特許 7165996 認知障害を治療または予防するためのヒト化抗体、その製造プロセス、及びそれを用いた認知障害を治療または予防するための薬剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-27

(45)【発行日】2022-11-07

(54)【発明の名称】認知障害を治療または予防するためのヒト化抗体、その製造プロセス、及びそれを用いた認知障害を治療または予防するための薬剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221028BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20221028BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221028BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221028BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221028BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221028BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221028BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221028BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221028BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221028BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221028BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221028BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/18 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P25/28

A61P25/00

A61P25/16

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2019545918

(86)(22)【出願日】2018-02-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-26

(86)【国際出願番号】 IB2018000249

(87)【国際公開番号】W WO2018154390

(87)【国際公開日】2018-08-30

【審査請求日】2021-02-24

(31)【優先権主張番号】P 2017035594

(32)【優先日】2017-02-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】503369495

【氏名又は名称】帝人ファーマ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】519300231

【氏名又は名称】メルク シャープ アンド ドーメ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】江口 広志

(72)【発明者】

【氏名】村上 隆

(72)【発明者】

【氏名】並木 直子

(72)【発明者】

【氏名】田野倉 章

(72)【発明者】

【氏名】ジャンヌ イー． ベイカー

(72)【発明者】

【氏名】ソフィー パルメンティエル バッテウル

(72)【発明者】

【氏名】アンジェラ マリー ジャブロンスキ

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ステファン マラショック

(72)【発明者】

【氏名】カール ミエクズコウスキ

(72)【発明者】

【氏名】ゴパラン ラグフ ラグフナサン

【審査官】竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１８０２３８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１０３から選択される軽鎖可変ドメイン、を含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項2】

ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１０３から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体であって、配列番号８のリン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性の、配列番号６９の非リン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性に対する比が少なくとも約４０である、前記抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項3】

前記抗体が、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３から選択される重鎖定常ドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項4】

前記抗体が、配列番号７９及び配列番号８０から選択される軽鎖定常ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項5】

前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１４を有し、前記重鎖可変ドメインが配列番号１１６を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項6】

前記抗体の軽鎖が配列番号１８４を有し、前記抗体の重鎖が配列番号１４４を有する、請求項５に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項7】

前記抗体の軽鎖が配列番号１８４を有し、前記抗体の重鎖が配列番号１５２を有する、請求項５に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項8】

前記重鎖及び前記軽鎖が、ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４４；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４５；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４６；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４７；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４８；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４９；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５０；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５１；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５２；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５３；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５４；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５５；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５６；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５７；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５８；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５９；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１６０；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１６１；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４４；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４５；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４６；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４７；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４８；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４９；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５０；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５１；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５２；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５３；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５４；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５５；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５６；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５７；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５８；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５９；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１６０、ならびにＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１６１のペアから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【請求項9】

ａ）配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、及び配列番号１８５から選択される軽鎖をコードする第１の核酸；ならびに
ｂ）配列番号１４４、配列番号１４５；配列番号１４６；配列番号１４７；配列番号１４８；配列番号１４９；配列番号１５０；配列番号１５１；配列番号１５２；配列番号１５３；配列番号１５４；配列番号１５５；配列番号１５６；配列番号１５７；配列番号１５８；配列番号１５９；配列番号１６０及び配列番号１６１から選択される重鎖をコードする第２の核酸を含む、核酸組成物。

【請求項10】

前記第１の核酸が第１の発現ベクターに含まれ、前記第２の核酸が第２の発現ベクターに含まれる、請求項９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物。

【請求項11】

前記第１の核酸及び前記第２の核酸が発現ベクターに含まれる、請求項９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物。

【請求項12】

請求項１０または１１に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。

【請求項13】

前記抗体を発現させる条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記抗体を回収することを含む、抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の作製方法。

【請求項14】

対象におけるタウオパチーを治療するための医薬組成物であって、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を含む、前記医薬組成物。

【請求項15】

前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、初老期の認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、タウ病理学を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－タウ）、嗜眠性脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳炎、及びボクサー病からなる群から選択される、請求項１４記載の医薬組成物。

【請求項16】

対象のタウオパチーを治療するための医薬の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の使用。

【請求項17】

前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、初老期の認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、タウ病理学を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－タウ）、嗜眠性脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳炎、及びボクサー病からなる群から選択される、請求項１６記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月２７日に出願された日本出願特願２０１７－０３５５９４の利益を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に明示的に援用する。

【0002】

ＩＩ．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に援用する。２０１８年２月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称が０６３７８５－０６－５００２－ＷＯ－ＳｅｑＬｓｔｇ－＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが３２３，５８４バイトである。

【0003】

ＩＩＩ．技術分野
本開示は、認知障害の治療的または予防的処置において使用するためのヒト化抗体、そのヒト化抗体の製造プロセス、その抗体を使用する認知障害治療薬または予防薬、ならびに本明細書に開示する治療薬を用いた認知障害の治療方法または予防方法に関する。より詳細には、本開示は、認知機能の改善に優れた効果を有する新規ヒト化抗リン酸化タウ抗体、そのヒト化抗体の製造プロセス、そのヒト化抗体を含有する認知障害治療薬もしくは予防薬、およびヒト化抗リン酸化タウ抗体を用いた認知障害の治療方法または予防方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ＩＶ．発明の背景
認知障害、すなわち認知症は、発達した知能が何らかの後天的原因により悪化し、その結果、社会的適応に支障をきたす病態である。認知障害は、神経変性疾患、血管性認知疾患、プリオン病、感染症、代謝性／内分泌疾患、精神的外傷及び脳外科疾患、中毒性疾患に分類される（Ｔｏｓｈｉｆｕｍｉ Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ ＆ Ｓｈｉｇｅｋｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ（Ｅｄｉｔ．），“ＳＴＥＰ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓｅｉｓｈｉｎｋａ”（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ），２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋａｉｂａｓｈｏｂｏ，２００８，ｐｐ．１０３－１０４参照）。２０１０年の時点で日本には約２１０万人の認知症患者がおり、罹患率は約８～１０％、または６５歳超の高齢者の間で１０％超である。このことは、世界的な高齢化社会における深刻な問題として認識されている（Ｔａｋａｓｈｉ Ａｓａｄａ，“Ｉｇａｋｕ ｎｏ Ａｙｕｍｉ”（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ），ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｏｌｕｍｅ，“Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，Ｉｓｈｉｙａｋｕ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１１，ｐｐ．５－１０）。認知障害の基礎疾患に関するデータは、大多数がアルツハイマー病（ＡＤ）及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）などの神経変性疾患であり、約３５％がＡＤであり、約１５％がＡＤと脳血管疾患の併発であり、５％がＦＴＬＤ（同上）であることを示す。神経変性疾患に関連する認知障害は、少なくとも６ヶ月以上の期間にわたって進行する記憶障害及び／または人格の変化の潜行性の発症を特徴とする。神経変性プロセスは、認知機能の障害の程度と高度に相関し、そしてそれに含まれる一貫した特徴は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在である（Ａｌｉｓｔａｉｒ Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｉｔ．），Ｄｅｍｅｎｔｉａ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．４０８－４６４）。

【0005】

タウタンパク質は、ヒトゲノムの第１７染色体（１７ｑ２１）に位置するＭＡＰＴ遺伝子によってコードされるタンパク質である。タウタンパク質は、中枢神経系において豊富に発現する微小管結合タンパク質の１つである。タウは、最も顕著な神経変性疾患の１つであるＡＤにおいてＮＦＴを形成する対らせん状細線維及び直線状細線維における主要構成タンパク質であることが見出されており、様々な神経病理学的病態においてその細胞内蓄積が示されている。

【0006】

タウは、当初、ＭＡＰＴ遺伝子における突然変異と、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）におけるタウの蓄積との間の関連性に基づいて、神経変性疾患に関係付けられた。ＦＴＤＰ－１７に関してＭＡＰＴ遺伝子に４０を超える遺伝子変異が報告されている（Ｔｅｔｓｕａｋｉ Ａｒａｉ，“Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｎａｉｋａ”（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｄｏｃｕｍｅｎｔ），Ｖｏｌ．７２，ｓｐｅｃｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ，（Ｓｕｐｐｌ．６），２０１０，ｐｐ．４６－５１）。これらの遺伝子変異は、タウアイソフォームの割合を変化させ、または構造を変化させ、及び変異タウと微小管との間の相互作用を変化させ、したがって病理の発達に寄与するものとして示唆される。しかしながら、家族性神経変性疾患とは異なり、ＭＡＰＴの変異はＡＤなどの散発性神経変性疾患ではめったに観察されることはない。さらに、神経変性疾患において蓄積するタウは、リン酸化を介して高度に修飾されていることを特徴とする。さらに、軽度認知障害（ＭＣＩ）を示す患者では、脊髄液中のリン酸化タウのレベルと下垂体萎縮の程度との間に相関が観察され、このことはリン酸化タウがタウオパチー患者における神経変性の信頼性の高いバイオマーカーであることを示唆している（Ｗｅｎｄｙ Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１１，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．８，ｐｐ．７９７－８１０）。これらの知見に基づいて、タウの過剰なリン酸化を阻害するために、リン酸化に関与する酵素であるキナーゼに対する阻害剤、特にＧＳＫ－３βに対する阻害剤を使用する治療法を開発する試みがなされてきた（同上）。しかしながら、ＧＳＫ－３βのようなキナーゼは、病的状態だけでなく正常な生理学的プロセスにおける機能制御にも関与しているため、起こり得る副作用についての懸念がある。実際、タウがＧＳＫ－３βによってリン酸化される部位のいくつかは、胎児及び正常なヒトの脳において認められるタウリン酸化の部位と一致しており（Ｂｕｒｎｅｓら、前出）、この戦略が正常なタウ機能に影響を及ぼし得る可能性を示唆している。

【0007】

細胞外タウは細胞死の結果としての変性神経細胞からの漏出に由来すると考えられていたが、最近の研究により、過剰な細胞内リン酸化の後にタウが処理され、次いで活発に細胞外に分泌されることが示唆されている。細胞から分泌されたリン酸化タウは、特定のリン酸化部位で脱リン酸化され、続いて周囲の細胞のムスカリン受容体Ｍ１及びＭ３に作用し、細胞内タウリン酸化の促進及び細胞死への寄与などの様々な効果をもたらすと考えられる（Ｍｉｇｕｅｌ Ｄｉａｚ－Ｈｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，Ｖｏｌ．２８５，Ｎｏ．４２，ｐｐ．３２５３９－３２５４８及びＶｅｎｅｓｓａ Ｐｌｏｕｆｆｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１２，Ｖｏｌ．７，ｐ．３６８７３）。タウに対する特定の作用を実行することを目的とした試みとして、タウタンパク質を標的とするタウオパチーに対する免疫療法に関する実験が報告されている（Ｎｏｂｌｅ（前出）、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ（前出）、Ａｓａｄａ（前出）及びＢｕｒｎｓ（前出）参照）。

【0008】

ヒトの認知障害における主な症状は、記憶障害及び認知機能障害であり、認知機能障害は、記憶に基づく判断、コミュニケーション及びパフォーマンスにおける認知機能の役割を考えると、特に重要である。一方、運動機能は、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）及び末期アルツハイマー病において認められる症状であるが、認知障害では必ずしも認められる主要な症状ではない。したがって、認知障害を治療するために考慮すべき主な問題は、認知機能の改善である。しかしながら、現在では、タウオパチー関連認知機能障害を試験するための適切な動物モデルが存在し、それによって認知障害を治療するための治療薬または予防薬の同定が可能となるであろう。さらに、認知障害に対して特異的で優れた効果を示すそのような薬剤は存在しない。

【0009】

ヒト対象における認知障害に対する治療的及び予防的適用の観点から、リン酸化タウに対して高い結合親和性を有するだけでなく、ヒトの体に対する抗原性を低下させたヒト化抗リン酸化タウ抗体が必要とされている。

【発明の概要】

【0010】

Ｖ．発明の概要
この背景に対して、本発明者らは、アルツハイマー病の状態において異常なリン酸化を受け得るタウタンパク質中の多数のリン酸化部位のうち、４１３位のセリン残基のリン酸化部位（Ｓｅｒ４１３）に注目し、Ｓｅｒ４１３リン酸化タウに特異的なポリクローナルウサギ抗体及びモノクローナルマウス抗体の作製に成功した。本発明者らはまた、リン酸化タウタンパク質の異常発現を示した認知障害のモデルマウスにモノクローナルマウス抗体を投与し、認知機能の改善が観察されたことを確認した（ＷＯ２０１３／１８０２３８Ａ）。

【0011】

いくつかの実施形態では、本開示は、セリン残基４１３でリン酸化されているタウタンパク質（ｐＳ４１３－タウ）に特異的に結合する抗原結合部分を含む、抗体などのタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示はそれらのタンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それらのタンパク質をコードするそのような核酸を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示するタンパク質、核酸、または細胞を、それを必要とする患者に投与することによる、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病）の治療方法を提供する。

【0012】

したがって、いくつかの態様では、本発明は、少なくとも配列番号１のＳｅｒ４１３に対応するアミノ酸残基においてリン酸化されたタウタンパク質またはタウペプチドと抗原－抗体反応を引き起こすヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体を提供する。いくつかの場合では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、タウタンパク質またはタウペプチドに対して１．８６×１０^－８Ｍ以下の平衡解離定数を有する。

【0013】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、非リン酸化タウタンパク質（またはタウペプチド、例えば、配列番号６９）に比べて、リン酸化タウタンパク質（またはタウペプチド、例えば配列番号８）に対してより高い選択的親和性を有する。

【0014】

さらなる態様では、本明細書に記載のヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、血中に投与した場合に、脳に進入する能力がより高い。

【0015】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、以下のようなＣＤＲを含む：配列１Ｍに対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるＣＤＲ－Ｈ１配列；ＣＤＲ－Ｈ２配列として、配列２Ｍまたは２Ｈ１に対して８４％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ３配列として、配列３Ｍに対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ１配列として、配列４Ｌ１または４Ｍに対して８７％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ２配列として、配列５Ｍに対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列；及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、配列６Ｍに対して７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列。

【0016】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、以下のようなＣＤＲを含む：ＣＤＲ－Ｈ１配列として、配列１Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ２配列として、配列２Ｈ１のアミノ酸配列か、または１５位のＡｌａがＡｓｐで置換されているという点で配列２Ｈ１と異なるアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ３配列として、配列３Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ１配列として、配列４Ｌ１のアミノ酸配列、または５位のＳｅｒがＡｓｎで置換されている点で配列４Ｌ１と異なるアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ２配列として、配列５Ｍのアミノ酸配列；及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、配列６Ｍのアミノ酸配列。

【0017】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、以下のようなＣＤＲを有する：（１）ＣＤＲ－Ｈ１配列として、１Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ２配列として、２Ｈ１のアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ３配列として、３Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ１配列として、４Ｌ１のアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ２配列として、５Ｍのアミノ酸配列；及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、６Ｍのアミノ酸配列；または（２）ＣＤＲ－Ｈ１配列として、１Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ２配列として、２Ｈ１のアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ３配列として、３Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ１配列として、４Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ２配列として、５Ｍのアミノ酸配列；及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、６Ｍのアミノ酸配列；または（３）ＣＤＲ－Ｈ１配列として、１Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ２配列として、２Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｈ３配列として、３Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ１配列として、４Ｍのアミノ酸配列；ＣＤＲ－Ｌ２配列として、５Ｍのアミノ酸配列；及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、６Ｍのアミノ酸配列。

【0018】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は：重鎖可変領域として、配列ＶＨ１１、ＶＨ１２、ＶＨ４７、ＶＨ６１、ＶＨ６２、ＶＨ６４、及びＶＨ６５から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；ならびに軽鎖可変領域として、配列ＶＬ１５、ＶＬ３６、ＶＬ４６、ＶＬ４７、ＶＬ４８、及びＶＬ５０から選択される配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。

【0019】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は：重鎖可変領域として、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、または２８位のＡｌａからＴｈｒへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｈ２８）、３０位のＡｓｎからＳｅｒへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｈ３０）、４９位のＶａｌからＧｌｙへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｈ４９）、６４位のＡｌａからＡｓｐへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｈ６１）、及び７８位のＧｌｎからＬｙｓへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｈ７５）からなる群から選択される１つ以上の置換を含む点で配列ＶＨ６５とは異なるアミノ酸配列を；ならびに軽鎖可変領域として、配列ＶＬ４７のアミノ酸配列、または１７位のＡｓｐからＧｌｕへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｌ１７）、２８位のＳｅｒからＡｓｎへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｌ２７Ａ）、４２位のＧｌｎからＬｅｕへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｌ３７）、５０位のＧｌｎからＡｒｇへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｌ４５）、及び５１位のＡｒｇからＬｅｕへの置換（Ｋａｂａｔナンバリング：Ｌ４６）からなる群から選択される１つ以上の置換を含む点で配列ＶＬ４７とは異なるアミノ酸配列を有する。

【0020】

さらなる態様では、ヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体は、以下の配列の組み合わせのいずれかを含む：（ａ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ１５；（ｂ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ３６；（ｃ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４６；（ｄ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４７；（ｅ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４８；（ｆ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ５０；（ｇ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ１２及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４８；（ｈ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ４７及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４８；（ｉ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ６１及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４８；（ｊ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ６２及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４８；（ｋ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ６４及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４７；（ｌ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ６４及び配列ＶＬ４８、ならびに（ｍ）重鎖可変領域としての配列ＶＨ６５及び軽鎖可変領域としての配列ＶＬ４７。

【0021】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体を含む、認知症を治療または予防するための薬剤を提供する。

【0022】

さらなる態様では、本発明は、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、初老性認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化を伴う認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、タウ病理学を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－タウ）を含む、認知症またはタウオパチーを治療または予防するための方法及び薬剤を提供する。

【0023】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0024】

さらなる態様では、本発明は：ａ）配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびにｂ）：ｉ）配列番号１０２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｉｉ）配列番号９１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｉｉｉ）配列番号９２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｉｖ）配列番号９３を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｖ）配列番号９４を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｖｉ）配列番号９５を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｖｉｉ）配列番号９６を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｖｉｉｉ）配列番号９７を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｉｘ）配列番号９８を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｘ）配列番号９９を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｘｉ）配列番号１００を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ｘｉｉ）配列番号１０１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３からなる群から選択されるｖｌＣＤＲのセットを含む軽鎖可変ドメインを含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を提供する。いくつかの場合では、抗体は、配列番号６９の非リン酸化ペプチドに結合する抗体に対する、配列番号８のリン酸化ペプチドに結合する抗体の比が少なくとも約４０である。

【0025】

さらなる態様では、本発明は：ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメイン、及びｂ）配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１１４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を提供する。いくつかの場合では、抗体は、配列番号６９の非リン酸化ペプチドに結合する抗体に対する、配列番号８のリン酸化ペプチドに結合する抗体の比が少なくとも約４０である。

【0026】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４４から選択される重鎖定常ドメインを含む。

【0027】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号７９及び配列番号８０から選択される軽鎖定常ドメインを含む。

【0028】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメインを含む。

【0029】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１１４から選択される軽鎖可変ドメインを含む。

【0030】

さらなる態様では、抗体は、配列番号１８４のＬＣと配列番号１４４のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１４５のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１４６のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１４７のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１４８のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１４９のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５０のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５１のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５２のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５３のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５４のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５５のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５６のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５７のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５８のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１５９のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１６０のＨＣ；配列番号１８４のＬＣと配列番号１６１のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４４のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４５のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４６のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４７のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４８のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１４９のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５０のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５１のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５２のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５３のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５４のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５５のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５６のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５７のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５８のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１５９のＨＣ；配列番号１８５のＬＣと配列番号１６０のＨＣ；及び配列番号１８５のＬＣと配列番号１６１のＨＣのペアから選択される重鎖と軽鎖を含む。

【0031】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号１８４を有するかまたはそれからなる軽鎖、及び配列番号１４４を有するかまたはそれからなる重鎖を含む。

【0032】

さらなる態様では、本発明の抗体は、配列番号１８４を有するかまたはそれからなる軽鎖、及び配列番号１５２を有するかまたはそれからなる重鎖を含む。

【0033】

さらなる態様では、本発明は：ａ）配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５から選択される軽鎖をコードする第１の核酸；ならびにｂ）配列番号１４４；配列番号１４５；配列番号１４６；配列番号１４７；配列番号１４８；配列番号１４９；配列番号１５０；配列番号１５１；配列番号１５２；配列番号１５３；配列番号１５４；配列番号１５５；配列番号１５６；配列番号１５７；配列番号１５８；配列番号１５９；配列番号１６０及び配列番号１６１から選択される重鎖をコードする第２の核酸を含む核酸組成物を提供する。

【0034】

さらなる態様では、本発明は、第１及び第２の核酸を含む発現ベクター組成物を提供し、第１の核酸は第１の発現ベクターに含まれ、第２の核酸は第２の発現ベクターに含まれる。

【0035】

さらなる態様では、本発明は、第１の核酸及び第２の核酸が単一の発現ベクターに含まれる発現ベクター組成物を提供する。

【0036】

さらなる態様では、本発明は、発現ベクター組成物を含む宿主細胞、及び前記抗体が発現する条件下で宿主細胞を培養し、前記抗体を回収することを含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の作製方法を提供する。

