特許 7162836 細胞評価用デバイス及び細胞評価用システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-21

(45)【発行日】2022-10-31

(54)【発明の名称】細胞評価用デバイス及び細胞評価用システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20221024BHJP

   G01N 27/04 20060101ALI20221024BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20221024BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221024BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 A

G01N27/04 Z

C12M1/00 A

C12Q1/02

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2018218390

(22)【出願日】2018-11-21

(65)【公開番号】P2020080697

(43)【公開日】2020-06-04

【審査請求日】2021-03-17

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】特許業務法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】藤山 陽一

(72)【発明者】

【氏名】三宅 力

(72)【発明者】

【氏名】田川 陽一

【審査官】進士 千尋

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１３４８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／００６５６６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５１５９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１９００４０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０３２６４６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】島津評論, 2010, Vol.67, No.1,2, pp.53-59

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

Ｇ０１Ｎ ２７／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１主面と第２主面とを有する多孔性膜と、
前記多孔性膜の第１主面において細胞が載置される、長手方向と短手方向を有する二次元の第１領域に面し、該第１領域の長手方向に沿って延びる第１流路部を有する第１流路と、
前記多孔性膜の第２主面において前記第１領域の裏側に位置する、長手方向と短手方向を有する二次元の第２領域に面し、該第２領域の長手方向に沿って延びる第２流路部を有する第２流路と、
前記多孔性膜の前記第１主面側に設けられた第１電極部材と、
前記多孔性膜の前記第２主面側に設けられた第２電極部材と、
前記細胞の電気抵抗を測定するための、第１電極及び第２電極からなる電圧測定用電極対と、第３電極及び第４電極からなる電流測定用電極対と
を備え、
前記第１電極及び前記第３電極は、前記第１電極部材の、前記第１流路部を臨む位置に、前記第１領域の長手方向に沿って配置され、
前記第２電極及び前記第４電極は、前記第２電極部材の、前記第２流路部を臨む位置に、前記第２領域の長手方向に沿って配置され、
前記第１電極と前記第２電極は、 前記第１領域及び前記第２領域を挟むように配置され、
前記第３電極と前記第４電極は、前記第１領域及び前記第２領域を挟むように配置されている、 細胞評価用デバイス。

【請求項2】

前記第１電極及び前記第３電極は、前記第１電極部材の、前記第１流路部を臨む位置に、前記第１領域を長手方向に覆うように配置され、
前記第２電極及び前記第４電極は、前記第２電極部材の、前記第２流路部を臨む位置に、前記第２領域を長手方向に覆うように配置される、請求項１に記載の細胞評価用デバイス。

【請求項3】

前記第１流路部の側から平面視して前記第１領域のうちの少なくとも一部を視認可能であるように前記第１電極及び前記第３電極が設けられている、請求項１又は２に記載の細胞評価用デバイス。

【請求項4】

前記第１電極は透明電極である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞評価用デバイス。

【請求項5】

前記第１領域が、前記多孔性膜の前記第１主面に固定された細胞載置領域規定部材が有する開口により規定され、
前記第１流路が、前記細胞載置領域規定部材の、前記多孔性膜と反対側に固定された第１流路部材が有する開口により規定され、
前記第２流路が、前記多孔性膜の、前記細胞載置領域規定部材と反対側に固定された第２流路部材が有する開口により規定され、
全体が１つのチップ状に形成されている、請求項１から４のいずれかに記載の細胞評価用デバイス。

【請求項6】

前記第２領域が、前記多孔性膜の前記第２主面に固定された部材が有する開口により規定される、請求項５に記載の細胞評価用デバイス。

【請求項7】

前記第１電極、前記第２電極、前記第３電極、及び前記第４電極が 前記細胞評価用デバイスの一方の側からコンタクト可能に形成されている、請求項１から６のいずれかに記載の細胞評価用デバイス。

【請求項8】

請求項１から７のいずれかに記載の細胞評価用デバイスと、
電圧 計と電流計を備え、前記電圧計が有する２つの端子が前記第１電極と前記第２電極に取り付けられ、前記電流計が有する２つの端子が前記第３電極と前記第４電極に取り付けられる、抵抗計と
を備えた細胞評価用システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞評価用デバイス、及びこれを備えた細胞評価用システムに関し、特に、細胞の培養時に細胞間に形成されるタイトジャンクションの状態を確認するために用いられるデバイスに関する。

【背景技術】

【0002】

生体内には多くの上皮細胞がタイトジャンクションを形成しており、この組織は吸収や代謝などの重要な機能に関わっている。このため、様々な機能解明のための実験前には細胞がタイトジャンクションを形成していることを確認する必要がある。腸管上皮細胞は、生体の腸管の内部表面を形成する細胞である。腸管上皮細胞は相互の細胞間にタイトジャンクションを形成することにより微生物や有害物質が生体に侵入することを防止している。こうした腸管上皮細胞を対象として、腸管の機能回復等を目的とする医薬品や食品の開発が行われている（例えば特許文献１）。

