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▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-10-27
(45)【発行日】2022-11-07
(54)【発明の名称】発作を抑制する組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/741 20150101AFI20221028BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20221028BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20221028BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221028BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221028BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20221028BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20221028BHJP
【ＦＩ】
A61K35/741
A61P25/08
A23L33/135
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K9/20
A61K9/48
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019554495
(86)(22)【出願日】2017-12-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-23
(86)【国際出願番号】 US2017067548
(87)【国際公開番号】W WO2018119048
(87)【国際公開日】2018-06-28
【審査請求日】2020-12-18
(31)【優先権主張番号】62/447,992
(32)【優先日】2017-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/436,711
(32)【優先日】2016-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，エレイン
(72)【発明者】
【氏名】ヤノ，ジェシカ
(72)【発明者】
【氏名】ヴォン，ヘレン
(72)【発明者】
【氏名】オルソン，クリスティーン
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１４３９６１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５０３４１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】J. Mol. Endocrinal., (2017(Epub:2016.12.07)), 58, [1], p.1-14
【文献】Mol. Autism, (2016.09), 7, [1], Article.37
【文献】Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol., (2016.11), 2016, Article.9032809
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／７４１
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１０重量％の生きているＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの細菌、及び少なくとも１０重量％の生きているＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅの細菌を含有する、てんかんの発作の治療において使用するための組成物。
【請求項2】
前記Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの細菌及び／又は前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅの細菌が、組成物中で結合剤と混合されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの細菌及び／又は前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅの細菌が、乾燥状態で存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの細菌及び／又は前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅの細菌が、医療食品（ｍｅｄｉｃａｌ ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）中に存在する、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａである、請求項１から４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの細菌及び／又は前記Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅの細菌が、ＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５、ＡＴＣＣ ４３１８４、又はこれらの組合せからなる群より選択される１種以上の細菌株を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
液体又はゲル組成物中にＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％がＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅである、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物中の前記細菌の約５０％がＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅであり、前記組成物中の前記細菌の約５０％がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａである、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
経口送達用に製剤化される、請求項１から９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
てんかんの発作の治療を受ける対象の胃腸組織と生理学的適合性がある薬学的に許容可能な担体を含有する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
丸剤、錠剤、又はカプセル剤に製剤化されている、請求項１から１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項13】
カプセル剤又は錠剤が腸溶性コーティングされたカプセル剤又は錠剤である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
細菌増殖を促進する他のプロバイオティック剤又は栄養剤をさらに含有する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１６年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／４３６，７１１号、及び２０１７年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，９９２号への優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０１６年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／４３６，７１１号、及び２０１７年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４４７，９９２号への優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【0002】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された、助成金番号ＧＭ０６５８２３、及び助成金番号ＧＭ１０６９９６の下で政府支援によって行われた。政府は、本発明にある一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された、助成金番号ＧＭ０６５８２３、及び助成金番号ＧＭ１０６９９６の下で政府支援によって行われた。政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
てんかんは、意識（ａｗａｒｅｎｅｓｓ）消失、意識（ｃｏｎｓｃｉｏｕｓｎｅｓｓ）消失、及び／または運動、自律神経機能、感覚（視覚、聴覚及び味覚を含む）、気分、及び／または精神機能の障害につながる可能性がある、反復性の発作を特徴とする。てんかんは、先進国の人口の１～２％を苦しめる。
【0004】
低炭水化物、高脂肪のケトン食療法（ＫＤ）は、難治性てんかんのための治療であり、その中で３分の１を上回るてんかん個体は、既存の抗けいれん薬に反応しない。ＫＤの有効性は、複数の後ろ向き及び前向き研究によって支援され、約３０％の患者に発作がなくなり、約６０％の患者が有意な利益を経験すると推定される。しかしながら、てんかんの治療についてのその値、ならびに自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、代謝症候群及びがんを含む他の疾患へのその適用の増加にもかかわらず、実行、食事コンプライアンス及び有害副作用を有する難しさのために、ＫＤの使用は低いままである。実際に、好結果の発作減少にもかかわらず、てんかん患者のＫＤ継続は、食事療法の３年目までに推定１２％に過ぎない。さらに、ＫＤの有益な効果の根底にあるメカニズムは、不十分に理解され、介入治療のための分子及び／または細胞標的はない。薬物が失敗した場合にさまざまな種類の症状を制御することに食事制限が成功することは、既存の薬物によって標的とされない内因性神経保護経路を食事制限が増強することを示唆する。
【発明の概要】
【0005】
本明細書に提供されるのは、プロバイオティック組成物を対象へ投与することによって、ケトン食療法の効果を模倣する方法及び組成物である。ある特定の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象（たとえば、自閉スペクトラム症、レット症候群、脆弱Ｘ、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、難治性てんかん、及び／または非難治性てんかんなどの、神経発達障害を有する対象）における発作の治療または予防のためのものである。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象における病態（たとえば、てんかん、発作、自閉症スペクトラム症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患（たとえば、糖尿病または肥満症）、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛（たとえば、慢性片頭痛）、レット症候群、注意欠陥障害、脆弱Ｘ症候群、または外傷性脳損傷（ＴＢＩ））を予防する、または治療するためのものである。好ましくは、これらの方法は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む１つの組成物、またはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属を合わせて含む複数の組成物を対象へ投与することを備える。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む。いくつかの実施形態において、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む。いくつかの実施形態において、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む。いくつかの態様において、これらの方法は、対象の腸内微生物叢を枯渇させ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を含む組成物を対象へ投与することを備える。いくつかの実施形態において、この組成物中の細菌の少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である。いくつかの実施形態において、この組成物中の細菌の少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、または少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である。いくつかの実施形態において、対象は、食事制限中であり、この食事制限は、対照食事制限、ケトン食療法、高脂肪食、または低炭水化物食であることができる。この組成物は、経口または直腸送達のために製剤化されることができる。この組成物は、食品であることができる。いくつかの実施形態において、この食品は、乳製品（たとえば、ヨーグルト）である。いくつかの実施形態において、この組成物は、プロバイオティクスを含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、自己投与される。いくつかの実施形態において、この組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の細菌、及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を含有する糞便試料（たとえば、糞便バンクからの糞便試料）を含む。いくつかの実施形態において、対象に抗生物質を与え、対象の腸内微生物叢を枯渇させる。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1A】図１は、Ａ～Ｆの６つの部分を有し、発作の予防を示し、ケトン食療法に応答性であるケトン体生成が腸内微生物叢中の変化と相関する。Ａは、２、４、８、１０または１４日間、対照食餌制限（ＣＤ）またはケトン食療法（ＫＤ）を給餌されたマウスの独立したコホート内で６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す（左側）。ｎ＝８、６、９、２０、６（ＣＤ）；８、７、１２、２１、５（ＫＤ）。食餌処置後１４日に発作試験されたマウスの代表的なコホートにおける行動（右側）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化するための閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１６。Ｂは、２、４、８、１０または１４日間ＣＤまたはＫＤを給餌されたマウスの独立したコホートにおける血清グルコースのレベルを示す。データは、各時点についてＳＰＦ ＣＤマウスに見られた血清グルコースレベルに対し正規化される。ｎ＝８、５、８、８、１９（ＣＤ）；８、８、８、７、１９（ＫＤ）。Ｃは、２、４、８、１０または１４日間、ＣＤまたはＫＤを給餌されたマウスの独立したコホートにおける血清ベータ－ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢ）のレベルを示す。ｎ＝８、１３、８、８、３７（ＣＤ）；８、１６、８、７、３８（ＫＤ）。Ｄは、０、４、８または１４日間、ＣＤまたはＫＤを給餌されたマウスの独立したコホートからの糞便の１６Ｓ ｒＤＮＡプロファイリングに基づく重み付き（左側）及び非重み付き（右側）のＵｎｉＦｒａｃ距離行列の主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。ｎ＝３ケージ（９匹のマウス）／群。Ｅは、１４日間ＣＤまたはＫＤを給餌されたマウスからの糞便の１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングデータのアルファ多様性を示す。ｎ＝３ケージ／群。Ｆは、糞便の１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングデータからのＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の相対的存在量を示す。ｎ＝３ケージ（９匹のマウス）／群。平均値±標準誤差としてデータを提示する。ボンフェローニによる二元配置分散分析（ａ～ｃ、ｅ）、ボンフェローニによるクラスカル－ウォリス法（ｆ）：Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度、ＢＨＢ＝ベータ－ヒドロキシ酪酸、ＯＴＵ＝操作的分類単位。
【図2A】図２は、Ａ～Ｂの２つの部分を有し、ケトン食療法がＫＤ対ＣＤの腸内微生物叢を区別する選択細菌種を濃縮することを示す。Ａは、１時点あたりｎ＝３のＣＤ（上部）対ＫＤ（下部）による処置後の０、４、８、及び１４日目に、糞便腸内微生物叢の１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングに基づくアルファ多様性を示す。Ｂは、ＫＤ（上段）またはＣＤ（下段）を給餌されたＳＰＦマウス内に濃縮される選択細菌分類群の相対的存在量を示す。ｎ＝３。データは、平均値＋標準誤差として提示される。ボンフェローニによるクラスカル－ウォリス：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法。
【図3-1】図３は、Ａ～Ｄの４つの部分を有し、ケトン食療法の抗発作効果に対する腸内微生物叢の相関を示す。Ａは、ＣＤまたはＫＤを給餌されたＳＰＦ、ＧＦまたはコンベンショナル化ＧＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝１３、１８、１２、６。Ｂは、ＣＤまたはＫＤを給餌されたＳＰＦ、ＧＦまたはコンベンショナル化ＧＦマウスにおいて、血清ＢＨＢ（左側）及びグルコース（右側）レベルを示す。ｎ＝３７、３８、１９、８。Ｃは、ビークルまたはＡｂｘ事前食餌処置により処置されたＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝１３、１８、１３。Ｄは、ビークルまたはＡｂｘ事前食餌処置により処置されたＳＰＦマウスにおいて、血清ＢＨＢ（左側）及びグルコース（右側）のレベルを示す。ｎ＝１８、１８、１９（ＢＨＢ）；ｎ＝１２、１１、１１（グルコース）。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによる一元配置分散分析：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＧＦ＝無菌、ＧＦ－ｃｏｎｖ＝ＳＰＦ微生物叢によってコンベンショナル化された無菌、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度。ＢＨＢ＝ベータ－ヒドロキシ酪酸、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）。
【図4A】図４は、Ａ～Ｂの２つの部分を有し、ＫＤ関連細菌がケトン食療法の抗発作効果を十分に媒介したことを示す。Ａは、ビークルまたはＡｂｘにより前処置され、またＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、これらの両方、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ（左側）によりコロニー形成されたＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚ刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝１３、１８、１５、６、８、５、５。発作試験されたマウスの代表的なコホートにおける行動（右側）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化するための閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１２、１６、８、２５。Ｂは、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）及び／またはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（上部）によりコロニー形成されたＧＦマウスにおける６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝１５、４、９、９。発作試験されたマウスにおける行動（下部）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化するための閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１７、１９。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによる一元配置分散分析：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＧＦ＝無菌、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）によって前処置された、Ｐｂ＝Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ａｋｋ＝Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂｆ＝Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ。
【図5A】図５は、Ａ～Ｃの３つの部分を有し、ＫＤ関連微生物叢が対照食餌制限を給餌されたマウスに発作予防を与えることを示す。Ａは、ＣＤ微生物叢（ＣＤ－ＦＭＴ）またはＫＤ微生物叢（ＫＤ－ＦＭＴ）を移植し、ＣＤまたはＫＤ（左側）を給餌された、Ａｂｘ処置されたＳＰＦにおいて６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝６、５、５。発作試験されたマウスの代表的なコホートにおける行動（右側）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化する閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１２。Ｂは、ビークルまたはＡｂｘによって前処置され、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、両方、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍによりコロニー形成されたＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す（左側）。ｎ＝１３、１８、９、８、６、６。Ｃは、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡｋｋＰｂ）、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ単独（Ａｋｋ）、または加熱殺菌Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（ｈｋ－ＡｋｋＰｂ）によって経口経管栄養を行われたＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す（左側）。ｎ＝６、６、４、３。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによる一元配置分散分析：＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度、ＣＤ－ＦＭＴ＝ＣＤ微生物叢を移植した、ＫＤＦＭＴ＝ＫＤ微生物叢を移植した、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）によって前処置された、Ｐｂ＝Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ａｋｋ＝Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂｆ＝Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、ｈｋ－ＡｋｋＰｂ＝加熱殺菌されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ。