【0037】

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を投与することを含む、対象のタウオパチーの治療方法を提供する。

【0038】

ＶＩ．図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面と併せて通読する場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解され得る。図面には以下の図が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1A】ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて作成した、タウタンパク質の様々なヒトアイソフォームのアラインメントをまとめて示す。

【図1B】ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて作成した、タウタンパク質の様々なヒトアイソフォームのアラインメントをまとめて示す。

【0040】

【図2A】本開示のいくつかの実施形態による軽鎖可変領域配列のアラインメントを示し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより、いくつかの抗ｐＳ４１３－タウ結合タンパク質のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３配列を強調している。

【0041】

【図2B】本開示のいくつかの実施形態による重鎖可変領域配列のアラインメントを示し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムにより、いくつかの抗ｐＳ４１３－タウ結合タンパク質のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３配列を強調している。

【0042】

【図3】本開示のいくつかの実施形態による、非リン酸化ペプチドＰＤ１７と比較した、リン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐに対する、いくつかの抗ｐＳ４１３－タウ抗体の選択的結合親和性を示す。

【0043】

【図4】本開示のいくつかの実施形態による、アルツハイマー病患者由来の脳ホモジネート中のリン酸化タウに対する、いくつかの抗ｐＳ４１３－タウ抗体の結合親和性を示す。

【0044】

【図5A】マウス血漿中のヒト化抗体変異体の経時的な薬物動態を示す。５つの初期ヒト化抗体変異体２、５、６、９、及び１０が、マウス血漿からの迅速な排出を示したことを示す。

【図5B】マウス血漿中のヒト化抗体変異体の経時的な薬物動態を示す。後に開発された３つのヒト化抗体変異体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５が、キメラ抗体に匹敵する薬物動態特性を示したことを示す。

【0045】

【図6A】異なるヒト化抗体変異体が異なる脳内移動を有することを示す。脳ホモジネート中の様々なヒト化抗体の濃度を示す。

【図6B】異なるヒト化抗体変異体が異なる脳内移動を有することを示す。脳中の代表的なヒト化抗体のレベルと血漿中の対応する抗体のレベルとの比を示す。

【0046】

【図7A】代表的なヒト化抗体変異体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と親マウス抗体とのアラインメントを示す。

【図7B】代表的なヒト化抗体変異体の重鎖可変領域のアミノ酸配列と親マウス抗体とのアラインメントを示す。

【0047】

【図8】Ａ～Ｄは、親マウス抗体（図８Ａ及び８Ｂ）及びキメラ抗体（図８Ｃ及び８Ｄ）がリン酸化ペプチド（図８Ａ及び８Ｃ）に結合するが、非リン酸化ペプチド（図８Ｂ及び８Ｄ）には結合しないことを示す。

【0048】

【図9】Ａ～Ｃは、ｐＳ４１３ペプチドに対する代表的なヒト化抗体変異体の結合を示す。

【0049】

【図10】Ａ～Ｅは、アルツハイマー病患者由来の脳ホモジネートにおける、Ｓ４１３リン酸化タウタンパク質への、親マウス抗体（図１０Ａ）、キメラ抗体（図１０Ｂ）、及び選択されたヒト化抗体変異体（図１０Ｃ～１０Ｅ）の結合特性が同等であることを示す。

【0050】

【図11A】本発明のいくつかの抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を示す。

【図11B】本発明のいくつかの抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を示す。

【図11C】本発明のいくつかの抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を示す。

【図11D】本発明のいくつかの抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を示す。

【図11E】本発明のいくつかの抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を示す。

【0051】

【図12】抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせに利用可能な多くの異なるヒトＩｇＧ定常ドメインを示す。「ヒト＿ＩｇＧ１＿」は、ヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「ヒトＩｇＧ１＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ」は、エフェクター機能を低減／消去する２つのアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（場合により「ＬＡＬＡ」変異と呼ばれる）を有するヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「ヒトＩｇＧ１＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ」は、エフェクター機能を低減／消去する３つのアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ｓを有するヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「ヒトＩｇＧ１＿ＹＴＥ＿」または「ヒトＩｇＧ１＿ＹＴＥ（Ｍ２５２Ｙ＿Ｓ２５４Ｔ＿Ｔ２５６Ｅ）」は、血清中の抗体の半減期を延ばす３つのアミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅを有するヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「ヒトＩｇＧ１＿Ｎ２９７Ａ＿」は、アミノ酸置換Ｎ２９７Ａを有するヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）であり、この置換はグリコシル化部位を排除し、エフェクター機能を低減／消去する。「ヒトＩｇＧ１＿Ｎ２９７Ｑ＿」は、アミノ酸置換Ｎ２９７Ｑを有するヒト野生型ＩｇＧ１の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）であり、この置換はグリコシル化部位を排除し、エフェクター機能を低減／消去する。「＿ヒトＩｇＧ２」は、ヒト野生型ＩｇＧ２の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「＿ヒトＩｇＧ４」は、ヒト野生型ＩｇＧ４の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。「ヒトＩｇＧ４＿Ｓ２２８Ｐ＿」は、アーム交換を防ぐためのアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを有するヒト野生型ＩｇＧ４の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である。

【0052】

【図13】図１２の主鎖と共に、Ｈ１１及びＨ６５可変領域の全長重鎖を示す。「スラッシュ」（「／」）は、可変ドメインと定常ドメインとの接合部を示し、ＣＤＲには下線が引かれている。

【0053】

【図14】１２種類の異なる可変軽鎖ドメインについて、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメインのいずれかを含む全長軽鎖を示す。「スラッシュ」（「／」）は、可変ドメインと定常ドメインとの接合部を示し、ＣＤＲには下線が引かれている。

【0054】

【図15】本発明の重鎖及び軽鎖の可能な組み合わせのマトリックスを示す。ボックス内の「Ａ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿」が使用されていることを示す。ボックス内の「Ｂ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ」が使用されていることを示す。ボックス内の「Ｃ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿＿Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ」が使用されていることを示す。ボックス内の「Ｄ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿ＹＴＥ＿」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｅ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿Ｎ２９７Ａ＿」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｆ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ１＿Ｎ２９７Ｑ＿」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｇ」は、重鎖定常ドメイン「＿ヒト＿ＩｇＧ２」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｈ」は、重鎖定常ドメイン「＿ヒト＿ＩｇＧ４」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｉ」は、重鎖定常ドメイン「ヒト＿ＩｇＧ４＿Ｓ２２８Ｐ＿」が使用されていることを意味する。ボックス内の「Ｊ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１定常ドメインが使用されていることを意味する。

【発明を実施するための形態】

【0055】

ＶＩＩ．詳細な説明
Ａ．概説
本開示は、セリン残基４１３でリン酸化されているタウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）に特異的に結合する抗原結合部分を含む抗体を提供する。そのタンパク質をコードする核酸、及びそのような核酸を含む細胞もまた提供する。いくつかの実施形態では、提供する方法及び組成物を、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病）の治療に使用する。

【0056】

タウをコードするＭＡＰＴ遺伝子は、ゲノム上に配置された１３個のエキソンからなるものとして同定されており、選択的スプライシングを介して複数の異なるタンパク質アイソフォームとして発現可能である（前出のＡｒａｉ参照）。タウタンパク質は、エキソン２及びエキソン３の選択的スプライシングに応じて２９個のアミノ酸からなる０～２個の反復配列（Ｎ）（Ｎ０～Ｎ２）を含むＮ末端酸性ドメイン、プロリンに富む中間ドメイン、ならびに微小管結合に寄与する３個（３Ｒ）または４個（４Ｒ）の反復配列（Ｒ）を含むＣ末端微小管結合ドメイン（エキソン９～１２によりコードされる）（Ｂｕｒｎｓ（前出）及びＡｒａｉ（前出））を含む。したがって、ヒトタウは、ヒトタウが含む２９個のアミノ酸反復配列（Ｎ）及び微小管結合反復配列（Ｒ）の数に応じて、６つの代表的なアイソフォームを有する：３Ｒ０Ｎ（３５２アミノ酸）、３Ｒ１Ｎ（３８１アミノ酸）、３Ｒ２Ｎ（４１０アミノ酸）、４Ｒ０Ｎ（３８３アミノ酸）、４Ｒ１Ｎ（４１２アミノ酸）、及び４Ｒ２Ｎ（４４１アミノ酸）。これらのアイソフォームのうち、３Ｒ０Ｎのみが胎児脳に存在し、一方、成人のヒトの脳には６個全てのアイソフォームが存在し、４Ｒが最も豊富である（Ｂｕｒｎｓ、前出）。３Ｒアイソフォームと４Ｒアイソフォームとの間の相違は、エキソン１０が選択的スプライシングを介して除去される（３Ｒ）かまたは存在する（４Ｒ）かによって生じる。これらのタウアイソフォームのいずれにおいてもアミノ酸残基の位置を明確に同定するために、最も長いアイソフォーム、すなわち４Ｒ２Ｎ（配列番号１に定義される）のアミノ酸番号（１～４４１）を、参照として用いる。例えば、「Ｓｅｒ４１３」は、４Ｒ２Ｎ（配列番号１に定義される）の４１３番目のアミノ酸位置のセリン残基を指し、これは４Ｒ１Ｎ（配列番号２に定義される）の３８４番目、４Ｒ０Ｎ（配列番号３に定義される）の３５５番目、３Ｒ２Ｎ（配列番号４に定義される）の３８２番目、３Ｒ１Ｎ（配列番号５に定義される）の３５３番目、３Ｒ０Ｎ（配列番号６に定義される）の３２４番目のセリンに対応する。

【0057】

タウは、配列番号１に定義されるアミノ酸配列の４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３、リン酸化されている場合は本明細書中で「ｐＳｅｒ４１３」と呼ばれる）に対応する位置にリン酸化されたアミノ酸残基を有し（したがって、Ｓｅｒ４１３でリン酸化されたタウタンパク質は、「ｐＳｅｒ４１３タウ」または「ｐＳｅｒ４１３－タウ」である）、これはＡＤにおいて特異的にリン酸化される部位である。ＷＯ２０１３／１８０２３８において以前に示されたように、ＰＳｅｒ４１３－タウとの特異的抗原－抗体反応に関与する抗体を、成熟中に認知機能障害を発症するトランスジェニックマウスに投与した結果、対照群とほぼ同じレベルまで認知機能が回復した。興味深いことに、配列番号１に定義されるアミノ酸配列のＳｅｒ３９６に対応する位置にリン酸化アミノ酸残基を有するタウタンパク質に、同等の抗原に対して上記抗体に比べてより強い親和性を有するモノクローナル抗体を同様の濃度で投与しても、認知機能の十分な改善は得られなかった。タウの構造及び機能に関して、配列番号１に定義されるアミノ酸配列のＳｅｒ４１３に対応する位置のアミノ酸残基を含む領域に関する具体的な情報がなかったため、この領域に結合する抗体がそのような強力な認知機能改善効果を有していたことは全く予想外の結果であった。

【0058】

したがって、本発明は、ヒト対象におけるタウオパチーなどの認知障害を治療するための治療薬または予防薬として有用な、ヒト化及び最適化された抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体に関する。

【0059】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、リン酸化タウに対して高い結合親和性を示す一方で、ヒトの体に対する抗原性が有意に低下しており、ヒト対象におけるタウオパチーなどの認知障害の治療薬または予防薬として有効に使用することができる。さらに、ＣＤＲ内のアミノ酸修飾は、マウスＣＤＲに比べて、アミド分解を低減し、安定性を高める；実施例８、９及び１０参照。

【0060】

Ｂ．定義
本明細書中で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、本節においてその用語に関連付ける意味を有するものとする。

【0061】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書中で使用される。例えば、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

【0062】

本明細書中で使用する「約」は、それが量、持続時間などの測定可能な値を指す場合、指定する値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味するが、そのような変動は開示された方法を実施するのに適切である。

【0063】

本明細書における「消去」とは、活性の減少または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合の消去」とは、特定の変異体を含まないＦｃ領域に比べて、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が５０％未満の開始結合を有し、７０～８０～９０～９５～９８％未満の活性の喪失が好ましく、一般的には、活性がＢｉａｃｏｒｅアッセイにおける検出可能な結合のレベル未満であることを意味する。

【0064】

本明細書中で使用する「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性の反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関しており；ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書中で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に消去する。

【0065】

本明細書中で用いられる「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞介在性の反応を意味する。

【0066】

本明細書における「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書中で論じるように標的抗原に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「抗原結合ドメイン」は、本明細書中に概説するように標的抗原に結合する。当技術分野で公知のように、これらのＣＤＲは、通常、可変重鎖ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶ_ＨＣＤＲまたはＣＤＲ－ＨＣ）の第１のセット及び可変軽鎖ＣＤＲ（ｖｌＣＤＲまたはＶ_ＬＣＤＲまたはＣＤＲ－ＬＣ）の第２のセットとして存在し、それぞれのセットは、３つのＣＤＲ：重鎖についてはｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、軽鎖についてはｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、それぞれ可変重鎖及び可変軽鎖ドメインに存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。したがって、いくつかの場合では、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲに可変重鎖と可変軽鎖が寄与する。「Ｆａｂ」形態では、６つのＣＤＲのセットに、２つの異なるポリペプチド配列、可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶ_Ｈ；ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む）及び可変軽鎖ドメイン（ｖlまたはＶ_Ｌ；ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与し、ｖｈドメインのＣ末端は重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合し、ｖｌドメインのＣ末端は定常軽鎖ドメインのＮ末端に結合する（したがって軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖ形態では、ｖｈ及びｖｌドメインは、通常、本明細書中に概説するようなリンカーの使用を介して、単一のポリペプチド配列に共有結合し、それは（Ｎ末端から開始して）ｖｈ－リンカー－ｖｌまたはｖｌ－リンカー－ｖｈのいずれかであり得るが、一般的には前者が好ましい（使用する形態に応じて、各々の側にオプションのドメインリンカーを含む。当技術分野において理解されるように、ＣＤＲは可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのそれぞれにおいて、フレームワーク領域によって分離されており：軽鎖可変ドメインに関しては、これらはＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ＦＲ４であり、重鎖可変ドメインに関しては、これらはＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲ４であり、これらのフレームワーク領域は、ヒト生殖系列の配列に高い同一性を示す。本発明の抗原結合ドメインには、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖが含まれる。

【0067】

本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失、あるいはタンパク質に化学的に結合している部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／または欠失を意味する。明確にするために、特に明記しない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡとＲＮＡにコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものとする。

【0068】

本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置に天然には存在せず、その生物内または任意の生物内に天然には存在しないアミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｍ２５２Ｙは、変異体ポリペプチド、この場合はＦｃ変異体を指し、２５２位のメチオニンがチロシンで置換されている。明確にするために、核酸コード配列を変更するが最初のアミノ酸から変えないように操作されたタンパク質（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に変換して宿主生物での発現レベルを高める）は「アミノ酸置換」ではない；すなわち、同じタンパク質をコードする新規遺伝子を作成するにもかかわらず、そのタンパク質が特定の位置に最初と同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。

【0069】

本明細書中で使用する「変異型タンパク質」または「タンパク質変異体」、または「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、親タンパク質のタンパク質とは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指す場合がある。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して、約１～約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約５個のアミノ酸修飾を有する。以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ヒト野生型配列、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域などである。本明細書中のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列に対して少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％～９８％～９９％の同一性を有する。変異体タンパク質は、変異体タンパク質自体、タンパク質変異体を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指し得る。

【0070】

したがって、本明細書中で使用する「抗体変異体」または「変異型抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親抗体と異なる抗体を意味し、本明細書中で使用する「ＩｇＧ変異体」または「変異型ＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親ＩｇＧと異なる抗体を意味し（ここでも、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列由来である）、本明細書中で使用する「免疫グロブリン変異体」または「変異型免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親免疫グロブリン配列の配列と異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書中で使用する「Ｆｃ変異体」または「変異型Ｆｃ」とは、Ｆｃドメイン中にアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異体は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えばＭ２５２Ｙまたは２５２Ｙは、親Ｆｃポリペプチドと比較して２５２位に置換チロシンを有するＦｃ変異体であり、その場合のナンバリングはＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅは、親Ｆｃポリペプチドと比較して置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異体は２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅと呼ばれる。置換を示す順序は任意であることに留意されたく、すなわち、例えば、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅは、２５４Ｔ／２５２Ｙ／２５６Ｅと同じＦｃ変異体であり、以下同様である。抗体に関して本発明で考察する全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置のナンバリングは、可変ドメインのナンバリングについてはＫａｂａｔに従い、Ｆｃドメインを含む定常ドメインについてはＥＵインデックスに従うものとする。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスまたはＥＵナンバリングスキームとは、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５、全体を参照により本明細書に援用する）。修飾は、付加、欠失、または置換である。置換は、天然アミノ酸、及びいくつかの場合では、合成アミノ酸を含み得る。

【0071】

本明細書中で使用する場合、本明細書中の「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然アミノ酸及びペプチド結合を含み得る。

【0072】

本明細書中で使用する「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単独でのこの領域を、または全長抗体、抗体断片もしくはＦａｂ融合タンパク質に関してのこの領域を指す場合がある。

【0073】

本明細書中で使用する「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」とは、単一の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは通常、２本の鎖で構成されているか、または（一般的に本明細書中で論じるようなリンカーを用いて）組み合わせてｓｃＦｖを形成することができる。

【0074】

本明細書中で使用する「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされる２０種の天然アミノ酸のうちの１つを意味する。

【0075】

本明細書中で使用する「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれるがこれらに限定されない。

【0076】

本明細書で使用する「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５、全体を参照により援用する）、ならびに、任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、本明細書中に概説するように、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を低減または消去する。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を低下させるとＡＤＣＣが低下し、いくつかの場合では、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂへの結合を低下させることが望ましい。

【0077】

本明細書中で使用する「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含むがこれらに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野において公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、多くの場合に重鎖及び軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ－２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書において特段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質とは、ＦｃＲｎ重鎖とβ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。

【0078】

本明細書中で使用する「親ポリペプチド」とは、その後に修飾を加えて変異体を生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然ポリペプチド、または天然ポリペプチドの変異体もしくは改変型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。したがって、本明細書中で使用する「親免疫グロブリン」とは、変異体を生成するように修飾される未修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書中で使用する「親抗体」とは、変異抗体を生成するように修飾される未修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説するように、公知の市販の組換え産生抗体が含まれることに留意されたい。

【0079】

本明細書における「重鎖定常領域」とは、通常、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４由来の、抗体のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分を意味する。

【0080】

本明細書中で使用する「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。この場合、標的抗原は、Ｓｅｒ４１３位でリン酸化されているタウタンパク質（「ｐＳｅｒ４１３－タウ」）である。

【0081】

本明細書中で使用する「標的細胞」とは、標的抗原を発現する細胞を意味する。

【0082】

本明細書中で使用する「可変領域」とは、それぞれ、κ、λ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成する、Ｖκ、Ｖλ、及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。

【0083】

本明細書における「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

【0084】

本明細書中で使用する用語「タウタンパク質」とは、配列番号１～６に定義されるアミノ酸配列、すなわち、４Ｒ２Ｎ（配列番号１に定義される）、４Ｒ１Ｎ（配列番号２に定義される）、４Ｒ０Ｎ（配列番号３に定義される）、３Ｒ２Ｎ（配列番号４に定義される）、３Ｒ１Ｎ（配列番号５に定義される）、及び３Ｒ０Ｎ（配列番号６に定義される）を有する、ヒトタウタンパク質の６つのアイソフォームのいずれか１つ、ならびにその遺伝子変異体を意味する。上記の「発明の背景」の節で説明したように、認知障害に関連する家族性神経変性疾患であるＦＴＤＰ－１７には４０を超える突然変異が関与しているとされてきた。しかしながら、タウタンパク質における突然変異の部位を、ＦＴＤＰ－１７と関係がある部位に限定すべきではない。配列番号１～６のアミノ酸配列に導入するアミノ酸変異の数は限定すべきでないが、１～５０、特に１～３０、さらに特に１～１０であってもよい。しかしながら、配列番号１の４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）に定義されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸残基は、好ましくは保存されるべきである。本発明によるタウタンパク質はまた、ＢＬＡＳＴ法（ＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件はＮＣＢＩによって提供される）に従って、配列番号１で定義されるヒトタウタンパク質のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性または同一性を有するタンパク質、及びそれらのアイソフォームを包含する。そのようなタウタンパク質は、チンパンジー、マカク、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、及びラットなどの非ヒト種に由来するタウを含む。標的動物の認知機能を改善する目的で、そのような非ヒト動物由来のタウを標的とする治療薬または予防薬を製造することが可能である。

【0085】

本明細書中で使用する用語「タウペプチド」とは、タウタンパク質のアミノ酸配列の一部を含むペプチドを意味する。タウタンパク質に由来するタウペプチドのアミノ酸配列の位置及び長さは限定すべきでないが、好ましくは、少なくともＳｅｒ４１３に対応するアミノ酸を含む、配列番号１のアミノ酸番号４１０～４２１に対応するアミノ酸残基に由来する、例えば一連の少なくとも３つの連続アミノ酸、特に少なくとも５つの連続アミノ酸、より特別には少なくとも８つの連続アミノ酸を有するべきである。タウペプチドの長さもまた限定すべきでないが、好ましくは４以上、特に６以上、より特別には８以上のアミノ酸長を有するべきである。