【0003】

こうした開発では、まず腸管上皮細胞を培養して細胞間にタイトジャンクションを形成させる。そして、タイトジャンクションが形成された腸管上皮細胞に対象物質を作用させて細胞の状態変化を観察する。こうした一連の処理には、従来、セルカルチャーインサートが広く用いられている。

【0004】

セルカルチャーインサートは、ウェルプレートのウェル内にインサートを吊り下げたものである。インサートの底面は多孔性膜で構成されている。セルカルチャーインサートでは、インサートの内部に第１培養液を、インサートとウェルプレートの間に第２培養液をそれぞれ導入し、該多孔性膜上で細胞を培養する。

【0005】

そして、インサートとウェルプレートの間、及びインサートの内部にそれぞれ、抵抗計の電極を差し込んで電気抵抗を測定する。こうして測定される電気抵抗には多孔性膜の抵抗と細胞の抵抗が含まれる。細胞の培養開始後、細胞間に形成されるタイトジャンクションの数が増えるにつれて細胞の電気抵抗が上昇し、測定される電気抵抗の値が高くなっていく。細胞間に十分なタイトジャンクションが形成されると、それ以上、電気抵抗が上昇しなくなるため、電気抵抗の測定値がほぼ一定になったことを確認することにより、細胞間に十分なタイトジャンクションが形成されたと判断する。細胞間にタイトジャンクションが形成されたことを確認した後、第２培養液に代えて対象物質を含んだ培養液を導入し、細胞の変化を観察する。

【0006】

近年、細胞評価用デバイスに電極を一体化したものが提案されている（例えば非特許文献１）。非特許文献１に記載の細胞評価用デバイスは、いずれも略Ｓ字状のチューブである第１流路部材と第２流路部材、及び多孔性膜を有している。第１流路部材と第２流路部材は上下に、平面視して交差するように隣接配置されている。第１流路部材の内部に形成された第１流路と第２流路部材の内部に形成された第２流路とが交差する位置に多孔性膜が配置されている。また、第１流路と第２流路は多孔性膜に形成された孔を通じて連通している。第１流路部材の流路入口端には第１電極が設けられており、第２流路部材の流路出口端には第２電極が設けられている。

【0007】

細胞評価用デバイスでは、第１流路に第１培養液、第２流路に第２培養液をそれぞれ流通させつつ多孔性膜上で細胞を培養する。また、2つの電極間の電気抵抗を測定して細胞間に形成されるタイトジャンクションの状態を確認する。細胞間に十分なタイトジャンクションの形成が確認された後、第１培養液に代えて対象物質を含んだ培養液を導入し、細胞の変化を観察する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開２００８－２１２００６号公報

【非特許文献】

【0009】

【文献】Odijk M. et al., "Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems", Lab on a chip, 15(3), 745-752 (2015)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

非特許文献１の細胞評価用デバイスでは、上述の通り、第１電極が第１流路部材の流路入口端に設けられ、第２電極が第２流路部材の流路出口端に設けられる。2つの電極間の電気抵抗には、細胞及び多孔性膜の電気抵抗だけでなく、第１流路及び第２流路の電気抵抗が含まれる。そのため、細胞間にタイトジャンクションが形成される前後の電気抵抗の差が相対的に小さくなり、細胞間にタイトジャンクションが形成されることにより生じる電気抵抗の上昇を確認することが難しいという問題があった。

【0011】

本発明が解決しようとする課題は、細胞の培養により該細胞間にタイトジャンクションを形成させる細胞評価用デバイスにおいて、該タイトジャンクションの形成により生じる電気抵抗の上昇を容易に確認できるようにすることである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞評価用デバイスは、
第１主面と第２主面とを有する多孔性膜と、
前記多孔性膜の第１主面において細胞が載置される第１領域に面する第１流路部を有する第１流路と、
前記多孔性膜の第２主面において前記第１領域の裏側に位置する第２領域に面する第２流路部を有する第２流路と、
前記第１領域及び前記第２領域を挟むように、前記第１流路部に設けられた第１電極及び前記第２流路部に設けられた第２電極と
を備える。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る細胞評価用デバイスでは、細胞が載置される第１領域と、該第１領域の裏面に位置する第２領域を挟むように、第１流路部に第１電極を設け、第２流路部に第２電極を設けた構成としており、第１領域に面した第１流路部及び第２領域に面した第２流路部以外の流路抵抗の影響が抑制される。従って、細胞の培養時に細胞間にタイトジャンクションの形成により生じる電気抵抗の上昇を容易に確認することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明に係る細胞評価用デバイスの一実施例を構成する各部材の構造を示す図。