【図6A】図６は、Ａ～Ｄの４つの部分を有し、対照食餌制限に応答性であるＫＤ微生物叢及びＫＤ関連発作予防の復帰を示す。Ａは、２８日間ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス（ＣＤ）、２８日間ＫＤを給餌されたマウス（ＫＤ）、または１４日間ＫＤ後に１４日間ＣＤを給餌されたマウス（ＫＤ－ＣＤ）からの糞便の縦方向の１６Ｓ ｒＤＮＡプロファイリングに基づき重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離行列の主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。ｎ＝３ケージ／群。Ｂは、２８日間ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス（ＣＤ）、２８日間ＫＤを給餌されたマウス（ＫＤ）、または１４日間ＫＤ後に１４日間ＣＤを給餌されたマウス（ＫＤ－ＣＤ）において、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す（左側）。ｎ＝４。Ｃは、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡｋｋＰｂ）、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ単独（Ａｋｋ）、または加熱殺菌されたＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種（ｈｋ－ＡｋｋＰｂ）によるプロバイオティック処置の２１日後にＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す（左側）。ｎ＝８。Ｄは、ビークルまたはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡｋｋＰｂ）によって、４日間経口経管栄養を行われたＳＰＦマウスにおいて、６Ｈｚの刺激に応答性である発作閾値を示す。ｎ＝６、７、７、７。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによる一元配置分散分析：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｎ.ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＫＤ－ＣＤ＝１４日間ＫＤ後に１４日間ＣＤを給餌された。ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｋｋ＝Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ｈｋ－ＡｋｋＰｂ＝加熱殺菌されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ。
【図7A】図７は、Ａ～Ｅの５つの部分を有し、ＫＤ関連細菌がケトン食療法に応答性である強直間代発作に対する予防を媒介することを示す。Ａは、１４日間ＣＤまたはＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－マウスの糞便の１６Ｓ ｒＤＮＡプロファイリングに基づき重み付けされたＵｎｉＦｒａｃ距離の主座標分析（ＰＣｏＡ）を示す。ｎ＝５ケージ／群。Ｂは、糞便の１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングデータからのＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の相対的存在量を示す（右側）。ｎ＝５ケージ／群。Ｃは、Ｄにおいて定量化された発作を定義するために使用される段階を示す、代表的なＥＥＧトレースを示す。Ｄは、ビークルまたはＡｂｘによって処置され、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によってコロニーを形成され、またはコロニーを形成せず、そしてＣＤまたはＫＤを給餌されたＳＰＦ Ｋｃｎａ１－／－マウスにおいて、１日あたりの発作の平均数（左側）、及び１日あたりの発作の全持続時間（右側）を示す。ｎ＝２、８、６、１２、９、３。Ｅは、ＧＧｓＴｏｐによって処置されたＳＰＦ ＣＤ Ｋｃｎａ１－／－マウスにおいて、１日あたりの発作の平均数（左側）、１発作あたりの平均持続時間（中央）、及び１日あたりの発作の全持続時間（右側）を示す。ＳＰＦ ＣＤマウスについてのデータは、（Ｄ）の通りである。ｎ＝６、４。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによるクラスカル-ウォリス（Ａ，Ｂ）、Ｄｕｎｎによるノンパラメトリック一元配置ネスト分散分析（Ｄ）、ノンパラメトリックコルゴモロフ－スミルノフｔ検定（Ｅ）。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質により前処置された（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ。
【図8A】図８は、Ａ～Ｄの４つの部分を有し、末梢ガンマ－グルタミルアミノ酸における減少、ならびに食餌制限及び微生物叢依存性発作予防に関する海馬のＧＡＢＡ／グルタミン酸塩の比における増大の関連性を示す。Ａは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスからの結腸内腔代謝産物（上部）及び血清代謝産物（下部）の主成分分析を示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｂは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスからの結腸内腔内容物中のガンマ－グルタミル化アミノ酸及びシステインのレベルを示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｃは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスからの血清中のガンマ－グルタミルアミノ酸及びグルタミンのレベルを示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｄは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスの海馬におけるＧＡＢＡ／グルタミン酸塩（左側）及びグルタミン（右側）のレベルを示す。ｎ＝５。データは、平均値±の標準誤差として提示される。二元配置分散分析対比（Ａ～Ｃ）、ボンフェローニによる一元配置分散分析（Ｄ）：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）によって前処置された、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ａ．ｕ．＝任意の単位。
【図9A】図９は、Ａ～Ｄの４つの部分を有し、ケトン食療法及び微生物叢状態による結腸内腔及び血清メタボロームの調節を示す。Ａは、結腸内腔中で検出された６２２個、及び血清中で検出された６７０個からの代謝産物において統計学的に有意な変化の数を示す。黒色テキストに示された値は、変化した代謝産物の総数であり、緑色の値は、上向き調節を示し、赤色の値は、下向き調節を示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｂは、結腸内腔（上部）及び血清（下部）のメタボロミクススクリーニングによって検出されたグルコース（左側）及びＢＨＢ（右側）のレベルを示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｃは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスからの結腸内腔内容物中の非ガンマグルタミル化アミノ酸のレベルを示す。ｎ＝８ケージ／群。Ｄは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウス、及びＫＤを給餌されたＡｋｋＰｂコロニー形成マウスからの血清中の非ガンマグルタミル化アミノ酸のレベルを示す。ｎ＝８ケージ／群。データは、平均値±の標準誤差として提示される。二元配置分散分析対比：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ｎ．ｓ．＝統計学的に有意ではない。ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）によって前処置された、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ａ．ｕ．＝任意の単位、ＢＨＢ＝ベータ－ヒドロキシ酪酸。
【図10A】図１０は、Ａ～Ｈの８つの部分を有し、ケトン食療法及び細菌交差給餌がガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性を低下させることを示し、これにより十分な発作予防を与える。Ａは、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウスに、ＧＧＴ阻害剤、ＧＧｓＴｏｐによる経口経管栄養に応答性である６Ｈｚの発作閾値を示す（左側）。ｎ＝６、９。発作試験されたマウスにおける行動（右側）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化するための閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１６。Ｂは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種について濃縮されたＡｂｘ処置ＳＰＦマウス中のケト原性アミノ酸による補給に応答性である６Ｈｚの発作閾値を示す（左側）。ｎ＝５、６。発作試験されたマウスにおける行動（右側）。破線は、ｙ＝１０秒で、発作をスコア化するための閾値を表し、三角形は、２４ｍＡで１実験コホートあたりの開始電流を示す。ｎ＝１２。Ｃは、ＳＰＦ ＣＤ、ＳＰＦ ＫＤ、ＡｋｋＰｂ ＫＤ、またはＡｋｋＰｂ ＣＤマウスからの１００ｍｇの糞便あたりの総合ＧＧＴ活性（左側）、及びＧＧｓＴｏｐによる阻害（右側）を示す。ｎ＝５。Ｄは、２８日間１日２回、ビークル、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種プロバイオティック、または加熱殺菌された細菌により処置されたＳＰＦ ＣＤ動物からの１００ｍｇの糞便あたりの総合ＧＧＴ活性（左側）、ならびにＧＧｓＴｏｐによる阻害（右側）を示す。ｎ＝５。Ｅは、生きているＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ（ＰｂＭ）を含む、または細菌を含まない（０）、Ｍ９最少培地によって重層されたＣＤ対ＫＤ培養培地中で、またはＣＤもしくはＫＤ寒天中でインキュベーション後、生きているＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（Ａｋｋ）のレベルを示す。ｎ＝３。Ｆは、Ａｋｋを含む、または細菌を含まない（０）、ＣＤまたはＫＤ寒天上に重層されたＭ９最少培地中にインキュベーション後、生きているＰｂＭのレベルを示す。ｎ＝５。Ｇは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、または細菌を含まない、ＣＤ寒天上に重層されたＭ９培地中でｔ＝２４時間で増殖したＰ．ｍｅｒｄａｅにおけるＧＧＴ活性、及びＧＧｓＴｏｐによるＧＧＴ活性の阻害を示す。ｎ＝５。Ｈは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、または細菌を含まない、ＫＤ寒天上に重層されたＭ９培地中にｔ＝２４時間で増殖したＰ．ｍｅｒｄａｅにおけるＧＧＴ活性、及びＧＧｓＴｏｐによるＧＧＴ活性の阻害を示す。ｎ＝５。データは、平均値±の標準誤差として提示される。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（ａ、ｂ）、ボンフェローニによる二元配置分散分析（Ｃ、Ｄ）、ボンフェローニによる一元配置分散分析（Ｅ～Ｈ）：＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来法でコロニー形成された）、ＣＤ＝対照食餌制限、ＫＤ＝ケトン食療法、ＣＣ５０＝試験されたマウスの５０％で発作を引き起こす電流強度、ＡＡ＝アミノ酸、ｖｅｈ＝ビークル、Ａｂｘ＝抗生物質（アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、メトロニダゾール［ＡＶＮＭ］）によって前処置された、ＡｋｋＰｂ＝Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、ＧＧｓＴｏｐ＝ＧＧＴ阻害剤、ＰｂＭ＝Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ、Ａｋｋ＝Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｍ９＝最少培地、ＧＧＴ＝ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ＡＵ＝任意の単位。
【図11A】図１１は、Ａ及びＢの２つの部分を有し、発作におけるアミノ酸効果、細菌性ＧＧＴ活性、及びアミノ酸代謝について細菌遺伝子の食餌調節を示す。Ａは、ＧＧｓＴｏｐまたはビークルによって処置される、従来法で培養されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ（左側）及びＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（右側）におけるＧＧＴ活性を示す。ｎ＝５。Ｂは、Ｍ９最少培地中でビークルまたはＧＧｓＴｏｐにより前処置されたＰ．ｍｅｒｄａｅ（ＰｂＭ）によって重層されたＣＤ寒天中で０、７、または２４時間インキュベーション後の、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（Ａｋｋ）のレベルを示す。ｎ＝３。データは、平均値±の標準誤差として提示される。ボンフェローニによる一元配置分散分析（ａ）：＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニによる二元配置分散分析（ｂ）：＊＊Ｐ＜０．０１、ＰｂＭ＝Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ、Ａｋｋ＝Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、ＧＧｓＴｏｐ＝ＧＧＴ阻害剤、ＧＧＴ＝ガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ＡＵ＝任意の単位。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本明細書に提供されるのは、プロバイオティック組成物を投与することによってケトン食療法の効果を模倣する方法及び組成物である。ある特定の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象（たとえば、自閉症スペクトラム症、レット症候群、脆弱Ｘ、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、難治性てんかん、及び／または非難治性てんかんなどの、神経発達疾患を有する対象）における発作の処置及び予防のためのものである。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象における病態（たとえば、自閉症スペクトラム症、てんかん、発作、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患（たとえば、肥満症または糖尿病）、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛（たとえば、慢性片頭痛）、レット症候群、注意欠陥障害、脆弱Ｘ症候群、または外傷性脳損傷（ＴＢＩ））を予防する、または処置するためのものである。好ましい実施形態において、これらの方法は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を含む１つの組成物、またはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を合わせて含む複数の組成物を対象へ投与することを備える。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中の神経伝達物質生合成を変化させる。ある特定の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中の血清ケト原性アミノ酸を変化させる。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中のガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性を低下させる。ある特定の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中のグルタミン合成酵素活性を低下させる。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中のガンマ－グルタミルアミノ酸を減少させる。ある特定の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中でＧＡＢＡ／グルタミン酸塩の比のレベルを上昇させる。他の実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象中のグルタミンレベルを上昇させる。他の実施形態において、これらの方法は、対象の腸内微生物叢を枯渇させ、対象へＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌を含む１つの組成物、またはＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌を合わせて含む複数の組成物を投与することを備える。
【0008】
定義
本明細書に使用されるように、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。請求項（複数可）において本明細書に使用されるように、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用されるときに、単語「ａ」、または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。本明細書において使用されるような、「別の」は、少なくとも二番目以降を意味することができる。
本明細書に使用されるように、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。請求項（複数可）において本明細書に使用されるように、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用されるときに、単語「ａ」、または「ａｎ」は、１つ以上を意味することができる。本明細書において使用されるような、「別の」は、少なくとも二番目以降を意味することができる。
【0009】
本明細書に使用されるような、語句「薬学的に許容可能な担体」は、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤または封入材料などの、薬学的に許容可能な材料、組成物またはビークルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、対象に有害ではないという意味の「許容可能」でなければならない。いくつかの例の材料は、薬学的に許容可能な担体として機能することが可能であり、（１）ラクトース、グルコース及びショ糖などの糖類、（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン類、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及びセルロースアセテートなどのセルロース及びその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑石、（８）カカオバター及び座薬ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油類、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール類、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤類、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液類、ならびに（２１）薬学的な製剤化に用いられる他の非毒性の適合性のある物質を含む。
【0010】
用語「予防する」は、当該技術分野において承認され、局所再発などの病態に関連して使用されるときに、当該技術分野において十分に理解されており、組成物を受けない対象と比較して、対象における医学的病態の症状の頻度を減少させる、またはこれらの症状の発生を遅らせるこの組成物の投与を含む。したがって、発作の予防は、たとえば、統計的に、及び／または臨床的に有意な量で、たとえば、未処置の対照母集団と比較して予防的処置を受ける患者の母集団における発作数を減少させること、及び／または未処置対照母集団に対して処置母集団における検出可能な病変の出現を遅らせることを備える。
【0011】
用語「予防的な」または「治療的な」処置は、当該技術分野において承認され、対象の組成物の１つ以上の宿主への投与を備える。それが望ましくない病態（たとえば、宿主動物の疾患または他の望ましくない病態）の臨床徴候の前に投与される場合、そのときこの処置は、予防的である（すなわち、それは望ましくない病態を発生することに対して宿主を保護する）が、それが望ましくない病態の臨床徴候の後に投与される場合、この処置は、治療である（すなわち、それは既存の望ましくない病態またはその副作用を減少させる、寛解させる、または安定させることを意図される）。
【0012】
用語「対象」は、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳類を含むが、これらに限定されない哺乳類を指す。
【0013】
本発明の処置方法に関連する「治療上の有効量」の化合物は、所望の投与計画（哺乳類、好ましくはヒトへの）の部分として投与されるときに、たとえば、いずれかの医学的処置に適用可能である合理的なベネフィット／リスク比などで、処置される疾患もしくは病態、または美容目的のために臨床的に許容可能な規格に従い、症状を緩和する、病態を寛解させる、または疾患病態の発生を遅くする、製剤中の化合物（複数可）の量を指す。
【0014】
本明細書に使用されるように、用語「処置する」または「処置」は、対象の病態を改善させる、または安定させる方式で、病態の症状、臨床徴候、及び基礎病態を、元に戻す、減少させる、または静止させることを備える。
【0015】
療法
本明細書における本開示は、ケトン食療法（ＫＤ）が腸内マイクロバイオームにおける実質的な変化を引き起こす発見、及びプロバイオティック投与、糞便移植、または天然のマイクロバイオームの選択的微生物再構成を介してＫＤ関連細菌を濃縮することによりＫＤの有益な効果を模倣する発見に部分的に関する。本明細書に提供されるのは、記載されるような病態の処置または予防におけるＫＤ食事制限を置換することが可能である方法及び組成物である。本明細書に記載される、これらの方法及び組成物は、本明細書に記載される病態の処置もしくは予防におけるＫＤ食事制限と、別々に使用される、または組み合わせることが可能である。
本明細書における本開示は、ケトン食療法（ＫＤ）が腸内マイクロバイオームにおける実質的な変化を引き起こす発見、及びプロバイオティック投与、糞便移植、または天然のマイクロバイオームの選択的微生物再構成を介してＫＤ関連細菌を濃縮することによりＫＤの有益な効果を模倣する発見に部分的に関する。本明細書に提供されるのは、記載されるような病態の処置または予防におけるＫＤ食事制限を置換することが可能である方法及び組成物である。本明細書に記載される、これらの方法及び組成物は、本明細書に記載される病態の処置もしくは予防におけるＫＤ食事制限と、別々に使用される、または組み合わせることが可能である。
【0016】
ある特定の実施形態において、これらの方法は、対象における発作を処置する、または予防する。いくつかの実施形態において、これらの方法は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の細菌を含有する組成物を投与することを備える。他の実施形態において、これらの方法は、対象における神経伝達物質生合成を変化させる。ある特定の実施形態において、これらの方法は、対象中の血清ケト原性アミノ酸を変化させる。他の実施形態において、これらの方法は、対象中のガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性を低下させる。ある特定の実施形態において、これらの方法は、対象中のグルタミン合成酵素活性を低下させる。他の実施形態において、これらの方法は、対象中のガンマ－グルタミルアミノ酸を減少させる。ある特定の実施形態において、これらの方法は、対象中のＧＡＢＡ／グルタミン酸塩の比のレベルを上昇させる。他の実施形態において、これらの方法は、対象中のグルタミンレベルを上昇させる。他の実施形態において、本明細書に提供されるこれらの方法は、対象の腸内微生物叢を枯渇させ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を含む組成物を対象へ投与することを備える。いくつかの実施形態において、対象は、てんかん（たとえば、難治性または非難治性てんかん）を有する。いくつかの実施形態において、対象は、神経発達障害を有する。代表的な神経発達障害は、自閉症スペクトラム症、レット症候群、脆弱Ｘ、注意欠陥障害、及び注意欠陥／多動性障害を有する。いくつかの実施形態において、神経発達障害は、発作を含む併存症であることが知られている疾患である。
【0017】
他の実施形態において、対象は、ケトン食療法に応答性である病態を有する。この病態は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛（たとえば、慢性片頭痛）、または外傷性脳損傷（ＴＢＩ）であることができる。いくつかの実施形態において、これらの方法及び組成物は、対象へ本明細書に提供される組成物を投与することを備える。いくつかの実施形態において、この病態は、てんかん、発作、自閉症スペクトラム症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患（たとえば、肥満症または糖尿病）、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛（たとえば、慢性片頭痛）、レット症候群、注意欠陥障害、脆弱Ｘ症候群、または外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される、これらの組成物及び方法は、老化または老化関連病態を処置する、または予防する際に有用である。いくつかの実施形態において、本明細書に提供される、これらの組成物及び方法は、本明細書に記載される病態の処置または予防の際にケトン食療法を置換することが可能であり、他の実施形態において、本明細書に提供される、これらの組成物及び方法は、ケトン食療法と組み合わされることが可能である。Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：５９に病態についてのさらなる情報を見出すことができ、その全体が本明細書により援用される。