【0086】

本明細書中で使用する用語「タウ」は、総じて、タウタンパク質またはタウペプチドを意味する。

【0087】

用語「抗ｐＳｅｒ４１３タウタンパク質」とは、本明細書中に記載するように、４１３位でセリンがリン酸化されていないタウタンパク質の結合と比較して、４１３位でセリンがリン酸化されているタウタンパク質に優先的に結合する抗体を意味する。Ｓｅｒ４１３でリン酸化されたタウタンパク質は、ヒト及び／またはマウスのものであり得る。

【0088】

本明細書中で使用する「位置」とは、タンパク質の配列中の位置を意味する。位置は、連続的に、または確立されたフォーマット、例えば抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従ってナンバリングしてもよい。

【0089】

本明細書中で使用する「残基」とは、タンパク質中の位置及びそれに関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１の２９７位の残基である。

【0090】

本発明に関して、タウタンパク質またはタウペプチド中のアミノ酸残基の位置は、明確にするために、配列番号１に定義されるアミノ酸配列に基づいて識別されるアミノ酸番号によって示される。例えば、配列番号１のＳｅｒ４１３に対応するアミノ酸残基は、配列番号１（４Ｒ２Ｎ）の４１３位、配列番号２（４Ｒ１Ｎ）の３８４位、配列番号３（４Ｒ０Ｎ）の３５５位、配列番号４（３Ｒ２Ｎ）の３８２位、配列番号５（３Ｒ１Ｎ）の３５３位、または配列番号６（３Ｒ０Ｎ）の３２４位のセリン残基を意味する。タウアイソフォーム間のアミノ酸残基の位置の対応を、以下の表１に示す。
表１．ヒトタウタンパク質のアイソフォーム

【表1】

【0091】

表１が、配列番号１で定義されるアミノ酸配列の４１０～４２１位に対応する、これらのアイソフォームのアミノ酸残基の位置を示す一方で、例えば、図１Ａ及び図１Ｂに基づいて、他の領域におけるアミノ酸残基の位置の対応も容易に認識することができる。当業者であれば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ法またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ法などのペアワイズ配列アラインメント、またはＣｌｕｓｔａｌＷ法またはＰＲＲＰ法などの多重配列アラインメントを使用して、アイソフォームまたは相同体におけるアミノ酸の対応する位置を決定することができよう。対応位置の解析の一例として、図１Ａ及び１Ｂは、ＣｌｕｓｔａｌＷに基づく６つのヒトアイソフォームのアミノ酸配列のアラインメント（１文字コードで示す）を示す。これらの図は、配列番号１に定義されるアミノ酸配列のＳｅｒ４１３に対応するアミノ酸残基を囲む構造が６つのアイソフォーム間で保存されていることを示している。

【0092】

本発明の抗体は一般的に単離されているかまたは組換え体である。「単離された」とは、本明細書中に開示する様々なポリペプチドを記載するために使用する場合、それを発現していた細胞または細胞培養物から同定及び分離及び／または回収したポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え」とは、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を用いて抗体を生成することを意味する。

【0093】

タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列をアラインメントし、さらに最大の配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後の、そしていかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない場合の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントの決定を目的としたアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較しようとする配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に援用される米国公開第２０１６０２４４５２５号の段落［０２７９］～［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ－２プログラムである。核酸配列についての別の近似的アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。

【0094】

配列同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの実施の例は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」実用新案出願のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供されている。この方法のデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記載されている。本発明に関して同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布されている、エジンバラ大学によって著作権で保護されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。この一連のパッケージのうち、スコアリングテーブルにデフォルトパラメータを使用する場合ではＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ１、及びギャップ６）。生成されたデータの「一致」値は「配列同一性」を反映するものである。配列間の同一性パーセントまたは類似性を計算するための他の適切なプログラムは、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両鎖；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート順＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉの前にｈｔｔｐ：／／を配置することによって位置するインターネットアドレスにおいて見出すことができる。

【0095】

本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数を、「本発明の配列」の長さか、または親配列の長さのうちのどちらか短い方の長さで割った数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。

【0096】

いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％同一である。

【0097】

「特異的結合」または特定の抗原もしくはエピトープに「特異的に結合する」もしくは「特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、分子の結合を、一般的に類似の構造の分子であるが結合活性を有さない対照分子の結合と比較して決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似している対照分子との競合によって決定することができる。

【0098】

本明細書中で使用する用語「Ｋ_{ａｓｓｏｃ}」または「Ｋ_ａ」は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことを意図し、一方、本明細書中で使用する用語「Ｋ_ｄｉｓ」または「Ｋ_ｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書中で使用する用語「Ｋ_Ｄ」は、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａの比（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことを意図する。抗体のＫ_Ｄ値は、当技術分野において十分に確立されている方法を用いて決定することができる。いくつかの実施形態では、抗体のＫ_Ｄを決定する方法は、表面プラズモン共鳴の使用による、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの使用によるものである。特定の実施形態では、リン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。いくつかの実施形態では、リン酸化ペプチドを用いてＫ_Ｄ値を測定する。いくつかの実施形態では、固定化した抗原（例えば、リン酸化タウタンパク質またはリン酸化ペプチド）を用いてＫ_Ｄ値を測定する。他の実施形態では、固定化した抗体（例えば、親マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体変異体）を用いてＫ_Ｄ値を測定する。さらに他の実施形態では、分析物としてリン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。さらに他の実施形態では、分析物としてリン酸化ペプチドを用いてＫＤ値を測定する。特定の実施形態では、二価結合様式でＫＤ値を測定する。他の実施形態では、一価結合様式でＫＤ値を測定する。

【0099】

「疾患」は、ヒトを含む動物の健康状態を含み、その場合、動物は恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける。

【0100】

対照的に、ヒトを含む動物における「障害」は、その動物が恒常性を維持することができるが、その動物の健康状態は、障害を有さない場合のその動物の健康状態に比べて好ましくない健康状態を含む。未治療のままにしておいた場合に、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるわけではない。

【0101】

用語「治療」、「治療すること」、「治療する」などは、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するか、または疾患もしくはその症状の可能性を低減するという点で予防的であってもよく、及び／または疾患及び／または疾患に起因する有害作用を部分的にもしくは完全に治療するという点で治療的であってもよい。本明細書中で使用する場合、「治療」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を含み：（ａ）疾患にかかりやすいがまだ疾患を有すると診断されていない対象における疾患の発生を予防し；（ｂ）疾患を抑制、すなわちその発症または進行を阻止し；（ｃ）疾患を軽減、すなわち、疾患の後退を引き起こし、及び／または１つ以上の疾患の症状を軽減することを含む。「治療」はまた、疾患または病態の非存在下で薬理学的効果をもたらすために薬剤を送達することを包含することを意味する。例えば、「治療」は、例えばワクチンの場合のように、疾患状態の非存在下で免疫応答を誘発するかまたは免疫を付与することができる組成物を送達することを包含する。

【0102】

本明細書中で使用する場合、用語「哺乳類」とは、マウス及びハムスターなどのＲｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳類、及びウサギなどのＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳類を含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類を指す。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含むＣａｒｎｉｖｏｒａ目に由来する。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ウシ属（ウシ）及びブタ類（ブタ）を含むＡｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目に由来するか、またはウマ科（ウマ）を含むＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目の哺乳類である。哺乳類が、霊長目、広鼻下目、もしくはシモイド目（サル）、または類人猿目（ヒト及び類人猿）の哺乳類であることが最も好ましい。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。

【0103】

本明細書中で使用する場合、用語「退行」、及びそれに由来する用語は、必ずしも１００％または完全な退行を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する様々な程度の退行がある。これに関して、開示する方法は、哺乳類におけるタウオパチーの任意の量の任意のレベルの退行を提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供する退行は、疾患、例えばタウオパチーの１つ以上の病態または症状の退行を含み得る。また、本明細書の目的のために、「退行」は、疾患の発症を遅らせ、症状の発症を遅らせ、及び／またはその病態の発症を遅らせることを包含し得る。進行性の疾患及び障害に関して、「退行」は、疾患もしくは障害の進行を遅らせ、疾患もしくは障害の症状の進行を遅らせ、及び／またはその病態の進行を遅らせることを包含し得る。

【0104】

組成物の「有効量」または「治療有効量」は、組成物を投与する対象に有益な効果を提供するのに十分な組成物の量を含む。送達ビヒクルの「有効量」は、組成物を効果的に結合または送達するのに十分な量を含む。

【0105】

「個体」または「宿主」または「対象」または「患者」とは、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳類対象、特にヒトを意味する。他の対象として、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられ得る。

【0106】

本明細書中で使用する用語「～と併用して」とは、例えば、第２の療法の投与の全過程の間に第１の療法を投与する場合の使用を指し；その場合、第１の療法を第２の療法の投与と重複する期間にわたって投与し、例えば、第２の療法の投与の前に第１の療法の投与が始まり、第２の療法の投与が終わる前に第１の療法の投与が終わり；第１の療法の投与の前に第２の療法の投与が始まり、第１の療法の投与が終わる前に第２の療法の投与が終わり；第２の療法の投与が始まる前に第１の療法の投与が始まり、第１の療法の投与が終わる前に第２の療法の投与が終わり；第１の療法の投与が始まる前に第２の療法の投与が始まり、第２の療法の投与が終わる前に第１の療法の投与が終わる。そのように、「併用して」はまた、２つ以上の療法の投与を含むレジメンを指し得る。本明細書中で使用する「～と併用して」とは、同じまたは異なる製剤で、同じまたは異なる経路で、ならびに同じまたは異なる剤形タイプで投与してもよい２つ以上の療法の投与も指す。

【0107】

「コードする」は、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれか、及びそれから生じる生物学的特性を有し、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子を合成するための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の性質を含む。したがって、例えば、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。コード鎖（そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、多くの場合、配列表に提供されているコード鎖）、及び非コード鎖（遺伝子またはｃＤＮＡを転写するための鋳型として使用される非コード鎖）のいずれも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。

【0108】

用語「核酸」は、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の形態の複数のヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。用語「ヌクレオチド配列」は、一本鎖形態の核酸中のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を含む。

【0109】

「核酸構築物」とは、天然においては一緒に見出されることのない１つ以上の機能単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例として、環状、直鎖状、二本鎖、染色体外ＤＮＡ分子（プラスミド）、コスミド（ラムダファージ由来のＣＯＳ配列を含むプラスミド）、非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが挙げられる。

【0110】

本明細書中で使用する用語「作動可能に連結された」とは、第２のポリヌクレオチドと機能的な関係にあるポリヌクレオチド、例えば、２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方が、それによって特徴付けられる生理学的効果を他方に対して発揮することができるような様式で核酸部分内に配置された２つのポリヌクレオチドを含む一本鎖または二本鎖核酸部分を含む。例として、遺伝子のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターは、コード領域の転写を促進することができる。作動可能な連結を示すときに特定される順序は重要ではない。例えば、語句：「プロモーターはヌクレオチド配列に作動可能に連結される」及び「ヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結される」は、本明細書中では同じ意味で使用され、同等とみなされる。いくつかの場合では、所望のタンパク質をコードする核酸がプロモーター／調節配列をさらに含む場合、そのプロモーター／調節配列は、細胞内で所望のタンパク質の発現を駆動するように所望のタンパク質コード配列の５’末端に位置する。

【0111】

本明細書中で同じ意味で使用する用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、及び「核酸分子」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然の、化学的または生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（一般的にＲＮＡまたはＤＮＡに見出され得るような）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。

【0112】

ポリヌクレオチドに適用される用語「組換え」とは、そのポリヌクレオチドが、天然に見出されるポリヌクレオチドとは区別される及び／または異なる構築物をもたらすような、クローニング、制限またはライゲーション工程、及び他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。この用語には、元のポリヌクレオチド構築物の複製物及び元のウイルス構築物の子孫がそれぞれ含まれる。

【0113】

本明細書中で使用する用語「プロモーター」は、転写される核酸配列、例えば所望の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含む。プロモーターは一般的に、転写される核酸配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。

【0114】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる。一般的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味し、導入は、ベクターの全部もしくは一部をゲノムへ組み込むか、または染色体外エレメントとしてベクターを一過性にもしくは遺伝性に維持することによって達成することができる。したがって、この用語には、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組込みベクターが含まれる。

【0115】

本明細書中で使用する用語「調節エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御するヌクレオチド配列を含む。調節エレメントの例として、例えば、核酸配列の複製、転写、及び／または転写後プロセシングに寄与する、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、プロモーター、エンハンサー、転写終結配列、及び上流調節ドメインが挙げられる。場合によっては、調節エレメントはまた、シス調節ＤＮＡエレメントならびに転位因子（ＴＥ）を含み得る。当業者であれば、日常的な実験だけで、発現構築物中のこれら及び他の調節エレメントを選択し、使用することができる。発現構築物は、遺伝子組換えアプローチを用いて、または周知の方法論を使用して合成的に生成することができる。

【0116】

「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、複製、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼす場合があり、本質的に促進性または抑制性であり得る。当技術分野において公知の制御エレメントとして、例えば、プロモーター及びエンハンサーなどの転写調節配列が挙げられる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼと結合し、多くの場合プロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。

【0117】

本明細書中で使用する記述、アミノ酸残基が「リン酸化される」とは、リン酸基がアミノ酸残基の側鎖にエステル結合することを意味する。リン酸化され得る一般的なアミノ酸残基として、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、及びチロシン（Ｔｙｒ）が挙げられる。

【0118】

ＶＩＩＩ．抗体
本発明は、４１３位でリン酸化されたヒトタウタンパク質に結合する抗体及び抗原結合断片に関する。

【0119】

伝統的な抗体構造単位は、一般的に四量体を含む。各四量体は、通常、２つの同一のペアのポリペプチド鎖からなり、各ペアは１つの「軽」鎖（通常、約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（通常、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類される。本発明は、通常ＩｇＧクラスに基づく抗体に関し、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般的に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４は、ＩｇＧ３よりも高頻度で使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）及び３５８（ＬまたはＭ）に多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書中に示す配列は３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプを使用するが、他のアロタイプも本明細書中に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｍを有することができる。

【0120】

当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確なナンバリング及び配置は、異なるナンバリングシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖及び／または可変軽鎖配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことを理解すべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示はｖｈＣＤＲ（例えばｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示はｖｌＣＤＲ（例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。

【0121】

抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３のそれぞれの配列の同定方法として：Ｋａｂａｔの方法（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１，Ｖｏｌ．１４７，Ｎｏ．５，ｐｐ．１７０９－１７１９）及びＣｈｏｔｈｉａの方法（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｖｏｌ．２７３，Ｎｏ．４，ｐｐ．９２７－９４８）が挙げられる。これらの方法は、当業者にとって技術的な常識の範囲内であり、その概要は、例えば、Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ博士のグループのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／）で入手可能である。

【0122】

ＣＤＲナンバリングの有用な比較は以下の通りである（Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）参照）：
表１

【表2】

【0123】

本明細書を通して、可変ドメイン中の残基（おおよそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７及び重鎖可変領域の残基１～１１３）を指す場合にはＫａｂａｔナンバリングシステムを、Ｆｃ領域などの定常領域に対してはＥＵナンバリングシステムを、通常用いる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、前出（１９９１））。

【0124】

本発明は多くの異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲと３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれ、より大きい可変軽鎖または可変重鎖ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書においてより十分に概説するように、可変重鎖及び可変軽鎖ドメインは、重鎖及び軽鎖を使用する場合（例えば、Ｆａｂを使用する場合）、別々のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合、単一のポリペプチド鎖上にあり得る。

【0125】

ＣＤＲは、抗原結合、またはより具体的には抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子のグループであり、通常、特定の構造的特徴及び特定の電荷特性を有する。単一の抗原が複数のエピトープを有していてもよい。

【0126】

この場合、エピトープは、本発明の抗体の結合に直接関与するアミノ酸残基だけでなく、Ｓｅｒ４１３でのリン酸化も含む。

【0127】

各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。Ｋａｂａｔらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。それらの配列の保存度に基づいて、個々の一次配列をＣＤＲとフレームワークとに分類し、そのリストを作成した（全体を参照により援用する、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．参照）。

【0128】

免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖にはいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、定常重鎖（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体に関しては、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧに関する「ＣＨ」ドメインは、以下の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスよる１１８～２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる２３７～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスによる３４１～４４７位を指す。

【0129】

重鎖の別の種類のＩｇドメインはヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間のアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ２３７位の残基で始まる。したがって、ＩｇＧに関して抗体ヒンジは、本明細書では２２１位（ＩｇＧ１ではＤ２２１）～２３６位（ＩｇＧ１ではＧ２３６）を含むものと定義され、その場合、ナンバリングはＫａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、例えばＦｃ領域に関して、下側ヒンジが含まれ、「下側ヒンジ」は通常、２２６位または２３０位を指す。本明細書に記載するように、ヒンジ領域においてもｐＩ変異体を作製することができる。

【0130】

軽鎖は一般的に、２つのドメイン、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインと共にＦｖ領域を形成する）、及び定常軽鎖領域（しばしばＣＬまたはＣκと呼ばれる）を含む。

【0131】

下記に概説するさらなる置換についての別の関心のある領域は、Ｆｃ領域である。

【0132】

したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において公知であるように、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖内に異なるドメインを含み、それらもまた重複し得る。これらのドメインとして、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＦｃドメインまたはＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン及びｓｃＦｖドメインが挙げられるが、これらに限定されない。

【0133】

したがって、「Ｆｃドメイン」には、－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、及び場合によりヒンジドメインが含まれる。重鎖は、可変重鎖ドメイン及び定常ドメインを含み、定常ドメインは、ＣＨ２－ＣＨ３を含むＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、及び可変軽鎖ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然には存在しないが、一般的にｓｃＦｖリンカーによって連結された可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインを含む。本明細書に概説するように、ｓｃＦｖドメインは、通常、Ｎ末端からＣ末端にかけてｖｈ－ｓｃＦｖリンカー－ｖｌという向きになるが、任意のｓｃＦｖドメイン（またはＦａｂ由来のｖｈ及びｖｌ配列を用いて構築されるもの）について、これを逆向きにｖｌ－ｓｃＦｖリンカー－ｖｈとすることができる。

【0134】

本明細書中に示すように、組換え技術によって生成される、伝統的なペプチド結合を含む、使用可能な多くの適切なｓｃＦｖリンカーがある。リンカーペプチドは、主に以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように、それらが互いに対して正しい立体配座をとるように２つの分子を連結するのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーを使用してもよく、いくつかの実施形態では、約５～約１０アミノ酸を使用する。有用なリンカーとして、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー（式中、ｎは、少なくとも１（そして一般的には３～４）の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び他の柔軟なリンカーが挙げられる。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体が挙げられるがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーをリンカーとして利用してもよく、すなわちリンカーとして利用し得る。

【0135】

他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列；例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基を含み得るが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含むことはできない。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えばＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）などの他のタンパク質、ヒンジ領域由来の配列、及び他のタンパク質由来の他の天然配列に由来し得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説するように任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー（式中、ｎは少なくとも１（そして一般的には３～４～５）の整数である）ならびに十分な長さと柔軟性を有して２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用して、各ドメインがその生物学的機能を保持できるようにする。

【0137】

Ａ．キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物に由来するもの、例えば、キメラ抗体及び／またはヒト化抗体であり得る。一般的に、「キメラ抗体」及び「ヒト化抗体」はいずれも、複数の種由来の領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的にマウス（またはいくつかの場合ではラット）由来の可変領域（複数可）とヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は、一般的に、可変ドメインフレームワーク領域をヒト抗体に見出される配列と交換した非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされているか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。その一部または全部が非ヒト生物由来の核酸によってコードされているＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植して抗体を作製する（その特異性は移植されたＣＤＲによって決定される）。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８，Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６に記載されており、これらはいずれも全体を参照により本明細書に援用する。初期の移植構築物において失われる親和性を取り戻すために、選択したアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「逆突然変異」が多くの場合に必要とされる（ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３、いずれもその全体を参照により本明細書に援用する）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み、したがって一般的にはヒトＦｃ領域を含む。ヒト化抗体はまた、遺伝子改変した免疫系を有するマウスを用いて作製することもできる。Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４、その全体を参照により援用する。非ヒト抗体をヒト化及び再形成するための様々な技術及び方法が当技術分野において周知である（いずれも全体を参照により本明細書に援用するＴｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３－５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、及び前記文献中に引用されている参考文献参照）。ヒト化方法として、いずれも全体を参照により援用するＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４－１５３６；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：１００２９－３３；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９－１０３５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５－９，Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３－９；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１８１－４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１－８に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化または他の方法として、例えば、全体を参照により援用するＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９－９７３に記載されているような表面再構成法が挙げられ得る。

【0138】

特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域及び／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」または「由来」である重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含むかまたはそれからなっていてもよい。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」または「由来」であるヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に最も近い配列（すなわち、最大の同一性％）であるヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、それ自体同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」または「由来」であるヒト抗体は、生殖系列配列と比較して、例えば、自然発生的な体細胞変異または意図的な部位特異的突然変異導入に起因するアミノ酸の差異を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、一般的には、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合、抗体がヒト配列由来のものであると同定させるアミノ酸残基を含む。特定の場合では、ヒト化抗体は、アミノ酸配列において、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。一般的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０～２０アミノ酸以下の差異しか示さないであろう。特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、５以下、またはさらには４、３、２、もしくは１以下のアミノ酸の差異を示し得る。

