知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シージェイ チェイルジェダン コーポレーションの特許一覧
特許7162660活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物及び活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-20
(45)【発行日】2022-10-28
(54)【発明の名称】活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物及び活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20221021BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20221021BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20221021BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20221021BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N9/02
C12P13/00
C12N15/53
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020520419
(86)(22)【出願日】2018-07-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-08-27
(86)【国際出願番号】 KR2018007914
(87)【国際公開番号】W WO2019013569
(87)【国際公開日】2019-01-17
【審査請求日】2019-12-25
(31)【優先権主張番号】10-2017-0088632
(32)【優先日】2017-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク ジンソン
(72)【発明者】
【氏名】パク ボソン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ヨンヨル
(72)【発明者】
【氏名】オ インソク
(72)【発明者】
【氏名】イ ナホム
(72)【発明者】
【氏名】ムン ジュンオク
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】Ute C. Kabisch et al.，The Journal of Biological Chemistry，1999年，Vol.274, No.13，p.8445-8454
【文献】Laurent Bouillaut et al.，Journal of Bacteriology，2013年02月，Vol. 195, No. 4，p. 844-854
【文献】Fonknechen et al.，BMC Genomics，2010年10月11日，Vol. 11, No. 555，p. 1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐｒｄＡまたはｐｒｄＡとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階；及びｐｒｄＢまたはｐｒｄＢとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階；
を含む、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法であって、前記ＰｒｄＨタンパク質が、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質をコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦでコードされたタンパク質であり、前記ＰｒｄＨタンパク質が、非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させる活性を有する、
製造方法。
【請求項2】
前記ＰｒｄＡタンパク質が、配列番号３または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項3】
前記ＰｒｄＢタンパク質が、配列番号５または配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項4】
前記ＰｒｄＨタンパク質が、配列番号１または配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１～３のいずれかに記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項5】
さらにＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ及びＰｒｄＥ２からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の活性が強化された、請求項１～４のいずれかに記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項6】
さらにＰｒｄＣ、ＰｒｄＧ及びＰｒｄＦからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の活性が強化された、請求項１～４のいずれかに記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項7】
前記微生物が、エシェリキア属微生物である、請求項１～６のいずれかに記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【請求項8】
前記微生物が、大腸菌である、請求項１～６のいずれかに記載の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、ＰｒｄＡタンパク質、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の活性が強化された、Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物及び当該活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法に関する。また、これを基にＤ－プロリン及びＤ－プロリン類似物質を還元する方法、及びＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質と同時発現されて非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させる活性を有するＰｒｄＨタンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
石油需給の不安及び枯渇に対する危機意識に加えて、環境にやさしい製品の開発トレンドにより、バイオプラスチック、バイオエネルギーなどのバイオマス由来の製品に対する研究開発が進められており、特にナイロンの場合、様々なバイオマス由来の単量体を適用するための様々な研究が進められている。一例として、バイオマス由来のプトレシン（putrescine）の適用を介したナイロン４,６の開発、バイオマス由来のカダベリン（cadaverine）の適用を介したナイロン６,６のヘキサメチレンジアミン（hexamethylene diamine、ＨＭＤＡ）を代替しうるナイロン５,６の研究が進められている。また、グルタミン酸（glutamic acid）を原料として、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（Glutamate decarboxylase）によって生産が可能な４－アミノ酪酸（またはガンマアミノ酪酸（gamma-aminobutyric acid、ＧＡＢＡ））を単量体として用いてナイロン４製品開発に対する研究も進められている。
【0003】
５－アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid）は、ナイロン５の単量体であって、プロリン（proline）からＤ－プロリンレダクターゼによって転換されることが知られている。しかし、前記Ｄ－プロリンレダクターゼの活性化のためには、ＰｒｄＡタンパク質の正確な自己切断と同時にピルボイル基が導入されなければならない。しかし、これは技術的な限界とされており、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを製造することができる方法のニーズが増大している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】大韓民国特許公開第２０１５－００２９５２６号
【非特許文献】
【0005】
【文献】Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844-854
【文献】Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8445-8454
【文献】Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3538-3544
【文献】Itoh et al., Science, 340(6128), 2013, 75-78
【文献】Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2486-2492
【文献】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【文献】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【文献】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【文献】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981）2:482
【文献】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical research Foundation, pp. 353-358（1979）
【文献】Gribskov et al（1986）Nucl. Acids Res. 14: 6745
【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【文献】Jackson et al., J. Bacteriol., 2006, 188, 8487-8495
【文献】Fonknechten et al., BMC Genomics, 2010, 11, 555
【文献】Rudnick et al., Biochemistry, 1975, 14(20), 4515-4522
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、Ｄ－プロリンレダクターゼ（D-proline reductase）を活性型に生産可能な組換え発現システム及び菌株開発のために継続的に研究しており、これに加え、様々なＤ－プロリン類似の基質に対する適用可能性の研究を行った。このことから、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質と同時発現されて、非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ（D-proline reductase）を活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換するＰｒｄＨタンパク質を最初に究明した。また、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物及びこれから生産されたＤ－プロリンレダクターゼの活性を成功的に証明した。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本出願の一つの目的は、ＰｒｄＡタンパク質、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の活性が強化された、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を提供することにある。
【0008】
本出願の他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階、前記微生物または培地から活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを回収する段階を含む、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法を提供することにある。
【0009】
本出願の別の目的は、前記微生物または前記微生物が生産する活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを用いて、アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）、γ－アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid、ＧＡＢＡ）及び５－アミノ－４－ヒドロキシペンタン酸（5-amino-4-hydroxypentanoic acid）からなる群から選択される１つ以上を生産する方法を提供することにある。
【0010】
本出願の別の目的は、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢと同時発現されて、非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させるＰｒｄＨタンパク質を提供することにある。
【0011】
本出願の別の目的は、ｐｒｄＡまたはｐｒｄＡとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階、ｐｒｄＢまたはｐｒｄＢとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階を含む、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【0012】
本出願で非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させうるポリペプチドを新たに提案し、既存のＤ－プロリンレダクターゼを構成するＰｒｄＡとＰｒｄＢの複合体と相互作用して発現する時、またはＰｒｄオペロンと共に発現する時に活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの活性が増加して新しい活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを提供し、Ｄ－プロリンまたはその類似体の転換方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】Ｄ－プロリンレダクターゼの活性生産方法に対する概略図である。
【図2】ＰｒｄＡタンパク質の発現条件によるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果である。
【図3】ＰｒｄＡタンパク質の発現する時に攪拌の有無によるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果である。
【図4】ＰｒｄＢタンパク質の発現によるウェスタンブロット分析結果である。
【図5】ＰｒｄＨタンパク質によるＰｒｄＡタンパク質の自己切断に対するウェスタンブロット分析結果である。
【図6】組換え発現されたＤ－プロリンレダクターゼの活性及びＰｒｄＤＥＥ２タンパク質の活性影響に対するＴＬＣ分析結果である。
【図7】ＰｒｄＨタンパク質の汎用的適用性に対するウェスタンブロット分析結果である。
【図8】ＰｒｄＣタンパク質によるＤ－プロリンレダクターゼの活性影響に対するＴＬＣ分析結果である。
【図9】ＰｒｄＧタンパク質によるＤ－プロリンレダクターゼの活性影響（Ａ）及びＰｒｄＧタンパク質の特性分析（Ｂ）に対するＴＬＣ分析結果である。
【図10】遺伝子組換え活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ及び追加タンパク質の同時発現を介して、糖源から５－アミノ吉草酸を生産した内容に対するＴＬＣ分析結果である。
【図11】活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを介してＤ－プロリン類似物質に対する転換能を評価したＴＬＣ分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【0015】
前記目的を達成するための本出願の一つの様態は、ＰｒｄＡタンパク質、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の活性が強化された、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を提供することである。
【0016】
