(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-25
(45)【発行日】2022-11-02
(54)【発明の名称】ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221026BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221026BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221026BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221026BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221026BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221026BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221026BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221026BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221026BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20221026BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221026BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221026BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20221026BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221026BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K16/46 ZNA
C07K16/28
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K47/65
A61P35/00
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021527066
(86)(22)【出願日】2019-10-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 CN2019112467
(87)【国際公開番号】W WO2020103629
(87)【国際公開日】2020-05-28
【審査請求日】2021-05-17
(31)【優先権主張番号】201811376950.9
(32)【優先日】2018-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】510277073
【氏名又は名称】三生国健薬業（上海）股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮＳＨＩＮＥ ＧＵＯＪＩＡＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ ＩＣＡＬ（ＳＨＡＮＧＨＡＩ）ＣＯ．，ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110002516
【氏名又は名称】特許業務法人白坂
(72)【発明者】
【氏名】朱禎平
(72)【発明者】
【氏名】黄浩旻
(72)【発明者】
【氏名】顧昌玲
【審査官】小川 知宏
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１３６５６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０９０９５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１３７５７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０５２７１３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ０７Ｋ １６／４６
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４７／６５
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体であって、免疫グロブリン抗体ＩｇＧ、および２つの同じ一本鎖可変領域断片ｓｃＦｖを含み、
前記一本鎖可変領域断片ｓｃＦｖは、それぞれ可変領域ＶＨおよび可変領域ＶＬを含み、
前記可変領域ＶＨと前記可変領域ＶＬは、ペプチドリンカーＬ１によって連結され、
前記一本鎖可変領域断片ｓｃＦｖは、それぞれペプチドリンカーＬ２を介して前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧにタンデムに連結されており、
前記可変領域ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号１３で表され、前記可変領域ＶＬのアミノ酸配列は、配列番号１４で表され、
前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、そのうち重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６で表されることを特徴とする、二重特異性抗体。
【請求項2】
前記ペプチドリンカーＬ１のアミノ酸配列は、配列番号１７で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記ペプチドリンカーＬ２のアミノ酸配列は、配列番号１８で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖは、ＶＬ-Ｌ１-ＶＨの分子構成を有し、各一本鎖可変断片ｓｃＦｖのＮ末端は、ペプチドリンカーＬ２を介して前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖のＣ末端に連結される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号１９で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２０で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２１で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
請求項１～６の何れか１項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項8】
前記ヌクレオチド分子は、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２２で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２３で表される、請求項７に記載のヌクレオチド分子。
【請求項9】
前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖは、ＶＨ-Ｌ１-ＶＬの分子構成を有し、各一本鎖可変断片ｓｃＦｖのＣ末端は、ペプチドリンカーＬ２を介して前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖のＮ末端に連結される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項10】
前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号２４で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項11】
前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２１で表される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
請求項９～１１の何れか１項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項13】
前記ヌクレオチド分子は、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２６で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２３で表される、請求項１２に記載のヌクレオチド分子。
【請求項14】
請求項７、８、１２又は１３の何れか１項に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項15】
前記発現ベクターは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲおよびｐＴＴ５からなる群より選ばれる任意の１種である、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項16】
請求項１４に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
【請求項17】
前記ホスト細胞は、ＣＨＯ細胞および２９３Ｅ細胞からなる群より選ばれる任意の１種である、請求項１６に記載のホスト細胞。
【請求項18】
請求項１～６および請求項９～１１の何れか１項に記載のＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を製造する方法であって、発現条件下で請求項１６～１７の何れか１項に記載のホスト細胞を培養することにより、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップａと、
前記ステップａで発現した二重特異性抗体を分離、精製するステップｂと
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項19】
請求項１～６および請求項９～１１の何れか１項に記載のＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上と
を含んでなることを特徴とする、組成物。
【請求項20】
請求項１～６および請求項９～１１の何れか１項に記載のＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合する二重特異性抗体又は請求項１９に記載の薬物組成物の、癌または腫瘍を治療するための薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍治療および生物工学の分野に属し、具体的には、ＨＥＲ２とＰＤ１を認識しうる二重特異性抗体、その製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）は、受容体型チロシンキナーゼ活性を有し、ヒト上皮成長因子受容体ファミリーメンバーの１つであり、成人の幾つかの正常組織に限って低レベルで発現する。一方、研究によりに複数の腫瘍でＨＥＲ２が過剰発現することが発見され、例えば約３０％の乳がん患者および１６％の胃がん患者においてＨＥＲ２が過剰発現する現象があり、腫瘍におけるＨＥＲ２の過剰発現は、腫瘍血管の新生や腫瘍成長を著しく加速化し、腫瘍の浸潤能や転移能を亢進させ、不良予後の可能性を示す重要な指標である。そのため、早くから１９９８年にＨＥＲ２を標的とした最初のモノクローナル抗体薬品としてハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社製）がＦＤＡより製造・販売許可が認められ、ＨＥＲ２過剰発現が確認された乳がんおよび胃がんの治療に用いられている。
【0003】
ヒトプログラム細胞死受容体－１（以下、「ＰＤ－１」とも称する）は、２８８個のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質であり、細胞外領域がリガンド結合用のＩｇ可変型（Ｖ－型）ドメインであり、細胞内領域がシグナル伝達分子結合用の細胞質尾部である。ＰＤ－１細胞質尾部には、チロシン残基に基づくシグナル伝達モチーフであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ）及びＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ）を含む。ＰＤ－１は、活性化Ｔリンパ球の表面で発現され、リガンドであるプログラム細胞死受容体－リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ １、以下では「ＰＤ－Ｌ１」とも称する）及びプログラム細胞死受容体－リガンド２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ ２、以下では「ＰＤ－Ｌ２」とも称する）に結合することで、Ｔリンパ球の活性及び関連体内細胞の免疫反応を抑制することができる。大量の研究により、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用が体内免疫系の均衡維持に必須であり、並びにＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞が免疫監視から逃れるための主な作用機序であることが解明されている。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路を遮断することは、免疫系を活性化させ、Ｔ細胞の免疫傷害機能を復活するのに有用であると考えられる。
【0004】
ペムブロリズマブ（商品名：キイトルーダ）は、ＰＤ１を認識対象とするヒト化モノクローナル抗体であり、２０１４年９月にＦＤＡよりメラノーマ（通常、「悪性黒色腫」とも称される）に対する治療薬として初の製造・販売が承認され、それから２０１８にまで認可された適応症としてはメラノーマ、非小細胞肺がん、ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、胃がん、及びＭＳＩ－ＨやｄＭＭＲを有する固形腫瘍を含む。ニボルマブ（商品名：オプジーボ）は、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社によって開発されたＰＤ１モノクローナル抗体であり、２０１４年１２月にＦＤＡより製造・販売が承認され、適応症としてはメラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞がん、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、結直腸がん及び肝細胞がんを含む。三生国健薬業会社が自ら開発した抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、新規な抗ＰＤ１ヒト化モノクローナル抗体である。体内や体外における生体活性及び抗腫瘍活性の研究から、その生体内における抗ＰＤ１活性が陽性対照薬であるニボルマブとペムブロリズマブに比べて両対照薬の中位にあり、一部の側面において陽性対照薬であるニボルマブを上回る効能を示すことが確認できた。
