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特許7160385脂質を用いた表面改質によって細胞内摂取効率を向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-17
(45)【発行日】2022-10-25
(54)【発明の名称】脂質を用いた表面改質によって細胞内摂取効率を向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/42 20170101AFI20221018BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20221018BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20221018BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20221018BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20221018BHJP
【ＦＩ】
A61K47/42
A61K9/51
A61K47/24
A61K9/127
A61K47/54
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020566223
(86)(22)【出願日】2018-09-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-02
(86)【国際出願番号】 KR2018010309
(87)【国際公開番号】W WO2019231051
(87)【国際公開日】2019-12-05
【審査請求日】2020-12-09
(31)【優先権主張番号】10-2018-0063163
(32)【優先日】2018-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】515139031
【氏名又は名称】ソガン ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＧＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヒョン チョル
(72)【発明者】
【氏名】キム，ド ヨン
【審査官】石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１８４４０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５０３０７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５００６７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１７２９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３０８８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２３９６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１５３８０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０６４３５０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１反応基が存在するアルブミンナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在するリン脂質ベースのマイクロサイズの脂質体を形成する脂質体形成ステップと、
前記ナノ粒子と脂質体とを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、脂質体の外面にナノ粒子が結合した脂質体－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、
前記脂質複合体形成ステップで形成された脂質体－ナノ粒子複合体に機械力を加えて脂質体を破砕することにより、ナノ粒子の外表面の一部分に結合したチューブ形状の脂質構造体を形成してナノ粒子複合体を製造する破砕形成ステップと、を含み、
前記脂質体は、バブルまたはリポソームであり、
前記ナノ粒子は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられ、前記脂質構造体は、ナノ粒子の細胞内摂取効率を向上させることを特徴とする、ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項2】
前記破砕形成ステップでは、脂質体－ナノ粒子複合体に機械力を加えて一定時間維持することにより、脂質体が破砕され、脂質体をなすリン脂質は組み換えが起こり、ナノ粒子に結合したチューブ形状の脂質構造体が形成されることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられるナノ粒子複合体及びその製造方法に係り、より詳細には、安定性が高く且つ生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより細胞内摂取効率が向上し、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ形状の脂質構造体が結合してエンドサイトーシスだけでなく、細胞膜を直接通り抜けることができ、スフェロイド状の腫瘍細胞に効果的に摂取でき、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず脂質ベースの脂質体（バブル、リポソームなど）とナノ粒子とを結合させた後に物質的な力を加えることにより脂質体が破砕されてナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を利用するので容易に量産が可能なナノ粒子複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
薬物送達分野における細胞内摂取効率は、薬物送達効果を達成するための重要な尺度となる。よって、細胞内摂取効率の向上を達成するための技術が広く開発されている。例えば、韓国公開特許第１０－２０１７－００４０７４８号公報に開示されているように、ナノ粒子に細胞透過性ペプチドなどを化学的に結合させてナノ粒子の細胞内摂取効率を向上させようとしている。
【0003】
しかし、従来の細胞内摂取効率の向上を達成するための技術は、十分な効果を得ることができず、結合した物質が容易に分解されて安定性が劣るという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１７－００４０７４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、かかる問題点を解決するために案出されたもので、その目的は、安定性が高く且つ生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより、細胞内摂取効率を飛躍的に向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0006】
本発明の他の目的は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ形状の脂質構造体が結合して、エンドサイトーシス（サイズ１００～２００ｎｍの粒子が細胞内に摂取されるメカニズムである）だけでなく、細胞膜を直接通り抜けることができるナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0007】
本発明の別の目的は、組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に摂取させることができるナノ粒子複合体を提供することにある。
【0008】