本出願において、用語、「Ｄ－プロリンレダクターゼ（D-Proline reductase）」は、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質からなるタンパク質複合体を意味する。主な機能は、Ｄ－型のプロリン（D-Proline）が還元されて５－アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）に転換される過程に関与することが知られており、前記反応は嫌気菌株のエネルギー源（ＡＴＰ）の供給のために活用されるスティックランド反応（Stickland reaction）の最終段階に該当することが知られている（非特許文献１）。
【0017】
前記スティックランド反応（Stickland reaction）は、スティックランド発酵（Stickland Reaction）とも呼ばれ、アミノ酸が有機酸に結合される間、酸化及び還元されることを含む反応を意味する。具体的には、電子供与体であるアミノ酸は、元のアミノ酸より短い１炭素原子の揮発性カルボン酸に酸化される。例えば、３つの炭素鎖を有するアラニンは、２つの炭素を有する酢酸に転換される。アミノ酸はスティックランド受容体（acceptor）、スティックランド供与体（doner）であってもよい。
【0018】
前記スティックランド反応（Stickland reaction）を有する代表的な菌株としては、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｋｌａｎｄｉｉ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｋｌａｎｄｉｉ）、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍがあり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓのようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ系の一部菌株もこれに該当すると知られている。したがって、前記菌株を用いて、本出願の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物、非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させる活性を有するＰｒｄＨタンパク質、及び活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産することができる。
【0019】
Ｄ－プロリンレダクターゼの主な機能は、Ｄ－プロリン（D-Proline）から５－アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）の転換過程に関与することが知られている。しかし、現在までにＤ－プロリンレダクターゼに対する明確な反応機序は知られていないが、次のような反応機序が提案されている。まず、ａｌｐｈａ－ＰｒｄＡ、Ｂｅｔａ－ＰｒｄＡ、及びＰｒｄＢタンパク質複合体からなるＤ－プロリンレダクターゼの構成タンパク質のうち、ａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質のアミノ末端に位置しているピルボイル基（pyruvoyl group）と基質であるＤ－プロリンのアミン基との相互結合により基質の活性エネルギーが低くなる。次の段階で、ＰｒｄＢタンパク質に位置しているセレノシステインによってＤ－プロリンのアルファ炭素とアミン基の間のＣ－Ｎ結合が切断されるようになり、その結果、Ｄ－プロリンから５－アミノ吉草酸への転換反応が起きるようになる（非特許文献２）。本出願において、用語、「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ」は、本出願の補助タンパク質であるＰｒｄＨにより、Ｄ－プロリンレダクターゼを構成するＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質中、ＰｒｄＡタンパク質が正確な自己切断によりａｌｐｈａ－ＰｒｄＡ及びｂｅｔａ－ＰｒｄＡに分離され、二重分離されたａｌｐｈａ－ＰｒｄＡ部分のアミノ末端側にピルボイル基が結合したａｌｐｈａ－ＰｒｄＡ、ｂｅｔａ－ＰｒｄＡ及びＰｒｄＢタンパク質からなるタンパク質複合体を意味する。このような活性型Ｄ－プロリンレダクターゼは、ピルボイル基が結合したａｌｐｈａ－ＰｒｄＡのピルボイル基が基質であるＤ－プロリン、またはＤ－プロリンと類似した基質との結合を介して前記基質を還元させうる状態の活性型酵素を意味する。例えば、前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼは、基質であるＤ－プロリンを５－アミノ吉草酸（5-aminovalerate）に転換させることができる。
【0020】
本出願において、用語、Ｄ－プロリンは、α-アミノ酸であるＬ－プロリンの光学異性体である。特に、Ｌ－プロリンの場合、非必須アミノ酸でＬ－グルタミン酸から合成することができ、ラセマーゼによってＤ－プロリンへと転換が可能である。
【0021】
本出願において、用語、「ＰｒｄＡタンパク質」は、Ｄ－プロリンレダクターゼのタンパク質複合体を構成する一構成要素であって、前記ＰｒｄＡタンパク質は自己切断過程を介してａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質（カルボキシル末端断片）及びｂｅｔａ－ＰｒｄＡタンパク質（アミノ末端断片）に分かれる。一般的な自己切断過程は、単純なペプチド結合の切断を介して起こるが、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断過程は、ペプチド結合の切断過程と同時にａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質のアミノ末端にピルボイル基（pyruvoyl group）が導入される特性がある。ＰｒｄＡタンパク質が独立して存在する場合、タンパク質自体の不完全性により非特異的な切断／分解過程が伴われ、ａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質及びｂｅｔａ－ＰｒｄＡタンパク質に完全に分離されない問題がある。
【0022】
前記ピルボイル基は、基質の活性エネルギーを下げる役割をするためＤ－プロリンレダクターゼの活性に不可欠な残基として知られている（非特許文献２）。しかし、一般的な加水分解反応を介して、タンパク質切断機序は、前記ピルボイル基が導入されていないため、これを解決するための様々な研究が進められてきた。ＰｒｄＡタンパク質（ｐｒｏ－ＰｒｄＡタンパク質）自体の構造的な不安定性に起因して起こる非特異的タンパク質分解過程を防止するために、アミノ末端が除去されたＰｒｄＡタンパク質断片を対象にＮａＢＨ４などの還元剤を添加して、人為的な切断過程を誘導した研究が行われたことがある。その結果、目的の位置特異的切断は確認されたが、ピルボイル基の導入は行われていないことが確認された（非特許文献３）。
【0023】
前記ＰｒｄＡタンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができ、スティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株のＰｒｄＡタンパク質をコードする配列であれば制限なく用いられてもよい。代表的な例として、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＡタンパク質であってもよいが、これに制限されない。その例として、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号１９の配列によってコードされるアミノ酸配列であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本出願の前記ＰｒｄＡタンパク質は、配列番号３及び前記配列番号１９と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するＰｒｄＡタンパク質も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
【0024】
本出願において、用語、「ＰｒｄＢタンパク質」は、Ｄ－プロリンレダクターゼのタンパク質複合体を構成する一構成要素であって、前記ＰｒｄＢタンパク質は、非天然アミノ酸（non-natural amino acid）であるセレノシステイン（selenocystein、Ｓｅｃ）を含んでいるセレノタンパク質である。セレノシステインは、別名２１番目のアミノ酸と呼ばれる非天然アミノ酸であって、一般的なタンパク質合成機序を介してタンパク質内に導入されない特徴を有する（非特許文献４）。特に６４個のコドンのうちＵＧＡコドン、すなわち停止コドン（stop codon）を用いて導入が行われるため、セレノシステイン導入システムがない場合、前記停止コドンでタンパク質合成が中断される現象が現れる。また、前記セレノシステイン導入コドンを、一般的な停止コドンとして認識しないため、ＳＥＣＩＳ（SElenoCysteine Incorporation Sequence）と呼ばれる配列／構造特異的ｍＲＮＡの二次構造がＵＧＡコドン下に位置しなければならず、これと連携して、タンパク質内に導入するためのｓｅｌシステム（ＳｅｌＡＢＣＤ）が確保されなければならない（非特許文献５）。
【0025】
前記ＰｒｄＢタンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができ、スティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株のＰｒｄＢタンパク質をコードする配列であれば制限なく用いられてもよい。代表的な例として、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＢタンパク質であってもよいが、これに制限されない。その例として、配列番号５のアミノ酸配列または配列番号２１のポリペプチド配列によってコードされるアミノ酸配列であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本出願の前記ＰｒｄＢタンパク質は、配列番号５及び前記配列番号２１と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するＰｒｄＢタンパク質も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
【0026】
本出願において、用語、「ＰｒｄＨタンパク質」は、Ｄ－プロリンレダクターゼを構成するＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質をコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦを用いてコードされた新規タンパク質を意味する。本出願では、これをＰｒｄＨと命名した。また、Ｄ－プロリンレダクターゼ活性を有する菌株の種属または特性に応じて、前記ＰｒｄＨタンパク質はＰｒｄＡまたはＰｒｄＢと一部重なって存在してもよく、ＰｒｄＨの停止コドン（Stop codon）がＰｒｄＢの開始コドン（Start codon）の後に存在してもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【0027】
前記ＰｒｄＨタンパク質はＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢと同時発現されて、ＰｒｄＡタンパク質の正確な自己切断及びピルボイル基の導入を誘導することにより、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼで構成されるようにする。具体的には、前記ＰｒｄＨタンパク質はスティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株のＰｒｄＨタンパク質をコードする配列であれば制限なく用いられてもよい。つまり、スティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株のＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質をコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦを含む配列であれば、制限なく用いられてもよい。代表的な例として、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来ＰｒｄＨタンパク質であってもよいが、これに制限されない。Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０由来ＰｒｄＨタンパク質とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＨタンパク質は、４０％の相同性または同一性を有し、前記各２種の微生物由来のＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質をコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦという共通点を有する。より具体的な例では、前記のＰｒｄＨタンパク質は、配列番号１または配列番号２３のアミノ酸配列からなるポリペプチド配列によってコードされるアミノ酸配列であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0028】
また、本出願の前記ＰｒｄＨタンパク質は、配列番号１または配列番号２３と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するＰｒｄＨタンパク質も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
【0029】
本出願において、相同性（homology）及び同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
【0030】
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性（homologous）を有するか同一な（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上の中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【0031】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献６と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献７）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン－ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献８）を用いて決定してもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA／.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【0032】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献９に公知されたように、例えば、非特許文献８のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献１０に開示されたように、非特許文献１１の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【0033】
また、本願で「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」と記載されていても、その配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本出願で用いることができるのは自明である。具体的には、当該配列番号のアミノ酸配列の前後にタンパク質の機能を変更していない配列の追加または自然的に発生しうる突然変異、保存的置換、あるいはその同義変異（synonymous mutation）を除外することなく、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属するのが自明である。
【0034】
本出願において、用語、「保存的置換（conservative substitution）」は、アミノ酸配列内の１つのアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。前記変異型は、１つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば、１つ以上の保存的置換を有してもよい。これらのアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／または両親媒性（amphipathic nature）での類似性に基づいて発生することができる。例えば、陽に荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；陰に荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含む。通常的に、保存性置換は生成されたポリペプチドの活性にほとんど影響を与えないか、または影響を及ぼさない。前記配列番号１または配列番号２３からなるアミノ酸配列を有するＰｒｄＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本発明の範囲内に属し、例えば、配列番号２または配列番号２４の塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。前記ポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内で、コーディング領域に多様な変形が行われてもよい。