【0005】
二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下では「ＢｓＡｂ」とも称する）とは、２つ以上の異なる抗原エピトープを同時に認識しうる抗体分子を指す。従来のモノクローナル抗体に比べて、二重特異性抗体は独特の作用を示し、例えば１）二重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗原分子又は同一抗原分子の異なるエピトープを同時に認識して結合し、併用薬物療法にしてもなかなか見られない効果を奏することができ、２）細胞間相互作用に寄与することにより、二重特異性抗体は効果細胞と標的細胞における２つの抗原にそれぞれ結合でき、効果細胞と標的細胞の間の架け橋として細胞間相互作用を促進して腫瘍細胞に対する免疫細胞の傷害能を高めることができる。したがって、二重特異性抗体は、従来のモノクローナル抗体には見られない独特な優勢がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる新規な二重特異性抗体を提供し、さらに、該二重特異性抗体の製造方法及び用途を提供する。より詳しくは、本発明は、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体、前記二重特異性抗体をコードするヌクレオチド分子、前記ヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクター、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供し、さらに、前記二重特異性抗体の製造方法、前記二重特異性抗体を含んでなる薬物組成物、前記二重特異性抗体の薬物製造における用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記目的を達成するため、本発明は、以下の技術案により構成される。
【0008】
本発明の１つの側面において、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を提供し、本発明の二重特異性抗体は、免疫グロブリン抗体ＩｇＧおよび２つの同じ一本鎖可変領域断片（以下、「ｓｃＦｖ」とも称する）を含み、各ｓｃＦｖは可変領域ＶＨおよび可変領域ＶＬを含み、ＶＨとＶＬはペプチドリンカーＬ１によって連結され、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーＬ２を介して免疫グロブリン抗体ＩｇＧにタンデムに連結される。
【0009】
本発明に係る「二重特異性抗体」とは、２つの異なる抗原結合サイトを備え、ＨＥＲ２及びＰＤ１に同時に結合しうる二重特異性抗体を指すものであり、２つの一本鎖可変断片ｓｃＦｖ及びそれに接合される免疫グロブリン抗体ＩｇＧを含み、各ｓｃＦｖはペプチドリンカーＬ２を介して免疫グロブリン抗体ＩｇＧの各重鎖に連結されて二重特異性抗体の重鎖融合タンパク質を形成し、そのうち各ｓｃＦｖは、可変領域ＶＨおよび可変領域ＶＬを含み、ＶＨとＶＬがペプチドリンカーＬ１を介して連結される。
【0010】
本発明に係る「一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）」とは、免疫グロブリンの重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬとで構成される融合タンパク質を指し、ＶＨとＶＬがペプチドリンカーによって連結され、そのうち前記融合タンパク質は、完全な免疫グロブリンと同様の抗原特異性を有する。
【0011】
本発明に係る「免疫グロブリン抗体ＩｇＧ」は、４つのペプチド鎖で構成される分子量約１５０ｋＤａの分子であり、２つの分子量が約５０ｋＤａであるγ重鎖と２つの分子量が約２５ｋＤａの軽鎖によって四量体を形成し、そのうち２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結され、かつそれぞれ１つの軽鎖に連結される。前記四量体は、２つの同じ構成部分で構成され、両者が分岐形または略Ｙ字形を形成し、分岐の各末端にはそれぞれ１つの同じ抗原結合サイトを有する。ＩｇＧ抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸配列における小さな差異によって例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧといった４つのサブタイプに分類される。
【0012】
本発明の一好適な実施形態において、前記ＶＨは、相補性決定領域ＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３を含み、そのうちＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１で表され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２で表され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３で表される。
【0013】
前記ＶＬは、相補性決定領域ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３を含み、そのうちＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４で表され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５で表され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、で表される配列番号６で表される。
【0014】
前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖は、相補性決定領域ＨＣＤＲ４～ＨＣＤＲ６を含み、そのうちＨＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号７で表され、ＨＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号８で表され、ＨＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号９で表される。
【0015】
前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧの軽鎖は、相補性決定領域ＬＣＤＲ４～ＬＣＤＲ６を含み、そのうちＬＣＤＲ４のアミノ酸配列は配列番号１０で表され、ＬＣＤＲ５のアミノ酸配列は配列番号１１で表され、ＬＣＤＲ６のアミノ酸配列は配列番号１２で表される。
【0016】
通常、抗体の結合領域が１つの軽鎖可変領域および１つの重鎖可変領域を含み、各可変領域に３つのＣＤＲドメインを含むことは当分野の技術者にとって常識でもある。抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲドメインはそれぞれＨＣＤＲ及びＬＣＤＲと称されており、抗体と抗原の結合サイトは、一般に６つのＣＤＲで構成され且つ重鎖および軽鎖可変領域それぞれに由来するＣＤＲの集合である。
【0017】
本発明の一好適な実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨのアミノ酸配列は配列番号１３で表される、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１４で表される。前記免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６で表される。
【0018】
本発明の一好適な実施形態において、前記ペプチドリンカーＬ１のアミノ酸配列は、配列番号１７で表される。
【0019】
本発明の一好適な実施形態において、前記ペプチドリンカーＬ２のアミノ酸配列は、配列番号１８で表される。
【0020】
本発明の一好適な実施形態において、前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖ１の分子構成がＶＬ－Ｌ１－ＶＨであり、各ｓｃＦｖのＮ末端は、ペプチドリンカーＬ２を介して免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖のＣ末端に連結される。
【0021】
本発明の一好適な実施形態において、前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖ１のアミノ酸配列は、配列番号１９で表される。
【0022】
本発明の一好適な実施形態において、前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２０で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２１で表される。
【0023】
本発明の一好適な実施形態において、前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖ２の分子構成がＶＨ－Ｌ１－ＶＬであり、各ｓｃＦｖのＣ末端は、ペプチドリンカーＬ２を介して免疫グロブリン抗体ＩｇＧの重鎖のＮ末端に連結される。
【0024】
本発明の一好適な実施形態において、前記一本鎖可変断片ｓｃＦｖ２のアミノ酸配列は、配列番号２４で表される。
【0025】
本発明の一好適な実施形態において、前記二重特異性抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２５で表され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２１で表される。
【0026】
本発明において、二重特異性抗体を構築するに当たって、例えば物理的に安定した分子を発現し、熱および塩に対する安定性を改善すると同時に凝集を減らし、高濃度条件での溶解性および２種類の抗原ＨＥＲ２及びＰＤ１それぞれに対する結合性を改善するなど、該二重特異性抗体の化学的および物理的安定性に関連する問題も解決されている。
【0027】
本発明のもう１つの側面において、前記二重特異性抗体をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【0028】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチド分子は、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２２で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２３で表され、または、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２６で表され、軽鎖をコードするヌクレオチド配列が配列番号２３で表される。
【0029】
本発明において、当分野で慣用の方法で前記ヌクレオチド分子を調製することができ、好ましくは、ＰＣＲ法などの遺伝子工学手法を用いて上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を得ることができ、若しくは全配列を人工合成することにより上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を得ることができる。
【0030】
当業者が熟知することでもあるが、上記二重特異性抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に置き換え、欠損、変更や、挿入又は増加を適宜導入することによりポリヌクレオチド分子の同族列を得ることができる。本発明に係るポリヌクレオチドの同族列は、抗体活性を損なわない前提で、該二重特異性抗体をコードする遺伝子における１つ又は２つ以上の塩基を置き換え、除去または増加することにより得られる。
【0031】
本発明のもう１つの側面において、上記ヌクレオチド分子を含んでなる発現ベクターを提供する。
【0032】
前記発現ベクターは、当分野で慣用の発現ベクターであり、例えばプロモータ配列、ターミネータ配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー 配列、標識遺伝子及び／又は配列などの調節配列、及び他の適切な配列を含んでなる発現ベクターある。前記発現ベクターとしは、ウイルス又はプラスミドであってもよく、例えばバクテリオファージまたはファージミドを適宜利用することができ、より具体的には、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９」を参照することができる。また、核酸分子を操作する際の技術や手法としては、「Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版」を参照することができる。本発明に係る発現ベクターとしては、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１／ＺＥＯ（＋）、ｐＤＨＦＲ、ｐＴＴ５、ｐＤＨＦＦ、ｐＧＭ－ＣＳＦ及びｐＣＨＯ１．０が挙げられ、そのうちｐＴＴ５を用いるのが好ましい。
【0033】
本発明は、さらに、上記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
【0034】
本発明に係るホスト細胞としては、上記組換え発現ベクターが安定に自己複製し、かつそれに含まれる前記ヌクレオチドを効率よく発現できれば、当分野で一般に使われる各種のホスト細胞を用いることができる。具体的には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈ ａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＴＧ１などの原核発現細胞や真核発現細胞が挙げられ、そのうち、一本鎖抗体又はＦａｂ抗体を発現する場合にはＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用い、全長ＩｇＧ抗体を発現する場合にはＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いるのが好ましい。また、前記発現ベクターをホスト細胞に導入することにより、本発明に係る組換え発現形質転換体が得られ、前記発現ベクターを導入する際には当分野で慣用の導入方法を利用することができ、その中でも化学的導入法、ヒートショック法又は電気的導入法を利用するのが好ましい。
【0035】
本発明の一好適な実施形態において、前記ホスト細胞としては、真核細胞が挙げられ、ＣＨＯ細胞又は２９３Ｅ細胞を用いるのが好ましい。
【0036】
本発明のもう１つの側面において、上記ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体の製造方法を提供し、該製造方法包括は、
発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップａと、
前記ステップａで発現した二重特異性抗体を分離、精製するステップｂと、を含む。
