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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-26
(45)【発行日】2022-11-04
(54)【発明の名称】Ｘ型コラーゲンアルファ－１アッセイ
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20221027BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20221027BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221027BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221027BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221027BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221027BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20221027BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20221027BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221027BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K7/06
C12N15/13
C12P21/08
C12N5/10
G01N33/53 D
G01N33/536 B
G01N33/536 C
G01N33/543 541B
G01N33/543 545A
C12N15/12
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2020503899
(86)(22)【出願日】2018-07-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-10-01
(86)【国際出願番号】 EP2018070430
(87)【国際公開番号】W WO2019020797
(87)【国際公開日】2019-01-31
【審査請求日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】1712071.8
(32)【優先日】2017-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】503259129
【氏名又は名称】ノルディック・ビオサイエンス・エー／エス
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＤＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ヘ，イー
(72)【発明者】
【氏名】イェンセン，アネ－セシリエ，バイ
(72)【発明者】
【氏名】カルスダル，モルテン
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１８０９９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／０３４１２８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１４－５２１０９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】BMC Musculoskeletal Disorders，2014年，Vol.15:309，pp.1-10
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）に含まれる、Ｘ型コラーゲンアルファ１のＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する、抗体。
【請求項2】
前記抗体は、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）に特異的に結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体は、前記アミノ酸配列Ｈ
２
Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のＮ－伸長された伸長型（Ｎ－ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）又は前記アミノ酸配列Ｈ
２
Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のＮ－切断された短縮型（Ｎ－ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）を、特異的に認識又は結合しない、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項5】
請求項４に記載の前記モノクローナル抗体を産生する、細胞株。
【請求項6】
生体試料において、Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片を検出するイムノアッセイの方法であって、当該方法は、前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含む前記生体試料を、請求項１から４のいずれかに記載の抗体と接触させることと、前記抗体の結合量を決定することとを含む、イムノアッセイの方法。
【請求項7】
検出は、定量的である、請求項６記載のイムノアッセイの方法。
【請求項8】
前記方法を用いて、生体液（ｂｉｏｆｌｕｉｄ）中の、前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を検出及び／又は定量化する、請求項６又は７に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項9】
前記生体液は、患者由来の生体液である、請求項８記載のイムノアッセイの方法。
【請求項10】
前記生体液は、血液、尿、滑液、血清、又は血漿である、請求項８又は９に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項11】
前記方法は、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイである、請求項６から１０のいずれか一項に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項12】
前記方法は、放射免疫測定法又は酵素結合免疫測定法である、請求項６から１１のいずれか一項に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項13】
前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を、疾患重症度がわかっている標準の疾患試料と関連させて、Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患の重症度を評価することをさらに含む、請求項６から１２のいずれか一項に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項14】
前記方法は、前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の前記断片の量を、健康な対象に関連する標準値と比較して、Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患の存在及び／又は重症度を評価することをさらに含む、請求項６から１３のいずれか一項に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項15】
前記Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患は、変形性関節症である、請求項１３又は１４に記載のイムノアッセイの方法。
【請求項16】
生体試料中の前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を決定するアッセイキットであって、当該キットは、請求項１から４のいずれか一項に記載したある抗体と、－ ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート、
－ Ｌは任意のリンカーである、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－Ｌ－ビオチン（配列番号５）、
－ サンドイッチイムノアッセイで使用する二次抗体、
－ 配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むキャリブレータペプチド、
－ 抗体ビオチン化キット、
－ 抗体ＨＲＰ標識キット、
－ 抗体放射標識キット、
－ アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つと、を備える、アッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｘ型コラーゲンアルファ１（type X collagen alpha 1）のＮ末端ネオエピトープ（neo-epitope）と特異的に反応する抗体、並びにＸ型コラーゲンアルファ１を検出及び定量化するイムノアッセイの方法における当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
変形性関節症（ＯＡ（osteoarthritis））は、軟骨傷害と関節機能の喪失とによって特徴づけられるよくある関節疾患である。ＯＡの病因には、加齢、肥満、外傷及び遺伝を含む複数の要因が含まれる［１］。ＯＡの発生機序は、当該疾患の異質性及び複雑性ゆえにほとんど解明されていない。
【0003】
注目すべきことには、ＯＡの特徴は、軟骨内骨化による骨格発達中の軟骨細胞分化過程に似ていることがある。健康な関節軟骨においては、軟骨細胞は、増殖及び最終分化に抵抗する。対照的に、疾患のある軟骨における軟骨細胞は、進行性に増殖して肥大化が発達する。さらに、関節軟骨の血管新生及び限局的な石灰化が惹起される［２～５］。軟骨細胞の分化を調節する分子事象は未だわかっていないが、ＯＡにおける軟骨細胞の肥大様変化は、研究のためにより注目されている［６～８］。
【0004】
Ｘ型コラーゲンアルファ－１
Ｘ型コラーゲンアルファ－１は非線維性であるが、軟骨コラーゲンと関連して微細な細胞周囲の線維を形成する。軟骨細胞培養から又は軟骨から単離される分子は、５９ｋＤａのＸ型コラーゲンのアルファ－１鎖のホモ三量体であり、またおよそ７５ｋＤａのＸ型コラーゲンの組換え分子の報告もある［９］。Ｘ型コラーゲンアルファ－１は、類似のドメイン構造をＶＩＩＩ型コラーゲンと共有し：５０ｋＤａの中央の三重らせん（ＣＯＬ１）ドメインの両脇に、Ｎ末端（ＮＣ２）及びＣ末端（ＮＣ１）の非三重らせんドメインが存在する［１０］。さらに、両コラーゲン型は、六方格子構造の主要な成分を表すものであって、そこでコラーゲン分子は、非三重らせん末端領域を巻き込む相互作用によって共に結合する。
Ｘ型コラーゲンアルファ－１は非線維性であるが、軟骨コラーゲンと関連して微細な細胞周囲の線維を形成する。軟骨細胞培養から又は軟骨から単離される分子は、５９ｋＤａのＸ型コラーゲンのアルファ－１鎖のホモ三量体であり、またおよそ７５ｋＤａのＸ型コラーゲンの組換え分子の報告もある［９］。Ｘ型コラーゲンアルファ－１は、類似のドメイン構造をＶＩＩＩ型コラーゲンと共有し：５０ｋＤａの中央の三重らせん（ＣＯＬ１）ドメインの両脇に、Ｎ末端（ＮＣ２）及びＣ末端（ＮＣ１）の非三重らせんドメインが存在する［１０］。さらに、両コラーゲン型は、六方格子構造の主要な成分を表すものであって、そこでコラーゲン分子は、非三重らせん末端領域を巻き込む相互作用によって共に結合する。
【0005】
Ｘ型コラーゲンアルファ－１の分布は、長管骨、椎骨及び肋骨の成長帯における正常な胎児の肥大軟骨、並びに成人（＞２１歳）では甲状軟骨に限られているが、軟骨内骨化中に軟骨基質が除去されるときに、それが局所的な崩壊を防止する足場となり得る［１１］。それはまた、骨の骨折仮骨において、変形性関節症軟骨において、及び軟骨形成腫瘍において見られ、また軟骨石灰化に関与し得る。
【0006】
変形性関節症（osteoarthritis）
ＯＡは概して、滑膜性の連結、主として膝及び臀部、の非炎症性疾患であると考えられている。軟骨細胞肥大及び軟骨石灰化は、ＯＡにおける重要な病理学的事象である。網目形成するＸ型コラーゲンの発現増加が、軟骨細胞肥大に特有のシグナルと考えられており［１２～１５］、したがってＸ型コラーゲンは、前記疾患のための検出可能なマーカーとして用いることが可能である。
ＯＡは概して、滑膜性の連結、主として膝及び臀部、の非炎症性疾患であると考えられている。軟骨細胞肥大及び軟骨石灰化は、ＯＡにおける重要な病理学的事象である。網目形成するＸ型コラーゲンの発現増加が、軟骨細胞肥大に特有のシグナルと考えられており［１２～１５］、したがってＸ型コラーゲンは、前記疾患のための検出可能なマーカーとして用いることが可能である。
【0007】
Ｘ型コラーゲン、ＭＭＰ１３、オステオポンチン、オステオカルシン［１６］、インディアンヘッジホッグ［１７］、Ｒｕｎｘ２［１８］、ＶＥＧＦ［１９］、ＨｔｒＡ１［２０］及びトランスグルタミナーゼ－２（ＴＧ－２）［２１］等、肥大軟骨細胞に関連するいくつかのタンパク質がある。Ｘ型コラーゲン及びＭＭＰ１３は、肥大軟骨細胞のマーカーとしてその中で最も広く用いられている。しかしながら、炎症及び機械的ストレスによって、軟骨細胞においてＭＭＰ１３の合成が誘発されることがある［２２～２３］。したがって、肥大軟骨細胞の特異的マーカーとしてのＸ型コラーゲンが、軟骨細胞の表現型変化を示すことが可能である。
【0008】
このように、生体試料中のＸ型コラーゲン又はその断片の量を正確に定量化する方法により、例えばＯＡである、Ｘ型コラーゲンの代謝回転に影響するＸ型コラーゲンの病理又は生理的プロセスのさらなる理解が可能になり得る。明らかに、こうした方法が要望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ここで、発明者は、カテプシンＫが４７８Ａ～Ｇ４７９間のペプチド結合においてＸ型コラーゲンアルファ１を切断し、結果的にＮ末端ネオエピトープバイオマーカーＨ２Ｎ－４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）の形成を生じるということを発見した。Ｘ型コラーゲンアルファ１のこのネオエピトープバイオマーカーが、変形性関節症とよく相関することを示した。
【課題を解決するための手段】
【0010】
このように、第１の態様においては、本発明は抗体に関するものであって、前記抗体は、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）に含まれる、Ｘ型コラーゲンアルファ１のＮ末端ネオエピトープに特異的に結合する。
【0011】
好ましくは、上記抗体は、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）に特異的に結合する。
【0012】
好ましくは、上記抗体は、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ－伸長された伸長型（N-extended elongated version）を、特異的に認識又は結合しない。この点において、「前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ－伸長された伸長型」とは、配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のＮ末端をこえて１又は複数のアミノ酸が伸びていることを意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）が、アラニン残基によって伸長している場合には、対応する「Ｎ－伸長された伸長型」は、Ｈ２Ｎ－ＡＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ・・・（配列番号３）となることとなる。同様に、上記抗体は、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ－切断された短縮型（N-truncated shortened version）を、特異的に認識又は結合しないことが好ましい。この点において、「前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ－切断された短縮型」とは、配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のＮ末端から１又は複数のアミノ酸が除去されていることを意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）が、１個のアミノ酸残基だけ短縮した場合には、対応する「Ｎ－切断された短縮型」は、Ｈ２Ｎ－ＩＡＴＫＧＬＮＧＰ・・・（配列番号４）となることとなる。
【0013】
上記抗体は、モノクローナル抗体又はその断片であることが好ましい。この発明には、こうしたモノクローナル抗体又はその断片を産生する細胞株が含まれる。
【0014】
第２の態様においては、本発明は、生体試料において、Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片を検出するイムノアッセイの方法に関し、当該方法は、前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含む前記生体試料を、上記に記載したある抗体と接触させることと、前記抗体の結合量を決定することとを含む。
【0015】
好ましくは、前記方法は、定量的である。
【0016】
好ましくは、前記方法を用いて、生体液（biofluid）中の、Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を検出及び／又は定量化する。
【0017】
上記生体液は、患者由来の生体液であり得る。生体液は、血液、尿、滑液、血清、血漿、又は羊水であり得るが、これに限定されない。
【0018】