【0035】
コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号１または配列番号２３のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそれと相同性または同一性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化し、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.,）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、４０％以上、８５％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を挙げられる。
【0036】
混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
【0037】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
【0038】
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献１２参照）。
【0039】
本出願において、用語、「活性の強化」は、酵素タンパク質の活性が導入されたり、微生物が有する内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記活性の「導入」は、自然的あるいは人為的に微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性が現れるようになることを意味する。「内在的活性」は、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株が本来有していた特定タンパク質の活性をいう。
【0040】
例えば、前記活性強化は、外来のＤ－プロリンレダクターゼを宿主細胞に導入したり、導入して強化すること、または内在的Ｄ－プロリンレダクターゼの活性を強化することをすべて含んでもよい。
【0041】
具体的には、本出願において活性の増加は、
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が増強されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が増強されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。
【0042】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。また、コピー数の増加の一様態として、その酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記酵素と同じ／類似した活性を示す限り、その由来や配列に制限されず用いられてもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行われてもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによって酵素が生成され、その活性が増加されてもよい。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するような発現調節配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。具体的に、ポリヌクレオチド発現単位の上部には本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがある。前記プロモーターとポリヌクレオチドが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するような発現調節配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。具体的に、ポリヌクレオチド発現単位の上部には本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがある。前記プロモーターとポリヌクレオチドが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
【0043】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
【0044】
最後に、４）前記１）～３）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形の中の１つ以上の方法を一緒に適用して行なわれてもよい。
【0045】
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【0046】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【0047】
本出願で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体に挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別できる。
【0048】
本出願において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。また、前記発現カセットの内部または外部には標的タンパク質の効率的な生産を助けることができる様々な因子が含まれてもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、 ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【0049】
また、前記において、用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知の遺伝子組換え技術を利用して製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
【0050】
また、本出願の一つの具体的な例は、前記ＰｒｄＡタンパク質、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の活性が強化された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物に、さらにＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ、及びＰｒｄＥ２からなる群から選択される１つ以上のタンパク質の活性が強化された、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を提供する。
【0051】
また、本出願の一つの具体的な例は、ＰｒｄＡタンパク質、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の活性が強化された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物に、さらにＰｒｄＣ、ＰｒｄＧ、またはＰｒｄＦからなる群から選択される１つ以上のタンパク質の活性が強化された、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を提供する。
【0052】
前記「ＰｒｄＤタンパク質、ＰｒｄＥタンパク質、ＰｒｄＥ２タンパク質、ＰｒｄＣタンパク質、ＰｒｄＧタンパク質、ＰｒｄＦタンパク質」は、Ｄ－プロリンレダクターゼのＰｒｄオペロンを構成するタンパク質を意味する。具体的には、Ｄ－プロリンレダクターゼを構成しているＰｒｄＡ及びＰｒｄＢタンパク質のほかに、ｐｒｄオペロンを構成しているタンパク質はＰｒｄＤＥＥ２ＣＧＦＲとして知られている。現在までに最もよく知られているｐｒｄオペロンはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ菌株に存在し、前記タンパク質の名称はＣ. ｓｔｒｉｃｋｌｎａｄｉｉのオペロン（NCBI GenBank：FP565809.1）の構成を基準とする（非特許文献１３）。
【0053】
Ｐｒｄオペロンを構成している各タンパク質の機能は明確に究明されていなかったが、ＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ、及びＰｒｄＥ２タンパク質はＰｒｄＡタンパク質と高い配列相同性または同一性を有している。このうち、ＰｒｄＤタンパク質はｂｅｔａ－ＰｒｄＡタンパク質と高い相同性または同一性を示し、ＰｒｄＥ及びＰｒｄＥ２タンパク質はａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質と高い相同性または同一性を示す。前記ＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ、及びＰｒｄＥ２タンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。本出願でＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ、及びＰｒｄＥ２タンパク質は、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＤ、ＰｒｄＥ、及びＰｒｄＥ２タンパク質、具体的には、配列番号７、９、１１のアミノ酸配列または配列番号８、１０、１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0054】
ＰｒｄＣタンパク質はＮＡＤＨを用いてＤ－プロリンレダクターゼの電子伝達に関与することが報告されており（非特許文献１４）、ＰｒｄＧタンパク質は膜タンパク質として知られているが、その機能性について報告されたことはない。前記ＰｒｄＣタンパク質は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。本出願でＰｒｄＣ、ＰｒｄＧタンパク質はＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＣ、ＰｒｄＧタンパク質、具体的には、配列番号１３、１５のアミノ酸配列または配列番号１４、１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0055】
また、ＰｒｄＦタンパク質はプロリンラセマーゼ（proline racemase）としてプロリンの光学異性体の形成に関与するタンパク質として知られており、ＰｒｄＲタンパク質はＰｒｄオペロンの活性化に関連する機能を有することが報告されている（非特許文献１）。前記ＰｒｄＦタンパク質は公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。本出願でＰｒｄＦタンパク質はＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＦタンパク質、具体的には、配列番号１７のアミノ酸配列または配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいが、これに制限されるものではない。
【0056】
本出願において、用語、「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物」とは、ＰｒｄＡタンパク質の正確な自己切断を介して得られたピルボイル基（pyruvoyl group）が結合されたａｌｐｈａ－ＰｒｄＡとｂｅｔａ－ＰｒｄＡ及びＰｒｄＢで構成された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を意味する。前記「微生物」は、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産しうる微生物であれば、原核微生物及び真核微生物いずれも含まれてもよい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物菌株が含まれてもよく、エシュリキア属の例として大腸菌であってもよいが、これに制限されない。
【0057】
本出願の前記Ｄ－プロリンレダクターゼ活性を有するポリペプチドを発現することができる活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産するエシュリキア属微生物は、前記ベクターの導入以外にも、様々な公知の方法により前記ポリペプチドを発現することができる微生物のすべて含んでよい。
【0058】
本出願の別の様態は、前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地から活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを回収する段階を含む、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法であってもよい。
【0059】
前記「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物」については、前記説明した通りである。
【0060】
前記「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行われてもよい。このような培養過程は選択された菌株に応じて、当業者が容易に調整して用いてもよい。前記微生物を培養する段階では、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的には、ｐＨ６～８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよい。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよく、また、培養物の好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気の状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には、２５～４０℃を維持してもよいが、これに制限されない。培養期間は目的の有用物質の生産量が収得されるまで続いてもよく、具体的には、約１０～１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【0061】
前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを生産する方法は、当業界に公知された最適化された培地及び培養条件で、当業者によって容易に決定されてもよい。前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを回収する段階は、当該分野で公知の適切な方法を用いて行われてもよい。例えば、遠心分離、ろ過、蒸留、イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよいが、これに制限されるものではない。
【0062】
また、前記回収段階は精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行われてもよい。したがって、前記の回収された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼは、精製された形態または活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを含有した微生物発酵液であってもよい。
【0063】
本出願の別の様態は、前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物またはそれから生産された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを用いてＤ－プロリンまたはその類似体を還元方法によって転換させる方法であってもよい。
【0064】
具体的には、前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物またはそれから生産された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを用いて、アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）、γ－アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid、ＧＡＢＡ）及び５－アミノ－４－ヒドロキシペンタン酸（5-amino-4-hydroxypentanoic acid）からなる群から選択される１つ以上を生産する方法であってもよい。
【0065】