発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップａと、
前記ステップａで発現した二重特異性抗体を分離、精製するステップｂと、を含む。
【0037】
本発明に係るホスト細胞の培養方法、前記抗体の分離、精製方法は当分野で慣用の方法であり、具体的には、関連の細胞培養技術マニュアル及び抗体分離、精製技術マニュアルを参照することができる。本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体の製造方法は、発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体を発現するステップと、前記二重特異性抗体を分離、精製するステップとを含む。このような方法を利用することにより、組換えタンパク質をほぼ均均一なものに精製し、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動でシングルバンドとすることができる。
【0038】
本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体は、アフィニティークロマトグラフィーを利用して分離精製することができ、使用するアフィニティーカラムの特性に基づき、例えば高塩濃度の緩衝液、ｐＨ変更などの方法を利用してカラムに結合したＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体を溶出することができる。さらに、本発明者は得られたＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体について評価実験を行い、該ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体が標的細胞および抗原に高い結合性で効率よく結合することを見出した。
【0039】
本発明のもう１つの側面において、前記ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および賦形剤からなる群より選ばれる１種又は２種以上と、を含む組成物を提供する。
【0040】
本発明に係る二重特異性抗体は、薬学的に許容可能な担体と共に薬物組成物を構成することにより、より安定に薬物効果を発揮することができる。これらの製剤は、本発明に係る二重特異性抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持し、同時にタンパク質の多官能基を分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。液体製剤にした場合、通常、２℃～８℃の温度条件で１年間安定に保存することができ、凍結乾燥製剤にした場合、３０℃の温度条件で少なくとも６ヶ月間安定に保存することができる。前記二重特異性抗体製剤としては、製薬分野でよく見られる懸濁剤、注射剤、凍結乾燥剤などが挙げられる。
【0041】
本発明に係る二重特異性抗体の注射剤又は凍結乾燥製剤に含まれる薬学的に許容可能な担体については特に制限がなく、表面活性剤、溶液安定剤、等張化剤および緩衝液から選ばれる１種又は２種以上を使用することができる。そのうち、表面活性剤については特に制限がなく、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（例えば、ツイン２０又はツイン８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトンなどの非イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウムや、テトラデシル、リノリル又はオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭ等が挙げられ、これらの表面活性剤をＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体の粒子化を最小限に抑える程度で添加することができる。溶液安定剤については特に制限がなく、還元糖や非還元糖などの糖類、グルタミン酸ナトリウ又はヒスチジンなどのアミノ酸類、三価アルコール、高級糖アルコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコールなどのアルコール類が挙げられ、これらの溶液安定剤は、最後に得られた製剤が当業者によって指定された期間内において安定な状態を維持できるように添加される。等張化剤については特に制限がなく、塩化ナトリウム、マンニトールのうち何れか１種以上を使用することができる。緩衝液についても特に制限がなく、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液のうち何れか１種以上を使用することができる。
【0042】
本発明のもう１つの側面において、上記ＨＥＲ２及びＰＤ１に特異的に結合しうる二重特異性抗体又は上記薬物組成物の、癌又は腫瘍を治療するための薬物の製造における用途を提供する。
【0043】
本発明において癌又は腫瘍を治療するための薬物とは、腫瘍に対して抑制及び／又は治療効果を示す薬物を指す。本発明で言う薬物は、腫瘍関連症状の遅延及び／又は低減に寄与し、さらに、既存症状および関連症状を減らし、並びに腫瘍の転移などを抑制又は防止することができる。
【0044】
本発明に係る薬物の投与対象については特に制限がなく、例えば肺がん、骨肉腫、胃がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、子宮がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腟がん、外陰がん、直腸がん、大腸がん、肛門部がん、乳がん、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎皮質がん、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膵臓がん、脳がん、精巣がん、悪性リンパ腫、移行上皮がん、膀胱がん、腎臓がん又は尿路がん、腎細胞がん、腎盂がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部肉腫、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、中枢神経系原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、黒色腫、カポジ肉腫、類表皮がん、有棘細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、慢性又は急性白血病のうち何れか１種又は２種以上が挙げられる。
【0045】
ヒトを含む動物に本発明の二重特異性抗体及びその組成物を投与するとき、投与量を患者の年齢及び体重、疾患の特性及び重篤度、投与形態に基づき適宜調整することができ、動物実験の結果や実際状況を応じて投与総量を一定範囲内に収めることができる。具体的には、静脈注射する際の投与量は１～１８００ｍｇ／１日にすることができる。
【0046】
本発明に係る二重特異性抗体及びその組成物は、他の抗腫瘍薬併用することでより優れた治療効果を発揮することができる。これらの抗腫瘍薬については特に制限がなく、細胞毒性を示す薬物、ホルモン類薬物、生体応答調整剤、モノクローナル抗体および他の抗腫瘍薬が挙げられる。そのうち細胞毒性を示す薬物としては、１）核酸化学構造に作用する薬物であって、窒素マスタード類、ニトロソウレア類、メタンスルホン酸エステル類などのアルキル化剤、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）およびオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）などの白金類化合物、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ／Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシンＤ（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダウノルビシン （Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトラマイシン（Ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）などの抗生物質、２）核酸代謝を影響する薬物であって、メトトレキサート（ＭＴＸ）及びペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）などのジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、フルオロウラシル（例えば、５－フルオロウラシルやカペシタビン）などのチミジル酸シンターゼ阻害剤、６－メルカプトプリン などのプリンヌクレオシドシンターゼ阻害剤、ヒドロキシカルバミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｍｉｄｅ）などのヌクレオチドレダクターゼ阻害剤、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）及びゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）などのＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、および３）チューブリンに作用する薬物であって、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ポドフィリン類、ホモハリントニンなどが挙げられる。また、ホルモン類薬物としては、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ドロロキシフェン（Ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、エキセメスタン（Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）などの抗エストロゲン剤、アミノグルテチミド（Ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ホルメスタン（Ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（Ｌｅｔｒｏｚｌｅ）、アナストロゾール（Ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）などのアロマターゼ阻害剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤、及びゾラデックス、エナントンなどのＲＨ－ＬＨアゴニスト／アンタゴニストが挙げられる。また、生体の免疫機能を調節することにより抗腫瘍効果を発揮する生体応答調整剤としては、インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、チモシン（Ｔｈｙｍｏｓｉｎｓ）などが挙げられる。モノクローナル抗体としては、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）などが挙げられる。また、他の抗腫瘍薬としては、その作用機序が未だに解明されておらず、薬理機構に対して更なる解析が必要とされる薬物などが上げられる。本発明に係る二重特異性抗体及びその組成物は、上述の抗腫瘍薬のうち１種又は２種以上と併用することが可能である。
【発明の効果】
【0047】
本発明によれば、腫瘍細胞の表面に局在するＨＥＲ２及びＴリンパ球の表面に局在するＰＤ１を標的とする二重特異性抗体を提供する。本発明に係る二重特異性抗体は、両端抗体の活性を維持してＰＤ１及びＨＥＲ２抗原を同時に認識結合し、細胞レベルにおいてはＨＥＲ２陽性の腫瘍細胞増殖を抑制し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を遮断することができる。また、２つの標的サイトを抱えるＮ８７－ＰＤＬ１腫瘍細胞モデルにおいて、ＨＥＲ２モノクローナル抗体や、ＨＥＲ２モノクローナル抗体とＰＤ１モノクローナル抗体の併用時を上回る活性を示す。また、マウスＮ８７腫瘍モデルを用いる動物実験では、該二重特異性抗体のＨＥＲ２端が腫瘍増殖を抑制することが確認でき、ヒト化ＰＤ１を移植したマウスＭＣ３８腫瘍モデルを用いる動物実験では、該二重特異性抗体のＰＤ－１端が腫瘍増殖を抑制することが確認できた。つまり、本発明の二重特異性抗体は、両端抗体の活性を良好に維持し、両端抗体の活性が相乗して抗腫瘍効果を発揮するものである。
【0048】
本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体は、以下の作用機序によって両端抗体の活性が協調して抗腫瘍効果を発揮すると考えられる。つまり、ＰＤ－Ｌ１が腫瘍細胞や一部の免疫調節細胞で発現し、ＰＤ－１がＴ細胞で発現することから、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合は、Ｔ細胞の増殖と活性化を抑制することによりＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路を遮断することができ、Ｔ細胞が持つ免疫傷害能を亢進させることができる。また、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体において、抗ＨＥＲ２抗体のＦｃ部分がＮＫ細胞などにおけるＦｃ受容体と結合し、Ｆｃ受容体を持つ免疫効果細胞のＡＤＣＣ活性を亢進させて腫瘍細胞を殺し、一方、Ｔ細胞に対しては明らかな傷害効果を示さない。なお、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体は、抗ＨＥＲ２活性を利用してＨＥＲ２抗原を高いレベルで発現する腫瘍細胞を認識結合し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。以上のことから、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体は、ＰＤ１抗原とＨＥＲ２抗原を同時に認識結合し、関連のシグナル経路を遮断し、免疫効果細胞を亢進させるといった３つの活性を一体に共有することにより、腫瘍細胞に対して優れた阻害活性を示し、かつ優れた安定性を有する。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図2A】図２Ａ乃至２Ｃは、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体をＨＰＬＣや、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で解析する際の結果を示す図であり、そのうち図２Ａは、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図2B】図２Ａ乃至２Ｃは、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体をＨＰＬＣや、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で解析する際の結果を示す図であり、そのうち図２Ｂは、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図2C】図２Ａ乃至２Ｃは、本発明に係るＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体をＨＰＬＣや、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で解析する際の結果を示す図であり、そのうち図２Ｃは、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ及びｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析結果を示す図である。
