(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-17
(45)【発行日】2022-10-25
(54)【発明の名称】植物細胞における標的化ＤＮＡ変更のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221018BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20221018BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20221018BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N5/04 ZNA
A01H1/00 A
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2018565404
(86)(22)【出願日】2017-06-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-06-27
(86)【国際出願番号】 NL2017050408
(87)【国際公開番号】W WO2017222370
(87)【国際公開日】2017-12-28
【審査請求日】2020-06-17
(31)【優先権主張番号】2016998
(32)【優先日】2016-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(73)【特許権者】
【識別番号】508186875
【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】バンドック， ポール
(72)【発明者】
【氏名】ケトラース－ボネ， アニタ
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１９４１９０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５０７５０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５００００３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２７０８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nature Biotechnology，2013年，Vol.31, No.8，p.688-691, Supplementary Information，DOI:10.1038/nbt.2654
【文献】Nature Biotechnology，2015年，Vol.33, No.11，p.1162-1164
【文献】Nature Protocols，2007年，Vol.2, No.7，p.1565-1572
【文献】Journal of Plant Physiology，1990年，Vol.137，p.95-101
【文献】Plant Cell Reports，1987年，Vol.6，p.172-175
【文献】Biotechnology Advances，2015年，Vol.33，p.41-52
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ１２Ｎ ５／０４
Ａ０１Ｈ １／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＦＳＴＡ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供する方法であって、標的配列を有するＤＮＡ分子を含む植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、前記水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、前記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地におけるグリセロールの終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）未満である、方法。
【請求項2】
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地が１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞を含むように、植物細胞の前記集団が前記水性培地と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記植物細胞がトマト細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
植物細胞の前記集団が植物プロトプラストの集団であり、好ましくは前記植物プロトプラストがトマトプロトプラストである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地が、２～８０ナノモル（ｎＭ）のＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質が、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地が、３０～６００ナノモル（ｎＭ）のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記水性培地中の前記ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質と、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡとの間のモル比は１：３００～８：３であり、好ましくはモル比は１：２０である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地が無グリセロールである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地が、１００～４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記植物細胞を含む前記水性培地が、２～８０ナノモル（ｎＭ）のＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、
３０～６００ナノモル（ｎＭ）のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、
１００～４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ、及び
１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＰＥＧが、前記ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡが前記培地に提供された後に前記水性培地に添加される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記植物細胞を、前記植物中のＤＮＡ分子に導入しようとしている所望の変更を含むＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＤＮＡポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
植物細胞の前記集団が、フィーダー植物細胞の存在下で、更に栽培され、前記フィーダー植物細胞は植物プロトプラストであることが好ましく、前記フィーダー植物細胞は植物細胞の前記集団と同じ植物種のものであることが好ましく、前記フィーダー植物細胞は好ましくは５０，０００～２５０，０００個のフィーダー植物細胞を含有しているフィーダーディスクの形態で提供されることが好ましい、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
植物細胞の前記集団からの個々のプロトプラストが、植物カルス、植物細胞壁を含む植物細胞、及び／又は植物へと更に栽培される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
標的化ＤＮＡ分子が、除草剤耐性、乾燥耐性、雄性不稔、昆虫耐性、非生物的なストレス耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝、改変された種子収量、改変された油パーセント、改変されたタンパク質パーセント、及び細菌疾患、真菌疾患若しくはウイルス疾患に対する耐性の形質のうちの１つ又は複数を付与する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記水性培地が、プラスミド又はベクター材料を含まない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供することにおける、２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、３０～６００ナノモル（ｎＭ）のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、０．０１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール、及び１００～４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを含む水性培地の使用。
【請求項19】
ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、好ましくは、２～８０ナノモル（ｎＭ）のＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質；ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、好ましくは３０～６００ナノモル（ｎＭ）のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ；
０．０１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール、好ましくはグリセロールなし；及び
１００～４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを
含む組成物、好ましくは水性組成物。
【請求項20】
前記組成物は、１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞を更に含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
植物細胞中のＤＮＡ分子の標的改変の方法であって、標的配列を有する標的化されるＤＮＡ分子を含む植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、前記水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、前記標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地におけるグリセロールの終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）未満である、方法。
【請求項22】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを導入する方法であって、植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、前記水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、
植物細胞の前記集団を含む前記水性培地におけるグリセロールの終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）未満である、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
生細胞の遺伝物質における変化を故意に作り出すプロセスは、その細胞の、又は細胞が一部を形成する若しくは細胞が再生することができる生物の、遺伝的にコードされる生物学的特性のうちの１つ又は複数を改変することをゴールとする。これらの変化は、遺伝物質の一部の欠失、外因性遺伝物質の付加又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列における変化の形態をとることができる。
【0002】
真核生物の遺伝物質を変更する方法は、２０年にわたって知られており、農業、ヒトの健康、食品品質及び環境保全の分野における改善のため、植物、ヒト及び動物細胞並びに微生物における広範な適用が見出されてきている。
【0003】
最も共通する方法は、外因性ＤＮＡ断片を細胞のゲノムに加えることからなり、これは次に、新しい特性を、その細胞又はその生物に既に既存の遺伝子によってコードされる特性に加えて付与する（既存の遺伝子の発現が、それによって、抑制される適用が含まれる）。多くのそのような例が、所望の特性を得ることに有効であるにもかかわらず、これらの方法は、全くもって正確ではなく、その理由は、外因性ＤＮＡ断片が挿入されるゲノム位置に対する制御が存在しない（それ故、発現の究極的なレベルを超える）からである及び所望の効果が、元の、バランスが良くとれたゲノムによってコードされている天然の特性を超えて顕在化しなければならないことになるからである。
【0004】
これに反して、予め規定したゲノム座位においてヌクレオチドの付加、欠失又は転換をもたらすゲノム編集方法は、既存の遺伝子の正確な改変を可能にする。
【0005】
最近、標的化ゲノム編集の新規方法が報告されている。ＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は、複数の短い直列反復を含有している座位であり、４０％の配列決定された細菌及び９０％の配列決定された古細菌において見出されている。
【0006】