本発明の別の目的は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず脂質ベースの脂質体（バブル、リポソームなど）とナノ粒子とを結合させた後に物質的な力を加えることにより、脂質体が破砕されてナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を利用するので、容易に量産が可能なナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記の目的を達成するために、本発明は、次の構成を持つ実施形態によって実現される。
【0010】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられるナノ粒子と、前記ナノ粒子の外表面の一部分に結合してナノ粒子の細胞内摂取効率を向上させる脂質ベースの脂質構造体とを含むことを特徴とする。
【0011】
本発明の他の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、１００～３００ｎｍの直径を有し、前記脂質構造体は、５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することを特徴とする。
【0012】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記脂質構造体は、親水性を帯びる脂質ヘッドが外側面に位置し、内部には疎水性を帯びる脂質尾が位置して、全体的に長さの長いチューブ形状を有することを特徴とする。
【0013】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、第１反応基を含み、前記脂質構造体は、ナノ粒子の第１反応基と化学結合する第２反応基を含み、第１反応基と第２反応基とが化学結合することにより、脂質構造体がナノ粒子に結合することを特徴とする。
【0014】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、外表面に第１反応基が位置し、前記チューブ形状の脂質構造体は、一端に第２反応基が位置して、前記第１反応基と前記第２反応基とが化学結合することにより、チューブ形状の脂質構造体が前記ナノ粒子の外表面に結合することを特徴とする。
【0015】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、薬物を担持し或いは疾病を治療することができる物質からなることを特徴とする。
【0016】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子複合体は、エンドサイトーシスだけでなく、細胞膜を直接通り抜けて細胞内に摂取できることを特徴とする。
【0017】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記脂質構造体は、スフェロイド状の腫瘍細胞の組織内まで前記ナノ粒子の組織透過性を向上させることができることを特徴とする。
【0018】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、抗がん剤を含み、腫瘍細胞の死滅効率を向上させることができることを特徴とする。
【0019】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体の製造方法は、第１反応基が存在するナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在するリン脂質ベースのマイクロサイズの脂質体を形成する脂質体形成ステップと、前記ナノ粒子と脂質体とを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、脂質体の外面にナノ粒子が結合した脂質体－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、前記脂質複合体形成ステップで形成された脂質体－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えて脂質体を破砕することにより、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成してナノ粒子複合体を製造する破砕形成ステップと、を含み、前記脂質体は、バブルまたはリポソームであり、前記ナノ粒子は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられ、前記脂質構造体は、ナノ粒子の細胞内摂取効率を向上させることを特徴とする。
【0020】
本発明の別の実施形態によれば、本発明に係るナノ粒子複合体の製造方法において、前記破砕形成ステップでは、脂質体－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えて一定時間維持することにより、脂質体が破砕され、脂質体をなすリン脂質は組み換えが起こり、ナノ粒子に結合したチューブ形状の脂質構造体が形成されることを特徴とする。
【発明の効果】
【0021】
本発明は、前述した実施形態によって、次の効果を得ることができる。
【0022】
本発明は、安定性が高く且つ生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより、細胞内摂取効率を飛躍的に向上させることができるという効果がある。
【0023】
また、本発明は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ形状の脂質構造が結合して、エンドサイトーシス（サイズ１００～２００ｎｍの粒子が細胞内に摂取されるメカニズムである）だけでなく、細胞膜を直接通り抜けることができるという効果がある。
【0024】
また、本発明は、組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に摂取させることができるという効果がある。
【0025】
また、本発明は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず、脂質ベースの脂質体（バブル、リポソームなど）とナノ粒子とを結合させた後、物質的な力を加えることにより、脂質体破砕されてナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を利用するので、容易に量産が可能であるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の模式図である。
【図2】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体のＴＥＭ画像である。
【図3】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図4】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体に結合する脂質構造体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図5】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の細胞摂取効率を確認するためのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を示す図表である。
【図6】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の細胞摂取効率を確認するための共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【図7】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の細胞摂取効率を確認するための共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【図8】エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後の、本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の細胞摂取効率を確認するためのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を示す図表である。