【0018】
この組成物は、経口送達用に製剤化されることができる。いくつかの実施形態において、この組成物は、プロバイオティクスを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される、これらの組成物は、食品である。この組成物は、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態にあることができる。いくつかの実施形態において、対象は、哺乳類（たとえば、ヒト）であることができる。いくつかの実施形態において、この組成物は、自己投与される。投与されるすべての細菌を含むことが単一組成物のために好まれるが、本明細書に記載されるさまざまな実施形態のいずれかのために、細菌の組み合わせを合わせて含む複数の組成物で細菌の組み合わせが同様に投与されることが可能であることを認識するであろう。たとえば、本発明は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を合わせて含有する複数の組成物を含むキットをさらに提供する。
【0019】
いくつかの実施形態において、この組成物は、直腸送達（たとえば、糞便試料）用に製剤化される。いくつかの実施形態において、対象は、糞便微生物叢移植を受け、この移植は、本明細書に開示される１つの組成物を含む。糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）は、「糞便細菌療法」としても一般に知られており、結腸微生物群集の再構成を可能にする治療プロトコルを表す。このプロセスは、健康な個体からの糞便細菌のレシピエントへの移植を伴う。ＦＭＴは、糞便試料の注入を通じて健康な細菌叢を導入することによって、たとえば、浣腸、経口胃チューブによって、または健康なドナーから得られた、凍結乾燥材料を含むカプセル剤の形態で口腔によって、結腸ミクロフローラを回復させる。いくつかの実施形態において、糞便試料は、糞便バンクからのものである。
【0020】
いくつかの実施形態において、対象の腸内微生物叢内の細菌ＤＮＡを配列決定する。この組成物の投与前に、対象の腸内細菌ＤＮＡを配列決定することができる。たとえば、細菌ＤＮＡを含む試料を対象から取得することができ、その後、この細菌ＤＮＡをＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓＤＮＡについて配列決定することによって、対象の腸内微生物叢中のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの存在またはレベルを測定する。つぎに、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓのレベルが低い場合に、本明細書に開示されるこの組成物を対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、試料中の細菌の０．０００１％未満、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０２％未満、０．０３％未満、０．０４％未満、０．０５％未満、０．０６％未満、０．０７％未満、０．０８％未満、０．０９％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、５％未満、７％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓのＤＮＡである場合、対象は、低レベルのＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ及び／またはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを含むと思われる。配列決定される細菌ＤＮＡは、対象から糞便試料を得ること、及び細菌ＤＮＡを単離することを含むが、これらに限定されない、当該技術分野において知られているいずれかの手段を通じて得られることができる。細菌ＤＮＡは、マクサムギルバートシーケンシング、サンガーシーケンシング、ショットガンシーケンシング、ブリッジＰＣＲ、または超並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）シーケンシング、４５４パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ単一分子シーケンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、もしくはナノポアＤＮＡシーケンシングなどの次世代シーケンシング方法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野におけるいずれかの既知の技法によって配列決定される。
【0021】
いくつかの実施形態において、上記の方法は、対象中の（すなわち、対象の消化管中の）病原性細菌量を減少させるように直接に作用する。いくつかの実施形態において、これは、本明細書に記載されるこれらの組成物と組み合わせて使用されるときに、非疾患病態と関連する天然ミクロフローラ、または疾患病態を引き起こす種類と同一の環境適所を占有する病原体種をほとんど含まない天然ミクロフローラと、疾患病態に含まれる病原ミクロフローラの置換を導く、病原生物数を減少させる同一の目標を達成する、いずれかのこのような療法を含む。たとえば、対象は、抗生物質（たとえば、抗菌性化合物）、または病原生物の有病率を標的として低下させる抗生物質を含む１つの組成物による処置を受けた後に、本明細書に記載される１つの組成物により処置されることができる。この処置は、抗真菌性または抗ウイルス性化合物をも含むことができる。
【0022】
適切な抗菌性化合物は、カプレオマイシン類（カプレオマイシンＩＡ、カプレオマイシンＩＢ、カプレオマイシンＩＩＡ及びカプレオマイシンＩＩＢを含む）；カルボマイシン類（カルボマイシンＡを含む）；カルモナム；セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフブペラゾン、セフカペンピボキシル、セフクリジン、セフジニル、セフジトレン、セフィム（ｃｅｆｉｍｅ）、セフタメット、セフメノキシム、セフメタゾール（ｃｅｆｍｅｔｚｏｌｅ）、セフミノクス、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォテタン、セフォチアム、セフォキシチン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチオフル、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファレキシン、セファロジシン（ｃｅｐｈａｌｏｇｙｃｉｎ）、セファロリジン、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファピリン、セファマイシン類（セファマイシンＣ、セフラジン、クロルテトラサイクリンなど）；クラリスロマイシン（ｃｈｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、クリンダマイシン、クロメトシリン、クロモサイクリン、クロキサシリン、シクラシリン、ダノフロキサシン、デメクロサイクリン、デストマイシンＡ、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドキシサイクリン、エピシリン、エリスロマイシンＡ、エタンブトール（ｅｔｈａｎｂｕｔｏｌ）、フェンベニシリン、フロモキセフ、フロルフェニコール、フロキサシリン、フルメキン、フォーチミシンＡ、フォーチミシンＢ、ホスホマイシン（ｆｏｒｆｏｍｙｃｉｎ）、フォラルタドン（ｆｏｒａｌｔａｄｏｎｅ）、フシジン酸、ゲンタマイシン、グリコニアジド、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、ヘタシリン、イダルビシン、イミペネム、イセパマイシン、ジョサマイシン、カナマイシン、ロイマイシン類（ｌｅｕｍｙｃｉｎｓ）（ロイマイシン（ｌｅｕｍｙｃｉｎ）Ａ１など）、リンコマイシン、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、リメサイクリン、メロペナム（ｍｅｒｏｐｅｎａｍ）、メタンピシリン、メタサイクリン、メチシリン、メズロシリン、ミクロノマイシン、ミデカマイシン類（ミデカマイシンＡ１など）、ミカマイシン、ミノサイクリン、マイトマイシン類（マイトマイシンＣなど）、モキサラクタム、ムピロシン、ナフシリン、ネチリシン（ｎｅｔｉｌｉｃｉｎ）、ノルカルディアン類（ｎｏｒｃａｒｄｉａｎｓ）（ノルカルディアンＡなど）、オレアンドマイシン、オキシテトラサイクリン、パニペナム（ｐａｎｉｐｅｎａｍ）、パズフロキサシン、ペナメシリン、ペニシリン類（ペニシリンＧ、ペニシリンＮ及びペニシリンＯなど）、ペニリン酸（ｐｅｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、ペンチルペニシリン（ｐｅｎｔｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、ペプロマイシン、フェネチシリン、ピパサイクリン（ｐｉｐａｃｙｃｌｉｎ）、ピペラシリン（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎ）、ピルリマイシン、ピバンピシリン、ピボセファレキシン、ポルフィロマイシン、プロピアリン（ｐｒｏｐｉａｌｌｉｎ）、キナシリン、リボスタマイシン、リファブチン、リファミド、リファンピン、リファマイシンＳＶ、リファペンチン、リファキシミン、リチペネム、レキタマイシン（ｒｅｋｉｔａｍｙｃｉｎ）、ロリテトラサイクリン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、サンサイクリン、シソマイシン、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、ストレプトゾシン、スルベニシリン、スルタミシリン、タランピシリン、テイコプラニン、テモシリン、テトラサイクリン、トストレプトン（ｔｈｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）、チアムリン、チカルシリン、チゲモナム、チルミコシン、トブラマイシン、トロポスペクトロマイシン（ｔｒｏｐｏｓｐｅｃｔｒｏｍｙｃｉｎ）、トロバフロキサシン、タイロシン、及びバンコマイシン、ならびに類似体、誘導体、薬学的に許容可能な塩類、エステル類、プロドラッグ類、及びそれらの保護形態を含む。
【0023】
適切な抗真菌化合物は、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、クロトリマゾール、ウンデシレン酸、セルタコナゾール、テルビナフィン、ブテナフィン、クリオキノール、ハロプロジン、ニスタチン、ナフチフィン、トルナフタート、シクロピロクス、アンホテリシンＢ、またはチャノキ油、ならびに類似体、誘導体、薬学的に許容可能な塩類、エステル類、プロドラッグ類、及びそれらの保護形態を含む。
【0024】
適切な抗ウイルス剤は、アシクロビル、アジドウリジン、アニソマイシン（ａｎｉｓｍｏｙｃｉｎ）、アマンタジン、ブロモビニルデオクスシジン（ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌｄｅｏｘｕｓｉｄｉｎｅ）、クロロビニルデオクスシジン（ｃｈｌｏｒｏｖｉｎｙｌｄｅｏｘｕｓｉｄｉｎｅ）、シタラビン、デラビルジン、ジダノシン、デオキシノジリマイシン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシン、ジデオキシヌクレオシド、デスシクロビル、デオキシアシクロビル、エファビレンツ、エンビロキシム、フィアシタビン、ホスカメット、フィアルリジン、フルオロチミジン、フロクスウリジン、ガンシクロビル、ヒペリシン、イドクスウリジン、インターフェロン、インターロイキン、イセチオン酸塩、ネビラピン、ペンタミジン、リバビリン、リマンタジン、スタブジン、サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｎ）、スラミン、トリコサンチン、トリブロモチミジン（ｔｒｉｂｒｏｍｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、トリクロロチミジン（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）、トリフルオロチミジン、ホスホモノホルメート三ナトリウム、ビダラビン、ジドビリジン、ザルシタビン及び３－アジド－３－デオキシチミジン、ならびに類似体、誘導体、薬学的に許容可能な塩類、エステル類、プロドラッグ類、及びそれらの保護形態を含む。
【0025】
他の適切な抗ウイルス剤は、２’，３’－ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、２’，３’－ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、２’，３’－ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、２’，３’－ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、２’，３’－ジデオキシ－ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、２’－デオキシ－３’－チア－シトシン（３ＴＣまたはラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｍｅ））、２’，３’－ジデオキシ－２’－フルオロアデノシン、２’，３’－ジデオキシ－２’－フルオロイノシン、２’，３’－ジデオキシ－２’－フルオロチミジン、２’，３’－ジデオキシ－２’－フルオロシトシン、２’，３’－ジデオキシ－２’，３’－ジデヒドロ－２’－フルオロチミジン（Ｆｄ４Ｔ）、２’３’－ジデオキシ－２’－ベータ－フルオロアデノシン（Ｆ－ｄｄＡ）、２’，３’－ジデオキシ－２’－ベータ－フルオロ－イノシン（Ｆ－ｄｄＩ）、及び２’，３’－ジデオキシ－２’－ベータ－フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（Ｆ－ｄｄＣ）を含む。いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤は、ホスホモノホルメート三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ）、ガンシクロビル、トリフルオロチミジン、アシクロビル、３’－アジド－３’－チミジン（ＡＺＴ）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、及びイドクスウリジン、ならびに類似体、誘導体、薬学的に許容可能な塩類、エステル類、プロドラッグ類、及びそれらの保護形態から選択される。
【0026】
組成物
いくつかの態様において、本発明は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む組成物（たとえば、食品または薬学的な組成物）に関する。この組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。この組成物は、プロバイオティクスを含むことができる。本明細書に開示される、これらの薬学的な組成物は、経口、頬側、舌下、非経口、及び直腸に、粉末、軟膏、液滴、液剤、ゲル、錠剤、カプセル剤、丸剤、またはクリームによるようなものを含む、いずれかの適切な投与経路によって送達されることができる。ある特定の実施形態において、薬学的な組成物を一般的に送達する（たとえば、経口投与を通じて）。ある特定の他の実施形態において、本明細書に開示される、これらの組成物を直腸に送達する。
いくつかの態様において、本発明は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む組成物（たとえば、食品または薬学的な組成物）に関する。この組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。この組成物は、プロバイオティクスを含むことができる。本明細書に開示される、これらの薬学的な組成物は、経口、頬側、舌下、非経口、及び直腸に、粉末、軟膏、液滴、液剤、ゲル、錠剤、カプセル剤、丸剤、またはクリームによるようなものを含む、いずれかの適切な投与経路によって送達されることができる。ある特定の実施形態において、薬学的な組成物を一般的に送達する（たとえば、経口投与を通じて）。ある特定の他の実施形態において、本明細書に開示される、これらの組成物を直腸に送達する。
【0027】
ある特定の実施形態において、本発明は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ属（たとえば、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（たとえば、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）の細菌を合わせて含む（たとえば、組み合わされる場合、この節内の他の箇所に記載されるような１つの組成物をもたらす）複数の組成物を含むキットを提供する。
【0028】
この組成物は、Ｐ．ｃｈａｒｔａｅ、Ｐ．ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ、Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐ．ｆａｅｃｉｓ、Ｐ．ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｐ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、またはＰ．ｍｅｒｄａｅを含むが、これらに限定されない、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓのいずれかの種を含むことができる。いくつかの実施形態において、この組成物中の細菌の、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である。この組成物中のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａの細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される、これらの組成物は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａの細菌を含むことができる。
【0029】
本明細書に開示される、これらの組成物は、胃腸管の組織へ細菌（たとえば、本明細書に開示される細菌）を導入する目的に向けられる、胃腸管への経口投与のために使用されることができる。また本発明のこの組成物（たとえば、プロバイオティック組成物）についての製剤は、芽胞発芽及び／または細菌増殖を促進する、他のプロバイオティック剤または栄養剤を含むことができる。例示的な材料は、有益なプロバイオティック細菌の増殖を促進する、ビフィズス菌オリゴ糖である。いくつかの実施形態において、このプロバイオティック細菌組成物は、抗生物質（好ましくは、広域スペクトル）、または抗真菌剤の治療有効量で投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される、これらの組成物は、腸溶性コーティングされた、徐放されるカプセルまたは錠剤中に被包される。腸溶性コーティングは、カプセル／錠剤が胃腸管を通過する場合に、ある一定の時間後まで、及び／またはＧＩ管のある特定の部分（たとえば、小腸）に到達するまで、未変化のままである（すなわち、溶解しない）ことを可能にする。徐放される成分は、所定の期間、本明細書に記載されるこれらの組成物中のプロバイオティック菌種の「放出」を防止する。
【0030】
この組成物は、限定されないが、乳製品などの、食品であることができる。この乳製品は、発酵または未発酵の乳製品（たとえば、牛乳）であることができる。発酵乳製品の非限定的な例は、ヨーグルト、カッテージチーズ、サワークリーム、ケフィア、バターミルクなどを含む。また乳製品は、さまざまな特殊な乳製品成分、たとえば、乳清、脱脂粉乳、乳清タンパク質濃縮固形分などを含むことが多い。乳製品は、香料、増粘力、栄養、特異的な微生物及びカビ増殖制御などの他の特性のような望ましい品質を達成する、当該技術分野において知られているいずれかの方式において加工処理されることができる。本発明のこれらの組成物は、既知の抗酸化剤、緩衝剤、及び着色料、着香料、ビタミン類、またはミネラル類などの他の薬剤を含むこともできる。
【0031】
いくつかの実施形態において、本発明のこれらの組成物は、投与される対象（複数可）の胃腸組織と生理学的適合性がある担体（たとえば、薬学的に許容可能な担体）と混合される。これらの担体は、錠剤、カプセル剤もしくは粉末形態への製剤化のために固体ベースの乾燥材料を含むことが可能である、またはこの担体は、液体もしくはゲル形態への製剤化のために液体もしくはゲルベースの材料を含むことが可能である。担体の具体的な種類、及び最終製剤は、選択された投与経路（複数可）に部分的に依存する。また本発明の治療組成物は、さまざまな担体及び／または結合剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、この担体は、１グラムの投薬総重量を完成させるのに十分な量内に加えられる微結晶セルロース（ＭＣＣ）である。担体は、錠剤、カプセル剤または粉末形態への製剤化のために固体ベースの乾燥材料であることが可能であり、液体またはゲル形態への製剤化のために液体またはゲルベースの材料であることが可能であり、どの形態かは、投与経路に部分的に依存する。乾燥製剤化用の一般的な担体は、トレハロース、マルト－デキストリン、米粉、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、ステアリン酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅｒａｔｅ）、イノシトール、ＦＯＳ、ＧＯＳ、ブドウ糖、ショ糖、及び同様の担体を含むが、これらに限定されない。適切な液体またはゲルベースの担体は、水及び生理的食塩水；尿素；アルコール類及び誘導体（たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）；グリコール類（たとえば、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び同様のもの）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、水性担体は、中性ｐＨ値（すなわち、ｐＨ７．０）を有する。本明細書に記載されるこれらの組成物を投与するための他の担体または薬剤は、米国特許第６，４６１，６０７号などの、当該技術分野において知られている。
【0032】
いくつかの実施形態において、この組成物は、胃腸管にコロニー形成することが知られている他の細菌または微生物をさらに含む。たとえば、この組成物は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ門、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門、またはそれらの組み合わせに属する種を含むことができる。本発明の組成物に含まれることができる追加の細菌及び微生物の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、この組成物は、発作のリスクを上昇させる、またはその他の方法によりケトン食療法の効果を損なう細菌を実質的に含まない。このような細菌は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの細菌を含む。したがって、いくつかの実施形態において、この組成物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの細菌を実質的に含まない。組成物は、細菌タイプが組成物中の細菌の１０％未満、組成物中の細菌の、好ましくは５％未満、さらにより好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満、またはさらに０％を構成する場合、この細菌タイプを実質的に含まない。
【0033】
いくつかの実施形態において、この組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の少なくとも１種、及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の少なくとも１種を含有する糞便試料を含む。いくつかの実施形態において、糞便試料は、糞便バンクからのものである。いくつかの実施形態において、対象への投与前に、これらの組成物を糞便試料に加えることができる。
【0034】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるのは、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の少なくとも１種、及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の少なくとも１種を濃縮した組成物（たとえば、糞便試料）を対象へ投与することによって、発作などの病態を処置する、または予防する方法である。糞便試料中の細菌の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、または少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％がＡｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である場合に、糞便試料は濃縮されている。いくつかの実施形態において、糞便試料中の細菌の少なくとも０．０１％、少なくとも０．０２％、少なくとも０．０３％、少なくとも０．０４％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．０６％、少なくとも０．０７％、少なくとも０．０８％、少なくとも０．０９％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、少なくとも０．６％、少なくとも０．７％、少なくとも０．８％、少なくとも０．９％、少なくとも１％、または少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％がＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）である場合に、糞便試料は濃縮されている。いくつかの実施形態において、糞便試料は、糞便バンクからのものである。いくつかの実施形態において、糞便試料は、ドナーからのものである。