【図5】ＢＴ４７４細胞増殖に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ及びｂの阻害効果を示す図である。
【図10】ＮＣＩ－Ｎ８７移植モデルに対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの抗腫瘍効果を示す図である。
【図11】ヒト化ＰＤ１を移植したマウスＭＣ３８モデルに対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0050】
以下、実施例や実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例や実験例に制限されない。以下において、ベクターやプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子をベクターやプラスミドに導入する方法、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来周知の操作については説明を省略する。これらの操作は当業者が熟知し、例えば［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］などの出版物に詳細な説明がある。
【0051】
実施例で使われる実験材料、及び実験試薬の調製については、以下において具体的に説明する。
【0052】
実験材料は、以下の通りである。
ＣＨＯ細胞：Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号Ａ２９１３３
２９３Ｅ細胞：ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製
ヒト乳がん細胞ＢＴ４７４：中国科学院細胞バンクにより入手、カタログ番号ＴＣＨｕ１４３
ＰＤ－Ｌ１ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞：Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｊ１２５２
ＣＤ４＋Ｔ細胞：Ａｌｌｃｅｌｌｓ社製、製品番号ＬＰ１８０３２９
ＮＫ細胞：Ａｌｌｃｅｌｌｓ社製、製品番号ＰＢ０１２－Ｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａチップ：ラベル番号２９１３９１３１－ＡＡ、ロット番号１０２６１１３２
ＳＤラット：浙江維通利華実験動物技術社製、動物製造認定証ＳＣＸＫ（浙）２０１８－０００１
ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７：アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）により入手
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス：上海霊暢バイオテック社製
ＭＣ３８マウス大腸がん細胞株：上海和元バイオテック社製
ヒト化ＰＤ１を移植したマウスＣ５７ＢＪ／６Ｊ－ＰＤＣＤ１ｅｍ１（Ｈｐｄｃｄ１）／Ｓｍｏｃ株：上海南方模式バイオテック社製、製品番号ＮＭ－ＫＩ－０００１５
ＰＢＭＣ：上海ＳＡＩＬＹバイオテック社製、製品番号ＳＬＢ－ＨＰ０４０Ａ
ＣＨＯ細胞：Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号Ａ２９１３３
２９３Ｅ細胞：ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製
ヒト乳がん細胞ＢＴ４７４：中国科学院細胞バンクにより入手、カタログ番号ＴＣＨｕ１４３
ＰＤ－Ｌ１ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞：Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｊ１２５２
ＣＤ４＋Ｔ細胞：Ａｌｌｃｅｌｌｓ社製、製品番号ＬＰ１８０３２９
ＮＫ細胞：Ａｌｌｃｅｌｌｓ社製、製品番号ＰＢ０１２－Ｃ
Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａチップ：ラベル番号２９１３９１３１－ＡＡ、ロット番号１０２６１１３２
ＳＤラット：浙江維通利華実験動物技術社製、動物製造認定証ＳＣＸＫ（浙）２０１８－０００１
ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７：アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）により入手
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス：上海霊暢バイオテック社製
ＭＣ３８マウス大腸がん細胞株：上海和元バイオテック社製
ヒト化ＰＤ１を移植したマウスＣ５７ＢＪ／６Ｊ－ＰＤＣＤ１ｅｍ１（Ｈｐｄｃｄ１）／Ｓｍｏｃ株：上海南方模式バイオテック社製、製品番号ＮＭ－ＫＩ－０００１５
ＰＢＭＣ：上海ＳＡＩＬＹバイオテック社製、製品番号ＳＬＢ－ＨＰ０４０Ａ
【0053】
また、実験試薬としては、以下のものである。
ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体：ｓｉｇｍａ社製、製品番号Ａ０２９３
ＨＲＰ標識のストレプトアビジン：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品番号５５４０６６
ヒツジ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ：ｓｉｇｍａ社製、製品番号Ｆ４１４３
ＣＤ２８抗体：Ａｂｃａｍ社製、 製品番号ａｂ２１３０４３
ＩＬ－２：Ｒ＆Ｄ社製、製品番号２０２－ＩＬ
ＰＢＳ：上海生工バイオテック社製、製品番号Ｂ５４８１１７
ＰＢＳＴ：０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ
ＢＳＡ：上海生工バイオテック社製、製品番号Ａ６０３３２
ＴＭＢ：ＢＤ社製、製品番号５５５２１４
Ｂｉｏ－Ｇｌｏ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｇ７９４０
ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号１００９９
ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液：Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＢＲ－１００６－６９
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ：ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｇ７７５Ｂ
ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体：ｓｉｇｍａ社製、製品番号Ａ０２９３
ＨＲＰ標識のストレプトアビジン：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、製品番号５５４０６６
ヒツジ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ：ｓｉｇｍａ社製、製品番号Ｆ４１４３
ＣＤ２８抗体：Ａｂｃａｍ社製、 製品番号ａｂ２１３０４３
ＩＬ－２：Ｒ＆Ｄ社製、製品番号２０２－ＩＬ
ＰＢＳ：上海生工バイオテック社製、製品番号Ｂ５４８１１７
ＰＢＳＴ：０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ
ＢＳＡ：上海生工バイオテック社製、製品番号Ａ６０３３２
ＴＭＢ：ＢＤ社製、製品番号５５５２１４
Ｂｉｏ－Ｇｌｏ：Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｇ７９４０
ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ社製、製品番号１００９９
ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液：Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＢＲ－１００６－６９
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ：ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｇ７７５Ｂ
【0054】
実験に使われる測定装置としては、以下のものであった。
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム：ＧＥ社製
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター：Ｂｅｃｋｍａｎ社製
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘプレートリーダー：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ示差走査熱量計（ＤＳＣ）：Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム：ＧＥ社製
Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター：Ｂｅｃｋｍａｎ社製
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘプレートリーダー：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社製
ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ示差走査熱量計（ＤＳＣ）：Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製
【0055】
また、以下で言うＨＥＲ２モノクローナル抗体とは、三生国健薬業会社がハーセプチンのアミノ酸配列に基づき、実施例２と同様にして二重特異性抗体を発現、精製して得られたヒトとマウスのキメラモノクローナル抗体である。また、以下で言うＰＤ１モノクローナル抗体とは、三生国健薬業会社が自ら開発した新規なＰＤ１ヒト化モノクローナル抗体であり、中国特許出願番号２０１７１００５４７８３．５で出願なされている。
【0056】
実施例１：ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体の構築
本発明では、ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＩｇＧとＰＤ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖをタンデムに繋いでＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを構築した。
本発明では、ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＩｇＧとＰＤ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖをタンデムに繋いでＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを構築した。
【0057】
ペプチドリンカーＬ１（配列番号１７）を用い、ＰＤ１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域ＶＬ（配列番号１４）と重鎖可変領域ＶＨ（配列番号１３）を繋いでＰＤ１の一本鎖抗体断片ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ、すなわちＰＤ１のｓｃＦｖ１断片（配列番号１９）を得た。さらに、ペプチドリンカーＬ２（配列番号１８）を用い、該一本鎖抗体断片とＨＥＲ２モノクローナル抗体の重鎖を繋ぐことにより、ＨＥＲ２モノクローナル抗体の軽鎖（配列番号２１）を保留したまま、二重特異性抗体分子であるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの重鎖（配列番号２０）を得た。また、ＣＨＯ細胞における抗体分子の発現効率を高めるため、ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼してＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ分子の核酸配列を最適化した。最適化に際してはコドン使用の好み、ＧＣ量、ｍＲＮＡ二次構造、重複配列などを考慮し、ＧＥＮＥＷＩＺ社が最適化したものを合成した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの重鎖の核酸配列が配列番号２２で表され、軽鎖の核酸配列が配列番号２３で表され、また、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの構造は図１Ａに示され、配列は配列表に示される通りであった。
【0058】
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの分子は、以下のように構築した。つまり、ペプチドリンカーＬ１（配列番号１７）を用い、ＰＤ１モノクローナル抗体ＰＤ１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域ＶＬ（配列番号１４）と重鎖可変領域ＶＨ（配列番号１３）を繋いでＰＤ１の一本鎖抗体断片ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ、すなわちＰＤ１のｓｃＦｖ２断片（配列番号２４）を得た。さらに、ペプチドリンカーＬ２（配列番号１８）を用い、該一本鎖抗体断片とＨＥＲ２モノクローナル抗体の重鎖を繋ぐことにより、ＨＥＲ２モノクローナル抗体の軽鎖（配列番号２１）を保留したまま、二重特異性抗体分子であるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの重鎖（配列番号２５）を得た。また、ＣＨＯ細胞における抗体分子の発現効率を高めるため、ＧＥＮＥＷＩＺ社に依頼してＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂ分子の核酸配列を最適化した。最適化に際してはコドン使用の好み、ＧＣ量、ｍＲＮＡ二次構造、重複配列などを考慮し、ＧＥＮＥＷＩＺ社が最適化したものを合成した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの重鎖の核酸配列が配列番号２６で表され、軽鎖の核酸配列が配列番号２３で表され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの構造は図１Ｂに示され、配列は配列表に示される通りであった。