イムノアッセイの方法は、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイであり得るが、これに限定されない。イムノアッセイの方法は、放射免疫測定法又は酵素結合免疫測定法であり得るが、これに限定されない。
【0019】
方法は、前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を、疾患重症度がわかっている標準の疾患試料と関連させて、Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患の重症度を評価することをさらに含み得る。
【0020】
あるいは、又は追加として、方法は、前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の前記断片の量を、健康な対象に関連する標準値と比較して、Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患の存在及び／又は重症度を評価することをさらに含み得る。
【0021】
この点に関して、前記方法は、前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を、重症度がわかっている標準の変形性関節症試料と関連させることをさらに含み得る。
【0022】
同様に、前記方法は、前記方法で決定された前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を、年齢と性別がわかっている対象における重症度がわかっている標準の変形性関節症試料と、及び／又は健康な対象に関連する標準値とに関連させて、変形性関節症の存在及び／又は重症度を評価することをさらに含み得る。この点において、試料の比較は、患者由来の試料間におけるものであって、当該患者（当該試料が由来する）は、標準の試料に対して、同じ性別且つ同様の年齢のものであることが好ましい。
【0023】
方法は、第１の時点及びそれに続く少なくとも１つの時点において対象から取得した少なくとも２つの試料中の前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量を定量化することをさらに含み得、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までの前記断片の量の変化は、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までのＸ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患の状態の変化を示す。
【0024】
例えば、上記Ｘ型コラーゲンアルファ１に関連する疾患は、変形性関節症であり、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までの前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量の増加は、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までの対象における変形性関節症の悪化を示す。同様に、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までの前記Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片の量の減少は、上記第１の時点から上記それに続く少なくとも１つの時点までの対象における変形性関節症の改善を示す。
【0025】
最後の態様においては、本発明は、生体試料中のＮ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片を検出するアッセイキットに関し、当該キットは、上記に記載したある抗体と、
－ ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート、
－ Ｌは任意のリンカーである、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－Ｌ－ビオチン（配列番号５）、
－ サンドイッチイムノアッセイで使用する二次抗体、
－ 配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰを含むキャリブレータペプチド、
－ 抗体ビオチン化キット、
－ 抗体ＨＲＰ標識キット、
－ 抗体放射標識キット、
－ アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つとを備える。
－ ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレート、
－ Ｌは任意のリンカーである、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－Ｌ－ビオチン（配列番号５）、
－ サンドイッチイムノアッセイで使用する二次抗体、
－ 配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰを含むキャリブレータペプチド、
－ 抗体ビオチン化キット、
－ 抗体ＨＲＰ標識キット、
－ 抗体放射標識キット、
－ アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つとを備える。
【0026】
定義
本明細書で用いる場合、「Ｎ末端」の語は、ポリペプチドの末端、すなわち該ポリペプチドのＮ末端端部における末端を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきでない。
本明細書で用いる場合、「Ｎ末端」の語は、ポリペプチドの末端、すなわち該ポリペプチドのＮ末端端部における末端を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるべきでない。
【0027】
本明細書で用いる場合、「Ｎ末端ネオエピトープ」の語は、プロテアーゼによるタンパク質の切断によって形成されるＮ末端エピトープを指す。本発明では、これは、カテプシンＫによるＸ型コラーゲンアルファ１の切断によって形成されるＮ末端エピトープを意味する。
【0028】
本明細書で用いる場合、「Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片」の語は、Ｘ型コラーゲンアルファ１のペプチド断片を意味し、当該ペプチド断片のＮ末端は、アミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ・・・（配列番号１）である。
【0029】
本明細書で用いる場合、「競合ＥＬＩＳＡ」の語は、競合酵素結合免疫測定法を指し、また当業者にとって公知の技術である。
【0030】
本明細書で用いる場合、「サンドイッチイムノアッセイ」の語は、試料中のある抗体を検出するための少なくとも２つの抗体の使用を指し、また当業者にとって公知の技術である。
【0031】
本明細書で用いる場合、「Ｃｏｌ１０ｎｅｏ」の語は、簡潔に、Ｎ末端ネオエピトープアミノ酸配列Ｈ２Ｎ－ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を含むＸ型コラーゲンアルファ１の断片を検出及び定量化するための本明細書に開示の特有のアッセイを記述するために用いる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１は、ｍＡｂのペプチド結合特異性である。ビオチン化合成ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）に対する２Ｆ４の反応性は、１０００ｎｇ／ｍＬの選択ペプチドを加えることによって完全に動いた。対照的に、伸長された選択ペプチド又は切断された選択ペプチドでは、同じ濃度で、動きはわずかに観察されたか又は観察されなかった。
【図2】図２は、インビトロでの酵素による軟骨の切断である。２Ａは、ＭＭＰで切断したヒト軟骨である。２Ｂは、ＡＤＡＭＴＳで切断したヒト軟骨である。２Ｃは、カテプシンＫで切断したヒト軟骨である。データは、平均±ＳＤとして示される。消化緩衝液中にプロテアーゼを添加しないものと比較して、試験したＭＭＰ又はＡＤＡＭＴＳ溶液のいずれにおいても、Ｃｏｌ１０／Ｃレベルの増加はなかった。反対に、カテプシンＫは、最大量をもたらしたが、これはネオエピトープ４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰを支持する断片を放出するその能力を示す。
【図3】図３は、軟骨における４７９ＧＩＡＴＫＧの免疫局在性である。３Ａは、正常マウスＩｇＧである。３Ｂは、１１Ｇ８、抗－Ｘ型コラーゲンＣ末端抗体（anti-C terminus of type X collagen）である。３Ｃは、２Ｆ４、抗－４７９ＧＩＡＴＫＧ抗体である。１１Ｇ８により検出されたＸ型コラーゲンは、深層における軟骨細胞の細胞外基質中で生じたが、それは石灰化軟骨Ｃの領域には不在であった。驚くべきことに、４７９ＧＩＡＴＫＧの強い染色が、軟骨内の全ての層からの軟骨細胞の細胞外基質中で確認された。スケールバー＝５００μＭ