【0035】
この組成物は、栄養剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、栄養剤は、細菌（たとえば、本明細書に開示される細菌）の増殖を補助する。いくつかの実施形態において、栄養剤は、図１２に列挙される成分である。いくつかの実施形態において、栄養剤は、脂質（たとえば、リノール酸（ｌｉｎｅｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸、またはパルミチン酸）である。いくつかの実施形態において、栄養剤は、本明細書に開示される組成物と合わせて投与されることができる。本明細書に使用されるように、語句「合わせて投与」は、先に投与された薬剤が体内でまだ有効でありながら第二の薬剤を投与するような、２つ以上の異なる薬剤（たとえば、本明細書に開示される組成物、及び本明細書に開示される栄養剤）の投与のいずれかの形式を指す。たとえば、本明細書に開示される組成物及び本明細書に開示される栄養剤は、同じ製剤、または別々の製剤のいずれか一方で、付随してか、順次にかのいずれか一方で、投与されることが可能である。
【0036】
薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性なしで、特定の患者、組成物、及び投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変えることができる。
【0037】
選択された投与量レベルは、用いられている特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄または代謝率、処置持続時間、用いられる特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または材料、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康及び以前の病歴、ならびに医学分野において周知である同様の要因を含む、多様な要因に依存する。
【0038】
当業者の医師または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することが可能である。たとえば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成し、所望の効果を達成するまで投与量を徐々に増加させるために、必要とされるものより低レベルで薬学的組成物に用いられる化合物の投与量を処方する、及び／または投与することが可能である。
【0039】
ここで一般的に記載されている本発明は、本発明のある特定の態様及び実施形態の例示目的のために含まれるに過ぎず、本発明を限定することを意図されない、以下の例を参照してさらに容易に理解される。
【実施例】
【0040】
例証
［実施例１：材料及び方法］
動物及び食餌制限
３から４週齢のＳＰＦ野生型Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）、ＧＦ野生型Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）及びＳＰＦ Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ ＫＣＮＡ１ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、ＵＣＬＡのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて飼育された。飼育動物に「ブリーダー」固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔｓ ５Ｋ５２）を与えた。実験動物に標準的な固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５０１０）、６：１のケトン食療法（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．０７７９７．ＰＷＤ）、またはビタミン及びミネラルが適合した対照食餌制限（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．１５０３００）を与えた。幼若マウスを使用して、ｉ）小児及び青年のてんかん患者を治療するためのＫＤの一般的な使用を模倣し、ｉｉ）３週齢のマウスにおける神経発達の重要な段階は２から３歳のヒトの脳６０の神経発達の重要な段階に匹敵するため、幼児期のヒトの脳発達とマウスの脳発達のタイミングを整合させ、ｉｉｉ）母性行動及び生理機能における食餌制限の効果が出生児における食餌制限の直接効果を交絡させるため、離乳前食餌制限処置を排除した。マウスを実験群に無作為に割り当てた。すべての動物実験は、ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
［実施例１：材料及び方法］
動物及び食餌制限
３から４週齢のＳＰＦ野生型Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）、ＧＦ野生型Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）及びＳＰＦ Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪ ＫＣＮＡ１ ＫＯマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、ＵＣＬＡのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて飼育された。飼育動物に「ブリーダー」固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔｓ ５Ｋ５２）を与えた。実験動物に標準的な固形飼料（Ｌａｂ Ｄｉｅｔ ５０１０）、６：１のケトン食療法（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．０７７９７．ＰＷＤ）、またはビタミン及びミネラルが適合した対照食餌制限（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ＴＤ．１５０３００）を与えた。幼若マウスを使用して、ｉ）小児及び青年のてんかん患者を治療するためのＫＤの一般的な使用を模倣し、ｉｉ）３週齢のマウスにおける神経発達の重要な段階は２から３歳のヒトの脳６０の神経発達の重要な段階に匹敵するため、幼児期のヒトの脳発達とマウスの脳発達のタイミングを整合させ、ｉｉｉ）母性行動及び生理機能における食餌制限の効果が出生児における食餌制限の直接効果を交絡させるため、離乳前食餌制限処置を排除した。マウスを実験群に無作為に割り当てた。すべての動物実験は、ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【0041】
６Ｈｚの精神運動発作アッセイ
６Ｈｚの試験を先に記載される通りに行った１３。パイロット研究は、発作閾値において性的二形性を示さなかった。その後のすべての実験コホートは、オスマウスを含んだ。刺激の１０～１５分前に、一滴（約５０ｕｌ）の０．５％テトラカイン塩酸塩の点眼液を、各マウスの角膜に適用した。角膜電極を電極ゲル（Ｐａｒｋｅｒ Ｓｉｇｎａｇｅｌ）の薄層によってコーティングした。定電流装置（ＥＣＴ Ｕｎｉｔ ５７８００、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を使用し、３秒の持続時間で、０．２ｍｓのパルス幅及び６パルス／秒の頻度で電流を送達した。ＣＣ５０（実験群の５０％において発作を誘発するために必要とされる電流強度）を発作感受性についての測定基準として測定した。パイロット実験を行い、２４ｍＡをＳＰＦ野生型Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスについてのＣＣ５０として特定した。各マウスに１回だけ発作試験をしたため、少なくともｎ＞６匹のマウスを使用し、各実験群に十分に電力を供給した。各実験群についてＣＣ５０を決定するために、２４ｍＡの電流は、１コホートにつき１実験群あたりの最初のマウスに投与した後、２ｍＡの間隔で一定の増加、または減少を行った。マウスを刺激中に手で拘束した後に、行動観察のために新しいケージに放した。Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して自発運動行動を記録し、転倒、尾背屈（ストラウブ挙尾）、前肢クローヌス、眼／感覚毛単収縮及び行動寛解についての定量的測定値を手動でスコア化した。各行動パラメータについて、我々は、２４ｍＡ中の発作インシデントの割合と微生物叢状態または群の発作感受性との間に相関性がなく、症状または形態よりもむしろ発作インシデントについて微生物叢の主な効果を示唆したことを観察した。探索までの潜時（実験マウスを観察ケージに放した（角膜刺激後）ときからマウスの最初の側方移動までに経過した時間）は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎを使用して、また手動で電子タイマーによってスコア化された。食餌制限群内では、盲検によって試験された。異なる食餌制限群にわたる標準の盲検化は、糞便色における食餌制限誘発性変化により不可能であった。しかしながら、パイロット実験からの結果は、盲検化試験対非盲検化試験を受けた同一の実験群から取得された結果の間に有意差がなかったことを明らかにする。マウスが発作行動を示さず、１０秒以内に通常の探索行動を再開した場合、発作を予防されているとマウスをスコア化した。発作閾値（ＣＣ５０）は、実験群あたりの電流ステップの平均ログ間隔を使用して、先に記載されるように決定され６１、そこで試料ｎは、頻度の少ない発作行動を表す動物のサブセットとして定義される。またＣＣ５０を計算するために使用されるデータを、各電流強度について探索するまでの潜時として表示し、そこでｎは、発作結果にかかわらず、１群あたりの生物学的反復実験の総数を表す。
６Ｈｚの試験を先に記載される通りに行った１３。パイロット研究は、発作閾値において性的二形性を示さなかった。その後のすべての実験コホートは、オスマウスを含んだ。刺激の１０～１５分前に、一滴（約５０ｕｌ）の０．５％テトラカイン塩酸塩の点眼液を、各マウスの角膜に適用した。角膜電極を電極ゲル（Ｐａｒｋｅｒ Ｓｉｇｎａｇｅｌ）の薄層によってコーティングした。定電流装置（ＥＣＴ Ｕｎｉｔ ５７８００、Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ）を使用し、３秒の持続時間で、０．２ｍｓのパルス幅及び６パルス／秒の頻度で電流を送達した。ＣＣ５０（実験群の５０％において発作を誘発するために必要とされる電流強度）を発作感受性についての測定基準として測定した。パイロット実験を行い、２４ｍＡをＳＰＦ野生型Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスについてのＣＣ５０として特定した。各マウスに１回だけ発作試験をしたため、少なくともｎ＞６匹のマウスを使用し、各実験群に十分に電力を供給した。各実験群についてＣＣ５０を決定するために、２４ｍＡの電流は、１コホートにつき１実験群あたりの最初のマウスに投与した後、２ｍＡの間隔で一定の増加、または減少を行った。マウスを刺激中に手で拘束した後に、行動観察のために新しいケージに放した。Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して自発運動行動を記録し、転倒、尾背屈（ストラウブ挙尾）、前肢クローヌス、眼／感覚毛単収縮及び行動寛解についての定量的測定値を手動でスコア化した。各行動パラメータについて、我々は、２４ｍＡ中の発作インシデントの割合と微生物叢状態または群の発作感受性との間に相関性がなく、症状または形態よりもむしろ発作インシデントについて微生物叢の主な効果を示唆したことを観察した。探索までの潜時（実験マウスを観察ケージに放した（角膜刺激後）ときからマウスの最初の側方移動までに経過した時間）は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎを使用して、また手動で電子タイマーによってスコア化された。食餌制限群内では、盲検によって試験された。異なる食餌制限群にわたる標準の盲検化は、糞便色における食餌制限誘発性変化により不可能であった。しかしながら、パイロット実験からの結果は、盲検化試験対非盲検化試験を受けた同一の実験群から取得された結果の間に有意差がなかったことを明らかにする。マウスが発作行動を示さず、１０秒以内に通常の探索行動を再開した場合、発作を予防されているとマウスをスコア化した。発作閾値（ＣＣ５０）は、実験群あたりの電流ステップの平均ログ間隔を使用して、先に記載されるように決定され６１、そこで試料ｎは、頻度の少ない発作行動を表す動物のサブセットとして定義される。またＣＣ５０を計算するために使用されるデータを、各電流強度について探索するまでの潜時として表示し、そこでｎは、発作結果にかかわらず、１群あたりの生物学的反復実験の総数を表す。
【0042】
グルコース測定
心臓穿刺によって血液試料を採取し、この血液試料を血清分離用にＳＳＴバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じて回転させた。製造元（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従い、比色アッセイによって血清中のグルコースレベルを検出した。複数の実験にわたりまとめられたデータを、各実験内のＳＰＦ対照に対して正規化されたグルコース濃度として表す。
心臓穿刺によって血液試料を採取し、この血液試料を血清分離用にＳＳＴバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じて回転させた。製造元（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従い、比色アッセイによって血清中のグルコースレベルを検出した。複数の実験にわたりまとめられたデータを、各実験内のＳＰＦ対照に対して正規化されたグルコース濃度として表す。
【0043】
ベータ－ヒロドキシ酪酸（ＢＨＢ）測定
心臓穿刺によって、血液を採取し、この血液を血清分離用にＳＳＴバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じて回転させた。結腸をＰＢＳによって洗い流し、内腔内容物を除去した。前頭皮質、海馬、視床下部及び小脳を顕微解剖し、肝臓を回収し、ＰＢＳ中で洗浄した。組織試料をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の氷上において２０ｍＶ、１０秒間隔で超音波処理した。製造元（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従い、比色アッセイによって血清中でＢＨＢレベルを検出した。データは、ＢＣＡアッセイによって検出される総タンパク質量に対して正規化された。複数の実験にわたりまとめられたデータを、各実験内のＳＰＦ対照に対して正規化されたＢＨＢ濃度として表す。
心臓穿刺によって、血液を採取し、この血液を血清分離用にＳＳＴバキュテナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通じて回転させた。結腸をＰＢＳによって洗い流し、内腔内容物を除去した。前頭皮質、海馬、視床下部及び小脳を顕微解剖し、肝臓を回収し、ＰＢＳ中で洗浄した。組織試料をＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の氷上において２０ｍＶ、１０秒間隔で超音波処理した。製造元（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の指示に従い、比色アッセイによって血清中でＢＨＢレベルを検出した。データは、ＢＣＡアッセイによって検出される総タンパク質量に対して正規化された。複数の実験にわたりまとめられたデータを、各実験内のＳＰＦ対照に対して正規化されたＢＨＢ濃度として表す。
【0044】
１６Ｓ ｒＤＮＡマイクロバイオームプロファイリング
ＭｏＢｉｏ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｋｉｔを使用して、マウス糞便試料または結腸内腔内容物から細菌ゲノムＤＮＡを抽出し、この試料ｎは、１ケージあたり３匹のマウスを含む独立したケージを反映する。６２から適合された方法に従い、ライブラリを作製した。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のＶ４領域は、個別にバーコード化されたユニバーサルプライマー、及び３０ｎｇの抽出されたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ反応を三連で設定し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。等しいモル濃度で、精製されたＰＣＲ産物をプールし、Ｋａｐａライブラリ定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ４８２４）によって定量化し、ペアエンドシーケンシングのためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム及び２×２５０ｂｐ試薬キットを使用して、Ｌａｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって配列決定した。Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ１３＿５データベースに類似する９７％の配列に基づくオープンリファレンス操作的分類単位（ＯＴＵ）ピッキングによって、ＯＴＵを選択した。１サンプルあたり８５，１３４個のリードを使用して、ＱＩＩＭＥ１．８．０６３を用いて分類学的な割り当て及び希薄化を実施した。メタゲノムは、ＰＩＣＲＵＳｔ６４を使用してクローズドリファレンスＯＴＵ表から推測された。図Ｓ７Ｃにおいて、結果をフィルタリングし、アミノ酸代謝に関連した上位７２個の遺伝子を表示する。
ＭｏＢｉｏ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ Ｋｉｔを使用して、マウス糞便試料または結腸内腔内容物から細菌ゲノムＤＮＡを抽出し、この試料ｎは、１ケージあたり３匹のマウスを含む独立したケージを反映する。６２から適合された方法に従い、ライブラリを作製した。１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のＶ４領域は、個別にバーコード化されたユニバーサルプライマー、及び３０ｎｇの抽出されたゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ反応を三連で設定し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。等しいモル濃度で、精製されたＰＣＲ産物をプールし、Ｋａｐａライブラリ定量キット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＫＫ４８２４）によって定量化し、ペアエンドシーケンシングのためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットフォーム及び２×２５０ｂｐ試薬キットを使用して、Ｌａｒａｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって配列決定した。Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ１３＿５データベースに類似する９７％の配列に基づくオープンリファレンス操作的分類単位（ＯＴＵ）ピッキングによって、ＯＴＵを選択した。１サンプルあたり８５，１３４個のリードを使用して、ＱＩＩＭＥ１．８．０６３を用いて分類学的な割り当て及び希薄化を実施した。メタゲノムは、ＰＩＣＲＵＳｔ６４を使用してクローズドリファレンスＯＴＵ表から推測された。図Ｓ７Ｃにおいて、結果をフィルタリングし、アミノ酸代謝に関連した上位７２個の遺伝子を表示する。
【0045】
微生物叢コンベンショナル化
糞便試料は、成体ＳＰＦ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから新たに採取され、１個のペレットあたり１ｍｌに事前に還元されたＰＢＳ中でホモジナイズされた。１００ｕｌの沈降した懸濁液を、経口経管栄養によってレシピエントＧＦマウスへ投与した。ニセの処置のために、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。
糞便試料は、成体ＳＰＦ Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスから新たに採取され、１個のペレットあたり１ｍｌに事前に還元されたＰＢＳ中でホモジナイズされた。１００ｕｌの沈降した懸濁液を、経口経管栄養によってレシピエントＧＦマウスへ投与した。ニセの処置のために、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。
【0046】
抗生物質処置
Ｒｅｉｋｖａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ（６），２０１１によって以前に記載された方法に従い、バンコマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ）、ネオマイシン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びメトロニダゾール（１００ｍｇ／ｋｇ）の溶液によって、７日間毎日１２時間毎にＳＰＦマウスに経管栄養を行った。アンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を適宜、飲料水中に与えた。ニセの処置のために、通常の飲料水によって７日間毎日１２時間毎にマウスに経管栄養を行った。Ｋｃｎａ１－／－マウスに、バンコマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む飲料水を１週間補給し、発作易発性マウスにおける経口経管栄養のストレスを防止した。
Ｒｅｉｋｖａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ ｏｎｅ（６），２０１１によって以前に記載された方法に従い、バンコマイシン（５０ｍｇ／ｋｇ）、ネオマイシン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びメトロニダゾール（１００ｍｇ／ｋｇ）の溶液によって、７日間毎日１２時間毎にＳＰＦマウスに経管栄養を行った。アンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を適宜、飲料水中に与えた。ニセの処置のために、通常の飲料水によって７日間毎日１２時間毎にマウスに経管栄養を行った。Ｋｃｎａ１－／－マウスに、バンコマイシン（５００ｍｇ／ｍｌ）、ネオマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む飲料水を１週間補給し、発作易発性マウスにおける経口経管栄養のストレスを防止した。
【0047】
抗生物質処置されたマウスにおけるノトバイオートコロニー形成及び細菌濃縮
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５）を嫌気性条件下で０．０５％のブタ胃ムチンＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって補充されたブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地中で培養した。Ｐ．ｍｅｒｄａｅ（ＡＴＣＣ ４３１８４）及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡＴＣＣ ８５０３）を増強されたクロストリジウム培地（ＲＣＭ）中の嫌気性条件内で増殖させた。１０９ｃｆｕの細菌を２００ｕｌの事前に還元されたＰＢＳ中で懸濁させ、これらにより抗生物質処置されたマウス、または無菌マウス中に経口で経管栄養を行った。「Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種」として同時投与されるときに、２：１：１の比をＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ：Ｐ．ｍｅｒｄａｅ：Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓに対して使用した。ニセの処置について、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。パイロット研究は、細菌負荷に関連した測定値としての、糞便ＤＮＡ濃度または１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅におけるコロニー形成群間に有意差がなかったことを明らかにした。マイクロアイソレーターケージ内でマウスを維持し、無菌的に取り扱った。コロニー形成の１４日後にマウスを発作試験した。
