特許 7161237 丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-18

(45)【発行日】2022-10-26

(54)【発明の名称】丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/343 20060101AFI20221019BHJP

   A61P 5/28 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20221019BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20221019BHJP

   A61K 36/537 20060101ALI20221019BHJP

【ＦＩ】

A61K31/343

A61P5/28

A61P13/08

A61P17/14

A23L33/105

A61K36/537

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020567509

(86)(22)【出願日】2020-10-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-28

(86)【国際出願番号】 KR2020015058

(87)【国際公開番号】W WO2021086120

(87)【国際公開日】2021-05-06

【審査請求日】2020-12-10

(31)【優先権主張番号】10-2019-0137533

(32)【優先日】2019-10-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0157928

(32)【優先日】2019-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0049163

(32)【優先日】2020-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0142540

(32)【優先日】2020-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520470084

【氏名又は名称】株式会社 キュロム・バイオサイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＣＵＲＯＭＥ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ジュ ソク

(72)【発明者】

【氏名】ソ、ガン シク

(72)【発明者】

【氏名】ハン、ジョン ス

(72)【発明者】

【氏名】キム、ウン ギョン

【審査官】井上 能宏

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５１７０２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００５５９４５（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１９－００４９４６７（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１２－００５３２４８（ＫＲ，Ａ）

【文献】米国特許第０５２３４６９８（ＵＳ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５００５５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】C. Wang et al.，Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology，2015年，vol. 145，p. 28-37

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含み、
前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、４０％ ～９９％エタノール抽出物であり、タンシノン類を前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉ ｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物全重量の２％～７０％含有し、
前記タンシノン類は、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、及び１５ ，１６－ジヒドロタンシノンを含む
ことを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用の組成物の製造方 法であって、
前記組成物は、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を含み、
前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を、
不純物を除去した丹参を破砕させる段階（１）；
前記（１）段階の破砕した丹参を５０℃～８０℃で４０％～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～２４時間放置する段階（２）；
前記（２）段階の丹参が抽出された酒精を分離し、残った残渣に新しい酒精を入れ、５０℃～８０℃で４０％～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～１２時間放置する段階（３）；
前記（３）段階の丹参が抽出された酒精を分離し、残った残渣に新しい酒精を入れ、５０℃～８０℃で４０％～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～５時間放置する段階（４）；
前記（２）～（４）段階で分離しておいた酒精を集めて４５℃～７５℃で蒸発、乾燥させる段階（５）；
前記（５）段階で蒸発、乾燥させた固形抽出物を粉砕し、８０ｍｅｓｈ以上でフィルタリングして丹参抽出物を得る段階（６）；を含む製造方法によって製造する
ことを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は防用組成物の製造方法。

【請求項4】

前記不純物を除去した丹参を破砕させる段階（１）は、丹参を－１９６℃～－８０℃の極低温で短時間に凍結し、５ｍｍ以下に粉砕する超微細粉砕工程（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＭＧＴ）で粉砕する
請求項３に記載の前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物の製造方法 。

【請求項5】

丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含み、
前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、４０％ ～９９％エタノール抽出物であり、タンシノン類を前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉ ｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物全重量の２％～７０％含有し、
前記タンシノン類は、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、及び１５ ，１６－ジヒドロタンシノンを含む
ことを特徴とする立腺肥大症又は脱毛症の予防又は改善用健康機能食品。

【請求項6】

１５，１６－ジヒドロタンシノンを有効成分として含む
ことを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物。

【請求項7】

１５，１６－ジヒドロタンシノンを有効成分として含む
ことを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の予防又は改善用健康機能食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）は、５０歳以上の男性における尿路系の一般的な慢性疾患である（非特許文献１：Ｂｅｒｒｙ Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ＢＰＨはまた、尿線途絶、頻尿、尿意切迫感、尿勢低下及び残尿感を含む尿路症状低下（ＬＵＴＳ）と関連があり、これにより、高齢者の生活の質が悪くなり、日常生活に否定的な影響を及ぼすことになる（非特許文献２：Ｓａｒｍａ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0003】

ＢＰＨの根本的な原因は知られていないが、老化した男性の前立腺はアンドロゲンによって影響を受けることがよく知られている（非特許文献３：Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＢＰＨの進行中に、アンドロゲンは自己分泌又はパラクリーン方式で前立腺の上皮細胞又は基質細胞の増殖を促進し、前立腺細胞増殖と細胞自殺の不均衡をもたらす。これはＢＰＨの重要な原因とされてきた（非特許文献４：Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0004】

特に、ジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ、ＤＨＴ）は、ＢＰＨの発達と関連があることがよく知られている。加齢するにつれて男性の性ホルモンであるテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ）が前立腺でジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に高い割合で転換し始めるが、これは、一次的にテストステロンをＤＨＴに転換させる酵素であるレダクターゼ（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）酵素の濃度が高くなることが原因である。ＤＨＴはアンドロゲン受容体（ＡＲ）の結合力が高いため、ＴＳＴに比較して、より強力なアンドロゲンである。５α還元酵素タイプ－２（５ＡＲ２）は前立腺でＴＳＴをＤＨＴに変換し、ＤＨＴはＡＲと結合してアンドロゲン依存性遺伝子の転写を増加させ、最終的に前立腺増殖に関連するタンパク質の合成の刺激を誘発し、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルを向上させる。一方、ＢＰＨと前立腺癌の進行中にＰＳＡレベルが増加するが、このことから、ＰＳＡはＢＰＨの診断に広く用いられている（非特許文献５：Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0005】

細胞周期は、前立腺基質及び上皮細胞から発生し、これらの分裂及び複製につながる。Ｇ１／Ｓ進行は、サイクリンＤ１によって高度に規制される。また、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）は、細胞周期においてＧ１／Ｓ段階に対する組織学的マーカーとして認識された酸性核タンパク質である。したがって、ＰＣＮＡとｃｙｃｌｉｎ Ｄ１の発現は、ＢＰＨの間に前立腺細胞の増殖状態を反映することができる（非特許文献６：Ｗａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0006】

逆に、前立腺上皮の細胞自殺は、ＢＰＨよりも正常な状態で前立腺においてより頻繁に発生する。細胞自殺を抑制するＢｃｌ－２はまた、前立腺の上皮で発見され、前立腺組織の増殖につながる（非特許文献７：Ｃａｒｄｉｌｌｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0007】

ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）などの男性ホルモンによる別の症状の一つは、男性型脱毛症（ｍａｌｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｂａｌｄｎｅｓｓ）である。脱毛の原因としては、血液循環不良説、男性ホルモン作用過剰説、皮脂分泌過剰説、フケ菌およびその他の細菌などによる頭皮機能低下説、遺伝的要因、加齢、ストレスなどが挙げられているが、現在まで、男性ホルモンの過剰分泌と直接関係がある、最も一般的な脱毛の一類型であるアンドロゲン性脱毛症（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ａｌｏｐｅｃｉａ）の原因が明らかになっている。

