抗体によるLAG-3誘導体のMHCクラスII陽性細胞への結合の阻害を示す。
【0082】
図8図8は、CCL4分泌によって決定されたLAG-3誘導体によるTHP-1細胞の活性化を示す。
【0083】
図9図9は、TNF-α分泌によって決定されたLAG-3誘導体によるTHP-1細胞の活性化を示す。
【0084】
図10図10は、LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断する抗体によるLAG誘導体誘導単球活性化の阻害を示す。
【0085】
図11図11は、LAG-3誘導体による抗原提示細胞(APC)の活性化を示す。
【0086】
図12図12は、LAG-3誘導体によるCD8陽性T細胞の活性化を示す。
【0087】
図13図13は、成熟ヒトLAG-3タンパク質のアミノ酸配列を示す。4個の細胞外Igスーパーファミリードメインは、アミノ酸残基:1~149(D1);150~239(D2);240~330(D3);および331~412(D4)にある。ヒトLAG-3タンパク質のD1ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列を太字下線付きで示す。
【実施例
【0088】
(実施例1)
がんの治療でのLAG-3誘導体およびトポイソメラーゼI阻害剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、結腸直腸腺癌細胞株CT26を使用して確立した。
【0089】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量(minimum tumorigenic dose)(MTD)(細胞0.5x10個)の4分の1を0日目に、4つの群のBALB/cマウス(5週齢)の右側腹部に皮下(s.c.)注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(群1のマウス)、LAG-3誘導体IMP321(群2のマウス)、IMP321およびトポテカン(群3のマウス)またはトポテカン単独(群4のマウス)を次のスケジュールに従って注射した:
群1(マウス8匹):陰性対照:D11、D14、D18、D21、D25およびD28にPBS s.c.注射;
群2(マウス7匹):D11、D14、D18、D21、D25およびD28にIMP321 s.c.注射(50μg、1.9mg/ml);
群3(マウス8匹):D11、D14、D18、D21、D25およびD28にIMP321 s.c.注射(50μg、1.9mg/ml)、加えてD10、D13およびD17にトポテカンi.p.注射(45μg、2.5mg/kg);
群4(マウス8匹):D10、D13およびD17にトポテカンi.p.注射(45μg、2.5mg/kg)。
【0090】
腫瘍成長を、ノギスを使用して2つの直交する腫瘍直径を測定することによって1週間に2回モニターした。結果を図1に示す。腫瘍サイズは、mmでの断面積を意味する。
【0091】
結果は、IMP321単独は腫瘍成長に効果を有さず、トポテカンは腫瘍成長の低減にいくらかの効果を有したが、IMP321およびトポテカンでの併用治療がより大きな(すなわち相乗的)効果を有することを示している。
【0092】
(実施例2)
がんの治療でのLAG-3誘導体および白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、リンパ腫細胞株EL4を使用して確立した。
【0093】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量(MTD)(細胞5x10個)を0日目にC57Bl/6マウス(5週齢)の右側腹部にs.c.注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(群1のマウス)、IMP321(群2のマウス)、IMP321およびカルボプラチン(群3のマウス)またはカルボプラチン単独(群4のマウス)を次のスケジュールに従って注射した:
群1(マウス8匹):陰性対照:D7、D11、D14、D19、D21およびD24にPBS s.c.注射;
群2(マウス8匹):D7、D11、D14、D19、D21およびD24にIMP321 s.c.注射(50μg、3.96mg/ml);
群3(マウス8匹):D7、D11、D14、D19、D21およびD24にIMP321 s.c.注射(50μg、3.96mg/ml)、加えてD6、D10、D13およびD17にカルボプラチンi.p.注射(288μg、16mg/kg);
群4(マウス8匹):D6、D10、D13およびD17にカルボプラチンi.p.注射(288μg、16mg/kg)。
【0094】
腫瘍成長を、ノギスを使用して2つの直交する腫瘍直径を測定することによって1週間に2回モニターした。結果を図2に示す。腫瘍サイズは、mmでの断面積を意味する。
【0095】
結果は、IMP321単独は腫瘍成長に効果を有さず、カルボプラチン単独はあるとしても非常にわずかな効果を有したが、IMP321およびカルボプラチンでの併用治療は腫瘍成長を低減したことを示し、それにより併用投与の相乗効果を実証している。
【0096】
(実施例3)
がんの治療でのLAG-3誘導体およびさまざまな白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
マウス同系皮膚腫瘍モデルを、リンパ腫細胞株EL4を使用して確立した。
【0097】
腫瘍細胞の最小腫瘍形成量(MTD)(細胞5x10個)を0日目にC57Bl/6マウス(5週齢)の右側腹部にs.c.注射によってインプラントした。マウスに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(群1のマウス)、IMP321(群2のマウス)、IMP321およびカルボプラチン(群3のマウス)、カルボプラチン単独(群4のマウス)、IMP321およびオキサリプラチン(群5のマウス)またはオキサリプラチン単独(群6のマウス)を次のスケジュールに従って注射した:
群1(マウス10匹):陰性対照:D7、D11、D14、D18、D21およびD25にPBS s.c.注射;
群2(マウス10匹):D7、D11、D14、D18、D21およびD25にIMP321 s.c.注射(50μg、1.9mg/ml);
群3(マウス9匹):D7、D11、D14、D18、D21およびD25にIMP321 s.c.注射(50μg、1.9mg/ml)、加えてD6、D10、D13およびD17にカルボプラチンi.p.注射(288μg、16mg/kg);
群4(マウス10匹):D6、D10、D13およびD17にカルボプラチンi.p.注射(288μg、16mg/kg);
群5(マウス10匹):D7、D11、D14、D18、D21およびD25にIMP321 s.c.注射(50μg、1.9mg/ml)に加えてD6およびD10にオキサリプラチンi.p.注射(54μg、3mg/kg);
群6(マウス10匹):D6およびD10にオキサリプラチンi.p.注射(54μg、3mg/kg)。
【0098】
腫瘍成長を、ノギスを使用して2つの直交する腫瘍直径を測定することによって1週間に2回モニターした。結果を図3A(カルボプラチンについて)および図3B(オキサリプラチンについて)に示す。腫瘍サイズは、mmでの断面積を意味する。
【0099】
結果は、IMP321単独はあるとしてもわずかな効果を有し、カルボプラチン単独はいくらかの効果を有し、IMP321およびカルボプラチンでの併用治療がより大きな(すなわち相乗的)効果を有したことを示している。オキサリプラチン単独は効果を有するが、IMP321およびオキサリプラチンでの併用治療は、さらに大きな(すなわち相乗的)効果を有し、17日目までに腫瘍成長が完全に阻害された。
【0100】
(実施例4)
がんの治療でのLAG-3誘導体および白金ベースの抗悪性腫瘍剤の投与の効果
C38結腸腺癌腫瘍モデルでのLAG-3誘導体IMP321(hLAG-3Igとも称される)およびオキサリプラチンでの併用治療の効果を評価した。このモデルでは、腫瘍断片は外科的に皮下にインプラントした。治療が始まったときに(12日目、平均腫瘍体積が200mmであるとき)、腫瘍は比較的成熟しており、実際の腫瘍についての良いモデルを提供する。
【0101】
マウス結腸38(C38)腫瘍断片は、the Division of Cancer Treatment、Tumor Repository、NCI(Frederick、MD、USA)から冷凍で得た。C38断片は、使用まで液体窒素中でDMSO/SVF/RPMI 1640培地(10/10/80)中で冷凍保存した。断片を37℃で5分間解凍し、マウスでの皮下(SC)インプラント術の前にRPMI 1640培地中で2回すすいだ。C38腫瘍をC57Bl/6マウスに連続的に移植した。
【0102】
小さなC38腫瘍断片(20~30mg)を12匹のC57BL/6マウスの右側腹部の皮下にインプラントした。腫瘍サイズが500~1000mmに達したときに、腫瘍を外科的に切除し、小さなC38腫瘍断片(20~30mg)をレシピエントC57BL/6マウスの右側腹部の皮下にインプラントした。
【0103】
治療は腫瘍が200~300mmの平均体積に達した時に開始した。治療スケジュールは次のとおりであった:
群1(マウス10匹):4週連続での週1回のPBSのSC注射;
群2(マウス10匹):4週連続での週1回の5mg/kg/注射でのオキサリプラチンのIV注射;
群3(マウス10匹):4週連続での週1回の20μg IMP321のSC注射;
群4(マウス10匹):4週連続での週1回の20μg IMP321のSC注射と組み合わされた週1回のオキサリプラチン5mg/kg/注射のIV注射。
【0104】
治療は、さまざまな群が200mmの平均腫瘍体積を有した12日目(D12)に開始した。PBSまたはオキサリプラチンをD12、D19、D26およびD33に注射した。IMP321をオキサリプラチンの翌日、つまり、D13、D20、27およびD34に注射した。皮下腫瘍が2,000mmの最大体積に達したときに動物を屠殺した:
【表1】
【0105】
結果を図4Aに示す。結果は、IMP321単独が腫瘍成長を遅らせることに効果を有さなかったことを示している。オキサリプラチンはわずかな効果を有した。オキサリプラチンおよびIMP321の組合せはより大きな効果を有した。同じ相乗効果が図4Bに示す生存曲線に見られる。
【0106】
(実施例5)
LAG-3誘導体のMHCクラスII陽性細胞への結合
LAG-3のいくつかの誘導体をMHCクラスII陽性細胞に結合するそれらの能力について検査した:
i)第1のリンカーによって免疫グロブリンFc(Ig Fc)配列に連結されたLAG-3のドメインD1~D4(LAG-3 D1D4-リンカー1-Ig、sLAG-3 D1D4-IgまたはIMP321);
ii)第2のリンカーによってIg Fc配列に連結されたLAG-3のドメインD1~D4(LAG-3 D1D4-リンカー2-IgまたはsLAG-3 D1D4-リンカーB-Ig);
iii)第2のリンカーによってIg Fc配列に連結されたLAG-3のドメインD1およびD2(LAG-3 D1D2-リンカー2-IgまたはsLAG-3 D1D2-リンカーB-Ig);ならびに
iv)第1のリンカーによってIg Fc配列に連結されたLAG-3のドメインD1~D4だが、3倍またはそれを超えるまでMHCクラスII分子への結合を増強する変異をLAG-3のD1ドメインのMHCクラスII結合部位中のR75位(R75A)に有する(Huardら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、94巻:5744頁)(IMP321 R75A)。
