特許 7162303 流路デバイス、発電デバイス、センサー、発電方法及びセンシング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-20

(45)【発行日】2022-10-28

(54)【発明の名称】流路デバイス、発電デバイス、センサー、発電方法及びセンシング方法

(51)【国際特許分類】

   H01M 4/86 20060101AFI20221021BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20221021BHJP

   G01N 27/327 20060101ALI20221021BHJP

   G01N 27/28 20060101ALI20221021BHJP

   H01M 4/90 20060101ALI20221021BHJP

   H01M 8/16 20060101ALI20221021BHJP

   H01M 8/0258 20160101ALI20221021BHJP

【ＦＩ】

H01M4/86 M

G01N37/00 101

G01N27/327 353U

G01N27/28 321F

G01N27/327 353F

H01M4/90 Y

H01M8/16

H01M8/0258

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2019024868

(22)【出願日】2019-02-14

(65)【公開番号】P2020135975

(43)【公開日】2020-08-31

【審査請求日】2022-01-18

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ・研究集会名 平成２９年度福井大学工学系研究科繊維先端工学専攻修士論文公聴会 開催場所 福井大学 文京キャンパス 開催日 平成３０年２月１４日

(73)【特許権者】

【識別番号】504145320

【氏名又は名称】国立大学法人福井大学

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】坂元 博昭

(72)【発明者】

【氏名】天谷 諭

(72)【発明者】

【氏名】末 信一朗

(72)【発明者】

【氏名】里村 武範

(72)【発明者】

【氏名】高村 映一郎

(72)【発明者】

【氏名】小松 丈紘

(72)【発明者】

【氏名】田中 陽

【審査官】守安 太郎

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－０７１５５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－０５９８００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－２４３３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０５７３８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開平０１－２１６２６０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｈ０１Ｍ ８／１６

Ｈ０１Ｍ ４／８６

Ｈ０１Ｍ ４／９０

Ｇ０１Ｎ ２７／３２７

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

酸化還元反応の基質を含む溶液を流す流路と、作用極と、対極とを備え、
２段階以上の酸化還元酵素反応に関与する酵素が反応順に、前記流路に沿って固定化されており、
前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とが別々の電極として、かつ互いに近接して形成されており、
前記酵素が固定化された電極の一方は、前記作用極または前記対極の層に対して積層されていることを特徴とする流路デバイス。

【請求項2】

前記酵素が固定化されている電極は、櫛歯形状を有していることを特徴とする請求項１に記載の流路デバイス。

【請求項3】

前記酵素が固定化されている電極は、前記溶液が流れる隙間を形成するように互いに対向していることを特徴とする請求項１に記載の流路デバイス。

【請求項4】

前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とは、互いに異なる材質で形成されている請求項１から３のいずれか１項に記載の流路デバイス。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか１項に記載の流路デバイスを備え、当該流路デバイスにおいて前記基質から抽出された電子を外部へ出力することを特徴とする発電デバイス。

【請求項6】

請求項１から４のいずれか１項に記載の流路デバイスを備え、当該流路デバイスにおいて前記基質から抽出された電子を検出することを特徴とするセンサー。

【請求項7】

請求項１から４のいずれか１項に記載の流路デバイスを用いた発電方法であって、
前記流路に前記基質を含む溶液を供給する工程と、
前記各電極に固定化された酵素によって前記基質から電子を抽出する工程とを含むことを特徴とする発電方法。

【請求項8】

請求項１から４のいずれか１項に記載の流路デバイスを用いたセンシング方法であって、
前記流路に検出対象物質としての前記基質を含む溶液を供給する工程と、
前記各電極に固定化された酵素によって前記基質から電子を抽出する工程と、
前記電子を検出することにより、前記検出対象物質を検出する工程とを含むことを特徴とするセンシング方法。

【請求項9】

酸化還元反応の基質を含む溶液を流す流路と、作用極と、対極とを備え、
２段階以上の酸化還元酵素反応に関与する酵素が反応順に、前記流路に沿って固定化されており、
前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された構造体と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とが別々の構造体として、かつ互いに近接して形成されており、
前記構造体の一部は、前記作用極または前記対極の層に対して積層されていることを特徴とする流路デバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、発電デバイス、センサー及びこれらを構成する流路デバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

近年の化石燃料の枯渇や原子力の危険性の問題から、安全かつ再生可能なエネルギーが求められており、次世代エネルギーの一つとしてバイオ電池（発電デバイス）が注目されている。バイオ電池は、生体触媒である酵素を用いて、グルコース、アルコール等の生物がエネルギーとして利用できる物質を燃料とする電池である。

【0003】

バイオ電池は、常温で作動可能、小型化が容易、取り扱いが安全、低コストといった利点を持つため、携帯機器のバッテリーやバイオセンサー等のマイクロデバイス用の低出力電源、及びペースメーカー等の体内埋め込み型デバイス用電源としても期待されている。

【0004】

非特許文献１には、複数種類の酸化還元酵素を利用して連続的な反応を行うことで電子を取り出すバイオ燃料電池が記載されている。このバイオ電池では、電極基板上に数種類の酵素を配置し、多段階反応を起こすことで、電子の抽出効率を高めている。

【0005】

上述のようなバイオ電池に利用される技術は、バイオセンサーにも利用されている。特許文献１、及び特許文献２には、酵素反応を利用したバイオセンサーが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特表２００３－５２９７７０号公報