前記Ｄ－プロリン類似体は、Ｄ－プロリンと類似した構造を有する物質であって、カルボキシル基とアルファ炭素、アミノ基が順次連結され、前記アルファ炭素とアミノ基を含むリング構造を有する物質であれば、リングのサイズに関係なく、本出願の活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによって還元されうるすべての類似体を含む。具体的には、Ｄ－アゼチジン－２－カルボン酸（D-azetidine-2-carboxylic acid）、トランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（trans-4-hydroxy-D-Proline）、シス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（cis-4-hydroxy-D-Proline）からなるグループから選択されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0066】
また、前記活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによる還元は、Ｄ－プロリンまたはその類似体の構造でアルファ炭素とアミノ基との間の結合が切れて、リング構造が解ける転換反応を意味する。具体的には、Ｄ－プロリンは、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによって５－アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）に転換されうる。また、前記Ｄ－アゼチジン－２－カルボン酸（D-azetidine-2-carboxylic acid）の場合、Ｄ－プロリンに比べて一つの炭素が不足した正方形リング状の構造を有し、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによって転換反応が進行される場合、γ－アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid、ＧＡＢＡ）が生成されうる。また、Ｄ－プロリンのリング構造にヒドロキシル基（－ＯＨ）が追加された形態のシス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（cis-4-hydroxy-D-Proline）またはトランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（trans-4-hydroxy-D-Proline）は活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによって転換反応が進行される場合、５－アミノ－４－ヒドロキシペンタン酸（5-amino-4-hydroxypentanoic acid ）が生成されうるが、これに制限されない。
【0067】
本出願の別の様態は、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質と同時発現されて、非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換させる活性を有するＰｒｄＨタンパク質であってもよい。
【0068】
前記「ＰｒｄＡタンパク質」、「ＰｒｄＢタンパク質」、「ＰｒｄＨタンパク質」、「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ」については、前記説明した通りである。
【0069】
本出願において、用語、「同時発現」は、２つ以上のタンパク質の発現または２つ以上のタンパク質をコードする遺伝子の発現が同時に示されることを意味する。前記遺伝子またはタンパク質の発現方法は、当業界に公知された方法の中から、当業者によって容易に決定してもよい。
【0070】
本出願において、用語、「非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換」とは、非活性状態であるＤ－プロリンレダクターゼが活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの活性を有するように転換されることを意味する。非活性型Ｄ－プロリンレダクターがＰｒｄＡタンパク質の正確な自己切断を介して得られたピルボイル基（pyruvoyl group）が結合されたａｌｐｈａ－ＰｒｄＡとｂｅｔａ－ＰｒｄＡ及びＰｒｄＢで構成された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼに転換されることを意味する。前記「非活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ」はＰｒｄＡタンパク質が自己切断されないか、自己切断されてもピルボイル基（pyruvoyl group）が結合されていないａｌｐｈａ－ＰｒｄＡとｂｅｔａ－ＰｒｄＡで構成されるか、ＰｒｄＡまたはＰｒｄＢのタンパク質が発現されないか、または発現されても活性がない場合を意味してもよい。
【0071】
本出願の別の様態は、ｐｒｄＡまたはｐｒｄＡとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階及びｐｒｄＢまたはｐｒｄＢとｐｒｄＨ遺伝子を含む発現カセットを宿主細胞に形質転換する段階を含む、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物を製造する方法であってもよい。
【0072】
前記「ＰｒｄＡタンパク質」、「ＰｒｄＢタンパク質」、「ＰｒｄＨタンパク質」、「発現カセット」、「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼ」、「活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを発現する微生物」については、前記説明した通りである。
【0073】
以下、本出願の実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
【0074】
実施例１：ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質の発現
１－１：ＰｒｄＡタンパク質の発現のための遺伝子の選定
ＰｒｄＡタンパク質の発現のためにスティックランド反応（Stickland reaction）を有する代表的な菌株として知られているＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＤ－プロリンレダクターゼＰｒｄＡタンパク質のアミノ酸配列（Ｑ１７ＺＹ９、UniProtKB、配列番号３）を対象に実験を行った。前記Ｄ－プロリンレダクターゼＰｒｄＡタンパク質の遺伝子の塩基配列（CD630_32440、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号４）を用いて発現ベクターを構成した。
１－１：ＰｒｄＡタンパク質の発現のための遺伝子の選定
ＰｒｄＡタンパク質の発現のためにスティックランド反応（Stickland reaction）を有する代表的な菌株として知られているＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＤ－プロリンレダクターゼＰｒｄＡタンパク質のアミノ酸配列（Ｑ１７ＺＹ９、UniProtKB、配列番号３）を対象に実験を行った。前記Ｄ－プロリンレダクターゼＰｒｄＡタンパク質の遺伝子の塩基配列（CD630_32440、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号４）を用いて発現ベクターを構成した。
【0075】
１－２：ＰｒｄＡ発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）の製作
前記塩基配列を対象に、両末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。合成された遺伝子とｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターをＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保した後、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＡ発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）を構築した。
前記塩基配列を対象に、両末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。合成された遺伝子とｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターをＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保した後、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＡ発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）を構築した。
【0076】
１－３：ＰｒｄＡタンパク質の自己切断の位置特異的変異の発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６）の製作
また、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断が起こる位置として知られている４２１番目のアミノ酸にアラニンスキャニング（alanine scanning）方法を適用した。４２１番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに置換（Ｃ４２１Ａ）するための位置特異的変異（site-directed mutagenesis）を行った。このため、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ベクターとＣ４２１Ａ変異のために設計された配列番号２５と２６のプライマー（表１）をＰｆｕ ＰＣＲプレミックスに添加して遺伝子を増幅した。この際、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング、及び７２℃で１０分間の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果にＤｐｎＩ（３７℃、３時間）を処理して大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養して菌体を確保した後、プラスミドベクターを分離し、配列確認を介してｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６ベクターを確保した。
また、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断が起こる位置として知られている４２１番目のアミノ酸にアラニンスキャニング（alanine scanning）方法を適用した。４２１番目のアミノ酸であるシステインをアラニンに置換（Ｃ４２１Ａ）するための位置特異的変異（site-directed mutagenesis）を行った。このため、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ベクターとＣ４２１Ａ変異のために設計された配列番号２５と２６のプライマー（表１）をＰｆｕ ＰＣＲプレミックスに添加して遺伝子を増幅した。この際、ＰＣＲ反応は、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリング、及び７２℃で１０分間の伸長過程を３０回繰り返した。このＰＣＲ結果にＤｐｎＩ（３７℃、３時間）を処理して大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換させた。形質転換された大腸菌を培養して菌体を確保した後、プラスミドベクターを分離し、配列確認を介してｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６ベクターを確保した。
【0077】
【表1】
【0078】
１－４：ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質を同時に発現できる発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）の製作
ＰｒｄＡタンパク質の自己切断過程を誘導するためにＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のｐｒｄオペロンを構成するタンパク質のうち、構造タンパク質であるＰｒｄＡ及びＰｒｄＢをコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦを用いてコードされた新規タンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１７ＺＹ５、UniProtKB、配列番号１／塩基配列：CD630_32430、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号２；以下ＰｒｄＨタンパク質と命名する）の同時発現を試みた。このため、前記塩基配列を対象に、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ組み合わせの制限酵素配列を有する遺伝子を合成し、合成されたｐｒｄＨ遺伝子と既に構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ベクターをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＡとＰｒｄＨタンパク質を同時に発現できる発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ ）を構築した。
ＰｒｄＡタンパク質の自己切断過程を誘導するためにＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のｐｒｄオペロンを構成するタンパク質のうち、構造タンパク質であるＰｒｄＡ及びＰｒｄＢをコードする遺伝子の間に存在する遺伝子ＯＲＦを用いてコードされた新規タンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１７ＺＹ５、UniProtKB、配列番号１／塩基配列：CD630_32430、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号２；以下ＰｒｄＨタンパク質と命名する）の同時発現を試みた。このため、前記塩基配列を対象に、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ組み合わせの制限酵素配列を有する遺伝子を合成し、合成されたｐｒｄＨ遺伝子と既に構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ベクターをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＡとＰｒｄＨタンパク質を同時に発現できる発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ ）を構築した。
【0079】
１－５：構築された３つの発現ベクターのＰｒｄＡタンパク質の発現有無及びＰｒｄＡの自己切断有無の確認
次の段階で、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６、ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６、またはｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、アンピシリン抗生剤（０．１ｍｇ／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）に接種して、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養を行った。
次の段階で、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６、ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６、またはｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、アンピシリン抗生剤（０．１ｍｇ／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）に接種して、３７℃、２００ｒｐｍの条件で培養を行った。
【0080】
目的タンパク質の過発現を誘導するためにＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に、０．１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside、以下ＩＰＴＧ）を添加した。
【0081】
また、基質結合を介したＰｒｄＡタンパク質の自己切断を誘導する目的として、ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６ベクターで形質転換された大腸菌を培養した培養液には、基質であるＤ－プロリン（１０ｍＭ）を添加または未添加して培養した。