【図2】本実施例の細胞評価用デバイスを備えた細胞評価システムの概略構成図。

【図3】本実施例の細胞評価用システムの内部に形成される細胞載置領域を説明する図。

【図4】従来の細胞評価システムにおける電気抵抗の変化を説明する図。

【図5】本実施例の細胞評価システムにおける電気抵抗の変化を説明する図。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明に係る細胞評価用デバイスの一実施例について、以下、図面を参照して説明する。本実施例の細胞評価用デバイスは、内部に設けた膜上で細胞を培養して細胞間にタイトジャンクションを形成させ、十分なタイトジャンクションが形成された後に菌を含む培地と作用させて細胞の変化を観察するために用いられる。本実施例の細胞評価用デバイスを嫌気チャンバー内に設置し、膜面に酸素を含む培地を流すことにより、例えば腸管上皮細胞に対する腸内細菌の作用を観察することができる。

【0016】

本実施例の細胞評価用デバイス１は８つの部材を重ね合わせることにより構成されている。８つの部材は、使用時に上方に位置するものから順に、フタ部材１０、上電極部材２０、上流路部材３０、上部フィルタ抑え部材４０、フィルタ部材５０、下部フィルタ抑え部材６０、下流路部材７０、下電極部材８０である（図１参照）。

【0017】

図１に各部材の構造を示す。
フタ部材１０は、板状部材に、上流路入口用孔１１１、上流路出口用孔１１２、下流路入口用孔１２１、及び下流路出口用孔１２２を形成したものである。これらの各孔にはシリコーンゴムチューブが取り付けられる。また、後述する各電極の端部が位置する箇所に、切り込み部１５が設けられている。フタ部材１０は、樹脂で作られていてもよい。当該樹脂の例はポリジメチルシロキサン（PDMS: polydimethylsiloxane）樹脂を含み、一例ではシルポット184（東レ・ダウコーニング株式会社製）である。

【0018】

上電極部材２０は、上流路入口用孔２１１、上流路出口用孔２１２、下流路入口用孔２２１、下流路出口用孔２２２、上部第１電極導通用孔２３１、上部第２電極導通用孔２３２、下部第１電極端子用孔２４１、及び下部第２電極端子用孔２４２が設けられている。上電極部材２０は、ガラス板であってよく、一例ではEagleXG（コーニング インコーポレイテッド社の登録商標）である。上電極部材２０の例示的な厚さは、0.5mmである。

【0019】

上電極部材２０の下面には、Ｔ字状の上部第１電極２５１が設けられている。上電極部材２０の上面の、前記切り込み部１５に対応する位置にも直線状の上部第１電極２５１が設けられている。上電極部材２０の上面と下面に設けられた上部第１電極２５１は、上部第１電極導通用孔２３１を介して電気的に接続されている。

【0020】

また、上電極部材２０の下面には、Ｔ字状の上部第１電極２５１のうちの頂部の直線部分と並行な直線部分と、該直線部分の一端から上部第１電極２５１を迂回するように上部第２電極導通用孔２３２に達する部分を有する上部第２電極２５２が設けられている。さらに、上電極部材２０の上面の、前記切り込み部１５に対応する位置にも直線状の上部第２電極２５２が設けられている。上電極部材２０の上面と下面に設けられた上部第２電極２５２は、上部第２電極導通用孔２３２を介して電気的に接続されている。

【0021】

上電極部材２０の上記各孔は、リソグラフィ及びサンドブラスト加工により形成されている。スパッタリングによりPt/Ti（白金でコーティングしたチタン）電極を、0.2μm/0.1μmの厚さで成膜することにより上部第１電極２５１及び上部第２電極２５２を形成した。上部第１電極２５１及び上部第２電極２５２のパターニング時にはメタルマスクを使用した。

【0022】

上流路部材３０には、下流路入口用孔３２１、下流路出口用孔３２２、下部第１電極端子用孔３４１、及び下部第２電極端子用孔３４２が設けられている。上流路部材３０には、例えばシリコーンゴムシートからなるものを用いることができる。また、その厚さは、例えば0.2mmである。上流路部材３０には、3つの直線を連結した形状を有し、一端が上流路入口用孔２１１の下方に、他端が上流路出口用孔２１２の下方となる位置する、上流路３７が形成されている。上流路３７は、例えば、幅3mm、長さ37mm（中央の直線部の流路の長さ14mm、その両端に接続された側部流路の長さ11.5mm）である。なお、中央の直線部の流路の長さは、該流路の中心線と側部流路の中心線の交点間の距離である。本実施例では、カッティングプロッタにより加工して上流路部材３０（及び後記の上部フィルタ抑え部材４０、下部フィルタ抑え部材６０、及び下流路部材７０）が作製されているが、レーザ加工等、別の加工方法を用いてもよい。