【0059】
実施例２：二重特異性抗体の発現と精製
二重特異性抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡ断片をそれぞれｐＴＴ５ベクターに導入し、組換えプラスミドを得て両者を同時にＣＨＯ細胞及び／又は２９３Ｅ細胞に導入した。細胞を培養し、５～７日後に培養液を回収して高速遠心し、ミリポアメンブレンフィルタで減圧ろ過した後、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムに注入して１００ｍＭのクエン酸を含む溶出液（ｐＨ３．５）でタンパク質を溶出し、目的サンプルを回収してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。ＨＰＬＣを用いて精製済みのタンパク質を分析し、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂのＨＰＬＣクロマトグラムはそれぞれ図２Ａ、２Ｂに示される通りであった。抗体分子は、均一な状態を呈し、純度が９７％以上であった。そして、精製済みのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂにそれぞれ非還元性の電気泳動緩衝液を加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、かつ精製済みのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂにそれぞれ還元性の電気泳動緩衝液を加え、沸騰するまで加熱処理してからＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動の結果を図２Ｃに示し、二重特異性抗体全長の分子量理論値が１９９ＫＤであった。
二重特異性抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡ断片をそれぞれｐＴＴ５ベクターに導入し、組換えプラスミドを得て両者を同時にＣＨＯ細胞及び／又は２９３Ｅ細胞に導入した。細胞を培養し、５～７日後に培養液を回収して高速遠心し、ミリポアメンブレンフィルタで減圧ろ過した後、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラムに注入して１００ｍＭのクエン酸を含む溶出液（ｐＨ３．５）でタンパク質を溶出し、目的サンプルを回収してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。ＨＰＬＣを用いて精製済みのタンパク質を分析し、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂのＨＰＬＣクロマトグラムはそれぞれ図２Ａ、２Ｂに示される通りであった。抗体分子は、均一な状態を呈し、純度が９７％以上であった。そして、精製済みのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂにそれぞれ非還元性の電気泳動緩衝液を加え、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、かつ精製済みのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂにそれぞれ還元性の電気泳動緩衝液を加え、沸騰するまで加熱処理してからＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動の結果を図２Ｃに示し、二重特異性抗体全長の分子量理論値が１９９ＫＤであった。
【0060】
実施例３：酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ法）による抗原と二重特異性抗体の結合性評価
ＨＥＲ２抗原に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよびｂの結合性を評価するため、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質（三生国健薬業社製）を２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた。４℃で一晩静置し、翌日にＰＢＳＴでプレートを２回洗い流した。各ウェルに１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを加え、３７℃、１時間ブロッキングしてからＰＢＳＴでプレートを２回洗い流した。そして、測定用抗体試料及び陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで濃度１００ｎＭから段階的に３倍希釈して１２段階の濃度勾配となるようにし、プレートに加えて３７℃、１時間静置した。ＰＢＳＴでプレートを２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を加えて３７℃、４０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で解析し、図を作成してＥＣ５０を算出した。実験結果は図３Ａに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体とＨＥＲ２抗原が結合する際のＥＣ５０がそれぞれ０．１９７５、０．２２９４及び０．２２１であり、ＨＥＲ２抗原に対して三者の結合性がほぼ同様であることが確認できた。
ＨＥＲ２抗原に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよびｂの結合性を評価するため、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質（三生国健薬業社製）を２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた。４℃で一晩静置し、翌日にＰＢＳＴでプレートを２回洗い流した。各ウェルに１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴを加え、３７℃、１時間ブロッキングしてからＰＢＳＴでプレートを２回洗い流した。そして、測定用抗体試料及び陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで濃度１００ｎＭから段階的に３倍希釈して１２段階の濃度勾配となるようにし、プレートに加えて３７℃、１時間静置した。ＰＢＳＴでプレートを２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を加えて３７℃、４０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で解析し、図を作成してＥＣ５０を算出した。実験結果は図３Ａに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体とＨＥＲ２抗原が結合する際のＥＣ５０がそれぞれ０．１９７５、０．２２９４及び０．２２１であり、ＨＥＲ２抗原に対して三者の結合性がほぼ同様であることが確認できた。
【0061】
ＰＤ１に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよびｂそれぞれの結合性を評価するため、組換えＰＤ１－ＥＣＤ－ｈＦｃタンパク質（三生国健薬業社製）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２００ｇ／ｍＬに希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えて４℃、一晩静置して被覆処理を行った。プレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、各ウェルにブロッキング液として２％のＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬずつ加えて３７℃、１時間静置し、プレートをＰＢＳＴで１回洗い流して次に備えた。そして、測定用抗体試料および陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体を、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで濃度１００ｎＭから段階的に３倍希釈して１２段階の濃度勾配になるようにした後、ブロッキング済みのＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えて３７℃、１時間静置した。ＰＢＳＴでプレートを２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を加えて３７℃、３０分間静置した。ＰＢＳＴでプレートを３回洗い流し、吸水紙にプレートを軽く叩いて残りの水液を吸い取り、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加え、室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーで波長４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取り、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で解析し、図を作成してＥＣ５０を算出した。実験結果は図３Ｂに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体がＰＤ１に結合する際のＥＣ５０がそれぞれ０．１３８４、０．１５２５及び０．１５５７であり、ＰＤ１に対して三者の結合性がほぼ同様であることが確認できた。
【0062】
実施例４：標的細胞に対する二重特異性抗体の結合性評価
ＨＥＲ２が細胞表面で高いレベルで発現するヒト乳がん細胞ＢＴ４７４を標的細胞とし、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、１回洗浄する度に３００ｇ、５分間遠心し、３回目の遠心後に上澄み液を捨てた。０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳＳで細胞を再懸濁し、細胞濃度が１×１０６個細胞／ｍＬとなるようにし、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を濃度４００ｎＭとなるように調製し、さらに、段階的に希釈して１１段階の濃度勾配を形成し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えてＢＴ４７４細胞と十分混ぜ合わせ、４℃で１時間静置した。細胞をＰＢＳで２回洗浄することにより未結合状態の測定用抗体試料を取り除いた後、１ｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣを１００μＬ加えて細胞と４℃で３０分間インキュベートし、３００ｇ、５分間遠心し、細胞をＰＢＳで２回洗浄することにより未結合状態の二次抗体を取り除いた。そして、細胞を２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターを用いて該細胞に対する二重特異性抗体の結合性を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトで整理し、回帰解析を行った。実験結果は図４Ａに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂが何れも細胞表面に発現するＨＥＲ２に特異的に結合することができ、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体がＢＴ４７４細胞に結合する際のＥＣ５０がそれぞれ１．６４、５．６６９及び１．５５６であった。そのうち、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体の結合性がほぼ同様であるが、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂは、陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体に少々劣る結合性を示した。
ＨＥＲ２が細胞表面で高いレベルで発現するヒト乳がん細胞ＢＴ４７４を標的細胞とし、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、１回洗浄する度に３００ｇ、５分間遠心し、３回目の遠心後に上澄み液を捨てた。０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳＳで細胞を再懸濁し、細胞濃度が１×１０６個細胞／ｍＬとなるようにし、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えた。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を濃度４００ｎＭとなるように調製し、さらに、段階的に希釈して１１段階の濃度勾配を形成し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えてＢＴ４７４細胞と十分混ぜ合わせ、４℃で１時間静置した。細胞をＰＢＳで２回洗浄することにより未結合状態の測定用抗体試料を取り除いた後、１ｇ／ｍＬのヒツジ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣを１００μＬ加えて細胞と４℃で３０分間インキュベートし、３００ｇ、５分間遠心し、細胞をＰＢＳで２回洗浄することにより未結合状態の二次抗体を取り除いた。そして、細胞を２００μＬのＰＢＳで再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターを用いて該細胞に対する二重特異性抗体の結合性を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトで整理し、回帰解析を行った。実験結果は図４Ａに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂが何れも細胞表面に発現するＨＥＲ２に特異的に結合することができ、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体がＢＴ４７４細胞に結合する際のＥＣ５０がそれぞれ１．６４、５．６６９及び１．５５６であった。そのうち、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体の結合性がほぼ同様であるが、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂは、陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体に少々劣る結合性を示した。