【0082】
以後、３０℃、２００ｒｐｍ攪拌条件または３０℃、静置培養条件で、それぞれ１６時間を追加で培養した。静置培養条件は発現されたＰｒｄＡタンパク質の非特異的分解現象を軽減するために攪拌過程を省略して行われた。
【0083】
組換え発現されたＰｒｄＡタンパク質の発現有無を確認するために、確保された菌体を破砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を介して上澄み液を分離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びウエスタンブロット分析を行った。分析の結果、ＰｒｄＡタンパク質の理論分子量と同じ６７．６ｋＤａの分子量を有する目的タンパク質の発現を確認した（図２）。しかし、いずれも不活性のＰｒｄＡタンパク質が有する自己切断されていないｐｒｏ－ＰｒｄＡタンパク質の形態で発現され、これにより示される追加のタンパク質の生成（ａｌｐｈａ－ＰｒｄＡ、２１．９ｋＤａ及びｂｅｔａ－ＰｒｄＡ、４４．７ｋＤａ）も確認されなかった。また、ウェスタンブロットの結果で示された非特異的に分解されたタンパク質のバンドを確認することにより、自己切断されていないｐｒｏ－ＰｒｄＡタンパク質の構造的な不安定性によりタンパク質の分解が多く起こったことを確認した（図２、ｌａｎｅ ２））。また、自己切断が起こる位置として知られているＰｒｄＡタンパク質の４２１番目のシステイン配列をアラニンに置換したＰｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）変異タンパク質の発現パターン様相及び野生型ＰｒｄＡの発現パターンが同じであることからＰｒｄＡタンパク質の独立した機序では自己切断が起こらないことを再確認した（図２、ｌａｎｅ ３）。また、基質結合を介してＰｒｄＡタンパク質の自己切断を誘導するためにＤ－プロリンを添加したり（図２、ｌａｎｅ ４）、ＰｒｄＡタンパク質をＰｒｄＨタンパク質と同時に発現した場合も、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断は起こらないことを確認した（図２、ｌａｎｅ ５）。
【0084】
ＰｒｄＡタンパク質を単独で発現した場合、発現されたタンパク質の非特異的分解現象を軽減するために攪拌過程なしに静置培養されたＰｒｄＡタンパク質の発現パターンを分析した。この場合、比較的低いレベルの発現量のため、タンパク質自体の分解現象が改善されたが、自己切断は起こらないことが確認された（図３、ｌａｎｅ ３,４）。具体的には、ｂｅｔａ－ＰｒｄＡタンパク質と同じようなサイズの切断タンパク質を確認することができたが、ａｌｐｈａ－ＰｒｄＡタンパク質の確認がされないことを介して非特異的切断によって生成された切断タンパク質であることが確認できた。これらの結果は、先行研究の結果（特許文献１；非特許文献３）と同じ結果であることが確認できた。
【0085】
実施例２：ＰｒｄＢタンパク質の発現
２－１：ＰｒｄＢタンパク質の発現のための遺伝子の選定
ＰｒｄＢタンパク質の発現のためにスティックランド反応（Stickland reaction）を有する代表的な菌株として知られているＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＤ－プロリンレダクターゼＰｒｄＢタンパク質のアミノ酸配列（Ｑ１７ＺＹ６、 UniProtKB、配列番号５）を対象に行い、前記タンパク質の遺伝子の塩基配列（CD630_32410、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号６）を用いて発現ベクターを構築した。
２－１：ＰｒｄＢタンパク質の発現のための遺伝子の選定
ＰｒｄＢタンパク質の発現のためにスティックランド反応（Stickland reaction）を有する代表的な菌株として知られているＰｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＤ－プロリンレダクターゼＰｒｄＢタンパク質のアミノ酸配列（Ｑ１７ＺＹ６、 UniProtKB、配列番号５）を対象に行い、前記タンパク質の遺伝子の塩基配列（CD630_32410、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号６）を用いて発現ベクターを構築した。
【0086】
２－２：ＰｒｄＢ発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－Ｈ６）の製作
前記塩基配列を対象に、カルボキシル末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。合成された遺伝子とｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ベクターをＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保した後、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＢ発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－Ｈ６）を構築した。
前記塩基配列を対象に、カルボキシル末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。合成された遺伝子とｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ベクターをＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保した後、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＢ発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－Ｈ６）を構築した。
【0087】
２－３：ＰｒｄＢタンパク質内セレノシステイン導入用ベクターの作製
ＰｒｄＢタンパク質はセレノタンパク質（selenoprotein）として知られている。つまり、ＰｒｄＢタンパク質のアミノ酸配列のうちセレノシステインを含んでおり、前記セレノシステインは非天然アミノ酸であるため、一般的なタンパク質生合成過程を経て導入が難しい技術的な限界を持っている。したがって、本出願では、既公知技術であるｓｅｌオペロンシステム（ｓｅｌＡＢＣ）の導入（非特許文献５）を介してＰｒｄＢタンパク質のセレノシステインの導入を試みた。
ＰｒｄＢタンパク質はセレノタンパク質（selenoprotein）として知られている。つまり、ＰｒｄＢタンパク質のアミノ酸配列のうちセレノシステインを含んでおり、前記セレノシステインは非天然アミノ酸であるため、一般的なタンパク質生合成過程を経て導入が難しい技術的な限界を持っている。したがって、本出願では、既公知技術であるｓｅｌオペロンシステム（ｓｅｌＡＢＣ）の導入（非特許文献５）を介してＰｒｄＢタンパク質のセレノシステインの導入を試みた。
【0088】
２－３－１：ｓｅｌＡＢ導入ベクター（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＢ／ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢ）
このため、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＳｅｌＡタンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１８２Ｉ２、UniProtKB／塩基配列：CD630_24950、NCBI GeneBank AM180355.1）とＳｅｌＢタンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１８２Ｉ０、UniProtKB／塩基配列：CD630_24930、NCBI GeneBank AM180355.1）を用い、それぞれアミノ末端とカルボキシル末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせの制限酵素配列を有するように遺伝子を合成した。
このため、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＳｅｌＡタンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１８２Ｉ２、UniProtKB／塩基配列：CD630_24950、NCBI GeneBank AM180355.1）とＳｅｌＢタンパク質（アミノ酸配列：Ｑ１８２Ｉ０、UniProtKB／塩基配列：CD630_24930、NCBI GeneBank AM180355.1）を用い、それぞれアミノ末端とカルボキシル末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせの制限酵素配列を有するように遺伝子を合成した。
【0089】
次の段階で市販ベクターであるｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１プラスミドベクター（Novagene）とｓｅｌＢ遺伝子を対象にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせの制限酵素を処理してアガロースゲルを介して分離した後、Ｔ４リガーゼ反応を介してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＢベクターを構築した。そして、前記ベクター（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＢ）を対象に、追加のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせの制限酵素反応を介してｓｅｌＡ遺伝子を挿入して、最終的にｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターを構築した。
【0090】
２－３－２：ｓｅｌＣ導入ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６_ＰｓｅｌＣ-ｓｅｌＣ）
ｓｅｌＣ遺伝子はセレノシステイン特異的なｔＲＮＡであって、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のｓｅｌＣ遺伝子（塩基配列：CDIF630_02727、NCBI GeneBank CP010905.1）とｓｅｌＣ固有のプロモーター及びターミネーターを含むことできるようにアミノ末端から１５０個、カルボキシル末端から２５０個のヌクレオチドをさらに含み、最終的に両末端にＸｂａＩ制限酵素配列を添加して合成を行った。このように確保されたｓｅｌＣ遺伝子と先に構築されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６ベクターを対象にＸｂａＩ制限酵素処理した後、アガロースゲルを介して分離した後にＴ４リガーゼ反応を介して、最終的にｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－Ｈ６_PｓｅｌＣ-ｓｅｌＣベクターを構築した。
ｓｅｌＣ遺伝子はセレノシステイン特異的なｔＲＮＡであって、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のｓｅｌＣ遺伝子（塩基配列：CDIF630_02727、NCBI GeneBank CP010905.1）とｓｅｌＣ固有のプロモーター及びターミネーターを含むことできるようにアミノ末端から１５０個、カルボキシル末端から２５０個のヌクレオチドをさらに含み、最終的に両末端にＸｂａＩ制限酵素配列を添加して合成を行った。このように確保されたｓｅｌＣ遺伝子と先に構築されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６ベクターを対象にＸｂａＩ制限酵素処理した後、アガロースゲルを介して分離した後にＴ４リガーゼ反応を介して、最終的にｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－Ｈ６_PｓｅｌＣ-ｓｅｌＣベクターを構築した。
【0091】
２－４：構築された３つの発現ベクターのＰｒｄＢタンパク質の発現有無の確認
１）ＰｒｄＢタンパク質単独の発現
前記実施例２－２で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）で培養を行った（３７℃ 、２００ｒｐｍ）。
１）ＰｒｄＢタンパク質単独の発現
前記実施例２－２で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）で培養を行った（３７℃ 、２００ｒｐｍ）。
【0092】
２）ＰｒｄＢタンパク質及びｓｅｌＣ同時発現
前記実施例２－３で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養方法は１）と同様に行った。
前記実施例２－３で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養方法は１）と同様に行った。
【0093】
３）ＰｒｄＢタンパク質及びＳｅｌＡＢタンパク質が同時発現された実施例２－２で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６及び実施例２－３で製作されたｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養方法は１）と同様に行った。
【0094】
４）ＰｒｄＢタンパク質及びｓｅｌＡＢＣの同時発現
実施例２－３で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養方法は１）と同様に行った。
実施例２－３で製作されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、培養方法は１）と同様に行った。
【0095】
目的タンパク質の過発現を誘導するためにＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した。また、セレノシステイン生合成及び導入に必要なセレンを供給するために、１０μＭ亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）を供給または未供給した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌の菌体を破砕した後、遠心分離を介して上澄み液を分離してウェスタンブロット分析を行った。
【0096】
分析の結果、ＰｒｄＢタンパク質を単独で発現した場合、セレノシステインの低い導入効率のために非常に低いレベルのＰｒｄＢタンパク質発現を確認し（図４、ｌａｎｅ １、２）、ＰｒｄＢタンパク質及びｓｅｌＣ同時発現（図４、ｌａｎｅ ３、４）、またはＰｒｄＢ及びＳｅｌＡＢタンパク質の同時発現（図４、ｌａｎｅ ５、６）時にも、同じ結果を確認した（図４）。しかし、ＰｒｄＢタンパク質とｓｅｌＡＢＣ遺伝子が同時に発現された場合、ＰｒｄＢタンパク質の発現量が格段に増加することを確認しており（図４、ｌａｎｅ ７）、これは、前記ｓｅｌオペロンを構成しているＳｅｌＡ及びＳｅｌＢタンパク質とセレノシステイン特異的ｔＲＮＡであるＳｅｌＣの影響で非天然アミノ酸であるセレノシステインがＰｒｄＢタンパク質内に効率的に導入されたことを意味する。また、亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）を添加した場合（図４、ｌａｎｅ ８；最終濃度１０μＭ）、添加していない場合（ｌａｎｅ ７）と比較してＰｒｄＢタンパク質の発現量がさらに増加した結果を確認することができ、これを介してセレノシステインの効率的な導入システムの構築がＰｒｄＢタンパク質が発現量の増大に主要な要素であることを確認した。
【0097】
実施例３：ＰｒｄＨタンパク質の機能性の検証及びＰｒｄＨタンパク質発現を含むＤ－プロリンレダクターゼの活性の評価
３－１：ＰｒｄＨ機能検証のためのＤ－プロリンレダクターゼタンパク質の発現
前記確認された情報をもとにＤ－プロリンレダクターゼの発現を試みており、そのために次のようなベクターの組み合わせを評価した。
３－１：ＰｒｄＨ機能検証のためのＤ－プロリンレダクターゼタンパク質の発現
前記確認された情報をもとにＤ－プロリンレダクターゼの発現を試みており、そのために次のようなベクターの組み合わせを評価した。
【0098】
１）ＰｒｄＡ及びＰｒｄＢタンパク質の同時発現
既に構築されたＰｒｄＡタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）で培養を進めた（３７℃、２００ｒｐｍ）。
既に構築されたＰｒｄＡタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地（５０ｍｌ）で培養を進めた（３７℃、２００ｒｐｍ）。
【0099】
２）ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の同時発現
既に構築されたＰｒｄＡ及びＰｒｄＨ同時発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。培養方法は１）と同様に行った。