【文献】特表２０１０－５２６３１１号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】E. Kjeang et. al., “Strategic enzyme patterning for microfluidic biofuel cells”, Journal of Power Sources 158 (2006) 1-12

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、上述の文献には、基質から電子を抽出する一連の酸化還元反応が複数種類の酵素によって触媒される場合に当該酵素反応の効率を高める手段については開示されていない。

【0009】

本発明の一態様は、基質から電子を抽出する一連の酸化還元反応が複数種類の酵素によって触媒される場合に当該酵素反応の効率を高めることができる流路デバイス、発電デバイスおよびセンサーを実現することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

上記の課題を解決するために、本発明の一様態に係る流路デバイスは、酸化還元反応の基質を含む溶液を流す流路と、作用極と、対極とを備え、２段階以上の酸化還元酵素反応に関与する酵素が反応順に、前記流路に沿って固定化されており、前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とが別々の電極として、かつ互いに近接して形成されており、前記酵素が固定化された電極の一方は、前記作用極または前記対極の層に対して積層されている。

【0011】

上記の構成により、基質から電子を抽出する一連の酸化還元反応が複数種類の酵素によって触媒される場合にも、これらの酵素反応を効率的に行うことができる。

【0012】

前記酵素が固定化されている電極は、櫛歯形状を有していることが好ましい。櫛歯電極のそれぞれに異種の酵素を固定化することにより、これらの酵素を近接配置することができる。前記酵素が固定化されている電極は、前記溶液が流れる隙間を形成するように互いに対向していることが好ましい。対向電極のそれぞれに異種の酵素を固定化することにより、これらの酵素を近接配置することができる。

【0013】

前記流路デバイスにおいて、前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とは、互いに異なる材質で形成されていることが好ましい。上記の構成により、前記別々の電極それぞれに、異なる種類の酵素を容易に固定化することが可能となる。

【0014】

前記流路デバイスを備え、当該流路デバイスにおいて前記基質から抽出された電子を外部へ出力する発電デバイス、及び前記流路デバイスを備え、当該流路デバイスにおいて前記基質から抽出された電子を検出するセンサーも本発明の技術的範囲に含まれる。

【0015】

本発明の一態様に係る前記流路デバイスを用いた発電方法は、前記流路に前記基質を含む溶液を供給する工程と、前記各電極に固定化された酵素によって前記基質から電子を抽出する工程とを含む。

【0016】

本発明の一態様に係るセンシング方法は、前記流路デバイスを用いたセンシング方法であって、前記流路に検出対象物質としての前記基質を含む溶液を供給する工程と、前記各電極に固定化された酵素によって前記基質から電子を抽出する工程と、前記電子を検出することにより、前記検出対象物質を検出する工程とを含む。

【0017】

本発明の一様態に係る流路デバイスは、酸化還元反応の基質を含む溶液を流す流路と、作用極と、対極とを備え、２段階以上の酸化還元酵素反応に関与する酵素が反応順に、前記流路に沿って固定化されており、前記基質の酸化反応を担う酵素が固定化された構造体と、前記酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素が固定化された電極とが別々の構造体として、かつ互いに近接して形成されており、前記構造体の一部は、前記作用極または前記対極の層に対して積層されている。

【発明の効果】

【0018】

本発明の一態様によれば、基質から電子を抽出する一連の酸化還元反応が複数種類の酵素によって触媒される場合にも、これらの酵素反応を効率的に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明の実施形態１に係る流路デバイスを備える発電デバイスの構成を示す図である。

【図2】本発明の実施形態１に係る流路デバイスの構成を示す概略図である。

【図3】本発明の実施形態１に係る流路デバイスの構成を示す断面図である。

【図4】本発明の実施形態１に係る流路デバイスの対極及びカーボン電極が形成されている部分を拡大した断面図である。

【図5】本発明の実施形態１に係る流路デバイスの第３電極及び第２電極、または第５電極及び第４電極が形成されている部分を拡大した図である。

【図6】本発明の実施形態１に係る流路デバイス上で起こる反応を説明する図である。

【図7】流路デバイス及び参考例としてディスク電極の電流密度を示すグラフである。

【図8】（ａ）～（ｈ）は、本発明の実施形態１に係る流路デバイスの電極の作成方法を説明する断面図である。

【図9】（ａ）～（ｅ）は、第２反応領域または第３反応領域の別の形態を示す斜視図である。

【図10】本発明の実施形態１に係る発電デバイスの構成を示すブロック図である。

【図11】（ａ）は本発明の実施形態２に係る流路デバイスの構成を示す概略図であり、（ｂ）は、（ａ）のＸ－Ｘ´矢視断面図である。

【図12】本発明の実施形態３に係るセンサーの外観の一例を示す図である。

【図13】本発明の実施形態３に係るセンサーの構成を示すブロック図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

〔実施形態１〕
以下、本発明の一実施形態について、図１～図７を用いて詳細に説明する。図１は、流路デバイス１０を備える発電デバイス１の構成を示す図である。図１に示すように、本発明の実施形態１に係る発電デバイス１は、流路デバイス１０を備え、流路デバイス１０において基質から抽出された電子を外部へ出力する。

【0021】

発電デバイス１は、酸化反応を起こし、電子を抽出するアノード２、アノード２から移動した電子を利用し還元反応を起こすカソード３、電子の移動により電力を取り出すための電力取り出し部４、基質を含む溶液（以下、反応液）を貯蔵する貯留槽５、及び基質をアノード２に供給するための送液パイプ６を備えている。発電デバイス１は、アノード２として流路デバイス１０を備えており、流路デバイス１０に反応液を流すことで、基質から電力を取り出す。