【図9】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の抗がん剤送達体としての効能を確認するための細胞生存アッセイ（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）結果を示す図表である。
【図10】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）結果を示す画像である。
【図11】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）結果を示す図表である。
【図12】本発明の一実施形態に係るナノ粒子複合体のスフェロイド腫瘍細胞モデルでの細胞摂取効率を確認するための共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【発明を実施するための形態】
【0027】
以下、本発明による脂質を用いた表面改質によって細胞内摂取効率を向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法を、添付図面を参照して詳細に説明する。特別な定義がない限り、本明細書のすべての用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する技術者が理解する当該用語の一般的意味と同じであり、もし本明細書で使用された用語の意味と衝突する場合には、本明細書に使用された定義に従う。また、本発明の要旨を不要に曖昧にするおそれがある公知の機能及び構成についての詳細な説明は省略する。明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特別に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【0028】
本発明の一実施形態に係る脂質を用いた表面改質によって細胞内摂取効率を向上させたナノ粒子複合体を、図１～図１２を参照して説明すると、前記ナノ粒子複合体は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられるナノ粒子１と、前記ナノ粒子１の外表面の一部分に結合してナノ粒子１の細胞内摂取効率を向上させる脂質ベースの脂質構造体２などを含む。
【0029】
前記ナノ粒子１は、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられる構成であって、薬物を担持したり疾病を治療したりすることができる物質で構成されるが、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられる従来の様々なナノ粒子が使用でき、例えば、薬物（ｓｉＲＮＡを含む概念）を担持したアルブミンナノ粒子、薬物を担持した生分解性高分子ナノ粒子、特定のタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡナノ粒子などが例示される。前記ナノ粒子は、例えば１００～３００ｎｍの直径及び球状の形状を有することができる。前記ナノ粒子は、脂質構造体と結合する化学反応基（以下、「第１反応基」という。）を含むことができる。例えば、第１反応基としては、チオール基、アミン基、アミノ基、カルボキシ基などを含む化合物が挙げられる。
【0030】
前記脂質構造体２は、ナノ粒子１の外表面の一部分に結合してナノ粒子１の細胞内摂取効率を向上させる脂質ベースの構造体であり、前記脂質構造体は、例えば、５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することができ、前記ナノ粒子の外表面に１つ以上が結合することができる。また、前記脂質構造体は、ナノ粒子の第１反応基と化学結合する化学反応基（以下、「第２反応基」という。）を含むことができる。例えば、第２反応基としては、チオール基、アミン基、アミノ基、カルボキシ基などを含む化合物が挙げられる。
【0031】
前記脂質構造体は、例えば、親水性を帯びる脂質ヘッド２１が外側面に位置し、内部に疎水性を帯びる脂質尾２２が位置して全体的に長さの長いチューブ形状を有することができ、チューブ形状の脂質構造体の一端に位置する第２反応基が前記ナノ粒子の第１反応基と化学結合してチューブ形状の脂質構造体が前記ナノ粒子１の外表面に結合する。例えば、ナノ粒子がアルブミンナノ粒子であり、前記脂質構造体にＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）反応基を形成する場合、ＮＨＳ－ａｍｉｎｅ反応を介して前記ナノ粒子１と脂質構造体２とを結合させることがてきる。本発明は、安定性が高く且つ生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより、細胞内摂取効率を飛躍的に向上させることができ、サイズ１００～２００ｎｍのナノ粒子が細胞内に摂取されるメカニズムは、エンドサイトーシスであるが、前記ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ形状の脂質構造体が結合して、エンドサイトーシスだけでなく、細胞膜を直接通り抜けることができ、スフェロイド状の腫瘍細胞に効果的に摂取されて生体モデルにも適用することがことができる。
【0032】
次に、本発明の他の実施形態によるナノ粒子複合体の製造方法を説明する。前記ナノ粒子複合体の製造方法は、第１反応基が存在するナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズの脂質体（バブル、リポソームなど）を形成する脂質体形成ステップと、前記ナノ粒子と脂質体とを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、脂質体の外面にナノ粒子が結合した脂質体－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、前記脂質複合体形成ステップで形成された脂質体－ナノ粒子複合体に機械力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えて脂質体を破砕することにより、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成する破砕形成ステップなどを含む。
【0033】
前記ナノ粒子形成ステップは、細胞内に摂取されて疾病の治療に用いられるナノ粒子が第１反応基を含むように前記ナノ粒子を形成するステップであって、従来の様々なナノ粒子を製造する方法が使用でき、例えば、薬物を担持したアルブミンナノ粒子の場合は、アルブミンにアミン基が存在して第１反応基として使用でき、特定のタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡナノ粒子の場合は、ｓｉＲＮＡナノ粒子にアミン付きヒアルロン酸をコーティングしてｓｉＲＮＡナノ粒子に第１反応基を形成することができる。
【0034】
前記脂質体形成ステップは、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズの脂質体（バブル、リポソームなど）を形成するステップであって、例えば、バブルは、脂質（例えば、リン脂質）で形成され、内部にガスが充填されており、前記バブルの外面に第２反応基が位置する。内部にガスを有し且つリン脂質からなるリポソーム形態のマイクロサイズのバブルは、従来の製造方法によって製造でき、例えば、第２反応基が結合したリン脂質と、第２反応基が結合していないリン脂質とを有機溶媒に一定の割合で混合して脂質フィルムを形成し、前記脂質フィルムを溶媒に溶かし、ガスを注入して形成することができる。
【0035】
前記脂質複合体形成ステップは、前記ナノ粒子と脂質体とを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、脂質の外面にナノ粒子が結合した脂質体－ナノ粒子複合体を形成するステップである。
【0036】