【0023】

上部フィルタ抑え部材４０には、下流路入口用孔４２１、下流路出口用孔４２２、下部第１電極端子用孔４４１、及び下部第２電極端子用孔４４２が設けられている。上部フィルタ抑え部材４０には、例えば、シリコーンゴムシートからなるものを用いることができる。また、その厚さは、例えば0.2mmである。上部フィルタ抑え部材４０には、上流路３７の一部（中央の直線部の流路）に対応する位置に、後述するフィルタ部材５０上の細胞載置領域１００を規定する開口４７が設けられている。開口４７の大きさは、例えば、幅2mm、長さ16mmである。

【0024】

フィルタ部材５０には、下流路入口用孔５２１、下流路出口用孔５２２、下部第１電極端子用孔５４１、及び下部第２電極端子用孔５４２が設けられている。フィルタ部材５０には、例えば、ポリカーボネートからなる膜（例示的な厚さ20μm）に貫通孔（例示的な大きさ5μmの）をランダムに形成したトラックエッチ膜（本発明における多孔性膜に相当）を用いることができる。また、トラックエッチ膜として、例えばipPORE（エア・ブラウン株式会社製）を用いることができる。

【0025】

下部フィルタ抑え部材６０は、上部フィルタ抑え部材４０と同一の材料からなり同一の構造を有する部材である。即ち、下流路入口用孔６２１、下流路出口用孔６２２、下部第１電極端子用孔６４１、及び下部第２電極端子用孔６４２が設けられている。下部フィルタ抑え部材６０にも、例えば、シリコーンゴムシートからなるものを用いることができる。また、その厚さは、例えば0.2mmである。また、後記の下流路７７の一部に対応する位置に、細胞に接触する流路部を規定する開口６７が設けられている。開口６７の大きさは、例えば、幅2mm、長さ16mmである。

【0026】

下流路部材７０には、下部第１電極端子用孔７４１及び下部第２電極端子用孔７４２が設けられている。下流路部材７０には、例えばシリコーンゴムシートからなるものを用いることができる。また、その厚さは、例えば0.2mmである。また、上流路３７と左右対称な形状の下流路７７が形成されている。下流路７７は、例えば、幅3mm、長さ37mm（中央の直線部の流路の長さ14mm、その両端に接続された側部流路の長さ11.5mm）である。下流路７７の一端は下流路入口用孔６２１の下方に、他端は下流路出口用孔６２２の下方に位置している。

【0027】

下電極部材８０の上面には、上部第１電極２５１（Ｔ字状の電極）と左右対称に下部第２電極８５２が設けられており、また上部第２電極２５２（上部第１電極２５１を迂回するように設けられた電極）と左右対称に下部第１電極８５１が設けられている。下部第１電極８５１及び下部第２電極８５２もPt/Ti電極であり、上部第１電極２５１及び上部第２電極２５２と同様の方法で形成されている。下電極部材８０は、ガラス板であってよく、一例ではEagleXGである。下電極部材８０の例示的な厚さは、0.5mmである。

【0028】

フィルタ部材５０と、上部フィルタ抑え部材４０及び下部フィルタ抑え部材６０は、プラズマ処理等により接着されている。両者を接着した後にフィルタ部材５０上に形成される細胞載置領域には、必要に応じて細胞接着用の足場がコーティングされる。これは、例えば上部フィルタ抑え部材４０の開口４７からコラーゲン溶液を滴下し乾燥させる等の方法により行うことができる。

【0029】

上電極部材２０と上流路部材３０、下電極部材８０と下流路部材７０は、それぞれ酸素プラズマ処理によって接合されている。また、上流路部材３０と上部フィルタ抑え部材４０、下部フィルタ抑え部材６０と下流路部材７０も、それぞれ酸素プラズマ処理によって接合されている。これにより本実施例の細胞評価用デバイス１が得られる。

【0030】

図２は、こうして作製された細胞評価用デバイス１、及び後述する抵抗計９０並びに制御・処理部９を含んだ細胞評価システムの概略構成図である。図２では細胞評価用デバイス１を平面図で示している。また。図２には、フタ部材１０の上流路入口用孔１１１、上流路出口用孔１１２、下流路入口用孔１２１、及び下流路出口用孔１２２のそれぞれに、シリコーンゴムチューブ１０１－１０４を取り付けた状態を示した。破線で付した部分は細胞評価用デバイス１の内部の構成である。また、図２では、同じ位置に複数の孔等が存在するものについて、最も上に位置する部材の符号のみを付している。

【0031】

細胞評価用デバイス１の内部の構造を分かりやすく示すために、図３に、細胞評価用デバイス１の一部（上流路部材３０、上部フィルタ抑え部材４０、フィルタ部材５０、下部フィルタ抑え部材６０、下流路部材７０）を重ねた状態の平面図を示す。図にハッチングで示すように、細胞評価用デバイス１のフィルタ部材５０の上面のうち、上部フィルタ抑え部材４０の開口４７が形成された位置に、細胞載置領域１００が形成される。図３でも、細胞評価用デバイス１の内部の構成は破線で示し、同じ位置に複数の孔等が存在するものについて、最も上に位置する部材の符号を付している。