【0139】

一実施形態では、当技術分野で公知のように、親抗体は親和性成熟している。例えば米国特許第７，６５７，３８０号に記載されているように、構造に基づく方法をヒト化及び親和性成熟のために使用してもよい。選択に基づく方法を用いて、抗体可変領域をヒト化及び／または親和性成熟させてもよく、その方法として、いずれもその全体を参照により本明細書に援用するＷｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１－１６２；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－１０６８４；Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１－２２６１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０－８９１５；Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３－７５９に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。他のヒト化方法は、いずれも全体を参照により本明細書に援用するＴａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６－３０８４に記載されている方法を含むがこれらに限定されない、ＣＤＲの一部分のみを移植することを含み得る。

【0140】

用語「抗体」は、最も広い意味で使用し、例えば、インタクトな免疫グロブリンまたは抗原結合部分を含む。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生し得る。したがって、抗体という用語には、伝統的な２つの重鎖と２つの軽鎖の四量体抗体、ならびにＦｖ、Ｆａｂ及びｓｃＦｖなどの抗原結合断片が含まれる。いくつかの場合では、本発明は、本明細書に概説するように少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を提供する。

【0141】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、好ましくは血漿中動態の向上を示すべきである。本明細書におけるヒト化抗体の血漿中動態の向上とは、血漿中のヒト化抗体の動態を表すパラメータが、ヒト化抗体に対応する非ヒト化抗体に比べて改変されていることを意味する。血漿中動態を表すパラメータの例として：血漿内半減期、血漿中の平均滞留時間、及び血漿クリアランスが挙げられる。そのようなパラメータが「改変された」とは、そのパラメータが増加または減少したことを意味する。ヒト化抗体に「対応する」非ヒト化抗体とは、ヒト化抗体を産生するための基礎として用いられる非ヒト化抗体、例えばマウス抗体またはキメラ抗体を意味する。

【0142】

用語「キメラ抗体」とは、１つの抗体由来の１つ以上の領域と１つ以上の他の抗体由来の１つ以上の領域とを含む抗体を指す。「ＣＤＲ移植抗体」とは、特定の種またはアイソタイプの抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、及び同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。

【0143】

ＩＸ．組成物
本発明は、「抗原－抗体反応」において、Ｓｅｒ４１３でリン酸化された（ｐＳｅｒ４１３）ヒトタウタンパク質に結合する多くの異なる抗原結合ドメイン（通常、抗体に組み込まれる）を提供する。

【0144】

「抗原－抗体反応」は、リン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに対する抗体の親和性、すなわち平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。特定の実施形態では、リン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。いくつかの実施形態では、リン酸化タウペプチドを用いてＫ_Ｄ値を測定する。一実施形態では、リン酸化タウペプチドは１残基のみでリン酸化されている（例えば、配列番号７５）。別の実施形態では、リン酸化ペプチドは複数の残基でリン酸化されている（例えば、配列番号７６または配列番号７８）。いくつかの実施形態では、固定化した抗原（例えば、リン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド）を用いてＫ_Ｄ値を測定し、その場合、親和性測定は、結合活性成分を含む、すなわち二価結合様式である。他の実施形態では、固定化した抗体（例えば、マウス親抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体変異体）を用いてＫ_Ｄ値を測定し、その場合、親和性測定は結合活性成分を含まない、すなわち一価結合様式である。さらに他の実施形態では、固定化した抗体及び分析物としてリン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。さらに他の実施形態では、固定化した抗体及び分析物としてリン酸化ペプチドを用いてＫ_Ｄ値を測定する。特定の実施形態では、二価結合様式でＫ_Ｄ値を測定する。他の実施形態では、一価結合様式でＫ_Ｄ値を測定する。

【0145】

したがって、特定の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は５×１０^－８Ｍ以下であり；いくつかの実施形態では、Ｋ_Ｄ値は５×１０^－９Ｍ以下であり；他の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は５×１０^－１０Ｍ以下であり；さらに他の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は１．８６×１０^－８Ｍ以下であり；さらに他の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は２×１０^－９Ｍ以下であり；さらに他の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は２×１０^－１０Ｍ以下である。特定の実施形態では、本明細書に開示する抗体は、固定化した抗体及び分析物としてリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドを用いて測定される５×１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄでリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に開示する抗体は、固定化したリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド及び分析物として抗体を用いて測定される５×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄでリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に開示する抗体は、固定化したリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド及び分析物として抗体を用いて測定される２×１０^－９Ｍ以下のＫ_Ｄでリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに結合する。別の特定の一実施形態では、本明細書に開示する抗体は、固定化したリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド及び分析物として抗体を用いて測定される５×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄでリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に開示する抗体は、固定化したリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド及び分析物として抗体を用いて測定される２×１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄでリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドに結合する。

【0146】

さらに、本明細書に概説するように、本発明の抗体は、４１３位にリン酸を含まないタンパク質またはペプチドよりも、Ｓ４１３位でリン酸化されているタウペプチドまたはタンパク質に優先的に結合する。

【0147】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、本発明によるリン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチドと抗原－抗体反応を引き起こすことができる抗体である。

【0148】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体が抗原－抗体反応を引き起こすことができるリン酸化タウタンパク質及びタウペプチドは、ＡＤなどの神経変性疾患において特異的にリン酸化されるアミノ酸残基においてリン酸化されているタウタンパク質及びタウペプチドである。具体的には、そのようなタウタンパク質及びタウペプチドは、配列番号１に定義されるアミノ酸配列の少なくとも４１３位のセリン残基（Ｓｅｒ４１３）においてリン酸化されており、またアミノ酸番号４１０～４２１に対応する１つ以上のアミノ酸残基、すなわち、配列番号１に定義されるアミノ酸配列のうち、４１２位のセリン残基（Ｓｅｒ４１２）、４１４位のトレオニン残基（Ｔｈｒ４１４）、及び４１６位のセリン残基（Ｓｅｒ４１６）に対応する１つ以上のアミノ酸残基においてリン酸化されていてもよい。一般的なそのようなリン酸化ペプチドとして：配列番号７に定義されるアミノ酸配列を有するｐＳｅｒ４１２／ｐＳｅｒ４１３（Ｃｙｓ－）；配列番号８に定義されるアミノ酸配列を有するｐＳｅｒ４１３（Ｃｙｓ－）、及び配列番号９に定義されるアミノ酸配列を有するｐＳｅｒ４０９／ｐＳｅｒ４１２／ｐＳｅｒ４１３（Ｃｙｓ－）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0149】

本発明によるリン酸化タウペプチドは、本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体の製造に、または反応性を研究するための抗原として使用することができる。

【0150】

本発明によるリン酸化タウペプチドは、当業者が適切な合成方法または遺伝子工学的方法を用いることによって製造することができる。合成によりリン酸化ペプチドを製造する方法として、Ｂｏｃ法（Ｗａｋａｍｉｙａ Ｔ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐ．１４０１，１９９３）、Ｆｍｏｃ法（Ｐｅｒｉｃｈ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４０，ｐｐ．１３４－１４０，１９９２）及びＪＰ３５８７３９０Ｂ及びＷＯ２０１３／１８０２３８が挙げられるが、当業者であれば、必要に応じて他の任意の方法を使用することができる。遺伝子工学的にリン酸化ペプチドを製造する方法の例として、製造しようとするペプチドまたはその前駆体をコードする核酸配列を有する遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を調製し、発現ベクターへの導入及びプロモーター配列の付加などの任意の工程の後に、発現のために適切な宿主に導入するか、または無細胞タンパク質合成系に供する方法が挙げられる。この場合、宿主固有のものでも遺伝子工学的に発現させるものでもよいキナーゼなどの酵素を用いて宿主内でリン酸化反応を引き起こすことにより、または目的とするペプチドを宿主から回収し、キナーゼなどの酵素を用いてリン酸化反応を引き起こすことにより、所望の部位でペプチドをリン酸化することができる。後者の場合、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）またはサイクリン依存性プロテインキナーゼ５（ＣＤＫ５）などの、タウのリン酸化反応において役割を果たすことが知られている酵素に標的ペプチドを供することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化反応を引き起こすことができる。上記の方法に従って宿主内またはｉｎ ｖｉｔｒｏでリン酸化したペプチドの中から、例えば抗体－抗原反応を介して上記の抗リン酸化タウ抗体に特異的に結合するものを選択することによって、所望のアミノ酸残基でリン酸化されたペプチドを回収することができる。

【0151】

本発明によるリン酸化タウペプチドは、そのＮ末端配列及び／またはＣ末端配列において、所望の目的に適した他の機能を有する物質で修飾することができる。例えば、本発明によるリン酸化タウペプチドは、そのＮ末端及び／またはＣ末端に、例えばメチオニン残基、アセチル基またはピログルタミン酸を付加するか、またはそのＮ末端及び／またはＣ末端を、例えば蛍光物質で修飾することができる。あるいは、本発明によるリン酸化タウペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端を、例えばペプチドまたはタンパク質で修飾してもよい。そのような修飾に使用可能なペプチドの例として、適切なタグ配列（一般的にはヒスチジンタグまたはＦＬＡＧタグ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって認識され得るアミノ酸配列を有するペプチド、そのようなタンパク質に由来する配列を有するウイルスまたは細菌またはペプチド由来のタンパク質が挙げられる。さらに、本発明によるリン酸化タウペプチドには、Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基が他の任意の化合物またはペプチドで修飾された少なくとも１つのアミノ酸残基を有するものが含まれる。当業者であれば、リン酸化タウペプチドへのそのような修飾を、任意の公知の方法、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，（ＵＳ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６に記載されている方法を用いて実施することができよう。

【0152】

当業者であれば、固相または液相の系において適切な結合アッセイを選択することにより、抗原－抗体反応の測定を実行することができよう。そのようなアッセイの例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、及び発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗原－抗体結合親和性の測定は、例えば、抗体及び／または抗原を、例えば、酵素、蛍光物質、発光物質、または放射性同位元素で標識し、使用する標識に特徴的な物理的及び／または化学的特性を測定するのに適した方法を用いて抗原－抗体反応を検出することによって行うことができる。

【0153】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、好ましくは、非リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドに対するその結合親和性に比べて、リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドに対してより高い選択的結合親和性を有するべきである。これに関して、リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドへの抗体の選択的結合親和性の向上とは、リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドへの抗体の結合親和性の、対応する非リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドへのその結合親和性に対する比が増加することを意味する。そのような選択的結合親和性は、例えば、リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドを固定化したプレート及び対応する非リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドを固定化したプレートを用いて、例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、発光波長の吸光度ＯＤ値として）によりこれらのタンパク質またはペプチドの各々に対する抗体の結合親和性を測定することにより、及びリン酸化タウタンパク質またはタウペプチドについて得られた結合親和性の値（例えば、吸光度ＯＤ値）を、対応する非リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドについて得られた値で割ることにより、分析できる。ＥＬＩＳＡのための特定の条件は、以下の実施例の節に記載するものであってもよい。

【0154】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、以下の実施例２に記載の方法に従って選択的結合親和性を求める限りにおいて、好ましくは、リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドへの選択的結合親和性の、非リン酸化タウタンパク質またはタウペプチドへの結合親和性に対する比が、少なくとも約４０以上、特に少なくとも約５０以上、より特に少なくとも約６０以上であるべきである。一実施形態では、配列番号８などのリン酸化ペプチドへの抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の結合親和性と、配列番号６９の非リン酸化ペプチドへの結合親和性とを比較することによって比を計算する。

【0155】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、好ましくは、血中に投与した場合に、脳への進入能力の向上を示すべきである。これに関連して、血中に投与した場合の抗体の脳への進入能力の向上とは、抗体をヒトまたは他の任意の哺乳類（例えば、マウスまたはラット）の血中に投与した場合に、血漿中の抗体濃度に対する脳内の抗体濃度の比が増加することを意味する。抗体の脳への進入能力は、例えば、血液を介して抗体を動物（例えば、マウスまたはラット）に投与し、所定の期間（例えば、１週間）後に、血液を採取し、脳ホモジネートを調製し、得られた血漿試料及び得られた脳ホモジネート試料それぞれの抗体濃度を公知の方法（例えば、抗ヒトポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ）を用いて測定し、脳内の抗体濃度を血漿中の抗体濃度で割ることにより分析できる。ＥＬＩＳＡのための特定の条件は、以下の実施例の節に記載されているものであってもよい。脳へ進入する抗体の濃度は、一般的には血漿中の濃度の約０．１～０．３％であることが知られている。

【0156】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、以下の実施例の「［７］実施例７：脳内移行の分析」の節に記載する方法に従ってその比を求める限りにおいて、好ましくは、脳内の抗体濃度が血漿中の抗体濃度に対して、０．３０％以上、特に０．３５％以上、より特別には０．４０％以上、さらにより特別には０．４５％以上の比を有するべきである。

【0157】

Ａ．本発明の抗原結合ドメイン
本発明は、本明細書中に記載するように、Ｓｅｒ４１３でリン酸化されていないタウタンパク質への結合よりもヒトｐＳｅｒ４１３タウタンパク質に優先的に結合する抗原結合ドメインを提供する。

【0158】

一実施形態では、本発明は、配列番号９１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0159】

一実施形態では、本発明は、配列番号９２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0160】

一実施形態では、本発明は、配列番号９３を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0161】

一実施形態では、本発明は、配列番号９４を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0162】

一実施形態では、本発明は、配列番号９５を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0163】

一実施形態では、本発明は、配列番号９６を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0164】

一実施形態では、本発明は、配列番号９７を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0165】

一実施形態では、本発明は、配列番号９８を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0166】

一実施形態では、本発明は、配列番号９９を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0167】

一実施形態では、本発明は、配列番号１００を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0168】

一実施形態では、本発明は、配列番号１０１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0169】

一実施形態では、本発明は、配列番号１０２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２；配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１；配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２；及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む抗原結合ドメインを提供する。

【0170】

本発明は、ヒトｐＳｅｒ４１３タウタンパク質に対する抗原結合ドメインを提供する。実施例に示すように、多くのヒト化可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを提供し、これらは、任意の組み合わせで組み合わせることができ、任意の組み合わせでヒトＩｇＧ定常ドメインに付加することができる。

【0171】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６（配列番号８４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせて、ｐＳｅｒ４１３タウに結合するＦｖドメインを形成する。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0172】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６（配列番号８４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0173】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４７（配列番号１０４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0174】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４７（配列番号１０４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0175】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ａ（配列番号１０５）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0176】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ａ（配列番号１０５）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0177】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ｓ（配列番号１０６）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0178】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ｓ（配列番号１０６）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0179】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ｔ（配列番号１０７）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0180】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ｔ（配列番号１０７）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0181】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｑ（配列番号１０８）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0182】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｑ（配列番号１０８）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0183】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｑ＿Ｇ３４Ａ（配列番号１０９）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0184】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｑ＿Ｇ３４Ａ（配列番号１０９）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0185】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｄ（配列番号１１０）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0186】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｄ（配列番号１１０）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0187】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｓ（配列番号１１１）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0188】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｓ（配列番号１１１）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0189】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｔ（配列番号１１２）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0190】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｎ３３Ｔ（配列番号１１２）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0191】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｓ２８Ｎ（配列番号１１３）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0192】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｓ２８Ｎ（配列番号１１３）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0193】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ａ＿Ｓ２８Ｎ（配列番号１１４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ１１（配列番号１１６）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0194】

一実施形態では、可変軽鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＬ４６＿Ｇ３４Ａ＿Ｓ２８Ｎ（配列番号１１４）を可変重鎖ドメインＴａ１５０５－ＶＨ６５（配列番号１１７）と組み合わせる。この実施形態では、ヒト重鎖定常ドメインは、配列番号ｓ１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、及び１２６、ならびにヒト軽鎖κ定常ドメイン、配列番号５２から選択される。

【0195】

本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体はまた、具体的に後述するように、好ましくは特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するべきである。

【0196】

重鎖可変領域として、本発明の抗体は、配列ＶＨ１１（配列番号１８に定義される）、配列ＶＨ１２（配列番号２０に定義される）、配列ＶＨ４７（配列番号２２に定義される）、ＶＨ６１（配列番号２４に定義される）、配列ＶＨ６２（配列番号２６に定義される）、配列ＶＨ６４（配列番号２８に定義される）、及び配列ＶＨ６５（配列番号３０に定義される）から選択される配列と、好ましくは、８０％以上、特に８５％以上、より特別には９０％以上、さらにより特別には９５％以上、さらにより特別には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するべきである。一実施形態では、本発明の抗体は、重鎖可変領域として、配列ＶＨ６５のアミノ酸配列、または：２８位のＡｌａ（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ２８）からＴｈｒへの置換；３０位のＡｓｎ（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ３０）からＳｅｒへの置換；４９位のＶａｌ（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ４９）からＧｌｙへの置換；６４位のＡｌａ（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ６１）からＡｓｐへの置換；及び７８位のＧｌｎ（Ｋａｂａｔ番号：Ｈ７５）からＬｙｓへの置換からなる群から選択される１つ以上の置換による配列ＶＨ６５に由来するアミノ酸配列を含み得る。

【0197】

軽鎖可変領域として、本発明の抗体は、配列ＶＬ１５（配列番号３２に定義される）、配列ＶＬ３６（配列番号３４に定義される）、配列ＶＬ４６（配列番号３６に定義される）、ＶＬ４７（配列番号３８に定義される）、配列ＶＬ４８（配列番号４０に定義される）、及び配列ＶＬ５０（配列番号４２に定義される）から選択される配列と、好ましくは、８０％以上、特に８５％以上、より特別には９０％以上、さらにより特別には９５％以上、さらにより特別には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するべきである。一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖可変領域として、配列ＶＬ４７のアミノ酸配列、または：１７位のＡｓｐ（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ１７）からＧｌｕへの置換；２８位のＳｅｒ（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ２７Ａ）からＡｓｎへの置換；４２位のＧｌｎ（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ３７）からＬｅｕへの置換；５０位のＧｌｎ（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４５）からＡｒｇへの置換；及び５１位のＡｒｇ（Ｋａｂａｔ番号：Ｌ４６）からＬｅｕへの置換からなる群から選択される１つ以上の置換による配列ＶＬ４７に由来するアミノ酸配列を含み得る。

【0198】

別の実施形態では、本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体は、以下から選択される任意の組み合わせを含み得る：

【0199】

（１）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ１５（配列番号３２）；

【0200】

（２）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ３６（配列番号３４）；

【0201】

（３）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４６（配列番号３６）；

【0202】

（４）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７（配列番号３８）；

【0203】

（５）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0204】

（６）重鎖可変領域として配列ＶＨ１１（配列番号１１６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ５０（配列番号４２）；

【0205】

（７）重鎖可変領域として配列ＶＨ１２（配列番号２０）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0206】

（８）重鎖可変領域として配列ＶＨ４７（配列番号２２）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0207】

（９）重鎖可変領域として配列ＶＨ６１（配列番号２４）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0208】

（１０）重鎖可変領域として配列ＶＨ６２（配列番号２６）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0209】

（１１）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４（配列番号２８）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７（配列番号３８）；

【0210】

（１２）重鎖可変領域として配列ＶＨ６４（配列番号２８）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４８（配列番号４０）；

【0211】

（１３）重鎖可変領域として配列ＶＨ６５（配列番号１１７）及び軽鎖可変領域として配列ＶＬ４７（配列番号３７）；

【0212】

上記のものから重鎖及び軽鎖のＣＤＲ及び／または可変領域のアミノ酸配列を選択し、それらを必要に応じてヒト抗体の重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域及び／または定常領域のアミノ酸配列と組み合わせることによって、当業者であれば本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体を設計することができよう。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域及び／または定常領域のアミノ酸配列は、例えば、ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤサブタイプまたはそれらの変異体のアミノ酸配列から選択することができる。

【0213】

Ｂ．特異的抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体
本発明は、以下のような一対の配列、すなわち重鎖及び軽鎖を含む多くの特異的抗体を提供する：