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ８３５）を嫌気性条件下で０．０５％のブタ胃ムチンＩＩＩ型（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって補充されたブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地中で培養した。Ｐ．ｍｅｒｄａｅ（ＡＴＣＣ ４３１８４）及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡＴＣＣ ８５０３）を増強されたクロストリジウム培地（ＲＣＭ）中の嫌気性条件内で増殖させた。１０９ｃｆｕの細菌を２００ｕｌの事前に還元されたＰＢＳ中で懸濁させ、これらにより抗生物質処置されたマウス、または無菌マウス中に経口で経管栄養を行った。「Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種」として同時投与されるときに、２：１：１の比をＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ：Ｐ．ｍｅｒｄａｅ：Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓに対して使用した。ニセの処置について、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。パイロット研究は、細菌負荷に関連した測定値としての、糞便ＤＮＡ濃度または１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅におけるコロニー形成群間に有意差がなかったことを明らかにした。マイクロアイソレーターケージ内でマウスを維持し、無菌的に取り扱った。コロニー形成の１４日後にマウスを発作試験した。
【0048】
糞便微生物叢移植
１４日間ＫＤまたはＣＤを給餌されたドナーマウスから糞便試料を新たに採取し、事前に還元されたＰＢＳ中に５０ｍｇ／ｍｌに懸濁した。抗生物質処置されたマウスに、１００ｕｌの懸濁液の経口経管栄養によってコロニー形成した。ニセの処置のために、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。マウスをマイクロアイソレーターケージ中に収容し、無菌的に取り扱った。発作試験を移植の４日後に行った。
１４日間ＫＤまたはＣＤを給餌されたドナーマウスから糞便試料を新たに採取し、事前に還元されたＰＢＳ中に５０ｍｇ／ｍｌに懸濁した。抗生物質処置されたマウスに、１００ｕｌの懸濁液の経口経管栄養によってコロニー形成した。ニセの処置のために、事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。マウスをマイクロアイソレーターケージ中に収容し、無菌的に取り扱った。発作試験を移植の４日後に行った。
【0049】
細菌処置
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓは、上述されるような嫌気性条件において新たに培養された後に、洗浄され、ペレット状にされ、事前に還元されたＰＢＳ中の５×１０９ｃｆｕ／ｍｌに再懸濁された。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を含むＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを２：１：１の比で調製した。加熱殺菌のために、細菌を９５℃に１０分間置いた。ビークル対照として、２８日間１２時間毎に、２００ｕｌの細菌懸濁液または無菌の事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓは、上述されるような嫌気性条件において新たに培養された後に、洗浄され、ペレット状にされ、事前に還元されたＰＢＳ中の５×１０９ｃｆｕ／ｍｌに再懸濁された。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を含むＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを２：１：１の比で調製した。加熱殺菌のために、細菌を９５℃に１０分間置いた。ビークル対照として、２８日間１２時間毎に、２００ｕｌの細菌懸濁液または無菌の事前に還元されたＰＢＳによってマウスに経管栄養を行った。
【0050】
Ｋｃｎａ１発作記録
ＥＥＧ移植及び回復。オス及びメスＫｃｎａ１－／－マウスからのＥＥＧを６～７週齢に記録した。Ｋｃｎａ１＋／＋同腹仔を対照として使用した。我々は、発作頻度及び持続時間においてオスとメスとの間に有意差がなかったことを観察した。提示されたデータは、両方の性別を含む。マウスをイソフルラン（５％の導入、２％の維持）、及び各眼に塗布された眼軟膏によって麻酔した。頭部沿いの毛を除去し、この面積をクロロヘキシジン及び７０％のイソプロパノールのどちらかの３回のスクラブによって洗浄した。バイオセーフティキャビネット中の、定位固定装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内にマウスを置き、１ｍｇ／ｋｇのリドカイン＋１ｍｇ／ｋｇのブピバカインを局所的に切開部位沿いに塗布した。滅菌の手術器具を使用して、２ｃｍの切開を眼の後嚢縁から肩甲骨間の中点へ背側正中線沿いに行った。背側側腹部沿いに皮下ポケットを作製し、このポケットを滅菌生理食塩水によって洗浄した。頭蓋に向けられた双電位リード線を備える無線テレメトリトランスミッタを挿入した。３％の過酸化水素後に７０％のイソプロパノールによって頭蓋骨を洗浄した。１．０ｍｍのマイクロドリルビットを使用して、頭蓋骨を穿孔し、２つの小さな孔部を十字縫合と人字縫合との間の中間で、矢状縫合から１～２ｍｍに生成した。両側ＥＥＧ記録電極（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＤＳＩ）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌ、ＥＴＡ－Ｆ１０）を硬膜外に前頭頭頂皮質経由で移植した。滅菌アクリルを乾燥領域に塗布した。切開部位を吸収性５－０縫合糸によって閉じ、３％の過酸化水素後、７０％のエタノールによって洗浄した。動物をオートクレーブ処理したマイクロアイソレーターケージ中に個別に収容し、記録を開始する前の３～５日間に回復させた。
ＥＥＧ移植及び回復。オス及びメスＫｃｎａ１－／－マウスからのＥＥＧを６～７週齢に記録した。Ｋｃｎａ１＋／＋同腹仔を対照として使用した。我々は、発作頻度及び持続時間においてオスとメスとの間に有意差がなかったことを観察した。提示されたデータは、両方の性別を含む。マウスをイソフルラン（５％の導入、２％の維持）、及び各眼に塗布された眼軟膏によって麻酔した。頭部沿いの毛を除去し、この面積をクロロヘキシジン及び７０％のイソプロパノールのどちらかの３回のスクラブによって洗浄した。バイオセーフティキャビネット中の、定位固定装置（Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内にマウスを置き、１ｍｇ／ｋｇのリドカイン＋１ｍｇ／ｋｇのブピバカインを局所的に切開部位沿いに塗布した。滅菌の手術器具を使用して、２ｃｍの切開を眼の後嚢縁から肩甲骨間の中点へ背側正中線沿いに行った。背側側腹部沿いに皮下ポケットを作製し、このポケットを滅菌生理食塩水によって洗浄した。頭蓋に向けられた双電位リード線を備える無線テレメトリトランスミッタを挿入した。３％の過酸化水素後に７０％のイソプロパノールによって頭蓋骨を洗浄した。１．０ｍｍのマイクロドリルビットを使用して、頭蓋骨を穿孔し、２つの小さな孔部を十字縫合と人字縫合との間の中間で、矢状縫合から１～２ｍｍに生成した。両側ＥＥＧ記録電極（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＤＳＩ）ＰｈｙｓｉｏＴｅｌ、ＥＴＡ－Ｆ１０）を硬膜外に前頭頭頂皮質経由で移植した。滅菌アクリルを乾燥領域に塗布した。切開部位を吸収性５－０縫合糸によって閉じ、３％の過酸化水素後、７０％のエタノールによって洗浄した。動物をオートクレーブ処理したマイクロアイソレーターケージ中に個別に収容し、記録を開始する前の３～５日間に回復させた。
【0051】
データ取得及び分析
ＥＥＧ記録中に、動物を自由に運動させ、実験食餌制限について維持した。ＤＳＩ Ｐｏｎｅｍａｈ Ｖ５．１データ取得システムを使用して、３日かけてＥＥＧトレースを取得した。行動発作の同時ビデオ記録をＥＥＧ記録と相関させ、適合したＲａｃｉｎｅスケールに基づきスコア化し、１）ミオクローヌス発作、２）頭部常同症及び顔面クローヌス、３）両側及び交互前肢／後肢クローヌス、４）立ち上がり行動及び転倒、ならびに５）全身性強直間代性エピソードの５段階まで定義した。盲検研究者は、Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ ＣＮＳソフトウェア（ＤＳＩ）を使用してデータを分析した。１０Ｈｚのハイパスフィルタを使用してＥＥＧ信号をフィルタリングし、盲検手動スコア化によって発作事象を検出した。６秒を上回る持続時間を有するバックグラウンドより少なくとも２倍大きい振幅を有する高頻度、高電圧同期不均一棘波形のパターンとして、発作を定義した。棘波頻度は、所与の発作におけるベースラインを上回り発生する棘波数として決定され、棘波出現間隔は、１匹のマウスあたりの各段階における５つの代表的な発作についての棘波間の時間の関数として分析された。１匹のマウスあたりの各段階における５つの代表的な発作についてのベースラインの３倍の大きさであった棘波に費やされた時間パーセントとして最大棘波振幅の持続時間を決定した。
ＥＥＧ記録中に、動物を自由に運動させ、実験食餌制限について維持した。ＤＳＩ Ｐｏｎｅｍａｈ Ｖ５．１データ取得システムを使用して、３日かけてＥＥＧトレースを取得した。行動発作の同時ビデオ記録をＥＥＧ記録と相関させ、適合したＲａｃｉｎｅスケールに基づきスコア化し、１）ミオクローヌス発作、２）頭部常同症及び顔面クローヌス、３）両側及び交互前肢／後肢クローヌス、４）立ち上がり行動及び転倒、ならびに５）全身性強直間代性エピソードの５段階まで定義した。盲検研究者は、Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｅ ＣＮＳソフトウェア（ＤＳＩ）を使用してデータを分析した。１０Ｈｚのハイパスフィルタを使用してＥＥＧ信号をフィルタリングし、盲検手動スコア化によって発作事象を検出した。６秒を上回る持続時間を有するバックグラウンドより少なくとも２倍大きい振幅を有する高頻度、高電圧同期不均一棘波形のパターンとして、発作を定義した。棘波頻度は、所与の発作におけるベースラインを上回り発生する棘波数として決定され、棘波出現間隔は、１匹のマウスあたりの各段階における５つの代表的な発作についての棘波間の時間の関数として分析された。１匹のマウスあたりの各段階における５つの代表的な発作についてのベースラインの３倍の大きさであった棘波に費やされた時間パーセントとして最大棘波振幅の持続時間を決定した。
【0052】
結腸内腔及び血清メタボロミクス
１ケージあたり少なくとも２匹のマウスを含む、独立したケージ中に収容されたマウスから試料を採取した。末期マウスの解剖から結腸内腔内容物を採取し、直ちに液体窒素中で急速凍結させ、－８０℃で保管した。心臓穿刺によって血清試料を採取し、ＳＳＴバキュテナーチューブを使用して分離させ、－８０℃に凍結させた。試料を自動ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して調製し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．によるＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォーム上で分析した。有機水性溶媒による連続抽出によってタンパク質分画を除去し、ＴｕｒｂｏＶａｐシステム（Ｚｙｍａｒｋ）を使用して濃縮し、吸引減圧乾燥させた。ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳについて、リニアイオントラップフロントエンド及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計バックエンドによって、＞１１の注入標準物質を含有する酸性または塩基性ＬＣ適合性溶媒中で試料を再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ及びＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ質量分析計上で実施した。ＧＣ／ＭＳについて、ビストリメチル－シリル－トリフルオロアセトアミドを使用して乾燥窒素下で試料を誘導体化し、電子衝撃イオン化を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ高速走査シングル四重極質量分析計上で分析した。精製標準物質のメタボロームライブラリエントリーと比較して化学薬品を同定した。各化合物について最小観察値とのログ変換及びインピュテーション後に、一元配置分散分析を使用してデータを分析し、群効果について試験した。二元配置分散分析の対比に基づき、Ｐ及びｑ値を計算した。主成分分析を使用して、分散分布を視覚化した。教師ありランダムフォレスト分析を行い、メタボロミクス予測精度を同定した。
１ケージあたり少なくとも２匹のマウスを含む、独立したケージ中に収容されたマウスから試料を採取した。末期マウスの解剖から結腸内腔内容物を採取し、直ちに液体窒素中で急速凍結させ、－８０℃で保管した。心臓穿刺によって血清試料を採取し、ＳＳＴバキュテナーチューブを使用して分離させ、－８０℃に凍結させた。試料を自動ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲシステム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して調製し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．によるＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットフォーム上で分析した。有機水性溶媒による連続抽出によってタンパク質分画を除去し、ＴｕｒｂｏＶａｐシステム（Ｚｙｍａｒｋ）を使用して濃縮し、吸引減圧乾燥させた。ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳについて、リニアイオントラップフロントエンド及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計バックエンドによって、＞１１の注入標準物質を含有する酸性または塩基性ＬＣ適合性溶媒中で試料を再構成し、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ及びＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ質量分析計上で実施した。ＧＣ／ＭＳについて、ビストリメチル－シリル－トリフルオロアセトアミドを使用して乾燥窒素下で試料を誘導体化し、電子衝撃イオン化を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ高速走査シングル四重極質量分析計上で分析した。精製標準物質のメタボロームライブラリエントリーと比較して化学薬品を同定した。各化合物について最小観察値とのログ変換及びインピュテーション後に、一元配置分散分析を使用してデータを分析し、群効果について試験した。二元配置分散分析の対比に基づき、Ｐ及びｑ値を計算した。主成分分析を使用して、分散分布を視覚化した。教師ありランダムフォレスト分析を行い、メタボロミクス予測精度を同定した。
【0053】
海馬メタボロミクス
海馬組織を１ｍｌの８０％の冷ＭｅＯＨ中でホモジナイズし、氷上で激しく撹拌した後、遠心分離した（１．３＊１０４ｒｐｍ、４℃）。５ｕｇの上澄みをガラスバイアス中に移し、５ｎｍｏｌ Ｄ／Ｌのノルバリンを補充し、吸引減圧乾燥させ、最後に７０％のアセトニトリル中で再懸濁させた。試料の質量分析に基づく分析のために、５ｌをＬｕｎａ ＮＨ２（１５０ｍｍ×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラム上に注入した。これらの試料は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析された。このＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅは、７０～１０５０ｍ／ｚの範囲を有するフルスキャンモードで極性スイッチング（＋４．００ｋＶ／－４．００ｋＶ）によって行われた。Ａ）５ｍＭ ＮＨ４ＡｃＯ（ｐＨ９．９）、及びＢ）ＡＣＮを使用して、分離を達成した。この勾配は、１５％のＡ）によって開始し、１８分かけて９０％のＡ）まで進行し、９分間アイソクラティックステップを行い、７分間最初の１５％のＡ）に戻した。正確な質量測定値（≦３ｐｐｍ）、純粋な標準物質の保持時間、及びＭＳ２フラグメンテーションパターンを使用してＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ３．３によって、代謝産物を定量化した。Ｒを使用して、主成分分析及び階層的クラスタリングを有するデータ分析を実行した。
海馬組織を１ｍｌの８０％の冷ＭｅＯＨ中でホモジナイズし、氷上で激しく撹拌した後、遠心分離した（１．３＊１０４ｒｐｍ、４℃）。５ｕｇの上澄みをガラスバイアス中に移し、５ｎｍｏｌ Ｄ／Ｌのノルバリンを補充し、吸引減圧乾燥させ、最後に７０％のアセトニトリル中で再懸濁させた。試料の質量分析に基づく分析のために、５ｌをＬｕｎａ ＮＨ２（１５０ｍｍ×２ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラム上に注入した。これらの試料は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析された。このＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅは、７０～１０５０ｍ／ｚの範囲を有するフルスキャンモードで極性スイッチング（＋４．００ｋＶ／－４．００ｋＶ）によって行われた。Ａ）５ｍＭ ＮＨ４ＡｃＯ（ｐＨ９．９）、及びＢ）ＡＣＮを使用して、分離を達成した。この勾配は、１５％のＡ）によって開始し、１８分かけて９０％のＡ）まで進行し、９分間アイソクラティックステップを行い、７分間最初の１５％のＡ）に戻した。正確な質量測定値（≦３ｐｐｍ）、純粋な標準物質の保持時間、及びＭＳ２フラグメンテーションパターンを使用してＴｒａｃｅＦｉｎｄｅｒ３．３によって、代謝産物を定量化した。Ｒを使用して、主成分分析及び階層的クラスタリングを有するデータ分析を実行した。
【0054】
アミノ酸補給
上記の方法に記述されるように、４週齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ ＳＰＦマウスを抗生物質によって処置し、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によってコロニー形成し、ＫＤを１４日間与えた。１１日目の夕方から、３日間１２時間毎に、滅菌ＰＢＳ中のケト原性アミノ酸カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）－－Ｌ－ロイシン（２．０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－リジン（２．０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－チロシン（２．４ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－トリプトファン（１．６ｍｇ／ｋｇ）、及びＬ－スレオニン（３．１ｍｇ／ｋｇ）をマウス腹腔内に注入した。濃縮は、マウス血液２６中の各アミノ酸について報告された生理的レベルに、また対照ＳＰＦ ＣＤ及びＡｋｋＰｂ ＫＤマウス間の各アミノ酸についての我々のメタボロミクスデータセット中で観察された倍率変化に基づく（表Ｓ４）。ビークル処置されたマウスにＰＢＳ（２００ｕｌ／３０ｇマウス）を注入した。１４日目に、前の１時間の行動試験室中での順化期間を含む、最後の朝のアミノ酸注入の２時間後に６Ｈｚ発作についてマウスを試験した。
上記の方法に記述されるように、４週齢のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ ＳＰＦマウスを抗生物質によって処置し、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によってコロニー形成し、ＫＤを１４日間与えた。１１日目の夕方から、３日間１２時間毎に、滅菌ＰＢＳ中のケト原性アミノ酸カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）－－Ｌ－ロイシン（２．０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－リジン（２．０ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－チロシン（２．４ｍｇ／ｋｇ）、Ｌ－トリプトファン（１．６ｍｇ／ｋｇ）、及びＬ－スレオニン（３．１ｍｇ／ｋｇ）をマウス腹腔内に注入した。濃縮は、マウス血液２６中の各アミノ酸について報告された生理的レベルに、また対照ＳＰＦ ＣＤ及びＡｋｋＰｂ ＫＤマウス間の各アミノ酸についての我々のメタボロミクスデータセット中で観察された倍率変化に基づく（表Ｓ４）。ビークル処置されたマウスにＰＢＳ（２００ｕｌ／３０ｇマウス）を注入した。１４日目に、前の１時間の行動試験室中での順化期間を含む、最後の朝のアミノ酸注入の２時間後に６Ｈｚ発作についてマウスを試験した。
【0055】
ＧＧｓＴｏｐ処置
野生型マウスについて：４週齢のＳＰＦ Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにＣＤを１４日間適宜給餌した。１１日目の夕方から、１２時間毎に滅菌水中の１３．３ｍｇ／ｋｇの３－［［（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）メトキシホスフィニル］オキシ］ベンゼン酢酸（ＧＧｓＴｏｐ、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってマウスに経口経管栄養を行った。ビークル処置されたマウスに滅菌水（２００ｕｌ／３０ｇマウス）によって経管栄養を行った。１４日目に、行動試験室中での前の１時間の順化期間を含む、最後の朝のＧＧｓＴｏｐ経管栄養の２時間後に、６Ｈｚ発作についてマウスを試験した。Ｋｃｎａ１マウスについて：３～４週齢のＫｃｎａ１－／－マウスにＣＤを２３日間適宜に給餌した。１５日目に、上記の節のＫｃｎａ１発作記録に記述されるように、ＥＥＧ伝達物質を移植した。１８日目の夕方に、１２時間毎に２１日目の朝まで、１３．３ｍｇ／ｋｇのＧＧｓＴｏｐによってマウスに経口経管栄養を行った。ＥＥＧによって最終経管栄養の２時間後に記録を開始し、３日間かけて発作を記録した。
野生型マウスについて：４週齢のＳＰＦ Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにＣＤを１４日間適宜給餌した。１１日目の夕方から、１２時間毎に滅菌水中の１３．３ｍｇ／ｋｇの３－［［（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）メトキシホスフィニル］オキシ］ベンゼン酢酸（ＧＧｓＴｏｐ、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってマウスに経口経管栄養を行った。ビークル処置されたマウスに滅菌水（２００ｕｌ／３０ｇマウス）によって経管栄養を行った。１４日目に、行動試験室中での前の１時間の順化期間を含む、最後の朝のＧＧｓＴｏｐ経管栄養の２時間後に、６Ｈｚ発作についてマウスを試験した。Ｋｃｎａ１マウスについて：３～４週齢のＫｃｎａ１－／－マウスにＣＤを２３日間適宜に給餌した。１５日目に、上記の節のＫｃｎａ１発作記録に記述されるように、ＥＥＧ伝達物質を移植した。１８日目の夕方に、１２時間毎に２１日目の朝まで、１３．３ｍｇ／ｋｇのＧＧｓＴｏｐによってマウスに経口経管栄養を行った。ＥＥＧによって最終経管栄養の２時間後に記録を開始し、３日間かけて発作を記録した。
【0056】
交差給餌インビトロアッセイ
前述のように交差給餌を測定した。嫌気性チューブの底部に１％の寒天によって補充された５ｍｌの事前に還元されたＣＤまたはＫＤベースの液体培地中に２×１０６ｃｆｕ／ｍｌでＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを包埋し、その上にＰ．ｍｅｒｄａｅを５ｍｌの事前に還元されたＭ９最少培地中に６×１０６ｃｆｕ／ｍｌで重層した。上述されたマウスＫＤ対ＣＤ食餌制限をＭ９培地中で２ｋｃａｌ／ｍｌへ無菌的に懸濁することによって、食餌制限に基づく培地を作製した。パイロット実験は、寒天区画から上記のＭ９液体区画中へ包埋されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの異所転位がないことを確認した。各時点に、頂部及び底部区画からアリコートを取り、濃厚培地中の希釈系列（Ｐ．ｍｅｒｄａｅについてＲＣＭ、及びＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａについてＢＨＩ＋０．０５％のムチン）に蒔き、コロニーを計数した。ＧＧｓＴｏｐ前処置実験について、ＲＣＭ培地中でＰ．ｍｅｒｄａｅを５００ｕＭのＧＧｓＴｏｐ対ビークルによって３７℃で２時間インキュベートした後に、滅菌培地によって洗浄した。パイロット実験は、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ生存率についてＧＧｓＴｏｐ前処置の有意な効果がなかったことを明らかにした。