【0032】

図２に示すとおり、上流路３７（本発明における第１流路に相当）のうち細胞載置領域１００に面する部分３７１（本発明における第１流路部に相当）の上方の一部を覆うように上部第１電極２５１と上部第２電極２５２が設けられている。また、下流路７７（本発明における第２流路に相当）のうち細胞載置領域１００の裏側の領域に面する部分７７１（本発明における第２流路部に相当）の一部を下方から覆うように下部第１電極８５１と下部第２電極８５２が設けられている。

【0033】

図２に示すように、本実施例の細胞評価システムは、細胞評価用デバイス１に加え、抵抗計９０、及び制御・処理部９を備えている。抵抗計９０は電流計９０１と電圧計９０２を備えており、それぞれが2つの端子を有している。即ち、抵抗計９０は四端子法で電気抵抗を測定する。

【0034】

制御・処理部９は、記憶部９１のほかに、機能ブロックとして培養制御部９２、及び判定部９３を備えている。制御・処理部９の実体はパーソナルコンピュータであり、入力部９４と表示部９５が接続されている。

【0035】

本実施例の細胞評価用システムを用いて細胞を培養し、該細胞間に形成されるタイトジャンクションの状態を評価する場合の手順を説明する。

【0036】

まず、抵抗計９０が有する電圧計９０２の端子を、上部第１電極２５１の、フタ部材１０の切り込み部１５から露出している部分と、下部第１電極８５１のうち下部第１電極端子用孔２４１から露出している部分に、それぞれ取り付ける。また、抵抗計９０が有する電流計９０１の端子を上部第２電極２５２のうちフタ部材１０の切り込み部１５から露出している部分と、下部第２電極８５２のうち下部第２電極端子用孔２４２から露出している部分に、それぞれ取り付ける。即ち、四端子法により、上部第２電極２５２と下部第２電極８５２の間の電気抵抗を測定するように各端子を取り付ける。なお、電流計９０１の端子と電圧９０２の端子を取り付ける電極の組は逆であってもよい。

【0037】

次に、細胞載置領域１００に細胞定着剤をコーティングし、その上に培養する細胞を載置する。

【0038】

使用者が、入力部９４を通じた所定の入力を行う等により細胞の培養開始を指示すると、培養制御部９２は、図示しない培養液供給部を動作させ、シリコーンゴムチューブ１０１から上流路入口用孔１１１、２１１を介して上流路３７に第１培養液を導入する。上流路３７を流通した第１培養液は、上流路出口用孔２１２、１１２を通ってシリコーンゴムチューブ１０２から流出する。また、シリコーンゴムチューブ１０３から下流路入口用孔１２１、２２１、３２１、４２１、５２１、６２１を介して下流路７７に第２培養液を導入する。下流路７７を流通した第２培養液は、下流路出口用孔６２２、５２２、４２２、３２２、２２２、１２２を通ってシリコーンゴムチューブ１０４から流出する。

【0039】

第１培養液と第２培養液の導入により、細胞載置領域１００上の細胞が培養され、該細胞間にタイトジャンクションが形成される。細胞の培養開始後、判定部９３は、上部第２電極２５２と下部第２電極８５２の間の電気抵抗を所定の時間間隔で測定し、測定値を記憶部９１に保存する。また、表示部９５に測定値の変化をグラフで表示する。判定部９３は、さらに、新たな測定値を取得する毎に、電気抵抗の変化の割合（所定時間あたりの電気抵抗値の上昇量）が予め決められた変化の割合を下回ったか否かを判定する。そして、電気抵抗の変化の割合が予め決められた変化の割合を下回ったと判定した時点で、細胞の培養が完了した（細胞間に十分なタイトジャンクションが形成された）ことを示すメッセージを表示部９５に表示する。

【0040】

上記メッセージが表示されると、使用者は、細胞評価用デバイス１の上方から細胞載置領域１００内の細胞の状態を確認する。そして、細胞間に十分なタイトジャンクションが形成されていると判断した場合には、入力部９４を通じた所定の入力により細胞の培養の終了を指示する。使用者が細胞間に十分なタイトジャンクションが形成されていないと判断した場合には、判定部９３による判定結果をリセットして細胞の培養を継続する。この場合、判定部９３は再び上述の動作を繰り返す。

【0041】

非特許文献１で提案されている従来の細胞評価用デバイスでは、フィルタの上側に第１流路を形成するチューブ状の第１流路部材を設け、多孔性膜の下側に第２流路を形成するチューブ状の第２流路部材を設けて、抵抗計が有する1対の電極を第１流路の流路入口端と第２流路の流路出口端に取り付けて電気抵抗を測定していた。そのため、2つの電極間の電気抵抗には、細胞及び多孔性膜の電気抵抗だけでなく、第１流路及び第２流路の電気抵抗や抵抗計の配線の電気抵抗が含まれ（図４参照）、細胞間にタイトジャンクションが形成される前後の電気抵抗の差が相対的に小さくなり、細胞間にタイトジャンクションが形成されることにより生じる電気抵抗の上昇を確認することが難しく、細胞間に十分なタイトジャンクションが形成された時点（t₀）を把握することができないという問題が生じていた。