【0214】

ｍＡｂ－ａＰＴ１：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４４のＨＣ

【0215】

ｍＡｂ－ａＰＴ２：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４５のＨＣ

【0216】

ｍＡｂ－ａＰＴ３：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４６のＨＣ

【0217】

ｍＡｂ－ａＰＴ４：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４７のＨＣ

【0218】

ｍＡｂ－ａＰＴ５：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４８のＨＣ

【0219】

ｍＡｂ－ａＰＴ６：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１４９のＨＣ

【0220】

ｍＡｂ－ａＰＴ７：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５０のＨＣ

【0221】

ｍＡｂ－ａＰＴ８：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５１のＨＣ

【0222】

ｍＡｂ－ａＰＴ９：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５２のＨＣ

【0223】

ｍＡｂ－ａＰＴ１０：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５３のＨＣ

【0224】

ｍＡｂ－ａＰＴ１１：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５４のＨＣ

【0225】

ｍＡｂ－ａＰＴ１２：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５５のＨＣ

【0226】

ｍＡｂ－ａＰＴ１３：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５６のＨＣ

【0227】

ｍＡｂ－ａＰＴ１４：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５７のＨＣ

【0228】

ｍＡｂ－ａＰＴ１５：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５８のＨＣ

【0229】

ｍＡｂ－ａＰＴ１６：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１５９のＨＣ

【0230】

ｍＡｂ－ａＰＴ１７：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１６０のＨＣ

【0231】

ｍＡｂ－ａＰＴ１８：配列番号１８４のＬＣ及び配列番号１６１のＨＣ

【0232】

ｍＡｂ－ａＰＴ１９：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４４のＨＣ

【0233】

ｍＡｂ－ａＰＴ２０：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４５のＨＣ

【0234】

ｍＡｂ－ａＰＴ２１：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４６のＨＣ

【0235】

ｍＡｂ－ａＰＴ２２：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４７のＨＣ

【0236】

ｍＡｂ－ａＰＴ２３：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４８のＨＣ

【0237】

ｍＡｂ－ａＰＴ２４：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１４９のＨＣ

【0238】

ｍＡｂ－ａＰＴ２５：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５０のＨＣ

【0239】

ｍＡｂ－ａＰＴ２６：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５１のＨＣ

【0240】

ｍＡｂ－ａＰＴ２７：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５２のＨＣ

【0241】

ｍＡｂ－ａＰＴ２８：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５３のＨＣ

【0242】

ｍＡｂ－ａＰＴ２９：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５４のＨＣ

【0243】

ｍＡｂ－ａＰＴ３０：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５５のＨＣ

【0244】

ｍＡｂ－ａＰＴ３１：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５６のＨＣ

【0245】

ｍＡｂ－ａＰＴ３２：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５７のＨＣ

【0246】

ｍＡｂ－ａＰＴ３３：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５８のＨＣ

【0247】

ｍＡｂ－ａＰＴ３４：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１５９のＨＣ

【0248】

ｍＡｂ－ａＰＴ３５：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１６０のＨＣ

【0249】

ｍＡｂ－ａＰＴ３６：配列番号１８５のＬＣ及び配列番号１６１のＨＣ

【0250】

Ｃ．結合を競合する抗体
４１３位でリン酸化された（ｐＳｅｒ４１３）ヒトタウタンパク質に結合する抗原結合ドメイン及びそれらを含む抗体に加えて、本発明は、本明細書中に記載の抗体と結合について競合する抗体を提供する。

【0251】

本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体と、ｐＳｅｒ４１３タウへの競合的結合を引き起こすヒト化抗体も本発明の範囲内に含まれる。本明細書中で使用する用語「競合的結合」とは、抗原と共に２つ以上のモノクローナル抗体が存在する場合に、一方の抗体の抗原への結合がそれ以外の抗体の抗原への結合によって阻害されることを意味する。競合的結合は通常、例えば一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対し、別のモノクローナル抗体をその量（濃度）を変動させて添加し、一定量存在する前者のモノクローナル抗体の結合量が減少する場合の、後者のモノクローナル抗体の量（濃度）を決定することによって測定することができる。その阻害の程度は、ＩＣ５０またはＫｉの単位で表すことができる。本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体に対して競合的結合を引き起こすヒト化抗体とは、本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体を１０ｎＭで用いて本発明の抗原－抗体結合を測定した場合に、ＩＣ５０が１μＭ以下、特に１００ｎＭ以下、より特別には１０ｎＭ以下である抗体を意味する。

【0252】

当技術分野で公知のように、一般的にＳＰＲ／Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはＯｃｔｅｔ（登録商標）結合アッセイ、ならびにＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのアッセイを用いて競合的結合研究を行うことができる。

【0253】

いくつかの実施形態では、競合的結合抗体の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、本明細書に概説する可変領域の少なくとも１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有し、定常ドメインにおいては、図１３に概説するヒトＩｇＧ配列に対して少なくとも９９または１００％の同一性を有する。

【0254】

Ｄ．アミノ酸置換

【0255】

本明細書に概説する配列に加えて、本発明は、親の出発配列と比較して１つ以上のアミノ酸置換を有し得る抗原結合ドメイン及びそれらを含む抗体を提供する。

【0256】

したがって、例えば、本明細書に列挙する可変重鎖及び軽鎖ドメインの全てについて、さらなる変異体を作製することができる。本明細書に概説するように、いくつかの実施形態では、６個のＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４または５個のアミノ酸修飾を有することができる（特定の用途に利用可能なアミノ酸置換を有する）。これらの実施形態では、一般的に、単一のＣＤＲは１または２以下のアミノ酸置換を有し、変異配列はｐＳｅｒ４１３タウタンパク質への結合を保持する。しかしながら、本明細書に概説する配列のＣＤＲにアミノ酸変異体を作製する場合、得られるＣＤＲは、ＰＣＴ／ＪＰ１３／６５０９０に概説された、配列番号８１、８２及び８３（可変軽鎖ＣＤＲ）ならびに配列番号８６、８７及び８８（可変重鎖ＣＤＲ）に示されるマウスＣＤＲとは異なる。

【0257】

いくつかの場合では、可変重鎖及び／または軽鎖ドメインのフレームワーク領域（複数可）に変化を生じさせることができる。この実施形態では、フレームワーク領域（例えばＣＤＲを除く）中の好ましい変異体は、ヒト生殖系列配列に対して少なくとも約８０、８５、９０または９５％の同一性を保持している。したがって、例えば、フレームワーク領域がヒト生殖系列配列に対して少なくとも８０、８５、９０または９５％の同一性を保持する限り、本明細書に記載の同一のＣＤＲを、ヒト生殖系列配列由来の異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。

【0258】

いくつかの実施形態では、本明細書で概説するヒト化軽鎖について、最も近いヒト軽鎖生殖系列は、本明細書の配列に対して８１％の同一性を有するＩＧＫＶ２－３０である。したがって、同一性がＩＧＫＶ２－３０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性である限り、軽鎖フレームワーク領域においてさらなる変異体を作製することができる。

【0259】

本明細書のヒト化重鎖について、重鎖について最も近いヒト生殖系列は、本明細書中の配列に対して８５％の同一性を有するＩＧＨＶ３－７３である。したがって、同一性がＩＧＨＶ３－７３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の同一性である限り、軽鎖フレームワーク領域においてさらなる変異体を作製することができる。

【0260】

あるいは、ＣＤＲは、アミノ酸修飾（例えば、ＣＤＲのセット中の１、２、３、４または５個のアミノ酸修飾）を有し得る（すなわち、ＣＤＲは、６つのＣＤＲセット内の変化の総数が６個未満のアミノ酸修飾である限り、ＣＤＲの任意の組み合わせを変化させてＣＤＲを改変することができ；例えば、ｖｌＣＤＲ１に１個、ｖｈＣＤＲ２に２個、ｖｈＣＤＲ３に０個、など））、ならびにフレームワーク領域がヒト生殖系列配列に対して少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持する限り、フレームワーク領域を変化させることができ、得られるＣＤＲはＰＣＴ／ＪＰ１３／６５０９０に概説された、配列番号８１、８２及び８３（可変軽鎖ＣＤＲ）及び配列番号８６、８７及び８８（可変重鎖ＣＤＲ）に示されるマウスＣＤＲとは異なる。

【0261】

一般的に、抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体間の比較のための同一性パーセントは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％であり、少なくとも約９５、９６、９７、９８または９９％の同一性パーセントが好ましい。同一性パーセントは、全アミノ酸配列、例えば全重鎖もしくは軽鎖にわたって、または鎖の一部にわたってのものであってもよい。例えば、本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の定義内に含まれるのは、可変領域全体にわたって（例えば、可変領域にわたって同一性が９５％もしくは９８％同一である場合）、または定常領域全体にわたって同一性を共有する抗体である。

【0262】

Ｘ．本発明の核酸
本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体をコードする核酸組成物、ならびにその核酸を含む発現ベクター及びその核酸で形質転換した宿主細胞及び／または発現ベクター組成物も提供する。当業者には理解されるように、本明細書中に示すタンパク質配列を、遺伝暗号の縮重により、任意の数の可能な核酸配列によってコードすることができる。

【0263】

したがって、本発明はさらに、抗原結合ドメインをコードする核酸組成物及びそれらを含有する抗体を提供する。当業者には理解されるように、抗原結合ドメインの場合、核酸組成物は一般的に、可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸及び可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸を含む。ｓｃＦｖの場合、タンパク質様リンカーによって分離された、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインをコードする単一の核酸を作製することができる。伝統的な抗体の場合、核酸組成物は一般的に、重鎖をコードする第１の核酸及び軽鎖をコードする第２の核酸を含み、これらは細胞内で発現すると自発的に２本の重鎖と２本の軽鎖の「伝統的」な四量体形態になる。

【0264】

当技術分野で公知のように、本発明の成分をコードする核酸を、当技術分野で公知のように、及び本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用する宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込むことができる。当業者には理解されるように、これら２つの核酸を、単一の発現ベクターまたは２つの異なる発現ベクターに組み込むことができる。一般的に、核酸を、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結させる。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組込みベクターであり得る。

【0265】

次いで、本発明の核酸及び／または発現ベクターを、多くの実施形態に利用できる哺乳類細胞（例えばＣＨＯ細胞）とともに、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び／または真菌細胞を含む当技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換する。

【0266】

本発明の抗体は、当技術分野において周知であるように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製する。一旦製造した後は、伝統的な抗体精製工程を行う。

【0267】

ＸＩ．生物学的及び生化学的アッセイ
本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を、その有効性についていくつかの方法でアッセイすることができる。予備的事項として、ＥＬＩＳＡ技術（例えば実施例２（１）参照）、Ｏｃｔｅｔ、ＢｉａｃｏｒｅまたはＦＡＣＳなどの当技術分野で公知の技術を使用して、Ｓ４１３位でリン酸化されているヒトタウタンパク質またはペプチドへの結合について、抗体を試験することができ、その場合、本明細書に概説するように、リン酸化ペプチド（例えば配列番号８）への結合と非リン酸化ペプチド（例えば配列番号６９）への結合とを比較する。

【0268】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示する抗体の結合効率をＢｉａｃｏｒｅアッセイによって測定する。特定の実施形態では、リン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。いくつかの実施形態では、リン酸化タウペプチドを用いてＫ_Ｄ値を測定する。一実施形態では、リン酸化タウペプチドは１残基のみでリン酸化されている（例えば、配列番号７５）。別の実施形態では、リン酸化ペプチドは複数の残基でリン酸化されている（例えば、配列番号７６または配列番号７８）。いくつかの実施形態では、固定化した抗原（例えば、リン酸化タウタンパク質またはリン酸化タウペプチド）を用いてＫ_Ｄ値を測定し、その場合、親和性測定は、結合活性成分を含む、すなわち二価結合様式である。他の実施形態では、固定化した抗体（例えば、マウス親抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体変異体）を用いてＫ_Ｄ値を測定し、その場合、親和性測定は、結合活性成分を含まない、すなわち一価結合様式である。さらに他の実施形態では、固定化した抗体及び分析物としてリン酸化タウタンパク質を用いてＫ_Ｄ値を測定する。さらに他の実施形態では、固定化した抗体及び分析物としてリン酸化ペプチドを用いてＫ_Ｄ値を測定する。特定の実施形態では、二価結合様式でＫ_Ｄ値を測定する。他の実施形態では、一価結合様式でＫ_Ｄ値を測定する。

【0269】

さらに、本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体はまた、ヒトＡＤ脳ホモジネートにおける結合親和性についてアッセイすることもでき、ならびにＨＥＣ２９３ タウＰ３０１Ｌ凝集アッセイにおけるＡＤ由来ａｕ種子の中和試験において、及び／またはマイクロ流体チャンバーにおけるヒトｉＰＳＣニューロンを用いたＡＤ由来タウ接種及び伝播モデルにおいてアッセイすることができる。

【0270】

さらに、本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体はまた、ＡＤ患者の脳試料の免疫組織化学的アッセイにおいても使用することができる。

【0271】

さらに、本発明の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む認知障害の動物モデルにおけるその有効性についてアッセイすることができる。本発明の認知障害のための治療薬または予防薬を研究するための動物には、認知障害のための動物モデル、特にタウオパチーの動物モデルが含まれる。タウオパチーの動物モデルは、脳内に正常型または変異型タウを発現する動物、特に認知機能の障害を示す動物モデルである。脳内で正常型または変異型タウを発現するそのような動物は、遺伝子工学によって調製することができ、典型的な例はトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）である。変異型タウを発現するＴｇマウスなどの動物モデルは、遺伝性家族性タウオパチーのモデルとして有用であるが、ヒトの大多数の症例を構成する散発性タウオパチーに対する治療薬または予防薬の薬効試験については、正常型タウを発現するＴｇマウスにおいて効果を示すのが好ましい。正常型タウを発現するＴｇマウスとして最も適しているのは、本発明の製造例で調製するマウスであるが、特にトランスジェニックマウスの作製及び使用についていずれも全体を参照により本明細書に援用するＫａｍｂｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．４２，Ｐ．４０４－４１４，２０１１）及びＫｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ．２６．Ｐ．５１４３－５１５２，２００７）によって報告されたＴｇマウスを使用してもよい。しかしながら、認知機能障害はＫａｍｂｅら及びＫｉｍｕｒａらのマウスに認められるが、それはそれぞれ１４ヶ月齢及び２０ヶ月齢後に出現するため、発症時にはかなり老齢に達しており、加齢効果もまた一因となる可能性があるが、一方で長期繁殖の影響や労力も課題である。

【0272】

動物モデルにおいて本発明による認知障害に対する治療薬または予防薬の効果を試験する好ましい方法は、認知機能を試験する記憶学習試験などの方法である。そのような方法は、モリス水迷路試験、ステップスルー学習試験または新奇物質認識試験であってもよいが、好ましくは、行動量と動物の不安の条件を考慮するために、オープンフィールド試験などの行動測定試験の組み合わせである。

【0273】

本発明による認知障害の治療薬または予防薬の効果を調べる方法としては、認知障害の動物モデルへの投与中に、脳組織中のタウタンパク質またはリン酸化タウのレベルを調べる方法を使用することができる。ＡＤ及び他の神経変性疾患において、タウタンパク質の発現レベルまたは異常なリン酸化タウの増加は病理と関連している（Ｋｈａｌｉｄ Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．７，ｐ６５４－６６４，２０１０）。いくつかの病理学的モデル動物においてタウ発現及び異常なリン酸化タウレベルを低下させることが認知機能及び運動機能の改善をもたらすこともまたよく知られている（Ｋ．Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０，Ｖｏｌ．９，ｐ．４７６－４８１，２００５；Ｓｙｌｖｉｅ Ｌｅ Ｃｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０３，ｐ．９６７３－９６７８，２００６）。タウタンパク質またはリン酸化タウの変化を調べる方法としては、実施例に記載のように脳組織ホモジネートを用いたウエスタンブロッティングなどの方法によって達成することができるが、当業者であれば、ＥＬＩＳＡ（Ｘｉｙｕｎ Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８６，ｐ．３４４５７－３４４６７，２０１１）または免疫組織化学的方法（Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｉｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＲＡＩＮ，Ｖｏｌ．１３５，ｐ．８０７－８１８，２０１２）などの他の適切な方法を選択することができる。

【0274】

ＸＩＩ．製剤
本発明に従って使用する抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］において一般的に概説されているように）。

【0275】

本発明による認知障害の治療薬または予防薬は、本発明によるヒト化抗リン酸化タウ抗体に加えて、薬学的に許容される担体及び／または他の賦形剤を含有する医薬組成物の形態で製剤化してもよい。薬学的に許容される担体及び／または他の賦形剤を用いた製剤化は、例えばＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ＥＤＩＴＩＯＮ”，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００に記載される方法を用いて実施することができる。そのような治療薬または予防薬は、成分を滅菌水性媒体もしくは油性媒体に溶解、懸濁、もしくは乳化することによって調製される液体製剤として、またはそれらの凍結乾燥製剤として提供してもよい。そのような製剤を調製するための媒体または溶媒は、水性媒体であってもよく、その例として、注射用蒸留水及び生理食塩水溶液が挙げられ、これらを、場合により浸透圧調節剤（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、及び塩化ナトリウム）を添加して使用してもよく、及び／または適切な溶解助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン水添ヒマシ油５０）と併用してもよい。そのような製剤を、油性媒体または油性溶媒を用いて調製することもでき、その例として、ゴマ油及びダイズ油が挙げられ、これらを、場合により溶解助剤、例えば安息香酸ベンジル及びベンジルアルコールと併用することができる。そのような液体薬物は、多くの場合、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤及び酢酸緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム及び塩酸プロカイン）、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン及びポリエチレングリコール）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸、及びそれらの塩）、着色剤（例えば、銅クロロフィルβ－カロチン、赤＃２及び青＃１）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、及び塩化ベンザルコニウム）、増粘剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、及びそれらの塩）、安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミンマンニトール及びソルビトール）、及び矯味矯臭剤（例えば、メントール及び柑橘系香料）などの適切な添加剤を用いて調製され得る。様々な形態の治療薬または予防薬として、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、及びロゼンジ剤などの固形製剤が挙げられる。経口剤形で投与するための固体製剤については、賦形剤（例えば結晶セルロース、ラクトース及びデンプン）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム及びタルク）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴールなど）、及び崩壊剤（例えば、デンプン及びカルボキシメチルセルロースカルシウム）などの添加剤を使用してもよい。必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル）、酸化防止剤、着色剤、甘味料などの添加剤を使用してもよい。他の代替形態として、粘膜上に塗布するための治療薬または予防薬が挙げられ、そのような製剤は、多くの場合、主に粘膜吸着または保持特性を付与する目的のために、感圧接着剤、感圧性増強剤、粘度調整剤、増粘剤などの添加剤を含む（例えば、ムチン、寒天、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、トラガカントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシーデンプン、スクラルファート、セルロース及びその誘導体（ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸アルキル（メタ）アクリレート共重合体、またはそれらの塩及びポリグリセリン脂肪酸エステル）。しかしながら、体に投与する治療薬または予防薬の形態、溶媒及び添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者が適宜選択してもよい。

【0276】

本発明の認知障害治療薬または予防薬は、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体に加えて、認知障害の治療または予防の効果を有する他の公知の薬物、特に認知障害の進行を抑制する効果を有する特定の薬物を含有していてもよい。あるいは、本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を含有する本発明の認知障害治療薬または予防薬を、認知障害の治療または予防効果を有する公知の薬物、特に認知障害の進行を抑制する効果を有する薬物を含有する他の治療薬または予防薬と組み合わせて、キットの形態で製造してもよい。認知障害の進行を抑制する効果を有する成分として、ドネペジル、ガランタミン、メマンチン、及びリバスチグミンが挙げられるが、これらに限定されない。認知障害の進行を抑制する効果を有する成分の用量及び認知障害の進行を抑制する効果を有する成分を含む治療薬または予防薬の用量は、通常の治療に用いる用量の範囲内であってもよいが、条件に応じて増減させることができる。

【0277】

本発明者らは、ＷＯ２０１３／１８０２３８Ａ（特許文献４）において、腹腔内投与により末梢投与した場合でも抗体が血液脳関門を介して脳に作用して薬効を発揮することを示す実験結果を示したが、本発明の認知障害治療薬または予防薬に含まれる本発明のヒト化抗リン酸化タウ抗体を脳組織に効率よく供給する製剤を調製することも可能である。そのような製剤はまた、本発明による認知障害のための治療薬または予防薬に包含される。血液脳関門を介して脳組織に抗体またはペプチドを効率的に供給する方法、例えば、標的物質を添加する方法またはリポソームもしくはナノ粒子に封入する方法が公知である。標的化に使用する物質として、抗体、または特定の受容体もしくは輸送体と結合する性質を有するペプチド、タンパク質もしくは他の化合物との結合によって電荷特性が全体的または部分的に変化する物質が挙げられる。特定の受容体または膜タンパク質と結合する性質を有するペプチド、タンパク質または他の化合物の例として、受容体リガンドまたは膜タンパク質と結合するリガンド、及びそれらの類似体、ならびに受容体リガンドまたは膜タンパク質と結合する抗体、アゴニスト化合物／アンタゴニスト化合物／アロステリック調節薬、及びそれらの類似化合物が挙げられる。特定の受容体または輸送体に結合する性質を有するペプチド、タンパク質または他の化合物の標的としての受容体リガンドまたは膜タンパク質の例として、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）及びジフテリア毒素受容体（ＨＢ－ＥＧＦ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ａｎｇｅｌａ Ｒ．Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００７，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．９，ｐｐ．１７５９－１７７１）。本発明の認知障害治療薬または予防薬に用いる抗体に標的物質を化学的に添加してもよく、その方法は当業者であれば公知の方法、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＵＳＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６に記載されている方法を適宜参照して実施することができる。標的物質はまた、抗体またはペプチドを封入しているリポソームまたはナノ粒子に結合させてもよい（Ｓｏｎｕ Ｂｈａｓｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ Ｆｉｂｒｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１０，７：３）。さらに、標的物質がペプチドまたはタンパク質である場合は、当業者が遺伝子工学技術を用いて、ペプチド化学合成により融合ペプチドを製造するか、またはペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、使用する抗体もしくはペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を組み合わせるかのいずれかにより、適切な融合タンパク質として製造することができる。