前記破砕形成ステップは、前記脂質複合体形成ステップで形成された脂質体－ナノ粒子複合体に機械力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えて脂質体を破砕することにより、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成するステップである。脂質体－ナノ粒子複合体に超音波機器などを用いて機械力を加えて一定時間維持する場合、脂質体が破砕され、脂質体をなすリン脂質は組み換えが起こることにより、ナノ粒子に結合したチューブ形状の脂質構造体が形成される。本発明は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず、脂質ベースの脂質体とナノ粒子とを結合させた後、機械力を加えることにより、脂質体が破砕されてナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を採用するので、容易な量産を可能にすることができる。
【0037】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【実施例1】
【0038】
＜実施例１＞ナノ粒子複合体の製造
１．ナノ粒子（ＮＰｓ）の形成
アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を蒸留水に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節してアルブミン溶液を準備し、１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で前記アルブミン溶液に滴定した。その後、４％のグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）１０μＬを添加し、遮光下でエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミンをピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除く上澄み液（ナノ粒子（ＮＰｓ））をピペットで得た（一方、蛍光実験を行う際には、必要による蛍光色素（ｄｙｅ）とナノ粒子とを一晩、常温で反応させた後、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行い、反応していない蛍光色素（ｄｙｅ）をピペットを用いて除去した後、ＰＢＳで再分散して使用する）。
１．ナノ粒子（ＮＰｓ）の形成
アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を蒸留水に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節してアルブミン溶液を準備し、１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で前記アルブミン溶液に滴定した。その後、４％のグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）１０μＬを添加し、遮光下でエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミンをピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除く上澄み液（ナノ粒子（ＮＰｓ））をピペットで得た（一方、蛍光実験を行う際には、必要による蛍光色素（ｄｙｅ）とナノ粒子とを一晩、常温で反応させた後、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行い、反応していない蛍光色素（ｄｙｅ）をピペットを用いて除去した後、ＰＢＳで再分散して使用する）。
【0039】
２．リポソームの形成
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）を９．２５：０．７５のモル比で混合してクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＬＣバイアル（ｖｉａｌ）に１００μｌずつ仕込んだ後、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させ、しかる後に、デシケーター（ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ）を用いて真空を作って１時間以上乾燥させて脂質薄膜（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を形成した。脂質薄膜バイアル（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ ｖｉａｌ）にａｕｔｏ ＰＢＳを１ｍｌ仕込んで脂質溶液を形成し、５５℃以上の温度を有する水に脂質溶液入りのＨＰＬＣバイアルを入れて脂質溶液の温度が５５℃以上となるようにし、バスソニック（ｂａｔｈｓｏｎｉｃ）で１５秒程度超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を実施することにより（このとき、熱水に浸す過程と超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）実施過程を３回ほど繰り返し行う）、リポソームを形成した。
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）を９．２５：０．７５のモル比で混合してクロロホルム（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし、１ｍｇ／ｍｌとなるようにＬＣバイアル（ｖｉａｌ）に１００μｌずつ仕込んだ後、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させ、しかる後に、デシケーター（ｄｅｓｉｃｃａｔｏｒ）を用いて真空を作って１時間以上乾燥させて脂質薄膜（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を形成した。脂質薄膜バイアル（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ ｖｉａｌ）にａｕｔｏ ＰＢＳを１ｍｌ仕込んで脂質溶液を形成し、５５℃以上の温度を有する水に脂質溶液入りのＨＰＬＣバイアルを入れて脂質溶液の温度が５５℃以上となるようにし、バスソニック（ｂａｔｈｓｏｎｉｃ）で１５秒程度超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を実施することにより（このとき、熱水に浸す過程と超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）実施過程を３回ほど繰り返し行う）、リポソームを形成した。
【0040】
３．脂質を用いたバブル形成
実施例１の２の過程を経て得られた結果物に、Ｃ３Ｆ８ガスを３０秒間バイアル（ｖｉａｌ）に満たし、バイアルミキサー（Ｖｉａｌ Ｍｉｘｅｒ）を用いて４５秒間ミキシング（ｍｉｘｉｎｇ）して、ＮＨＳ反応基を含む脂質ベースのバブルを形成した。
実施例１の２の過程を経て得られた結果物に、Ｃ３Ｆ８ガスを３０秒間バイアル（ｖｉａｌ）に満たし、バイアルミキサー（Ｖｉａｌ Ｍｉｘｅｒ）を用いて４５秒間ミキシング（ｍｉｘｉｎｇ）して、ＮＨＳ反応基を含む脂質ベースのバブルを形成した。
【0041】
４．ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の形成
（１）実施例１の１で形成されたナノ粒子をリポソーム溶液（実施例１の２で形成されたリポソームがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＮＨＳ－アミン（ＮＨＳ－ａｍｉｎｅ）反応を誘導するために、ＲＴで２時間以上反応させた後（このとき、リポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）が形成される）、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）１００％の条件で５分以上機械力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたリポソームが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