既に構築されたＰｒｄＡ及びＰｒｄＨ同時発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。培養方法は１）と同様に行った。
【0100】
３）ＰｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）、ＰｒｄＢタンパク質及びＰｒｄＨタンパク質の同時発現
既に構築されたＰｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）タンパク質とＰｒｄＨタンパク質の同時発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。培養方法は１）及び２）と同様に行った。
既に構築されたＰｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）タンパク質とＰｒｄＨタンパク質の同時発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ（Ｃ４２１Ａ）－Ｈ６）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－Ｈ６－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。培養方法は１）及び２）と同様に行った。
【0101】
目的タンパク質の過発現を誘導するために、培養液のＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に各培養液に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭの 亜セレン酸ナトリウム供給した後、１６時間を追加で培養した。
【0102】
３－２：ＰｒｄＨタンパク質導入を介したＰｒｄＡタンパク質の自己切断確認－ウエスタンブロット分析
前記実施例３－１で得られた各培養液の大腸菌菌体を破砕した後、遠心分離を介して上澄み液を分離してウェスタンブロット分析を行った。
前記実施例３－１で得られた各培養液の大腸菌菌体を破砕した後、遠心分離を介して上澄み液を分離してウェスタンブロット分析を行った。
【0103】
分析の結果、ＰｒｄＡタンパク質及びＰｒｄＢタンパク質だけを同時に発現した場合、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断現象は確認されなかった（図５、ｌａｎｅ １）。しかし、ＰｒｄＨタンパク質とＰｒｄＡ及びＰｒｄＢタンパク質を同時に発現した場合、非活性形態のＰｒｄＡタンパク質（Ｐｒｏ－ＰｒｄＡタンパク質）が消えると同時に、追加のタンパク質バンドが形成されたことを確認した（図５、ｌａｎｅ ２）。
【0104】
前記実験結果がＰｒｄＡタンパク質固有の自己切断メカニズムから起因されたことを確認するために、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断位置として知られている４２１番目のアミノ酸システインをアラニンに置換（Ｃ４２１Ａ）してＰｒｄＢ及びＰｒｄＨタンパク質と同時に発現した結果、Ｐｒｏ－ＰｒｄＡタンパク質が維持されると同時に切断されたタンパク質は確認されなかった（図５、ｌａｎｅ ３）。これは追加で現れたタンパク質がＰｒｄＡタンパク質の４２１番目のシステインの位置で特異的に切断されたことを意味する。
【0105】
したがって、ＰｒｄＨタンパク質がＰｒｄＡタンパク質の自己切断に不可欠なタンパク質であることを確認し、ＰｒｄＡタンパク質の活性の確保に重要な機能をする補助タンパク質であることを確認した。
【0106】
これに加え、先行実施例を介してＰｒｄＡタンパク質とＰｒｄＨタンパク質を同時に発現したにもかかわらず、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断が起こらない結果（実施例１；図２、ｌａｎｅ ５）を介して、ＰｒｄＡタンパク質の自己切断を誘導するためにはＰｒｄＨタンパク質だけでなく、ＰｒｄＢタンパク質が同時に存在しなければならず、これはＰｒｄＡタンパク質とＰｒｄＢタンパク質が一定水準以上の複合体を優先的に形成した後、ＰｒｄＨタンパク質によって切断される過程が進行されることを確認できた。
【0107】
３－３：ＰｒｄＨタンパク質が同時発現されたＤ－プロリンレダクターゼ活性の評価 －ＴＬＣ分析
３－１で獲得された大腸菌菌体を最終ＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後１ｍＬの０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に希釈した。次の段階で希釈された各サンプル２００μｌを分注して、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）及びＤ－プロリン（最終濃度１０ｍＭ）を添加し、６時間の反応後にＴＬＣ分析を行った。
３－１で獲得された大腸菌菌体を最終ＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後１ｍＬの０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に希釈した。次の段階で希釈された各サンプル２００μｌを分注して、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）及びＤ－プロリン（最終濃度１０ｍＭ）を添加し、６時間の反応後にＴＬＣ分析を行った。
【0108】
ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢ及びＰｒｄＨタンパク質が同時発現された菌株の場合、ＴＬＣ上で５－アミノ吉草酸（5-aminovaleric acid、５－ＡＶＡ）に対応するスポットが生成されることを確認しており（図６、ｌａｎｅ １）、ＰｒｄＨタンパク質が存在しない場合には活性が示されないことを確認した（図６、ｌａｎｅ ２）。これは、ＰｒｄＨタンパク質の不在によりＰｒｄＡタンパク質の自己切断が起こらず、これによりＤ－プロリンレダクターゼの活性が示されないことを意味する。
【0109】
ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢ及びＰｒｄＨタンパク質が同時発現された菌株をＣＣ０４－９００７と命名し、２０１７年２月２日付けでブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１９６３Ｐを与えられた。
【0110】
実施例４：ＰｒｄＨタンパク質の汎用性の検証
４－１：ＰｒｄＨタンパク質の汎用性検証のための菌株の選定
前記ＰｒｄＨタンパク質がＰｒｄＡタンパク質の自己切断に汎用的に適用されうる必須の補助タンパク質であることを検証するために、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０に加えて、スティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株として知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＡ（以下ＬｓＰｒｄＡ）タンパク質の自己切断にＰｒｄＨ（以下ＬｓＰｒｄＨ）タンパク質の関与有無を確認した。
４－１：ＰｒｄＨタンパク質の汎用性検証のための菌株の選定
前記ＰｒｄＨタンパク質がＰｒｄＡタンパク質の自己切断に汎用的に適用されうる必須の補助タンパク質であることを検証するために、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０に加えて、スティックランド反応（Stickland reaction）を有する菌株として知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＡ（以下ＬｓＰｒｄＡ）タンパク質の自己切断にＰｒｄＨ（以下ＬｓＰｒｄＨ）タンパク質の関与有無を確認した。
【0111】
４－２：ＬｓＰｒｄＡ発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）の製作
ＬｓＰｒｄＡタンパク質（アミノ酸配列：E1JLY6、UniProtKB、配列番号１９／塩基配列：HMPREF9269_1797、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２０）は、その遺伝子配列の両末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターと前記合成された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保してＴ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを構築した。
ＬｓＰｒｄＡタンパク質（アミノ酸配列：E1JLY6、UniProtKB、配列番号１９／塩基配列：HMPREF9269_1797、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２０）は、その遺伝子配列の両末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加し、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクターと前記合成された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保してＴ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを構築した。
【0112】
４－３：ＬｓＰｒｄＡ及びＬｓＰｒｄＨタンパク質を同時に発現できるベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＨ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）の製作
さらにＬｓＰｒｄＨタンパク質（アミノ酸配列：E1JLY7、UniProtKB、配列番号２３／塩基配列：HMPREF9269_1798、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２４）の遺伝子配列の両末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせの制限酵素配列を添加した後に合成を行い、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓＰｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを対象に制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保してＴ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＨ_Ｈ６ －ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを構築した。
さらにＬｓＰｒｄＨタンパク質（アミノ酸配列：E1JLY7、UniProtKB、配列番号２３／塩基配列：HMPREF9269_1798、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２４）の遺伝子配列の両末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせの制限酵素配列を添加した後に合成を行い、前記構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓＰｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを対象に制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保してＴ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＨ_Ｈ６ －ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターを構築した。
【0113】
４－４：ＬｓＰｒｄＢ発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）－Ｈ６）の製作
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＢ（以下ＬｓＰｒｄＢ）タンパク質（アミノ酸配列：E1JLY8とE1JLY9、UniProtKB、配列番号２１／塩基配列：HMPREF9269_1799とHMPREF9269_1800、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２２；配列のデータベース上でＬｓＰｒｄＢタンパク質内に存在する停止コドン（stop codon、ＵＡＧ）配列が、セレノシステインの導入のための配列ではなくタンパク質の発現停止コドンとして認識され、２つのタンパク質または塩基配列で表される。したがって、前記２つの塩基配列及び２つの塩基配列の間に存在する配列をすべてＬｓＰｒｄＢタンパク質の塩基配列と推定して発現ベクターを構築した）は、その遺伝子カルボキシル末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加した。また、ＰｒｄＢタンパク質の効率的な発現のために、セレノシステインが導入されるコドン（ＵＧＡ）が停止コドンとして認識されないようにシステインコドン（ＵＧＴ）に置換した後、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＰｒｄＢ（以下ＬｓＰｒｄＢ）タンパク質（アミノ酸配列：E1JLY8とE1JLY9、UniProtKB、配列番号２１／塩基配列：HMPREF9269_1799とHMPREF9269_1800、NCBI GeneBank AEBA01000066.1、配列番号２２；配列のデータベース上でＬｓＰｒｄＢタンパク質内に存在する停止コドン（stop codon、ＵＡＧ）配列が、セレノシステインの導入のための配列ではなくタンパク質の発現停止コドンとして認識され、２つのタンパク質または塩基配列で表される。したがって、前記２つの塩基配列及び２つの塩基配列の間に存在する配列をすべてＬｓＰｒｄＢタンパク質の塩基配列と推定して発現ベクターを構築した）は、その遺伝子カルボキシル末端にウエスタンブロット分析のための６×ヒスチジンタグ（Ｈ６）を追加した。また、ＰｒｄＢタンパク質の効率的な発現のために、セレノシステインが導入されるコドン（ＵＧＡ）が停止コドンとして認識されないようにシステインコドン（ＵＧＴ）に置換した後、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｄｅＩ、ＸｈｏＩの制限酵素配列を有する遺伝子を合成した。
【0114】
これを基に、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ベクターと前記合成された遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保してＴ４リガーゼ酵素反応を介してｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓＰｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ） － Ｈ６発現ベクターを構築した。
【0115】
４－５：ＬｓＰｒｄＨタンパク質導入を介したＬｓＰｒｄＡ自己切断の確認－ウエスタンブロット分析
前記のように構築されたＬｓＰｒｄＡタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）とＬｓＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）－Ｈ６）の組み合わせ、またはＬｓＰｒｄＡ及びＬｓＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＨ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）とＬｓＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）－Ｈ６）の同時発現を行った。前記２つの組み合わせの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌菌体を破砕した後、遠心分離を介して上澄み液を分離してウェスタンブロット分析を行った。
前記のように構築されたＬｓＰｒｄＡタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）とＬｓＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）－Ｈ６）の組み合わせ、またはＬｓＰｒｄＡ及びＬｓＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＨ_Ｈ６－ＬｓｐｒｄＡ－Ｈ６）とＬｓＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＬｓｐｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）－Ｈ６）の同時発現を行った。前記２つの組み合わせの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌菌体を破砕した後、遠心分離を介して上澄み液を分離してウェスタンブロット分析を行った。