【0022】

貯留槽５からアノード２へ基質が供給されると、当該基質は、アノード２に配置された酸化還元酵素により酸化され、電子が抽出される。抽出された電子は、カソード３へ移動し、カソード３に配置された酵素、例えばＭＣＯ（Multi copper oxidase）によって、酸素を還元するために利用される。上記のような電子の移動に伴い、電力取り出し部４から電力が得られる。

【0023】

また、図１に示すように、発電デバイス１に、電極ごとの温度が、各電極における酵素反応を起こすための最適温度となるように制御する温度調節部７を設けてもよい。温度調節部７は、流路デバイス１０が備える、後述する酵素が固定化された電極、及びカソード３の温度を調節できる。この構成により、各電極での酵素反応効率を向上させることができる。なお、温度調節部７は、本発明にとって必須の構成要素ではないため、省略してもよい。

【0024】

（流路デバイス１０の構造）
図２は、流路デバイス１０の構造を示す概略図である。また、図３は、流路デバイス１０の構造を示す断面図である。図２に示すように流路デバイス１０は、作用極２０、対極３０、参照電極４０、流路構造５０及びカーボン電極３３を備えている。図３に示すように、これらの電極及び流路構造５０は、基板としてのガラス基板８０上に設けられている。流路デバイス１０の基板は、ガラスに限定されず、他の材質からなる絶縁基板であってもよい。また当該基板は、電極及び流路構造５０が形成される側の表面が絶縁膜処理されていてもよく、この場合、当該基板の材質は特に限定されない。

【0025】

作用極２０は、発電デバイス１の作動時に酸化電位をかけられる電極であり、金で形成されている。後述するように、作用極２０を介して電子が抽出される。抽出された電子は、カソード３へ送られる。図２に示すように、作用極２０は、その一部に第１電極２１、第３電極２２、及び第５電極２３を備えている。なお、第１電極２１、第３電極２２、及び第５電極２３は、連結されている必要はなく、それぞれが独立していてもよい。この場合には、第１電極２１、第３電極２２、及び第５電極２３は、外部配線により互いに接続されていればよい。

【0026】

第１電極２１は、金で形成された電極であり、当該電極上に、ＬＰＤＨ（色素依存型Ｌ－プロリン脱水素酵素：L-Proline dehydrogenase）が固定化されている。流路デバイス１０は、２段階以上の酸化還元酵素反応を担う、各段階の酵素または酵素群が反応順にそれぞれ固定化された複数の反応領域（第１～第３反応領域）を備えており、第１電極２１は、第１反応領域２４に相当する。

【0027】

第３電極２２は、金で形成された電極であり、当該電極上に、酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素であるプロリン脱水素酵素複合体（ＰＤＨ）が固定化されている。プロリン脱水素酵素複合体は、Ｌ-プロリン脱水素酵素とＮＡＤＨ（Nicotinamide adenine dinucleotide）脱水素酵素とをサブユニットに含む複合体である（NADH dehydrogenase）。第５電極２３は、金で形成された電極であり、当該電極上に酸化反応によって生じた還元物からメディエータへ電子を移動させる酵素であるＰＤＨが固定化されている。

【0028】

対極３０は、作用極２０と対になる電極であり、作用極２０に酸化電位をかけたときに、作用極２０と対極３０との間に電流が流れる。対極３０は、金で形成されている。なお、対極３０は、連結されている必要はなく、第１電極２１、第３電極２２、及び第５電極２３に対応する部分が独立していてもよい。この場合には、独立した各部は、外部配線により互いに接続されていればよい。

【0029】

カーボン電極３３は、カーボンで形成された電極であり、その一部に第２電極３１及び第４電極３２を備える。また、カーボン電極３３は、第２電極３１及び第４電極３２に酵素を固定化する際に電圧をかけるための電極取り出し口を有している。このカーボン電極３３（複数の電極の一部）は、作用極２０及び対極３０とは別の電極として形成されている。なお、第２電極３１及び第４電極３２は、連結されている必要はなく、それぞれが独立していてもよい。この場合には、第２電極３１及び第４電極３２は、外部配線により互いに接続されていればよい。

【0030】

図４は、流路デバイス１０の対極３０及びカーボン電極３３が形成されている部分を拡大した断面図である。本実施形態では、カーボン電極３３の上に対極３０が積層される。すなわち、酵素が固定化された電極の一方であるカーボン電極３３は、対極３０の層に対して、その一部が積層されている。そのため、ショートの発生を防止するため、カーボン電極３３と対極３０との間にアルミナによる絶縁層３５が作製される。なお、酵素が固定化された電極の層を作用極２０の層に対して積層してもよい。

【0031】

第２電極３１は、カーボンで形成された電極であり、当該電極上に基質の酸化反応を担う酵素であるＰ５ＣＤＨ（ピロリン－５－カルボン酸脱水素酵素：Pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase）が固定化されている。第４電極３２は、カーボンで形成された電極であり、当該電極上に、基質の酸化反応を担う酵素であるＧＤＨ（グルタミン酸脱水素酵素：L-Glutamate dehydrogenase）が固定化されている。