【図4】図４は、Ｃ４Ｐａｉｎ研究での対象の血漿中のＫＬグレード及びＣｏｌ１０ｎｅｏレベル間における関連である。当該データは、平均±９５ＣＩ％として示した。４Ａは、異なるＫ／Ｌ群における血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルである。Ｋ／Ｌグレードが高いと、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルが高い傾向があったが、統計学的有意性には達していない。４Ｂは、三分位数での、血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルがＫ／Ｌ３～４である対象の分布である。一元配置分散分析（one-way ANOVA）を、ポストホックでのチューキー・クレーマー検定と共に用いた。血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏデータは、全分析において対数変換した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。
【図5】図５は、ＮＹＵＨＪＤ進行研究における血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルである。当該データは、平均±９５ＣＩ％として示した。血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏは、健康な対照（ｐ＝０．０００２）又はＲＡ（ｐ＜０．０００１）よりもＯＡでは統計学的に高かった。健康な対照及びＲＡでは有意差は見られなかった。一元配置分散分析を、ポストホックでのチューキー・クレーマー検定と共に用いた。血漿Ｃｏｌ１０／Ｃａｔデータは、全分析において対数変換した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。ｐ＜０．０５であれば１アスタリスク（＊）、ｐ＜０．０１であれば２アスタリスク（＊＊）、ｐ＜０．００１であれば３アスタリスク（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１であれば４アスタリスク（＊＊＊＊）である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
実施例
【実施例】
【0034】
ここで開示する実施形態は以下の実施例で説明するが、これらは、この開示の理解を助けるために明記するのであり、後に続く特許請求の範囲において規定される開示の範囲を何らかの形で限定するものとして解釈されるべきでない。以下の実施例は、説明する実施形態の作製及び使用方法の完全な開示と説明とを当業者に提供するために出すものであり、本開示の範囲を限定することを意図せず、又は、以下の実験が全てである若しくは実行された実験のみであるということを表すことも意図していない。用いる数字（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保する努力は行ったが、一部の実験的誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示していない限り、部分は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、セ氏温度であり、また圧力は、大気圧又は大気圧付近である。
【0035】
以下の実施例では、以下の物質及び方法を採用した。
【0036】
物質
別途記載していない限り、実験に用いる全ての物質は、高品質のものであり、またシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）（デンマーク国、コペンハーゲン）又はＶＷＲ社（デンマーク国、Ｒｏｄｅｄｏｖｒｅ）より注文した。モノクローナル抗体産生及びアッセイ開発に用いた合成ペプチドは、ジェンスクリプト社（GenScript）（米国）から購入した。ＭＭＰ－２触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ０２Ｃ）、ＭＭＰ－９触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ０９Ｃ）及びＭＭＰ－１３触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ１３Ｃ）は、Ｇｉｔｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（イタリア国、フローレンス）より購入した。カテプシンＫ（カタログ番号２１９４６１）、カテプシンＢ（カタログ番号２１９３６２）及びカテプシンＳ（カタログ番号２１９３４３）及びＡＤＡＭＴＳ－４（カタログ番号ＣＣ１０２８）は、メルクミリポア社（Merck Millipore）（独国、ダルムシュタット）からとした。ＡＤＡＭＴＳ－５（カタログ番号２１９８－ＡＤ－２０）は、Ｒ＆Ｄシステム社（R&D system）（米国、ミネソタ州）から購入した。
別途記載していない限り、実験に用いる全ての物質は、高品質のものであり、またシグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich）（デンマーク国、コペンハーゲン）又はＶＷＲ社（デンマーク国、Ｒｏｄｅｄｏｖｒｅ）より注文した。モノクローナル抗体産生及びアッセイ開発に用いた合成ペプチドは、ジェンスクリプト社（GenScript）（米国）から購入した。ＭＭＰ－２触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ０２Ｃ）、ＭＭＰ－９触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ０９Ｃ）及びＭＭＰ－１３触媒ドメイン（カタログ番号Ｇ０４ＭＰ１３Ｃ）は、Ｇｉｔｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（イタリア国、フローレンス）より購入した。カテプシンＫ（カタログ番号２１９４６１）、カテプシンＢ（カタログ番号２１９３６２）及びカテプシンＳ（カタログ番号２１９３４３）及びＡＤＡＭＴＳ－４（カタログ番号ＣＣ１０２８）は、メルクミリポア社（Merck Millipore）（独国、ダルムシュタット）からとした。ＡＤＡＭＴＳ－５（カタログ番号２１９８－ＡＤ－２０）は、Ｒ＆Ｄシステム社（R&D system）（米国、ミネソタ州）から購入した。
【0037】
免疫化のための配列の選択
ＯＡ患者からのヒト尿中に自然に生じるペプチドについての分析を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで行った。ヒトＯＡ尿において、有意な量のペプチド断片を同定した。ヒトＸ型コラーゲンに特有である、１７のペプチド配列が見られた。アミノ酸（ａａ）４７８’位にある（アクセッション番号：Ｑ０３６９２；データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ）、同一の遊離Ｃ末端を支持する１７の配列のうちの２つが、疾患患者の尿中に存在したが、これはＡ４７８－４７９Ｇ結合間において切断が起こることを示す。この切断によって生じた遊離Ｎ末端のはじめの１０個のａａ、４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ４８８（配列番号１）が、免疫化のために選択された。異なる種からの配列アラインメントもまた、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（表１を参照）を用いて分析した。
ＯＡ患者からのヒト尿中に自然に生じるペプチドについての分析を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで行った。ヒトＯＡ尿において、有意な量のペプチド断片を同定した。ヒトＸ型コラーゲンに特有である、１７のペプチド配列が見られた。アミノ酸（ａａ）４７８’位にある（アクセッション番号：Ｑ０３６９２；データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ）、同一の遊離Ｃ末端を支持する１７の配列のうちの２つが、疾患患者の尿中に存在したが、これはＡ４７８－４７９Ｇ結合間において切断が起こることを示す。この切断によって生じた遊離Ｎ末端のはじめの１０個のａａ、４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ４８８（配列番号１）が、免疫化のために選択された。異なる種からの配列アラインメントもまた、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（表１を参照）を用いて分析した。
【0038】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）産生