ＣＲＩＳＰＲ反復は、バクテリオファージ及びプラスミドなどの遺伝的な病原体に対して獲得された細菌性免疫のシステムを形成している。ある細菌が病原体に攻撃されると、病原体ゲノムの小さな断片が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）によってプロセスされ、ＣＲＩＳＰＲ反復の間の細菌ゲノムに組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位は、次に転写され、プロセスされ、いわゆるｃｒＲＮＡが形成される、これには、病原体ゲノムと同一のおよそ３０ｂｐの配列が含まれる。これらのＲＮＡ分子は、引き続く感染に際して病原体の認識にとっての基礎を形成し、病原体ゲノムのＲＮＡｉ様プロセス又は直接的な消化のどちらかによる病原体遺伝エレメントのサイレンシングを導く。
【0007】
Ｃａｓ９タンパク質（又は類似機能を有するタンパク質）は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの重要な成分であり、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される第２のＲＮＡと組合わさると、エンドヌクレアーゼを形成し、これが、ｃｒＲＮＡによって規定されるゲノムにおける位置でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入による分解のため侵入する病原体ＤＮＡを標的とする。
【0008】
最近、Ｊｉｎｅｋら（２０１２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２０）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須な部分を融合することによって産生される単鎖キメラＲＮＡが、機能的なエンドヌクレアーゼを、Ｃａｓ９との組合せで形成できることを実証した。ＣＲＩＳＰＲシステムは、広範囲の異なる細胞型におけるゲノム編集のため使用することができる。
【0009】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、基本的に２つの成分：「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び非特異的なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９結合に必要な足場配列から構成される短い合成ＲＮＡ、及び利用者が定義するヌクレオチド「ターゲティング」配列（これは、改変されるゲノム標的を定義する）である。したがって、ｇＲＮＡに存在するターゲティング配列を単純に変化させることによってエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）のゲノム標的を変化させることができる。ＣＲＩＳＰＲは、様々な細胞型及び生物における標的遺伝子をノックアウトするため当初採用されたが、酵素に対する改変は、標的遺伝子の選択的な活性化又は抑制、ＤＮＡの特定の領域の精製、及び更に蛍光顕微鏡を使用する生細胞中のＤＮＡの視覚化にＣＲＩＳＰＲの適用を拡大させた。更には、ｇＲＮＡを生成する容易性は、ＣＲＩＳＰＲを最もスケーラブルなゲノム編集技術の１つとし、全ゲノムスクリーニング（ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｃｒｅｅｎｓ）に最近利用されている。
【0010】
したがって、キメラＲＮＡを、真核生物ゲノム中の特定の配列を標的化するために設計することができ、ＤＳＢを、細胞中の、例えば、Ｃａｓ９タンパク質及びキメラＲＮＡの発現に際して、この配列で誘導することができる。ＤＮＡ ＤＳＢが生じたら、細胞ＤＮＡ修復機構（特に、非相同的な末端結合経路に属するタンパク質）が、ＤＮＡ末端の再ライゲーションに関与する。このプロセスは、切断部での少数のヌクレオチドの欠損又は獲得を導くことができ、ゲノムＤＮＡ中のＩＮＤＥＬ変異を作り出す。ＤＳＢがコード配列中に誘導される場合、この位置で任意のＩＮＤＥＬは、タンパク質リーディングフレームにおける変更を導くことができ、ヌル変異として機能し得る。或いは、複数の３ヌクレオチド（例えば、＋３、＋９、－６）の欠失又は挿入を導く任意のＩＮＤＥＬが、インフレーム変異を作り出し、これはタンパク質機能を排除するというよりはむしろタンパク質機能に影響することができる。
【0011】
ＤＳＢ修復は不完全であることがあり、遺伝子のオープンリーディングフレームの破壊がもたらされることがあるが、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、標的ＤＮＡ中の特定のヌクレオチド変化を生成することができる。遺伝子変更に関してＨＤＲを利用するために、所望の配列を含有するＤＮＡ「修復鋳型」を、ｇＲＮＡ（複数可）及び例えばＣａｓ９とともに所望の細胞型に送達しなければならない。修復鋳型は、所望の変更並びに標的のすぐ上流及び下流に追加の相同配列（左及び右相同性アーム）を含有しなければならない。
【0012】
ＣＲＩＳＰＲシステムより以前は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又は転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのゲノムエンジニアリングアプローチは、どのゲノム標的に対しても毎回、新しいヌクレアーゼ対を科学者が設計及び生成させる必要があるカスタマイズ可能なＤＮＡ結合タンパク質ヌクレアーゼの使用に依存していた。ＣＲＩＳＰＲは、大部分はその単純性及び適応性に起因して、ゲノムエンジニアリングにとってますます最も好評なものになってきている。
【0013】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムが、ヒト細胞、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫（ｗｏｒｍ）、酵母、細菌、及び植物におけるゲノム編集ツールとして採用され得ることを最近の研究は実証している。そのシステムは、多用途であり、ゲノム中のいくつかの部位を編集するため使用されるエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をプログラムすることによって、同時に単純に複数のガイドＲＮＡを使用することによって、マルチプレックスゲノムエンジニアリングさえ可能にする。ニッカーゼへのＣａｓ９の容易な転換が、低下した変異原性活性を有する哺乳動物ゲノム中の相同組換え修復を促進することが示された。
【発明の概要】
【0014】
標的化ＤＮＡ変更の機構の理解におけるこれらの最近の進歩にもかかわらず、植物材料における標的改変（ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は、まだ必ずしも成功するわけでも効率的なわけでもない。実際に利用可能な方法（動物、特にヒト、細胞材料に対して最適化されることが多い）は、特に植物細胞に適用する場合、必ずしも成功するわけでも効率的なわけでもない。したがって、ＣＲＩＳＰＲに基づくシステム及びそのような植物細胞のため特に設計されたプロトコールで標的改変が導入されている植物細胞を提供する新しい方法に対する必要性が存在する。そのような方法は、様々な植物細胞において、当技術分野において知られている方法と比較して適切な効率で、好ましく、首尾よく適用され得る。
【0015】
この観点から、標的改変が導入されている、植物細胞を提供するための、又は植物細胞のＤＮＡに標的改変を導入するための、新しい組成物、方法及び使用が、非常に望ましいであろう。特に、植物細胞中のＤＮＡ分子の効率的な標的改変を可能にする、信頼がおけ、効率的であり、再現性があり、特に標的化された組成物、方法及び使用に対する明らかな必要性が当技術分野において存在する。したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、任意の前述の必要性に適合するための、そのような組成物、方法及び使用の供給において認められる。技術的な問題は、特許請求の範囲及び本明細書の以下に特徴付けられる実施形態により解決される。
【0016】
最近、Ｃａｓ９タンパク質を実際に使用して、ＤＮＡ構築物を使用することなく所望の植物遺伝子において変異を生成させることができるとのいくつかの報告が存在している（例えば、Ｗｏｏら、２０１５． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３３、１１６２－１１６４を参照）。これらの方法は、Ｃａｓ９タンパク質及びインビトロ転写されたｓｇＲＮＡを植物プロトプラストに導入することに基づいている。本発明者らは、これらの方法に記載される条件が、最適以下であり、いくつかの種に対しては致死的でさえあることを同定した。Ｃａｓ９タンパク質及びインビトロ転写されたガイドＲＮＡを使用して、良好なプロトプラスト生存及び生育を保証する、植物ＤＮＡにおける標的改変に関する、改善され、いくつかの例においては必須な、パラメータを本発明は明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【0017】
本発明の実施形態は、以下の添付の図面を参照して、更に記載される：
【図1】Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＯＲＦ（受託番号ＮＣ＿００２７３７；配列番号２）を示す図である。トランスポータン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ）配列には下線がひかれている、タンパク質には単純な精製のための６ｘＨＩＳ配列タグ（太字）及びタンパク質の核への輸送を保証するための核局在化シグナル（イタリック）も含まれる。
【図2】Ｓ．ピオゲネス Ｃａｓ９ ＯＲＦ（受託番号ＮＣ＿００２７３７；配列番号３）のトマト（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）における最適な発現のため変更されたコドン使用頻度を有するバリアントのＯＲＦを示す図である。
【図3】シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列に融合したトマトの３ｇ０９５３１０座のエキソン５（ＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡ；配列番号１）における推定変異部位を含むｓｇＲＮＡ（配列番号４）を示す図である。シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーターには下線がひかれており、３ｇ０９５３１０標的部位配列は太字であり、ｓｇＲＮＡの残りはイタリックで示される。
【図4】Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡが、予測されるサイズの断片を産生するＰＣＲ産物を消化できることを示す図である。したがって、これらの試薬は、良好な活性を示し、変異誘発実験に使用することができる。Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡでの推定標的部位を保有する３ｇ０９５３１０ ＰＣＲ産物の消化；レーン１、３ｇ０９５３１０ ＰＣＲ産物 レーン２、３ｇ０９５３１０ ＰＣＲ産物＋Ｃａｓ９タンパク質＋３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡ。
【図5】クローン化したＰＣＲ産物の４％におけるｉｎｄｅｌ変異の検出を示す図であり、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡがトマトプロトプラストに入ることができ、そこで、それらが正確なゲノム部位に標的化されるアクティブヌクレアーゼ複合体を形成することを示唆している。ｉｎｄｅｌ変異は、Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡをトマトプロトプラストにトランスフェクションした後、３ｇ０９５３１０標的部位に由来するクローン中に見出された。下線がひかれた配列（ＷＴ）は、個々の変異体クローン中に見出されたｉｎｄｅｌと整列させた未変更の標的部位を表す。破線は、各クローンにおいて欠失したヌクレオチドの数及び位置を表す。数字は、いくつのヌクレオチドが欠失したかを示す。
【図6】３．９％（６５８個のうちの２６個）が、３ｇ０９５３１０標的部位でｉｎｄｅｌ変異を含有したことを示す図である。プロトプラストへのプラスミドトランスフェクションに由来するカルスの遺伝子型決定は、２．８％（１１２８個のうちの３２個）が、３ｇ０９５３１０標的部位で変異を含有することを示した。ｉｎｄｅｌ変異は、Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡをトマトプロトプラストにトランスフェクションした後、３ｇ０９５３１０標的部位でカルス中に見出された。下線がひかれた配列（ＷＴ）は、個々の変異体カルス中に見出されたｉｎｄｅｌと整列させた未変更の標的部位を表す。破線は、各カルスにおいて欠失したヌクレオチドの数及び位置を表す。数字は、いくつのヌクレオチドが欠失又は付加したかを示す（太字）。カルスの大多数は、ｉｎｄｅｌ変異に関してヘテロ接合性である。しかしながら、いくつかのカルスは二対立遺伝子変異（ＢＩ）を含有し、同じｉｎｄｅｌ変異が遺伝子の両方のコピーに存在し、カルス２Ｃ１０（Ａ＆Ｂ）は二対立遺伝子性であるが、各遺伝子において異なるｉｎｄｅｌ変異を含有する。
【図7】プロトプラスト生存における様々なグリセロール濃度の効果を示す図である。グリセロール（ｖ／ｖ）の終濃度はｘ軸に示され、生存しているプロトプラストのパーセンテージはｙ軸に示される。対照（グリセロールの添加なし）は、自由裁量で１００％にセットされ、他のサンプル中の生存している細胞の数は、これを参照として使用して示される。
【発明を実施するための形態】
【0018】
［定義］
本開示の一部には、著作権保護の対象である対象物が含まれる（例えば、著作権保護が、任意の管轄区域において有効である又は有効であることがある、本願の図、デバイス写真、又は任意の他の態様に限定されない）。特許庁の特許ファイル又はレコード中に掲載されるが、全ての著作権はどんなものであれ留保されるので、著作権者は特許文書又は特許開示のいずれかによる複製に対して不服はない。
本開示の一部には、著作権保護の対象である対象物が含まれる（例えば、著作権保護が、任意の管轄区域において有効である又は有効であることがある、本願の図、デバイス写真、又は任意の他の態様に限定されない）。特許庁の特許ファイル又はレコード中に掲載されるが、全ての著作権はどんなものであれ留保されるので、著作権者は特許文書又は特許開示のいずれかによる複製に対して不服はない。
【0019】