【0032】

第２電極３１に固定化されたＰ５ＣＤＨが触媒する反応と、第３電極２２に固定化されたＰＤＨが触媒する反応とが連続的に起こることにより、一連の酸化還元酵素反応が起こる。第３電極２２及び第２電極３１は、前記複数の反応領域のうちの第２反応領域６０に相当する。第２反応領域６０において、第２電極３１と第３電極２２とは別々の構造体として形成されている。

【0033】

また、第４電極３２に固定化されたＧＤＨが触媒する反応と、第５電極２３に固定化されたＰＤＨが触媒する反応とが連続的に起こることにより、一連の酸化還元酵素反応が起こる。第５電極２３及び第４電極３２は、前記複数の反応領域のうちの第３反応領域７０に相当する。第３反応領域７０において、第４電極３２と第５電極２３とは別々の構造体として形成されている。

【0034】

このように、第２電極３１と第３電極２２と、または第４電極３２と第５電極２３とを別々の構造体として、異なる材質で形成することにより、目的とする電極にのみ電位をかけることが可能となり、互いに近接している電極のそれぞれに異なる種類の酵素を固定化することが容易となる。

【0035】

なお、第２電極３１または第３電極２２に電位をかけずに酵素を固定化する場合には、第２電極３１と第３電極２２とは、同一の材質で形成されていてもよい。第４電極３２の材質は、第２電極３１の材質と同様であり、第５電極２３の材質は、第３電極２２の材質と同様である。

【0036】

第１電極２１、第３電極２２及び第５電極２３の材質は、金に限定されず、例えば白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、またはオスミウム等所望の導電性を有する材質であってもよい。第２電極３１及び第４電極３２の材質は、カーボンに限定されず、例えば白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、ルテニウム、またはオスミウム等所望の導電性を有する材質であってもよい。また第２電極３１及び第４電極３２の材質は、酵素を固定化できるものであればよく、例えば、合成樹脂またはガラスであってもよい。また、第１電極２１、第２電極３１、第３電極２２、第４電極３２及び第５電極２３を、導体の表面を絶縁膜で被覆した電極としてもよい。さらに、基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極である第２電極３１及び第４電極３２は、厳密には電極である必要はなく、当該酵素が固定化された構造体であってもよい。すなわち、基質の酸化反応を担う酵素が固定化された電極については、便宜上「電極」という表現を用いているが、作用極２０または対極３０に対して積層された積層構造体の一部であればよい。

【0037】

図５は、第２反応領域６０が形成されている部分を拡大した図である。図５に示すように、第２反応領域６０では、第２電極３１及び第３電極２２がそれぞれ櫛歯形状を有する電極として形成されている。具体的には、第２反応領域６０は、２つの櫛歯型電極の歯が互い違いになるように配置されることで形成されている。櫛歯型電極の歯１本分の幅（図５のＷ１及びＷ３で示す幅）、及び歯の間の幅（図５のＷ２で示す幅）は、それぞれ１００ｎｍ～１０μｍである。Ｗ２で示す幅は、第２電極３１における酵素反応と、第３電極２２における酵素反応とが連続的に効率良く行われるように設定されればよい。

【0038】

このように、第２反応領域６０では、第２電極３１及び第３電極２２が互いに近接している構成である。そのため、第２電極３１及び第３電極２２での一連の反応を高効率に起こすことが可能である。第３反応領域７０での第４電極３２及び第５電極２３の関係についても同様である。

【0039】

参照電極４０は、発電デバイス１の作動時に作用極２０に対する基準となる電位を持つ電極であり、銀及び塩化銀で処理されている銀－塩化銀電極４１を有している。

【0040】

流路構造５０は、酸化還元反応の基質を含む溶液を流すための微細流路を形成する構造体である。図２及び図３に示すように、流路構造５０は、ガラス基板８０の上に配置されており、各電極の表面上を一定の方向に向かって反応液が流れるように形成されている。流路構造５０は、反応液を供給するための開口部である供給口５１、及び基質が反応した後の生成物を排出するための開口部である排出口５２を備えている。流路構造５０は、例えばシリコン樹脂(ポリジメチルシロキサン（Poly dimethyl siloxane :PDMS）)で形成されている。

【0041】

なお、本実施形態では、流路デバイス１０はアノードとして利用されているが、カソードとして利用してもよくその場合は、アノードから得た電子を利用して、基質を還元する反応系に関する酵素が各反応領域に固定化される。

【0042】

また、流路デバイス１０では、供給する基質としてＬ－プロリンを使用している。しかしながら、流路デバイス１０では、酵素を利用した酸化還元反応を起こすことができる基質であれば利用可能であり、供給する基質はＬ－プロリンに限られない。流路デバイス１０に供給する基質としては、システイン、カテコール、メトリブジン、ドーパミン、Ｌ－アスコルビン酸、チロシン、Ｓ－アルキル－Ｌ－システインスルホキシド、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン、グルコース、乳酸、グルタミン酸、グルタミン、ラクトース、尿素、コレステロール、アミノ酸、尿酸、リン脂質、モノアミン、ショ糖、中性脂肪(中性脂質)、ペニシリン、アルコール、有機酸、マルトース、ガラクトース、エタノール、フェノール、ピルビン酸、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－チロシン、Ｌ－リジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－メチオニン、アミグダリン、クレアチニン、過酸化水素、リン酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、硫酸イオン、水銀イオン、ヘモグロビンエーワンシーケトン体(β-ヒドロキシ酪酸、βＯＨＤ)等が挙げられる。