６～７週齢のメスＢａｌｂ／Ｃマウス６例を、シグマアジュバントシステム（Sigma Adjuvant System（登録商標））（カタログ番号Ｓ６３２２、シグマアルドリッチ社）で乳化したＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ＧＧＣ－ＫＬＨ（配列番号６）で皮下免疫した。アジュバントで乳化したＫＬＨコンジュゲート１００μｇを、安定な力価レベルが得られるまで２週間おきにマウスに繰り返し投与した。各採血（bleeding）時に、ストレプトアビジンで被覆したマイクロプレート（ロシェ・ダイアグノスティック社（Roche Diagnostics）、独国）上に被覆させたビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）に対する、血清の抗体価を測定した。選択ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）に対して最も高い抗体価及び最良の反応性をもつマウスを、融合のために選択した（データは示さず）。選択したマウスを、融合のために屠殺する３日前に、１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中の１００μｇのＫＬＨコンジュゲートで、腹腔内（ｉ．ｐ．）に追加免疫した。融合及び抗体スクリーニングのプロセスは、標準技術を用いて実行した。簡潔には、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８１（商標））と融合させる脾細胞の単離のため、脾臓を外科的に取り出した。ＨＡＴ（ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン）培地を用いて、ハイブリドーマ細胞を選択した。間接ＥＬＩＳＡで、上清をスクリーニングしたが、ここではビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）を、ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロプレート上に被覆させた。標準の限界希釈法を行って、シングルセルを選択した。上清中の抗体のアイソタイプを、アイソタイプ決定キット、ＳＢＡクロノタイピングシステム－ＨＲＰ（SBA Clonotyping System-HRP）（５３００－０５、サザンバイオテック社（Southern Biotech））を用いて試験した。シングルセル由来のハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、それらをさらに増殖させて、最終的にＴ２５フラスコからＴ１７５フラスコまで拡大した。上清を回収して、０．２μｍフィルターでろ過した後、抗体精製のために、１ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラム（カタログ番号１７－０４０４－０１、ＧＥヘルスケア社（GE healthcare））に適用した。
６～７週齢のメスＢａｌｂ／Ｃマウス６例を、シグマアジュバントシステム（Sigma Adjuvant System（登録商標））（カタログ番号Ｓ６３２２、シグマアルドリッチ社）で乳化したＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ＧＧＣ－ＫＬＨ（配列番号６）で皮下免疫した。アジュバントで乳化したＫＬＨコンジュゲート１００μｇを、安定な力価レベルが得られるまで２週間おきにマウスに繰り返し投与した。各採血（bleeding）時に、ストレプトアビジンで被覆したマイクロプレート（ロシェ・ダイアグノスティック社（Roche Diagnostics）、独国）上に被覆させたビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）に対する、血清の抗体価を測定した。選択ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）に対して最も高い抗体価及び最良の反応性をもつマウスを、融合のために選択した（データは示さず）。選択したマウスを、融合のために屠殺する３日前に、１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中の１００μｇのＫＬＨコンジュゲートで、腹腔内（ｉ．ｐ．）に追加免疫した。融合及び抗体スクリーニングのプロセスは、標準技術を用いて実行した。簡潔には、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８１（商標））と融合させる脾細胞の単離のため、脾臓を外科的に取り出した。ＨＡＴ（ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン）培地を用いて、ハイブリドーマ細胞を選択した。間接ＥＬＩＳＡで、上清をスクリーニングしたが、ここではビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）を、ストレプトアビジンで予め被覆したマイクロプレート上に被覆させた。標準の限界希釈法を行って、シングルセルを選択した。上清中の抗体のアイソタイプを、アイソタイプ決定キット、ＳＢＡクロノタイピングシステム－ＨＲＰ（SBA Clonotyping System-HRP）（５３００－０５、サザンバイオテック社（Southern Biotech））を用いて試験した。シングルセル由来のハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、それらをさらに増殖させて、最終的にＴ２５フラスコからＴ１７５フラスコまで拡大した。上清を回収して、０．２μｍフィルターでろ過した後、抗体精製のために、１ｍＬのＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラム（カタログ番号１７－０４０４－０１、ＧＥヘルスケア社（GE healthcare））に適用した。
【0039】
４７９ＧＩＡＴＫＧ特異的イムノアッセイ（Ｃｏｌ１０ｎｅｏ）
精製したモノクローナル抗体は、はじめに、３つの合成ペプチドである選択ペプチド（ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号１）、伸長された選択ペプチド（ＡＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号３）及び切断された選択ペプチド（ＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号４）によりペプチド結合特異性を試験し、次いで競合イムノアッセイで用いた。緩衝液、温度、インキュベーション時間、及び重要試薬の濃度により最適化後の、４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）検出のアッセイのための最終プロトコールを、以下のとおり開発した：９６ウェルのストレプトアビジンで予め被覆したマイクロプレートを、３０分間、２０℃で、５０ｍＭのＰＢＳ－ＢＴＢ緩衝液（ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）中に溶解した１ｎｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）で被覆した。次いで、当該プレートを、標準洗浄緩衝液（２０ｍＭのトリス（Tris）、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。２０μＬのペプチド標準、キットコントロール又は試料を、適切なウェルに加えて、それに５％オステオカルシンＥＩＡ Ｐｕｆ－Ｌｉｑ（ロシェ・ダイアグノスティック社、独国）を含有する５０ｍＭのＰＢＳ－ＢＴＢ緩衝液中の２３ｎｇ／ｍｌモノクローナル抗体１００μＬを続けて、４℃で一晩（２０±１時間）インキュベートした。５回洗浄後、１００μＬのヒツジ抗－マウス二次抗体（１１５－０３５－００３、ジャクソンイムノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch））を添加して、１時間、２０℃でインキュベートした。このステップの後、当該プレートを、洗浄緩衝液で５回洗浄した。最後に、１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加し、暗所で１５分間、２０℃でインキュベートした。比色反応を、１００μＬの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を添加して停止し、４５０ｎｍで６５０ｎｍを参照として測定した。
精製したモノクローナル抗体は、はじめに、３つの合成ペプチドである選択ペプチド（ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号１）、伸長された選択ペプチド（ＡＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号３）及び切断された選択ペプチド（ＩＡＴＫＧＬＮＧＰ；配列番号４）によりペプチド結合特異性を試験し、次いで競合イムノアッセイで用いた。緩衝液、温度、インキュベーション時間、及び重要試薬の濃度により最適化後の、４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）検出のアッセイのための最終プロトコールを、以下のとおり開発した：９６ウェルのストレプトアビジンで予め被覆したマイクロプレートを、３０分間、２０℃で、５０ｍＭのＰＢＳ－ＢＴＢ緩衝液（ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ－２０を含むリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）中に溶解した１ｎｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）で被覆した。次いで、当該プレートを、標準洗浄緩衝液（２０ｍＭのトリス（Tris）、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。２０μＬのペプチド標準、キットコントロール又は試料を、適切なウェルに加えて、それに５％オステオカルシンＥＩＡ Ｐｕｆ－Ｌｉｑ（ロシェ・ダイアグノスティック社、独国）を含有する５０ｍＭのＰＢＳ－ＢＴＢ緩衝液中の２３ｎｇ／ｍｌモノクローナル抗体１００μＬを続けて、４℃で一晩（２０±１時間）インキュベートした。５回洗浄後、１００μＬのヒツジ抗－マウス二次抗体（１１５－０３５－００３、ジャクソンイムノリサーチ社（Jackson ImmunoResearch））を添加して、１時間、２０℃でインキュベートした。このステップの後、当該プレートを、洗浄緩衝液で５回洗浄した。最後に、１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加し、暗所で１５分間、２０℃でインキュベートした。比色反応を、１００μＬの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を添加して停止し、４５０ｎｍで６５０ｎｍを参照として測定した。