【0063】
ＰＤ１が細胞表面で安定に発現するＣＨＯ細胞を標的細胞とし、上記と同様にしてフローサイトメーターで該細胞に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂの結合性を測定した。測定は上記と同様にして行い、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトで整理し、回帰解析を行った。実験結果は図４Ｂ、図４Ｃに示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂが何れも細胞表面で発現するＰＤ１に特異的に結合することができ、そのうちＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよび陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体の場合、ＥＣ５０がそれぞれ１．７７７及び０．８９８１であり、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂおよび陽性対照物抗であるＰＤ１モノクローナル抗体の場合、ＥＣ５０がそれぞれ１．１９２和０．８８９１であり、３者の結合性がほぼ同様であることが確認できた。
【0064】
実施例５：ＢＴ４７４細胞増殖に対する二重特異性抗体の阻害効果
ヒト乳がん細胞株ＢＴ４７４は、その細胞表面においてＨＥＲ２抗原分子を発現し、体外でＢＴ４７４細胞を培養するとき、細胞はＨＥＲ２受容体を介して伝達される増殖シグナルに部分的に依存して増殖する。そして、培地にＨＥＲ２抗体を加えると、細胞の増殖が阻害され、このときの抗体濃度と細胞増殖の阻害効果が一定の範囲内で用量効果関係を示すことが既に知られている。このとき、細胞増殖は、ＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）を用いる毒性実験によって測定することができ、用量反応曲線がＳ字型を呈するのが一般である。
ヒト乳がん細胞株ＢＴ４７４は、その細胞表面においてＨＥＲ２抗原分子を発現し、体外でＢＴ４７４細胞を培養するとき、細胞はＨＥＲ２受容体を介して伝達される増殖シグナルに部分的に依存して増殖する。そして、培地にＨＥＲ２抗体を加えると、細胞の増殖が阻害され、このときの抗体濃度と細胞増殖の阻害効果が一定の範囲内で用量効果関係を示すことが既に知られている。このとき、細胞増殖は、ＣＣＫ－８（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８）を用いる毒性実験によって測定することができ、用量反応曲線がＳ字型を呈するのが一般である。
【0065】
ＢＴ４７４細胞をパンクレアチンで消化し、再懸濁してから細胞数を計測し、生きた細胞の密度に基づき完全培地で細胞密度を５×１０４個細胞／ｍＬに調製し、９６ウェルプレートのＢ行～Ｇ行の各ウェルに１００μＬずつ加えた。プレート辺縁のＡ行、Ｈ行の各ウェルには培地又はＰＢＳを２００μＬ加えて封じ込め、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで３～５時間付着培養した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体サンプルを完全培地で濃度３００ｎＭの溶液に調製し、さらに、段階的に３倍希釈して１１段階の濃度勾配を形成した。９６ウェルプレートの対応ウェルに希釈済みの測定試料を加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで７日間培養した。７日後、各ウェルに体積比で１：１０の着色液（ＣＣＫ－８試料希釈液で希釈したもの）を加え、ＣＯ２インキュベータにおいて引き続き３～５時間培養した。プレートリーダーを用い、基準波長を６５０ｎｍとし、波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトで整理、解析した。実験結果は図５に示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂおよび陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体のＩＣ５０がそれぞれ０．４９６７、０．９４２７及び０．５９１４であり、ＢＴ４７４細胞増殖に対する３者の阻害効果がほぼ同様であることが確認できた。
【0066】
実施例６：細胞レベルでＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１結合に対する二重特異性抗体の阻害活性評価
対数増殖期にあるＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞をパンクレアチンで消化して細胞を粘着状態から遊離させ、白色で且つ底部透明の９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ、１ウェル当たりに４００００個細胞となるように播種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで一晩培養した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ及びｂ、ＰＤ１モノクローナル抗体および同型の陰性対照物試料を、濃度６００ｎＭから段階的に３倍希釈して２×測定溶液を得た。そして、細胞密度が１．４～２×１０６個／ｍＬであり、細胞生存率が９５％以上であるＰＤ１効果細胞をパンクレアチンで消化し、再懸濁して１．２５×１０６個細胞／ｍＬの細胞溶液を得た。１日前に予め準備したＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を取って上澄みを捨て、段階的に希釈した二重特異性抗体およびＰＤ１モノクローナル抗体の測定溶液を４０μＬ加え、さらに、同体積のＰＤ１効果細胞を加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで６時間インキュベートした。各ウェルにＢｉｏ－Ｇｌｏ測定試薬を８０μＬ加えて室温、１０分間静置し、ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３を用いて発光量を測定した。
対数増殖期にあるＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞をパンクレアチンで消化して細胞を粘着状態から遊離させ、白色で且つ底部透明の９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ、１ウェル当たりに４００００個細胞となるように播種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで一晩培養した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ及びｂ、ＰＤ１モノクローナル抗体および同型の陰性対照物試料を、濃度６００ｎＭから段階的に３倍希釈して２×測定溶液を得た。そして、細胞密度が１．４～２×１０６個／ｍＬであり、細胞生存率が９５％以上であるＰＤ１効果細胞をパンクレアチンで消化し、再懸濁して１．２５×１０６個細胞／ｍＬの細胞溶液を得た。１日前に予め準備したＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を取って上澄みを捨て、段階的に希釈した二重特異性抗体およびＰＤ１モノクローナル抗体の測定溶液を４０μＬ加え、さらに、同体積のＰＤ１効果細胞を加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで６時間インキュベートした。各ウェルにＢｉｏ－Ｇｌｏ測定試薬を８０μＬ加えて室温、１０分間静置し、ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３を用いて発光量を測定した。
【0067】
測定には平行ウェルを設け、得られた実測値から平均値を求めて４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ法に従って回帰分析を行い、検量線を作成した。測定結果は、図６Ａ及び図６Ｂに示された通りであり、また、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａのＩＣ５０、ｔｏｐ、ｂｏｔｔｏｍ、ｈｉｌｌｓｌｏｐｅなどを下記表１に示し、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂのＩＣ５０、ｔｏｐ、ｂｏｔｔｏｍ、ｈｉｌｌｓｌｏｐｅなどを下記表２に示す。
【0068】
【表1】
【0069】
【表2】
【0070】
実施例７：Ｂｉａｃｏｒｅ法による抗原と二重特異性抗体の結合性評価
ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ捕捉法を利用し、二重特異性抗体と抗原ＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓが結合する際の動態パラメータを測定した。具体的には、濃度が１μｇ／ｍＬの二重特異性抗体をＰｒｏｔｅｉｎ－Ａチップに固定し、さらに、１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて抗原ＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓを濃度５０ｎＭから段階的に２倍希釈することにより、６段階の濃度勾配を形成して抗体との結合実験に用いた。解離は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて行われた。
ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ捕捉法を利用し、二重特異性抗体と抗原ＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓが結合する際の動態パラメータを測定した。具体的には、濃度が１μｇ／ｍＬの二重特異性抗体をＰｒｏｔｅｉｎ－Ａチップに固定し、さらに、１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて抗原ＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓを濃度５０ｎＭから段階的に２倍希釈することにより、６段階の濃度勾配を形成して抗体との結合実験に用いた。解離は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて行われた。
【0071】
また、ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ捕捉法を利用し、二重特異性抗体と抗原ＰＤ１－ＥＣＤ－ｈｉｓが結合する際の動態パラメータを測定した。具体的には、濃度が１μｇ／ｍＬの二重特異性抗体をＰｒｏｔｅｉｎ－Ａチップに固定し、さらに、１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて抗原ＰＤ１－ＥＣＤ－ｈｉｓを濃度２５０ｎＭから２倍希釈することにより、５段階の濃度勾配を形成して抗体との結合実験に用いた。解離は、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液を用いて行われた。
【0072】
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａとＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ、ＰＤ１－ＥＣＤ－ｈｉｓが結合する際の動態パラメータを、下記表３に纏めて示す。表３に示すように、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａが抗原ＰＤ１、ＨＥＲ２に対して何れも良好な結合性を示すことが確認できた。
【0073】
【表3】
【0074】
抗体ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂとＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓ、ＰＤ１－ＥＣＤ－ｈｉｓが結合する際の動態パラメータを、下記表４に示す。表４に示すように、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂが抗原ＰＤ１、ＨＥＲ２に対して何れも良好な結合性を示すことが確認できた。
【0075】
【表4】
【0076】
表３および表４において、ＫＤは結合定数であり、ｋａは抗原と抗体の結合速度定数であり、ｋｄは抗原と抗体の解離速度定数であり、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａである。
【0077】
実施例８：ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂの薬物動態評価
体重が約２００ｇのＳＤラットを４組に分け、各組は４匹ずつであった。ラットに抗体２ｍｇを尾静脈経由で注射することにより投与を行い、投与後の指定時点でマウス眼窩から採血し、血液が自然凝固するまで待ってから８０００ｒｐｍ／分間遠心して血清を回収した。
体重が約２００ｇのＳＤラットを４組に分け、各組は４匹ずつであった。ラットに抗体２ｍｇを尾静脈経由で注射することにより投与を行い、投与後の指定時点でマウス眼窩から採血し、血液が自然凝固するまで待ってから８０００ｒｐｍ／分間遠心して血清を回収した。
【0078】
血清中におけるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの薬物濃度は、以下のようにして測定した。
【0079】
１）ＥＬＩＳＡプレートを２枚用意し、各ウェルにＨＥＲ２－Ｈｉｓを５０ｎｇ加え、４℃で一晩静置して被覆を行った。翌日にプレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、２％のＢＳＡを含むＰＢＳを加えて３７℃、２時間ブロッキングした。また、ＨＥＲ－２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを濃度０．５μｇ／ｍＬから段階的に２倍希釈することにより、１２段階の濃度勾配を形成した。各血清サンプルを２０００倍希釈し、ブロッキング済のＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃、１時間静置した後にプレートをＰＢＳＴで２回洗い流した。
【0080】
ＨＥＲ２抗体を検出するに当たってＥＬＩＳＡプレートを１枚用意し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を３０００倍希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加えて３７℃、４０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで４回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。そして、各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0081】