【0008】

アンドロゲン性脱毛症がある場合、健康な毛髪は徐々に細くなり、短くなり、毛髪が弱くなって砕けやすくなる現象が現れるが、このような現象を縮小化（ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎ）という。縮小化が起こる毛嚢は、最終的に細くて目に見えない短い綿毛に変わって脱毛に進む。そこで、最近、男性ホルモン活性抑制を用いた脱毛の予防及び治療のための多くの研究が報告されている。

【0009】

テストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）が５α還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によって活性型男性ホルモンであるジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）に転換され、このように活性化されたジヒドロテストステロンがアンドロゲン受容体と結合して毛嚢細胞のタンパク質合成を遅延させ、毛嚢の成長期が短縮され、毛嚢が萎縮され、脱毛を誘発する。また、アンドロゲン性脱毛の過程で、皮脂が過剰生成されることもあり、その結果として、頭皮では炎症を伴う脱毛が発生することもある（非特許文献８：Ｄｅｎｎｉｓ Ａ．Ｈｏｌｔ，ｅｔ．ａｌ，．１９９０）。

【0010】

現在開発されているテラゾシン、ドキサゾシン、タムスロシン、アルフゾシンなどのようなａｌｐｈａ－１アドレナリン遮断薬として用いられる前立腺肥大症治療剤は、前立腺平滑筋を弛緩させて尿道閉塞症状を緩和させるが、交感神経遮断による低血圧、血管拡張性頭痛などの副作用が報告されている。

【0011】

５α還元酵素阻害剤であるフィナステリド（Ｆｉ）とデュタステリドは、テストステロンが５α還元酵素によって活性代謝物であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に転換することを抑制し、前立腺のサイズを減らし、ＢＰＨ及び脱毛症に用いられる効果的なものとして知られているが（非特許文献９：Ｐａｒｋ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８）、これらの薬物は、勃起不全、性欲の減少、及び射精における精液体積の減少のような副作用を伴うことが知られている。このように、現在使用している薬物治療に多少効果があるといえるが、その副作用が問題であり、事実上、前立腺肥大症は継続する老化現象の一つであって、根本的治療が難しい。

【0012】

そこで、副作用の少ない効果的な治療戦略を見つけようとする研究者らは、天然材料で製造された薬剤を含む代替医療に関心が高い。現在、天然材料の中ではソーパルメット抽出物だけがＢＰＨに効果を有する機能性食品として広く知られている（非特許文献１０：Ｍａｒｋｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０００）。

【0013】

丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）は、シソ科に属する多年生草で、根が高麗人参に似ており、色が赤いことから丹参と名付けられたものである。丹参は昔から、血管を丈夫にする薬草として知られており、丹参のタンシノン成分が、血管中の老廃物が酸化することを抑えて血管の若返りを助け、血管を拡張させて血液の循環を改善し、高血圧や心筋梗塞のような血管疾患を予防することが知られている。漢方医学でも丹参は、血液の流れを促進し、お血を除去し、新しい血液生成に役立つ薬草として記録されている。

【0014】

特許文献１：韓国公開特許公報第２０１２－００２０６３９号には、丹参を含む前立腺癌治療用組成物が開示されており、特許文献２：韓国公開特許公報第２００１－００７６８１０号には前立腺疾患及び痔疾治療用組成物の製造方法及びその製造方法による組成物として、虎杖根、馬歯けん、益智仁、車前子、蒲公英、金銀花、龍胆草、大黄，鶏内金、蘇木、木瓜、川楝子、五霊脂、丹参、沒薬、破故紙、威霊仙、乳香、龍脳、玄胡索、白屈菜、小茴香、三稜、蓬朮、蛇床子、香附子、烏薬、地龍、水蛭をそれぞれ２～５ｗｔ％を混合して製造した丸剤が開示されているが、本発明の丹参抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症の予防治療組成物は記載されていない。

【0015】

また、特許文献３：韓国登録特許公報第０２５９０３７号には、半夏、丁香、トックリイチゴ、山椒、蔓荊子、丹参及び柏子仁の粉末を油及びエタノールのそれぞれに浸漬後に一定期間熟成させて結果した抽出物を用いて外用液剤を製造し、直接適用する発毛促進用外用液剤が記載されているが、本発明の構成とは異なる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【文献】韓国公開特許第２０１２－００２０６３９号、丹参を含む前立腺癌治療用組成物、２０１２．０３．０８．公開

【文献】韓国公開特許第２００１－００７６８１０号、前立腺疾患及び痔疾治療用組成物の製造方法及びその製造方法による組成物、２００１．０８．１６．公開。

【文献】韓国登録公報第０２５９０３７号、発毛促進用外用液剤、２０００．０３．１６．登録

【非特許文献】

【0017】

【文献】Berry, S.J.; Coffey, D.S.; Walsh, P.C.;Ewing, L.L. The development of human benign prostatic hyperplasia with age. J. Urol. 1984, 132, 474-479.

【文献】Sarma, A.V.; Wei, J.T. Clinical practice. Benign prostatic hyperplasia and lower urinary tract symptoms. N. Engl. J. Med. 2012, 367, 248-257.

【文献】Kim, S.K.; Seok, H.; Park, H.J.; Jeon, H.S.; Kang, S.W.; Lee, B.C.; Yi, J.; Song, S.Y.; Lee, S.H.; Kim, Y.O.; et al. Inhibitory effect of curcumin on testosterone induced benign prostatic hyperplasia rat model. BMC Complement. Altern. Med. 2015, 15, 380-386

【文献】Choi, H.M.; Jung, Y.; Park, J.B.; Kim, H.L.; Youn, D.H.; Kang, J.W.; Jeong, M.Y.; 3 Lee, J.H.; Yang, W.M.; Lee, S.G.; et al. Cinnamomi cortex (Cinnamomum verum) suppresses testosterone-induced benign prostatic hyperplasia by regulating 5α-reductase. Sci. Rep. 2016, 6, 31906-31917.

【文献】Chen, Y.; Robles, A.I.; Martinez, L.A.; Liu, F.; Gimenez-Conti, I.B.; Conti, C.J. Expression of G1 cyclins, cyclin-dependent kinases, and cyclin-dependent kinase inhibitors in androgen-induced prostate proliferation in castrated rats. Cell Growth Differ. 1996, 7, 1571-1578.

【文献】Wang, W.; Bergh, A.; Damber, J.E. Chronic inflammation in benign prostate hyperplasia is associated with focal upregulation of cyclooxygenase-2, Bcl-2, and cell proliferation in the glandular epithelium. Prostate 2004, 61, 60-72.