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する様々な用語は、明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語は、他に示さない限り、本発明の属する技術分野における、それらの通常の意味を与えられる。他の特に定義された用語は、本明細書に提供される定義と一致した様式において解釈される。本明細書に記載されるものと類似した又は同等な任意の方法及び材料を本発明の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。
【0020】
「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語には、内容が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。よって、例えば、「細胞」に対する参照には、２つ又はそれ以上などの細胞の組合せが含まれる。
【0021】
「約」及び「およそ」：これらの用語は、例えば、量、時間的な持続時間などの測定可能な値を指す場合、変形形態が開示される方法を実施するため適切であるものとして、指定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、及び更により好ましくは±０．１％の変形形態を包含することを意味する。
【0022】
「及び／又は」：用語「及び／又は」は、記載されたケースのうちの１つ又は複数が、単独で又は少なくとも１つの記載されたケース（全ての記載されたケースまで）の組合せで起こり得る状況を指す。
【0023】
「含む」：この用語は、包括的であり、オープンエンドであり、排他的ではないと解釈される。特に、その用語及びその変形は、特定の特徴、ステップ又は成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ又は成分の存在を排除すると解釈されない。
【0024】
用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ反応を触媒する酵素を指す。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、それぞれ、シチジン又はデオキシシチジンからウラシル又はデオキシウラシルへの加水分解脱アミノを触媒する、シチジンデアミナーゼである。
【0025】
「例示的」：この用語は、「実施例、実例、又は例示として供すること」を意味し、本明細書に開示される他の構成が排除すると解釈されるべきではない。
【0026】
「植物」：これには、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生させることができる植物細胞組織培養、植物カルス、植物細胞凝集塊（ｐｌａｎｔ ｃｌｕｍｐ）、及び植物中の無傷（ｉｎｔａｃｔ）である植物細胞又は胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、殻、柄、根、根端、葯、穀粒などのような植物の部分が含まれる。
【0027】
［詳細な説明］
本明細書に記載の任意の方法、使用又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法、使用又は組成物に関して達成できることが意図されている。本発明の方法、使用及び／又は組成物の文脈において議論される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法、使用又は組成物に関して採用され得る。したがって、１つの方法、使用又は組成物に属する実施形態は、本発明の他の方法、使用及び組成物にも適用され得る。
本明細書に記載の任意の方法、使用又は組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法、使用又は組成物に関して達成できることが意図されている。本発明の方法、使用及び／又は組成物の文脈において議論される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法、使用又は組成物に関して採用され得る。したがって、１つの方法、使用又は組成物に属する実施形態は、本発明の他の方法、使用及び組成物にも適用され得る。
【0028】
本明細書に具体化され、広く記載されるように、本発明は、培地のインキュベーション混合物中のグリセロールの存在と、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供する効率との間に予想外の関係性が存在するとの発明者らによる所見を対象としており、その方法は、植物細胞を、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡ（以後、ｓｇＲＮＡ、ｇＲＮＡ又はガイドＲＮＡとも称される）を含む培地と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下で接触させるステップを含む。ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対してハイブリダイズしたｃｒＲＮＡ、又は例えば、Ｊｉｎｅｋら、（２０１２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２０）に記載されているような単鎖ガイドＲＮＡ、又は例えば、Ｃｐｆ－１での使用のための単一ＲＮＡガイドとして理解される。
【0029】
言い換えると、植物細胞が、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びｓｇＲＮＡ及びＰＥＧを含む水性培地と、前記ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びｓｇＲＮＡを植物細胞に導入する目的で、前記植物細胞においてＤＮＡ分子を（標的化）変更させる目的で、接触させられる場合、そのような培地が、実質的に無グリセロールであるべきであることは本発明者らにとって驚きであった。この所見に反して、当業者は、当技術分野において、いわゆるグリセロールショック（例えば相当量のグリセロール、例えば、５、１０又は更に２０％（ｖ／ｖ）以上のグリセロールを使用）が、トランスフェクション効率の改善を促進することを認識している（例えば、Ｇｒｏｓｊｅａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ （２００６）、２８（２２）：１８２７－１８３３又はＪｏｒｄａｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９６） ２４ （４）： ５９６－６０１．ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／２４．４．５９６を参照）。
【0030】
植物細胞と接触する水性培地が実質的に無グリセロールであるべきであるとの所見に加えて、本発明者らは、最適な結果（例えば、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供する）が、以下に詳細に記載されるように、いくつかの他のステップ及び因子を含ませることによって達成されることも見出した。
【0031】
したがって、第１の態様によれば、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供する方法であって、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ分子は標的配列を有する）を含む植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及び標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡを含み、水性培地が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、実質的に無グリセロールである方法が提供される。
【0032】
方法において、植物細胞の集団は、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡを含む水性培地と接触される。
【0033】
限定されないが、植物細胞は、少なくとも５分間の期間、例えば、５分間～２４時間の間、又は５分間～６時間の間、又は５分間～６０分間の間、又は５分間～３０分間の間、又は５分間～２５分間の間の期間で接触されることが好ましい。接触させることは、任意の適切な温度であってもよく、例えば、摂氏４℃～摂氏４０℃の間の温度であり、摂氏１０℃～摂氏３０℃の間、例えば、室温が好ましい。
【0034】
本明細書の発明の背景の部分に説明されているように、当業者は、ＣＲＩＳＰＲ又はＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム及び細胞中に存在するＤＮＡを変更させることにおけるその使用をよく認識している。ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を、植物細胞中のＤＮＡ分子に存在する配列を特異的に標的とするよう設計され、植物細胞中に導入されたらＤＮＡ分子における前記標的配列とハイブリダイズするシステムガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）との組合せで、提供する。ＣＡＳタンパク質（例えば、ＣＡＳ９）－ｓｇＲＮＡ複合体とＤＮＡのハイブリダイゼーション後、ＣＡＳタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が、ＤＮＡ分子における標的部位で二本鎖切断を導入し得る。
【0035】
当業者は、どのようにして異なる成分のＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムを調製するかを知っている。先行技術において、多数の報告が、その設計及び使用において利用可能である。例えば、ｓｇＲＮＡの設計及びＣＡＳタンパク質ＣＡＳ９（当初はＳ．ピオゲネスから得られた）とのその組合せ使用におけるＨａｅｕｓｓｌｅｒら（Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． （２０１６）４３（５）：２３９－５０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１６．０４．００８．）による最近の総説を参照。
【0036】
更に、当業者は、培地に関して本明細書に定義される特定の要求に次いで、培地は任意の適切な培地であってもよいことを理解する。例えば、培地は、５～８の間、好ましくは６～７．５の間のｐＨ値を有することが好ましい。
【0037】
ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びｓｇＲＮＡの水性培地中の存在に次いで、培地は、ポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業的な製造から医療まで多くの適用を有する、ポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧの構造は、一般にＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨとして表現される。使用されるＰＥＧは、２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する、オリゴマー及び／又はポリマー、又はその混合物であることが好ましい。
【0038】
ＰＥＧ媒介性遺伝子形質転換は、１９８５年から知られている。植物プロトプラスト形質転換についての最初の方法は、ＰＥＧを利用した（Ｋｒｅｎｓら、（１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９６： ７２－７４；Ｐｏｔｙｒｙｋｕｓら、（１９８５） Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ． ３：１１７－１２８；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら、（１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８： ３６３－３７３）。この技術は、多くの異なる植物からのプロトプラストに適用可能である（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ８９： １９９－２０７）。ＰＥＧは、二価のカチオンの存在下で、植物プロトプラストの表面にＤＮＡを沈殿させ、次にそこからインターナライズされて、形質転換を刺激すると考えられている（Ｍａａｓ ＆ Ｗｅｒｒ （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ８： １４８－１５１）。上記先行技術は、植物細胞中にＤＮＡを標的改変させることを目的として、植物細胞にｓｇＲＮＡ及びＣＡＳタンパク質及び／又はＣＡＳ様タンパク質を導入するためのＰＥＧ形質転換の使用を意図していない、特に、そのような使用において、水性培地は、実質的に無グリセロールであるべきである。
【0039】
本明細書に説明されたように、発明者らには驚きであったことには、水性培地は、実質的に無グリセロールであるべきである。グリセロールは、単純なポリオール化合物である。グリセロールは、無色で、無臭の粘稠性の液体であり、甘い味があり、一般的に無毒であると考えられる。グリセロールは、生命科学において使用される、緩衝液、培地などにおいて一般に使用されている。グリセロールは、タンパク質を安定化するため、溶液中に及び／又は抗凍結剤として使用して、タンパク質及び酵素を低温で維持することができる。例えば、ＣＡＳ９タンパク質は、高レベルのグリセロールを含む貯蔵溶液の形態で一般に販売されている（例えば、５０％まで；例えば、ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍ０３８６－ｃａｓ９－ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｓ－ｐｙｏｇｅｎｅｓ＃ｐｄ－ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎを参照）。したがって、グリセロールは溶液中のタンパク質を安定化するため使用されるが、本発明の文脈において、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質を含む水性培地中のそのようなグリセロールの存在が、（例えば、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供することにおいて）方法の全体的な有効性を低減させることが見出された。実際、グリセロール濃度が水性培地中で高すぎる場合、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞が全く得られないことがあることを結果は示した。