前述のように交差給餌を測定した。嫌気性チューブの底部に１％の寒天によって補充された５ｍｌの事前に還元されたＣＤまたはＫＤベースの液体培地中に２×１０６ｃｆｕ／ｍｌでＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを包埋し、その上にＰ．ｍｅｒｄａｅを５ｍｌの事前に還元されたＭ９最少培地中に６×１０６ｃｆｕ／ｍｌで重層した。上述されたマウスＫＤ対ＣＤ食餌制限をＭ９培地中で２ｋｃａｌ／ｍｌへ無菌的に懸濁することによって、食餌制限に基づく培地を作製した。パイロット実験は、寒天区画から上記のＭ９液体区画中へ包埋されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの異所転位がないことを確認した。各時点に、頂部及び底部区画からアリコートを取り、濃厚培地中の希釈系列（Ｐ．ｍｅｒｄａｅについてＲＣＭ、及びＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａについてＢＨＩ＋０．０５％のムチン）に蒔き、コロニーを計数した。ＧＧｓＴｏｐ前処置実験について、ＲＣＭ培地中でＰ．ｍｅｒｄａｅを５００ｕＭのＧＧｓＴｏｐ対ビークルによって３７℃で２時間インキュベートした後に、滅菌培地によって洗浄した。パイロット実験は、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ生存率についてＧＧｓＴｏｐ前処置の有意な効果がなかったことを明らかにした。
【0057】
ＧＧＴ活性アッセイ
ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（６），５６７（２０１５）に以前に記載されたように、ＧＧＴ活性を測定した。嫌気性培養のために、ＣＤ及びＫＤベースの培地中に３×１０５ｃｆｕ／ｍｌで細菌を播種した。１ｍｌの細菌懸濁液をペレット状にし、－８０℃で１時間冷凍した。細菌ｃｆｕによる後のデータ正規化のために、同一の懸濁液の別々のアリコートをＢＨＩムチン寒天培地またはＲＣＭ中に蒔き、Ｃｏｙ嫌気性チャンバ中に３７℃でインキュベートした。つぎにペレットを２５０ｕｌの溶解緩衝液（１ｕｇ／ｍｌのリゾチームを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。糞便試料について、１つのペレットを計量し、１ｍｌの溶解緩衝液中でホモジナイズした。つぎに細菌及び糞便懸濁液を超音波処理し（ＱＳｏｎｉｃａ １２５）、１０分間４℃で１２０００ｘｇにおいて遠心分離した。２０ｕｌの上澄みを１８０ｕｌの基質緩衝液（２．９ｍＭ Ｌ－ガンマ－グルタミル－３－カルボキシ－４－ニトロアニリド（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ）、１００ｍＭのグリシルグリシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）、及び５００ｕＭのＧＧｓＴｏｐ（注記がある場合）と撹拌した。自動マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１）を使用して１時間毎分３７℃で、３－カルボキシ－４－ニトロアニリンの生成を示す４０５ｎｍで吸光度を測定した。
ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（６），５６７（２０１５）に以前に記載されたように、ＧＧＴ活性を測定した。嫌気性培養のために、ＣＤ及びＫＤベースの培地中に３×１０５ｃｆｕ／ｍｌで細菌を播種した。１ｍｌの細菌懸濁液をペレット状にし、－８０℃で１時間冷凍した。細菌ｃｆｕによる後のデータ正規化のために、同一の懸濁液の別々のアリコートをＢＨＩムチン寒天培地またはＲＣＭ中に蒔き、Ｃｏｙ嫌気性チャンバ中に３７℃でインキュベートした。つぎにペレットを２５０ｕｌの溶解緩衝液（１ｕｇ／ｍｌのリゾチームを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。糞便試料について、１つのペレットを計量し、１ｍｌの溶解緩衝液中でホモジナイズした。つぎに細菌及び糞便懸濁液を超音波処理し（ＱＳｏｎｉｃａ １２５）、１０分間４℃で１２０００ｘｇにおいて遠心分離した。２０ｕｌの上澄みを１８０ｕｌの基質緩衝液（２．９ｍＭ Ｌ－ガンマ－グルタミル－３－カルボキシ－４－ニトロアニリド（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ）、１００ｍＭのグリシルグリシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ）、及び５００ｕＭのＧＧｓＴｏｐ（注記がある場合）と撹拌した。自動マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１）を使用して１時間毎分３７℃で、３－カルボキシ－４－ニトロアニリンの生成を示す４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【0058】
腸管透過性アッセイ
０．６ｇ／ｋｇの４ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による経管栄養前に、午前７時に開始して４時間マウスを絶食させた。経管栄養の４時間後に、心臓穿刺によって血清試料を採取し、水中で３倍に希釈し、水中で３倍に希釈された通常のマウス血清中のＦＩＴＣ－デキストランストックの標準希釈系列に対して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ９マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して蛍光強度について５２１ｎｍで二度繰り返して読んだ。
０．６ｇ／ｋｇの４ｋＤａ ＦＩＴＣ－デキストラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による経管栄養前に、午前７時に開始して４時間マウスを絶食させた。経管栄養の４時間後に、心臓穿刺によって血清試料を採取し、水中で３倍に希釈し、水中で３倍に希釈された通常のマウス血清中のＦＩＴＣ－デキストランストックの標準希釈系列に対して、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ９マルチモードプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して蛍光強度について５２１ｎｍで二度繰り返して読んだ。
【0059】
統計学的解析
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して統計学的解析を実行した。データを正規分布について評価し、平均値±の標準誤差として図中にプロットした。各図について、ｎ＝独立した生物学的反復実験数。試料または動物をこれらの解析から除外しなかった。ウェルチの補正による両側の、対応しないスチューデントｔ検定を使用して、２つの処置群間の差を評価した。ボンフェローニの事後検定による一元配置分散分析を使用して１つの変数のみを有する＞２群間の差を評価した。ダンの事後検定によるノンパラメトリック一元配置分散分析によって、Ｋｃｎａ１マウスについてのデータを解析した。２つの変数を有する≧２群（たとえば、発作時間経過、ＢＨＢ時間経過、メタボロミクスデータ、細菌増殖曲線）に対してボンフェローニの事後検定による二元配置分散分析を使用した。ＧＧＴアッセイに対して、反復測定及びボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を使用した。上記の検定から現れる有意差を、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１によって図中に示す。注目すべき、ほぼ有意な差（０．５＜Ｐ＜０．１）を図中に示した。注目すべき、有意ではない（及びほぼ有意ではない）差を図中に「ｎ．ｓ．」によって示す。
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して統計学的解析を実行した。データを正規分布について評価し、平均値±の標準誤差として図中にプロットした。各図について、ｎ＝独立した生物学的反復実験数。試料または動物をこれらの解析から除外しなかった。ウェルチの補正による両側の、対応しないスチューデントｔ検定を使用して、２つの処置群間の差を評価した。ボンフェローニの事後検定による一元配置分散分析を使用して１つの変数のみを有する＞２群間の差を評価した。ダンの事後検定によるノンパラメトリック一元配置分散分析によって、Ｋｃｎａ１マウスについてのデータを解析した。２つの変数を有する≧２群（たとえば、発作時間経過、ＢＨＢ時間経過、メタボロミクスデータ、細菌増殖曲線）に対してボンフェローニの事後検定による二元配置分散分析を使用した。ＧＧＴアッセイに対して、反復測定及びボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析を使用した。上記の検定から現れる有意差を、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１によって図中に示す。注目すべき、ほぼ有意な差（０．５＜Ｐ＜０．１）を図中に示した。注目すべき、有意ではない（及びほぼ有意ではない）差を図中に「ｎ．ｓ．」によって示す。
【0060】
［実施例２：ケトン食療法は腸内微生物叢を変えて発作に対する予防を与える］
難治性てんかんの６Ｈｚの精神運動発作モデルは、低周波数角膜刺激を伴い、ヒト側頭葉てんかんの焦点性認知障害性発作を誘発する。ＫＤは、試験される対象の５０％に発作を誘発するために必要とされる上昇した電流強度（ＣＣ５０、発作閾値）によって示されるような、６Ｈｚ発作を予防する。特定病原体除去（ＳＰＦ）Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに６：１の脂肪：タンパク質ＫＤ、またはビタミン及びミネラルが適合した対照食餌療法（ＣＤ）を給餌した。ＣＤ対照と比較して、ＫＤを摂取するマウスは、６Ｈｚの刺激に応答して上昇した発作閾値（図１Ａ）、減少した血清グルコース（図１Ｂ）及び増加した血清β－ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢ；図１Ｃ）を示した。ＣＤ群対ＫＤ群にわたる摂食量、または体重増加における有意差がなかった。
難治性てんかんの６Ｈｚの精神運動発作モデルは、低周波数角膜刺激を伴い、ヒト側頭葉てんかんの焦点性認知障害性発作を誘発する。ＫＤは、試験される対象の５０％に発作を誘発するために必要とされる上昇した電流強度（ＣＣ５０、発作閾値）によって示されるような、６Ｈｚ発作を予防する。特定病原体除去（ＳＰＦ）Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに６：１の脂肪：タンパク質ＫＤ、またはビタミン及びミネラルが適合した対照食餌療法（ＣＤ）を給餌した。ＣＤ対照と比較して、ＫＤを摂取するマウスは、６Ｈｚの刺激に応答して上昇した発作閾値（図１Ａ）、減少した血清グルコース（図１Ｂ）及び増加した血清β－ヒドロキシ酪酸（ＢＨＢ；図１Ｃ）を示した。ＣＤ群対ＫＤ群にわたる摂食量、または体重増加における有意差がなかった。
【0061】
発作閾値を上昇させることに加えて、ケトン食療法は、腸内微生物叢の組成物を変え（図１Ｄ）、α－多様性を低下させ（図１Ｅ）、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの相対的存在量を増加させた（図１Ｆ）。Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ及びＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ菌種は、ＫＤ給餌されたマウスにおいても増加したが、Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ菌種は、対照食餌制限を給餌されたマウスにおいて増加した（図２）。これらの結果は、腸内微生物叢の組成物がＫＤに応答して迅速、かつ有意に変わったことを明らかにした。
【0062】
［実施例３：腸内微生物叢はケトン食療法の抗発作効果を与える］
腸内微生物叢がケトン食療法の抗発作効果に必要であったかどうかを判定するために、無菌（ＧＦ）及び抗生物質（Ａｂｘ）処置されたＳＰＦマウスについての６Ｈｚ精神運動発作閾値を測定した。
腸内微生物叢がケトン食療法の抗発作効果に必要であったかどうかを判定するために、無菌（ＧＦ）及び抗生物質（Ａｂｘ）処置されたＳＰＦマウスについての６Ｈｚ精神運動発作閾値を測定した。
【0063】
ＣＤ対照（ＳＰＦ ＣＤ）と比較して、ＫＤ（ＳＰＦ ＫＤ）を１４日間給餌されたＳＰＦマウスは、上昇した発作閾値を示し、微生物叢を変えた（図３Ａ及び図１Ｄ）。これは、ＧＦマウス（図３Ａ）及びＡｂｘ処置されたＳＰＦマウス（図３Ｃ）において抑制され、発作予防において、ＫＤが媒介した増加のために腸内微生物叢を必要としたことを示した。ＳＰＦ腸内微生物叢を含むＧＦマウスのコンベンショナル化は、ＫＤ関連発作予防を天然ＳＰＦ ＫＤマウスに見られるレベルへ回復させ（図３Ａ）、ＫＤ発作抵抗性の微生物媒介が離乳前微生物叢コロニー形成に依存しなかったこと、及びこの微生物叢がＫＤによる発作予防を能動的に媒介したことを示唆した。注目すべきことに、ＫＤ関連発作抵抗性の微生物調節は、血清ＢＨＢまたはグルコースレベルにおける変化と相関しなかった（図３Ｂ及び図３Ｄ）。また、腸、肝臓、または脳のＢＨＢレベルにおいて群間の有意差がなかった。全体として、これらのデータは、腸内微生物叢が６Ｈｚの発作モデルにおけるＫＤの抗発作効果に必要とされたことを実証し、さらに腸内微生物がＢＨＢレベルにおける変化を伴わない機構を通して発作感受性を調節したことを示唆した。
【0064】
特異的細菌分類群がＫＤに反応して発作予防を媒介したかどうかを判定するために、Ａｂｘ処置されたＳＰＦマウスに選択ＫＤ関連細菌によってコロニー形成し、これらのマウスにＫＤを給餌した後、６Ｈｚ発作について試験した（図４）。１０９ｃｆｕの細菌：ｉ）Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ；ｉｉ）ＫＤによって濃縮されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ操作的分類単位リードへ最も高い相同性を有するヒト微生物叢からの代表的な腸内Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種として、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの１：１の割合（図１Ｄ）；またはｉｉｉ）Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓの２：１：１の割合によってマウスに経管栄養を行った。経管栄養の１４日後に、結腸内腔内容物の１６Ｓ ｒＤＮＡシーケンシングは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａで処置されたマウスは、４３．７±０．４％の相対的存在量のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含み、両方の分類群によって経管栄養を行われたマウスは、４９．０±４．１％のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及び２２．５±５．４％のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓを含んだことを明らかにした。これと一致して、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によって処置されたマウスからの結腸切片のＦＩＳＨプロセシングは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａプローブＭＵＣ１４３７、ならびにＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種プローブＢＡＣ３０３の増加したハイブリダイゼーションを示し、ＢＡＣ３０３陽性細胞から最も近いＭＵＣ１４３７陽性細胞への平均距離は、０．６４±０．０９ミクロンである。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の両方は、粘膜間隙ではなく、マウス結腸の内腔に局在した。ＣＤ対ＫＤを給餌されたマウスにわたる、体重、血清グルコースレベル、またはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の濃縮において有意差がなかった。コロニー形成及び発作病態にかかわらず、ＫＤ給餌群において、ＢＨＢを同様に引き起こした。これらのデータは、Ａｂｘ処置による微生物叢枯渇後の外因性細菌の経口経管栄養が播種後１４日までにそれらの持続的な腸内濃縮をもたらしたことを明らかにした。
【0065】
ＫＤ単独による処置は、ＳＰＦ ＣＤマウスにおける１９．４±０．８ｍＡから、ＳＰＦ ＫＤマウスにおける２４．２±０．３ｍＡへ、２４．５％発作閾値を上昇させた。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の同時投与がＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウスにおける６Ｈｚ発作に対する予防を回復させながら、Ａｂｘ ＫＤマウスにおける１９．９±０．３ｍＡから、ＡｋｋＰｂ ＫＤマウスにおける２７．０±０．５ｍＡへ、３６．０％閾値を上昇させた（図４Ａ）。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓによって経管栄養を行われたマウスが発作予防の回復がなかったことを示したため、細菌濃縮の発作予防効果は、Ｐ．ｍｅｒｄａｅを含むＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａに特異的であった。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種単独のいずれか一方の濃縮後に、発作閾値における有意な上昇がなく（図４Ａ）、これらの両方がケトン食療法の抗発作効果を媒介するために必要とされたことを示した。また、ＣＤ処置されたマウスにおいて増加した（図１Ｆ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍによる処置の効果がなかった（図４Ａ）。さらに、ＧＦマウス中のＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ単一コロニー形成、またはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ単一コロニー形成に比較したとき、ＧＦマウスにおけるＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の同時コロニー形成は、ＫＤに反応して発作予防を促進した（図４Ｃ）。全体として、これらの知見は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種がケトン食療法に反応して増殖し、その予防効果を６Ｈｚ発作モデルにおいて媒介したことを明らかにした。
【0066】
［実施例４：腸内微生物叢は対照食餌制限を給餌されたマウスに発作予防を十分に与える］
ＫＤ関連腸内微生物も対照食餌制限を給餌されたマウスに抗発作効果を与えたかどうかを判定するために、Ａｂｘ処置されたマウスは、ＳＰＦマウスからＣＤ対ＫＤ微生物叢を移植され、ＣＤまたはＫＤを給餌され、４日間の食餌処置後に６Ｈｚ発作へのこれらのマウスの感受性について試験された。Ａｂｘ処置されたマウスを使用し、天然微生物叢を枯渇させるためにＡｂｘによる前処置を伴う臨床糞便移植手法を模倣した。４日目は、ｉ）その時点までに有意な微生物叢変化を誘導するＫＤの能力（図１Ｄ、図１Ｆ、及び図５Ａ）と、ｉｉ）ＫＤ微生物叢がＫＤからＣＤへ切り換えた４日後に、ＣＤプロファイルへの不完全な復帰を示す証拠（図６Ａ）とに基づき選択した。ＣＤ微生物叢を移植され、ＫＤを４日間給餌されたマウスは、ＣＤ給餌された対照と比較して、上昇した発作閾値を示した（図５Ａ）。ＫＤマイクロバイオームを移植したが、４日間ＣＤを給餌されたＡｂｘ処置マウスも、同様の発作予防を示した。これは、ＫＤ微生物叢によるコロニー形成がＣＤを給餌されたマウスにおける発作閾値を上昇させたことを示唆した。注目すべきことに、しかしながら、２８日目にＣＤプロファイルへＫＤ微生物叢の完全な復帰後に発作予防を抑制し（図６Ｂ）、ＫＤ微生物叢、食餌制限及び神経活性間の持続的な相互作用を必要としたことを示唆した。同様な抗発作効果は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＢ．ｌｏｎｇｕｍ対照と比較して、ＣＤを給餌されたＡｂｘ処置ＳＰＦマウスにおいて、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を濃縮した後に見られた（図５Ｂ）。しかしながら、ＳＰＦ ＣＤ対照と比較してＡｂｘ単独によって処置されたＳＰＦ ＣＤマウス中の発作閾値における上昇は、これらの結果の解釈を混乱させた（図５Ｂ）。この不確実性を明らかにするために、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による外因性の処置がＣＤを給餌されたマウスに抗発作効果を与えたかどうかを調査する細菌処置手法を適用した。１０９ｃｆｕのＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による、またはビークルによる、２８日間１日２回の経管栄養をＳＰＦ ＣＤマウスに行った。この細菌処置は、ビークル経管栄養対照と比較して、発作閾値を上昇させた（図６Ｃ）。ケトン食療法を給餌されたマウスにおける実験（図４）と一致して、この発作予防は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ単独によって処置された動物において観察されず、発作予防のためにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の同時投与を必要としたことを明らかにした（図５Ｃ）。さらに、加熱殺菌された細菌による処置は、ビークル処置された対照と比較して、発作閾値を低下させ、生菌が抗発作効果を与えるために必要であり、細菌細胞表面及び／または細胞内因子の放出が６Ｈｚ発作への感受性を促進したことを示唆した。発作閾値における上昇が２１日間処置を止めた後に失われたため、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種への持続的な曝露を必要とした（図６Ｃ）。加えて、発作予防は、４日間だけ処置されたマウスにおいて観察されず（図６Ｄ）、長期間の曝露を必要としたことを示唆した。まとめると、これらの知見は、ＫＤ微生物叢の糞便移植、及びＫＤ関連分類群Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による細菌処置が対照食餌制限を給餌されたマウスにおける６Ｈｚ精神運動発作に対する予防を与えたことを明らかにした。
ＫＤ関連腸内微生物も対照食餌制限を給餌されたマウスに抗発作効果を与えたかどうかを判定するために、Ａｂｘ処置されたマウスは、ＳＰＦマウスからＣＤ対ＫＤ微生物叢を移植され、ＣＤまたはＫＤを給餌され、４日間の食餌処置後に６Ｈｚ発作へのこれらのマウスの感受性について試験された。Ａｂｘ処置されたマウスを使用し、天然微生物叢を枯渇させるためにＡｂｘによる前処置を伴う臨床糞便移植手法を模倣した。４日目は、ｉ）その時点までに有意な微生物叢変化を誘導するＫＤの能力（図１Ｄ、図１Ｆ、及び図５Ａ）と、ｉｉ）ＫＤ微生物叢がＫＤからＣＤへ切り換えた４日後に、ＣＤプロファイルへの不完全な復帰を示す証拠（図６Ａ）とに基づき選択した。ＣＤ微生物叢を移植され、ＫＤを４日間給餌されたマウスは、ＣＤ給餌された対照と比較して、上昇した発作閾値を示した（図５Ａ）。ＫＤマイクロバイオームを移植したが、４日間ＣＤを給餌されたＡｂｘ処置マウスも、同様の発作予防を示した。これは、ＫＤ微生物叢によるコロニー形成がＣＤを給餌されたマウスにおける発作閾値を上昇させたことを示唆した。注目すべきことに、しかしながら、２８日目にＣＤプロファイルへＫＤ微生物叢の完全な復帰後に発作予防を抑制し（図６Ｂ）、ＫＤ微生物叢、食餌制限及び神経活性間の持続的な相互作用を必要としたことを示唆した。同様な抗発作効果は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたはＢ．ｌｏｎｇｕｍ対照と比較して、ＣＤを給餌されたＡｂｘ処置ＳＰＦマウスにおいて、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を濃縮した後に見られた（図５Ｂ）。しかしながら、ＳＰＦ ＣＤ対照と比較してＡｂｘ単独によって処置されたＳＰＦ ＣＤマウス中の発作閾値における上昇は、これらの結果の解釈を混乱させた（図５Ｂ）。この不確実性を明らかにするために、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による外因性の処置がＣＤを給餌されたマウスに抗発作効果を与えたかどうかを調査する細菌処置手法を適用した。１０９ｃｆｕのＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による、またはビークルによる、２８日間１日２回の経管栄養をＳＰＦ ＣＤマウスに行った。この細菌処置は、ビークル経管栄養対照と比較して、発作閾値を上昇させた（図６Ｃ）。ケトン食療法を給餌されたマウスにおける実験（図４）と一致して、この発作予防は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ単独によって処置された動物において観察されず、発作予防のためにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の同時投与を必要としたことを明らかにした（図５Ｃ）。さらに、加熱殺菌された細菌による処置は、ビークル処置された対照と比較して、発作閾値を低下させ、生菌が抗発作効果を与えるために必要であり、細菌細胞表面及び／または細胞内因子の放出が６Ｈｚ発作への感受性を促進したことを示唆した。発作閾値における上昇が２１日間処置を止めた後に失われたため、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種への持続的な曝露を必要とした（図６Ｃ）。加えて、発作予防は、４日間だけ処置されたマウスにおいて観察されず（図６Ｄ）、長期間の曝露を必要としたことを示唆した。まとめると、これらの知見は、ＫＤ微生物叢の糞便移植、及びＫＤ関連分類群Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による細菌処置が対照食餌制限を給餌されたマウスにおける６Ｈｚ精神運動発作に対する予防を与えたことを明らかにした。
【0067】
［実施例５：ＫＤ関連細菌はＫｃｎａ１－／－マウスにおける強直間代性発作を減少させた］