【文献】Cardillo, M.; Berchem, G.; Tarkington, M.A.; Krajewski, S.; Krajewski, M.; Reed, J.C.; Tehan, T.; Ortega, L.; Lage, J.; Gelmann, E.P. Resistance to apoptosis and up regulation of Bcl-2 in benign prostatic hyperplasia after androgen deprivation. J. Urol. 1997, 158, 212-216.

【文献】Dennis A. Holt; Mark A. Levy; Hye Ja Oh; Jill M. Erb; Julie I.; Heaslip; Martin Brandt; Hsuan Yin Lan-Hargest; Brian W. Metcalf, Inhibition of steroid 5.alpha.-reductase by unsaturated 3-carboxy steroids, J. Med. Chem. 1990, 333, 943-950.

【文献】Park, E.S.; Lee, M.Y.; Jeon, W.W.; Seo, C.S.; You, S.S.; Shin, H.K. Paljung-San, a traditional herbal medicine, attenuates benign prostatic hyperplasia in vitro and in vivo. J. Ethnopharmacol. 2018, 218, 109-115.

【文献】Marks, L.S.; Partin, A.W.; Epstein, J.I.; Tyler, V.E.; Simon, I.; Macairan, M.L.; Chan, T.L.; Dorey, F.J.; Garris, J.B.; Veltri, R.W.; et al. Effects of a saw palmetto herbal blend in men with symptomatic benign prostatic hyperplasia. J. Urol. 2000, 163, 1451-1456.

【文献】SHAN GAO, SHIQIN LI, QIN LI, FUYONG ZHANG, MENGQI SUN, ZILIN WAN and SHURONG WANG, Protective effects of salvianolic acid B against hydrogen peroxide-induced apoptosis of human umbilical vein endothelial cells and underlying mechanisms, INTERNATIONAL JOURNAL OF MOlecular medicine 44: 457-468, 2019

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

本発明の目的は、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症治療又は予防用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0019】

上記の課題を解決するために、本発明は、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物の有効成分を含む前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物を提供する。

【0020】

前記丹参抽出物は、蒸留水又はエタノール抽出物であってもよく、他の溶媒が用いられてもよい。抽出溶媒の種類によって、抽出温度、抽出時間、溶媒の量及び残留成分処理方式などを異ならせて設計することができる。抽出溶媒も、様々な溶媒が使用可能であり、抽出可能な溶媒には、水、エタノール、メタノール、脂肪油、グリセリン、麻油、エチルアセテート、アセトン、ブタノール、イソプロパノール及びメチレンクロリドなどがある。

【0021】

前記丹参抽出物は、特に、炭素数１～６のアルコール又はこれらの混合溶媒で抽出した抽出物であり得る。前記アルコールはエタノールでよく、４０～９９％エタノールであり得る。
前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、４０～９９％エタノール抽出物であり得る。

【0022】

前記丹参抽出物は濃縮され得る。マイクロ波乾燥方法で抽出物を４０～８０℃で加熱して水分を除去できる。または、低温真空乾燥方法で抽出物を濃縮乾燥できる。低温真空乾燥は、乾燥器内部の圧力を真空に維持し、温度を５～１５℃程度に調節して乾燥させる方法であり、抽出成分の変性がなく、味も香りも消失しない。設計条件によっては、噴霧乾燥、冷風乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、遠赤外線乾燥、陰干し、減圧乾燥などの方法が利用できる。

【0023】

丹参はまた、極低温超微細粉砕工程（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＭＧＴ）を用いて製造できる。より具体的には、－１９６℃～－８０℃の極低温で丹参根を短時間に凍結後に微細粉末に粉砕し、向上した物性を有する粉末を製造できる。

【0024】

前記丹参濃縮物は乾燥させて様々な剤形にすることができる。噴霧乾燥方法で抽出物を濃縮乾燥させた後、様々な剤形に製造できる。例えば、粉末に製造できる。低温真空乾燥は、乾燥器内部の圧力を真空に維持し、温度を５℃～１５℃程度に調節して乾燥する方法であり、抽出成分の変性がなく、味も香りも消失しない。設計条件によっては、冷風乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、遠赤外線乾燥、陰干し、減圧乾燥などの方法が利用できる。好ましくは、丹参（Ｓ．ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｚａ）はエタノール５０ｌで２４時間溶出させた後、減圧濃縮できる。ここに、水１５００ｍｌを添加し、同量のｎ－ヘキサン、ジクロロメタン（ＣＨ_２Ｃｌ_２）及びエチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）を入れ、順に２回反復抽出し、ゲル（ｇｅｌ）状の赤色抽出物の丹参抽出物が製造できる。

【0025】

丹参は、極低温冷凍凍結微細粉末の蒸留水又はエタノール溶解物であり得る。しかし、これに限定されず、丹参は、熱水抽出法、蒸留抽出法、エタノール抽出法、超音波エタノール抽出法、超音波水抽出法など、利用可能な公知の抽出方法で抽出できる。前記丹参抽出物は、０．０１～７００μｇ／ｍｌの量で含むことができる。

【0026】

前記のような方法において、丹参の有効成分であるタンシノン類の含有量を増加させることができる。丹参（Ｓ．ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、タンシノン類が全重量の２％～７０％含まれたものであり得る。
前記で丹参抽出物は、メチレンクロリドを含む有機溶媒で分別抽出でき、カラムを用いて特定成分を濃縮することができる。
前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、タンシノン類が全重量の２％～７０％で含まれたものであり得る。

【0027】

前記タンシノン類は、タンシノン１（１，６－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ［１，２－ｂ］ｆｕｒａｎ－１０，１１－ｄｉｏｎｅ又は１，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈｏ［１，２－ｇ］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ－１０，１１－ｄｉｏｎｅ）、タンシノン２ａ（１，６，６－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－６，７，８，９－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ［１，２－ｂ］ｆｕｒａｎ－１０，１１－ｄｉｏｎｅ）、クリプトタンシノン（（Ｒ）－１，２，６，７，８，９－Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１，６，６－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ（１，２－ｂ）ｆｕｒａｎ－１０，１１－ｄｉｏｎｅ）、１５，１６－ジヒドロタンシノン（（１Ｒ）－１，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１，２－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｏ［１，２－ｇ］［１］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ－１０，１１－ｄｉｏｎｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ－Ｉ）からなる群から選ばれる一つ以上を有効成分として含むことができ、前記４種のタンシノン以外のタンシノンであってもよい。

【0028】

本発明は、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン及びタンシノン酸からなる群から選ばれる一つ以上を有効成分として含むことを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物を提供する。