【0278】

本発明による治療薬または予防薬は、症状の改善を目的として、それを必要とする患者に経口的または非経口的に投与してもよい。経口投与の場合、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤またはエリキシル剤などの剤形を選択してもよい。非経口投与の場合、経鼻剤を調製してもよく、また、液剤、懸濁剤または固体製剤を選択してもよい。異なる形態の非経口投与として注射剤を調製してもよく、注射は、皮下注射、静脈内注射、注入、筋肉内注射、脳室内注射または腹腔内注射として選択される。非経口投与に使用する他の製剤として、坐剤、舌下剤、経皮剤及び経鼻剤以外の経粘膜投与剤が挙げられる。さらに、ステントまたは血管内閉塞具へ添加するかまたはコーティングする方式での血管内局所投与が可能である。

【0279】

本発明による治療または予防のための薬剤の用量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、治療時間、または医薬組成物中に含まれる有効成分の種類に応じて異なるであろうが、通常、成人への投与あたり０．１ｍｇ～１ｇ、好ましくは０．５ｍｇ～２００ｍｇの活性化合物の範囲で投与してもよい。しかしながら、用量は様々な条件によって変化するため、上記の用量より少ない用量で十分であるか、またはこれらの範囲を超える用量が必要な場合もある。本発明の治療薬または予防薬は、短い投与期間のうちに効果を発揮することができる。

【0280】

ＸＩＩＩ．抗体の投与

【0281】

一旦作製すると、本発明の抗体は、タウオパチーなどの認知障害の治療に利用することができる。本明細書中で考察するように、タウタンパク質の細胞内蓄積が様々な神経病理学的病態において示されている。そのようなタウの細胞内蓄積によって引き起こされる疾患は、まとめて「タウオパチー」と呼ばれる（全体を参照により本明細書に援用するとともに、障害について概説している前出のＡｒａｉ参照）。タウオパチーとして、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）または皮質基底核症候群（ＣＢＳ）、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、認知症を伴う多系統タウオパチー（ＭＳＴＤ）、第１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ－１７）、神経原線維変化認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病（ＤＮＴＣ）、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー（ＷＭＴ－ＧＧＩ）、タウ病理学を伴う前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ－タウ）などが挙げられる。タウオパチーには：嗜眠性脳炎後遺症、亜急性硬化性全脳炎などの感染症；ボクサー病などの外傷による病態を含む、非神経変性疾患も含まれる。

【0282】

認知障害は、一旦発達したまたは獲得した知的機能が低下した状態を含む一種の知的障害として定義されるが（“Ｎｅｗ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（Ｎａｎｋｏｄｏ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｗｅｌｌ－Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｅｒｉｅｓ）”（日本語文献），Ｋｕｎｉｔｏｓｈｉ Ｋａｍｉｊｉｍａ ａｎｄ Ｓｈｉｎ－ｉｃｈｉ Ｎｉｗａ（編），Ｎａｎｋｏｄｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，２００８，ｐｐ．６９－７０）、広義には、知的障害及び／または記憶障害を示す疾患であると考えられている。ＡＤなどの神経変性疾患の診断において、病態が「神経変性」であるかどうかは、例えば、死後の組織学的分析によって神経原線維変化（ＮＦＴ）が存在するかどうかについて分析することによって判定するが、その一方で、医師は、様々な手段、例えば：改訂長谷川式簡易知能評価スケール（ＨＤＳ－Ｒ）及びミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）などの問診による神経心理学的検査；臨床認知症評価（ＣＤＲ）または機能的評価病期分類（ＦＡＳＴ）などの観察による神経心理学的検査；例えば、タウ及びリン酸化タウのレベルの増加、または脳脊髄液中のＡβのレベルの増加に基づく生化学的検査；ならびに、例えば頭部ＣＴ、頭部ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、またはＰＥＴを介して得られた情報に基づく画像検査を用いて、認知障害、特に神経変性疾患であると診断する。本発明の認知障害治療薬または予防薬は、神経変性疾患の診断指標の少なくとも１つに基づいて、医師が認知障害を患っていると診断した患者に対して投与され、投与前の病態に比べて患者の病態を改善するか、投与を介して病態の進行を制御するか、または投与前の病態を維持するか、または投与前の病態に回復させる効果を有する。

【0283】

本発明による認知障害の治療薬または予防薬は、ヒトまたはヒト以外の動物において、認知機能を改善するか、または認知機能の低下を阻害するか、または認知機能を維持する効果も有し得る。そのような非ヒト動物の例は、好ましくは、ヒトタウと高い相同性を有するタウを発現する動物であるべきであり：チンパンジー、マカク、ウマ、ブタ、イヌ、マウス、ウサギ、ラット及びネコが挙げられるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0284】

ＸＩＶ．実施例
Ａ．実施例１：抗体の産生
１．マウス抗体（親抗体）
キメラ抗体及びヒト化抗体の親抗体としてマウス抗体Ｔａ１５０５を使用した。マウス抗体Ｔａ１５０５の詳細は、国際公開第ＷＯ２０１３／１８０２３８Ａ号の実施例に記載されている。マウス抗体Ｔａ１５０５の軽鎖（Ｌ鎖）のアミノ酸配列は配列番号４４に定義され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号４５に定義される。マウス抗体Ｔａ１５０５の重鎖（Ｈ鎖）のアミノ酸配列は配列番号４６に定義され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号４７に定義される。

【0285】

２．キメラ抗体
マウス抗体Ｔａ１５０５の軽鎖（Ｌ鎖）及び重鎖（Ｈ鎖）の可変領域を、それぞれヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１（κ）のＬ鎖及びＨ鎖の定常領域と組み合わせることにより、キメラ抗体を産生した。キメラ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）のアミノ酸配列は配列番号４８に定義され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号４９に定義される。キメラ抗体の重鎖（Ｈ鎖）のアミノ酸配列は配列番号５０に定義され、それをコードするヌクレオチド配列は配列番号５１に定義される。本明細書を通して、このキメラ抗体は、「キメラ抗体」または「キメラ抗体Ｔａ１５０５」と呼ばれる。

【0286】

３. ヒト化抗体
ａ．ＶＬ及びＶＨの設計
ヒト生殖系列から高い相同性を有する一次配列を選択し、相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植によってヒト化を実施し、様々なヒト化抗体を設計した。

【0287】

詳細には、高い相同性を有するヒトフレームワークをデータベースから選択し；マウス抗体Ｔａ１５０５のＣＤＲ領域を各フレームワークに挿入し；例えば活性を維持しながら免疫原性を低下させるために、アミノ酸置換を行った。それにより、様々な軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を設計した。ＶＬのアミノ酸配列の配列番号及びそれらをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の配列番号を表２Ａに示し、ＶＨのアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の配列番号を表２Ｂに示す。ＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列のアラインメントをそれぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。
表２Ａ：軽鎖可変領域（ＶＬ）

【表3】

表２Ｂ：重鎖可変領域（ＶＨ）

【表4】

【0288】

ｂ．免疫原性スコアに基づくＶＬとＶＨの組み合わせの選択
上記の手順によって設計したＶＬ及びＶＨを任意に組み合わせ、各組み合わせの免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）をｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイソフトウェアＥｐｉｂａｓｅ（Ｌｏｎｚａ）によって計算した。以降の実験で使用するＶＬとＶＨの組み合わせは、免疫原性スコアが所定値以下（ＤＲＢ１スコア：１５００）の低免疫原性を示す組み合わせから選択した。選択したＶＬとＶＨの組み合わせを表３Ａに示し、これらの組み合わせの免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）を表３Ｂに示す。
表３Ａ：選択したＶＬとＶＨの組み合わせ

【表5】

表３Ｂ：免疫原性スコア（ＤＲＢ１スコア）

【表6】

【0289】

ｃ．ヒト化抗体の発現培養及び精製
上記の手順によって選択したＶＬ及びＶＨの各組み合わせについて、ＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列をコードする遺伝子を調製した。ＶＬ遺伝子をヒト免疫グロブリンκＬ鎖定常領域（ＣＬ）遺伝子にインフレームで融合させ（そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号５２及び配列番号５３に定義される）、ＶＨ遺伝子をヒト免疫グロブリンγ－１Ｈ鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子にインフレームで融合させ（そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、配列番号５４及び配列番号５５に定義される）、それにより、各結合部位に突然変異または欠失は生じないはずである。ＶＬ遺伝子及びＶＨ遺伝子の５’末端を、それぞれヒト免疫グロブリンκＬ鎖遺伝子由来のシグナル配列（そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５６及び配列番号５７に定義される）及びヒト免疫グロブリンγ－１Ｈ鎖遺伝子由来のシグナル配列（そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５８及び配列番号５９に定義される）にインフレームで融合させ、それにより、各結合部位に突然変異または欠失は生じないはずである。

【0290】

上記手順で設計したシグナル配列融合Ｌ鎖及びＨ鎖をそれぞれコードする核酸構築物を動物細胞発現用の発現ベクターに組み込み、ＥｘｐｉＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．製）を用いて、抗体を発現させるための標準的なプロトコルに従って培養した。各培養物を遠心分離により清澄化し、得られた培養上清をプロテインＡアフィニティーカラムに供してヒト化抗体を精製した。ｐＨ２．８～３．５の酸性溶液で溶出した画分を速やかに中和し、濃縮し、ゲルろ過カラムにかけて凝集物を除去した。緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に変えて主要画分を集め、これを溶媒で適切な濃度に希釈した後、以下の試験に用いた。

【0291】

以下の記載において、上記の手順によって産生した各ヒト化抗体は、そのＶＬ及びＶＨのコード名の組み合わせを使用して略記され得る。例えば、ＶＬとしてＬ１５及びＶＨとしてＨ１１を使用して産生したヒト化抗体は、Ｌ１５Ｈ１１と呼ばれる。

【0292】

以下の試験では、特に指定しない限り、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを抗体濃度を調整するための溶媒として使用した。

【0293】

Ｂ．実施例２：抗原ペプチド結合親和性のＥＬＩＳＡ分析
１．抗原ペプチドに対する結合親和性のＥＬＩＳＡ分析
表３Ａに示すＶＬとＶＨの組み合わせを有するいくつかのヒト化抗体を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗原ペプチドに対する結合親和性について分析した。

【0294】

非リン酸化タウペプチドＰＤ１７（Ｓｅｒ４１３）、及びＳｅｒ４１３がリン酸化されているリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐ（ｐＳｅｒ４１３）をそれぞれ冷ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、得られた溶液を、それぞれプレートに５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、ブロッキング緩衝液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、プレートを４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、抗体溶液を３％ＢＳＡ－ＰＢＳで段階的に希釈し、次いで５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で９０分間反応させた。非リン酸化タウペプチドＰＤ１７（Ｓｅｒ４１３）及びリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐ（ｐＳｅｒ４１３）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６０及び配列番号８に定義される。

【0295】

０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で各ウェルを洗浄した。希釈緩衝液（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で２０００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－アルカリホスファターゼ標識（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ製）を、５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、発色溶液（１ｍｇ／ｍＬのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液）を１００μＬ／ウェルでプレートに添加して４０分間発色させた。４０５ｎｍの波長で吸光度（光学濃度（ＯＤ）値）を測定した。

【0296】

各抗体のＯＤ値と０．２５ｎＭキメラ抗体のＯＤ値との比を決定し、得られた比を以下の３点尺度で評価することにより、反応性を評価した。

【0297】

＋：十分な反応性（０．６≦ＯＤ比）、

【0298】

±：非常にわずかな反応性（０．１５＜ＯＤ比＜０．６）、及び

【0299】

－：反応性なし（ＯＤ比≦０．１５）。

【0300】

表４Ａは、抗体とリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐとの反応性の評価結果を示す。表４Ｂは、抗体と非リン酸化タウペプチドＰＤ１７との反応性の評価結果を示す。キメラ抗体に比べて、全てのヒト化抗体はリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐとより高い反応性を示したが、非リン酸化タウペプチドＰＤ１７とはより低い反応性を示した。これらの結果は、ヒト化抗体がリン酸化タウペプチドと選択的反応性を有することを示している。
表４Ａ：リン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐとの反応性のＥＬＩＳＡ分析

【表7】

表４Ｂ：非リン酸化ペプチドＰＤ１７との反応性のＥＬＩＳＡ分析

【表8】

【0301】

２．リン酸化タウペプチドへの選択的結合親和性のＥＬＩＳＡ分析
表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組み合わせを有するヒト化抗体のいくつかを、キメラ抗体Ｔａ１５０５を参照抗体として用いて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、抗タウヒト化抗体のリン酸化タウペプチドに対する選択的結合親和性について分析した。

【0302】

１μｇ／ｍＬの非リン酸化ペプチドＰＤ１７またはリン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐを含有する溶液を５０μＬ／ウェルでプレートに分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、ブロッキング緩衝液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）－ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、プレートを４℃で一晩静置し、それにより各ウェルに非リン酸化ペプチドＰＤ１７またはリン酸化ペプチドＰＤ１７Ｐを固定化したプレートを調製した。

【0303】

一連の５つの濃度の各抗体を、０．６μｇ／ｍＬ（４ｎＭ）の初期濃度から始めて、４倍連続希釈によって調製した。各溶液を５０μＬ／ウェルでプレートのウェルに添加して、室温で１時間反応させた。洗浄工程後、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ標識（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．製）を２０００倍に希釈した後、５０μＬ／ウェルで各ウェルに添加してさらに一時間反応させた。

【0304】

洗浄工程後、１ｍｇ／ｍＬのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液を各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ添加して２０分間反応させた。４０５ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ）を測定した。

【0305】

調製した各抗体の各濃度における吸光度ＯＤのデータを、ＳｏｆｔＭａｘ ＰｒｏソフトウェアＶｅｒ．６．５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて分析し、下記の４つのパラメータロジスティック回帰曲線に割り当てられた以下の数値Ａ～Ｄを決定した：

【0306】

【数1】

式中、
ｘは抗体の濃度を表し、及び
ｙは吸光度（ＯＤ値）を表す。

【0307】

１ｎＭの濃度の非リン酸化ペプチドＰＤ１７の吸光度ＯＤ値を発現に入力して、ＯＤ値に対応する各抗体の濃度ｘを計算した。ＰＤ１７の濃度は１ｎＭであったため、各ペプチドについてのＰＤ１７への結合親和性に基づくリン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐへの結合親和性のスケールファクターを１／ｘで計算し、リン酸化タウペプチドへの選択的結合親和性の指標として使用した。

【0308】

結果を図３のグラフに示す。リン酸化タウペプチドＰＤ１７Ｐに対するキメラ抗体Ｔａ１５０５の結合親和性は、非リン酸化ペプチドＰＤ１７に対する親和性の３０倍であった。対照的に、ヒト化抗体における選択的結合親和性は、高い選択性を示し、スケールファクターは４０～２１０倍であった。この結果は、ヒト化抗体がリン酸化ペプチドに対して特異的結合親和性を有することを示している。

【0309】

３．リン酸化タウペプチドを用いたＳｅｒ４１３リン酸化部位への選択的結合親和性のＥＬＩＳＡ分析
表３Ａに示すＶＬとＶＨの組み合わせを有するヒト化抗体を、様々なリン酸化ペプチドを用いたＥＬＩＳＡにより、タンパク質の主要リン酸化部位のうちＳｅｒ４１３リン酸化部位に選択的に結合する能力について、それぞれ分析した。

【0310】

表５に示すように、１２個のリン酸化ペプチドを使用した。「エピトープ」と命名された列は、４Ｒ２Ｎ型タウタンパク質のリン酸化部位（複数可）を示しており（例えば、ペプチド番号１の「ｐＳ４６」は、Ｓｅｒ４６の部位がリン酸化エピトープであることを示し、複数のエピトープの記載は、１つのペプチドが２つまたは３つのリン酸化部位を有することを示す）、例外として、ペプチド番号１２は、Ｓｅｒ４１３部位を含むエピトープを有するがリン酸化されていない（ＰＤ１７）。
表５：タウタンパク質Ｓｅｒ４１３リン酸化部位への特異的結合を分析するためのペプチド

【表9】

【0311】

表５に示した１２個のペプチド、すなわちペプチド番号１～１２、またはこれらのペプチドとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との複合体を、４℃に冷却したＰＢＳでそれぞれ希釈して１μｇ／ｍＬとし、得られた溶液を５０μＬ／ウェルでプレートに分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、プレートを４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、精製抗体を３％ＢＳＡ－ＰＢＳで１５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、次いで５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で９０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で各ウェルを洗浄した。希釈緩衝液（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で２０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－アルカリホスファターゼ標識（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．製）を５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、発色溶液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、４０分間発色させた。測定波長４０５ｎｍ、基準波長５５０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定した。

【0312】

反応性は、以下の３点尺度で評価した。
＋：十分な反応性（１．０≦ＯＤ値）、
±：非常にわずかな反応性（０．５≦ＯＤ値＜１．０）、及び
－：反応性なし（ＯＤ値＜０．５）。

【0313】

結果を表６に示す。全てのヒト化抗体は、ペプチド番号９（ｐＳｅｒ４１２／ｐＳｅｒ４１３：ＰＲＨＬＳＮＶ（ｐＳ）（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）、ペプチド番号１０（ｐＳｅｒ４１３：ＰＲＨＬＳＮＶＳ（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）、及びペプチド番号１１（ｐＳｅｒ４０９／ｐＳｅｒ４１２／ｐＳｅｒ４１３：ＰＲＨＬ（ｐＳ）ＮＶ（ｐＳ）（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ）に対してのみ強い結合親和性を示したが、タウタンパク質のＳｅｒ４１３に対応する部位がリン酸化されていなかった他のペプチドには結合しなかった。結合のパターン及び強度は、キメラ（キメラ抗体Ｔａ１５０５）と実質的に同じであった。これらの結果は、ヒト化抗体がリン酸化Ｓｅｒ４１３部位を有するタウタンパク質に特異的な結合親和性を有することを示している。
表６：様々なリン酸化タウペプチドとの反応性のＥＬＩＳＡ分析の結果

【表10】

【0314】

Ｃ．実施例３：抗原タンパク質に対する結合親和性のＥＬＩＳＡ分析
表３Ａに示すＶＬとＶＨの組み合わせを有するいくつかのヒト化抗体を、ＥＬＩＳＡにより、抗原タンパク質に対する結合親和性について分析した。

【0315】

リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕを調製するために、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞中でタウタンパク質４Ｒ２Ｎを発現させた。また、高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕを作製するために、タウタンパク質とＧＳＫ３βを同時に発現することが可能な組換えバキュロウイルスを作製した。

【0316】

組換えバキュロウイルスの製造において、ｐＦａｓｔＢａｃ１及びｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌベクターを使用した。リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕについては、Ｈｉｓタグ付加Ｃ末端を有するタウタンパク質４Ｒ２ＮをコードするｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１に挿入した。高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕについては、Ｈｉｓタグ付加Ｃ末端を有するタウタンパク質４Ｒ２ＮをコードするｃＤＮＡ及びＧＳＫ３βをコードするｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ Ｄｕａｌに挿入した。Ｈｉｓタグ付加タウタンパク質４Ｒ２Ｎのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７０及び７１に定義される。ＧＳＫ３βのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７２及び７３に定義される。

【0317】

得られたベクターを、それぞれリポフェクションにより細胞株Ｓｆ９に導入し、細胞を培養して組換えバキュロウイルスを調製した。次いで、得られた組換えバキュロウイルスを用いて細胞株Ｓｆ９またはＴｎ５を感染させ、それによってリン酸化タウタンパク質（ｐＴａｕ）及び高リン酸化タウタンパク質（ｈｐＴａｕ）を発現させた。

【0318】

所望のタンパク質を発現する細胞を収集し、超音波処理及び遠心分離にかけて細胞溶解物を得て、次いでこれをＮｉ－ＮＴＡカラムにかけてタウタンパク質を精製した。精製タウタンパク質の濃度は、標準試料としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより決定した。

【0319】

得られた高リン酸化タウタンパク質（ｈｐＴａｕ）及びリン酸化タウタンパク質（ｐＴａｕ）を、冷却したＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、希釈液を５０μＬ／ウェルでプレートに分注し、４℃で一晩静置した。溶液を除去した後、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を２７０μＬ／ウェルで分注し、プレートを４℃で一晩静置した。緩衝液を除去した後、３％ＢＳＡ－ＰＢＳで段階希釈して調製した一連の抗体溶液を５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で９０分間反応させた。

【0320】

その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）でウェルを洗浄した。希釈緩衝液（３％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で２０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－アルカリホスファターゼ標識（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．製）を５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で６０分間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、発色溶液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、４０分間発色させた。４０５ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ値）を測定した。

【0321】

各抗体のＯＤ値と０．２５ｎＭキメラ抗体のＯＤ値との比を決定し、得られた比を以下の３点尺度で評価することによって反応性を評価した。
＋：十分な反応性（０．６≦ＯＤ比）、
±：非常にわずかな反応性（０．１５＜ＯＤ比＜０．６）、及び
－：反応性なし（ＯＤ比≦０．１５）。