（１）実施例１の１で形成されたナノ粒子をリポソーム溶液（実施例１の２で形成されたリポソームがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＮＨＳ－アミン（ＮＨＳ－ａｍｉｎｅ）反応を誘導するために、ＲＴで２時間以上反応させた後（このとき、リポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）が形成される）、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）１００％の条件で５分以上機械力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたリポソームが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【0042】
（２）リポソームの代わりに、実施例１の３で形成されたバブルを用いた以外は、他の条件を実施例１の４の（１）と同様にして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【実施例2】
【0043】
＜実施例２＞ナノ粒子複合体の特性確認
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）をＴＥＭで測定し、その結果を図２に示した。また、前記ナノ粒子複合体及び脂質構造体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図３および図４に示す。
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）をＴＥＭで測定し、その結果を図２に示した。また、前記ナノ粒子複合体及び脂質構造体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図３および図４に示す。
【0044】
２．図２を参照すると、ナノ粒子の場合、表面が滑らかであることを確認することができるのに対し、ナノ粒子複合体は、脂質構造体がナノ粒子の表面に付着しており、表面が滑らかでないことが分かる。また、図３を参照すると、ナノ粒子の表面にチューブ形状の脂質構造体が付着していることが分かり、図４を参照すると、前記脂質構造体は、チューブ形状を有することをさらに明確にすることができる。また、図３および図４を参照すると、ナノ粒子は１００～３００ｎｍの直径を有し、前記脂質構造体は５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することが分かり、前記脂質構造体は前記ナノ粒子の外表面に１つ以上が結合できることが分かる。
【実施例3】
【0045】
＜実施例３＞ナノ粒子複合体の細胞摂取効率の評価
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞摂取効率を評価するために、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて分析し、その結果を図５に示したとともに、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図６に示した。フローサイトメトリーを用いた分析は、Ａ５４９細胞（１×１０４）にＡｌｅｘａ ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理して行った。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され、ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ｃｙ５．５蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理して行った。
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞摂取効率を評価するために、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて分析し、その結果を図５に示したとともに、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図６に示した。フローサイトメトリーを用いた分析は、Ａ５４９細胞（１×１０４）にＡｌｅｘａ ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理して行った。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され、ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ｃｙ５．５蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理して行った。
【0046】
２．また、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（１）で形成したリポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）、ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞摂取効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化して、その結果を図７に示した。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ５５５蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子、リポソーム－ナノ粒子複合体及びナノ粒子複合体を処理して行った。
【0047】
３．図５を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて著しく優れた細胞摂取効能を示すことが分かり、図６を参照すると、ナノ粒子の代わりにナノ粒子複合体を用いた場合に、細胞内でさらに多くの赤色を帯びることが分かるため、蛍光画像を用いた実験でも、図５のような結果を確認することができる。また、図７を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子やリポソーム－ナノ粒子複合体に比べて著しく優れた細胞摂取効能を示すことを確認することができるため、脂質からなるバブルだけでなく、リポソームまたは他の脂質球状体によってもナノ粒子複合体が形成できることが分かる。
【実施例4】
【0048】
＜実施例４＞エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後のナノ粒子複合体の細胞摂取効率の評価
１．エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した細胞に対して、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の細胞摂取効率を評価した。サイズ２００ｎｍのナノ粒子は、大きくマクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｒｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｒｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｄ ｏｃｙｔｏｓｉｓ）の合計３つのメカニズムで細胞内摂取が行われることが知られているので、これを阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）する阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を選定して、まず、Ａ５４９細胞（１×１０４）をそれぞれまたは同時に１時間処理した後、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を３時間処理し、フローサイトメトリーを用いて測定した。測定結果について、ナノ粒子を基準に正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）して、図８に示した。マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＥＩＰＡ（５－（Ｎ－Ｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）を選定（２５μｇ／ｍｌの濃度）してＮａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅメカニズムを妨害し、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＣＰＺ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）選定（２０μｇ／ｍｌの濃度）してクラスリン被覆ピット形成（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を妨害し、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＭβＣＤ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を選定（３ｍｇ／ｍｌの濃度）してクラスリン依存性エンドサイトーシスプロセス（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ）を妨害した。
１．エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した細胞に対して、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の細胞摂取効率を評価した。サイズ２００ｎｍのナノ粒子は、大きくマクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｒｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｒｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｎｄ ｏｃｙｔｏｓｉｓ）の合計３つのメカニズムで細胞内摂取が行われることが知られているので、これを阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）する阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を選定して、まず、Ａ５４９細胞（１×１０４）をそれぞれまたは同時に１時間処理した後、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を３時間処理し、フローサイトメトリーを用いて測定した。測定結果について、ナノ粒子を基準に正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）して、図８に示した。マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＥＩＰＡ（５－（Ｎ－Ｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）を選定（２５μｇ／ｍｌの濃度）してＮａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅメカニズムを妨害し、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＣＰＺ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）選定（２０μｇ／ｍｌの濃度）してクラスリン被覆ピット形成（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を妨害し、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＭβＣＤ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を選定（３ｍｇ／ｍｌの濃度）してクラスリン依存性エンドサイトーシスプロセス（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ）を妨害した。
【0049】
２．図８を参照すると、ナノ粒子の場合（ＮＰｓ）は、ＣＰＺ、ＥＩＰＡ阻害剤により細胞摂取効能が大幅に減少することを確認することができ、３種類の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をすべて処理してエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）メカニズムをすべて妨害したとき、ナノ粒子の細胞摂取が殆ど行われないことが分かり、ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の場合は、細胞摂取効能がナノ粒子と比較して３５０％程度より優れることを確認することができ、３種類の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）でエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）メカニズムをすべて妨害したときも、ナノ粒子よりも優れた細胞摂取効能を示すことを観察することができる。これにより、ナノ粒子複合体は、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）だけでなく、細胞膜を直接透過（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を介して直接通過することを確認することができる。
【実施例5】
【0050】
＜実施例５＞ナノ粒子複合体の抗がん剤送達体としての効能評価
１．アルブミン溶液にドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）が混合された溶液を添加して反応させた後、混合溶液が濁るまでエタノール滴定を行った以外は、実施例１の１及び実施例１の４の（２）と同様にして、ドキソルビシン含有ナノ粒子、ドキソルビシン含有ナノ粒子複合体を形成し、抗がん抵抗性を有する乳がん細胞株であるＭＣＦ－７／ＡＤＲをウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ）にシードし、それぞれドキソルビシン（１００ｍＭ、ＤＯＸ）、ドキソルビシン含有ナノ粒子（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）及びドキソルビシン含有ナノ粒子複合体（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）を含む培地中で３７℃で６時間培養した後、前記細胞株をノーマル培地（ｎｏｒｍａｌ ｍｅｄｉａ）中で４８時間培養して細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を行うことにより、その結果を図９に示した。細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＭＴＴアッセイとトリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるが、細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、０．４％トリパンブルー色素（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ）を有する細胞を培養し、ノイバウエル血球計（Ｎｅｕｂａｕｅｒ ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）でカウントすることによって決定される。ＭＴＴアッセイで９６ウェルプレートと１．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））を使用し、１５μｌのＭＴＴ試薬を持って２時間培養した後、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェル（ｗｅｌｌ）に追加し、Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓをプレートリーダー（ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）によって５７０ｎｍで測定した。