【0040】
プレート間及びプレート内の変動を、デュプリケートでの精度管理パネルの１０の独立の操作（３つのヒト血清及び２つのペプチド標準）によって決定した。検出下限（ＬＬＯＤ）は、２１個のゼロ標準の平均値の３ＳＤとして計算した。複数のヒト血清又は血漿の試料について、そのままのもの、インキュベーション緩衝液中で２倍のもの、４倍のもの、６倍のもの、８倍のもの、１６倍のものを検定した。回収率は、希釈のために補正した期待濃度で除算した測定濃度として計算した。
【0041】
インビトロでのヒト軟骨の切断
膝置換手術を受けた変形性関節症（ＯＡ）患者からの関節軟骨生検を、ゲントフテ病院（Gentofte Hospital）（デンマーク国、ゲントフテ）より取得した。検体の回収は、ヒト試料及び患者情報の取り扱いに関する国際倫理ガイドラインに沿って実施した。全ての参加者がインフォームドコンセントに署名し、またこの研究はデンマーク当局によって承認された。Ａ４７８－４７９Ｇ結合の切断の原因となっている酵素を同定するため、軟骨を、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１３）、カテプシン（ＣａｔＫ、ＣａｔＢ及びＣａｔＳ）、並びにトロンボスポンジンモチーフを含むＡディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン（ＡＤＡＭＴＳ－４及びＡＤＡＭＴＳ－５）を含む、多数のプロテアーゼによって切断した。急速凍結し破砕した軟骨３０ｍｇを、１μｇの各酵素と共に、２５０μＬの消化緩衝液（ＭＭＰ用の消化緩衝液：１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び２ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ８．０；ＡＤＡＭＴＳ用の消化緩衝液：５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＣａＣＬ２、ｐＨ７，５；カテプシン用の消化緩衝液：２５ｍＭのＮＡ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５）を含む、０，５ｍｌのエッペンドルフに入れた。消化は、１日で、２反復実験で行った。５ｍＭのＥＤＴＡ（ＭＭＰ及びＡＤＡＭＴＳ用の広域スペクトルの阻害剤）及び５ｍＭのＥ６４（カテプシン用の広域スペクトルの阻害剤）を添加して、反応を停止した。全ての上清を、使用するまで－８０℃で保存した。
膝置換手術を受けた変形性関節症（ＯＡ）患者からの関節軟骨生検を、ゲントフテ病院（Gentofte Hospital）（デンマーク国、ゲントフテ）より取得した。検体の回収は、ヒト試料及び患者情報の取り扱いに関する国際倫理ガイドラインに沿って実施した。全ての参加者がインフォームドコンセントに署名し、またこの研究はデンマーク当局によって承認された。Ａ４７８－４７９Ｇ結合の切断の原因となっている酵素を同定するため、軟骨を、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９及びＭＭＰ１３）、カテプシン（ＣａｔＫ、ＣａｔＢ及びＣａｔＳ）、並びにトロンボスポンジンモチーフを含むＡディスインテグリン及びメタロプロテアーゼドメイン（ＡＤＡＭＴＳ－４及びＡＤＡＭＴＳ－５）を含む、多数のプロテアーゼによって切断した。急速凍結し破砕した軟骨３０ｍｇを、１μｇの各酵素と共に、２５０μＬの消化緩衝液（ＭＭＰ用の消化緩衝液：１００ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び２ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ８．０；ＡＤＡＭＴＳ用の消化緩衝液：５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＣａＣＬ２、ｐＨ７，５；カテプシン用の消化緩衝液：２５ｍＭのＮＡ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５）を含む、０，５ｍｌのエッペンドルフに入れた。消化は、１日で、２反復実験で行った。５ｍＭのＥＤＴＡ（ＭＭＰ及びＡＤＡＭＴＳ用の広域スペクトルの阻害剤）及び５ｍＭのＥ６４（カテプシン用の広域スペクトルの阻害剤）を添加して、反応を停止した。全ての上清を、使用するまで－８０℃で保存した。
【0042】
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）
ＩＨＣのための骨検体を伴う軟骨は、デンマーク当局によって承認された、フレズレクスハウン病院（Frederikshavn Hospital）（デンマーク国）との協力での研究（Ｎ－２０１１００３１）からのものとした。全ての参加者が、インフォームドコンセントに署名した。膝置換手術を受けたＯＡ患者から単離した検体を固定して脱灰し、次いでパラフィンに包埋した。厚さ５μｍの軟骨切片を、６０℃で１時間融解させ、脱パラフィンを行って水和し、その後にプロナーゼＥ（カタログ番号１０１６５９２１００１、ロシェ社（Roche））を用いて３７℃で１０分間の抗原回復が続いた。当該切片は、室温で３０分間、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の０．５％カゼインによって処理して、非特異的な結合をブロッキングした。本研究で開発した抗体ＮＢ１１７－２Ｆ４と、先に開発された抗体ＮＢ５０９－１１Ｇ８とによって、免疫染色を行った。免疫反応性は、ペルオキシダーゼで標識した抗－マウス抗体及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｄａｋｏ社、デンマーク国）により視覚化した。対比染色には、マイヤー社（Mayer）のヘマトキシリンを用いた。オリンパスＣ５０５０デジタルカメラを装備したオリンパス顕微鏡ＢＸ６０により、写真を撮影した。
ＩＨＣのための骨検体を伴う軟骨は、デンマーク当局によって承認された、フレズレクスハウン病院（Frederikshavn Hospital）（デンマーク国）との協力での研究（Ｎ－２０１１００３１）からのものとした。全ての参加者が、インフォームドコンセントに署名した。膝置換手術を受けたＯＡ患者から単離した検体を固定して脱灰し、次いでパラフィンに包埋した。厚さ５μｍの軟骨切片を、６０℃で１時間融解させ、脱パラフィンを行って水和し、その後にプロナーゼＥ（カタログ番号１０１６５９２１００１、ロシェ社（Roche））を用いて３７℃で１０分間の抗原回復が続いた。当該切片は、室温で３０分間、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中の０．５％カゼインによって処理して、非特異的な結合をブロッキングした。本研究で開発した抗体ＮＢ１１７－２Ｆ４と、先に開発された抗体ＮＢ５０９－１１Ｇ８とによって、免疫染色を行った。免疫反応性は、ペルオキシダーゼで標識した抗－マウス抗体及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ、Ｄａｋｏ社、デンマーク国）により視覚化した。対比染色には、マイヤー社（Mayer）のヘマトキシリンを用いた。オリンパスＣ５０５０デジタルカメラを装備したオリンパス顕微鏡ＢＸ６０により、写真を撮影した。
【0043】
研究参加者
血漿試料を、２つの研究、地域の倫理委員会によって承認されたＣ４Ｐａｉｎ研究（Ｎ－２０１０００９４）［２４］と、地域の倫理委員会によって承認されたＮＹＵＨＪＤ進行研究［２５、２６］とから回収した。全ての参加者から、登録前にインフォームドコンセントが得られた。
血漿試料を、２つの研究、地域の倫理委員会によって承認されたＣ４Ｐａｉｎ研究（Ｎ－２０１０００９４）［２４］と、地域の倫理委員会によって承認されたＮＹＵＨＪＤ進行研究［２５、２６］とから回収した。全ての参加者から、登録前にインフォームドコンセントが得られた。
【0044】
簡潔には、Ｃ４Ｐａｉｎは、クロスセクショナル研究である。これはケルグレン／ローレンス（Ｋ／Ｌ）分類（Kellgren/Lawrance (K/L) grading scale）（Ｋ／Ｌ ０～４）を用いた、関節変性がない者から重症な関節変性の者まで２８１例の個体を含んだ。本研究において２５３例の登録者からの血漿試料を測定したが、これは他２８例の試料は量が不十分であったことに起因した。