【0322】

表７Ａは、ヒト化抗体と高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕとの反応性を評価した結果を示す。表７Ｂは、ヒト化抗体とリン酸化タウタンパク質ｐＴａｕとの反応性を評価した結果を示す。結果は、全てのヒト化抗体が、キメラ抗体の反応性に比べて、高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕ及びリン酸化タウタンパク質ｐＴａｕの両方に対して高い反応性を有することを示している。
表７Ａ：高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕとの反応性のＥＬＩＳＡ分析の結果

【表11】

表７Ｂ：リン酸化タウタンパク質ｐＴａｕとの反応性のＥＬＩＳＡ分析の結果

【表12】

【0323】

Ｄ．実施例４：ＳＰＲによる結合親和性の分析
表３Ａに示すＶＬとＶＨの組み合わせを有するいくつかのヒト化抗体を、参照抗体としてキメラ抗体Ｔａ１５０５を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による結合親和性分析に供した。

【0324】

抗原タンパク質として高リン酸化タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ：実施例３参照）を用い、陰性対照としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにより産生した非リン酸化タウタンパク質（Ｔａｕ：Ｈｉｓタグ付加非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎ：ＡＴＧｅｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、カタログ番号：ＡＴＧＰ０７９５）を用いた。使用した抗原ペプチドは、Ｓｅｒ４１３のみがリン酸化されたモノリン酸化タウペプチド（１×Ｐ）、及びＳｅｒ４１３に加えてＳｅｒ４０９及びＳｅｒ４１２がさらにリン酸化されたトリリン酸化タウペプチド（３×Ｐ）であった。これらのペプチドのアミノ酸配列を表８に示す。使用した陰性対照ペプチドは非リン酸化タウペプチド（Ｎｏｎ Ｐ）であり、そのアミノ酸配列も表８に示す。Ｈｉｓタグ付加非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎのアミノ酸配列は、配列番号７４に定義される。モノリン酸化タウペプチド１×Ｐ、トリリン酸化タウペプチド３×Ｐ、及び非リン酸化タウペプチドＮｏｎ Ｐのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５、７６、及び７７に定義される。
表８：ＳＰＲに使用する抗原ペプチド

【表13】

【0325】

高リン酸化タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）、非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎ、モノリン酸化タウペプチド１×Ｐ、トリリン酸化タウペプチド３×Ｐ、及び非リン酸化タウペプチドＮｏｎ Ｐと、各抗体との結合親和性を、ＳＰＲシステムＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ）を用いて、そのシステムに添付された評価用の取扱説明書に従って測定した。

【0326】

結合親和性を：ＮＴＡセンサーチップ（ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）が既に固定化されているカルボキシメチルデキストラン層を含む：コード番号ＢＲ－１００５－３２）を調製し；アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ、コード番号ＢＲ－１００６－３３）を用いたアミンカップリング反応を介して、Ｈｉｓ－ｔａｇと融合した上記各ペプチド及び表８に示す各抗原ペプチドを共有結合によりセンサーチップ上に固定化し；及び固定化したタンパク質及びペプチドに対する抗体の結合速度を測定することを含む方法により測定した。

【0327】

固定化反応溶液としてＨＢＳ－Ｎ緩衝液（コード番号ＢＲ－１００３－６９）を用い、塩化ニッケル溶液と、ＮｉをＮＴＡに結合させるためのＮＴＡセンサーチップとを反応させることにより、Ｈｉｓタグ付加ｈｐＴａｕまたはＴａｕタンパク質をそれぞれセンサーチップ上に固定化した。続いて、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ）とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液でセンサーチップを活性化した。４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で１００～５００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整した、各Ｈｉｓタグ付加タンパク質の溶液をセンサーチップに塗布し、それによってタンパク質をＮｉ－ＮＴＡとの共有結合によりセンサーチップ上に固定化した。残りの活性ＮＨＳをエタノールアミンでブロックし、ＮｉイオンをＥＤＴＡ溶液で除去した（Ｎｉ－親和性アミンカップリング：国際公開第ＷＯ２００５／０２２１５６号参照）。ＮＴＡセンサーチップをＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）塩酸塩とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の混合溶液で活性化することにより、抗原ペプチド（１×Ｐ、３×Ｐ、及びＮｏｎ Ｐ）をそれぞれセンサーチップ上に固定化し、その後、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４～４．５）で１～１０μＭに希釈した抗原ペプチドの溶液をセンサーチップに塗布し、それにより、ペプチドをセンサーチップ上に共有結合させた。残りの活性ＮＨＳをエタノールアミンでブロックした。このようにして、上記のタンパク質及びペプチドをそれぞれ固定化したセンサーチップを作製した。

【0328】

ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．５）をこれらのセンサーチップに３７℃で塗布して、タンパク質またはペプチドで固定化したセンサーチップ表面を安定化させた。特異的結合反応溶液としてＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて調製した各抗体の溶液を、反応させるために１５０秒間（同じ評価では一様）、センサーチップ表面に０．２～１ｎＭの範囲（推定結合解離定数［ＫＤ］付近）の濃度で塗布し、結合速度を測定した。得られたデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア、バージョン３．０）を用いて分析した。

【0329】

各抗体の結合速度は、抗原タンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）のセンサーチップへの結合速度から陰性対照としての非リン酸化タンパク質４Ｒ０Ｎのセンサーチップへの結合速度を差し引くことによって補正した。各抗原ペプチドの結合速度は、抗原ペプチド１×Ｐ及び３×Ｐのそれぞれの結合速度から陰性対照としての非リン酸化ペプチドＮｏｎ Ｐのセンサーチップへの結合速度を差し引くことによって補正した。測定に供した試料濃度の範囲内で、非リン酸化タウタンパク質４Ｒ０Ｎまたは非リン酸化ペプチドＮｏｎ Ｐへの各抗体の結合は観察されなかった。

【0330】

表９Ａは、リン酸化タウタンパク質４Ｒ２Ｎ（ｈｐＴａｕ）に対するヒト化抗体の結合活性を示す。表９Ｂは、モノリン酸化タウペプチド１×Ｐ及びトリリン酸化タウペプチド３×Ｐに対するヒト化抗体の結合活性の結果を示す。結果は、各ヒト化抗体が、高リン酸化タウタンパク質ｈｐＴａｕ、モノリン酸化タウペプチド１×Ｐ、及びトリリン酸化タウペプチド３×Ｐの全てに対して高い結合活性を示したことを示している。
表９Ａ：リン酸化タウタンパク質（ｈｐＴａｕ）に対するヒト化抗体の結合活性（１：１結合モデル）

【表14】

表９Ｂ：リン酸化ペプチド（１×Ｐ、３×Ｐ）に対するヒト化抗体の結合活性（１：１結合モデル）

【表15】

【0331】

Ｅ．実施例５：ＡＤ患者脳ホモジネート中のｐＳｅｒ４１３－タウの結合親和性分析
参照抗体としてマウス抗体Ｔａ１５０５及びキメラ抗体を用いて、表３Ａに示すＶＬ及びＶＨの組み合わせを有するヒト化抗体のうち、Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５を、液相中のアルツハイマー病（ＡＤ）患者臨床試料由来のＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）への結合親和性について評価した。

【0332】

ヒト化抗体、マウス抗体、及びキメラ抗体を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＬＣ－ビオチン（ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いてそれぞれビオチン化し、続いてＰＢＳで透析した。

【0333】

Ｂｒａａｋ病期Ｖ／ＶＩのＡＤ患者の脳由来の凍結海馬組織（１６０ｍｇ）を０．８ｍＬのＴＢＳ－Ｉ（トリス緩衝食塩水、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル）に添加し、氷水中で超音波処理した。超音波処理した溶液を４℃、３０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収し、さらに４℃、１０００００×ｇで１５分間超遠心して脳ホモジネートを取得した。Ｉｎｎｏｔｅｓｔ ｐＴａｕ（ｐＴ１８１）キット（Ｆｉｊｉｒｅｂｉｏ Ｉｎｃ．）をＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）のＥＬＩＳＡシステムとして使用したが、キットに含まれるビオチン化抗体（ＣＯＮＪ１と表示）を上記で生成したビオチン化抗体で置換した。

【0334】

上記で作製したビオチン化抗体のそれぞれを０．１ｎＭの濃度で溶液にし、１０００倍希釈の脳ホモジネートと共にＨＴ７抗体固定化ＭＴプレート（キットに含まれる）に添加した。得られた試料を混合し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（キットにＣＯＮＪ２として含まれる）をプレートに添加し、続いて１時間インキュベートした。洗浄後、発色試薬ＴＭＢを加え、遮光下室温で３０分間インキュベートした。次いで反応停止剤溶液（キット中にＳＴＯＰ溶液として含まれる）を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍの波長での吸光度を測定した。

【0335】

結果を図４に示す。図４のグラフに示すように、ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５は全て、ＡＤ患者の臨床試料由来のＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）に対して高い結合親和性を示した。

【0336】

Ｆ．実施例６：血中速度試験
５つの初期ヒト化抗体変異体を、正常マウスにおけるその薬物動態について、市販の抗体ハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）及びキメラＴａ１５０５抗体と比較して試験した。各ヒト化抗体変異体の軽鎖及び重鎖を以下の表１０にまとめる。

【0337】

表１０．いくつかの初期ヒト化抗体変異体の軽鎖及び重鎖

【表16】

【0338】

１１週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）に１０ｍｇ／ｋｇの用量で抗体を腹腔内注射した。投与後１、３、８、２４、及び７２時間に収集した血液から血漿を得た。試料サイズは、抗体あたり動物２匹であった。

【0339】

抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて血漿抗体濃度を決定した。マウス血漿を用いて各抗体を段階希釈することにより検量線をプロットした。

【0340】

血漿を１，０００倍に希釈し、抗体濃度を測定した。

【0341】

ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体の１μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））にピペットで移し、４℃で一晩静置した。その後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングを行い、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体を含むプレートを調製した。マウス血漿を用いて抗体を段階希釈し、標準物質を得た。血漿及び標準物質を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈し、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体を含むプレートに５０μＬ／ウェルで、ピペットで移した。混合物を室温で１．５時間反応させ、次いでプレートをＴＢＳ－Ｔ（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。その後、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０８７－０４）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで、ピペットで移し、反応を室温で１時間進行させた。次にプレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、発色試薬を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍと５５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0342】

検量線を標準物質でプロットし、これを用いて血漿抗体濃度を計算した。結果を図５Ａに示す。

【0343】

試験した最初のヒト化変異体（変異体２、５、６、９、及び１０）は、投与後８時間で、ハーセプチン及びキメラ抗体のレベルに比べて血漿濃度の急速な減少を示し、これは注射後最大３日間、高く安定していた。これらの初期ヒト化抗体は、キメラ抗体に比べてより短い半減期及び低いＰＫ特性を示したが、これは、これらの変異体の高いｐＩ値に起因する可能性が高い。キメラ抗体のＰＫに達するためにはさらなる改良が必要であった。

【0344】

【0345】

表３Ａに示すＶＬとＶＨの組み合わせを有するヒト化抗体のうち、Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５を血中動態の試験に供した。使用した参照抗体は、特許情報またはデータベース情報に開示されているアミノ酸配列情報に基づく組換え発現により作製した、ＡＤ治療の臨床試験に使用するキメラ抗体Ｔａ１５０５及び公知のヒト化抗体である。具体的には、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）のデータベースをソラネズマブ（抗Ａ□抗体、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）について参照し；ＩＰＮ００７（抗タウＮ末端抗体、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ｉＰｉｅｒｉａｎ）には、ＷＯ２０１４／２００９２１Ａ１に開示されているＶＨ２Ｖｋ３のアミノ酸配列を使用し；また、ＭＡｂ３２２１（抗タウ－ｐＳ４２２抗体、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｋ．Ｋ．）には、ＷＯ２０１５／０９１６５６Ａ１に開示されているＶＨ３２ＶＬ２１のアミノ酸配列を使用した。

【0346】

各抗体を１１週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．）にそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内投与した。投与後１、３、８、及び２４時間時点、さらには３日目及び７日目に血液を採取して血漿を収集した。各抗体を３回試験した（Ｎ＝３）。

【0347】

血漿中の抗体濃度は、抗ヒトポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。具体的には、９６ウェルプレート（Ｍａｘ Ｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むＰＢＳ溶液を加え、４℃で一晩固定化し、３％ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングし、これによりヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体固定化プレートを作製した。

【0348】

これとは別に、既知濃度の一連の標準抗体試料を、抗体を投与しなかったマウスから採取した血漿で各抗体を段階希釈することにより調製し、検量線の作成のために測定した。

【0349】

測定対象の血漿試料及び標準試料をそれぞれ１００００倍に希釈し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体固定化プレートに５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間３０分反応させ、その後、プレートをＴＢＳ－Ｔ（トリス緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。その後、３％ＢＳＡ－ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の溶液を５０μＬ／ウェルでプレートに添加して室温で１時間反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、発色溶液（１ｍｇ／ｍＬ ｐＮＰＰ溶液）を１００μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの測定波長及び５５０ｎｍの基準波長で吸光度を測定した。標準試料の測定結果に基づいて検量線を作成し、この検量線を用いて各血漿試料中の抗体濃度を算出した。

【0350】

図５Ｂは、血漿中の抗体濃度の経時変化を示すグラフである。グラフから明らかなように、ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１（ＬＣ配列番号３２ ＨＣ配列番号１８）、Ｌ４６Ｈ１１（ＬＣ配列番号３６、ＨＣ配列番号１８）、及びＬ４７Ｈ６５（ＬＣ配列番号３８、ＨＣ配列番号３０）（全てヒトＩｇＧ１（配列番号１３５）及びヒトκ（配列番号７９）を使用）は、キメラ抗体Ｔａ１５０５と実質的に同じ血中動態を示した。これらのヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５の血中動態は、公知のヒト化抗体ＩＰＮ００７及びＭＡｂ３２２１の血中動態に匹敵し、公知のヒト化抗体ソラネズマブの血中動態より有意に優れていた。

【0351】

Ｇ．実施例７：脳内移行の分析
血漿中薬物動態を向上させたヒト化変異体の脳内濃度を分析する試験を実施した。

【0352】

抗体の注射の１週間後に、親マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体変異体（Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ３６Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、Ｌ４８Ｈ１２、Ｌ４８Ｈ４７、Ｌ４８Ｈ６４、Ｌ４７Ｈ６５、またはＬ４８Ｈ１１）を注射したマウスから血液を採取した。次に、動物を３種麻酔カクテルで麻酔し、開腹し、そして腹部大動脈を介して放血させた。その後、脳組織を採取した。この採取した脳組織を左右の半球に分け、ドライアイス／エタノールで凍結させ、－８０℃で保存した。凍結させた各半球を秤量し、２ｍＬチューブに移した。次に、０．８ｍＬのＴＢＳ－Ｉ（トリス緩衝食塩水、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤カクテル）を加え、混合物を氷水中で超音波処理した。超音波処理した混合物を３０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を集めた。上清をさらに１００，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心して脳ホモジネートを得た。

【0353】

ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体の１０μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））にピペットで移し、４℃で一晩静置した。その後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングを行い、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体を含むプレートを作製した。抗体を注射していないマウスから得た脳ホモジネートを用いて抗体を段階希釈し、標準物質を得た。

【0354】

脳ホモジネート及び標準物質を１０倍に希釈し、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体を含むプレートに５０μＬ／ウェルで、ピペットで移した。混合物を室温で２時間反応させ、次いでプレートをＴＢＳ－Ｔ（ＴＢＳ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次に、アルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ３７０１３３７－１ＭＧ）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで、ピペットで移し、反応を室温で１時間進行させた。次に、プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄し、発色試薬ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７９９８）を１００μＬ／ウェルで加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍと５５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0355】

標準物質を用いて検量線をプロットし、これを用いて脳ホモジネート中の抗体濃度を計算した。脳重量（全脳容積）あたりの抗体濃度を決定し、血漿濃度に対する比を計算した。

【0356】

図６Ａは、良好な薬物動態を有するヒト化抗体変異体（例えば、図５ＢによるＬ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５）の脳内濃度が向上していたことを示す。

【0357】

ＡＤ治療のための臨床試験に使用したキメラ抗体Ｔａ１５０５及び公知のヒト化抗体ソラネズマブ、ＩＰＮ００７、及びＭＡｂ３２２１を参照抗体として用いて、ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５のそれぞれの脳内移行を分析した。

【0358】

実施例６における各抗体の投与の１週間後、マウスから血液を採取し、次いでマウスを３種類の混合麻酔薬による麻酔下で開腹術に供した。腹部大静脈からの放血による死亡後、脳組織を採取した。収集した脳組織を左右の半球に分け、それらをドライアイスエタノール中で凍結させ、－８０℃で保存した。凍結させた半球のそれぞれを秤量し、２ｍＬのチューブに移し、そこに０．８ｍＬのＴＢＳ－Ｉ（トリス緩衝食塩水、プロテアーゼ阻害剤カクテル、及びホスファターゼ阻害剤カクテル）を加えた。次いで各半球を氷水中で超音波処理した。超音波処理した溶液を４℃、３０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収し、さらに４℃、１０００００×ｇで１５分間超遠心して脳ホモジネートを得た。

【0359】

脳ホモジネート中の抗体レベルを、抗ヒトポリクローナル抗体を用いた抗原ＥＬＩＳＡによって測定した。具体的には、１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを含むＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（Ｍａｘ Ｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に添加し、４℃で一晩固定化した後、３％ＢＳＡ－ＰＢＳでブロッキングし、それによって固定化プレートを製造した。

【0360】

これとは別に、既知濃度の一連の抗体標準試料を、抗体を投与していないマウスから採取した脳ホモジネートで各抗体を段階希釈することによって調製し、検量線の作成のために測定した。

【0361】

脳ホモジネート及び測定する標準試料をそれぞれ０．１％スキムミルク－３％ＢＳＡ－ＰＢＳで１０倍希釈し、５０μＬ／ウェルでＰＤ１７（Ｐ）固定プレートに添加し、室温で２時間反応させた。次にプレートをＴＢＳ－Ｔ（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。続いて、０．１％スキムミルク－３％ＢＳＡ－ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．、カタログ番号ＳＡＢ３７０１３３７：１ｍｇ）の溶液を５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、室温で１時間反応させた。プレートをＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、ｐＮＰＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．ＬＬＣ．、カタログ番号Ｐ７９９８：１００ｍＬ）を発色基質として１００μＬ／ウェルで添加し、続いて室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの測定波長及び５５０ｎｍの参照波長で吸光度を測定した。標準試料の測定結果に基づいて検量線を作成し、その検量線を用いて各脳ホモジネート試料中の抗体レベルを求め、脳内抗体レベルとして評価した。

【0362】

さらに、開腹前に採取した血液を用いて実施例６と同様にして血漿中の抗体レベルを測定し、血漿中の抗体レベルに対する脳内の抗体レベルの比を算出した。

【0363】

図６Ｂは、脳内の各抗体のレベルの、血漿中の対応する抗体のレベルに対する比を示すグラフである。ヒト化抗体Ｌ１５Ｈ１１、Ｌ４６Ｈ１１、及びＬ４７Ｈ６５の血漿中の抗体濃度に対する脳内の抗体濃度の比は、キメラ抗体Ｔａ１５０５及び公知のヒト化抗体ＩＰＮ００７、ＭＡｂ３２２１、及びソラネズマブの抗体濃度比に比べて高かった。この結果は、これらのヒト化抗体が脳への高い移行性を有することを示している。

【0364】

実施例８：選択的ヒト化抗体のさらなる開発
ＶＬ４６のＣＤＲ１配列にさらなる変異を導入し、脱アミド化ホットスポットを除去し、及び／またはＣＤＲ配列を親マウス配列に戻した。表１１は、ＶＬ４６ ＣＤＲ１に導入した変異をまとめたものである。
表１１．ＶＬ４６ ＣＤＲ１に導入した変異

【表17】

【0365】

さらに、新たに生成されたヒト化抗体変異体において、Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ１及びＩｇＧ４を含む異なるＩｇＧアイソタイプを試験した。表１２は、親マウス抗体及びキメラ抗体とともに、新たに生成されたヒト化抗体変異体の軽鎖及び重鎖をまとめたものである。
表１２．特異的抗体の軽鎖及び重鎖

【表18】

【0366】

Ｈ．実施例９：新たに生成されたヒト化抗体変異体のＢｉａｃｏｒｅ（商標）結合分析
新たに生成されたヒト化抗体変異体の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００及び４０００のバイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて測定した。以下のランニング緩衝液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６７１）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６７１）、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６７１）、２ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、１０７０８９８４００１、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、及び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８９９５０４３）を、以下に特に記載のない限り、固定化、試料希釈及びデータ収集に使用した。

【0367】

固定化したタンパク質とは、チップ上に固定化した組換えヒトリン酸化タウタンパク質を指し；固定化した１×Ｐペプチドとは、チップ上に固定化したリン酸化ペプチド（ＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳ（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＣ、配列番号７５）を指す。これらの方法は両方とも、親和性測定に対する結合活性成分を有する。４×Ｐペプチド分析物は、チップ上に捕捉された抗体及び溶液中の４×リン酸化ペプチド（ＧＡＥＩＶＹＫ（ｐＳ）ＰＶＶＳＧＤＴ（ｐＳ）ＰＲＨＬＳＮＶＳ（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ（ｐＳ）ＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ、配列番号７８）を有する。