１．アルブミン溶液にドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）が混合された溶液を添加して反応させた後、混合溶液が濁るまでエタノール滴定を行った以外は、実施例１の１及び実施例１の４の（２）と同様にして、ドキソルビシン含有ナノ粒子、ドキソルビシン含有ナノ粒子複合体を形成し、抗がん抵抗性を有する乳がん細胞株であるＭＣＦ－７／ＡＤＲをウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ）にシードし、それぞれドキソルビシン（１００ｍＭ、ＤＯＸ）、ドキソルビシン含有ナノ粒子（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）及びドキソルビシン含有ナノ粒子複合体（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）を含む培地中で３７℃で６時間培養した後、前記細胞株をノーマル培地（ｎｏｒｍａｌ ｍｅｄｉａ）中で４８時間培養して細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を行うことにより、その結果を図９に示した。細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＭＴＴアッセイとトリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるが、細胞生存（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、０．４％トリパンブルー色素（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ）を有する細胞を培養し、ノイバウエル血球計（Ｎｅｕｂａｕｅｒ ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）でカウントすることによって決定される。ＭＴＴアッセイで９６ウェルプレートと１．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））を使用し、１５μｌのＭＴＴ試薬を持って２時間培養した後、２００μｌのＤＭＳＯを各ウェル（ｗｅｌｌ）に追加し、Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓをプレートリーダー（ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）によって５７０ｎｍで測定した。
【0051】
２．図９を参照すると、同じ濃度のドキソルビシンを乳がん細胞に処理したとき、ナノ粒子複合体を用いる場合、一般がん細胞だけでなく、抗がん剤に対する抗がん抵抗性を有する細胞においても抗がん剤による細胞死滅効果を増加させることができることが分かる。
【実施例6】
【0052】
＜実施例６＞ナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての評価
１．アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｗｉｔｈ ０．０１ｍＭ ＥＤＴＡに４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ（５’ｍｏｄｉｆｉｅｄ）を仕込み、アルブミンとｓｉＲＮＡとの混合溶液が濁るまで１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴定した後、遮光下でエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミン或いは未反応薬物をピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除く上澄み液（ｓｉＲＮＡが担持されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ））をピペットで得た。前記ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘのセンス（ｓｅｎｓｅ）は５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は５’－ｔｈｉｏｌ－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵ－３’（配列番号：２）である。
１．アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｗｉｔｈ ０．０１ｍＭ ＥＤＴＡに４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ（５’ｍｏｄｉｆｉｅｄ）を仕込み、アルブミンとｓｉＲＮＡとの混合溶液が濁るまで１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴定した後、遮光下でエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミン或いは未反応薬物をピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除く上澄み液（ｓｉＲＮＡが担持されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ））をピペットで得た。前記ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘのセンス（ｓｅｎｓｅ）は５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）は５’－ｔｈｉｏｌ－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵ－３’（配列番号：２）である。
【0053】
２．実施例６の１で形成された、ｓｉＲＮＡが担持されたナノ粒子をバブル溶液（実施例１の３で形成されたバブルがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に仕込んだ後、ＲＴで２時間以上反応させた後、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティサイクル（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）１００％の条件で５分以上機械力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートして、ｓｉＲＮＡが担持されたナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合した、ｓｉＲＮＡが担持されたナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【0054】
３．実施例６の１及び２でｓｉＲＮＡ ＮＰｓ、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓに対する遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を確認して図１０および図１１に示す。遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の確認は、ＭＣＦ－７細胞（１×１０５）にｓｉＲＮＡ ＮＰｓ、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓをそれぞれ３時間処理し、２４時間培養した後、ｍＲＮＡを抽出し、同様の方法で、細胞に対するＰＣＲを行った。ＰＣＲ ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙにおいて、遺伝子バンド（ｇｅｎｅ ｂａｎｄｓ）は、ＧｅｌＲｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓｔａｉｎで染色され、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅによって視覚化される。図１１はｇｅｎｅ ｂａｎｄのｉｎｔｅｎｓｉｔｙをＩｍａｇｅＰｒｏを用いて相対的に定量化した値を示した。