【0040】
当業者は、グリセロールの許容濃度が、実験設定にある程度依存することがあり、本開示に基づいて、当業者は、そのような最大の許容濃度を決定することに問題はなく、それを超えて本発明の方法の有効性が低減されることを理解する。
【0041】
本発明の文脈内では、植物中のＤＮＡ分子における標的改変が、いわゆるＩＮＤＥＬ変異（すなわち、ヌクレオチドの挿入又はヌクレオチドの欠失又は両方をもたらし、ヌクレオチドの総数において正味の変化をもたらし得る変異）を含む、ＤＮＡ分子における標的位置として、１つ又は複数のヌクレオチド（複数可）の欠失、１つ又は複数のヌクレオチド（複数可）の挿入及び／又は１つ又は複数のヌクレオチド（複数可）置換などの任意の型の変更であってもよいことを当業者は理解する。
【0042】
本発明において使用される培地が実質的に無グリセロールである必要があるとの所見に加えて、それとの組合せで、望ましい結果が、ＣＡＳタンパク質及び／又はＣＡＳ様タンパク質、ｓｇＲＮＡ及びＰＥＧを含む水性培地と接触される細胞の量が、水性培地の１ミリリットル当たり約１０，０００～２，０００，０００個の植物細胞に達する場合、得られることが見出された。したがって、細胞の量は変動してもよく且つ所与の範囲を外れてもよいが、好ましい実施形態において、水性培地の１ミリリットル当たりの細胞の量は、１０，０００～２，０００，０００個の植物細胞の間である。当業者は、どのようにして、そのような数の細胞を提供するかを知っている。
【0043】
細胞は、互いに分離した細胞として、すなわち単一細胞として提供されるのが好ましいが、集団中の一部の細胞は、互いに連結されていてもよく、細胞の小塊を形成してもよい。また、当業者は、どのようにして、少なくとも、大多数、単一細胞形態で、すなわち、大多数の細胞が互いに連結されていない形態で、細胞の集団を提供するかを知っている。
【0044】
本明細書の他で説明されている通り、当業者は、本発明の方法が、異なる植物細胞、例えば、異なる植物種の植物細胞に対して適用可能であり得ることを理解している。実際、本明細書に開示されている発明は、広範囲の植物、単子葉植物及び双子葉植物の両方の植物細胞に対して適用可能であり得ることが意図されている。非限定的な例には、ウリ科、ナス科及びイネ科、トウモロコシ／トウモロコシ（Ｚｅａ種）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、オオムギ（例えば、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（例えば、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ、例えば、Ｇ．ｍａｘ）、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ種、例えば、Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、アブラナ属種（例えば、Ｂ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ、Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂ．ｒａｐａ、など）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、ベニバナ、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ種、例えば、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ｉｎｄｉｃａ栽培品種群又はｊａｐｏｎｉｃａ栽培品種群）、飼料草、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｓｐｐ．例えば、Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、樹木種（Ｐｉｎｕｓ、ポプラ、モミ、オオバコ、など）、茶、コーヒー、アブラヤシ、ココナツ、野菜種、例えば、エンドウ、ズッキーニ、マメ（例えば、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ種）、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、ニンニク、リーキ、レタス、タマネギ、ダイコン、レタス、カブ、芽キャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリー、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、茴香、ビート、多肉果を実らせる植物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴ、リンゴ、プラム、サクランボ、アンズ、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ）、キーウィ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、キイチゴ、スイカ、オレンジ、グレープフルーツ、など）、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ（ミント、パセリ、バジル、タイム、など）、木質性樹木（ｗｏｏｄｙ ｔｒｅｅ）（例えば、Ｐｏｐｕｌｕｓの種、Ｓａｌｉｘ、Ｑｕｅｒｃｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、線維種、例えば、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）及びアサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、又はモデル生物、例えば、シロイヌナズナからの植物細胞が含まれる。
【0045】
しかしながら、好ましい実施形態において、植物細胞は、トマトから得られる植物細胞である。
【0046】
別の好ましい実施形態によれば、植物細胞の集団は、植物プロトプラスト、好ましくはトマト植物プロトプラストの集団である。当業者は、様々な植物についての植物プロトプラストの調製に関して利用可能な方法を使用することによって植物プロトプラストを提供することができる。例えば、植物プロトプラストは、植物全体（ｗｈｏｌｅ ｐｌａｎｔ）、植物全体の一部若しくは植物細胞をセルロース若しくはペクチナーゼなどの酵素で処理すること又は適切な機械的な手段によって、調製して、細胞壁を除去することができる。結果として生じる植物プロトプラストは、次に、それらを安定な形態に維持するための浸透圧制御剤を含有する水溶液に配置される（例えばＲｅｕｓｉｎｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９６６） １５４ （３７４６）： ２８０－２８１ ＤＯＩ： １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１５４．３７４６．２８０又はＭｕｈｌｂａｃｈら、Ｐｌａｎｔａ （１９８０）１４８ （１）： ８９－９６．を参照）。
【0047】
同様に、本発明の方法において使用される水性培地が実質的に無グリセロールであるべきことに次いで、上記開示された量の植物細胞又は植物プロトプラストを有することが好ましく、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びｓｇＲＮＡの濃度及び比が、ある特定の範囲内であることが好ましいことが見出された。
【0048】
特に、望ましい結果が、植物細胞の集団を含む水性培地が、２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質を含む場合に得られる。したがって、濃度は、例えば１～２００ｎＭの間であり変動してもよく、好ましい実施形態において、濃度は２～８０ｎＭの間、例えば、５～７０ｎＭの間、１０～５０ｎＭの間又は２０～４０ｎＭの間である。
【0049】
用語ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指し、ＣＡＳ９、ＣＳＹ４、ｄＣＡＳ９（例えば、ＣＡＳ９＿Ｄ１０Ａ／Ｈ８２０Ａ）、ニッカーゼ（例えば、ＣＡＳ９＿Ｄ１０Ａ、ＣＡＳ９＿Ｈ８２０Ａ又はＣＡＳ９＿Ｈ８３９Ａ）及びｄＣＡＳ９－エフェクタードメイン（アクチベータ及び／又は阻害ドメイン）融合タンパク質（例えば、更なる機能ドメイン、例えば、デアミナーゼドメインに融合されたＣＡＳ９又はＣＡＳ様分子）、及び他の例、例えば、Ｃｐｆ１又はＣｐｆ１＿Ｒ１２２６Ａ及び例えば、ＷＯ２０１５／００６７４７に記載されるものを含むが、限定されない。Ｃａｓ９の変異体及び誘導体並びに他のＣａｓタンパク質は、本明細書に開示される方法において使用することができる。そのような他のＣａｓタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有し、標的配列の認識に関して操作されたｓｇＲＮＡの存在下、植物細胞にある場合、標的核酸配列を認識できることが好ましい。ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質は、Ｃｐｆ１のＣＡＳ９タンパク質であることが好ましい。
【0050】
Ｃａｓ９タンパク質は、広く市販されており、並びに、その改変されたバージョンである（これは、本発明の文脈内のＣＡＳタンパク質としても意図されている）。Ｃａｓ９タンパク質は、（エンド）ヌクレアーゼ活性を有し、次に分解される病原体ゲノム中の標的配列で特異的なＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じることができる。実際、ゲノム配列を標的化するＣａｓ９タンパク質（ヌクレアーゼ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲシステムの成分）又はｓｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡのキメラ融合）は、ゲノム標的配列で標的化ＤＳＢを作り出し、これは細胞ＤＮＡ機構によって誤修復されることが多く、小さな挿入又は欠失をもたらす（ＩＮＤＥＬ）ことが示される（Ｆｅｎｇら、（２０１３） Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １： ４；Ｌｉら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３１： ６８９－６９１；Ｎｅｋｒａｓｏｖら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３１： ６９１－６９３；Ｓｈａｎら、（２０１３） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３１： ６８６－６８８）。
【0051】
Ｃｐｆ１は、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである（例えば、Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（３）：７５９－７７１を参照）。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接性モチーフを利用する。Ｃｐｆ１は、ねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。Ｃｐｆ１は、ヒト細胞中で効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。したがって、Ｃｐｆ１は、代替ＣＡＳタンパク質として使用され得る。
【0052】
ＣＡＳ又はＣＡＳ様タンパク質は、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９ＺＷ２）、フランシセラツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ５Ｙ３）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｊ７ＲＵＡ５）、ネスルンド放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）からのＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｊ３Ｆ２Ｂ０）、ストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｇ３ＥＣＲ１；ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ－Ｑ０３ＪＩ６；Ｑ０３ＬＦ７）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｃ９Ｘ１Ｇ５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ１ＩＱ６８）；リステリアイノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９２７Ｐ４）；ストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ８ＤＴＥ３）；パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＣＬＴ２）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ６ＮＫＩ３）；カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）からのＣａｓ９（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０Ｐ８９７）、フランシセラツラレンシスからのＣｐｆ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２）、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からのＣｐｆ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｕ２ＵＭＱ６）、その任意のオルソログ又はそれから由来する任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得るが、限定されない。