【0043】

これらの物質を多段階酵素反応の最初の酵素反応の基質として流路デバイス１０に供給し、当該基質に対応する酵素を各電極に固定化することにより、当該基質から電子を効率的に抽出することができる。

【0044】

（流路デバイス１０での反応の流れの一例）
以下、流路デバイス１０で起こる反応について、図６を用いて説明する。図６は、本発明の実施形態１に係る流路デバイス１０上で起こる反応を説明するための図である。

【0045】

まず、基質の材料としてとして食品廃棄物、または家庭ごみ等のバイオマスに含まれるゼラチンが使用される。バイオマスに含まれるゼラチンをプロテアーゼで分解し、Ｌ－プロリンを生成する。生成されたＬ－プロリンを含む溶液が、反応液として流路デバイス１０に供給される。このとき、電源８（図１０参照）から作用極２０に酸化電位がかけられた状態で反応液が供給される。

【0046】

流路デバイス１０の供給口５１から供給された反応液は、流路構造５０を流れ、第１電極２１で第１の反応が起こる。第１の反応とは、Ｌ－プロリンが、第１電極２１に固定化されているＬＰＤＨと反応し、ピロリン－５－カルボン酸が生成する反応である。また、上記反応に伴い２電子が抽出される。抽出された２電子は、メディエータを介して作用極２０に受け渡される。

【0047】

次に、上記反応で生成したピロリン－５－カルボン酸は、第２電極３１での第２－１の反応の基質となる。第２－１の反応とは、ピロリン－５－カルボン酸が、ＮＡＤ^＋を補酵素として、第２電極３１に固定化されているＰ５ＣＤＨと反応し、これによりＬ－グルタミン酸が生成する反応である。補酵素として利用されたＮＡＤ^＋は還元され、還元物であるＮＡＤＨが生成する。

【0048】

ＮＡＤＨは、そのままでは電極に電子を受け渡すことが困難であるため、第３電極２２に固定化されているＰＤＨによって酸化され、この反応に伴って酸化型メディエータが還元される（第２－２の反応）。つまり、ＰＤＨは、ＮＡＤＨからメディエータへ電子を移動させる。還元されたメディエータから２電子が第３電極２２（作用極２０）に受け渡される。酸化され生成したＮＡＤ^＋は、第２電極３１における第２－１の反応で再利用される。また、電子を受け渡したことで酸化型となったメディエータは、第３電極２２における第２－２の反応で再利用される。

【0049】

次に、上記反応で生成したＬ－グルタミン酸は、第４電極３２で、第３－１の反応の基質となる。第３－１の反応とは、Ｌ－グルタミン酸が、第４電極３２に固定化されているＧＤＨによって酸化され、２－オキソグルタル酸が生成する反応である。補酵素として利用されたＮＡＤ^＋は還元され、還元物であるＮＡＤＨが生成する。

【0050】

ＮＡＤＨは、そのままでは電極に電子を受け渡すことが困難であるため、第５電極２３においてＰＤＨによって酸化され、この反応に伴って酸化型メディエータが還元される（第３－２の反応）。つまり、ＰＤＨは、ＮＡＤＨからメディエータへ電子を移動させる。還元されたメディエータから２電子が第５電極２３（作用極２０）に受け渡される。ＮＡＤＨが酸化され生成したＮＡＤ^＋は、第４電極３２における第３－１の反応で再利用される。また、電子を受け渡したことで酸化型となったメディエータは、第５電極２３における第３－２の反応で再利用される。

【0051】

上記反応で生成した２－オキソグルタル酸を含んだ溶液は、排出口５２から排出される。
以上の反応により、流路デバイス１０において、６電子を抽出することが可能である。このように発電デバイス１では、第１反応領域２４、第２反応領域６０及び第３反応領域７０が、反応液の流れの上流から下流に沿って、当該反応領域における酵素反応の順に配列されているため、複数段階の酵素反応を効率良く行うことができる。

【0052】

以上のように、発電デバイス１を用いた発電方法では、流路デバイス１０の流路構造５０に基質を含む溶液を供給することにより前記基質から電子を抽出し、これによって発電を行う。すなわち、発電デバイス１を用いた発電方法は、作用極２０に酸化電位をかける工程と、流路構造５０に基質を含む溶液を供給する工程と、各電極に固定化された酵素によって基質から電子を抽出する工程とを含む。

【0053】

流路デバイス１０で用いられる酵素は、上述のものに限定されず、供給される基質に応じて適切な酵素が選択されればよい。特に、基質から抽出した電子を直接電極に受け渡すことができる酵素を用いてもよい。

【0054】

（流路デバイス１０の効果）
流路構造５０を用いて基質を含む反応液を流すことで、第１電極２１で第１の反応を行い、上記反応の生成物がさらに流れることで、第２反応領域６０において第２－１の反応及び第２－２の反応が起きる。さらに、第２－１の反応の生成物が流れることで第３反応領域７０において第３－１の反応及び第３－２の反応が起きる。このように、各反応が起きる電極を流路上に順に配置することで、一連の反応を連続的に効率良よく起こすことができる。

【0055】

また、第２反応領域６０では、図６に示すように、材質が異なり、かつ互いに近接する２種類の櫛歯型電極の一方に、第２－１の反応に関与する酵素を固定化し、第２－２の反応に関与する酵素を他方に固定化しているため、連続的に行われるべき酵素反応を効率良く起こすことができる。なお、本実施形態では、第２反応領域６０は２種類の櫛歯型電極を有しており、一連の反応として２つの反応が起こるが、第２反応領域６０が３種類以上の櫛歯電極を有する構成としてもよい。上記構成によれば、一連の反応が３以上の反応を含む場合も流路デバイス１０に適用できる。上記事項については、第３反応領域７０における第３－１の反応及び第３－２の反応についても同様である。