【0029】

今まで知られた主要タンシノン類には、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン又はジヒドロタンシノンがあり、タンシノン酸をはじめとして、末端作用基を異にするその他タンシノンが含まれる。丹参の有効成分は、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン又はジヒドロタンシノンであり得、有効成分は、好ましくはタンシノン２ａ、又はジヒドロタンシノン又はタンシノン酸を含むその他タンシノン類でよく、より好ましくはジヒドロタンシノン又はその他タンシノン類であり得る。

【0030】

本発明は、丹参抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症治療又は予防薬学組成物を提供する。本発明の薬学組成物は、丹参抽出物、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン及び／又はタンシノン酸など、その他タンシノン類を含む丹参の有効成分を含むことができる。

【0031】

前記薬学組成物は担体又は賦形剤を含むことができ、これらはそれぞれ、薬学的組成物全重量に対して、好ましくは０．００１重量％～９０重量％、より好ましくは０．００１重量％～５０重量％、最も好ましくは０．００１重量％～３０重量％となるように添加できる。

【0032】

前記薬学組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因に基づいて様々に処方できる。本発明の薬学組成物は、前記タンシノン誘導体を有効成分として含有する。前記薬学組成物は、臨床投与時に、経口又は非経口で投与可能であり、通常の医薬品製剤の形態で使用可能である。すなわち、本発明の組成物は、実際の臨床投与時に、経口及び非経口の様々な剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤及びカプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、タンシノン誘導体に少なくとも一つ又はそれ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単純な賦形剤の他に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤及びシロップ剤などが挙げられるが、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤及び保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤及び坐剤が含まれる。非水溶性溶剤と懸濁溶剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロール及びゼラチンなどを用いることができる。

【0033】

投薬単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍を含有したり、又は１／２、１／３又は１／４倍を含有できる。個別投薬量は、好ましくは、有効薬物が１回投与される量を含有し、これは通常、１日投与量の全部、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。タンシノン誘導体の有効容量は濃度依存的であるが、好ましくは０．１ｍｇ～１，０００ｍｇ／ｋｇ、より一層好ましくは０．４～５００ｍｇ／ｋｇであり、１日１～６回投与できる。したがって、成人体重１ｋｇ当たり０．１～６，０００ｍｇ／日の範囲で投与できる。

【0034】

前記薬学的組成物は、ネズミ、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与できる。投与の全ての方式が予想可能であり、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与できる。

【0035】

前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物は、５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ステロイド受容共活性因子－１（ＳＲＣ－１）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）からなる群から選ばれる一つ以上のタンパク質の発現を減少させることができる。前記タンパク質は、アンドロゲン関連タンパク質であり、前立腺肥大症又は脱毛症において増加する様相を示す。
本発明は、前記丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物が、
不純物を除去した丹参を破砕させる段階（１）；
前記（１）段階の破砕した丹参を５０～８０℃で４０～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～２４時間放置する段階（２）；

【0036】

前記（２）段階の丹参が抽出された酒精を分離し、残った残渣に新しい酒精を入れ、５０～８０℃で４０～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～１２時間放置する段階（３）；

【0037】

前記（３）段階の丹参が抽出された酒精を分離し、残った残渣に新しい酒精を入れ、５０～８０℃で４０～９９％の酒精（ＥｔＯＨ）に浸漬させ、２～５時間放置する段階（４）；
前記（２）～（４）段階で分離しておいた酒精を集めて４５～７５℃で蒸発、乾燥させる段階（５）；

【0038】

前記（５）段階で蒸発、乾燥させた固形抽出物を粉砕して８０ｍｅｓｈ以上でフィルタリングし、丹参抽出物を得る段階（６）；を含む丹参抽出物製造方法によって製造されることを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物を提供する。

【0039】

また、前記不純物を除去した丹参を破砕させる段階（１）は、丹参を－１９６℃～－８０℃の極低温で短時間に凍結させ、５ｍｍ以下に粉砕する超微細粉砕工程（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＭＧＴ）で粉砕させることを特徴とする前立腺肥大症又は脱毛症の治療又は予防用組成物を提供する。

【0040】

本発明は、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症又は脱毛症の予防又は改善用健康機能食品を提供する。

【0041】

前記健康機能食品は、丹参抽出物、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン又はタンシノン酸などのその他タンシノン類を含む丹参の有効成分及び食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む健康機能食品を提供する。

【0042】

前記健康機能食品は、前記丹参抽出物、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン及び／又はタンシノン酸などその他タンシノン類を含む丹参の有効成分が、健康機能食品全重量に対して、好ましくは０．００１重量％～５０重量％、より好ましくは０．００１重量％～３０重量％、最も好ましくは０．００１重量％～１０重量％となるように添加できる。

【0043】

本発明の丹参抽出物は、健康機能食品全重量に対して、好ましくは０．００１重量％～５０重量％、より好ましくは０．００１重量％～３０重量％、最も好ましくは０．００１重量％～１０重量％となるように添加できる。

【0044】

前記健康機能食品は、錠剤、カプセル剤、丸剤又は液剤などの形態を含み、本発明の抽出物を添加できる食品には、例えば、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、クッキー類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、粉ミルク、禅食、生食、乳酸菌発酵乳、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがある。具体的に、丹参抽出物を含む健康食品には、丹参抽出物を主成分として作った汁、茶、ジェリー、ジュースなどの健康食品及び嗜好品が挙げられ、浮腫、腎臓炎、尿道炎などを目的とする民間療法剤などが挙げられる。

【0045】

前記丹参抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症治療又は予防用組成物は、化粧料組成物として製造されてもよい。化粧料組成物として用いる場合、丹参抽出物をそのまま添加してもよいが、他の化粧品成分と共に用いられてもよく、通常の方法によって適切に用いることができる。有効成分の混合量は、その使用目的によって適切に決めることができ、一般に、丹参抽出物を用いた化粧品製造時に、原料の全重量に対して０．０００１～１０重量％、好ましくは０．１～５重量％の量で添加できる。化粧品には、皮膚外用軟膏、クリーム、柔軟化粧水、栄養化粧水、パッグ、エッセンス、ヘアトニック、シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ジェル、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、色調化粧品、栄養エッセンス、サンスクリーン、石鹸、クレンジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション及びボディークレンザーからなる群から選ばれるいずれか一つの剤形を有する化粧料組成物であるが、これに制限されない。

【0046】

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウリン（ｍｅｔｈｙｌ ｔａｕｒａｔｅ）、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジメタノールアミド、植物性油、リノリン誘導体又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

【0047】

本発明の剤形は、蛍光物質、殺真菌剤、屈水性誘発物質、保湿体、芳香剤、芳香剤担体、タンパク質、溶解化剤、糖乳導体、日光遮断剤、ビタミン及び植物抽出物などを含む賦形剤をさらに含有できる。