【0053】
本明細書に言及されるように、ＣＲＩＳＰ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ）の濃度も、本明細書に開示される発明の文脈内で、ある特定の範囲内であることが好ましい。更に、特に、水性培地中で３０～６００ナノモルのＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡの濃度を使用することにより、（例えば、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供することにおいて）得られる結果が改善されることが見出された。したがって、例えば、１０～１０００ｎＭ ｓｇＲＮＡの濃度（一を超える異なるｓｇＲＮＡが、本発明において同時に使用されるケースでは、総濃度）が、使用され得るが、濃度は、３０～６００ｎＭの間、例えば、５０～４００ｎＭの間、例えば、１００～３００ｎＭの間、例えば、１５０～２５０ｎＭの間であることが好ましい。
【0054】
別の選択によれば、水性培地中のＣＡＳタンパク質と、ＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡとの間のモル比は１：３００～８：３であり、好ましくはモル比は１：２０である。例えば、モル比は、１：１～１：５０、又は１：５～１：３０、又は１：１～８：３、及びこれらの好ましい比内の任意の他の比であってもよい。
【0055】
ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びｓｇＲＮＡの濃度及び比は、所与の濃度範囲内及び所与のモル比内の両方であることが好ましい。
【0056】
本明細書の詳細のように、細胞と接触させる水性培地は、実質的に無グリセロールであるべきである。
【0057】
好ましい実施形態において、植物細胞の集団を含む水性培地は、０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロールを含み、好ましくは水性培地は（検出可能な）グリセロールなしである。言い換えると、植物細胞の集団を含む水性培地中の終濃度グリセロールは、好ましくは、０．１％（ｖ／ｖ）未満、例えば、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロールである。任意選択で、植物細胞の集団を含む水性培地は、完全に無グリセロールである。
【0058】
本明細書の詳細のように、実質的に無グリセロールである水性培地は、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及び少なくとも１つのｓｇＲＮＡ（原則として、一を超える型のｓｇＲＮＡが、同じ実験、例えば、２つ又はそれ以上の異なる標的配列向け、又は更に同じ標的配列向けで使用されてもよい）に次いで、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【0059】
本発明の文脈内で、ＰＥＧの濃度が、ある特定の範囲内であることが好ましいことが見出された。特に、植物細胞の集団を含む水性培地は、１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧを含む。したがって、ＰＥＧの終濃度は、１００～４００ｍｇ／ｍｌ、例えば、１５０～３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば、１８０～２５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＰＥＧは、ＰＥＧ ４０００ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｎｏ．８１２４０である。（すなわち、平均Ｍｎ４０００を有する（Ｍｎ、数平均分子量は、サンプル中の全てのポリマー分子の総重量を、サンプル中のポリマー分子の総数で割ったものである）。ＰＥＧは、約１０００～１０，０００、例えば、２０００～６０００の間のＭｎとして使用されることが好ましい）。
【0060】
本明細書の既述の詳細のように、非常に好ましい実施形態において、本発明の方法が提供され、ここで、植物細胞を含む水性培地は、
２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質；
３０～６００ナノモル（ｎＭ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ；
０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール；
１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ、及び
１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞
を含む。
２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質；
３０～６００ナノモル（ｎＭ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ；
０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール；
１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ、及び
１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞
を含む。
【0061】
パラメータのこの組合せは、驚くべきことに、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供することに有効であることが見出された。実際、上記パラメータの偏りが、効率及び／又は有効性を低減させることがあることが見出された。
【0062】
上記に加えて、本発明の方法の効率及び／又は有効性は、ＰＥＧが、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡが水性培地に提供された後に培地に添加される場合に、改善されることが見出された。したがって、ＰＥＧは、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡが培地に提供される前に水性培地に添加され得るが、水性培地は、ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを最初に提供され、その後、ＰＥＧが培地に提供されることが好ましいことが見出された。ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ並びにＰＥＧを添加する間の時間は、５秒間～１０分間の間であることが好ましいが、そのように所望する場合、より短く又はより長くてもよい。
【0063】
更なる選択によれば、植物細胞を、植物中のＤＮＡ分子に導入しようとしている所望の変更を含むＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＤＮＡポリヌクレオチドと接触させることを更に含む、本発明の方法が提供される。
【0064】
ＮＨＥＪ媒介性ＤＳＢ修復は不完全であることがあるが、遺伝子のオープンリーディングフレームの破壊をもたらすことが多く、相同組換え修復は、単一ヌクレオチド変化から大きい挿入の範囲の特異的なヌクレオチド変化を生成させるため使用することができる。この使用に関しては、所望の配列を含有するＤＮＡ「修復鋳型」が作られ、これが、ｇＲＮＡ（複数可）及びＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質とともに所望の細胞型に送達しなければならない。
【0065】
修復鋳型は、所望の変更並びに標的のすぐ上流及び下流に追加の相同配列（いわゆる、左及び右相同性アーム）を含有しなければならない。各相同性アームの長さ及び結合位置は、導入されている変化のサイズに依存的である。修復鋳型は、特定の適用に依存して、一本鎖オリゴヌクレオチド（６～２５０ヌクレオチドの間の任意の長さを有するオリゴヌクレオチド）、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は二本鎖ＤＮＡプラスミドであり得る。
【0066】
更なる好ましい実施形態によれば、植物細胞の集団が、更に栽培される（すなわち、本明細書の詳細のように、フィーダー植物細胞の存在下で、水性培地と接触させた後）、本発明の方法が提供され、フィーダー植物細胞は植物プロトプラストであることが好ましく、フィーダー植物細胞は植物細胞の集団と同じ植物種のものであることが好ましく、フィーダー植物細胞は好ましくは５０，０００～２５０，０００個のフィーダー植物細胞を含有しているフィーダーディスクの形態で提供されることが好ましい。
【0067】
当業者は、どのようにして、フィーダー細胞の存在下で、プロトプラストを栽培するかを知っており、例えば、例中の詳細のようになされる。植物細胞が、実質的に無グリセロールであるが、ＣＡＳ／ＣＲＩＳＰＲシステム成分及びＰＥＧを含む水性培地と接触された後の培養期間の間のフィーダー細胞の存在が、本発明に従った方法の全体的な有効性及び／又は有効性を増加することができることが見出された。このことは、特に、フィーダー細胞が、水性培地中でＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムと接触させた植物細胞の集団と同じ植物種のものである場合、特に１フィーダーディスク当たり５０，０００～２５０，０００個のフィーダー植物細胞の量が使用される場合（１実験当たり通常１つのフィーダーディスクが使用される）、真である。
【0068】
当業者は、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９８４） ３３ （３）： ２９３－３０２； ｄｏｉ：１０．１０１６／０３０４－４２１１（８４）９００２０－８における詳細のような又はＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＩＳＢＮ ０－７９２３－２４９３－５； ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖａｓｉｌ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ； Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を含む様々なハンドブックに記載されるようなフィーダー細胞の存在中でプロトプラストをどのようにして栽培するかにおける他の技術を知っている。
【0069】
植物細胞の集団からの個々のプロトプラストが、植物カルス、植物細胞壁を含む植物細胞、及び／又は植物へと更に栽培される、本発明の方法も意図されている。
【0070】
本発明の方法は、除草剤耐性、乾燥耐性、雄性不稔、昆虫耐性、非生物的なストレス耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝、改変された種子収量、改変された油パーセント、改変されたタンパク質パーセント、及び細菌疾患、真菌疾患又はウイルス疾患に対する耐性の形質のうちの１つ又は複数を付与する、例えば遺伝子又はプロモーターのＤＮＡ分子、ヌクレオチド配列内にターゲティングするため特に適切であるが、ＤＮＡ分子内の任意の種類の配列を標的化するため使用することができる。
【0071】
別の好ましい実施形態において、水性培地が、任意のプラスミド又はベクター材料、特に任意のプラスミド材料又はＣＡＳタンパク質及び／又はＣＡＳ様タンパク質をコードするベクター材料を含まない、本発明の方法が提供される。そのようなベクターを培地中に存在させると、植物又は植物細胞中のＤＮＡ分子において、その望ましくない導入のケースとなることがある。
【0072】
別の態様によれば、ＤＮＡ分子において標的改変を有する植物細胞を提供することにおける、２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、３０～６００ナノモル（ｎＭ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール、及び１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧを含む水性培地の使用が提供される。
【0073】
当業者は、本発明の方法に関して本明細書に開示される様々な制限及び選択に関して、これらが、水性培地の上記使用に対して同様に適用されることを理解している。
【0074】
本発明に従った方法又は使用で得られる、植物細胞壁、植物、又はその種子を含むプロトプラスト、プロトプラストの集団、植物細胞も提供される。
【0075】
本発明の別の態様によれば、
ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、好ましくは、２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質；
ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、好ましくは３０～６００ナノモル（ｎＭ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ；
０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール、好ましくはグリセロールなし；及び
１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ
を含む組成物、好ましくは水性組成物が提供される。
ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質、好ましくは、２～８０ナノモル（ｎＭ）ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質；
ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ、好ましくは３０～６００ナノモル（ｎＭ）ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡ；
０．１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール、好ましくはグリセロールなし；及び
１００～４００ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ
を含む組成物、好ましくは水性組成物が提供される。
【0076】
当業者は、本発明の方法及び本発明の使用に関して本明細書に開示される様々な制限及び選択に関して、これらが、上記組成物に対して同様に適用されることを理解している。
【0077】
例えば、好ましい実施形態において、組成物は、１０，０００～２，０００，０００個／ｍｌの植物細胞を更に含む。
【0078】
本明細書に開示される方法はまた、植物細胞中のＤＮＡ分子の標的改変の方法であることを当業者は理解している。したがって、植物細胞中のＤＮＡ分子の標的改変の方法であって、標的化されるＤＮＡ分子（ＤＮＡ分子は標的配列を有する）を含む植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及び標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムガイドＲＮＡを含み、水性培地が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、実質的に無グリセロールである方法も提供される。
【0079】
当業者は、上記に記載される方法に関して本明細書に開示される様々な制限及び選択に関して、これらが、植物細胞中のＤＮＡ分子の標的改変の方法に対して同様に適用されることを理解している。
【0080】
最終的に、本明細書に開示される方法はまた、植物細胞中にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを導入する方法であることを当業者は理解している。したがって、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを導入する方法であって、植物細胞の集団を水性培地と接触させるステップを含み、水性培地が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを含み、水性培地が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、実質的に無グリセロールである方法も提供される。
【0081】
上記に開示される方法に関して本明細書に開示される様々な制限及び選択に関して、これらが、植物細胞中にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＡＳタンパク質）又はＣＡＳ様タンパク質、及びＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムガイドＲＮＡを導入する方法に対して同様に適用されることを当業者は理解している。
【0082】
以下、本発明を一般的に記載しながら、同じ発明が、例示の手段で提供され、本発明の限定を意図していない、以下の実施例に対する参照によって、より容易に理解される。
【実施例】
【0083】
実施例１－Ｃａｓ９タンパク質及びインビトロ転写されたｓｇＲＮＡを使用する、トマト３ｇ０９５３１０座位でのＩｎｄｅｌの誘導。
【0084】
材料及び方法
構築物
Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ ＯＲＦ（図１）（受託番号ＮＣ＿００２７３７）を、核局在化シグナルとともに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン使用を最適化して合成し、次に発現ベクターｐＥＴ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、精製のため使用することができるタンパク質のＮ末端での６ｘＨＩＳエピトープの融合をもたらした。これを、次に、タンパク質産生のため大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
構築物
Ｓ．ピオゲネスＣａｓ９ ＯＲＦ（図１）（受託番号ＮＣ＿００２７３７）を、核局在化シグナルとともに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン使用を最適化して合成し、次に発現ベクターｐＥＴ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、精製のため使用することができるタンパク質のＮ末端での６ｘＨＩＳエピトープの融合をもたらした。これを、次に、タンパク質産生のため大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【0085】
Ｓ．ピオゲネス Ｃａｓ９ ＯＲＦ（受託番号ＮＣ＿００２７３７）はまた、トマト（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）における最適な発現のため変更されたコドン使用頻度を有するバリアントを設計するため使用された。もたらされたＯＲＦは、図２に示されている。ＯＲＦを、次に、ＸｈｏＩ（５’）及びＳａｃＩ（３’）部位の両方と隣接させて合成し（ｗｗｗ．ｇｅｎｅａｒｔ．ｃｏｍ）、プラスミドにクローン化した。Ｃａｓ９ ＯＲＦ断片を、次に、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩで消化後、このプラスミドから単離した。ベクターｐＫＧ７３８１に存在する構成的なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを使用して、トマトプロトプラストにおいてＣａｓ９ ＯＲＦを発現させた。プラスミドｐＫＧ７３８１は、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩ部位と隣接する６ｘＨＩＳタグ化バージョンの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を保有する。ｐＫＧ７３８１中のＧＦＰ ＯＲＦを、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩ部位を使用するＣａｓ９ ＯＲＦによって置換して、Ｃａｓ９ ＯＲＦを保有させて、構築物ｐＫＧ７２３０をもたらし、核局在化配列（ＮＬＳ）及び６ｘＨＩＳタグをそのＮ末端に翻訳段階で融合させた。このベクターは、植物細胞においてＣａｓ９タンパク質の発現のため使用することができる。
【0086】
タンパク質発現及び精製
Ｃａｓ９発現株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、ＩＰＴＧを次に１ｍＭの終濃度を添加して、タンパク質産生を誘導した。これらの培養物を、次に、最適なタンパク質発現のため２２°Ｃで振盪機中で一晩増殖させた。組換えタンパク質を、次に、製造者のプロトコールに従ってＮｉ－ＮＴＡスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。タンパク質産生を、次に、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における精製したタンパク質の分離、続いてクーマシー染色によって確認した。精製したタンパク質を、次に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％グリセロールからなる緩衝剤（Ｇ）に対して、２０Ｋ Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩４°Ｃで透析した。タンパク質を、次に、カセットから除去し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ １００Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。フィルターにおけるタンパク質を、１ｘＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ、８０ｇ／ｌ；ＫＣｌ、２ｇ／ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１４．４ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２．４ｇ／ｌ；ｐＨ７．４）で洗浄し、次に、２００μｌ １ｘＰＢＳ緩衝液を使用してフィルターから最終的に洗浄した。Ｃａｓ９タンパク質の濃度を、標準として市販のＣａｓ９タンパク質（Ｍ０６４１、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、１６６ｎｇ／μｌ）を使用して、１０％ポリアクリルアミドゲル、続いてクーマシーゲル染色で定量化した。
Ｃａｓ９発現株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．６まで増殖させ、ＩＰＴＧを次に１ｍＭの終濃度を添加して、タンパク質産生を誘導した。これらの培養物を、次に、最適なタンパク質発現のため２２°Ｃで振盪機中で一晩増殖させた。組換えタンパク質を、次に、製造者のプロトコールに従ってＮｉ－ＮＴＡスピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。タンパク質産生を、次に、１０％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における精製したタンパク質の分離、続いてクーマシー染色によって確認した。精製したタンパク質を、次に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％グリセロールからなる緩衝剤（Ｇ）に対して、２０Ｋ Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩４°Ｃで透析した。タンパク質を、次に、カセットから除去し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ １００Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。フィルターにおけるタンパク質を、１ｘＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ、８０ｇ／ｌ；ＫＣｌ、２ｇ／ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４、１４．４ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、２．４ｇ／ｌ；ｐＨ７．４）で洗浄し、次に、２００μｌ １ｘＰＢＳ緩衝液を使用してフィルターから最終的に洗浄した。Ｃａｓ９タンパク質の濃度を、標準として市販のＣａｓ９タンパク質（Ｍ０６４１、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、１６６ｎｇ／μｌ）を使用して、１０％ポリアクリルアミドゲル、続いてクーマシーゲル染色で定量化した。
【0087】
トマト座位３ｇ０９５３１０に関するｓｇＲＮＡ合成
トマトの座位３ｇ０９５３１０の分析により、エキソン５における推定変異部位（ＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡ）が同定された。次に、この配列を含むｓｇＲＮＡを合成して、シロイヌナズナＵ６ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列と融合した（図３）。このプラスミド（ＫＧ９４９２）を、次に、プライマーＴ７－３ｇ０９５３１０ Ｆ（５’－ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡ－３’；配列番号５）及びｓｇＲｅｖ（５’－ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ－３’；配列番号６）でのＰＣＲのための鋳型として使用して、ｓｇＲＮＡ配列をＴ７ポリメラーゼプロモーターに対して融合した産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、次に、沈殿させ、Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ５０ Ｍｉｃｒｏカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、次に、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用するインビトロＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。ｓｇＲＮＡを、次に、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製及び濃縮し、Ｑｕｂｉｔで定量化した。
トマトの座位３ｇ０９５３１０の分析により、エキソン５における推定変異部位（ＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡ）が同定された。次に、この配列を含むｓｇＲＮＡを合成して、シロイヌナズナＵ６ ｐｏｌＩＩＩプロモーター配列と融合した（図３）。このプラスミド（ＫＧ９４９２）を、次に、プライマーＴ７－３ｇ０９５３１０ Ｆ（５’－ＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＴＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＣＴＣＧＡ－３’；配列番号５）及びｓｇＲｅｖ（５’－ＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧ－３’；配列番号６）でのＰＣＲのための鋳型として使用して、ｓｇＲＮＡ配列をＴ７ポリメラーゼプロモーターに対して融合した産物がもたらされた。ＰＣＲ産物を、次に、沈殿させ、Ｐｒｏｂｅ Ｑｕａｎｔ Ｇ５０ Ｍｉｃｒｏカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、次に、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｆｌａｓｈ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用するインビトロＲＮＡ合成のための鋳型として使用した。ｓｇＲＮＡを、次に、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製及び濃縮し、Ｑｕｂｉｔで定量化した。