ＰＤ１抗体を検出するに当たってＥＬＩＳＡプレートをもう１枚用意し、各ウェルにビオチン化ＰＤ１－ｈＦｃを７．５ｎｇ加えて１時間静置した。プレートを洗い流し、ＨＲＰ標識のストレプトアビジンを１０００倍希釈して各ウェルに加え、３７℃、３０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで４回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0082】
２）抗体Ｆａｂフラグメントを検出するため、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにｐｒｏｔｅｉｎ－Ａを１００ｎｇ加え、４℃で一晩静置して被覆を行った。翌日にＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを２回洗い流し、２％のＢＳＡを含むＰＢＳを加えて３７℃、２時間ブロッキングしてからＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで２回洗い流した。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを濃度１０００ｎｇ／ｍＬから段階的に２倍希釈することにより１２段階の濃度勾配を形成し、一方、ラットの血清サンプルを２０００倍希釈し、上記２組のサンプルをブロッキング済のＥＬＩＳＡプレートに加えて１時間静置した。プレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を加えて３７℃、３０分間静置し、プレートをＰＢＳＴで３回洗い流した。給水紙にプレートを軽く叩いて残りの水滴をできるだけ取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0083】
ラット体内における抗体薬物の半減期はＰｈｏｅｎｉｘソフトを用いて算出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で整理して解析図を作成した。表５～表７に薬物動態パラメータを纏めて示し、実験結果は、図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃに示される通りである。ラット体内における抗体薬物の半減期を上記２つの方法で測定した場合、方法１）ではＨＥＲ２抗体の半減期が２７３時間であり、ＰＤ１抗体の半減期が３３３時間であり、方法２）では半減期が３３３時間であり、データからして３者に大きな差がなく、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの半減期が３００時間程度であることが確認できた。
【0084】
【表5】
【0085】
【表6】
【0086】
【表7】
【0087】
また、血清中におけるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの薬物濃度は、以下のようにして測定した。
【0088】
１）ＨＥＲ２抗体を検出するに当たってＥＬＩＳＡプレートを１枚用意し、各ウェルにＨＥＲ２－Ｈｉｓを５０ｎｇ加えて４℃で一晩静置し、翌日にプレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、２％のＢＳＡを含むＰＢＳで３７℃、２時間ブロッキングした。ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂを濃度０．５μｇ／ｍＬから段階的に２倍希釈することにより１２段階の濃度勾配を形成し、その傍ら各血清サンプルを２０００倍希釈し、ブロッキング済のＥＬＩＳＡプレートに加えて３７℃、１時間静置した。プレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を３０００倍希釈してから各ウェルに１００μＬ加えて３７℃、４０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで４回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0089】
２）ＰＤ１抗体を検出するに当たってＥＬＩＳＡプレートをもう１枚用意し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにＰＤ１－ＥＣＤ-ｈＦｃを２０ｎｇ加えて被覆した後、プレートを洗い流した。抗体は上記と同様にして希釈し、その傍ら血清サンプルを１０００～２０００倍希釈し、ブロッキング済のＥＬＩＳＡプレートに加えて３７℃、１時間静置した。プレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を３０００希釈して各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃、４０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで４回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。その後、各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0090】
３）抗体Ｆａｂフラグメントを検出するため、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにｐｒｏｔｅｉｎ－Ａを１００ｎｇ加えて４℃で一晩静置し、翌日にプレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、２％のＢＳＡを含むＰＢＳを加えて３７℃、２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗い流し、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂを濃度１０００ｎｇ／ｍＬから段階的に２倍希釈することにより１２段階の濃度勾配を形成し、その傍らラット血清サンプルを５００～１０００倍希釈し、ブロッキング済のＥＬＩＳＡプレートに加えて１時間静置した。ＰＢＳＴでプレートを２回洗い流し、ＨＲＰ標識のマウス抗ヒトＦａｂ抗体を加えて３７℃、３０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで４回洗い流し、軽く叩いて水滴を取り除き、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。そして、各ウェルに停止液として２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ加えて基質反応を停止させ、プレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍでのＯＤ値を測定した。
【0091】
ラット体内における抗体薬物の半減期はＰｈｏｅｎｉｘソフトを用いて算出し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で整理し、解析図を作成した。表８～表１０に薬物動態パラメータを纏めて示し、実験結果は、図７Ｄ、図７Ｅおよび図７Ｆに示される通りである。ラット体内における抗体薬物の半減期を上記３つの方法で測定した場合、方法１）では３１２時間であり、方法２）では２８０時間であり、方法３）では２７７時間であり、データからして３者に大きな差がなく、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ｂの半減期が２８０時間程度であることが確認できた。
【0092】
【表8】
【0093】
【表9】
【0094】
【表10】
【0095】
実施例９：ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａのＡＤＣＣ活性
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体が腫瘍細胞や、ＰＤ－１を発現するＴ細胞に結合し、さらに、抗体のＦｃ部分がＮＫ細胞に結合することができるため、ＮＫ細胞が抗体結合のＣＤ４＋Ｔ細胞に対して傷害力を保持できるかどうか、かつ抗体結合のＢＴ４７４腫瘍細胞に対して傷害力を保持できるかどうかの問題について検討を行った。
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体が腫瘍細胞や、ＰＤ－１を発現するＴ細胞に結合し、さらに、抗体のＦｃ部分がＮＫ細胞に結合することができるため、ＮＫ細胞が抗体結合のＣＤ４＋Ｔ細胞に対して傷害力を保持できるかどうか、かつ抗体結合のＢＴ４７４腫瘍細胞に対して傷害力を保持できるかどうかの問題について検討を行った。
【0096】
１）ＮＫ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞に対して傷害力を保持できるかどうかを検証するに当たって、活性化したＴ細胞がＰＤ１を発現するため、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを加えて結合させ、また、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａのＦｃ部分が効果細胞であるＮＫ細胞のＦｃ受容体に結合するため、ＮＫ細胞を加えてＴ細胞に対して傷害力があるかどうかを検証することができる。
【0097】
具体的には、以下のようにして検証を行なった。まず、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させるため、Ｄ－ＰＢＳを用いて濃度が５μｇ／ｍＬのＣＤ３抗体溶液を調製し、２４ウェルプレートに加えて４℃で一晩静置した。翌日、各ウェルにＣＤ４＋Ｔ細胞を５×１０５個播種し、２μｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ２を加えて３７℃、ＣＯ２インキュベータで７２時間インキュベートすることによりＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させた。
【0098】
活性化したＴ細胞を回収し、ＦＡＣＳでＰＤ１発現状況を確認し、５％のＦＢＳを含む１６４０培地でＰＤ１高発現のＴ細胞を２×１０５個細胞／ｍＬになるように調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬずつ加えた。
【0099】
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよび陰性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を濃度４００ｎＭから段階的に５倍し、Ｔ細胞を蒔いた９６ウェルプレートを加えて３７℃、ＣＯ２インキュベータで１５分間静置した。一方、５％のＦＢＳを含む１６４０培地でＮＫ細胞を５×１０５個細胞／ｍＬになるように調製し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ加えて３７℃、ＣＯ２インキュベータにおいて３時間静置することにより傷害検証実験を行った。
【0100】
９６ウェルプレートを３００ｇ、５分間遠心し、上澄みを回収して更に１回遠心した後、上澄み１００μＬを別の９６ウェルプレートに移し、各ウェルに更にＬＤＨ基質を５０μＬ加えて１５分間静置した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーを用い、４５０ｎｍを測定波長とし、６５０ｎｍを基準波長としてＯＤ値を測定し、得られた測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で整理し、解析図を作成した。実験結果は図８Ａに示され、ＮＫ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞に対して明らかな傷害効果を示さず、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａが高濃度で存在する場合に限って微弱ながら一定の傷害効果を示すことが確認できた。
【0101】
２）ＨＥＲ２抗原がＢＴ４７４細胞の表面で発現し、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａを加えると、抗体はＢＴ４７４細胞に結合することができ、一方、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａのＦｃ部分とＮＫ効果細胞のＦｃ受容体が結合するため、ＮＫ細胞を加えてＢＴ４７４細胞に対して傷害効果があるかどうかを検証することができる。
【0102】
ＢＴ４７４腫瘍細胞に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を検証するため、ＢＴ４７４細胞を５％のＦＢＳを含む１６４０培地で２×１０５個細胞／ｍＬになるように調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに５０μＬを加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで一晩培養した。
【0103】
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａおよび陰性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体を濃度２００ｎＭから段階的に４倍希釈し、ＢＴ４７４細胞を蒔いた９６ウェルプレートに加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで１５分間静置した。同時に、ＮＫ細胞を５％のＦＢＳを含む１６４０培地で５×１０５個細胞／ｍＬになるように調製し、上記９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつを加えて３７℃、ＣＯ２インキュベータで３時間静置した。
【0104】
９６ウェルプレートを３００ｇ、５分間遠心し、上澄みを回収して更に１回遠心した後、上澄みを１００μＬ取って別の９６ウェルプレートに移し、各ウェルに更にＬＤＨ基質を５０μＬ加えで１５分間静置した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５プレートリーダーを用い、４５０ｎｍを測定波長とし、６５０ｎｍを基準波長としてＯＤ値を測定し、得られた測定データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６で整理し、解析図を作成した。実験結果は図８Ｂに示され、ＮＫ細胞がＢＴ４７４腫瘍細胞に対してＨＥＲ２モノクローナル抗体と同様に明らかな傷害効果を示すことが確認できた。
【0105】
実施例１０：細胞レベルでＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの相乗効果評価