【0368】

固定化したリン酸化タウタンパク質への抗体の結合を、シリーズＳセンサーチップＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１０００３４）を用いて測定した。固定化のためのランニング緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ_２、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６７１）であり、流速は１０μＬ／分であった。３５０ｍＭのＥＤＴＡを１分間注入してチップを洗浄し、続いて０．５ｍＭのＮｉＣｌ_２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＮＴＡ試薬キット）を２分間注入して、ｈｉｓタグ付加タンパク質を捕捉するためのチップを調製した。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００６３３）を使用して製造元の指示に従ってチップを活性化し、次に３００ｎＭのリン酸化タウタンパク質（８０ＡＷＢ）を所望の量のタンパク質が固定化されるまで注入した。アミンカップリングキットのエタノールアミンでチップをブロックした。各実験は、複数レベルの固定化リン酸化タウタンパク質を使用した。最低レベルは５４レゾナンスユニット（ＲＵ）～４５２ＲＵの範囲で様々であり、最高レベルは４６３ＲＵ～１０２０ＲＵの範囲で様々であった。固定化リン酸化タウタンパク質に結合するＴａ１５０５抗体の親和性を測定するために、０．３７ｎＭ～３０ｎＭの濃度が得られる、各抗体の５点構成の３倍希釈系列を調製した。各濃度及びいくつかの緩衝液のブランクを流速４５μｌ／分で３分間注入した。抗体の解離を１５分間モニタリングした後、１００ｍＭ ＣＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６０７０）、１Ｍ ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ９５４１）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ１０．５を３０秒～１分注入して表面を再生させた。

【0369】

固定化したリン酸化タウペプチドへの抗体結合を、シリーズＳセンサーチップＣＭ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００５３６）を用いて測定した。アミンカップリングキットを使用してチップを活性化し、次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の３０μｇ／ｍＬリン酸化タウペプチド（配列番号７５）を、５１ＲＵが固定化されるまで注入した。チップをエタノールアミンでブロックした。非リン酸化タウペプチド（ＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＣ、配列番号７７）を用いて、陰性対照の参照表面を同様に調製した。固定化リン酸化タウペプチドに結合するＴａ１５０５抗体の親和性を測定するために、０．３７ｎＭ～３０ｎＭの濃度が得られる、各抗体の５点構成の３倍希釈系列を調製した。各濃度及び数種類の緩衝液ブランクを流速４５μＬ／分で３分間注入した。抗体の解離を１５分間モニタリングした。１００ｍＭ塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳＡ５６－１、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の３０秒間の注入により、表面を再生させた。

【0370】

固定化抗体へのリン酸化タウペプチドの結合を、シリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９１４９６０３）を用いて測定した。アミンカップリングキットを用いてチップを活性化し、次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の１～３μｇ／ｍｌの抗体（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００３５１）を、２８０～９１００ＲＵの抗体が固定化されるまで注入した。チップをエタノールアミンでブロックした。固定化Ｔａ１５０５抗体に結合するリン酸化タウペプチド（配列番号７８）の親和性を測定するために、５．１ｎＭ～５００ｎＭの濃度が得られる、ペプチドの６点構成の２．５倍希釈系列を調製した。試料と数種類の緩衝液ブランクを３０～５０μＬ／分で３分間注入し、解離を１５分間モニタリングした。調整をせずに、または塩酸でｐＨを３．５に調整して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５を３０秒間注入して表面を再生させた。

【0371】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアバージョン２．０またはＢｉａｃｏｒｅ（商標）４０００評価ソフトウェアバージョン１．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、データを処理し、フィッティングした。陰性対照フローセルから反応を差し引き、及び緩衝液注入から反応を差し引くかまたは２回の緩衝液の注入結果から反応の平均を差し引くことによって、データを「二重参照」した。次いで、データを「１：１結合」モデルに当てはめて、会合速度定数ｋ_ａ（Ｍ^－１ｓ^－１、式中「Ｍ」はモル濃度に等しく、「ｓ」は秒に等しい）及び解離速度定数ｋ_ｄ（ｓ^－１）を決定した。これらの速度定数を用いて平衡解離定数、Ｋ_Ｄ（Ｍ）＝ｋ_ｄ／ｋ_ａを計算した。表１３は、新たに生成されたヒト化抗体変異体のＫ_Ｄ値を、親マウス抗体及びキメラ抗体のＫ_Ｄ値と比較してまとめたものである。
表１３．リン酸化タウタンパク質またはペプチドに対する抗体のＫ_Ｄ（ｎＭ）値

【表19】

【0372】

Ｉ．実施例１０：親マウス抗体、キメラ抗体、及びいくつかのヒト化抗体変異体のＥＬＩＳＡ結合分析
親マウス抗体、キメラ抗体、及び新たに生成されたヒト化抗体変異体の、リン酸化ペプチド（ＰＲＨＬＳＮＶＳ（ｐＳ）ＴＧＳＩＤＭＶＤ、配列番号７９）及び対応する非リン酸化ペプチド（ＰＲＨＬＳＮＶＳＴＧＳＩＤＭＶＤ、配列番号８０）への結合をＥＬＩＳＡによって分析した。

【0373】

ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのリン酸化または非リン酸化ペプチド５０μＬをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを３回洗浄し、４℃で一晩、２００μＬのｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋでブロッキングした。３日目に、プレートを３回洗浄した。次に、１０μｇ／ｍＬから開始して１：３で段階希釈したＥＬＩＳＡ緩衝液中の５０μＬの抗体をプレートの各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、次いで３回洗浄した。親マウス抗体の測定については、１：３０００希釈した５０μＬのヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０３０－０５）を添加した。キメラ抗体及びヒト化抗体の測定については、１：３０００希釈した５０μＬのヤギ抗ヒトＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ、１０９－０３６－０９８）を添加した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で４５分間インキュベートし、３回洗浄し、次いで室温で５分間、ＡＢＴＳで発色させた。その後、プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。

【0374】

図８Ａ及び８Ｂは、ハイブリドーマまたは組換え法によって生成した親抗体は、リン酸化ペプチドに結合したが（図８Ａ）、非リン酸化ペプチドには結合しなかった（図８Ｂ）ことを示す。同様に、キメラ抗体（ＩｇＧ１またはＩｇＧ４骨格のいずれかを有する）は、リン酸化ペプチドに結合したが（図８Ｃ）、非リン酸化ペプチドには結合しなかった（図８Ｄ）。

【0375】

図９Ａ～９Ｃは、新たに生成されたヒト化抗体変異体のほとんどが、キメラＩｇＧ４抗体に匹敵する親和性でリン酸化ペプチドに結合したが、その一方でいくつかの変異体はリン酸化ペプチドに対する結合親和性を失ったことを示す。特に図９Ｂでは、アミノ酸Ｎ３３からＤへの完全な脱アミド化を模倣するヒトＶＬ４６／ＶＨ１１＿Ｎ３３Ｄ＿ＩｇＧ４変異体が、リン酸化ペプチドへの結合を大幅に減少させ、完全に脱アミド化された抗体がリン酸化タウタンパク質への結合親和性を劇的に失わせるであろうことを示唆する。したがって、ヒト化抗体変異体におけるＮ３３での脱アミド化の減少は不可欠である。

【0376】

ＸＶ．実施例１１：アルツハイマー病患者の脳ホモジネート中の新たに生成されたヒト化抗体変異体の抗原結合分析
親マウス抗体、キメラ抗体、及び選択したヒト化抗体変異体を、液相中のアルツハイマー病（ＡＤ）患者臨床試料由来のＳｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）へのそれらの結合力について評価した。

【0377】

図１０Ａ～１０Ｅに記載するように、それぞれ、濃度を増大させた対照ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ２５１１）及び選択した抗体変異体と共にＡＤ脳試料をインキュベートした後に、マウスビオチン化Ｔａ１５０５ ＩｇＧ２ａ抗体を用いて検出した全抗原結合と遊離抗原結合との差によって、ｐＳｅｒ４１３－タウ上の抗体占有率を決定した。

【0378】

同じマウスビオチン化Ｔａ１５０５ ＩｇＧ２ａ抗体を用いた検出により、抗体変異体間の結合力価の直接比較が可能である。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド－ＬＣ－ビオチン（ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ．Ｋ．）を用いてマウスＴａ１５０５ ＩｇＧ２ａ抗体をビオチン化し、続いてＰＢＳで透析した。

【0379】

ＡＤ患者の脳由来の凍結前頭前皮質組織（１００ｍｇ）を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８６１２８１）を含有する１ｍＬのＴＢＳ－Ｉ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、カタログ番号ＢＰ２４７１－１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加し、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｚｅｒ ＩＩを使用して氷水上で溶解させた。ホモジナイズした試料をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｍａｘ－ＸＰ超遠心機で２７，０００ｇ（ＴＬＡ－５５ローター）、４℃で２０分間遠心分離し、上清を回収し、さらにＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｍａｘ－ＸＰ 超遠心機で１５０，０００×ｇ（ＴＬＡ－５５ローター）、４℃で２０分間遠心分離し、Ｐ２画分と呼ばれるペレットを得た。超音波処理によってＰ２画分を均質化緩衝液ＴＢＳ－Ｉに再懸濁した。Ｐ２画分のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２３２２５）を製造元の指示に従って使用して決定した。タンパク質濃度は４μｇ／ｍＬに調整した。

【0380】

ＩＮＮＯＴＥＳＴ（登録商標）ｐＴａｕ（ｐＴ１８１）キット（Ｆｉｊｉｒｅｂｉｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号８１５８１）を、Ｓｅｒ４１３リン酸化タウタンパク質（ｐＳｅｒ４１３－タウ）のためのＥＬＩＳＡシステムとして使用したが、キットに含まれるビオチン化抗体（ＣＯＮＪ１と表示）を上記で作製したビオチン化マウスＴａ１５０５ ＩｇＧ２ａ抗体に置き換えた。

【0381】

親マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体変異体、または対照ヒトＩｇＧを、試料希釈緩衝液（ＩＮＮＯＴＥＳＴ（登録商標）キットにより提供される）中でストックから２００ｎＭに希釈した。抗体溶液を次いで段階希釈し、アッセイプレート中で１／１０００に予め希釈したＡＤ脳Ｐ２画分と共に室温で４時間インキュベートした。次いで、抗体－抗原混合物を、希釈したビオチン化抗体マウスＴａ１５０５ ＩｇＧ２ａ（ＩＮＮＯＴＥＳＴ（登録商標）キットにより提供されるＣＯＮＪ ＤＩＬ１中１／１０）と共にＨＴ７抗体固定化ＭＴプレート（キットに含まれる）に加えた。得られた試料を混合し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＣＯＮＪ２としてキットに含まれる）をプレートに添加し、続いて１時間インキュベートした。洗浄後、発色試薬ＴＭＢを加え、遮光下室温で３０分間インキュベートした。次いで反応停止剤溶液（ＳＴＯＰ溶液としてキットに含まれる）を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍの波長での吸光度を測定した。

【0382】

図１０Ａ～１０Ｅに示す濃度反応曲線の非線形分析により、ＡＤ脳ホモジネート中のタウ ｐＳｅｒ４１３の５０％占有率に必要な各抗体の濃度、及び各抗体の最大占有率の割合を決定することができる。図１０Ａ～１０Ｅは、ＡＤ患者の脳ホモジネートにおける親マウス抗体、キメラ抗体、及び選択したヒト化抗体変異体について、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの占有率レベル及びｐＳｅｒ４１３タウ抗原の最大結合などの結合特性が同等であることを示す。

【0383】

ＸＶＩ．実施例１２：新たに生成されたヒト化抗体変異体の安定性及び純度分析
ナノＤＳＦを介して融解温度（Ｔｍｌ）及び凝集温度（Ｔａｇｇ）を測定することによって、様々な抗体の安定性を決定した。各抗体の純度は、ＳＥＣ及び非還元キャピラリーＳＤＳ（ＮＲ－ｃＳＤＳ）によって測定した。

【0384】

Ｔｍ及びＴａｇｇの決定：ＰＲ．ＴｈｅｒｍＣｏｎｔｒｏｌ ｖ２．０．４ソフトウェアによって制御されるＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８示差走査蛍光光度計（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してナノＤＳＦによってＴｍ及びＴａｇｇを決定した。励起電力は４０％であり、温度は１℃／分の速度で２０℃から９５℃に上昇させた。ＴｍとＴａｇｇは自動的に測定した。試料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５の緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬに希釈することによって調製し、毛管現象によってＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓガラス毛細管（ＰＲ－Ｌ００２）中に引き入れた。

【0385】

ＳＥＣによる純度の決定：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム上でＳＥＣを実施した。使用したカラムは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）のＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（部品番号１８６００５２２５、１．７μｍ、２００Ａ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）であった。カラム温度は２５℃で、１ｍｇ／ｍＬの試料１０μＬを０．５ｍＬ／分のシステム流量で注入した。移動相は１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．０であった。データを２１４及び２８０ｎｍの両方で定量し、Ｅｍｐｏｗｅｒ３ソフトウェアを使用して分析した。Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）のＢＥＨ２００ ＳＥＣタンパク質標準混合物（部品番号１８６００６５１８）を１０μｇで注入し、ＵＳＰ分解能、理論段、及びテーリングを測定した。

【0386】

ＮＲ－ｃＳＤＳによる純度の決定：ＮＲ－ｃＳＤＳによる純度の評価のために、１ｍｇ／ｍＬの各試料５μＬを、５０ｍＭのヨードアセトアミドを含むローディングバッファー（ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））３５μＬと９６ウェルプレートで混合した。プレートを７０℃で２０分間インキュベートし、７５μＬの水を各ウェルに加えた。各試料を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で分析した。試料の蛍光を経時的に測定することによってエレクトロフェログラムを収集し、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアＶ４．１．１６１９．０ ＳＰ１（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して統合した。

【0387】

表１４は、試験した抗体の安定性及び純度をまとめたものである。
表１４．様々な抗体の安定性と純度

【表20】

【0388】

新たに生成されたヒト化抗体変異体は全て、親マウス抗体またはキメラ抗体に比べて安定性及び純度が維持されるかまたは向上していた。元のヒト化変異体であるヒトＶＬ４７／ＶＨ６５＿ＩｇＧ１のうちの１つは、Ｔｍｌ／Ｔａｇｇによって測定されるように安定性の低下が際立っていた。

【0389】

ＸＶＩＩ．実施例１３：新たに生成されたヒト化抗体変異体の脱アミド化分析
様々な抗体の軽鎖ＣＤＲ１中のアミノ酸Ｎ３３の脱アミド化レベルを測定した。５０℃またはｐＨ１０でのインキュベーションなどのストレス条件を試験した。対照として４℃でのインキュベーションを行った。

【0390】

４℃及び５０℃でのインキュベーション：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に配合した２ｍｇ／ｍｌの試料を、温度制御下の安定チャンバー内に５０℃で１週間保持した。比較用の４℃対照については、試料を４℃に保持した。

【0391】

ｐＨ１０でのインキュベーション：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中に配合した２ｍｇ／ｍＬの試料を、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ１０に調整し、温度制御下の安定チャンバー内に２５℃で１週間保持した。その後、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（７Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ２ｍＬ、８９８９０）を用いて、試料を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５．５の緩衝液中にバッファー交換した。

【0392】

ペプチドマッピングによる脱アミド化分析：質量分析によるペプチドマッピングのために、１００μｇの各試料を３０μＬの８Ｍグアニジン／１Ｍトリス塩酸塩溶液（１５：１）で変性させ、１Ｍ ＤＴＴ ２μＬで６０℃で、３０分間還元し、１Ｍヨードアセトアミド５μＬで、暗所において４５分間アルキル化した。消化の前に、７キロダルトンの分子量カットオフのＺＥＢＡカートリッジを用いて試料を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムにバッファー交換した。試料を異なるチューブに分け、２μｇのトリプシンとキモトリプシンで並行して３７℃で２時間消化した。各試料に３μＬの５Ｍ塩酸塩を添加することによって消化を停止させた。４０℃に維持したＰｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ－Ｃ１８－１ｘ５０ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣカラム（部品番号１８６００５５９２）に２μＬの試料を注入した。Ｄｉｏｎｅｘ／ＱＥ ｐｌｕｓ ＭＳにおいて、０．１％ギ酸中２％～３６％のアセトニトリルの５０分間にわたる線形勾配を用いてデータを取得した。データベース検索についてはＰＥＡＫＳ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）、ならびにパーセント変化評価についてはＰｅｐＦｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び手動検証を用いて試料を分析した。表１５は、試験した抗体の軽鎖ＣＤＲ１中のアミノ酸Ｎ３３の脱アミド化の割合をまとめたものである。
表１５．様々な条件下での軽鎖ＣＤＲ１中のＮ３３の脱アミド化割合（％）

【表21】

【0393】

親マウス抗体及び元のヒト化変異体（ＶＬ４６／ＶＨ１１）ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体に比べて、新たに生成されたヒト化抗体変異体は、軽鎖ＣＤＲ１中のＮ３３の脱アミド化レベルの有意な減少を示した。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメイン；及び
ｂ）配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１０３から選択される軽鎖可変ドメイン、を含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様２）
ａ）配列番号１１６及び配列番号１１７から選択される重鎖可変ドメイン；及び
ｂ）配列番号１１４、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１０３から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体であって、配列番号８のリン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性の、配列番号６９の非リン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性に対する比が少なくとも約４０である、前記抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様３）
前記抗体が、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４４から選択される重鎖定常ドメインを含む、態様１又は２に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様４）
前記抗体が、配列番号７９及び配列番号８０から選択される軽鎖定常ドメインを含む、態様１～３のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様５）
前記可変軽鎖ドメインが配列番号１１４を有し、前記可変重鎖ドメインが配列番号１１６を有する、態様１～４のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様６）
前記抗体の軽鎖が配列番号１８４を有し、前記抗体の重鎖が配列番号１４４を有する、態様５に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様７）
前記軽鎖が配列番号１８４を有し、前記抗体の重鎖が配列番号１５２を有する、態様５に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様８）
前記重鎖及び前記軽鎖が、ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４４；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４５；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４６；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４７；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４８；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１４９；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５０；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５１；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５２；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５３；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５４；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５５；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５６；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５７；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５８；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１５９；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１６０；ＬＣ配列番号１８４及びＨＣ配列番号１６１；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４４；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４５；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４６；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４７；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４８；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１４９；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５０；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５１；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５２；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５３；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５４；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５５；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５６；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５７；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５８；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１５９；ＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１６０、ならびにＬＣ配列番号１８５及びＨＣ配列番号１６１のペアから選択される、態様１～７のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様９）
ａ）配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、及び配列番号１８５から選択される軽鎖をコードする第１の核酸；ならびに
ｂ）配列番号１４４、配列番号１４５；配列番号１４６；配列番号１４７；配列番号１４８；配列番号１４９；配列番号１５０；配列番号１５１；配列番号１５２；配列番号１５３；配列番号１５４；配列番号１５５；配列番号１５６；配列番号１５７；配列番号１５８；配列番号１５９；配列番号１６０及び配列番号１６１から選択される重鎖をコードする第２の核酸を含む、核酸組成物。
（態様１０）
前記第１の核酸が第１の発現ベクターに含まれ、前記第２の核酸が第２の発現ベクターに含まれる、態様９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物。
（態様１１）
前記第１の核酸及び前記第２の核酸が発現ベクターに含まれる、態様９に記載の核酸組成物を含む発現ベクター組成物。
（態様１２）
態様１０または１１に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
（態様１３）
前記抗体を発現させ、前記抗体を回収する条件下で態様１２に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体の作製方法。
（態様１４）
態様１～８のいずれか一項に記載の抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体を対象に投与することを含む、前記対象におけるタウオパチーの治療方法。
（態様１５）
ａ）配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）
ｉ）配列番号１０２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号９１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号９２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号９３を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖ）配列番号９４を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉ）配列番号９５を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉｉ）配列番号９６を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉｉｉ）配列番号９７を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｘ）配列番号９８を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｘ）配列番号９９を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｘｉ）配列番号１００を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ならびに
ｘｉｉ）配列番号１０１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３
からなる群から選択される一組のｖｌＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン、を含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。
（態様１６）
ａ）配列番号８６を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号１１５を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号８８を有するｖｈＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；ならびに
ｂ）
ｉ）配列番号１０２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号９１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号９２を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号９３を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖ）配列番号９４を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉ）配列番号９５を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉｉ）配列番号９６を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｖｉｉｉ）配列番号９７を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｉｘ）配列番号９８を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｘ）配列番号９９を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；
ｘｉ）配列番号１００を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３；ならびに
ｘｉｉ）配列番号１０１を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号８２を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号８３を有するｖｌＣＤＲ３
からなる群から選択される一組のｖｌＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン、を含む抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体であって、
配列番号８のリン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性の、配列番号６９の非リン酸化ペプチドへの前記抗体の結合親和性に対する比が少なくとも約４０である、前記抗ｐＳｅｒ４１３タウ抗体。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A-B】

【図9C】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15】

【配列表】

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