【0116】
実験の結果、ＬｓＰｒｄＡタンパク質及びＬｓＰｒｄＢ（Ｕ１５１Ｃ）タンパク質を同時発現した場合、切断されていない形態のＬｓＰｒｄＡタンパク質（Ｐｒｏ－ＬｓＰｒｄＡタンパク質）とＬｓＰｒｄＢタンパク質が発現されており、同時にＬｓＰｒｄＡタンパク質の非特異的分解現象を確認した（図７、ｌａｎｅ １）。一方、ＬｓＰｒｄＨタンパク質と同時発現した場合、Ｐｒｏ－ＬｓＰｒｄＡタンパク質が減少するとともに追加的なタンパク質バンドが確認された結果から、ＬｓＰｒｄＡタンパク質の自己切断現象を確認することができた（図７、ｌａｎｅ ２）。 ＬｓＰｒｄＨタンパク質は、既に確保されたＰｒｄＨタンパク質と約５５％レベルのアミノ酸配列相同性を有するが、ゲノムの構造上にｐｒｄＡ遺伝子とｐｒｄＢ遺伝子の間に位置している遺伝子ＯＲＦにコードされるという同様の特性を有している。
【0117】
これを介して、比較的に低いレベルの配列相同性を有するが、ゲノム構造上、同じような位置に存在している２つのタンパク質（ＰｒｄＨ及びＬｓＰｒｄＨタンパク質）の機能が同一であることを確認しており、菌株の種類及び配列相同性とは関係なく、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの生産のために必要段階であるＰｒｄＡタンパク質の自己切断過程を誘導するＰｒｄＨタンパク質の汎用的な機能性を確認した。
【0118】
実施例５：Ｄ－プロリンレダクターゼオペロンが全体発現されたタンパク質の活性の評価－ＰｒｄＤＥＥ
２
タンパク質との同時発現
活性が確認されたＤ－プロリンレダクターゼを対象に、他のｐｒｄオペロン内タンパク質の影響を評価するために、さらに同時発現を行った。その最初の段階としてＰｒｄＤＥＥ２タンパク質の同時発現を行った。
活性が確認されたＤ－プロリンレダクターゼを対象に、他のｐｒｄオペロン内タンパク質の影響を評価するために、さらに同時発現を行った。その最初の段階としてＰｒｄＤＥＥ２タンパク質の同時発現を行った。
【0119】
５－１：ＰｒｄＡ、ＰｒｄＨ及びＰｒｄＤＥＥ２タンパク質を同時発現できるベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ＰｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）の製作
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＤタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY7、UniProtKB、配列番号７／塩基配列：CD630_32400、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号８）、ＰｒｄＥタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY2、UniProtKB、配列番号９／塩基配列：CD630_32390、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号１０）、及びＰｒｄＥ２タンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY3、UniProtKB、配列番号１１／塩基配列：CD630_32380、NCBI GeneBank AM180355. 1、配列番号１２）の各遺伝子をＰｒｄＡタンパク質と同時に発現できるように、各遺伝子の間にリボソーム結合配列（ribosome binding site）を添加した後、両末端にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせの制限酵素配列を追加して合成（ｐｒｄＡＤＥＥ２）を行った。具体的には、実施例１－４で既に構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターと合成されたｐｒｄＤＥＥ２遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２発現ベクターを構築した。
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＤタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY7、UniProtKB、配列番号７／塩基配列：CD630_32400、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号８）、ＰｒｄＥタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY2、UniProtKB、配列番号９／塩基配列：CD630_32390、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号１０）、及びＰｒｄＥ２タンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY3、UniProtKB、配列番号１１／塩基配列：CD630_32380、NCBI GeneBank AM180355. 1、配列番号１２）の各遺伝子をＰｒｄＡタンパク質と同時に発現できるように、各遺伝子の間にリボソーム結合配列（ribosome binding site）を添加した後、両末端にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせの制限酵素配列を追加して合成（ｐｒｄＡＤＥＥ２）を行った。具体的には、実施例１－４で既に構築されたｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_Ｈ６－ｐｒｄＡ－Ｈ６発現ベクターと合成されたｐｒｄＤＥＥ２遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２発現ベクターを構築した。
【0120】
５－２：ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢ、ＰｒｄＨ及びＰｒｄＤＥＥ２タンパク質の同時発現及びＤ－プロリンレダクターゼの活性増大の確認 －ＴＬＣ分析
ＰｒｄＡＤＥＥ２及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。
ＰｒｄＡＤＥＥ２及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。
【0121】
前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムを供給した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌菌体を最終的なＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後、１ｍＬの０．１Ｍ リン酸緩衝液 （ｐＨ８．０）に希釈した。
【0122】
次の段階で、希釈された各サンプル２００μｌを分注し、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）及びＤ－プロリン（最終濃度１０ｍＭ）を添加した後、６時間の反応の後にＴＬＣ分析を行った。
【0123】
その結果、ＰｒｄＡＨＢタンパク質の組み合わせに比べてＰｒｄＡＨＢＤＥＥ２組み合わせの場合でＴＬＣ上５－アミノ吉草酸のスポットサイズが相対的に大きいだけでなく、Ｄ－プロリンレダクターゼの初期反応速度も速いことを確認し（図６、ｌａｎｅ ３）、これらの結果を介してＰｒｄＤＥＥ２タンパク質がＤ－プロリンレダクターゼの活性増大を誘導するという事実を確認することができた。
【0124】
実施例６：追加のＰｒｄＣタンパク質の発現及びＤ－プロリンレダクターゼの活性増大の確認
次の段階でＰｒｄＣタンパク質の同時発現を行った。Ｄ－プロリンレダクターゼの場合ＮＡＤＨを消費して転換反応を進行することが知られており、ＰｒｄＣの場合、前記ＮＡＤＨを介した電子伝達に関与することが知られている。したがって、ＰｒｄＣタンパク質がＤ－プロリンレダクターゼの電子伝達に寄与することになるだろう。そこで、ＰｒｄＣタンパク質の効果を確認するために還元剤であるＤＴＴの有無による実験を行った。
次の段階でＰｒｄＣタンパク質の同時発現を行った。Ｄ－プロリンレダクターゼの場合ＮＡＤＨを消費して転換反応を進行することが知られており、ＰｒｄＣの場合、前記ＮＡＤＨを介した電子伝達に関与することが知られている。したがって、ＰｒｄＣタンパク質がＤ－プロリンレダクターゼの電子伝達に寄与することになるだろう。そこで、ＰｒｄＣタンパク質の効果を確認するために還元剤であるＤＴＴの有無による実験を行った。
【0125】
６－１：ＰｒｄＣタンパク質発現ベクター（ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ＳｅｌＡ-ＰｒｄＣ_ＳｅｌＢ）の製作
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＣタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZZ2、UniProtKB、配列番号１３／塩基配列：CD630_32470、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号１４）の遺伝子を既存のＤ－プロリンレダクターゼ発現システムに添加するために、ＳｅｌＡ及びＳｅｌＢタンパク質と同時に発現できるようにベクターを製作した。ｓｅｌＡとｐｒｄＣ遺伝子の間にリボソーム結合配列（ribosome binding site）を添加した後、両末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせの制限酵素配列を追加して合成（ＳｅｌＡ-ＰｒｄＣ）を行った。既に構築されたｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢ発現ベクターと合成されたｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢ発現ベクターを構築した。
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＣタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZZ2、UniProtKB、配列番号１３／塩基配列：CD630_32470、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号１４）の遺伝子を既存のＤ－プロリンレダクターゼ発現システムに添加するために、ＳｅｌＡ及びＳｅｌＢタンパク質と同時に発現できるようにベクターを製作した。ｓｅｌＡとｐｒｄＣ遺伝子の間にリボソーム結合配列（ribosome binding site）を添加した後、両末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせの制限酵素配列を追加して合成（ＳｅｌＡ-ＰｒｄＣ）を行った。既に構築されたｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢ発現ベクターと合成されたｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢ発現ベクターを構築した。
【0126】
６－２：ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢ、ＰｒｄＨ及びＰｒｄＣタンパク質の同時発現及びＤ－プロリンレダクターゼの活性増大の確認 - ＴＬＣ分析
ＰｒｄＡＤＥＥ２及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）とＰｒｄＢ及びＰｒｄＣタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。
ＰｒｄＡＤＥＥ２及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）とＰｒｄＢ及びＰｒｄＣタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。
【0127】
前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムを供給した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌菌体を最終的なＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後、１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ８．０）に希釈した。その対照群では、実施例５のＰｒｄＡＤＥＥ２及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡＤＥＥ２）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）が同時発現された大腸菌を用いた。次の段階で希釈された各サンプル２００μｌを分注し、Ｄ－プロリン（最終濃度１０ｍＭ）を添加した後、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）の有無に基づいて６時間反応の後にＴＬＣ分析を行った。
【0128】
反応の結果、ＤＴＴを添加した場合に比べて相対的に低い反応速度が確認されたが、ＰｒｄＣタンパク質が存在する場合にのみ、ＤＴＴが添加されていない条件にもかかわらずＤ－プロリンが転換され、５－アミノ吉草酸が生産されることを確認しした（図８、ｌａｎｅ ２）。これにより、ＰｒｄＣタンパク質がＤ－プロリンレダクターゼの電子伝達に寄与するという事実を確認し、追加の還元剤（ＤＴＴ）の添加なしに細胞内ＮＡＤＨなどの還元力を活用して転換反応が可能であることを確認した。
【0129】
実施例７：追加のｐｒｄＧタンパク質の発現及びＤ－プロリンレダクターゼの活性増大の確認
ＰｒｄＧタンパク質は膜タンパク質であると推定されるが、正確な機能については現在までに報告されていない。
ＰｒｄＧタンパク質は膜タンパク質であると推定されるが、正確な機能については現在までに報告されていない。
【0130】
７-１：ＰｒｄＧ及びＰｒｄＢタンパク質を同時に発現できるベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ）の製作
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＧタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY0、UniProtKB、配列番号１５／塩基配列：CD630_32360、NCBI GeneBank AM180355.1；配列のデータベース上ＰｒｄＧタンパク質と命名されてはいないがＣ. ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ ＰｒｄＧタンパク質の相同性に基づいてＰｒｄＧタンパク質と命名、配列番号１６）の塩基配列を対象に、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ組み合わせの制限酵素配列を有する遺伝子を合成し、合成されたＰｒｄＧ遺伝子と既に構築されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣベクターをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＧタンパク質とＰｒｄＢタンパク質を同時に発現できるベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ）を構築した。
Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のＰｒｄＧタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY0、UniProtKB、配列番号１５／塩基配列：CD630_32360、NCBI GeneBank AM180355.1；配列のデータベース上ＰｒｄＧタンパク質と命名されてはいないがＣ. ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ ＰｒｄＧタンパク質の相同性に基づいてＰｒｄＧタンパク質と命名、配列番号１６）の塩基配列を対象に、アミノ末端とカルボキシル末端にそれぞれＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ組み合わせの制限酵素配列を有する遺伝子を合成し、合成されたＰｒｄＧ遺伝子と既に構築されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣベクターをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を用いて特異的に切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してＰｒｄＧタンパク質とＰｒｄＢタンパク質を同時に発現できるベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ）を構築した。