【0055】
４．図１０及び図１１を参照すると、ｓｉＲＮＡ ＮＰｓよりもＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓを使用したとき、遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効率が遥かに優れることを確認することができるため、ナノ粒子複合体が誘電体薬物送達体として効果的に使用できることが分かる。
【実施例7】
【0056】
＜実施例７＞腫瘍細胞スフェロイド（Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）での効能評価
１．Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ（腫瘍細胞スフェロイド）は、一般な接着性（ａｄｈｅｒｅｎｔ）がん細胞とは異なり、３次元培養（３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を用いて増殖し、このようなスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、がん細胞が培地上でフロート（ｆｌｏａｔｉｎｇ）して成長するため、がん細胞がかたまって成長する。かたまって成長する形態ががん組織のＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）をミミック（ｍｉｍｉｃ）するという研究結果があるため、脂質表面の改質による組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認するために、このモデルで実験を行った。
１．Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ（腫瘍細胞スフェロイド）は、一般な接着性（ａｄｈｅｒｅｎｔ）がん細胞とは異なり、３次元培養（３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）を用いて増殖し、このようなスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、がん細胞が培地上でフロート（ｆｌｏａｔｉｎｇ）して成長するため、がん細胞がかたまって成長する。かたまって成長する形態ががん組織のＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）をミミック（ｍｉｍｉｃ）するという研究結果があるため、脂質表面の改質による組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）有無をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認するために、このモデルで実験を行った。
【0057】
２．スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）細胞の形成
ポリ（２-ヒドロキシエチルメタアクリレート）（Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））１０ｇを１００％純粋エタノール（ｐｕｒｅ ｅｔｈａｎｏｌ）１Ｌに添加して６０℃で溶かした後、溶かしたポリ（２-ヒドロキシエチルメタアクリレート）を１００ｐｈｉ基準３．３ｍｌ程度プレート（ｐｌａｔｅ）全体に均等に分散させて２４時間乾燥させた後、コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）を行い、用意されたプレートにＭＣＦ７細胞をシードし、５日間維持してスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成した細胞を得た。
ポリ（２-ヒドロキシエチルメタアクリレート）（Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ））１０ｇを１００％純粋エタノール（ｐｕｒｅ ｅｔｈａｎｏｌ）１Ｌに添加して６０℃で溶かした後、溶かしたポリ（２-ヒドロキシエチルメタアクリレート）を１００ｐｈｉ基準３．３ｍｌ程度プレート（ｐｌａｔｅ）全体に均等に分散させて２４時間乾燥させた後、コーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）を行い、用意されたプレートにＭＣＦ７細胞をシードし、５日間維持してスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成した細胞を得た。
【0058】
３．スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）細胞へのナノ粒子複合体の処理
（１）実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対するスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）細胞摂取効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図１２に示した。ＤＡＰＩを用いて核が染色された実施例７の２で形成されたスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状のＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ５５５蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理した後、３時間が経過した時点で共焦点顕微鏡を用いて測定した。
（１）実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対するスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）細胞摂取効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図１２に示した。ＤＡＰＩを用いて核が染色された実施例７の２で形成されたスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状のＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ５５５蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理した後、３時間が経過した時点で共焦点顕微鏡を用いて測定した。
【0059】
（２）図１２を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて優れた細胞摂取効率を示すことを確認することができ、これにより、単純ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏをミミック（ｍｉｍｉｃ）した環境でも、ナノ粒子複合体の摂取効率が優れることを確認することができるので、ナノ粒子複合体は、組織における優れた透過（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）効率を有することが分かる。
【0060】
以上、本発明の様々な実施例を説明したが、これらの実施例は、本発明の技術的思想を実現する一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想を実現する限り、いかなる変更例または修正例も本発明の範囲に属するものと解釈されるべきである。
【符号の説明】
【0061】
１ ナノ粒子
２ 脂質構造体
２１ 脂質ヘッド
２２ 脂質尾
２ 脂質構造体
２１ 脂質ヘッド
２２ 脂質尾
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】