【0056】

流路デバイス１０を使用し、電流密度を計測した。図７は、流路デバイス１０及び参考例としてのディスク電極の電流密度を示すグラフである。

【0057】

図７のＡ１を付した曲線は、流路デバイス１０にＬ－プロリン及びＮＡＤ^＋を加えた条件（条件Ａ）で計測を行った結果を示す。図７のＢ１を付した曲線は、流路デバイス１０にＬ－プロリン及びＮＡＤ^＋を加えない条件（条件Ｂ）で計測を行った結果を示す。図７のＣを付した曲線は、金製のディスク上に各酵素をランダムに固定化したディスク電極にＬ－プロリン及びＮＡＤ^＋を加えない条件（条件Ｃ）で計測を行った結果を示す。図７のＤ１を付した曲線は、上記ディスク電極にＬ－プロリン及びＮＡＤ^＋を加えた条件（条件Ｄ）で計測を行った結果を示す。上記実験は異なる条件で２回行い、それぞれ１度目の結果を図７のＡ１、Ｂ１、Ｃ１、Ｄ１、２度目の結果を図７のＡ２、Ｂ２，Ｃ２、Ｄ２で示している。

【0058】

図７に示すように、Ａ１＞Ｂ１であり、Ａ２＞Ｂ２であった。この結果から、流路デバイス１０において、一連の酸化還元反応が効率良く行われていることが確認された。また、条件Ａでは、従来のデバイスに対応する条件Ｄと比較すると、およそ２１倍の電流密度が計測された。

【0059】

（流路デバイス１０の電極作製方法の一例）
流路デバイス１０の電極は、公知の方法、例えばフォトリソグラフィによって作製することができる。以下、具体的な方法について、図８の（ａ）～（ｈ）を用いて説明する。図８の（ａ）～（ｈ）は、流路デバイス１０の電極の作製方法を説明するための断面図である。

【0060】

まず、図８の（ａ）に示すように、スピンコートによりガラス基板８０上にフォトレジストを塗布し、フォトレジスト層９０を作製する。次に、カーボン電極３３の形状を描写したマスクをガラス基板８０上に配置し、紫外光を照射する。次に、図８の（ｂ）に示すように、ガラス基板８０を現像液に浸すことで、感光した部分のフォトレジストをフォトレジスト層９０から除去する。次に、図８の（ｃ）に示すように、ガラス基板８０上にカーボンをコーティングし、カーボン層９１を作製する。次に、図８の（ｄ）に示すように、残ったフォトレジスト層９０を除去する。これにより、図８の（ｂ）に示す段階でフォトレジスト層９０が除去された部分のみにカーボン層９１が残る。以上の方法でカーボン電極３３が作製される。

【0061】

次に、カーボン層９１における、第２電極３１及び第４電極３２となる以外の部分にアルミナをコーティングし、アルミナからなる層（図４に示す絶縁層３５）を作製する。

【0062】

続いて、図８の（ｅ）に示すように、ガラス基板８０及びカーボン層９１上にフォトレジストを塗布し、フォトレジスト層９０を作製する。次に、フォトレジスト層９０から、作用極２０、対極３０、及び参照電極４０の形状を描写したマスクをガラス基板８０上に配置し、紫外光を照射する。次に、図８の（ｆ）に示すように、ガラス基板８０を現像液に浸すことで、感光した部分のフォトレジストを除去する。次に、図８の（ｇ）に示すように、ガラス基板８０上に金をコーティングし、金層９２を作製する。次に、図８の（ｈ）に示すように、残ったフォトレジスト層９０を除去する。これにより、図８の（ｆ）に示す段階でフォトレジスト層９０が除去された部分のみに金層９２が残る。以上の方法で作用極２０、対極３０、及び参照電極４０が作製される。

【0063】

このように複数の電極の一部を、他の電極とは別の層として形成することにより、複数の電極を、積層構造を利用して容易に形成することができる。

【0064】

（酵素固定化方法）
次に、流路デバイス１０の電極上に各酵素を固定化する方法について説明する。流路デバイス１０の電極上に固定化される各酵素には、適切な配向で固定化されるように設計されたヒスチジンタグが付与されている。

【0065】

まず、第１電極２１、第３電極２２及び第５電極２３上に、末端にニトリロ三酢酸(ＮＴＡ)基をもった１００μＭのＣ２－ＮＴＡ（3,3'-Dithiobis[N-(5-amino-5-carboxypentyl)propionamide-N',N’-diacetic acid] dihydrochloride）を滴下し、３時間室温で静置することで、自己組織化単分子膜(ＳＡＭ：Self-assembled monolayer)を形成した。

【0066】

次に、５０ｍＭのカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で未結合のＣ２－ＮＴＡを洗浄し、１００ｍＭの硫酸ニッケルに電極を浸し１０分間静置することでＣ２－ＮＴＡの末端のＮＴＡ基にニッケル原子を配位させた。