【0042】

本実施例の細胞評価用デバイス１では、電圧測定用の１対の電極２５２、８５２が、上流路３７のうちの細胞載置領域に面した部分である第１流路部３７１の外縁と下流路７７のうちの細胞載置領域１００に面した部分である第２流路部７７１の外縁に配置される。また、各電極２５１、２５２、８５１、８５２が、細胞載置領域１００の長手方向（上流路３７及び下流路７７が延びる方向）の長さと同一あるいはそれ以上の長さを有している。そのため、フィルタ部材５０の細胞載置領域１００を斜めに通過する電流パスが形成され、また該細胞載置領域１００を挟んで第１流路部３７１と第２流路部７７１の上下にかかる電圧が測定される。このような構成を取ることにより、細胞載置領域１００以外の流路の抵抗成分の影響が除去される。セルカルチャーインサートのようにウェル内に培養液を満たした状態で電気抵抗を測定する場合とは異なり、本実施例のように、幅3mm程度、深さ0.2mm程度の流路を用いて微量の被検細胞を観察する場合には、流路内の電気抵抗が大きくなり、市販の装置では電気抵抗が大きすぎて計測不可能な場合があった。これに対し、本実施例の構成を採ることにより、幅3mm程度、深さ0.2mm程度の流路であっても十分に電気抵抗の変化を確認することができる。このように、測定される電気抵抗には、実質的にフィルタ部材５０及び該フィルタ部材５０の細胞載置領域１００内の細胞の電気抵抗のみが含まれる（図５参照）ため、細胞間にタイトジャンクションが形成されることにより生じる電気抵抗の上昇を容易に確認することができる。

【0043】

また、本実施例の細胞評価用デバイス１は2対の電極（上部第１電極２５１と下部第１電極８５１の対、及び上部第２電極２５２と下部第２電極８５２の対）を備えており、四端子法により電気抵抗を測定することができる。従って、この細胞評価用デバイス１を備えた細胞評価用システムでは、抵抗計の配線の電気抵抗の影響も抑制され、細胞間にタイトジャンクションが形成されることにより生じる電気抵抗の上昇を容易に確認することができる。

【0044】

本実施例の細胞評価用デバイス１では、上流路３７と下流路７７に培地（10%FSB DMEM）を満たした状態での電気抵抗の例示的な測定値は2500Ω程度であり、この培地を用いたCaco2細胞（ヒト結腸癌由来の細胞）の培養時にCaco2細胞間にタイトジャンクションが形成されることによる電気抵抗値の上昇を確認することができた。一方、従来同様に流路端に電極を設けた構成の細胞評価用デバイスでは、培地を満たした時点での抵抗値が高すぎて、Caco2細胞間にタイトジャンクションが形成されることによる電気抵抗値の上昇を確認することができなかった。

【0045】

本実施例の細胞評価用デバイス１では、上電極部材２０に上部第１電極導通用孔２３１と上部第２電極導通用孔２３２を形成し、上部第１電極２５１と上部第２電極２５２の一部を細胞評価用デバイス１の上面側に露出している。また、各部材に下部第１電極端子用孔（２４１等）及び下部第２電極端子用孔（２４２等）を設け、下部第１電極８５１及び下部第２電極８５２の一部を細胞評価用デバイス１の上面側に露出している。そのため、これらのいずれの電極についても、細胞評価用デバイス１の上面側からコンタクトを取ることができる。

【0046】

また、本実施例の細胞評価用デバイス１では、上部第１電極２５１と上部第２電極２５２を、これらが細胞載置領域１００の全体を覆わないような大きさ及び位置としている。つまり、第１流路部３７１の側から平面視して、細胞載置領域１００のうちの少なくとも一部を視認可能であるように２つの電極２５１、２５２が設けられている。そのため、細胞の培養中に、電気抵抗値の測定と並行して、視覚的に細胞の状態を確認することができる。

【0047】

上記実施例は一例であって、本発明の趣旨に沿って適宜に変更することができる。
本実施例の細胞評価システムは、腸管上皮細胞に限らず、タイトジャンクション形成が必要である細胞の評価に広く用いることができる。また、上記実施例ではPt/Ti電極を使用したが、ITOなどの透明電極を用いることにより細胞載置領域１００内の細胞を確認できるように構成することができる。

【0048】

以上、図面を参照して本発明における種々の実施形態を詳細に説明したが、最後に、本発明の種々の態様について説明する。なお、以降に付した符号は理解を容易にするためのものであって、本発明の構成を限定するものではない。