【発明の効果】

【0048】

以上のように、本発明によれば、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物を有効成分として含む前立腺肥大症治療又は予防用組成物は、従来副作用の多い治療剤を代替可能な安全で強力な前立腺肥大症の治療及び予防組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】ＤＨＴ誘導されたＬＮＣａＰ細胞株において丹参が主成分として含有（約１０～２０％）されている丹参抽出物Ｓ、タンシノン類（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）が主成分として含有（約２２％）されている丹参抽出物Ｔ、及びその有効成分タンシノン１（Ｔａｎ１）、タンシノン２ａ（Ｔａｎ２ａ）、クリプトタンシノン（ＣｒｙＴ）及びジヒドロタンシノン（ＤｉｈＴ）による５α還元酵素タイプ２（５α ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｔｙｐｅ２，５ＡＲ２）、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）、ステロイド受容共活性因子－１（Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１，ＳＲＣ－１）、前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ，ＰＳＡ）の発現変化を、ウェスタンブロッティングで確認した結果である。

【図2】図１の各タンパク質を定量化して示すグラフである。

【図3】ＤＨＴ処理ＬＮＣａＰ細胞株に丹参抽出物Ｔ９５、Ｔ７０、Ｔ４０を濃度別に処理し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現に及ぼす効果を示すウェスタンブロッティング結果である。

【図4】図３のアンドロゲン受容体（ＡＲ）（Ａ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（Ｂ）をそれぞれ定量化して示すグラフである。

【図5】前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの体重変化を示すグラフである。

【図6】前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの前立腺サイズの変化を示す写真である。

【図7】前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの前立腺重さの変化を示すグラフである。

【図8】前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの前立腺の指数（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｉｎｄｅｘ）（体重に対する前立腺の重さ）変化を示すグラフである。

【図9】前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ４０がラットの前立腺肥大関連蛋白である５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，５ＡＲ２）、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現に及ぼす効果を示すウェスタンブロッティング結果である。

【図10】ＢＰＨにおいてテストステロンの信号伝達経路及び丹参抽出物の薬理機転を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

前立腺肥大症（ＢＰＨ）は、高齢者における尿路系の一般的な慢性疾患で、特に、高齢者のアンドロゲン代謝不均衡はＢＰＨの主な原因の一つである。アンドロゲン受容体（ＡＲ）と結合する５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）によるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）は、前立腺増殖と成長に影響を与える。ＢＰＨにおいて、アンドロゲン信号伝達関連タンパク質の発現レベルが高く現れることが報告されており、アンドロゲン信号伝達は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の過発現と関係がある。また、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の調節に関連する別の症状として脱毛症を挙げることができる。

【0051】

本発明は、前記前立腺肥大症（ＢＰＨ）及び脱毛症の信号伝達経路を研究している中で、丹参（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ）抽出物及びその有効成分が当該経路に関与することによって前立腺肥大症（ＢＰＨ）又は脱毛症の治療及び予防に優れた効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。

【0052】

以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、別の形態に具体化されてもよい。これらの実施例は、むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。

【0053】

＜実施例１．丹参抽出物の成分分析＞
１．１．丹参抽出物Ｓの製造

【0054】

破砕させた丹参根を５０～１００℃の熱水で抽出した。前記熱水で２時間～２４時間抽出した後、濾過して残渣を除去し、抽出液を集め、加熱して蒸発乾燥させた。蒸発させた固形物は、必要によって１００℃の高温の水で洗浄後、マイクロウエーブで５５℃、２５～３０分間乾燥後に粉砕し、６０ｍｅｓｈ以上でフィルタリングして準備した。前記段階で丹参から抽出した丹参抽出物Ｓの主要成分はサルビアノール酸（Ｓａｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）で、抽出物中に約１０～２０％含まれることが見られた。

【0055】

丹参抽出の効率を上げるために、丹参根に極低温超微細粉砕工程（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＭＧＴ）を用いることができる。ＣＭＧＴ（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、液体窒素を用いて－１９６℃の超低温状態で天産物や食品素材を急速冷凍粉砕し、本然の物性と味、栄養、香などの変化を最小化する加工技術である。常温で粉砕し難いか、脂肪含有量の高い素材、水分の多い素材などが加工でき、特に、原物固有特性の損傷無しで溶解力と分散力の向上が可能である。また、ＣＭＧＴは、原料を超低温で冷却して脆性破壊（衝撃に対して著しく砕けやすくする。）に有効な衝撃式粉砕方式である。粒子間摩擦による粉砕により粒子の形態が円形をなし、他の粉砕方式に比べて同一粒度において変性が少なく、粉砕発熱が低いので、脂分の多い素材の連続粉砕が可能であり、食品素材への適用が容易である。原物サイズが大きいものは、粗粉砕機（ドクサン製、韓国）で５ｍｍ以下に粉砕して使用し、Ｈｏｓｏｋａｗａ製の物（Ｌｉｎｒｅｘ Ｍｉｌｌ ＬＸ－１，Ｊａｐａｎ）とドクサン製の物のスクリュー（ｓｃｒｅｗ）を利用できるサイズの原物はそのままで粉砕する。

【0056】

丹参根を、極低温超微細粉砕工程（Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｒｏ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＭＧＴ）を用いて丹参ＣＭＧＴを製造した。より具体的には、－１１０～－９０℃の極低温で丹参根を短時間に凍結させ、４５００～５５００ｒｐｍで粉砕させて、丹参抽出物Ｓ及び下記丹参抽出物Ｔの製造に用いることができる。

【0057】

１．２．丹参抽出物Ｔの製造
丹参抽出物Ｔは、破砕させた丹参根を５０～８０℃で酒精（ＥｔＯＨ）で抽出した（丹参抽出物Ｔ）。また、抽出酒精の濃度による効果を確認するために、酒精の濃度を異にして丹参抽出物Ｔ１０（ＥｔＯＨ１０％）、Ｔ４０（ＥｔＯＨ４０％）、Ｔ７０（ＥｔＯＨ７０％）、Ｔ９５（ＥｔＯＨ９５％）、Ｔ９９（ＥｔＯＨ９９％）をそれぞれ得た。前記酒精で２～２４時間抽出し、必要によって新しい酒精でさらに２～１２時間抽出した後、必要によって新しい酒精で２～５時間さらに抽出して遠心分離し、上澄液を得た。その後、得られた上澄液を集めて４５～７５℃で蒸発、乾燥させた後に粉砕し、８０ｍｅｓｈ以上でフィルタリングして準備した。