２つの標的に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体の相乗効果を細胞レベルで評価するに当たっては、腫瘍細胞がＨＥＲ２抗原を発現し、ＨＥＲ２抗体で腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、同時に細胞がＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞におけるＰＤ－１と結合できることが求められる。こうした構想に基づくと、ＰＤ１抗体はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を阻害し、Ｔ細胞に対する抑制作用を抹消し、腫瘍細胞に対して傷害効果を奏すると推定できる。ところが、上記一連の要求を満たす細胞株を得ることは容易でなく、代わりにレンチウイルスベクターを用いてＰＤ－Ｌ１遺伝子をヒト胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞株に導入することによりＮ８７－ＰＤＬ１細胞を構築することにした。そして、Ｎ８７－ＰＤＬ１細胞の表面で高いレベルで発現するＰＤ－Ｌ１についてはＦＡＣＳ法で確認した。
２つの標的に対するＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体の相乗効果を細胞レベルで評価するに当たっては、腫瘍細胞がＨＥＲ２抗原を発現し、ＨＥＲ２抗体で腫瘍細胞の増殖を抑制することができ、同時に細胞がＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞におけるＰＤ－１と結合できることが求められる。こうした構想に基づくと、ＰＤ１抗体はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合を阻害し、Ｔ細胞に対する抑制作用を抹消し、腫瘍細胞に対して傷害効果を奏すると推定できる。ところが、上記一連の要求を満たす細胞株を得ることは容易でなく、代わりにレンチウイルスベクターを用いてＰＤ－Ｌ１遺伝子をヒト胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞株に導入することによりＮ８７－ＰＤＬ１細胞を構築することにした。そして、Ｎ８７－ＰＤＬ１細胞の表面で高いレベルで発現するＰＤ－Ｌ１についてはＦＡＣＳ法で確認した。
【0106】
対数増殖期にあるＮ８７－ＰＤＬ１細胞をパンクレアチンで消化した後、１％のＦＢＳを含む６４０培地で１×１０５個細胞／ｍＬになるように希釈し、白色で且つ底部透明の９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬ加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで一晩培養した。翌日、各ウェルに１％のＦＢＳを含む１６４０培地で新たに希釈したＰＢＭＣ細胞を５０μＬ、１ウェル当たり１×１０５個細胞となるように播種し、同時に各ウェルにそれぞれ測定用抗体試料としてＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ＨＥＲ２モノクローナル抗体、ＨＥＲ２モノクローナル抗体とＰＤ１モノクローナル抗体の併用、ＰＤ１モノクローナル抗体を５０μＬずつ、抗体濃度が４ｎＭになるように加えて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで６日間培養した。そして、９６ウェルプレートをＰＢＳで３回洗い流し、各ウェルに更に培地で１：１の倍率で希釈したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを１００μＬ加えた後、ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３を用いて発光量を測定し、得られたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで整理し、解析図を作成した。実験結果は、図９Ａ～図９Ｂに示され、腫瘍細胞に対する傷害効果からしてＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａがＨＥＲ２モノクローナル抗体や、ＨＥＲ２モノクローナル抗体とＰＤ１モノクローナル抗体併用の場合を上回り、二重特異性抗体の両部分が抗腫瘍活性において相乗効果を示すことが確認できた。
【0107】
実施例１１：ＮＣＩ－Ｎ８７移植モデルにおけるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの抗腫瘍効果評価
体外で培養したヒト胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞株を、無血清培地で濃度が５×１０７個細胞／ｍＬになるように再懸濁させ、細胞懸液を１００μＬ取って無菌条件下でヌードマウスの背部皮下に接種した。ノギスで移植腫瘍の長さと幅を計測して腫瘍体積を算出し、腫瘍が１００～２００ｍｍ３に成長するまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。
体外で培養したヒト胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞株を、無血清培地で濃度が５×１０７個細胞／ｍＬになるように再懸濁させ、細胞懸液を１００μＬ取って無菌条件下でヌードマウスの背部皮下に接種した。ノギスで移植腫瘍の長さと幅を計測して腫瘍体積を算出し、腫瘍が１００～２００ｍｍ３に成長するまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。
【0108】
測定試料としてのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの投与量をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ（０．４ｍｇ／匹）、４ｍｇ／ｋｇ（０．０８ｍｇ／）とし、陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体の投与量を１５ｍｇ／ｋｇ（０．３ｍｇ／匹）とし、ブランク組には同量のＰＢＳを投与した。腹腔経由で投与を行い、体重２０ｇのマウス１匹当たりに０．２ｍＬ、週に２回、３週間連続して投与を行った。
【0109】
移植腫瘍の体積を毎週２回の頻度で測定し、同時にマウス体重を秤量して記録した。腫瘍体積（ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＴＶ）は、算式ＴＶ＝１／２×長さ×幅２を利用して算出し、さらに、得られた数値に基づき算式ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０を利用して相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）を算出し、そのうちＶ０は組を分けるとき（すなわち、０日目）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは指定時点で測定した腫瘍体積であった。抗腫瘍活性を評価するに当たっては相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を指標とし、相対腫瘍増殖率の算式はＴ／Ｃ（％）＝（ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００であり、そのうちＴＲＴＶは治療組のＲＴＶであり、ＣＲＴＶは陰性対照組のＲＴＶであった。また、腫瘍抑制率は算式１－Ｔ／Ｃ（％）を利用して算出し、Ｔ／Ｃ（％）＞４０％の場合を腫瘍抑制効果無しとし、Ｔ／Ｃ（％）≦４０であり且つ統計学的にｐ≦０．０５の場合を腫瘍抑制効果ありとして評価を行った。実験結果は、図１０に示され、移植モデルにおいてＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａが陽性対照物であるＨＥＲ２モノクローナル抗体と同等の抗腫瘍効果を示すことが確認できた。
【0110】
実施例１２：ヒト化ＰＤ１を移植したマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおけるＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの抗腫瘍効果評価
測定試料としてのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの投与量を１３ｍｇ／ｋｇとし、陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体の投与量を１０ｍｇ／ｋｇとし、ブランク組には同量の生理塩水を投与した。体外で培養したＭＣ３８マウス大腸がん細胞を濃度が１×１０７個細胞／ｍＬになるように再懸濁させ、細胞懸液を１００μＬ取って無菌条件下でヒト化ＰＤ１を移植したマウスの右脇皮下に接種した。ヒト化ＰＤ１を移植したマウスの移植腫瘍の直径をノギスで測定し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３になるまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。ＰＤ１モノクローナル抗体やＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａは、上述の投与量に従って投与し、ブランク組には同量の生理塩水を与え、腹腔経由で週に２回、３週間連続して投与を行った。
測定試料としてのＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａの投与量を１３ｍｇ／ｋｇとし、陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体の投与量を１０ｍｇ／ｋｇとし、ブランク組には同量の生理塩水を投与した。体外で培養したＭＣ３８マウス大腸がん細胞を濃度が１×１０７個細胞／ｍＬになるように再懸濁させ、細胞懸液を１００μＬ取って無菌条件下でヒト化ＰＤ１を移植したマウスの右脇皮下に接種した。ヒト化ＰＤ１を移植したマウスの移植腫瘍の直径をノギスで測定し、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３になるまで待ってからマウスをランダムで幾つかの組に分けた。ＰＤ１モノクローナル抗体やＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａは、上述の投与量に従って投与し、ブランク組には同量の生理塩水を与え、腹腔経由で週に２回、３週間連続して投与を行った。
【0111】
毎週２回の頻度で移植腫瘍の直径を測定し、同時にマウス体重を秤量して記録した。腫瘍体積（ｔｕｍｏｒｖｏｌｕｍｅ，ＴＶ）は算式ＴＶ＝１／２×長さ×幅２を利用して算出し、得られた数値に基づき、更に算式ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０を利用して相対腫瘍体積（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ＲＴＶ）を算出し、そのうちＶ０は組を分けるとき（すなわち、０日目）に測定した腫瘍体積であり、Ｖｔは指定時点で測定した腫瘍体積であった。抗腫瘍活性を評価するに当たっては、相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を指標とし、相対腫瘍増殖率の算式はＴ／Ｃ（％）＝（ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００であり、そのうちＴＲＴＶは治療組のＲＴＶであり、ＣＲＴＶは陰性対照組のＲＴＶであった。また、腫瘍抑制率は算式１－Ｔ／Ｃ（％）を利用して算出し、Ｔ／Ｃ（％）＞４０％の場合を腫瘍抑制効果無しとし、Ｔ／Ｃ（％）≦４０であり且つ統計学的にｐ≦０．０５の場合を腫瘍抑制効果ありとして評価を行った。実験を２回繰り返し、実験結果は図１１に示され、ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａがヒト化ＰＤ１を移植したマウスＭＣ３８腫瘍モデルにおいてＰＤ１活性を阻害することで腫瘍増殖を抑制し、陽性対照物であるＰＤ１モノクローナル抗体と同等の抗腫瘍効果を示すことが確認できた。
【0112】
実施例１３：ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂの安定性評価
タンパク質構造に対する添加剤の影響などを含め、相互作用に関連する熱力学的パラメータを検討、評価するということは、製剤の最適化および開発に最も必要とされる作用機序関連の情報を提供することができる。そこで、試料および緩衝液を０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過した後、それぞれ４００μＬを取って９６ウェルプレートに移し、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣを用いて２５℃～１００℃の温度範囲、加熱速度１２０℃／１時間の条件下で走査した。
タンパク質構造に対する添加剤の影響などを含め、相互作用に関連する熱力学的パラメータを検討、評価するということは、製剤の最適化および開発に最も必要とされる作用機序関連の情報を提供することができる。そこで、試料および緩衝液を０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過した後、それぞれ４００μＬを取って９６ウェルプレートに移し、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣを用いて２５℃～１００℃の温度範囲、加熱速度１２０℃／１時間の条件下で走査した。
【0113】
ＨＥＲ２／ＰＤ１二重特異性抗体ａ、ｂはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に保存し、これら二重特異性抗体のＴｍをＤＳＣで測定する際に得られた測定値を表１１に示し、測定グラフは図１２Ａ～図１２Ｂに示される通りである。実験結果から、本発明に係る二重特異性抗体が高い安定性を有することが確認でき、３７℃で長期安定性を測定するときも同じ結果が得られた。ＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いる測定結果は、図１２Ｃ～図１２Ｄに示される通りである。
【0114】
【表11】
【0115】
以上のことから、本発明に係る二重特異性抗体は、安定な構造を有し、同時にＨＥＲ２抗原およびＰＤ１抗原に結合でき、さらに、ＨＥＲ２シグナル経路を遮断することでＨＥＲ２抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を抑制し、同時にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断してＴ細胞の免疫傷害活性を亢進させることで腫瘍細胞を傷害することができ、並びに二重特異性抗体におけるＨＥＲ２抗体のＦｃ部分がＮＫ細胞のＦｃ受容体に結合してＡＤＣＣ活性を亢進させることで腫瘍細胞を傷害することができ、Ｔリンパ球に対しては明らかな傷害効果を示さないことが確認できた。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【配列表】