【0088】
Ｃａｓ９タンパク質及び０３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡインビトロ試験
推定変異部位を含む、この座位の５３６ｂｐ領域を増幅する、（フォワード、５’－ａａｇｇｔｇａａｇｇｇｇｇｔａａａａｔｇｇ－３’（配列番号７）；リバース、５’－ｇａａｇｇｔｇａａｇｇｇｇｇｔａａａａｔｇｇ－３’（配列番号８））プライマーを設計した。このＰＣＲ産物を、トマトゲノムＤＮＡから増幅し、次に、精製されたＣａｓ９タンパク質及び転写された３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡでの消化反応に使用した。反応について、３００ｎｇのＰＣＲ産物を、１６０ｎｇ Ｃａｓ９タンパク質、２００ｎｇ ３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡ及び１μｌ １０ｘ反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）での１０μｌ反応中で１時間３７°Ｃでインキュベートした。１μｌのＲＮａｓｅＡ（４ｍｇ／ｍｌ）を、次に、添加し、１５分間後、サンプルを、アガロースゲルで分析した（図４）。図に示されるように、Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡは、予測されるサイズの断片を産生するＰＣＲ産物を消化できた。したがって、これらの試薬は、良好な活性を示し、変異誘発実験に使用することができる。
推定変異部位を含む、この座位の５３６ｂｐ領域を増幅する、（フォワード、５’－ａａｇｇｔｇａａｇｇｇｇｇｔａａａａｔｇｇ－３’（配列番号７）；リバース、５’－ｇａａｇｇｔｇａａｇｇｇｇｇｔａａａａｔｇｇ－３’（配列番号８））プライマーを設計した。このＰＣＲ産物を、トマトゲノムＤＮＡから増幅し、次に、精製されたＣａｓ９タンパク質及び転写された３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡでの消化反応に使用した。反応について、３００ｎｇのＰＣＲ産物を、１６０ｎｇ Ｃａｓ９タンパク質、２００ｎｇ ３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡ及び１μｌ １０ｘ反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）での１０μｌ反応中で１時間３７°Ｃでインキュベートした。１μｌのＲＮａｓｅＡ（４ｍｇ／ｍｌ）を、次に、添加し、１５分間後、サンプルを、アガロースゲルで分析した（図４）。図に示されるように、Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡは、予測されるサイズの断片を産生するＰＣＲ産物を消化できた。したがって、これらの試薬は、良好な活性を示し、変異誘発実験に使用することができる。
【0089】
トマトプロトプラスト単離及びトランスフェクション
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｖａｒ Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ）のインビトロシュート培養を、高いプラスチック瓶中の０．８％寒天中のＭＳ２０培地において、１６／８時間の光周期（２０００ルクス）で２５°Ｃ及び６０～７０％ ＲＨで維持した。若葉（１ｇ）を、葉脈まで垂直に丁寧にスライスして、酵素混合物の浸透を容易にした。スライスした葉を、酵素混合物（ＣＰＷ９Ｍ中の２％ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．４％ Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０）に移し、細胞壁消化を、暗所中で一晩２５°Ｃで続行させた。プロトプラストを、５０μｍナイロン篩を通して濾過し、５分間８００ｒｐｍでの遠心分離によって収穫した。プロトプラストを、ＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）培地に再懸濁し、３ｍＬ ＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）を、長首ガラスパスツールピペットを使用して各チューブの底に添加した。生きたプロトプラストを、１０分間８００ｒｐｍでの遠心分離によって、スクロースとＣＰＷ９Ｍ培地との間の界面での細胞画分として収穫した。プロトプラストを、カウントし、ＭａＭｇ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、１９８７）培地中に最終密度１０６個／ｍＬで再懸濁した。
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｖａｒ Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ）のインビトロシュート培養を、高いプラスチック瓶中の０．８％寒天中のＭＳ２０培地において、１６／８時間の光周期（２０００ルクス）で２５°Ｃ及び６０～７０％ ＲＨで維持した。若葉（１ｇ）を、葉脈まで垂直に丁寧にスライスして、酵素混合物の浸透を容易にした。スライスした葉を、酵素混合物（ＣＰＷ９Ｍ中の２％ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ ＲＳ、０．４％ Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｏｎｏｚｕｋａ Ｒ１０）に移し、細胞壁消化を、暗所中で一晩２５°Ｃで続行させた。プロトプラストを、５０μｍナイロン篩を通して濾過し、５分間８００ｒｐｍでの遠心分離によって収穫した。プロトプラストを、ＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）培地に再懸濁し、３ｍＬ ＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）を、長首ガラスパスツールピペットを使用して各チューブの底に添加した。生きたプロトプラストを、１０分間８００ｒｐｍでの遠心分離によって、スクロースとＣＰＷ９Ｍ培地との間の界面での細胞画分として収穫した。プロトプラストを、カウントし、ＭａＭｇ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、１９８７）培地中に最終密度１０６個／ｍＬで再懸濁した。
【0090】
２つの異なる試薬混合物を作製した。第１のものは、緩衝液Ｇ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）中の８０ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質及び６００ｐｍｏｌの３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡから構成された。第２の試薬混合物は、１ｘＰＢＳ緩衝液に再懸濁された８ｐｍｏｌ Ｃａｓ９タンパク質及び１５０ｐｍｏｌ ３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡから作った。対照として、本発明者らはまた、４ｐｍｏｌのプラスミド ＫＧ７２３０（３５：：Ｃａｓ９）と一緒に６ｐｍｏｌのプラスミド ＫＧ９４９２（Ｕ６ｐ：：３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡ）を使用してトランスフェクションを実施した。これらの試薬混合物を、５００μＬ（５００，０００個のプロトプラスト）のプロトプラスト懸濁液に添加し、５００μＬのＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌポリ（エチレングリコール）４０００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃８１２４０；０．１Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２）を次に添加し、トランスフェクションを２０分間室温で起こさせた。次に、１０ｍＬの０．２７５Ｍ Ｃａ（ＮＯ３）２溶液を添加し、完全に且つ丁寧に混合した。プロトプラストを、５分間８００ｒｐｍでの遠心分離によって収穫し、９Ｍ培養培地中に１ｍｌ当たり０．５ｘ１０６個の密度で再懸濁し、４ｃｍ直径ペトリ皿に移し、等容量の２％アルギナート溶液（２０ｇ／ｌアルギナート－Ｎａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ０６８２）、０．１４ｇ／ｌ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、９０ｇ／ｌマンニトール）を添加した。次に、１ｍｌアリコート（１２５，０００個のトランスフェクトされたプロトプラスト）を、Ｃａ－寒天プレート（７２．５ｇ／ｌマンニトール、７．３５ｇ／ｌ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、８ｇ／ｌ寒天、ｐＨ５．８）に広げ、１時間重合させた。プロトプラスト生存を改善するため、本発明者らは、トランスフェクトされていないが、同じプロトコールを使用してアルギナートに包埋した２００，０００個のトマトプロトプラスト（Ｍｏｎｅｙｂｅｒｇ品種）を含有している「フィーダー」ディスクも産生した。プロトプラスト培養について、４ｍｌのＫ８ｐ（Ｋａｏ、１９７５）培養培地を、フィーダーディスクと、この頂部に配置されたトランスフェクトされたプロトプラストのディスクの両方を含有している４ｃｍ組織培養皿に添加した。トマトプロトプラストにおけるｉｎｄｅｌを検出するため、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを、４８時間後、皿から除去し、アルギナートを溶解し、プロトプラストを単離した。カルスの再生について、ディスクを、２１日間２８°Ｃで暗所で一緒にインキュベートした。この期間後、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを、１ｍｇ．ｌ－１ ゼアチン及び０．２ｍｇ．ｌ－１ ＧＡ３を補充した固体ＧＭ培地（Ｔａｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６（３）、１７２、１９８７）に移し、更に３週間増殖させた、その時点で、カルスはおよそ０．３ｍｍのサイズであった。次に、アルギナートを溶解し、カルスをＧＭ培地の新鮮なプレートに広げ、それらをおよそ１．５ｍｍまで成長させ、その時点で、それらを再度新鮮な培地に移し、次に、更に１４日後、遺伝子型決定した。
【0091】
プロトプラスト及びカルスの遺伝子型決定
Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡをトランスフェクトされているトマトプロトプラストを、４８時間栽培し、次にアルギナートの除去後に収集した。総ゲノムＤＮＡを、次に、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してサンプルから単離し、遺伝子特異的プライマーを使用する３ｇ０９５３１０標的部位の増幅のための鋳型として使用した。この５３６ｂｐ ＰＣＲ断片を、次に、ＤＮｅａｓｙ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、次に、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドにライゲーションした。ライゲーションを化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換し、次にこれをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有している固体ＬＢ培地にプレートした。次に、ＰＣＲをＭ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーを使用して９６個の個々のコロニーで実施し、次に、これらのＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩで直接的に消化した。３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡは、このＸｈｏＩ部位にｉｎｄｅｌを誘導し、したがって、消化を受けないことによってスコアをつけられる、この部位の欠損は、ｉｎｄｅｌ形成の効率を決定するため多数のクローンについて遺伝子型決定する単純な方法である。ＸｈｏＩ消化に耐性があるＰＣＲ産物を、次に、配列決定して、ｉｎｄｅｌの存在を確認した。
Ｃａｓ９タンパク質及び３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡをトランスフェクトされているトマトプロトプラストを、４８時間栽培し、次にアルギナートの除去後に収集した。総ゲノムＤＮＡを、次に、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してサンプルから単離し、遺伝子特異的プライマーを使用する３ｇ０９５３１０標的部位の増幅のための鋳型として使用した。この５３６ｂｐ ＰＣＲ断片を、次に、ＤＮｅａｓｙ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、次に、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドにライゲーションした。ライゲーションを化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換し、次にこれをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有している固体ＬＢ培地にプレートした。次に、ＰＣＲをＭ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーを使用して９６個の個々のコロニーで実施し、次に、これらのＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩで直接的に消化した。３ｇ０９５３１０ ｓｇＲＮＡは、このＸｈｏＩ部位にｉｎｄｅｌを誘導し、したがって、消化を受けないことによってスコアをつけられる、この部位の欠損は、ｉｎｄｅｌ形成の効率を決定するため多数のクローンについて遺伝子型決定する単純な方法である。ＸｈｏＩ消化に耐性があるＰＣＲ産物を、次に、配列決定して、ｉｎｄｅｌの存在を確認した。