【0067】

次に、再び５０ｍＭのカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で未配位のニッケルを洗浄した後、第１電極２１にＬＰＤＨを、第３電極２２及び第５電極２３にＰＤＨをそれぞれ５０μｌ電極上に滴下し３０分間、室温で静置することでそれらの酵素のヒスチジンタグを介してＣ２－ＮＴＡに配向的に固定化した。最後に５０ｍＭのカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。以上の操作により、第１電極上にＬＰＤＨが、第３電極２２及び第５電極２３上にＰＤＨがそれぞれ固定化された。

【0068】

続いて、カーボン電極３３において、２．５％二クロム酸カリウムと１０％硝酸の混合液中で、カーボン電極３３の電極取り出し口を作用極として＋１．２Ｖの電位を３０秒間、掛けることによりカーボン電極３３上にカルボキシル基を導入した。超純水で洗浄した後、第２電極３１及び第４電極３２上に２００ｍＭのＥＤＣ、５０ｍＭのＮＨＳを含む５０ｍＭのＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液を滴下し、３０分間室温で静置することで活性化させ、スクシンイミド（ＮＨＳ）基を形成させた。

【0069】

次いで、第２電極３１にＰ５ＣＤＨを、第４電極３２にＧＤＨをそれぞれ５０μｌ滴下し、３０分間室温で静置することで第２電極３１及び第４電極３２上のＮＨＳ基に各酵素を共有結合により固定化した。なお、それぞれの酵素は電極上での分子個数が概ね同じになるように濃度を調整して用いた。

【0070】

第１電極２１、第２電極３１、第３電極２２、第４電極３２、及び第５電極２３に対する各酵素の固定化は、反応液の流れによって各電極から酵素が脱離しない程度に固定化できるものであればよく、上述したように電極表面に形成されたＳＡＭとヒスチジンタグとの相互作用（アフィニティ結合）によって当該固定化を実現してもよいし、共有結合による固定化であってもよい。

【0071】

（変形例）
本発明の流路デバイス１０が備える第２反応領域６０、または第３反応領域７０の変形例について、図９の（ａ）～（ｅ）を用いて説明する。図９の（ａ）～（ｅ）は、第２反応領域６０または第３反応領域７０の別の形態を示す斜視図である。以降、第２反応領域６０を代表として説明するが、第３反応領域７０についても同様の形態とすることが可能である。なお、図９の（ａ）～（ｅ）の矢印は、反応液が流れる箇所及び方向を示している。

【0072】

上述の実施形態１において、流路デバイス１０の第２反応領域６０は、図９の（ａ）に示すように、櫛歯型の形状である。

【0073】

これを、図９の（ｂ）に示すように、第２反応領域６０の第３電極２２ｂ及び第２電極３１ｂが、突起部３７を有する構成としてもよい。突起部３７を設けることで、第２反応領域６０の表面積が大きくなり、より反応の効率を向上させることが可能となる。

【0074】

また、図９の（ｃ）に示すように、第２反応領域６０が備える第３電極２２ｃ及び第２電極３１ｃを上下に配置し、これらの電極の間に反応液が流れる隙間流路を形成する構成としてもよい。

【0075】

また、図９の（ｄ）に示すように、第３電極２２ｄ及び第２電極３１ｄを、櫛歯形状でなく板状の電極とし、これらの電極の間に反応液が流れる隙間（隙間流路）を形成するように対向する電極としてもよい。上記のような構成とした場合、第３電極２２ｄ及び第２電極３１ｄの距離を近づけることで、毛細管現象を利用して反応液を流すことも可能となる。

【0076】

また、図９の（ｅ）に示すように、対極３０ｅを、第３電極２２及び第２電極３１の上部に設ける構成としてもよい。上記のような構成とした場合、第２反応領域での反応により抽出された電子を作用極２０に効率良く受け渡すことができる。

【0077】

（発電デバイス１の機能的構成）
図１０は、発電デバイス１の構成を示すブロック図である。図１０に示すように、発電デバイス１は、電子を抽出するアノードとしての流路デバイス１０、流路デバイス１０において抽出された電子を利用して還元反応を起こすカソード３、電子の移動により電力を取り出すための電力取り出し部４、基質を含む反応液を貯蔵する貯留槽５、反応液を流路デバイス１０に供給する送液パイプ６、及び作用極２０に酸化電位をかける電源８を備えている。また、発電デバイス１は、酵素が固定化された電極の温度を調節する温度調節部７を備えていてもよい。なお、発電デバイス１が発電している状態において、流路デバイス１０の対極３０は特に機能していない。

【0078】

電力取り出し部４には、任意の電気機器が通電可能に接続され、発電デバイス１によって抽出された電子を、当該電気機器が利用できる。

【0079】

〔実施形態２〕
本発明の他の実施形態について、以下に説明する。なお、説明の便宜上、上記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を繰り返さない。

【0080】

グルコースを基質として供給する場合には、解糖系およびＴＣＡ（Tricarboxylic acid）サイクルに含まれる全ての酵素を、反応順に各電極に固定化することにより、グルコースから２４電子を抽出することができる。

【0081】

図１１の（ａ）は、本発明の実施形態２に係る流路デバイス１０ａの構成を示す概略図であり、図１１の（ｂ）は、図１１の（ａ）のＸ－Ｘ´矢視断面図である。

【0082】

流路デバイス１０ａでは、基質及び一連の反応の一例として、グルコースを基質として使用し、解糖系及びＴＣＡサイクルに関する反応を起こすものを示す。図１１の（ａ）に示すように、流路デバイス１０ａは、第１反応領域２０１、第２反応領域２０２、第３反応領域２０３、第４反応領域２０４、第５反応領域２０５、第６反応領域２０６、第７反応領域２０７、第８反応領域２０８、第９反応領域２０９、及び第１０反応領域２１０を備えている。また、流路デバイス１０ａは、流路デバイス１０と同様の流路構造５０（不図示）を備えている。