【0058】

１．３．丹参抽出物の成分分析
前記実施例１．１及び１．２で抽出した丹参抽出物Ｓ及び丹参抽出物Ｔの成分及び含有量を測定した。特に、丹参に含まれている主要タンシノン４種成分を設定するために、既存研究者によって明らかにされた様々な化合物のうち、標準品が販売されているタンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン及びサルビアノール酸Ｂなどの成分が丹参抽出物に存在するか否かをＨＰＬＣ分析で確認した。ＨＰＬＣ条件は、次の通りである。カラム（Ｃｏｌｕｍｎ）；ｃａｄｅｚａ ｃｄ－Ｃ１８ ３．０μｍ、３．０ｍｍ×２５０ｍｍ、検出器（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）；ＤＡＤ（２５４ｎｍ）、温度（Ｔｅｍｐ．）；４０℃、試料量（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ）；１０μＬ、流速（Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）；０．２ｍＬ／ｍｉｎ、移動相（Ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）；８０％ ＭｅＯＨである。

【0059】

丹参抽出物には、主要タンシノン成分の他にも、様々なその他タンシノン類が含まれている。その他タンシノン類の標準品は購買し難い。このため、一般に、タンシノン類は、分子構造において共通骨格を有し、分子量が一定（分子量３００ｋＤａ前後）で、物理化学的性質が類似している点に着目し、タンシノン２ａを指標成分とした後、濃度別吸光度標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を設定し、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で２７０ｎｍ波長帯で吸光度を測定し、回帰方程式で全タンシノンを定量した。これを下記の表１に示す。

【0060】

【表1】

【0061】

前記表１に示すように、熱水抽出物である丹参抽出物Ｓには、タンシノン類は殆ど検出されず、サルビアノール酸Ｂが抽出物中１５．１４％検出された。また、エタノール１０％でタンシノン類は１．７２％、エタノール４０％で１０．７９％抽出され、エタノールの濃度を上げるほどタンシノン類の抽出効率が高くなることを確認した。エタノール９５％溶媒条件で抽出物中に全タンシノン類は２２．２２％含まれた。これと逆に、エタノールの濃度が上がるにつれてサルビアノール酸Ｂの含有量は急に減少した。

【0062】

タンシノン類のうちクリプトタンシノンが最も多く検出され、タンシノン２ａ、タンシノン１、１５，１６－ジヒドロタンシノンの順に検出され、主要タンシノン類以外のその他タンシノン類も、エタノール濃度が増加するにつれて抽出効率が増加した。丹参抽出物Ｔ９９の場合も丹参抽出物Ｔ９５と類似であったが、抽出過程時に加熱過程において不安定性が高く、大量生産への効率性が低いため、その後には丹参抽出物Ｔ９５を代表として用いた。

【0063】

＜実施例３．丹参抽出物がＤＨＴ処理ＬＮＣａＰ細胞においてアンドロゲン経路関連タンパク質レベルに及ぼす効果確認＞
３．１．細胞の培養

【0064】

本発明の丹参抽出物の前立腺肥大症及び脱毛症に対する効果を確認するために動物細胞を培養した。このとき、動物細胞は、アンドロゲンに敏感なヒト前立腺腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ細胞を使用し、韓国細胞株銀行（ソウル、韓国ＫＣＬＢ ＃：２１７４０）から購入した。細胞は、１００ｍｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンと１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が添加されたＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地で培養され、３７℃に維持されているＣＯ_２培養器内で培養された。

【0065】

３．２材料の準備
ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ，７０７４）及び抗マウスＩｇＧ（７０７６）に対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から購入した。ＡＲ（ＳＣ－８１６）、ＳＲＣ１（ＳＣ－３２７８９）、ＰＳＡ（ＳＣ－７６３８）及びβ－アクチン（ＳＣ－１６１６）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国テキサス州ダラス）から、５ＡＲ２に対する抗体（ａｂ１２４８７７）はＡｂｃａｍ Ｉｎｃ．（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市）から購入した。ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）培地、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンはＧｉｂｃｏ（ビックキャビン、ＯＫ、米国）から購入した。その他、フィナステリド、Ｆｉ（≧９７％純度）及びＤＨＴ（≧９９％純度）を含む試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｉｎｃ．（米国ミズーリ州セントルイス市）から購買した。
３．３ ＤＨＴ処理ＬＮＣａＰ細胞に対する丹参抽出物の効果

【0066】

ＬＮＣａＰ細胞株を１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンが補充された２ｍＬのＲＰＭＩ培地で６ウェルプレート（１×１０^６細胞／ウェル）に接種（ｓｅｅｄ）した。１日後、細胞を、２４時間ＤＨＴ（１０ｎｍｏｌ）及び丹参抽出物Ｓ、丹参抽出物Ｔ９５を１５μｇ／ｍｌ、タンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン及び１５，１６－ジヒドロタンシノンをそれぞれ５μＭ濃度になるように処理した。得られたＬＮＣａＰ細胞は、プロテアーゼ抑制剤カクテルを含有する冷放射線免疫沈殿分析（ＲＩＰＡ）緩衝液を用いて溶解させた。溶解された細胞を４℃で２０分間１３，０００ＲＰＭで遠心分離し、タンパク質濃度をＢＣＡ分析で測定した。細胞溶解物（３０μｇタンパク質／サンプル）を１２０％で９０分間１０％ラウリル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を室温で１時間５％脱脂乳でブロックした。

【0067】

その直後、ＡＲ、５ＡＲ２、ＰＳＡ及びＳＲＣ－１のような１次抗体（１：２０００に希釈）を一晩膜に反応させた。膜を洗浄した後、これらは、ヤギ抗ウサギＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合された二次抗体（１：１００００に希釈）と共に室温で１時間培養された。強化化学発光（ＥＣＬ）検出試薬を用いて免疫検出を行い、それを図１に示した。その後、ダビンチ（Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｃｈｅｍｉ）イメージングシステム（Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｋ．，ソウル）を用いて膜を撮影した。タンパク質信号の化学発光強度をＩｍａｇｅＪ １．４７ｖソフトウェアを用いて定量化し、図２に示した。結果は、ウィンド（Ｗｉｎｄｏｗｓ）用ＳＰＳＳバージョン１１．５（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、米国イリノイ州シカゴ市）によって得られたデータを、平均±平均標準誤差（ＳＥＭ）で示した。

【0068】

２つの連続正規分布変数の平均を独立標本に対してスチューデントｔ－検定で比較した。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重範囲検定を用いて、正規分布に従わない２個又は３個以上の変数グループの平均を比較した。ｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１は、統計的留意性に対する基準と見なした。

【0069】

図１及び図２に示すように、ＬＮＣａＰ細胞株は、ＤＨＴによってアンドロゲン受容体（ＡＲ）以外のアンドロゲン関連タンパク質の発現レベルが増加した。ここに丹参抽出物Ｓを処理した場合、ＤＨＴによって増加したＳＲＣ－１の発現が多少減少し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現量を４０％減少させた。しかし、前立腺肥大症に主要に増加する５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、却って発現が増加する様相が見られた。