【0045】
ＮＹＵＨＪＤ進行研究は、ベースライン時に、２１例の非ＯＡの健康な対照（Ｋ／Ｌ≦１且ついずれの膝にも疼痛がない）、１４６例のＯＡ患者（Ｋ／Ｌ≧２）及び３６例の関節リウマチ（ＲＡ）患者を含んだ。ＯＡ患者１４６例は、２４ヶ月の間、さらに追跡調査した。ベースライン及び２４ヶ月にＸ線撮影評価を行い、またベースライン時に血漿を採取した。ベースライン時における非ＯＡの健康な対照２０例、ＯＡ対象１４２例及びＲＡ対象３４例からの血漿試料が、本研究の測定に利用可能であった。しかしながら、本研究では、ベースライン時における異なる群のＣｏｌ１０ｎｅｏレベルを調査したのみであった。今後の研究は、ＯＡにおけるＸ線撮影での進行の潜在的な予後徴候のバイオマーカーとしてのＣｏｌ１０ｎｅｏのさらなる全体像に近づくために継続される。
【0046】
統計
データは、グラフパッドプリズム６（GraphPad Prism 6）又はメッドカルク１６．８（MedCalc 16.8）により分析した。正常性確認のため、関心の変数全てに関してシャプリオ－ウィルク検定（Shaprio-Wilk test）を行った。年齢、ＢＭＩ及びＶＡＳスコアでの群比較の間において、一元配置分散分析を、ポストホックでのチューキー・クレーマー検定と共に用いた。血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏデータは、全分析において対数変換した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。ｐ＜０．０５であれば１アスタリスク（＊）、ｐ＜０．０１であれば２アスタリスク（＊＊）、ｐ＜０．００１であれば３アスタリスク（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１であれば４アスタリスク（＊＊＊＊）である。
データは、グラフパッドプリズム６（GraphPad Prism 6）又はメッドカルク１６．８（MedCalc 16.8）により分析した。正常性確認のため、関心の変数全てに関してシャプリオ－ウィルク検定（Shaprio-Wilk test）を行った。年齢、ＢＭＩ及びＶＡＳスコアでの群比較の間において、一元配置分散分析を、ポストホックでのチューキー・クレーマー検定と共に用いた。血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏデータは、全分析において対数変換した。Ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意と考えた。ｐ＜０．０５であれば１アスタリスク（＊）、ｐ＜０．０１であれば２アスタリスク（＊＊）、ｐ＜０．００１であれば３アスタリスク（＊＊＊）、ｐ＜０．０００１であれば４アスタリスク（＊＊＊＊）である。
【0047】
結果
ペプチド選択
種間の選択されたペプチドの配列アラインメント
同一の遊離Ｃ末端を共有する２つの断片４６３ＰＧＳＫＧＤＰＧＳＰＧＰＰＧＰＡ４７８（配列番号７）と４６５ＳＫＧＤＰＧＳＰＧＰＰＧＰＡ４７８（配列番号８）とが、ＯＡ患者の尿中において質量分析法で同定されたが、これはＡ４７８－４７９Ｇ間において切断部位の存在があることを示す。切断によって生じた遊離Ｎ末端の１０ａａペプチド４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）が、免疫化のために選択された。ブラスト（blast）により、この配列は、ヒトタンパク質のうち、Ｘ型コラーゲンアルファ１に特有であることが示された。種間の配列類似性は、ヒト及びマウス間で１００％の同一性を示すが、一方ヒト配列と比較して、ラット又はウシでは不適正のａａが含まれる。
ペプチド選択
種間の選択されたペプチドの配列アラインメント
同一の遊離Ｃ末端を共有する２つの断片４６３ＰＧＳＫＧＤＰＧＳＰＧＰＰＧＰＡ４７８（配列番号７）と４６５ＳＫＧＤＰＧＳＰＧＰＰＧＰＡ４７８（配列番号８）とが、ＯＡ患者の尿中において質量分析法で同定されたが、これはＡ４７８－４７９Ｇ間において切断部位の存在があることを示す。切断によって生じた遊離Ｎ末端の１０ａａペプチド４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）が、免疫化のために選択された。ブラスト（blast）により、この配列は、ヒトタンパク質のうち、Ｘ型コラーゲンアルファ１に特有であることが示された。種間の配列類似性は、ヒト及びマウス間で１００％の同一性を示すが、一方ヒト配列と比較して、ラット又はウシでは不適正のａａが含まれる。
【0048】
【表1】
【0049】
Ｃｏｌ１０ｎｅｏアッセイの技術的性能
４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）を標的とするモノクローナル抗体２Ｆ４（アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ、κ）を、ハイブリドーマから産生し、ＨｉＴｒａｐプロテインＧアフィニティカラム（カタログ番号１７－０４０４－０１、ＧＥヘルスケア社）により精製した。ペプチド結合特異性の試験において、ビオチン化合成ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）に対する２Ｆ４の反応性は、１０００ｎｇ／ｍＬの選択ペプチドを加えることによって、完全に動いた。対照的に、伸長された選択ペプチド又は切断された選択ペプチドでは、同じ濃度で、動きはわずかに観察されたか又は観察されなかった（図１）。このことは、開発した抗体２Ｆ４が選択ペプチドに対して特異的であるということを示した。
４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）を標的とするモノクローナル抗体２Ｆ４（アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ、κ）を、ハイブリドーマから産生し、ＨｉＴｒａｐプロテインＧアフィニティカラム（カタログ番号１７－０４０４－０１、ＧＥヘルスケア社）により精製した。ペプチド結合特異性の試験において、ビオチン化合成ペプチドＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ－ｋ（ビオチン）（配列番号５）に対する２Ｆ４の反応性は、１０００ｎｇ／ｍＬの選択ペプチドを加えることによって、完全に動いた。対照的に、伸長された選択ペプチド又は切断された選択ペプチドでは、同じ濃度で、動きはわずかに観察されたか又は観察されなかった（図１）。このことは、開発した抗体２Ｆ４が選択ペプチドに対して特異的であるということを示した。
【0050】
したがって、高い特異性を示す抗体２Ｆ４を、競合ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｃｏｌ１０ｎｅｏに適用した。本アッセイの技術的性能を、表２に要約して列記した。ＩＣ５０は４１．９ｎｇ／ｍＬであった。アッセイ内の係数変動（coefficient variation）（ＣＶ％）は３％であり、アッセイ間のＣＶ％は１１．８であった。測定範囲は８～２５０ｎｇ／ｍＬであった。血清の４倍から３２倍希釈及びＥＤＴＡ抗凝固処理血漿の８倍から６４倍希釈の広範囲にわたって、線形性は良好であった。
【0051】
【表2】
【0052】
カテプシンＫ由来の４７９ＧＩＡＴＫＧ
Ａ４７８－４７９Ｇ結合の切断の原因となる酵素を調査するため、いくつかのプロテアーゼを、ヒト軟骨と共に個々にインキュベートした。全てのプロテアーゼは、同一の酵素濃度とし、また全てのインキュベーションは、同一のインキュベーション時間で実行した。４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のネオエピトープを生成する、プロテアーゼ毎の相対効率を、Ｃｏｌ１０ｎｅｏアッセイに適用することによって評価した。消化緩衝液中にプロテアーゼを添加しないものと比較して、試験したＭＭＰ又はＡＤＡＭＴＳ溶液のいずれにおいても、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルの増加はなかった（図２Ａ及び２Ｂ）。反対に、カテプシンＫは、最大量をもたらしたが、これはネオエピトープ４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を支持する断片を放出するその能力を示す（図２Ｃ）。
Ａ４７８－４７９Ｇ結合の切断の原因となる酵素を調査するため、いくつかのプロテアーゼを、ヒト軟骨と共に個々にインキュベートした。全てのプロテアーゼは、同一の酵素濃度とし、また全てのインキュベーションは、同一のインキュベーション時間で実行した。４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）のネオエピトープを生成する、プロテアーゼ毎の相対効率を、Ｃｏｌ１０ｎｅｏアッセイに適用することによって評価した。消化緩衝液中にプロテアーゼを添加しないものと比較して、試験したＭＭＰ又はＡＤＡＭＴＳ溶液のいずれにおいても、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルの増加はなかった（図２Ａ及び２Ｂ）。反対に、カテプシンＫは、最大量をもたらしたが、これはネオエピトープ４７９ＧＩＡＴＫＧＬＮＧＰ（配列番号１）を支持する断片を放出するその能力を示す（図２Ｃ）。