【0083】

流路デバイス１０ａ上で起こる反応における反応物（基質）、上記反応による生成物、及び上記反応に使用される酵素について、表１に示した。第１反応領域２０１には、グルコースを基質としてピルビン酸を生成する解糖系反応に関連する各酵素が固定化されている。以下、同様に、流路デバイス１０ａの第２反応領域２０２から第１０反応領域２１０には、表１の番号２から１０に図示されるＴＣＡサイクルに関する反応に関連する各酵素が、反応の順に、各々別々の電極または構造体上に固定化されている。なお、表１中の反応物の欄における、ＮＡＤ^＋、ＣｏＡ、ＣｏＡ－ＳＨ、及びユビキノン（Ｑ）は、各反応に使用される補酵素である。

【0084】

【表1】

【0085】

上記構成により、基質として供給されたグルコースは流路デバイス１０ａの各反応領域における反応を経て、結果としてグルコースから２４電子が抽出される。

【0086】

（別の実施例）
表２は、グルコース及びＡＴＰを基質として使用し、一連の反応が４段階である反応系（エントナ－ドウドルフ経路（ＥＤ経路））における反応物（基質）、生成物、及び酵素の例を示す表である。

【0087】

【表2】

【0088】

本発明の流路デバイス１０ｂ（図示せず）では、表２に示した各酵素が、その反応順に、流路に沿って第１～４反応領域の各電極に固定化されていてよい。これにより、グルコース１分子を基質として、ピルビン酸が２分子生成される。

【0089】

グルコースを出発物質とする解糖系の代謝サイクルとしては、ＥＤ経路のほかに、エムデン-マイヤーホフ経路（ＥＭ経路）やペントースリン酸経路（ＰＰ経路）も知られている。そこで、本発明の流路デバイス１０ｂでは、ＥＭ経路やＰＰ経路の各酵素が、その反応順に、流路に沿って別々の電極または構造体に固定化されている構成としてもよい。

【0090】

（別の実施例）
ＥＤ経路は、表１の番号１に示される解糖系反応に相当する。そこで、本発明の流路デバイス１０ｃ（図示せず）においては、第１反応領域２０１を４つの別々の電極または構造体に分けて構成し、解糖系（第１反応領域２０１で行われる反応系）に係る４つの酵素が反応順に異なる電極上または構造体上に固定化された構成とし、グルコースからピルビン酸を得てもよい。

【0091】

（別の実施例）
さらに異なる実施例を示す。本発明の流路デバイス１０ｄ（図示せず）では、第１反応領域に、ＥＭ経路の反応酵素の各々が同一または別々の電極または構造体上に固定化され、第２反応領域２０２から第１０反応領域２１０に、表１の番号２から１０に図示されるＴＣＡサイクルに関する反応を起こす各反応酵素が固定化された、人工ミトコンドリア様の流路デバイスとして構成してもよい。

【0092】

なお、上述した実施例に示した反応系に含まれる全ての酵素を電極または構造体上に固定化する必要はなく、当該反応系に含まれる一部の連続する酵素反応を担う一連の酵素を固定化してもよい。

【0093】

〔実施形態３〕
本発明の他の実施形態について、以下に説明する。なお、説明の便宜上、上記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を繰り返さない。

【0094】

図１２は、本発明の実施形態３に係るセンサー１００の外観の一例を示す概略図であり、図１３は、センサー１００の構成を示すブロック図である。図１３に示すように、センサー１００は、センサー電極１１０（アノード）、カソード３及び検出部１４０を備えている。センサー電極１１０として、流路デバイス１０を用いる。また、センサー１００は、図１２に示すように、測定結果等を表示するための表示部１２０及びユーザによる操作を行うための操作部１３０を備えていてもよい。

【0095】

作用極２０に酸化電位をかけた状態のセンサー電極１１０を、検出対象物質を含む溶液中に浸すことにより、当該溶液中に存在する検出対象物質を基質とする酵素反応が、実施形態１と同様に第１反応領域２４において起こり、これに続く酵素反応が、第２反応領域６０及び第３反応領域７０において起こる。これらの酵素反応によって抽出された電子がカソードに移動する時に、検出部１４０で当該電流の値を測定することで、当該溶液中に含まれている検出対象物質の濃度を測定する。

【0096】

すなわち、センサー１００を用いたセンシング方法では、センサー電極１１０としての流路デバイス１０の作用極２０に酸化電位をかける工程と、検出対象物質としての基質を含む溶液を供給する工程と、流路デバイス１０において検出対象（基質）から抽出された電子を検出部１４０が検出することにより、当該検出対象を検出する工程とを含む。

【0097】

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【符号の説明】

【0098】

１ 発電デバイス
２ アノード
３ カソード
１０ 流路デバイス
２０ 作用極
２１ 第１電極
２２ 第３電極
２３ 第５電極
２４ 第１反応領域
３０ 対極
３１ 第２電極
３２ 第４電極
３３ カーボン電極
５０ 流路構造（流路）
６０ 第２反応領域
７０ 第３反応領域
１００ センサー
１１０ センサー電極

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】