【0049】

本発明の第１態様の細胞評価用デバイス（１）は、
第１主面と第２主面とを有する多孔性膜（５０）と、
前記多孔性膜（５０）の第１主面において細胞が載置される第１領域（１００）に面する第１流路部（３７１）を有する第１流路（３３）と、
前記多孔性膜（５０）の第２主面において前記第１領域（１００）の裏側の領域に位置する第２領域に面する第２流路部（７７１）を有する第２流路（７７）と、
前記第１領域（１００）及び前記第２領域を挟むように、前記第１流路部（３７１）に設けられた第１電極（２５２）及び前記第２流路部（７７１）に設けられた第２電極（８５２）と
を備える。

【0050】

第１態様の細胞評価用デバイスでは、第１電極が第１流路部に、第２電極が第２流路部に、細胞が載置される第１領域とその裏側に位置する第２領域を挟むように設けられており、これら各部の電気抵抗のみが測定されるため、細胞の培養時に細胞間にタイトジャンクションの形成により生じる電気抵抗の上昇を容易に確認することができる。

【0051】

また、本発明の第２態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第１態様の細胞評価用デバイス（１）において、
前記第１流路部（３７１）と前記第２流路部（７７１）は、前記第１領域に沿って共通する方向に設けられており、
前記共通する方向において、前記第１電極（２５２）の長さが前記第１領域（１００）の長さの半分以上であり、前記第２電極（８５２）の長さが前記第２領域の長さの半分以上である。

【0052】

細胞間にタイトジャンクションが形成される速度は、必ずしも第１領域（細胞載置領域）の全体にわたって一様であるとは限らない。例えば、細胞間のタイトジャンクションの形成速度が速い位置に局所的に電極が配置されていると、電極から遠い位置では未だ細胞間に十分なタイトジャンクションが形成されていないにも関わらず電気抵抗が大きくなる場合がある。第２態様の細胞評価用デバイスを用いることにより、タイトジャンクションの形成速度が一様でない場合にも、細胞載置領域全体におけるタイトジャンクションの形成状況に応じた電気抵抗の変化をより正確に確認することができる。なお、第１領域は、上記実施例のような直線状に限定されず、屈曲していてもよい。そして、第１流路部と第２流路部も同様に、上記実施例のような直線状に限定されず、屈曲していても良い。また、第１流路部と第２流路部は屈曲している場合に、その曲率が均一である必要もない。上記実施例では、第１流路部及び第２流路部は、それぞれ、第１流路と第２流路の幅方向全体に広がった形状を有しているが、これらは必須の要件ではなく、第１流路部（又は第２流路部）は、第１流路（又は第２流路）の幅方向の一部に設けられていても良い。

【0053】

また、本発明の第３態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第１態様又は第２態様の細胞評価用デバイス（１）において、
前記第１流路部（３７１）の側から平面視して前記第１領域（１００）のうちの少なくとも一部を視認可能であるように前記第１電極（２５２）が設けられたものである。

【0054】

第３態様の細胞評価用デバイスを用いることにより、細胞載置領域上で細胞間にタイトジャンクションが形成される状況を視覚的に確認することができる。これは、例えば、第１流路方向と直交する方向において第１領域の長さ（幅）よりも短い形状の電極を用いることによっても具現化することができる。さらには、第１流路部材の外側から平面視して第１領域の少なくとも一部を覆わないような位置に第１電極を配置することによっても具現化することができる。

【0055】

また、本発明の第４態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第１態様から第３態様の細胞評価用デバイス（１）のいずれかにおいて、
前記第１電極（２５２）を透明電極としたものである。

【0056】

第４態様の細胞評価用デバイスでは、不透明の電極を用いる場合に比べ、電極配置の自由度が高くなる。

【0057】

また、本発明の第５態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第１態様から第４態様の細胞評価用デバイス（１）のいずれかにおいて、さらに、
前記第１領域（１００）及び前記第２領域を挟むように、前記第１流路部（３７１）に設けられた第３電極（２５１）及び前記第２流路部（７７１）に設けられた第４電極（８５１）と
を備えたものである。

【0058】

第５態様の細胞評価用デバイスは、2対の電極（第１電極と第２電極からなる対と、第３電極と第４電極からなる対）を、電流計接続用電極と電圧計接続用電極として用いる、いわゆる四端子法により電気抵抗を測定する構成のものである。従来の細胞評価用デバイスは、いわゆる二端子法により電気抵抗を測定するものであり、測定により得られる電気抵抗には配線の抵抗が含まれる。そのため、配線抵抗によって細胞にタイトジャンクションが形成される前後の電気抵抗の差が相対的に小さくなっていた。一方、第５態様の細胞評価用デバイスでは四端子法で電気抵抗が測定されるため、その測定値に対する配線抵抗の影響が抑制される。従って、細胞の培養時に細胞間にタイトジャンクションの形成により生じる電気抵抗の上昇をより一層、容易に確認することができる。