【0053】
軟骨における４７９ＧＩＡＴＫＧの免疫局在性
４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）の生成及び分布をさらに規定するため、ＴＫＲ（膝関節全置換）患者からの関節軟骨の連続的な切片を、抗－４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）抗体（２Ｆ４）、正常マウスＩｇＧ（陰性対照）及び抗－Ｘ型コラーゲンＣ末端抗体（１１Ｇ８－国際公開第２０１４／１８０９９２号において開示）で同様に染色した。正常マウスＩｇＧでは、染色は何も観察されなかった（図３Ａ）。先の研究と一致して、１１Ｇ８により検出されたＸ型コラーゲンは、深層における軟骨細胞の細胞外基質中で生じたが、それは石灰化軟骨の領域には不在であったことが見出された（図３Ｂ）。驚くべきことに、４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）の強い染色が、軟骨内の全ての層からの軟骨細胞の細胞外基質中で確認された（図３Ｃ）。ネオエピトープの染色により、細胞外基質中に放出されたＸ型コラーゲンがさらなるタンパク質のプロセッシングを受けていたことが実証された。
４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）の生成及び分布をさらに規定するため、ＴＫＲ（膝関節全置換）患者からの関節軟骨の連続的な切片を、抗－４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）抗体（２Ｆ４）、正常マウスＩｇＧ（陰性対照）及び抗－Ｘ型コラーゲンＣ末端抗体（１１Ｇ８－国際公開第２０１４／１８０９９２号において開示）で同様に染色した。正常マウスＩｇＧでは、染色は何も観察されなかった（図３Ａ）。先の研究と一致して、１１Ｇ８により検出されたＸ型コラーゲンは、深層における軟骨細胞の細胞外基質中で生じたが、それは石灰化軟骨の領域には不在であったことが見出された（図３Ｂ）。驚くべきことに、４７９ＧＩＡＴＫＧ（配列番号２）の強い染色が、軟骨内の全ての層からの軟骨細胞の細胞外基質中で確認された（図３Ｃ）。ネオエピトープの染色により、細胞外基質中に放出されたＸ型コラーゲンがさらなるタンパク質のプロセッシングを受けていたことが実証された。
【0054】
Ｃ４Ｐａｉｎ研究でのＫ／Ｌグレード及び血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベル間における関連
Ｃ４Ｐａｉｎ研究からの２５３例の参加者を、Ｋ／Ｌグレードに基づいて４群に分類した。これら４群の人口統計学的特性を、表３に要約した。
Ｃ４Ｐａｉｎ研究からの２５３例の参加者を、Ｋ／Ｌグレードに基づいて４群に分類した。これら４群の人口統計学的特性を、表３に要約した。
【0055】
【表3】
【0056】
参加者の平均年齢は＞６０歳であったため、Ｋ／Ｌが０又はＫ／Ｌが１である数人の参加者は、同一の群に分類した。本研究に関与した対象のうち５７％は、Ｋ／Ｌが２であり、群２に割り当てられた。各群内の性別分布に有意差はなかった。Ｋ／Ｌ４の平均年齢が、Ｋ／Ｌ０～１の群（ｐ＜０．００５）より有意に高かった。Ｋ／Ｌグレードの増加に伴うＢＭＩの増加は、明白であるが有意でない傾向であった。直近２４時間の最大疼痛強度として規定される、ＶＡＳスコアの平均値は、各群で有意な差はなかった。
【0057】
ＫＬ０～４の４群における参加者のＣｏｌ１０ｎｅｏの平均±９５ＣＩ％の濃度は、それぞれ２．６［２．３１６～２．８８４］μｇ／ｍＬ、３．２８８［２．８８５～３．６９１］μｇ／ｍＬ、３．４３５［２．７２９～４．１４１］μｇ／ｍＬ及び３．５１７［２．５９９～４．４３５］μｇ／ｍＬであった。Ｋ／Ｌグレードが高いと、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルが高い傾向があったが、それは統計学的有意性には達していなかった（図４Ａ）。対象を、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルに基づいて三分位数に分けて、Ｋ／Ｌグレードの分布を比較した（図４Ｂ）。それらのうち、Ｃｏｌ１０ｎｅｏの最高三分位数において、Ｋ／Ｌが３～４である対象の数が最も多かった。
【0058】
ＮＹＵＨＪＤ進行研究における血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベル
Ｃ４Ｐａｉｎ研究からの結果より、非ＯＡの健康な対照、ＯＡ及びＲＡからなるＮＹＵＨＪＤ進行研究において、診断上のバイオマーカーとしてＣｏｌ１０ｎｅｏを用いることの可能性を調査することにした。ＯＡ群及びＲＡ群では、健康な対照群においてよりも、女性参加者の割合が高かった。平均年齢は、対照群及びＯＡ群において有意に差があった。しかしながら、ＲＡは、いずれの年齢でも生じる可能性があるが、３０～５５歳の間でそのピークとなるから、対象は、ＯＡ群におけるよりもＲＡ群で有意に若かった。健康な対照とＯＡとの間では、ＢＭＩにわずかな差があった。
Ｃ４Ｐａｉｎ研究からの結果より、非ＯＡの健康な対照、ＯＡ及びＲＡからなるＮＹＵＨＪＤ進行研究において、診断上のバイオマーカーとしてＣｏｌ１０ｎｅｏを用いることの可能性を調査することにした。ＯＡ群及びＲＡ群では、健康な対照群においてよりも、女性参加者の割合が高かった。平均年齢は、対照群及びＯＡ群において有意に差があった。しかしながら、ＲＡは、いずれの年齢でも生じる可能性があるが、３０～５５歳の間でそのピークとなるから、対象は、ＯＡ群におけるよりもＲＡ群で有意に若かった。健康な対照とＯＡとの間では、ＢＭＩにわずかな差があった。
【0059】
対照、ＯＡ及びＲＡにおける血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏ（平均±９５ＣＩ％）は、それぞれ、２．９５３［２．７１１～３．１９４］μｇ／ｍＬ、４．０４［３．８３５～４．２４６］μｇ／ｍＬ及び２．５４８［２．２８５～２．８１］μｇ／ｍＬであった（図５）。血漿Ｃｏｌ１０ｎｅｏは、健康な対照（ｐ＝０．０００２）又はＲＡ（ｐ＜０．０００１）におけるよりもＯＡで統計学的に高かった。健康な対照とＲＡとの間では、有意差は見られなかった。データを年齢及び性別で調整すると、Ｃｏｌ１０ｎｅｏレベルは、対照（ｐ＝０．００３）又はＲＡ（ｐ＜０．０００１）に対してＯＡでは有意に高いままであった（表５）。
【0060】
驚くべきことに、年齢及び性別で調整すると、対照及びＣｏｌ１０ｎｅｏ間における差は、ＲＡ（ｐ＝０．００８４；表５）に対して有意になる。
【0061】
【表4】
【0062】
結び
本明細書において開示したＣｏｌ１０ｎｅｏアッセイは、ＯＡの評価に有用であることが実証された。
本明細書において開示したＣｏｌ１０ｎｅｏアッセイは、ＯＡの評価に有用であることが実証された。
【0063】
本明細書においては、この有用性は、強直性脊椎炎など、Ｘ型コラーゲンアルファ－１に関連した他の疾患を評価することにまで及び得るということが提案される。
【0064】
本明細書においては、別途明示的に示していない限り、「又は（or）」の語は、条件の一方のみが満たされることを要求する演算子「排他的なＯＲ（exclusive or）」とは対立するものとして、記載した条件の一方又は両方が満たされるときに真の値を戻す演算子という意味で用いられる。「含む（comprising）」の語は、「～からなる（consisting of）」の意味ではなく、「含む（including）」の意味で用いられる。上記で認めた先行する教示の全ては、参照によって本明細書に援用する。本明細書における先に公開されたいずれの文書の承認も、その教示が、本明細書に関する日の時点で、オーストラリア又はその他の場所においてありふれた一般知識であったということの承認又は表現と捉えるべきではない。
【0065】
参考文献
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２５．Attur M, Statnikov A, Samuels J, et al. Plasma levels of interleukin-1 receptor antagonist (IL1Ra) predict radiographic progression of symptomatic knee osteoarthritis. Osteoarthr Cartil. 2015;23(11):1915-1924. doi:10.1016/j.joca.2015.08.006.
２６．Attur M, Krasnokutsky S, Statnikov A, et al. Low-Grade Inflammation in Symptomatic Knee Osteoarthritis: Prognostic Value of Inflammatory Plasma Lipids and Peripheral Blood Leukocyte Biomarkers. Arthritis Rheumatol. 2015;67(11):2905-2915. doi:10.1002/art.39279.
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【配列表】