【0107】
誘導体を図5に例示する。
【0108】
MHCクラスII+Raji細胞を種々の濃度のLAG-3誘導体と、または陰性対照としてのヒトIgG1抗体(hIgG1)と45分間、4℃でインキュベートした。細胞表面に結合したLAG-3分子がFITC-コンジュゲートヤギ抗マウスIg(Coulter)で明らかになった。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。蛍光強度単位として表される結果を、図6に示す。結果は、すべてのLAG-3誘導体がMHCクラスII陽性細胞に結合したことを示している。
【0109】
(実施例6)
LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断する抗体によるLAG-3誘導体IMP321のMHCクラスII陽性細胞への結合の阻害
17B4および11E3は、LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断することが知られている抗LAG-3モノクローナル抗体である。IMP321-標識コンジュゲート(LAG-3Ig-Alexa488)のMHCクラスII陽性B細胞(Raji細胞)への結合を、17B4もしくは11E3遮断抗体またはアイソタイプ適合(isotype matched)陰性対照モノクローナル抗体(mIgG1)とのコンジュゲートの予備インキュベーション(4μg/ml、4℃)に続いて決定した。細胞結合蛍光の分析を、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して実行した。結果を図7に示す。
【0110】
結果は、IMP321のRaji細胞への結合が、LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断するLAG-3-特異的モノクローナル抗体によって阻害されたことを示している。
【0111】
(実施例7)
LAG-3誘導体による単球の活性化
THP-1細胞を図5に例示するLAG-3誘導体と、または陰性対照としてのヒトIgG1と4時間、4℃でインキュベートした。ケモカインCCL4、およびサイトカイン腫瘍壊死因子-α、TNF-αのTHP-1細胞による分泌の量を決定し、単球活性化の測定値として使用した。CCL4およびTNF-α分泌をCytometric Beads Arrayを使用して細胞上清中で定量した。CCL4決定の結果を図8に示し、TNF-α決定の結果を図9に示す。
【0112】
結果は、LAG-3誘導体がすべてTHP-1単球細胞を活性化できたことを示している。
【0113】
(実施例8)
LAG-3のMHCクラスII分子への結合を遮断する抗体によるIMP321誘導単球活性化の阻害
THP-1細胞との混合物の4時間のインキュベーションの前にIMP321(20ng/ml)を17B4または11E3抗体と予備インキュベート(+37℃で)した。THP-1細胞によるCCL4分泌の量を単球活性化のレベルを決定するために使用した。2つの実験の結果を図10に示す。
【0114】
結果は、IMP321誘導単球活性化が遮断抗LAG-3 mAbs 17B4および11E3によって阻害されることを実証している。これは、単球を活性化するIMP321の能力がIMP321のMHCクラスII分子への結合に依存することを示している。
【0115】
(実施例9)
LAG-3誘導体による初代抗原提示細胞(APC)の活性化
ヒト末梢血液単核細胞(PBMC)を図5に例示するLAG-3誘導体と、または陰性対照としてのヒトIgG1と、分泌阻害物質であるブレフェルジンの存在下で4時間インキュベートした。PBMCに存在するAPCのサイトカイン応答をCCL4(Th1およびCD8陽性応答を支持することが知られているケモカイン)ならびにTNF-α(腫瘍形成を直接阻害する多機能性サイトカイン)の細胞内染色によって決定した。結果をサイトメトリーによって分析した。結果をMHCクラスII陽性細胞においてCCL4および/またはTNF-αを発現している細胞の百分率によって表し、図11に示す。
【0116】
結果は、検査したすべてのLAG-3誘導体がCCL4およびTNF-αの産生を誘導したことを示している。
【0117】
(実施例10)
LAG-3誘導体によるT細胞の活性化
ヒトPBMCを図5に例示するLAG-3誘導体と、または陰性対照としてのヒトIgG1と18時間インキュベートした。ブレフェルジンは、インキュベーションの最後の16時間に存在した。LAG-3誘導体への18時間曝露後のCD8陽性T細胞のサイトカイン応答をCCL4、IFN-γおよびTNF-αの細胞内染色によって追跡し、サイトメトリーによって分析した。結果をCD3陽性/CD8陽性T細胞においてCCL4、IFN-γおよび/またはTNF-αを発現している細胞の百分率として表し、図12に示す。
【0118】
結果は、検査したすべてのLAG-3誘導体が1型細胞傷害性CD8陽性T細胞(Tc1細胞)の活性化を誘導したことを示している。APCによって発現されるMHCクラスII分子への結合を通じて、LAG-3誘導体はTc1細胞の活性化を誘導したことが結論付けられる。Tc1細胞の活性化は主な抗腫瘍免疫応答を形成する。
図1
図2
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図5
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【配列表】
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