【0059】

また、本発明の第６態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第１態様から第５態様の細胞評価用デバイス（１）のいずれかにおいて、
前記第１領域（１００）が、前記多孔性膜（５０）の前記第１主面に固定された細胞載置領域規定部材（４０）が有する開口（４７）により規定され、
前記第１流路（３７）が、前記細胞載置領域規定部材（４０）の、前記多孔性膜（５０）と反対側に固定された第１流路部材（３０）が有する開口（３７）により規定され、
前記第１電極（２５２）が、前記第１流路部材（３０）の、前記多孔性膜（５０）と反対側に固定された第１電極部材（２０）の前記第１領域（１００）を臨む位置に形成され、
前記第２流路（７７）が、前記多孔性膜（５０）の、前記細胞載置領域規定部材（４０）と反対側に固定された第２流路部材（７０）が有する開口（７７）により規定され、
前記第２電極（８５２）が、前記第２流路部材（７０）の、前記多孔性膜（５０）と反対側に固定された第２電極部材（８０）の前記第２領域を臨む位置に形成され、
全体が１つのチップ状に形成されたものである。

【0060】

第６態様の細胞評価用デバイスは、多孔性膜の一方の側に細胞載置領域規定部材、第１流路部材、及び第１電極部材を配置し、該多孔性膜の他方の側に第２流路部材及び第２電極部材を配置することにより構成されており、全体が１つのチップ状に形成される。そのため、各部を個別に備えた構成のものに比べて取り扱いが容易である。

【0061】

また、本発明の第７態様の細胞評価用デバイス（１）は、上記第６態様の細胞評価用デバイス（１）において、
前記第２領域が、前記多孔性膜（５０）の前記第２主面に固定された部材（６０）が有する開口（６７）により規定されたものである。

【0062】

第７態様の細胞評価用デバイスでは、第２流路が多孔性膜の表面、該多孔性膜に隣接して設けられた第２流路部材の開口によって第２流路が規定されるため、少なくとも第２流路全体を覆うような大きさの多孔性膜を用いる必要がある。一方、第７態様の細胞評価用デバイスでは、第２流路が上記部材と、該部材に隣接して設けられた第２流路部材の開口によって第２流路が規定されるため、第１領域のみを覆う大きさの多孔性膜を使用することが可能になる。第２流路部材には、例えば上記実施例のようにシリコーンゴムシートからなるものが用いられる。第６態様の細胞評価用デバイスにおいて上記部材（６０）を有しない場合には、シリコーンゴムシートと多孔性膜を貼り合わせて第２流路を規定することになる。シリコーンゴムシート同士の貼り合わせは容易であるが、多孔質膜とシリコーンゴムシートの貼り合わせは難易度が高い。上記第７態様の細胞評価用デバイスの構成を採ることにより精確に第２流路を規定して必要な機能を容易に実現することができる。

【0063】

また、本発明の第８態様の細胞評価用デバイス（１）では、
前記第１電極（２５２）と前記第２電極（８５２）の両方が、前記細胞評価用デバイス（１）の一方の側からコンタクト可能に形成されている。

【0064】

第８態様の細胞評価用デバイスでは、第１電極及び第２電極が細胞評価用デバイスの一方の側からコンタクト可能に形成されているため、抵抗計の端子の接続が容易である。

【0065】

さらに、本発明の第９態様は、
上記第５態様の細胞評価用デバイス（１）と、
電流計（９０１）と電圧計（９０２）を備え、前記電流計（９０１）が有する２つの端子が前記第１電極（２５２）と前記第２電極（８５２）に取り付けられ、前記電圧計（９０２）が有する２つの端子が前記第３電極（２５１）と前記第４電極（８５１）に取り付けられる、抵抗計（９０）と
を備えた細胞評価用システムである。

【0066】

上記第９態様の細胞評価用システムでは、第１領域で培養される細胞等の電気抵抗が四端子法で測定されるため、その測定値に与える配線抵抗の影響が抑制される。従って、第９態様の細胞評価用システムでは、測定値の変化から、細胞の培養時に細胞間にタイトジャンクションの形成により生じる電気抵抗の上昇を容易に確認することができる。

【符号の説明】

【0067】

１…細胞評価用デバイス
１００…細胞載置領域
１０…フタ部材
１５…切り込み部
２０…上電極部材
２５１…上部第１電極
２５２…上部第２電極
３０…上流路部材
３７…上流路
３７１…上流路のうち細胞載置領域に面する部分（第１流路部）
４０…上部フィルタ抑え部材
４７…開口
５０…フィルタ部材
６０…下部フィルタ抑え部材
６７…開口
７０…下流路部材
７７…下流路
７７１…下流路のうち細胞載置領域の裏側の領域に面する部分（第２流路部）
８０…下電極部材
８５１…下部第１電極
８５２…下部第２電極
９０…抵抗計
９…制御・処理部
９１…記憶部
９２…培養制御部
９３…判定部
９４…入力部
９５…表示部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】