てんかんは、多様な臨床症状を有する不均一な疾患である。微生物叢が異なる発作タイプに影響したかどうかを判定するために、側頭葉てんかん、及びてんかんにおける予期せぬ突然死（ＳＵＤＥＰ）についてのＫｃｎａ１－／－マウスのモデルにおいて、全般性強直間代性発作を調節する際に腸内微生物叢についての役割を試験した。Ｋｃｎａ１－／－マウスは、電位開口型カリウムチャネルＫｖ１．１アルファサブユニットにヌル変異体を含み、てんかん、発作性運動失調症及びＳＵＤＥＰとヒトＫＣＮＡ１遺伝子バリアントの関連性を模倣する。Ｋｃｎａ１－／－マウスは、ＫＤによって５４％減少する、重度の自発性反復性発作を発症する。Ｋｃｎａ１－／－ＳＰＦ Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅJマウスをＡｂｘまたはビークルによって１週間処置し、これらのマウスにビークル、またはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によって経管栄養を行い、３週間ＫＤまたはＣＤを給餌した。発作頻度及び持続時間をＥＥＧによって３日かけて記録し、エレクトログラフィック発作を５段階：Ａ）低電圧棘波を有する、低周波バックグラウンド、Ｂ）同期した高周波、高電圧棘波、Ｃ）高周波、低電圧棘波、Ｄ）同期しなかった高周波、高電圧棘波、及びＥ）高周波、バースト棘波（図７Ｃ）からなる特徴的なてんかん様棘波パターンに基づき特定した。さらに、ＥＥＧ発作パターンは、５段階によって特定される常同発作行動によって実証された。ＫＤ対ＣＤを給餌されたマウス間の体重増加、摂食量における有意差がなかった。群にわたる生存率における差は、観察されなかった。ＣＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－マウスは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種における増加を有する、腸内微生物叢プロファイルの変化を示した（図７Ａ）。注目すべきことに、これらの変化は、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに見られるＫＤ誘導型濃縮（図１Ｆ）と比較して、穏やかで、統計学的に有意ではなく、ベースライン微生物叢組成物、及びＫＤへの反応についての宿主遺伝型の効果を強調した。ビークル処置されたＫｃｎａ１－／－マウスは、４９０±２６ｕＶの平均最大棘波振幅を有する、１５～１８０秒持続した発作を示した（図７Ｃ）。ＣＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－マウスにおける発作発生率及び持続時間における減少を観察し（図７Ｄ）、前述されるようにＫＤ媒介型発作予防と一致していた。Ａｂｘによって前処置され、腸内微生物叢を枯渇させたＫｃｎａ１－／－マウスは、ビークル処置され、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、１日あたりの発作、及び合計発作持続時間に有意な増加を示した（図７Ｄ）。１発作あたりの棘波頻度、棘波内間隔、及び平均持続時間における有意差がなく、発作出現率についてＡｂｘ処置及び腸内微生物叢の枯渇の主な効果を示唆した。さらに、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によるＡｂｘ処置されたＫｃｎａ１－／－マウスのコロニー形成は、ビークル処置され、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照に見られたレベルに対して、発作頻度、及び発作の合計持続時間を減少させた（図７Ｄ）。これは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による処置が異なるベースライン及び食餌制限を変更された微生物叢（この事例において、Ｃ５７Ｂ１／６対Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅJ）を含むマウス系統において発作予防を同様に与えたことを示唆した。まとめると、これらの結果は、常在性腸内微生物叢からの選択細菌種が変化した発作タイプ及びモデルにわたりＫＤの抗発作効果を媒介した概念を支持した。
てんかんは、多様な臨床症状を有する不均一な疾患である。微生物叢が異なる発作タイプに影響したかどうかを判定するために、側頭葉てんかん、及びてんかんにおける予期せぬ突然死（ＳＵＤＥＰ）についてのＫｃｎａ１－／－マウスのモデルにおいて、全般性強直間代性発作を調節する際に腸内微生物叢についての役割を試験した。Ｋｃｎａ１－／－マウスは、電位開口型カリウムチャネルＫｖ１．１アルファサブユニットにヌル変異体を含み、てんかん、発作性運動失調症及びＳＵＤＥＰとヒトＫＣＮＡ１遺伝子バリアントの関連性を模倣する。Ｋｃｎａ１－／－マウスは、ＫＤによって５４％減少する、重度の自発性反復性発作を発症する。Ｋｃｎａ１－／－ＳＰＦ Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅJマウスをＡｂｘまたはビークルによって１週間処置し、これらのマウスにビークル、またはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によって経管栄養を行い、３週間ＫＤまたはＣＤを給餌した。発作頻度及び持続時間をＥＥＧによって３日かけて記録し、エレクトログラフィック発作を５段階：Ａ）低電圧棘波を有する、低周波バックグラウンド、Ｂ）同期した高周波、高電圧棘波、Ｃ）高周波、低電圧棘波、Ｄ）同期しなかった高周波、高電圧棘波、及びＥ）高周波、バースト棘波（図７Ｃ）からなる特徴的なてんかん様棘波パターンに基づき特定した。さらに、ＥＥＧ発作パターンは、５段階によって特定される常同発作行動によって実証された。ＫＤ対ＣＤを給餌されたマウス間の体重増加、摂食量における有意差がなかった。群にわたる生存率における差は、観察されなかった。ＣＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－マウスは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種における増加を有する、腸内微生物叢プロファイルの変化を示した（図７Ａ）。注目すべきことに、これらの変化は、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに見られるＫＤ誘導型濃縮（図１Ｆ）と比較して、穏やかで、統計学的に有意ではなく、ベースライン微生物叢組成物、及びＫＤへの反応についての宿主遺伝型の効果を強調した。ビークル処置されたＫｃｎａ１－／－マウスは、４９０±２６ｕＶの平均最大棘波振幅を有する、１５～１８０秒持続した発作を示した（図７Ｃ）。ＣＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－マウスにおける発作発生率及び持続時間における減少を観察し（図７Ｄ）、前述されるようにＫＤ媒介型発作予防と一致していた。Ａｂｘによって前処置され、腸内微生物叢を枯渇させたＫｃｎａ１－／－マウスは、ビークル処置され、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照と比較して、１日あたりの発作、及び合計発作持続時間に有意な増加を示した（図７Ｄ）。１発作あたりの棘波頻度、棘波内間隔、及び平均持続時間における有意差がなく、発作出現率についてＡｂｘ処置及び腸内微生物叢の枯渇の主な効果を示唆した。さらに、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によるＡｂｘ処置されたＫｃｎａ１－／－マウスのコロニー形成は、ビークル処置され、ＫＤを給餌されたＫｃｎａ１－／－対照に見られたレベルに対して、発作頻度、及び発作の合計持続時間を減少させた（図７Ｄ）。これは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種による処置が異なるベースライン及び食餌制限を変更された微生物叢（この事例において、Ｃ５７Ｂ１／６対Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅJ）を含むマウス系統において発作予防を同様に与えたことを示唆した。まとめると、これらの結果は、常在性腸内微生物叢からの選択細菌種が変化した発作タイプ及びモデルにわたりＫＤの抗発作効果を媒介した概念を支持した。
【0068】
［実施例６：微生物叢は腸、血清、及び脳のメタボロームを調節した］
メタボロームプロファイリングを使用して、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウスと、ＫＤを給餌されたＳＰＦ、Ａｂｘ処置されたＳＰＦ、ならびにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の濃縮されたマウスとの結腸内腔内容物及び血清における候補の微生物叢依存性分子を特定した（図８Ａ及び図９Ａ）。結腸内腔内容物及び血清におけるメタボロームプロファイルにより、結腸内腔代謝産物について９４％、及び血清代謝産物について８７．５％の予測精度で、発作感受性（ＣＤを給餌されたビークル処置ＳＰＦマウス、及びＫＤを給餌されたＡｂｘ処置ＳＰＦマウス）群から発作予防した（ＫＤを給餌されたビークル処置ＳＰＦマウス、及びＫＤを給餌されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を含むＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ濃縮マウス）群を識別した。群識別へ非常に寄与した代謝産物の大部分は、リジン、チロシン及びスレオニンの誘導体を含む、アミノ酸代謝に関連した。加えて、発作感受性群と比較して、発作予防群からの結腸内腔内容物（図８Ｃ）及び血清（図８Ｄ）中のケト原性ガンマグルタミル化アミノ酸（ガンマ－グルタミル（ＧＧ）－ロイシン、ＧＧ－リジン、ＧＧ－スレオニン、ＧＧ－トリプトファン及びＧＧ－チロシン）のサブセットにおける広範な減少を観察した。これは、腸内微生物叢がガンマ－グルタミル化自体、またはケト原性ＧＧアミノ酸の選択的代謝を調節したこと、及び増加したケト原性ＧＧアミノ酸を発作感受性と関連付けたことを示唆した。この概念を支持するように、補完を行ったメタゲノムが、アミノ酸代謝に関連する細菌遺伝子中のＫＤ関連変化を予測した。これらのデータは、ＫＤに対する腸管及び全身性メタボローム応答について腸内微生物叢の有意な効果を明らかにし、さらにケト原性ＧＧアミノ酸のレベルにおける、ＫＤ誘導型発作予防と微生物叢依存性変化との間の関連性を明らかにした。
メタボロームプロファイリングを使用して、ＣＤを給餌されたＳＰＦマウスと、ＫＤを給餌されたＳＰＦ、Ａｂｘ処置されたＳＰＦ、ならびにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の濃縮されたマウスとの結腸内腔内容物及び血清における候補の微生物叢依存性分子を特定した（図８Ａ及び図９Ａ）。結腸内腔内容物及び血清におけるメタボロームプロファイルにより、結腸内腔代謝産物について９４％、及び血清代謝産物について８７．５％の予測精度で、発作感受性（ＣＤを給餌されたビークル処置ＳＰＦマウス、及びＫＤを給餌されたＡｂｘ処置ＳＰＦマウス）群から発作予防した（ＫＤを給餌されたビークル処置ＳＰＦマウス、及びＫＤを給餌されたＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を含むＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ濃縮マウス）群を識別した。群識別へ非常に寄与した代謝産物の大部分は、リジン、チロシン及びスレオニンの誘導体を含む、アミノ酸代謝に関連した。加えて、発作感受性群と比較して、発作予防群からの結腸内腔内容物（図８Ｃ）及び血清（図８Ｄ）中のケト原性ガンマグルタミル化アミノ酸（ガンマ－グルタミル（ＧＧ）－ロイシン、ＧＧ－リジン、ＧＧ－スレオニン、ＧＧ－トリプトファン及びＧＧ－チロシン）のサブセットにおける広範な減少を観察した。これは、腸内微生物叢がガンマ－グルタミル化自体、またはケト原性ＧＧアミノ酸の選択的代謝を調節したこと、及び増加したケト原性ＧＧアミノ酸を発作感受性と関連付けたことを示唆した。この概念を支持するように、補完を行ったメタゲノムが、アミノ酸代謝に関連する細菌遺伝子中のＫＤ関連変化を予測した。これらのデータは、ＫＤに対する腸管及び全身性メタボローム応答について腸内微生物叢の有意な効果を明らかにし、さらにケト原性ＧＧアミノ酸のレベルにおける、ＫＤ誘導型発作予防と微生物叢依存性変化との間の関連性を明らかにした。
【0069】
脳は、神経伝達物質生合成に補給するために必須アミノ酸の能動的移入に依存するため、末梢アミノ酸の生物学的利用率における変動に感受性がある。ＧＧアミノ酸は、特に、非ガンマ－グルタミル化形態と比較して、増加した輸送特性を示すと仮定される。血清のケト原性アミノ酸中の食餌制限及び微生物叢依存性変化、アミノ酸移入と脳ＧＡＢＡレベルとの間の関連、ならびにＧＡＢＡがＫＤの抗発作効果に寄与したという一般的な理論を明らかにしたデータに基づき、発作伝播についての重要な領域である海馬中のＧＡＢＡ及びグルタミン酸塩のバルクレベルを検討した。海馬代謝産物プロファイルは、発作予防マウス対発作感受性マウスについての試料を区別した。海馬のＧＡＢＡ／グルタミン酸塩の比は、ＣＤを給餌された対照と比較して、ＫＤを給餌されたＳＰＦマウスにおいて有意に増加する（図８Ｄ、左側）。これらの増加は、ＫＤを給餌されたＡｂｘ処置マウスにおいて抑制され、Ａｂｘ処置マウスにＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を濃縮後に回復した（図８Ｄ）。同様の変化は、グルタミンの海馬レベル、グルタミン酸塩及びＧＡＢＡの前駆体について見られた（図８Ｄ、右側）。全体として、これらの結果は、グルタミンの生物学的利用率における食餌制限及び微生物叢依存性調節、ならびに発作予防マウスにおけるグルタミン酸塩と比較して海馬ＧＡＢＡレベルにおける優先的な上昇を明らかにした。
【0070】
［実施例７：細菌ガンマ－グルタミル化は発作感受性に影響した］
本質的なケト原性ＧＧアミノ酸が発作予防実験群対発作感受性実験群の結腸内腔及び血清において減少した知見に基づき、ケト原性ＧＧアミノ酸の微生物叢依存性制限がＫＤの抗発作効果を媒介するために重要であると仮定された。アミノ酸のガンマ－グルタミル化形態は、グルタチオンからアミノ酸上へのＧＧ部分のペプチド転移によって生成された。アミノ酸のガンマ－グルタミル化が発作感受性に影響するかどうかを判定するために、ＳＰＦ ＣＤマウスに経管栄養を３日間、ＧＧＴの選択的不可逆的阻害剤であるＧＧｓＴｏｐによって行った。ＧＧｓＴｏｐによって処置されたＳＰＦ ＣＤマウスは、ＳＰＦ ＫＤマウスに見られたレベルに対して発作閾値において増加を示した（図１０Ａ）。同様に、ＧＧｓＴｏｐによって処置されたＣＤ給餌ＳＰＦ Ｋｃｎａ１－／－マウスのＥＥＧ記録は、１日あたりの発作における有意な減少を示した（図７Ｅ）。これは、ガンマ－グルタミル化の末梢阻害、及びＧＧアミノ酸の制限が発作予防を促進したことを実証し、発作感受性対照と比較して、発作予防群からの結腸内腔内容物及び血清中のケト原性ＧＧアミノ酸のメタボローム減少が観察されたことと一致している。グルタチオンの異化よりもむしろ、アミノ酸の制限がＫＤ微生物叢の抗発作効果のために必要であったかどうかを判定するために、ＫＤを給餌されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種濃縮マウスは、３日間、１日２回、併用のロイシン、リジン、スレオニン、トリプトファン及びチロシンによる腹腔内注入によって補われた後に、６Ｈｚ発作について試験された。それぞれについての投与量が血中濃度をＳＰＦ ＣＤ対照に見られた血中濃度まで回復させるように、血清メタボロームデータに基づき、生理学的に適切なアミノ酸濃度を計算した。ケト原性アミノ酸の全身レベルの上昇は、ビークル処置されたＳＰＦ ＣＤ対照に見られたレベルまで発作閾値を低下させた（図１０Ｂ）。これは、末梢ケト原性アミノ酸の制限が発作抵抗性における微生物叢及びＫＤ依存性向上を媒介するために必要であったことを示唆した。
本質的なケト原性ＧＧアミノ酸が発作予防実験群対発作感受性実験群の結腸内腔及び血清において減少した知見に基づき、ケト原性ＧＧアミノ酸の微生物叢依存性制限がＫＤの抗発作効果を媒介するために重要であると仮定された。アミノ酸のガンマ－グルタミル化形態は、グルタチオンからアミノ酸上へのＧＧ部分のペプチド転移によって生成された。アミノ酸のガンマ－グルタミル化が発作感受性に影響するかどうかを判定するために、ＳＰＦ ＣＤマウスに経管栄養を３日間、ＧＧＴの選択的不可逆的阻害剤であるＧＧｓＴｏｐによって行った。ＧＧｓＴｏｐによって処置されたＳＰＦ ＣＤマウスは、ＳＰＦ ＫＤマウスに見られたレベルに対して発作閾値において増加を示した（図１０Ａ）。同様に、ＧＧｓＴｏｐによって処置されたＣＤ給餌ＳＰＦ Ｋｃｎａ１－／－マウスのＥＥＧ記録は、１日あたりの発作における有意な減少を示した（図７Ｅ）。これは、ガンマ－グルタミル化の末梢阻害、及びＧＧアミノ酸の制限が発作予防を促進したことを実証し、発作感受性対照と比較して、発作予防群からの結腸内腔内容物及び血清中のケト原性ＧＧアミノ酸のメタボローム減少が観察されたことと一致している。グルタチオンの異化よりもむしろ、アミノ酸の制限がＫＤ微生物叢の抗発作効果のために必要であったかどうかを判定するために、ＫＤを給餌されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種濃縮マウスは、３日間、１日２回、併用のロイシン、リジン、スレオニン、トリプトファン及びチロシンによる腹腔内注入によって補われた後に、６Ｈｚ発作について試験された。それぞれについての投与量が血中濃度をＳＰＦ ＣＤ対照に見られた血中濃度まで回復させるように、血清メタボロームデータに基づき、生理学的に適切なアミノ酸濃度を計算した。ケト原性アミノ酸の全身レベルの上昇は、ビークル処置されたＳＰＦ ＣＤ対照に見られたレベルまで発作閾値を低下させた（図１０Ｂ）。これは、末梢ケト原性アミノ酸の制限が発作抵抗性における微生物叢及びＫＤ依存性向上を媒介するために必要であったことを示唆した。
【0071】
宿主細胞と特定の細菌種との両方は、ＧＧＴ活性を示す。ＫＤ、及びＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａとＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種との間の相互作用がインビボで細菌のガンマ－グルタミル化を抑制したかどうかの洞察を得るために、ＣＤもしくはＫＤを給餌されたＳＰＦマウス、またはＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種濃縮マウスから採取された糞便試料において、ＧＧＴ活性を測定した。ＳＰＦマウスにＫＤを給餌することは、ＣＤ対照と比較して糞便ＧＧＴ活性を低下させた（図１０Ｃ）。糞便ＧＧＴ活性における同様の低下は、ＣＤを給餌されたマウスにおいてＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を濃縮した後に見られた。さらに、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種を濃縮すること、ならびにＫＤを給餌することにより、ＳＰＦ ＫＤ及びＳＰＦ ＣＤマウスに見られたものと比較して、糞便ＧＧＴ活性をさらに低下させた。すべての糞便試料をＧＧＴ阻害剤、ＧＧｓＴｏｐに曝露することにより、検出されたシグナルを除去し、測定値がＧＧＴ活性を反映したことを確認した。これと一致して、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種によるＣＤ給餌ＳＰＦマウスの処置は、ビークル処置対照、及び加熱殺菌細菌によって処置されたマウスと比較して、糞便ＧＧＴ活性を低下させた（図１０Ｄ）。全体として、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種について濃縮、またはこれらによる外因性処置が糞便ＧＧＴ活性を低下させたことを明らかにし、これにより、発作予防マウスにおいて観察された結腸及び血清ＧＧアミノ酸の低レベルを説明することが可能である。
【0072】
細菌ガンマ－グルタミル化がＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａとＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種との間の相互作用によって影響されたかどうかを探索するために、インビトロ交差給餌システムにおいて増殖した細菌のＧＧＴ活性を測定した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａがＣＤまたはＫＤベースの寒天中に包埋され、Ｐ．ｍｅｒｄａｅがＭ９最少培地中に寒天上で重層されたときに、両方の細菌は、増強された増殖を示し（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが可溶性因子を遊離させ、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ増殖を可能にし、今度はＰ．ｍｅｒｄａｅがＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ増殖を増強したことを示唆した。パイロット実験は、ＫＤまたはＣＤ寒天中に包埋されたＰ．ｍｅｒｄａｅ上に重層されたときにＭ９培地中でＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの増殖がなかったことを明らかにし、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａが持続するＰ．ｍｅｒｄａｅからの交差給餌だけに頼ることが不可能であることを示唆した。
【0073】
Ｐ．ｍｅｒｄａｅは、ＣＤまたはＫＤ寒天中に包埋されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの追加によって除去された、高いＧＧＴ活性を示した（図１０Ｇ及び図１０Ｈ）。Ｐ．ｍｅｒｄａｅ中のＧＧＴ活性の低下がＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ増殖を促進したかどうかを判定するために、Ｐ．ｍｅｒｄａｅをビークルまたはＧＧｓＴｏｐによって前処置し、交差給餌アッセイで試験する前にＧＧＴ活性を薬理学的に阻害した。ＧＧｓＴｏｐによって前処置されたＰ．ｍｅｒｄａｅに曝露されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａは、ビークル処置されたＰ．ｍｅｒｄａｅに曝露されたＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａと比較して、インキュベーションの２４時間後に増加した増殖を示した（図１１Ｂ）。まとめると、これらの知見は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａがＰ．ｍｅｒｄａｅ増殖を支持するためにＫＤ及びＣＤ食餌制限から成分を代謝することが可能であったこと、ならびに協同的相互作用がＧＧＴ活性を低下させたことを示唆した。つぎに、Ｐ．ｍｅｒｄａｅ中のＧＧＴ活性における低下は、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ増殖を促進する。これは、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種の濃縮が糞便ＧＧＴ活性、結腸内腔ＧＧアミノ酸及び血清ＧＧアミノ酸を低下させた知見と一致していた。これは、発作予防のためにアミノ酸制限を必要としたこと、及びＧＧＴ阻害が発作予防を促進したことを実証した。これは、ＧＧＴ活性を変化した発作重症度と関連付ける以前の研究と整合した。７５名のてんかん患者の研究において、高い血清ＧＧＴ活性は、対照と比較して、８４．５％の患者において観察された。ラット発作モデルにおいて、ＧＧＴ活性は、５回連続、毎日の電気ショック送達後に上昇した。動物及びヒトにおける、さまざまな末梢アミノ酸における減少は、ＫＤ媒介発作抑制と関連している。
【0074】
本明細書におけるデータ、及び脳神経伝達物質生合成のための基質としての末梢アミノ酸についての役割に関する既存の文献に基づき、ＧＧアミノ酸の細菌調節がＧＡＢＡ／グルタミン酸塩の代謝を補給するアミノ酸の脳移入を変えたと仮定した（図８）。注目すべきことに、いくつかの腸内細菌は、新たなＧＡＢＡを合成することが報告されているが、ＧＡＢＡの循環が血液脳関門にわたり輸送が制限されていることを示す。加えて、腸内微生物叢における変化は、脳ＧＡＢＡレベルにおける変化と関連付けられているが、関与した分子機構は、不明なままである。ＧＧアミノ酸がアミノ酸の脳輸送、及びグルタミン酸塩対ＧＡＢＡの局所合成に影響するかどうかを判定するために、追加の研究を必要とする。
【0075】
全体的に見て、本研究は、難治性てんかんについてのマウスモデルにおける発作予防を媒介して与える際に、特定のＫＤ関連腸内細菌（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種）についての新しい役割を実証した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａにおける増加は、ヒト、ハムスター、リス、及びパイソンにおける絶食中に、またマウスにおけるカロリー制限及び高多価不飽和脂肪食餌制限に応答して、同様に観察された。またＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種は、ヒトにおけるケトン症の増加及びケトン食療法と陽性に関連する。本明細書におけるデータは、海馬におけるグルタミン酸塩と比較して、ケト原性ＧＧアミノ酸の宿主レベルを低下させ、ＧＡＢＡの全体の生物学的利用率を上昇させた特定の微生物間相互作用をＫＤが促進したことにより可能性のある経路を明らかにする。ガンマ－グルタミル化の薬理学的阻害は、発作閾値を上昇させ、ＧＧＴ活性の低下がマウスにおけるＫＤ関連腸内微生物叢の抗発作効果を媒介するために重要であったことを示唆した。注目すべきことに、ＧＦ条件中の細菌ＧＧＴ活性の欠如が発作感受性と関連したことを考えると、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌種がＧＧＴ活性の抑制に加えて、発作予防に貢献することもできる機能に寄与したという可能性がある。