【0070】

しかし、丹参抽出物Ｔの場合、５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ステロイド受容体共活性因子－１（ＳＲＣ－１）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）のタンパク質発現を全て著しく減少させた。特に、丹参抽出物Ｔは、５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現を、対照群に比べて低いレベルに抑制した。

【0071】

また、丹参から確認された主要タンシノンであるタンシノン１、タンシノン２ａ、クリプトタンシノン及び１５，１６－ジヒドロタンシノンの各５μＭをＤＨＴ誘導ＬＮＣａＰ細胞株に処理した場合、１５，１６－ジヒドロタンシノンにおいて、ＤＨＴによって増加したアンドロゲン関連タンパク質の抑制効果が最も高かった。特に、１５，１６－ジヒドロタンシノンは同一濃度でタンシノン２ａに比べて、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現を５倍以上抑制した。これは、前立腺肥大症又は脱毛症のようなアンドロゲン関連タンパク質を媒介とする疾病の治療及び予防に効果的な組成物が提供できるということを意味する。

【0072】

１５，１６－ジヒドロタンシノンは、５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）及びステロイド受容共活性因子－１（ＳＲＣ－１）の発現も、タンシノン２ａに比べてより効果的に抑制した。一方、丹参抽出物Ｔ１５μｇ／ｍｌ処理は、１５，１６－ジヒドロタンシノンに比べてより効果的にアンドロゲン関連タンパク質の発現を抑制した。これが処理濃度の差によるものかを確認するために、丹参抽出物Ｔ １５μｇ／ｍｌの個別タンシノンの含有量を前記表１の結果に基づいて換算し、表２に示した。

【0073】

【表2】

【0074】

前記表２に示すように、丹参抽出物Ｔに３．３３μｇ／ｍｌでタンシノン類が含まれており、ここには、アンドロゲン関連タンパク質の抑制効果に最も優れた１５，１６－ジヒドロタンシノンの含有量が０．２６μｇ／ｍｌしかなかったが、他の主要タンシノン類の効果に比べて優れたアンドロゲン関連タンパク質の抑制効果を示すことを確認した。これは、丹参抽出物Ｔに含まれた種々のタンシノン混合物が相乗効果を生んだり、又は４種の主要タンシノン以外のその他タンシノン類にアンドロゲン関連タンパク質の抑制効果に優れた化合物が含まれている可能性があるからとみられる。

【0075】

３．４ ＤＨＴ処理ＬＮＣａＰ細胞に対する丹参抽出物Ｔの濃度別効果
エタノール濃度による丹参抽出物のアンドロゲン関連タンパク質の抑制効果を確認するために、エタノール９５％、７０％、４０％でそれぞれ抽出した丹参抽出物Ｔ９５、Ｔ７０、Ｔ４０を、ＤＨＴ処理ＬＮＣａＰ細胞に濃度別に処理し、その効果を確認した。

【0076】

実施例３．３と同じ方法でＬＮＣａＰ細胞にＤＨＴを処理し、丹参抽出物Ｔ９５、Ｔ７０、Ｔ４０をそれぞれ、５、１０、１５μｇ／ｍｌで投与した後、アンドロゲン受容体（ＡＲ）及び前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ＰＳＡ）の発現を確認し、図３及び図４に示した。

【0077】

図３及び図４に示すように、丹参抽出物Ｔ９５、Ｔ７０、Ｔ４０は、濃度依存的にアンドロゲン受容体（ＡＲ）及び前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ＰＳＡ）の発現を抑制し、丹参抽出物Ｔ９５が最も優れた効果を示した。また、丹参抽出物Ｔ７０はＴ４０に比較して大差はなかったが、丹参抽出物Ｔ７０がＴ４０に比べて抑制効果に優れる傾向を示した。このような結果を、表１の成分含有量に基づいて分析すると、タンシノン類の抽出比率が顕著に増加し、サルビアノール酸などの物質含有量が減少するエタノール４０％～９９％が、最適の溶媒濃度であることが確認できる。

【0078】

＜実施例４．前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔの効果確認＞
４．１．テストステロンで誘導した前立腺肥大症動物モデル構築

【0079】

９週齢（体重３５０ｇ以下）のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを１週間以上馴化飼育後に実験に使用した。前立腺肥大症を誘導するために、睾丸を除去した後、テストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、トウモロコシ油に溶かして使用）を３ｍｇ／ｋｇの容量で１回／３日、合計１０回皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。

【0080】

４．２．前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物の効果確認
９週齢（体重３５０ｇ以下）のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを無作為に（１）正常群、（２）前立腺肥大症誘導及びビークル投与群（陰性対照群）、（３）前立腺肥大症誘導及び丹参抽出物Ｓ投与群、（４）前立腺肥大症誘導及び丹参抽出物Ｔ７０投与群、（５）前立腺肥大症誘導及び丹参抽出物Ｔ４０投与群、（６）前立腺肥大症誘導及び丹参抽出物Ｔ１０投与群、（７）前立腺肥大症誘導及びソーパルメットの実抽出物投与群（陽性対照群、告示型原料）、（８）前立腺肥大症誘導及びフィナステリド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）投与群（陽性対照群、治療剤）に分離した。

【0081】

前立腺肥大症誘導群は、前記実施例４．１の方法で睾丸を除去した後、ジヒドロテストステロン（Ｄｉｈｙｄｒｏ－ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、トウモロコシ油に溶かして使用）を３ｍｇ／ｋｇの容量で１回／３日、合計１０回皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、正常群は、同量のトウモロコシ油を皮下注射した。

【0082】

丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０とソーパルメットの実抽出物は蒸留水に溶かして１０～２５ｍｇ／ｋｇの容量で１回／日、１４日間経口投与した。フィナステリド投与群（シグマ、０．２％ツイン８０に溶かして使用）は、１０ｍｇ／ｋｇの容量で１回／１日、１４日間経口投与した。陰性対照群は、蒸留水だけを経口投与した。実験が終了する時点に体重を測定し、最後の投薬及び処理が終わった次の日にＳＤ－ラットを二酸化炭素ガスで犠牲させた後、前立腺組織を摘出して重さを測定し、その結果を図５～図７に示した。全ての動物関連手続きは、建国大学校動物保護機関と使用委員会によって検討され承認された。