【0131】
７－２：ＰｒｄＡ、ＰｒｄＢ、ＰｒｄＨ及びＰｒｄＣＧタンパク質の同時発現及びＤ－プロリンレダクターゼの活性増大の確認－ＴＬＣ分析
ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクターの組み合わせ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢ）、またはＰｒｄＡとＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢ及びＰｒｄＣＧタンパク質の同時発現ベクターの組み合わせ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢ ）の同時発現を行った。
ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクターの組み合わせ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢ）、またはＰｒｄＡとＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢ及びＰｒｄＣＧタンパク質の同時発現ベクターの組み合わせ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢ ）の同時発現を行った。
【0132】
前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムを供給した後、１６時間をさらに培養した。獲得された大腸菌菌体を最終的なＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後、１ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（phosphate buffer、ｐＨ８．０）に希釈した。
【0133】
ＰｒｄＧタンパク質が膜タンパク質であることを考慮して、ＰｒｄＡＨＢ組み合わせとＰｒｄＡＨＢＣＧ組み合わせを対象に、希釈されたそれぞれのサンプル２００μｌを分注し、Ｄ－プロリン（最終濃度１０ｍＭ）を添加した後、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）の有無、１％グルコースの有無に応じて前記前細胞の反応だけでなく、同じＯＤ条件で培養菌体の破砕液及びこれを遠心分離して得られた上澄み液に対する追加反応を同様に行っており、６時間反応後にＴＬＣ分析を行った。
【0134】
実験の結果、ＰｒｄＣタンパク質が追加されているＰｒｄＡＨＢＣＧ組み合わせの場合、ＤＴＴの有無に関係なく活性が示されることを再確認し（図９、ｗｏ、ｌａｎｅ ４～６）、特異的に菌体破砕液の上澄み液を対象にＤＴＴを添加して反応を進行した場合、ＰｒｄＡＨＢＣＧ組み合わせの場合でＰｒｄＡＨＢ組み合わせに比べて相対的に低いレベルの活性を確認した（図９、ＤＴＴ、ｌａｎｅ ６）。
【0135】
これにより、発現されたＤ－プロリンレダクターゼが遠心分離を介してかなりの部分除去されたことを確認でき、これは膜タンパク質の特性を有したＰｒｄＧタンパク質との結合のため、遠心分離時、沈殿後に削去されたことが分かる。また、ＤＴＴを基にした転換反応の場合、前細胞及び細胞破砕液からＰｒｄＡＨＢ及びＰｒｄＡＨＢＣＧ組み合わせの両方が同様のレベルの活性を示したが、ＤＴＴの添加なしにＮＡＤＨ供給を増大するために、１％グルコースのみ添加した場合、ＰｒｄＡＨＢＣＧ組み合わせの場合にのみ活性が確認された（図９、１％グルコース）。ＰｒｄＣタンパク質がＮＡＤＨ利用性と関係があるという実施例６の実験結果を基に、ＰｒｄＧタンパク質はＰｒｄＣタンパク質との連携により細胞内ＮＡＤＨの活用が容易なＤ－プロリンレダクターゼ複合体の形成を誘導することが分かった。つまり、ＤＴＴのような還元剤を使用する場合、媒介タンパク質の有無に関係なく、Ｄ－プロリン還元酵素に直接的に電子伝達が可能であるが、外部から添加された還元剤なしに細胞内ＮＡＤＨを使用する場合は、電子伝達を助けることができる媒介タンパク質（ＰｒｄＣタンパク質）が必要であり、効率的な電子伝達システムの構築のためにＰｒｄＧタンパク質がＤ－プロリンレダクターゼの集積度を高める機能を行うことにより、活性の改善効果を誘導すると考えられる。
【0136】
実施例８：補助タンパク質ＰｒｄＨを用いてＤ－プロリンから５－アミノ吉草酸を生産する菌株の製造
８－１：５－アミノ吉草酸の生産菌株の製作
微生物が糖源から５－アミノ吉草酸を生産するためには、Ｄ－プロリンレダクターゼの基質であるＤ－プロリンが供給されなければならない。しかし、大腸菌の場合、Ｄ－プロリンを生産する生合成経路がないためＬ－プロリンをＤ－プロリンに転換した後、これを活用する方向で代謝経路を設計した。具体的には、プロリン異性体形成能を有するプロリンラセマーゼ（proline racemase）が同時に存在しなければならない。したがって、本出願では、既公知技術であるプロリンラセマーゼの導入（非特許文献１５）を介して実験を行った。
８－１：５－アミノ吉草酸の生産菌株の製作
微生物が糖源から５－アミノ吉草酸を生産するためには、Ｄ－プロリンレダクターゼの基質であるＤ－プロリンが供給されなければならない。しかし、大腸菌の場合、Ｄ－プロリンを生産する生合成経路がないためＬ－プロリンをＤ－プロリンに転換した後、これを活用する方向で代謝経路を設計した。具体的には、プロリン異性体形成能を有するプロリンラセマーゼ（proline racemase）が同時に存在しなければならない。したがって、本出願では、既公知技術であるプロリンラセマーゼの導入（非特許文献１５）を介して実験を行った。
【0137】
このため、Ｐｅｐｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０）由来のプロリンラセマーゼタンパク質（アミノ酸配列：Q17ZY4、UniProtKB、配列番号１７／塩基配列：CD630_32370、NCBI GeneBank AM180355.1、配列番号１８）の遺伝子ｐｒｄＦを既存のＤ－プロリンレダクターゼ発現システムに添加するために、ＰｒｄＧタンパク質と同時に発現できるように各遺伝子の間にリボソーム結合配列（ribosome binding site）を添加した後、両末端にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ組み合わせの制限酵素配列を追加して合成（ｐｒｄＧＦ）を行った。
【0138】
既に構築されたｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ発現ベクターと合成されたＰｒｄＧＦ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩの組み合わせで切断した後、アガロースゲル分離を介して各遺伝子の切断を確保し、Ｔ４リガーゼ酵素反応を介してｐＣＤＦＤｕｅｔ_ＰｒｄＧＦ_ＰｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ発現ベクターを構築した。
【0139】
８－２：活性Ｄ－プロリンレダクターゼによる５－アミノ吉草酸の生産の確認 －ＬＣ／ＭＳ及びＴＬＣ分析
ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢＣＧ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクター）の組み合わせ、そしてＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢＣＧＦタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧＦ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクター）の組み合わせ発現を行った。前記２つの組み合わせの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１Ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ＭＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムと１％のグルコース（ＮＡＤＨ強化）を供給した後、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間さらに培養した。遠心分離を介して取得した培養液を対象に、ＬＣ／ＭＳ及びＴＬＣ分析を行った。
ＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢＣＧ（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクター）の組み合わせ、そしてＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢＣＧＦタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧＦ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクター）の組み合わせ発現を行った。前記２つの組み合わせの発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１Ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ＭＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムと１％のグルコース（ＮＡＤＨ強化）を供給した後、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間さらに培養した。遠心分離を介して取得した培養液を対象に、ＬＣ／ＭＳ及びＴＬＣ分析を行った。
【0140】
実験の結果、プロリンラセマーゼが存在する場合、約６７．７ｐｐｍの５－アミノ吉草酸を確認し（図１０、ｌａｎｅ ３）、プロリンラセマーゼが存在しない場合は、５－アミノ吉草酸が全く生産されないことを確認した（図１０、ｌａｎｅ １～２）。つまり、生産された５－アミノ吉草酸は添加された糖源から大腸菌内の代謝過程を経てＬ－プロリン生産された後、プロリンラセマーゼによってＤ－プロリン形態に転換され、最終的に導入された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼによって５－アミノ吉草酸が生産されたことが確認できる。
【0141】
８－３：培養培地内に添加されたＤ－プロリンから５－アミノ吉草酸の生産
糖源から直接発酵を介して５－アミノ吉草酸を生産する工程に加えて、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを含む微生物の培養中に外部から追加されたＤ－プロリンを５－アミノ吉草酸に転換させるための実験を行った。
糖源から直接発酵を介して５－アミノ吉草酸を生産する工程に加えて、活性型Ｄ－プロリンレダクターゼを含む微生物の培養中に外部から追加されたＤ－プロリンを５－アミノ吉草酸に転換させるための実験を行った。
【0142】
具体的には、培養培地内に添加されたＤ－プロリンから５－アミノ吉草酸の生合成が可能であるかを確認するための実験を行った。このため、既に構築されたＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢＣＧタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＧ_ｐｒｄＢ-ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ-ｐｒｄＣ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１Ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムと１％のグルコースを供給した後、５ｍＭ Ｄ－プロリンの有無に基づいて、３０℃ 、２００ｒｐｍで２４時間さらに培養した。遠心分離を介して取得した培養液を対象にＬＣ／ＭＳ分析を行った。
【0143】
分析の結果、Ｄ－プロリンを添加していない場合、５－アミノ吉草酸は確認されなかったが、５ｍＭのＤ－プロリンを添加した場合、ＨＰＬＣ（Shimadzu）分析を介して平均１９６．７ｐｐｍ（１．６８ｍＭ）の５－アミノ吉草酸の生産が確認された。
【0144】
実施例９：Ｄ－プロリンレダクターゼベースのＤ－プロリン類似基質の評価
構築された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの活性をさらに確認するために、プロリン以外の様々な基質を対象に転換反応を行った。本実施例では、Ｄ－プロリンレダクターゼの基質としては、Ｄ－プロリンと類似した構造を有するＤ－アゼチジン－２－カルボン酸（D-azetidine-2-carboxylic acid、Ｄ－Ａｚｅ）、Ｄ－プロリンのリング構造にヒドロキシル基（－ＯＨ）が追加された形態のシス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（cis-4-hydroxy-D-Proline）、トランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（trans-4-hydroxy-D-Proline）が用いられた。
構築された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの活性をさらに確認するために、プロリン以外の様々な基質を対象に転換反応を行った。本実施例では、Ｄ－プロリンレダクターゼの基質としては、Ｄ－プロリンと類似した構造を有するＤ－アゼチジン－２－カルボン酸（D-azetidine-2-carboxylic acid、Ｄ－Ａｚｅ）、Ｄ－プロリンのリング構造にヒドロキシル基（－ＯＨ）が追加された形態のシス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（cis-4-hydroxy-D-Proline）、トランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（trans-4-hydroxy-D-Proline）が用いられた。
【0145】
このため、既に構築されたＰｒｄＡ及びＰｒｄＨタンパク質発現ベクター（ｐＥＴＤｕｅｔ_ｐｒｄＨ_ｐｒｄＡ）とＰｒｄＢタンパク質発現ベクター（ｐＣＤＦＤｕｅｔ_ｐｒｄＢ－ＰｓｅｌＣ_ｓｅｌＣ及びｐＡＣＹＣＤｕｅｔ_ｓｅｌＡ_ｓｅｌＢベクターの組み合わせ）の同時発現を行った。前記３種類の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、抗生剤（アンピシリン０．１Ｍｇ／ｍｌ、スペクチノマイシン５０μg／ｍｌ、クロラムフェニコール３０μg／ｍｌ）が含まれているＬＢ培地で培養を行った（３７℃、２００ｒｐｍ）。そして目的タンパク質の過発現を誘導するために、ＯＤ６００値が０．５～０．６に達した時に０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、１０μＭ 亜セレン酸ナトリウムを供給した後、１６時間さらに培養した。獲得された大腸菌菌体を最終的なＯＤを５０に補正して遠心分離を行った後、１次洗浄後、１ｍＬの０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に希釈した。次の段階で希釈された各サンプル２００μｌを分注し、ＤＴＴ（最終濃度２５ｍＭ）と、様々な基質（最終濃度１０ｍＭ、図１１Ａ）を添加した後、６時間反応の後にＴＬＣ分析を行った。Ｄ－アゼチジン－２－カルボン酸はＤ－プロリンに比べて１つの炭素が不足している正方形リング形態の構造を有し、Ｄ－プロリンレダクターゼによって転換反応が進行される場合、γ－アミノ酪酸（γ-aminobutyric acid 、ＧＡＢＡ）が生成される。反応の結果、Ｄ－アゼチジン－２－カルボン酸の場合、Ｄ－プロリンに比べて比較的に低い反応速度を示すが、ＴＬＣ上で明確なＧＡＢＡの生産を確認することができた（図１１Ｂ、ｌａｎｅ ６）。
【0146】
シス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（cis-4-hydroxy-D-Proline）またはトランス－４－ヒドロキシ－Ｄ－プロリン（trans-4-hydroxy-D-Proline）は、転換反応が進行される場合は、５－アミノ－４－ヒドロキシペンタン酸（5-amino-4-hydroxypentanoic acid）が生成される。反応の結果、Ｄ－プロリンに比べて比較的に低い反応速度を示すが、ヒドロキシル基の異性体形状に関係なくＴＬＣ上での基質の減少に加え、新たに生成されたＴＬＣスポットを確認することができた（図１１Ｃ、ｌａｎｅ ５とｌａｎｅ ８）。
【0147】
これにより、発現された活性型Ｄ－プロリンレダクターゼの場合、既存に知られているＤ－プロリンだけでなく、リング構造の大きさが異なる基質だけでなく、追加の変形がなされた類似の基質に対しても転換反応が可能であることが確認できた。
【0148】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【0149】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】