【0076】
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が具体的に、かつ個別に参照により援用されるように示されたかのように、本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。矛盾がある場合、本明細書のいかなる定義をも含む本出願が支配する。
本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が具体的に、かつ個別に参照により援用されるように示されたかのように、本明細書によってそれらの全体が参照により援用される。矛盾がある場合、本明細書のいかなる定義をも含む本出願が支配する。
【0077】
均等物
本発明の特定の実施形態を考察したが、上記の明細書は、例示であり、限定ではない。本明細書、及び以下の特許請求の範囲を検討すると、本発明の多くの変形形態は、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲に加え、それらの均等物の全範囲、及び本明細書に加え、このような変形形態への参照によって決定されるべきである。 本発明は、以下を提供する。
（１） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（２） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の神経伝達物質生合成を変えることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（３） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の血清ケト原性アミノ酸を変えることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（４） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性を低下させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（５） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のグルタミン合成酵素活性を低下させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（６） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のガンマ－グルタミルアミノ酸を減少させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（７） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のＧＡＢＡ／グルタミン酸塩比のレベルを上昇させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（８） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のグルタミンレベルを上昇させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（９） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１０） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１５）前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（１８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（１９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２２） 前記病態は、発作であり、任意選択で対象は、たとえば、てんかん、自閉症スペクトラム症、レット症候群、注意欠陥障害、及び脆弱Ｘ症候群から選択される、神経発達病態を有する、上記のいずれかに記載の方法。
（２３） 前記対象は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）から選択される病態を有する、上記（１）から（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（１）から（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（１）から（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（１）から（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（１）から（２６）のいずれかに記載の方法。
（２８） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９） 前記組成物は、食品である、上記（１）から（２８）のいずれかに記載の方法。
（３０） 前記食品は、乳製品である、上記（２９）に記載の方法。
（３１） 前記食品は、ヨーグルトである、上記（２９）に記載の方法。
（３２） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（３３） 前記組成物は、自己投与される、上記（１）から（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４） 対象におけるケトン食療法に応答性である病態を処置する、または予防する方法であって、
（ａ）前記対象の腸内微生物叢を枯渇させること、
（ｂ）Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を前記対象に投与すること、
を備える、前記方法。
（３５） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（３４）に記載の方法。
（３６） 前記組成物は、食品である、上記（３４）または上記（３５）に記載の方法。
（３７） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（３４）に記載の方法。
（３８） 前記組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）を含有する糞便試料を含む、上記（３０）に記載の方法。
（３９） 前記糞便試料は、糞便バンクからのものである、上記（３８）に記載の方法。
（４０） 抗生物質を前記対象に投与し、前記対象の腸内微生物叢を枯渇させることをさらに備える、上記（３４）から（３９）のいずれかに記載の方法。
（４１） 前記対象の腸内微生物叢を配列決定することをさらに備える、上記（３４）から（４０）のいずれかに記載の方法。
（４２） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（３４）から（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（３４）から（４２）のいずれかに記載の方法。
（４４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（３４）から（４３）のいずれかに記載の方法。
（４５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（３４）から（４３）のいずれかに記載の方法。
（４６） 前記組成物は、自己投与される、上記（３４）に記載の方法。
（４７） 前記病態は、発作であり、任意選択で前記対象は、たとえば、てんかん、自閉症スペクトラム症、レット症候群、注意欠陥障害、及び脆弱Ｘ症候群から選択される、神経発達病態を有する、上記（３４）から（４６）のいずれかに記載の方法。
（４８） 前記病態は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）から選択される、上記（３４）から（４７）のいずれかに記載の方法。
（４９） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む組成物。
（５０） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５２） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５５） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６３） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（４９）に記載の組成物。
（６４） 前記組成物は、食品である、上記（６３）に記載の組成物。
（６５） 前記食品は、乳製品である、上記（６４）に記載の組成物。
（６６） 前記乳製品は、ヨーグルトである、上記（６５）に記載の組成物。
（６７） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（４９）に記載の組成物。
（６８） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の病態を予防する、または処置する方法。
（６９） 前記病態は、自閉症スペクトラム症、てんかん、発作、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、レット症候群、注意欠陥障害、脆弱Ｘ症候群、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である、上記（６８）に記載の方法。
（７０） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記（６８）または（６９）に記載の方法。
（７１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記（６８）から（７０）のいずれかに記載の方法。
（７２） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記（６８）から（７１）のいずれかに記載の方法。
（７３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７５） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８３） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（６８）から（８２）のいずれかに記載の方法。
（８４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（６８）から（８３）のいずれかに記載の方法。
（８５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（６８）から（８４）のいずれかに記載の方法。
（８６） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（６８）から（８５）のいずれかに記載の方法。
（８７） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（６８）から（８６）のいずれかに記載の方法。
（８８） 前記組成物は、食品である、上記（６８）から（８７）のいずれかに記載の方法。
（８９） 前記食品は、乳製品である、上記（８８）に記載の方法。
（９０） 前記食品は、ヨーグルトである、上記（８８）に記載の方法。
（９１） 前記組成物は、直陽送達用に製剤化される、上記（６８）から（８６）のいずれかに記載の方法。
（９２） 前記組成物は、自己投与される、上記（６８）から（９１）のいずれかに記載の方法。
本発明の特定の実施形態を考察したが、上記の明細書は、例示であり、限定ではない。本明細書、及び以下の特許請求の範囲を検討すると、本発明の多くの変形形態は、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲に加え、それらの均等物の全範囲、及び本明細書に加え、このような変形形態への参照によって決定されるべきである。 本発明は、以下を提供する。
（１） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（２） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の神経伝達物質生合成を変えることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（３） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の血清ケト原性アミノ酸を変えることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（４） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のガンマ－グルタミルトランスペプチダーゼ活性を低下させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（５） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のグルタミン合成酵素活性を低下させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（６） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のガンマ－グルタミルアミノ酸を減少させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（７） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のＧＡＢＡ／グルタミン酸塩比のレベルを上昇させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（８） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内のグルタミンレベルを上昇させることによって、前記対象におけるケトン食療法に応答性である病態を予防する、または処置する方法。
（９） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１０） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記のいずれかに記載の方法。
（１２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１５）前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記のいずれかに記載の方法。
（１７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（１８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（１９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記のいずれかに記載の方法。
（２２） 前記病態は、発作であり、任意選択で対象は、たとえば、てんかん、自閉症スペクトラム症、レット症候群、注意欠陥障害、及び脆弱Ｘ症候群から選択される、神経発達病態を有する、上記のいずれかに記載の方法。
（２３） 前記対象は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）から選択される病態を有する、上記（１）から（２２）のいずれかに記載の方法。
（２４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（１）から（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（１）から（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（１）から（２５）のいずれかに記載の方法。
（２７） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（１）から（２６）のいずれかに記載の方法。
（２８） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（２９） 前記組成物は、食品である、上記（１）から（２８）のいずれかに記載の方法。
（３０） 前記食品は、乳製品である、上記（２９）に記載の方法。
（３１） 前記食品は、ヨーグルトである、上記（２９）に記載の方法。
（３２） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（３３） 前記組成物は、自己投与される、上記（１）から（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４） 対象におけるケトン食療法に応答性である病態を処置する、または予防する方法であって、
（ａ）前記対象の腸内微生物叢を枯渇させること、
（ｂ）Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を前記対象に投与すること、
を備える、前記方法。
（３５） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（３４）に記載の方法。
（３６） 前記組成物は、食品である、上記（３４）または上記（３５）に記載の方法。
（３７） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（３４）に記載の方法。
（３８） 前記組成物は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）を含有する糞便試料を含む、上記（３０）に記載の方法。
（３９） 前記糞便試料は、糞便バンクからのものである、上記（３８）に記載の方法。
（４０） 抗生物質を前記対象に投与し、前記対象の腸内微生物叢を枯渇させることをさらに備える、上記（３４）から（３９）のいずれかに記載の方法。
（４１） 前記対象の腸内微生物叢を配列決定することをさらに備える、上記（３４）から（４０）のいずれかに記載の方法。
（４２） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（３４）から（４１）のいずれかに記載の方法。
（４３） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（３４）から（４２）のいずれかに記載の方法。
（４４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（３４）から（４３）のいずれかに記載の方法。
（４５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（３４）から（４３）のいずれかに記載の方法。
（４６） 前記組成物は、自己投与される、上記（３４）に記載の方法。
（４７） 前記病態は、発作であり、任意選択で前記対象は、たとえば、てんかん、自閉症スペクトラム症、レット症候群、注意欠陥障害、及び脆弱Ｘ症候群から選択される、神経発達病態を有する、上記（３４）から（４６）のいずれかに記載の方法。
（４８） 前記病態は、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）から選択される、上記（３４）から（４７）のいずれかに記載の方法。
（４９） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含む組成物。
（５０） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５２） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記（４９）に記載の組成物。
（５３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５５） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（５９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（４９）から（５２）のいずれかに記載の組成物。
（６３） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（４９）に記載の組成物。
（６４） 前記組成物は、食品である、上記（６３）に記載の組成物。
（６５） 前記食品は、乳製品である、上記（６４）に記載の組成物。
（６６） 前記乳製品は、ヨーグルトである、上記（６５）に記載の組成物。
（６７） 前記組成物は、直腸送達用に製剤化される、上記（４９）に記載の組成物。
（６８） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）及びＰａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の細菌を含有する組成物を対象に投与することを備える、前記対象内の病態を予防する、または処置する方法。
（６９） 前記病態は、自閉症スペクトラム症、てんかん、発作、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、がん、脳卒中、代謝疾患、ミトコンドリア病、うつ状態、片頭痛、レット症候群、注意欠陥障害、脆弱Ｘ症候群、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である、上記（６８）に記載の方法。
（７０） Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）属の前記細菌は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを含む、上記（６８）または（６９）に記載の方法。
（７１） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｒｄａｅを含む、上記（６８）から（７０）のいずれかに記載の方法。
（７２） Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）属の前記細菌は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓを含む、上記（６８）から（７１）のいずれかに記載の方法。
（７３） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７４） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７５） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７６） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７７） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ（Ａｋｋ）である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７８） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも１０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（７９） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも３０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８０） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも５０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８１） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも７０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８２） 前記組成物中の前記細菌の少なくとも９０％は、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｐｂ）の細菌である、上記（６８）から（７２）のいずれかに記載の方法。
（８３） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、対照食事制限である、上記（６８）から（８２）のいずれかに記載の方法。
（８４） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、ケトン食療法である、上記（６８）から（８３）のいずれかに記載の方法。
（８５） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、高脂肪食である、上記（６８）から（８４）のいずれかに記載の方法。
（８６） 前記対象は、食事制限中であり、前記食事制限は、低炭水化物食である、上記（６８）から（８５）のいずれかに記載の方法。
（８７） 前記組成物は、経口送達用に製剤化される、上記（６８）から（８６）のいずれかに記載の方法。
（８８） 前記組成物は、食品である、上記（６８）から（８７）のいずれかに記載の方法。
（８９） 前記食品は、乳製品である、上記（８８）に記載の方法。
（９０） 前記食品は、ヨーグルトである、上記（８８）に記載の方法。
（９１） 前記組成物は、直陽送達用に製剤化される、上記（６８）から（８６）のいずれかに記載の方法。
（９２） 前記組成物は、自己投与される、上記（６８）から（９１）のいずれかに記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2A】
【図2B】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【図11A】
【図11B】