【0083】

図５は、前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの体重変化を示すグラフである。図５に示すように、前立腺肥大症動物モデル（ＢＰＨ）は、対照群（Ｃｏｎ）に比較して体重に有意の差がなく、睾丸除去手術後、テストステロン処理される前立腺肥大症動物モデルが適切に確立されたことを確認した。ここに、陽性対照群であるソーパルメット（ＢＰＨ＋Ｓａｗ）及びフィナステリド（ＢＰＨ＋Ｆｉ）を投与した場合、対照群（Ｃｏｎ）と大差がなく、丹参抽出物Ｔ（ＢＰＨ＋丹参Ｔ７０～Ｔ１０）を処理した場合にも体重に有意の変化はなかった。しかし、丹参抽出物Ｓの場合、対照群に比較して体重が減少した。丹参抽出物Ｓは、表１に示した通り、サルビアノール酸Ｂが１５％以上含まれている。非特許文献１１：ＳＨＡＮ ＧＡＯら（２０１９）によれば、サルビアノール酸Ｂは細胞内で強力な抗酸化機能をし、酸化状態によって開始されるプログラムされた細胞死を抑制する機能を有し、その他にも、抗炎、抗癌機能が多数知られている。しかし、ＳＨＡＮ ＧＡＯら（２０１９）が報告した通り、サルビアノール酸Ｂは、一定濃度で細胞毒性を有しており、他の抗癌機能も、癌細胞への細胞毒性効果を用いる場合が多い。本発明者等は、丹参抽出物Ｓがサルビアノール酸Ｂを高い濃度で含んでおり、前立腺肥大症動物モデルにおいて一定の細胞毒性を示し、このような過程がＳＤラットの体重減少につながると解析した。特に、図１及び表１に示したように、サルビアノール酸Ｂを主に含んでいる丹参抽出物Ｓは、前立腺肥大症に主要に増加する５α還元酵素タイプ２（５ＡＲ２）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を却って増加させる様相を示し、丹参抽出物を前立腺肥大症に用いるにはサルビアノール酸Ｂの除去が必要であると考えられる。

【0084】

図６は、前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの前立腺サイズの変化を示す写真である。ＢＰＨ処理によってサイズが増加したラットの前立腺は、丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によって減少した。図７は、前立腺肥大症動物モデルにおいて丹参抽出物Ｔ７０～Ｔ１０処理によるラットの前立腺重さの変化を示すグラフであり、図８は、各サンプルの前立腺の指数（体重に対する前立腺の重さ）変化を示すグラフである。図６～図８に示すように、丹参抽出物Ｓは全体的にラットの体重を減少させ、前立腺のサイズを殆ど縮小させず、前立腺の指数（体重に対する前立腺の重さ）が前立腺肥大症モデル（ＢＰＨ）に比べて却って増加した。

【0085】

これに対し、丹参抽出物Ｔ７０及びＴ４０は、対照群（Ｃｏｎ）に類似する程度に前立腺重さ及び前立腺の指数を示し、４０％エタノール抽出物で前立腺肥大症や男性型脱毛を治療するために主に用いられる薬物であるフィナステリドと略同じ効果を示した。丹参抽出物Ｔ１０は、前立腺重さ及び前立腺の指数の減少に、ある程度効果はあったが、丹参抽出物Ｔ７０及びＴ４０のように顕著な差を示すことはできなかった。これは、エタノール濃度を上げて抽出するにつれて増加するタンシノン類の含有量が減少し、サルビアノール酸Ｂが減少する傾向があり、エタノール４０％以上で抽出した丹参抽出物がアンドロゲン関連酵素の抑制に効果があると理解できよう。

【0086】

４．３．前立腺肥大症動物モデル由来前立腺組織において丹参抽出物の効果確認
図９では、丹参抽出物Ｔ４０の前立腺肥大症動物モデルにおいて前立腺肥大関連蛋白である５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，５ＡＲ２）、アンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の発現に及ぼす効果を確認した。

【0087】

前記実施例４．２で得られた前立腺組織は、プロテアーゼ抑制剤カクテルを含有する冷放射線免疫沈殿分析（ＲＩＰＡ）緩衝液を用いて溶解させた。溶解された細胞を４℃で２０分間１３，０００ＲＰＭで遠心分離し、タンパク質濃度をＢＣＡ分析で測定した。細胞溶解物（３０μｇタンパク質／サンプル）を１２０％で９０分間１０％ラウリル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を室温で１時間５％脱脂乳でブロックした。その直後、ＡＲ、５ＡＲ２、ＰＳＡ及びβ－アクチンのような一次抗体を一晩膜に反応させた。膜を洗浄した後、これらは、ヤギ抗ウサギＩｇＧ及び抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合された二次抗体と共に室温で１時間培養された。強化化学発光（ＥＣＬ）検出試薬を用いて免疫検出を行い、ダビンチ（Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｃｈｅｍｉ）イメージングシステム（Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｋ．，ソウル）を用いて膜を撮影し、これを図９に示した。

【0088】

図９に示すように、前立腺肥大症誘導動物モデルにおいて５ＡＲ２及びＰＳＡが顕著に増加し、丹参抽出物４０Ｔによって５ＡＲ２、ＡＲ及びＰＳＡの全てのタンパク質の発現が顕著に抑制されることを確認した。

【0089】

図１０は、ＢＰＨにおいてテストステロンの信号伝達経路及び丹参抽出物の薬理機転を示す模式図である。前立腺肥大症の原因はまだ明らかにされていないが、加齢、男性ホルモンの不均衡（特に、ジヒドロテストステロン，ＤＨＴ）、代謝障害が前立腺肥大症を誘発する主要発生要因として推測されている。現在使用中のソーパルメットの実抽出物（健康機能食品告示型素材）とフィナステリド（前立腺肥大症治療剤）は男性ホルモンだけを標的とするが、治療効果を極大化するためには、加齢、不均衡状態の男性ホルモン、代謝障害を複合的に改善できる戦略が必要である。丹参酒精抽出物の主要タンシノン成分は、ＮＡＤ^＋－促進剤として細胞質内‘ＮＱＯ１’酵素を標的とし、同時に補基質（ｃｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるＮＡＤＨをＮＡＤ^＋に転換して生体内ＮＡＤ^＋の濃度を増加させる。ＮＱＯ１酵素は、フラボタンパク質系統の２－電子還元酵素で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補助因子としてキノン（Ｑｕｉｎｏｎｅ）系統の化合物をヒドロキノン（ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ）に還元し、一般的に活性酸素の除去、ビタミンＫ代謝を行う。ＮＡＤ^＋－促進剤（主要タンシノン成分）による細胞内ＮＡＤ^＋増加は、サーチュインとＡＭＰＫ及びＰＧＣ－１αを活性化し、これはミトコンドリアの量と機能を同時に増進させ、細胞内エネルギー代謝を活性化させることができる。特に、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）は、抗老化効果に、ＡＭＰＫ及びＰＧＣ－１αは代謝疾患改善効果に中核的な役割を担うタンパク質であり、‘加齢、代謝疾患、男性ホルモン不均衡’に誘発される‘前立腺肥大症’を効果的に好転させる可能性が大きいものと期待し、前記のような結果から、丹参抽出物の４０％以上（４０～９９％）のエタノール抽出物は、前立腺肥大症又は脱毛症の予防又は治療に優れた効果があることを確認した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】