【0092】
カルスについて、ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット（Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び上記３ｇ０９５３１０遺伝子特異的なプライマーを使用して直接的に遺伝子型決定した。もたらされたＰＣＲ産物を、次に、ＸｈｏＩで直接的に消化し、アガロースゲルで分析した。
【0093】
カルス再生
カルスを、２ｍｇ．ｌ－１ ゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ－１ ＩＡＡ培地を補充したＭＳ培地に移し、その後、再生したトマト苗を、温室に移す前に、０．５ｍｇ．ｌ－１ ＩＢＡを補充したＭＳ培地に根づかせた。
カルスを、２ｍｇ．ｌ－１ ゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ－１ ＩＡＡ培地を補充したＭＳ培地に移し、その後、再生したトマト苗を、温室に移す前に、０．５ｍｇ．ｌ－１ ＩＢＡを補充したＭＳ培地に根づかせた。
【0094】
結果
本発明者らの実験セットアップは、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁された８ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質、１５０ｐｍｏｌのインビトロ転写されたｓｇＲＮＡ及び２００，０００個のプロトプラストを含有しているフィーダーディスクを使用してトランスフェクトされたプロトプラストの生存を保証した。本発明者らのプロトコールで処理されたトマトプロトプラストからのゲノムＤＮＡを、トランスフェクション後４８時間で単離し、３ｇ０９５３１０標的部位を増幅するための鋳型として使用した。これらのＰＣＲ産物を、次に、ｉｎｄｅｌ変異を含有するクローンを同定するため、クローン化し、遺伝子型決定した。本発明者らは、クローン化したＰＣＲ産物の４％においてｉｎｄｅｌ変異を検出し（図５）、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡが、トマトプロトプラストに入ることができ、そこで、それらが正確なゲノム部位に標的化されるアクティブヌクレアーゼ複合体を形成することを示唆している。次のステップは、本発明者らのプロトコールが３ｇ０９５３１０標的部位においてｉｎｄｅｌ変異を有するカルスの生成を可能にすること及びこれらのカルスが予測されるｉｎｄｅｌ変異を保有する植物に再生できることも実証するためのものであった。したがって、本発明者らは、本発明者らのプロトコールを使用するプロトプラストトランスフェクションを反復し、次に、カルスを再生し、これを、次に、ｉｎｄｅｌの存在に関して遺伝子型決定した。本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡのための発現カセットを保有するプラスミドのトランスフェクションが関与するより確立された方法と比較して、タンパク質に基づく方法がｉｎｄｅｌ変異を創出することにいかに効率的であるかを決定することにも興味をもった。本発明者らがプロトプラストへのＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡトランスフェクションに由来するカルスについて遺伝子型決定すると、本発明者らは３．９％（６５８個のうちの２６個）が３ｇ０９５３１０標的部位でｉｎｄｅｌ変異を含有していることを見出した（図６）。プロトプラストへのプラスミドトランスフェクションに由来するカルスの遺伝子型決定は、２．８％（１１２８個のうちの３２個）が、３ｇ０９５３１０標的部位で変異を含有することを示した。これにより、タンパク質を使用する方法が、プラスミドを利用する、より確立された方法と同等であること、及びそれ固有の欠点がないことが実証された。本発明者らは、タンパク質及びプラスミド方法の両方から得られたカルスからトマト植物を再生できた。これらの植物について、遺伝子型決定し、元のカルスに存在していた同じ変異を含有することを見出した。
本発明者らの実験セットアップは、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁された８ｐｍｏｌのＣａｓ９タンパク質、１５０ｐｍｏｌのインビトロ転写されたｓｇＲＮＡ及び２００，０００個のプロトプラストを含有しているフィーダーディスクを使用してトランスフェクトされたプロトプラストの生存を保証した。本発明者らのプロトコールで処理されたトマトプロトプラストからのゲノムＤＮＡを、トランスフェクション後４８時間で単離し、３ｇ０９５３１０標的部位を増幅するための鋳型として使用した。これらのＰＣＲ産物を、次に、ｉｎｄｅｌ変異を含有するクローンを同定するため、クローン化し、遺伝子型決定した。本発明者らは、クローン化したＰＣＲ産物の４％においてｉｎｄｅｌ変異を検出し（図５）、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡが、トマトプロトプラストに入ることができ、そこで、それらが正確なゲノム部位に標的化されるアクティブヌクレアーゼ複合体を形成することを示唆している。次のステップは、本発明者らのプロトコールが３ｇ０９５３１０標的部位においてｉｎｄｅｌ変異を有するカルスの生成を可能にすること及びこれらのカルスが予測されるｉｎｄｅｌ変異を保有する植物に再生できることも実証するためのものであった。したがって、本発明者らは、本発明者らのプロトコールを使用するプロトプラストトランスフェクションを反復し、次に、カルスを再生し、これを、次に、ｉｎｄｅｌの存在に関して遺伝子型決定した。本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡのための発現カセットを保有するプラスミドのトランスフェクションが関与するより確立された方法と比較して、タンパク質に基づく方法がｉｎｄｅｌ変異を創出することにいかに効率的であるかを決定することにも興味をもった。本発明者らがプロトプラストへのＣａｓ９タンパク質／ｓｇＲＮＡトランスフェクションに由来するカルスについて遺伝子型決定すると、本発明者らは３．９％（６５８個のうちの２６個）が３ｇ０９５３１０標的部位でｉｎｄｅｌ変異を含有していることを見出した（図６）。プロトプラストへのプラスミドトランスフェクションに由来するカルスの遺伝子型決定は、２．８％（１１２８個のうちの３２個）が、３ｇ０９５３１０標的部位で変異を含有することを示した。これにより、タンパク質を使用する方法が、プラスミドを利用する、より確立された方法と同等であること、及びそれ固有の欠点がないことが実証された。本発明者らは、タンパク質及びプラスミド方法の両方から得られたカルスからトマト植物を再生できた。これらの植物について、遺伝子型決定し、元のカルスに存在していた同じ変異を含有することを見出した。
【0095】
このプロトコールの進行の間、本発明者らは、得られる結果を最適化する、特にトランスフェクトされたプロトプラストの生存を保証し、したがって、編集されたカルスの回収に成功する、重要ないくつかのパラメータを発見した。
【0096】
第１に、本発明者らは、驚くべきことに、Ｃａｓ９タンパク質緩衝剤中のグリセロールの存在が、プロトプラスト生存に大きいネガティブな効果を有し、できる限り低く、好ましくは、トランスフェクション混合物（終濃度）中に０．１％（ｖ／ｖ）のレベル未満で維持すべきことを見出した。
【0097】
第２に、トランスフェクションに加えられる、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡの量及び比（例えば、１：：２０のモル比で加えられる）が、結果に影響する。驚くべきことに、最適な実験結果を得るためには、これらは、ある特定の好ましい範囲内に入りうることが見出された。ＣＡＳタンパク質（ここでは、ＣＡＳ９）について、２～８０ナノモル（ｎＭ）ｐｍｏｌの間を使用してもよく、ｓｇＲＮＡについて、３０～６００ナノモル（ｎＭ）の範囲が最適であることが見出された。
【0098】
トランスフェクションにおけるプロトプラストの量は、好ましくは、１００００～２，０００，０００個／ｍｌの細胞の範囲であってもよい。最終的に、フィーダーディスク（好ましくは、５０，０００～２５０，０００個のプロトプラストを含有）が、トランスフェクトされたプロトプラストの生存を改善するため使用される場合、最適な結果が得られた。実際、標的部位でｉｎｄｅｌを含有している植物を最も提供する、最適な結果は、これらの最適な条件の全てが、単一トランスフェクションにおいて組合せて使用される場合、得られた。実験が、最適な条件の上記組合せを使用して、他の植物において類似の結果を提供し得ることを当業者は理解する。
【0099】
実施例２－トマトプロトプラスト生存におけるグリセロール濃度の効果
トマトプロトプラストを、葉から単離し、１ｍｌ当たり１ｘ１０６個の密度に培地中に再懸濁した。続いて、本発明者らは、０．５ｍｌのプロトプラストを取って、１μｇのＣａｓ９タンパク質、５μｇのｓｇＲＮＡ及び様々な量の６０％グリセロールを添加した（図７）。次に、ＰＥＧを各サンプルに添加（５００μｌを与えて最終的な容量の１ｍｌ）し、標準的なトランスフェクションを実施した（実施例１を参照）。次に、プロトプラストをアルギナート溶液中に再懸濁し、次に、これを重合させ、プロトプラストを７２時間培地中でインキュベートした。プロトプラストを含有しているアルギナートディスクを、次に、バイタル色素ＦＤＡ（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ ＦＤＡ）でインキュベートし、各サンプル中の生きているプロトプラストの数を計算した。
トマトプロトプラストを、葉から単離し、１ｍｌ当たり１ｘ１０６個の密度に培地中に再懸濁した。続いて、本発明者らは、０．５ｍｌのプロトプラストを取って、１μｇのＣａｓ９タンパク質、５μｇのｓｇＲＮＡ及び様々な量の６０％グリセロールを添加した（図７）。次に、ＰＥＧを各サンプルに添加（５００μｌを与えて最終的な容量の１ｍｌ）し、標準的なトランスフェクションを実施した（実施例１を参照）。次に、プロトプラストをアルギナート溶液中に再懸濁し、次に、これを重合させ、プロトプラストを７２時間培地中でインキュベートした。プロトプラストを含有しているアルギナートディスクを、次に、バイタル色素ＦＤＡ（ｖｉｔａｌ ｄｙｅ ＦＤＡ）でインキュベートし、各サンプル中の生きているプロトプラストの数を計算した。
【0100】
結果
トランスフェクションの間の０．１４％グリセロールの添加が、わずか３６時間培養後に単一細胞レベルで生存するプロトプラストにおいて既にネガティブな効果を有していることを結果は示している。本発明者らの少量のグリセロールをトランスフェクションに加えることが、カルス形成を厳密に阻害することができるとの以前の観察を考慮すれば、細胞生存における小さな減少でさえ、いかなるカルスも実験から得られないポイントまで細胞分裂も劇的に阻害することを本発明者らは予期する。
トランスフェクションの間の０．１４％グリセロールの添加が、わずか３６時間培養後に単一細胞レベルで生存するプロトプラストにおいて既にネガティブな効果を有していることを結果は示している。本発明者らの少量のグリセロールをトランスフェクションに加えることが、カルス形成を厳密に阻害することができるとの以前の観察を考慮すれば、細胞生存における小さな減少でさえ、いかなるカルスも実験から得られないポイントまで細胞分裂も劇的に阻害することを本発明者らは予期する。
【0101】
以上、本発明が完全に記載されたが、同じ発明が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく且つ過度の実験なしで、広範囲の同等なパラメータ、濃度、及び条件内で実施することができることは当業者に理解されよう。
【0102】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されてきたが、更なる改変が可能であることが理解されよう。この出願が、通常は本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用、又は適用も網羅することが意図されており、これには、本発明が関係する技術分野の公知又は慣用の実施の範囲内に収まり、添付の特許請求の範囲に従うものとして先に記載された必須の特徴に適用され得るような本開示からの逸脱も含まれる。
【0103】
本明細書において引用されている全ての参照は、雑誌論文若しくは要約、公開された若しくは対応する特許出願、特許、又は任意の他の参照を含み、全体が参照により本明細書に組み込まれ、引用されている参照に提示される全てのデータ、表、図、及びテキストを含む。加えて、本明細書において引用されている参照内に引用される参照の全体の内容も、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0104】
公知の方法ステップ、従来の方法ステップ、公知の方法又は従来の方法への参照は、本発明の何らかの態様、説明又は実施形態が、関連性がある技術分野において開示、教示又は示唆されているとの何らかの承認ではない。
【0105】
特定の実施形態の前述の説明は、他が、当業者の知識（本明細書に引用されている参照の内容を含む）を適用することによって、過度の実験なしで、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態の様々な適用に関して容易に改変及び／又は適応することができるほど完全に、本発明の一般的な性質を明らかにする。したがって、そのような適応及び改変は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内であることが意図されている。本明細書の語法又は用語法は、説明の目的のためであり、制限されなく、本明細書の用語法又は語法は、本明細書に提示される教示及びガイダンス、当業者の知識の組合せに照らして、当業者によって解釈されることが理解される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】